FR2902441A1 - Procede de determination de la concentration d'acides nucleiques - Google Patents

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Abstract

Système comprenant un dispositif (1) microfluidique comportant une première chambre (10) dotée de moyens d'amplification d'acides nucléiques et une deuxième chambre (20) qui peut être mise en communication fluidique avec la première chambre et qui comporte un dispositif (22) de détermination de concentration d'acides nucléiques amplifiés, le système comporte un dispositif (30) d'introduction d'un volume défini d'une solution comportant des réactifs dans la première chambre (10) et de transfert d'un volume défini de la première chambre (10) dans la deuxième chambre (20).

Description

PROCEDE DE DETERMINATION DE LA CONCENTRATION D'ACIDES NUCLEIQUES
L'invention concerne un procédé de détermination de la concentration d'acides nucléiques dans un échantillon placé dans un dispositif de microfluidique et concerne également un système permettant de mettre en œuvre le procédé. ETAT DE LA TECHNIQUE Dans de nombreux problèmes qui se posent dans le domaine du diagnostic et de la recherche en biologie moléculaire, il est nécessaire de déterminer la quantité ou la concentration de certains acides nucléiques dans un échantillon. Par exemple, pour contrôler le déroulement de la thérapie chez les patients atteints du sida, il est nécessaire de déterminer le nombre de duplication des acides nucléiques viraux du virus VIH dans le sang (ce que l'on appelle la charge virale). Comme les acides nucléiques à déterminer sont fréquemment mélangés à de nombreux autres acides nucléiques et qu'en outre ils sont à une concentration de départ très faible, il est le plus souvent nécessaire d'amplifier les acides nucléiques à déterminer (ou acides nucléiques) et de les mettre en évidence de façon spécifique. Il faut mentionner que dans le contexte de la présente invention le terme "acide nucléique" englobera les séquences d'acides nucléiques.
Cela peut être par exemple des séquences d'ADN ou d'ARN. Pour effectuer l'amplification (multiplication) spécifique d'acides nucléiques, on connaît en microbiologie différents procédés, par exemple la réaction en chaîne par polymérase (PCR) qui est décrite entre autres dans le document US 4 683 195. En outre, le procédé PCR est également approprié à la quantification d'acides nucléiques, par exemple en impliquant dans la réaction PCR un acide nucléique connu à une concentration de départ connue (un étalon interne) de façon à déduire, lors de la détection d'autres acides nucléiques dans l'échantillon, la concentration de départ de ceux-ci, comme cela est décrit dans le document US 5 219 727. Étant donné que la détermination de la concentration n'est ici réalisée qu'après avoir effectué la réaction PCR, on parle d'un procédé à point final. En outre, on a également développé des procédés qui permettent de déterminer la concentration pendant le processus de réaction PCR, ce que l'on appelle des procédés en temps réel ou Real-Time (Real-Time-PCR). Comme dans la PCR le nombre d'acides nucléiques amplifiés peut être doublés à chaque cycle de réaction dans des conditions idéales, l'amplification s'effectue de façon exponentielle. Dans des procédés Real-Time-PCR, l'augmentation de la concentration d'acides nucléiques amplifiés peut être effectué en temps réel, par exemple en introduisant un colorant de fluorescence. Pour déterminer la concentration, on connaît en 20 outre des procédés optiques, électrochimiques et à spectrométrie de masse. Un autre procédé d'amplification d'acides nucléiques est la réaction en chaîne par ligase (LCR) dont le processus est analogue à celui d'une PCR ; on utilise 25 cependant comme enzyme une ligase d'acide nucléique, voir par exemple Wiedmann et al. Discrimination of Listeria monocytogenes from other Listeria species by ligase chain reaction , Appl Environ Microbiol. 1992 Nov; 58(11): 3443-7. 30 Cependant, ces procédés ont pour inconvénient d'avoir une plage dynamique limitée. La plage dynamique typique est comprise entre 1 à 100 et 1 à 1000, la plage de concentration d'acides nucléiques à mesurer est cependant fréquemment bien plus étendue, par exemple 1 à 1 000 000. Par conséquent, pour déterminer la concentration, il faut fréquemment effectuer toute une série de dilutions, par exemple 1 à 1, 1 à 10, 1 à 100 etc. pour pouvoir effectuer ensuite une mesure de la concentration dans la plage de mesure du procédé de détermination. Cela est onéreux en temps et en ressources supplémentaires et est en plus une source d'erreurs. Un problème particulier est constituée par la courbe sigmoïde de la concentration du produit PCR obtenu par rapport au temps qui est due entre autres au fait que, pendant le déroulement de la réaction, les réactifs de la PCR (amorces, triphosphates nucléotidiques etc.) sont utilisés graduellement et/ou que le domaine de saturation du procédé de détection est atteint. A ce moment, on ne peut plus pratiquement déterminer la concentration. En conséquence, le but de la présente invention est de proposer un procédé qui pallie les inconvénients susmentionnés. DESCRIPTION DE L'INVENTION Selon la présente invention, il est proposé un procédé de détermination de la concentration d'acides nucléiques dans un échantillon placé dans un dispositif microfluidique, ledit procédé comportant les étapes suivantes consistant à : a) introduire l'échantillon dans une première chambre, b) effectuer une réaction d'amplification réalisable cycliquement afin d'amplifier des acides nucléiques pendant un nombre de cycles prédéterminé, c) transférer un volume défini, qui est une fraction du volume de la première chambre et qui comporte des acides nucléiques amplifiés, dans une deuxième chambre et remplacer la partie transférée du volume d'échantillon par des réactifs non utilisé (frais) pour la réaction d'amplification, d) déterminer la concentration des acides nucléiques amplifiés dans une deuxième chambre qui comporte un dispositif de détermination de concentration, et e) répéter les étapes b) à d) jusqu'à déterminer, dans la deuxième chambre, une concentration des acides nucléiques amplifiés qui se trouve dans une plage prédéterminée. Il faut souligner que, selon un aspect de l'invention, le nombre de cycles prédéterminé de la réaction d'amplification peut varier d'une étape de répétition à une autre. On peut donc imaginer d'effectuer par exemple 20 cycles d'un premier ensemble ainsi que 10 cycles d'un premier ensemble de répétitions et 5 cycles dans un deuxième ensemble de répétitions.
Par "réaction d'amplification d'acides nucléiques cycliquement réalisable" on entend dans le contexte de la présente invention une réaction dans laquelle les acides nucléiques sont multipliés, par exemple doublés, peu à peu dans des étapes de réaction individuelles. En modifiant cycliquement certains paramètres de réaction, on peut au choix terminer ou poursuivre de telles réactions selon un nombre prédéterminé d'étapes (c'est-à-dire cycles). Avantageusement, on utilise comme réaction d'amplification d'acides nucléiques réalisable cycliquement la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Cependant, le procédé selon l'invention peut également être réalisé avec toute autre réaction d'amplification cycliquement réalisable, par exemple la LCR. Le transfert du volume défini dans la deuxième chambre et le remplacement du volume transféré par des réactifs non utilisés (frais) pour la réaction cycliquement réalisable peuvent être effectués en une étape, par exemple en transférant le volume de la première chambre dans la deuxième chambre avec un volume correspondant de solution de réaction fraîche. Cependant, on peut également imaginer d'effectuer le transfert et le remplacement dans des étapes séparées. L'expression microfluidique caractérise des procédés dans lesquels on manipule des volumes de fluide de l'ordre du pl. Dans le dispositif microfluidique, il peut être prévu des canaux et des cavités dans lesquels on peut mettre en œuvre le procédé. Avantageusement, le dispositif microfluidique est conformé en produit plat de type carte, également appelé cartouche, dans lequel les canaux et cavités sont destinés à effectuer la réaction. Les réactifs de la réaction d'amplification cyclique peuvent comporter un tampon de réaction (par exemple sous la forme de sels correspondants), une enzyme, des triphosphates nucléotidiques et une amorce (oligonucléotides). Les réactifs peuvent être déjà prévus dans le dispositif microfluidique sous une forme de conservation stable, par exemple sous une forme séchée ou au-dessous d'une couche de paraffine éliminable par fusion. Selon un aspect préféré de l'invention, la plage de concentration prédéterminée est la plage de mesure du dispositif de détermination de la concentration. La détermination de la concentration d'acides nucléiques amplifiés peut être effectuée de façon non spécifique, par exemple par un procédé optique (par exemple par spectrométrie d'absorption ou par fluorescence, par exemple en introduisant un colorant de fluorescence dans des acides nucléiques amplifiés).
Selon un autre aspect de la présente invention, il est cependant préféré d'effectuer la détection des acides nucléiques amplifiés au niveau de séquences spécifiques, le dispositif de détermination de la concentration d'acides nucléiques comportant un microréseau dans lequel des capteurs oligonucléotidiques sont immobilisés (spotted) à des positions spécifiques sur un support afin de se lier aux acides nucléiques amplifiés. De façon préférée, la détermination de la concentration des acides nucléiques amplifiés liés est effectuée en utilisant un marqueur (label). Ce marqueur peut être par exemple un marqueur optique ou un marqueur enzymatique. Le marqueur enzymatique peut catalyser une réaction enzymatique qui peut être détectée par des moyens optiques, ou avantageusement catalyser une réaction enzymatique qui peut être détectée par des moyens électrochimiques. La détection enzymatique offre de nombreux avantages, par exemple un traitement simple des signaux obtenus et une plus faible dépense en appareils d'exploitation que pour les procédés optiques. Dans un autre aspect de l'invention, la réaction électrochimique est de préférence une mesure de courant amplifiée par cycle redox. La concentration de départ des acides nucléiques à déterminer ou des acides nucléiques peut être déterminée par exemple en utilisant une norme interne (un acide nucléique connu à une concentration de départ connue qui est ajouté à l'échantillon ou qui est amplifié ou mesuré en parallèle) dont la concentration permet de déduire après amplification la concentration d'origine des acides nucléiques. En outre, il est également possible d'évaluer les acides nucléiques dans l'échantillon à partir du rapport des volumes et du nombre de cycles PCR effectués. En outre, l'invention concerne un système qui permet de mettre en oeuvre le procédé de l'invention et qui comprend un dispositif microfluidique comportant une première chambre dotée de moyens de chauffage/refroidissement pour l'amplification d'acides nucléiques par une réaction d'amplification réalisable cycliquement et une deuxième chambre qui peut être mise en communication fluidique avec la première chambre et qui comporte un dispositif de détermination de la concentration d'acides nucléiques amplifiés, le système comportant un dispositif destiné à introduire dans la première chambre un volume défini d'une solution comprenant des réactifs destinés à la réaction d'amplification et à transférer un volume défini de la première chambre dans la deuxième chambre.
Selon un autre aspect de la présente invention, le système peut comporter une commande qui commande le dispositif d'introduction d'un volume défini d'une solution dotée de réactifs destinés à la réaction d'amplification dans la première chambre et de transfert d'un volume défini de la première chambre dans la deuxième chambre. Cette commande est avantageusement conçue de façon à pouvoir recevoir un signal du dispositif de détermination de concentration et à commander, en réaction au signal, le dispositif d'introduction du volume défini de la solution dotée de réactifs d'amplification dans la première chambre et à transférer le volume défini de la première chambre dans la deuxième chambre afin d'alimenter la première chambre en solution non utilisée de réactifs d'amplification. Il est en outre préféré que la commande puisse commander les cycles de réaction d'amplification, par exemple en prescrivant un profil de température aux moyens de chauffage et/ou de refroidissement de la première chambre. Lorsque, lors d'une première mesure de concentration après un premier ensemble de cycles de réaction d'amplification, la commande reçoit par exemple un signal indiquant que la concentration se trouve au-dessous d'une plage prédéterminée, la commande peut commander un nouvel ensemble de cycles en commandant un profil de température dans la première chambre. Pour accélérer tout le processus d'analyse, les autres cycles peuvent déjà être démarrés, ou réalisés au cours des étapes de détermination de la concentration, telles que l'hybridation, le couplage de marqueur et la détection des acides nucléiques déjà amplifiés avec la fraction de volume transférée. Selon un autre aspect de la présente invention, le système comporte en outre avantageusement un ordinateur qui est conçu pour calculer la concentration d'un acide nucléique dans un échantillon en se fondant sur un signal du dispositif de détermination de la concentration. Cet ordinateur peut être commandé par microprocesseur et les conditions matérielles et logicielles, nécessaires au fonctionnement d'un tel ordinateur, sont déjà connues de l'homme du métier. Selon un autre aspect de la présente invention, le système comporte en outre avantageusement au moins un réservoir qui contient des réactifs qui sont utilisés pour la détection d'acides nucléiques. Ce réservoir peut contenir par exemple un marqueur enzymatique (c'est-à-dire un enzyme permettant de marquer des acides nucléiques) ou un substrat enzymatique qui est transformé par acides nucléiques marqués par une enzyme. Le réservoir est avantageusement prévu dans le dispositif de microfluidique. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description suivante d'exemples de réalisation en se référant aux dessins joints qui sont simplement donnés à titre d'exemple et d'illustration et dans lesquels : la figure 1 est une représentation schématique d'un système permettant de mettre en oeuvre le procédé de l'invention ; et la figure 2 est une représentation schématique partielle d'un dispositif microfluidique, conformé en cartouche, qui peut être utilisé dans un système permettant de mettre en oeuvre le procéder de l'invention. La figure 1 représente un système permettant de mettre en oeuvre le procédé de l'invention au moyen d'une cartouche microfluidique 1 (représenté par la ligne discontinue), laquelle comporte une première chambre 10 et une deuxième chambre 20. Une amenée 11 et une première conduite 12 permettent d'introduire dans la chambre 10 un échantillon qui contient des acides nucléiques à analyser. Dans la chambre 10, il est prévu des moyens de chauffage et/ou de refroidissement (non représentés). Ce peut être du côté de la cartouche une région présentant une grande conductibilité thermique, par exemple en raison de la paroi de matériau relativement mince ; des éléments de chauffage et de refroidissement, par exemple des éléments à effet Peltier, peuvent être associés à la cartouche. Les réactifs permettant d'effectuer une réaction PCR (tampons de réaction, enzyme, triphosphates nucléotidiques, amorces etc.) peuvent déjà se trouver dans la chambre lors de l'introduction de l'échantillon, par exemple sous une forme sèche, de sorte qu'ils sont dissous lors de l'introduction de l'échantillon liquide ou bien ils peuvent par exemple être également introduits par l'amenée 11 et la première conduite 12 étant mélangés à l'échantillon. Il est en outre prévu une deuxième conduite 13 menant à la deuxième chambre 20. Les conduites 12, 13 peuvent être fermées sélectivement au moyen d'un premier clapet 14 respectivement un deuxième clapet 15. Après avoir effectué une réaction PCR avec un nombre prédéterminé de cycles (par exemple 20 cycles), les clapets 14, 15 sont ouverts. Un dispositif 30 permet d'amener ensuite un volume défini, qui est une fraction du volume de la première chambre, d'une solution comportant des réactifs PCR non utilisés (par exemple des tampons de réaction, une enzyme, des triphosphates nucléotidiques, des amorces etc.), dans la chambre 10 par l'intermédiaire de la conduite 12. Le dispositif de transfert de volume 30 peut être une pompe de dosage réglable, une pompe à piston alternatif ou un dispositif similaire permettant de déplacer un volume défini. Ainsi, une partie correspondante du volume de la chambre 10 est déplacée et transférée dans la chambre 20. Dans la chambre 20, il est prévu un dispositif 22 permettant de déterminer la concentration des acides nucléiques. Le volume en excès peut être évacué de la chambre 20 par une sortie 21. Le dispositif de détermination de concentration 22 permet de déterminer la concentration d'acides nucléiques amplifiés dans le volume défini transféré et de transmettre un signal correspondant à la commande 40. Dans le cas où la concentration des acides nucléiques amplifiés se trouve au-dessous de la plage de mesure du dispositif de détermination de la concentration, la commande 40 ordonne de fermer les clapets 14 et 15 et de commencer un autre ensemble de cycles de réaction PCR (par exemple 10 autres cycles). Une fois que le deuxième ensemble de cycles de réaction PCR est terminé, la commande 40 ordonne d'ouvrir de nouveau les clapets 14 et 15 et d'amener dans la chambre 10 une solution fraîche, comportant des réactifs PCR non utilisés, par le biais de la conduite 12 et du dispositif 30. Ainsi, un nouveau volume défini correspondant, comportant des acides nucléiques amplifiés, est transféré dans la chambre 20 dans laquelle la concentration est déterminée par le dispositif de détermination de concentration 22 et dans laquelle ce procédé est répété jusqu'à ce que la concentration des acides nucléiques amplifiés se trouve dans la plage de mesure. On peut maintenant déterminer définitivement la concentration et, en raison de la cinétique connue de la réaction PCR, on peut déduire à partir du nombre de cycles et de la fraction des volumes transférés, sur tout le volume d'échantillon, la concentration de départ des acides nucléiques à déterminer. Cela peut être effectué en raccordant un ordinateur qui peut calculer la concentration en se fondant sur les signaux de mesure et les autres informations relatives au nombre de cycles de réaction, aux volumes d'échantillon etc. Selon l'invention, les chambres 10 et 20, ainsi que les conduites d'amenée, de liaison et d'évacuation 11, 12, 13 respectivement 21 sont prévues dans une chambre microfluidique 1. En se référant à la figure 2, les deux derniers chiffres des références coïncident, pour les éléments analogues à ceux de la figure 1, avec les références respectives de la figure 1, de sorte que la première chambre 10 de la figure 1 porte dans la figure 2 la référence 110, etc.
On se réfère maintenant à la figure 2. Une cartouche 101 est constituée d'un corps en matière plastique dans lequel sont ménagés des creux respectivement des microcanaux et d'autres structures qui sont décrites dans la suite.
Les réactifs prévus sous forme sèche seront immobilisés dans la cartouche 101. Les réactifs PCR du premier ensemble de cycles de réaction peuvent être prévus directement dans la première chambre (la chambre PCR) 110. Dans la chambre 120, il est prévu un microréseau conformé en puce et servant de dispositif de détermination de la concentration. Des réactifs PCR destinés à d'autres ensembles de cycles PCR peuvent être prévus sous forme sèche dans les creux 112' ménagés dans la première conduite 112. La cartouche peut être fermée par exemple par une feuille après immobilisation des réactifs du côté supérieur. L'échantillon peut être introduit dans la première chambre (chambre PCR) 110 par le canal 111. La première chambre peut être fermée au moyen d'un premier clapet 114 et d'un deuxième clapet 115. Pour mettre en oeuvre le procédé, la cartouche est ensuite introduite dans un appareil qui contient la commande, des éléments de chauffage, des amenées d'eau ou de tampons et analogues (non représentés). La chambre PCR 110 peut être chauffée et/ou refroidie par des éléments de chauffage respectivement de refroidissement (par exemple des éléments à effet Peltier) de sorte que les cycles de réaction PCR peuvent être réalisés par une commande (non représentée) en se référant à un profil de température prescrit, comme c'est connu de l'homme du métier. Après un nombre de cycles prescrit, les clapets 114, 115 sont ouverts et la première conduite 112 introduit, par le biais du dispositif de transfert de volume se trouvant à l'extérieur de la cartouche (non représenté), un volume de solution défini dans la cartouche qui déplace ainsi à l'extérieur de la chambre 110 un volume correspondant de l'échantillon comportant des acides nucléiques amplifiés. La solution peut déjà contenir des réactifs PCR non utilisés. En variante, des réactifs PCR non utilisés peuvent également se trouver par exemple à l'état sec dans des creux 112' ménagés dans la première conduite 112 de sorte que les réactifs PCR secs sont dissous en pompant un solvant (par exemple de l'eau ou un tampon) à travers la première conduite 112 et sont ensuite introduits en solution dans la chambre 110. La partie déplacée correspondante du volume d'échantillon est transféré, par l'intermédiaire de la deuxième conduite 113, dans la chambre 120 où on détermine la concentration. Ainsi, l'introduction de la solution comportant des réactifs PCR non utilisés et le transfert d'un volume défini sont effectués en une étape et des réactifs PCR non utilisés sont déjà disponibles dans la première chambre pour un autre ensemble éventuel de cycles PCR. Les acides nucléiques amplifiés peuvent être marqués, par exemple en utilisant des amorces biotinylées pour pouvoir effectuer ensuite une détection. Le volume déplacé arrive dans la chambre 120 dans laquelle se trouve un microréseau, sous la forme d'un micro-système de capteurs oligonucléotidiques à séquence connue, immobilisés sur un support, qui peuvent se lier aux acides nucléiques amplifiés. La détection est effectuée par voie électrochimique, comme décrit par exemple dans la publication DE 101 26 341 Al. De plus, à chaque emplacement de détection, il y a deux électrodes sur une surface de silicium qui forme, en tant que système d'électrodes constitué d'une anode et d'une cathode, une structure interdigitale dont les doigts d'électrode s'interpénètrent et permettent de prélever un courant. Pour effectuer la détection, une enzyme est introduite dans la chambre de détection, par exemple une phosphatase alcaline conjuguée à de la streptavidine. Celle-ci se lie aux acides nucléiques amplifiés marqués à la biotine. Ensuite, un substrat enzymatique est introduit dans la chambre de détection 120. On peut amener comme substrat par exemple du p-aminophényl- phosphate qui est transformé par la phosphatase alcaline liée aux acides nucléiques amplifiés en para-aminophénol.
Le p-aminophénol est oxydé au niveau du système d'électrodes, respectivement la paire rédox paminophénol.chinonimine est cyclisée, comme c'est décrit dans le document DE 101 26 341 Al. Cela entraîne au niveau des électrodes une augmentation mesurable du flux de courant. Le signal ainsi prélevé peut être traité dans un ordinateur raccordé. Dans le cas où une quantité encore insuffisante d'acides nucléiques amplifiés a été formée dans un premier ensemble de cycles de réaction PCR, le signal se trouve au-dessous de la plage de mesure. Dans ce cas, la commande ordonne d'effectuer un nouvel ensemble de cycles PCR. Cela se poursuit jusqu'à ce que les acides nucléiques amplifiés atteignent une concentration qui se trouve dans une plage souhaitée, par exemple dans la plage de mesure du dispositif de détermination d'une concentration. Dans un premier cycle de réaction PCR, on peut réaliser par exemple 10 cycles. Ensuite, on transfère par exemple la moitié du volume de la première chambre et on effectue une première détermination de la concentration. L'autre moitié du volume, qui reste dans la chambre PCR, est additionnée du volume correspondant de tampon de réaction PCR frais, et on peut maintenant réaliser dans un deuxième ensemble 10 autres cycles afin de déterminer de nouveau la concentration. Lorsque l'on connaît la plage de mesure dynamique du dispositif de détermination de concentration (par exemple 1:1000), on peut obtenir un recouvrement continu d'une plage de concentration ininterrompue en choisissant de façon appropriée le nombre de cycles dans les ensembles de réaction PCR respectifs. Il faut signaler que l'exemple de réalisation décrit est donné à titre d'exemple seulement, et que l'on peut imaginer un grand nombre de variantes concernant le système de chambres et de conduites (canaux), le type de détection et de réalisation des réactions. En interrompant la réaction d'amplification et en transférant une partie du volume d'échantillon ainsi qu'en remplaçant la partie de volume transféré par du tampon de réaction d'amplification frais, il est important de pouvoir déterminer, dans un procédé simple et intégré, la concentration sur une plage nettement plus importante que sur la plage de mesure du dispositif de détermination de la concentration.

Claims (25)

Revendications
1. Procédé de détermination de la concentration d'acides nucléiques dans un échantillon placé dans un dispositif microfluidique, caractérisé en ce que le procédé comporte les étapes suivantes consistant à : a) introduire l'échantillon dans une première chambre, b) effectuer une réaction d'amplification réalisable cycliquement afin d'amplifier des acides nucléiques pendant un nombre de cycles prédéterminé, c) transférer un volume défini, qui est une fraction du volume de la première chambre et qui comporte des acides nucléiques amplifiés, dans une deuxième chambre et remplacer la partie transférée du volume d'échantillon par des réactifs non utilisés pour la réaction d'amplification, d) déterminer la concentration des acides nucléiques amplifiés dans une deuxième chambre qui comporte un dispositif de détermination de concentration, et e) répéter les étapes b) à d) jusqu'à déterminer, dans la deuxième chambre, une concentration des acides nucléiques amplifiés qui se trouve dans une plage prédéterminée.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la plage prédéterminée est la plage de mesure du dispositif de détermination de la concentration.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le dispositif de détermination de la concentration comporte un microréseau dans lequel des capteurs oligonucléotidiques sont immobilisés à des positions spécifiques afin de se lier aux acides nucléiques amplifiés.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la détermination de la concentration des acidesnucléiques amplifiés liés est effectuée en utilisant un marqueur.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le marqueur est un marqueur optique.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le marqueur est un marqueur enzymatique.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le marqueur catalyse une réaction enzymatique qui est détectable par des moyens optiques.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le marqueur catalyse une réaction enzymatique qui est détectable par des moyens électrochimiques.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la détection électrochimique est une mesure de 15 courant amplifiée par cycle redox.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que un acide nucléique connu est ajouté à l'échantillon à concentration de départ connue (norme interne). 20
11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration d'acides nucléiques est calculée en se fondant sur le rapport entre le volume défini transféré et le volume d'échantillon total et/ou en se fondant sur le nombre de 25 cycles d'amplification effectués.
12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la réaction d'amplification est une réaction en chaîne par polymérase.
13. Système permettant de mettre en œuvre le procédé 30 selon la revendication 1, ledit système comprenant un dispositif (1) microfluidique comportant une première chambre (10) dotée de moyens d'amplification d'acides nucléiques par une réaction d'amplification réalisable cycliquement et une deuxième chambre (20) qui peut êtremise en communication fluidique avec la première chambre et qui comporte un dispositif (22) de détermination de concentration d'acides nucléiques amplifiés, caractérisé en ce que le système comporte un dispositif (30) d'introduction d'un volume défini d'une solution comportant des réactifs destinés à la réaction d'amplification dans la première chambre (10) et de transfert d'un volume défini de la première chambre (10) dans la deuxième chambre (20).
14. Système selon la revendication 13, caractérisé en ce que le dispositif de détermination de la concentration comporte un microréseau dans lequel des capteurs oligonucléotidiques sont immobilisés à des positions spécifiques afin de détecter les acides nucléiques amplifiés.
15. Système selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que le dispositif de détermination de la concentration comporte des moyens de détection optique.
16. Système selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que le dispositif de détermination de la concentration comporte des moyens de détection électrochimique.
17. Système selon la revendication 16, caractérisé en ce que les moyens de détection électrochimique sont conformés de façon à mesurer des courants et/ou des potentiels.
18. Système selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que il est prévu une commande du dispositif d'introduction d'un volume défini d'une solution dans la première chambre et de transfert d'un volume défini de la première chambre dans la deuxième chambre.
19. Système selon la revendication 18, caractérisé en ce que la commande est conformée de façon à recevoir unsignal du dispositif de détermination de la concentration et à commander, en réaction au signal, le dispositif d'introduction d'un volume défini d'une solution dans la première chambre et de transfert d'un volume défini de la première chambre dans la deuxième chambre afin d'alimenter la première chambre avec un volume défini de la solution comportant des réactifs destinés à la réaction d'amplification et de transférer un volume défini correspondant de la première chambre dans la deuxième chambre.
20. Système selon la revendication de 19, caractérisé en ce que les moyens d'amplification d'acides nucléiques, à l'aide d'une réaction d'amplification réalisable cycliquement, comportent des moyens de chauffage et/ou de refroidissement.
21. Système selon la revendication 20, caractérisé en ce que la commande est en outre conçue de façon à prescrire un profil de température aux moyens de chauffage et/ou de refroidissement de la première chambre.
22. Système selon l'une des revendications 13 à 21, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un ordinateur qui est conçu de façon à calculer la concentration d'un acide nucléique dans un échantillon en se fondant sur un signal du dispositif de détermination de la concentration.
23. Système selon l'une des revendications 13 à 22, caractérisé en ce que il est prévu au moins un réservoir de réactifs destinés à la détermination de la concentration d'acides nucléiques, lequel réservoir peut être mis en communication fluidique avec la deuxième chambre.
24. Système selon la revendication 23, caractérisé en ce que le réservoir contient un marqueur enzymatique.
25. Système selon la revendication 23, caractérisé en ce que le réservoir contient un substrat enzymatique.
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