FR2858326A1 - Procede de preparation d'anticorps mimetiques d'une substance et les anticorps ainsi obtenus - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des anticorps préparés par triple immunisation et imitant l'image d'un anticorps idiotypique (Ac1) dirigé contre une substance cible immunogène ou rendu immunogène. L'invention s'intéresse plus particulièrement au domaine de l'angiogénèse et à la préparation d'anticorps dirigés contre un ligand d'un motif présent sur des cellules endothéliales, comme un récepteur.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'ANTICORPS MIMETIQUES D'UNE

SUBSTANCE ET LES ANTICORPS AINSI OBTENUS

L'invention concerne la préparation d'anticorps 5 mimétiques d'une substance cible et donc capables d'inhiber ou d'activer un processus biologique dont est responsable cette substance.

On connaît dans l'art antérieur, la préparation d'anticorps (Acl) notamment monoclonaux spécifiques d'une 10 substance cible immunogène et utiles tant dans le domaine thérapeutique que du diagnostic ou encore pour transporter des molécules d'intérêts vers des cellules cibles à partir desquelles lesdits anticorps ont été fabriqués.

On connaît également dans l'art antérieur la 15 préparation des anticorps anti-idiotypique (Ac2), notamment monoclonaux destinés à mimer la substance cible immunogène à partir de laquelle ont été préparés les premiers anticorps (Acl), et utiles également tant dans le domaine thérapeutique que du diagnostic ou encore pour transporter 20 des molécules d'intérêt.

La Demanderesse a maintenant mis au point une technique de triple immunisation permettant de préparer des anticorps (Ac3) mimétiques d'une substance cible et donc 25 capables d'inhiber ou d'activer un processus biologique dont est responsable cette substance.

Ce but est atteint grâce à un procédé de préparation d'anticorps mimétiques d'une substance, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivants: (i) on administre une substance cible, immunogène ou rendue immunogène, à un premier hôte capable de réagir immunologiquement à cette administration, et (ii) on prépare à partir dudit hôte une première composition d'anticorps dirigée contre ladite substance, puis (iii) on administre ladite première composition 5 d'anticorps à un deuxième hôte capable de réagir immunologiquement à ladite administration, et (iv) on prépare à partir dudit deuxième hôte une deuxième composition d'anticorps dirigée contre les anticorps de la première composition, puis (v) on administre ladite deuxième composition d'anticorps à un troisième hôte capable de réagir immunologiquement à cette administration, et (vi) on prépare à partir dudit troisième hôte une troisième composition d'anticorps dirigée contre les 15 anticorps de la deuxième composition, et (vii) éventuellement, on analyse les propriétés des anticorps de ladite troisième composition par exemple par rapport à celles de la substance cible.

On entend par composition d'anticorps, tant des 20 anticorps polyclonaux que des anticorps monoclonaux ou fragments de ceux-ci, de même que des anticorps chimériques, comme des anticorps humanisés.

Ainsi la présente invention se rapporte à un anticorps (Ac3) imitant l'image d'un anticorps idiotypique (Acl) 25 dirigé contre une substance immunogène ou rendu immunogène.

L'avantage des anticorps de type 3 (Ac3) par rapport aux anticorps de type 1 réside dans le fait que la succession d'immunisations permet, grâce à la restriction idiotypique, d'obtenir une sélection rapide d'anticorps 30 dirigés contre des structures conformationnelles plus que contre des séquences de l'antigène considéré. Cette stratégie permet aussi d'identifier les antigènes reconnus par les anticorps naturels et fonctionnels, en particulier les anticorps anti cellules endothéliales présents chez certains malades.

La substance cible de la première administration (i) peut être toute substance immunogène ou rendue immunogène, 5 comme un antigène ou mélange d'antigènes, un extrait protéique, des cellules ou partie de cellule, par exemple un récepteur ou un ligand d'un récepteur.

La substance cible est ainsi par exemple l'un des partenaires d'un couple de substances complémentaires, comme 10 un couple récepteur ligand.

Les hôtes auxquels sont administrées les compositions d'anticorps de chaque étape du procédé ci-dessus peuvent identiques ou différents.

L'invention concerne aussi un anticorps mimétique 15 (Ac3) d'une substance cible comme défini précédemment et donc susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus. Cet anticorps peut constituer un inhibiteur ou un activateur d'un processus biologique dont est responsable ladite substance cible.

Ces anticorps (Ac3) sont utiles tant dans le domaine thérapeutique que du diagnostic ou encore pour transporter des molécules d'intérêt.

L'invention se rapporte donc aussi aux compositions pharmaceutiques comprenant un ou plusieurs anticorps (Ac3) 25 ci-dessus.

L'invention trouve en particulier un intérêt pour obtenir des anticorps spécifiques de cellules cibles, notamment de cellules endothéliales.

Les cellules endothéliales tapissent l'intérieur de 30 tous les vaisseaux sanguins de l'organisme. Ces cellules ont un phénotype quiescent, elles ne prolifèrent quasiment pas.

En effet, seulement 0,01% des cellules endothéliales sont engagées dans la division cellulaire à un moment donné. Le rôle physiologique des cellules endothéliales est très vaste, elles participent à de nombreux phénomènes vitaux pour l'organisme: coagulation sanguine, maintien de la pression artérielle, recrutement de cellules circulantes, synthèse de facteurs de croissance. Quand un territoire 5 requiert un apport accru en oxygène et en nutriments, il réagit en relarguant des facteurs solubles qui convertissent le phénotype des cellules endothéliales en un phénotype activé, et des facteurs mitogènes pour les cellules endothéliales de phénotype activé. Ces cellules 10 endothéliales acquièrent enfin un phénotype angiogénique et deviennent capables d'effectuer le programme d'angiogenèse, c'est-à-dire le développement de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau préexistant. Ce phénomène est normal et contrôlé lors d'une blessure ou dans la maturation du corps 15 jaune de l'ovaire. En revanche, il devient dangereux dans des situations pathologiques où l'angiogenèse n'est plus contrôlée, par exemple dans la rétinopathie diabétique, la polyarthrite et le développement tumoral.

Il est donc utile de disposer d'agents spécifiques des 20 cellules endothéliales et capables de détruire les vaisseaux associés à ces pathologies.

Ce but est atteint grâce aux anticorps selon l'invention qui sont des mimétiques de ligands activant ou inhibant la prolifération de ces cellules. Dans cette 25 application aux cellules endothéliales, la substance cible est avantageusement choisie parmi: - Des cellules endothéliales cultivées in vitro en présence d'un facteur angiogénique tel qu'un membre de la famille du FGF ou du VEGF.

- Des membranes purifiées à partir de ces cellules endothéliales.

- Des constituants purifiés à partir des membranes de cellules endothéliales.

- Du milieu conditionné de cellules en culture exerçant une activité sur des cellules endothéliales.

- Des vecteurs d'expression de protéines, choisis notamment parmi la famille du pcDNA 3, contenant une 5 séquence d'intérêt. Cette séquence peut avoir été sélectionnée dans des banques publiées comme une séquence homologue à un récepteur ou à un ligand connu.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention 10 apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation d'anticorps mimétiques de substances cibles constituées par des cellules endothéliales ou partie de celles-ci ou encore de molécule ou de composé capable d'interagir avec ces cellules endothéliales. 15 I - Immunisation primaire.

1) Immunisation chez un animal de laboratoire, par

exemple la souris.

souris Balbc de 6 semaines sont immunisées par une 20 injection par voie sous-cutanée de 100 pl de PBS contenant pg de la substance cible choisie et de 100 pl d'adjuvant de Freund complet (Sigma). Alternativement 1-5 x 106 cellules endothéliales peuvent être injectées par voie intrapéritonéale. Alternativement 100 pg de plasmide peut 25 être injecté par voie intradermique ou intramusculaire. 15 et 30 jours après, les souris reçoivent une injection du même produit par une voie identique, excepté que l'adjuvant complet est remplacé par de l'adjuvant incomplet. Entre les Jours 40 et 50, l'évaluation de la réponse de chaque souris 30 à l'immunisation est faite par ELISA à partir d'un prélèvement de sérum.

Le sang des animaux présentant les titres les plus élevés d'anticorps est prélevé par ponction transcutanée et les immunoglobulines sont purifiées par chromatographie d'affinité pour la protéine A. 2) Immunoglobulines humaines.

Certains malades affectés de pathologies, en 5 particulier auto-immunes, présentent dans leur sérum un titre élevé en anticorps dirigés contre la substance cible, comme cela peut-être le cas vis-à-vis d'anticorps visant les cellules endothéliales. Ces anticorps peuvent être purifiés du sérum par chromatographie sur protéine A et utilisés 10 comme anticorps de première immunisation.

A l'issue de la purification des lots d'anticorps 1, les fragments Fab sont préparés par une technique classique comportant une étape de clivage à la papaïne et une purification par protéine A sepharose (les fragments Fab 15 n'étant pas retenus alors que les fragments Fc et les IgG non clivées le sont).

Ces anticorps de type 1 reconnaissent soit un motif présent sur la substance cible, notamment un récepteur, en particulier des récepteurs sur les cellules endothéliales, 20 quand l'immunogène utilisé est une cellule, une préparation membranaire, un constituant purifié, un fragment de protéine obtenu par transfection d'une séquence codante dans un vecteur d'expression, ou que le vecteur d'expression luimême a été injecté dans le muscle ou par voie intra 25 dermique, ou que l'anticorps provienne du sérum d'un humain présentant une pathologie auto-immune. Il peut s'agir d'un anticorps dirigé contre la substance cible, en particulier un ligand d'une cellule endothéliale, quand l'immunogène correspond à un milieu conditionné de la substance cible, en 30 particulier dans le cas d'une cellule susceptible d'interagir avec une cellule endothéliale.

II - Deuxième immunisation: préparation des anticorps de type 2.

On injecte à des souris par voie sous-cutanée 10 pg d'un anticorps polyclonal dirigé contre la substance cible, ledit anticorps étant obtenu selon lors de l'immunisation primaire décrit ci-dessus.

15 et 30 jours après, les souris reçoivent une injection du même produit par une voie identique, excepté que l'adjuvant complet est remplacé par de l'adjuvant incomplet. Entre les Jours 40 et 50, l'évaluation de la réponse de chaque souris immunisée est faite par ELISA à 10 partir d'un prélèvement de sérum.

Les titres d'anticorps 2 sont évalués dans les sérums des souris par un ELISA de type 2 Les fragments Fab des anticorps 1 sont tapissés dans du tampon carbonate 50 mM pH 9 à une dilution de 0,1-10 15 pg/ml. La surface des puits est ensuite incubée avec de la sérumalbumine à 0,5%. Les sérums sont ensuite incubés dans les boîtes et leur présence est révélée par les anticorps anti-immunoglobulines de souris conjugués à la peroxydase.

Une fois les titres déterminés le sang est recueilli 20 par ponction veineuse des souris, le sérum préparé et les IgG purifiées par chromatographie d'affinité pour la protéine A sepharose.

A l'issue de la purification des lots d'anticorps 2, les fragments Fab sont préparés par une technique classique 25 comportant une étape de clivage à la papaïne et une purification par protéine A sepharose (les fragments Fab n'étant pas retenus alors que les fragments Fc et les IgG non clivées le sont).

Ces anticorps de type 2 reconnaissent des anticorps 30 dirigés contre un motif présent sur la substance cible, notamment un récepteur, en particulier des récepteurs sur les cellules endothéliales, quand l'immunogène utilisé est une cellule, une préparation membranaire, un constituant purifié, un fragment de protéine obtenu par transfection d'une séquence codante dans un vecteur d'expression, ou que le vecteur d'expression lui-même ait été injecté par voie intramusculaire ou par voie intra dermique, ou que l'anticorps provienne du sérum d'un humain présentant une 5 pathologie auto-immune. Ils se comportent comme les motifs désolidarisés des substances cible, notamment des récepteurs solubles, et en particulier des récepteurs sur les cellules endothéliales. Ces anticorps de type 2 entrent en compétition avec le ligand de la substance cible et se 10 comportent comme des anticorps mimant ou neutralisant des ligands encore inconnus de la substance cible.

Alternativement il s'agit d'anticorps dirigés contre un récepteur d'une cellule endothéliale quand l'immunogène correspondant a été purifié à partir d'un milieu conditionné 15 d'une cellule susceptible d'interagir avec une cellule endothéliale.

III - Troisième immunisation: préparation des anticorps de type 3.

On injecte à des souris 10 pg d'un anticorps 2, tel qu'obtenu selon le procédé décrit dans le paragraphe précédent, en association avec 100 pl d'adjuvant complet de Freund. L'injection est répétée 15 et 30 jours après dans des conditions similaires, excepté que l'adjuvant est 25 remplacé par un adjuvant incomplet de Freund.

jours après la première injection, on injecte à des souris 10 pg d'anticorps par voie intrapéritonéale, sans adjuvant. 43 jours après, les souris sont sacrifiées et leurs rates sont prélevées et dilacérées dans du milieu 30 ISCOVE pour libérer les splénocytes. Les splénocytes sont fusionnés avec des cellules de myélome de souris, notamment des cellules SP2A ou AG8X 63, et incubés à raison de 100 000 cellules/puits.

La fusion s'effectue par ajout de 20 fois 50 pi de polyéthylène glycol (PEG) à 30 secondes d'intervalle. Quatre ml de milieu ISCOVE préchauffé à 37 C sont alors ajoutés goutte à goutte sur la suspension cellulaire, puis après une 5 période d'incubation de 4 minutes à 37 C, 4 ml sont ajoutés.

La suspension est centrifugée puis le culot cellulaire est alors repris dans 100 ml de milieu ISCOVE complémenté avec 20% de sérum de veau foetal et du HAT 1X (50X: Hypoxanthine 5 mM, Aminoptérine 20 pM et Thymidine 0,8 mM) et distribuée 10 à raison de 100 pl par puits sur les macrophages.

Après 5 jours, 100 pl de milieu HAT sont ajoutés, et, entre 8 et 14 jours, le milieu conditionné de chaque hybridome est prélevé pour mesurer les anticorps dirigés contre les anticorps anti-idiotypiques.

Les hybridomes sélectionnés par leur capacité à sécréter des anticorps dirigés contre des anticorps 2 sont alors clones, c'est-à-dire que les cellules sont ensemencées en condition de dilution limite (5 cellules/ml) sous un volume de 0,1 ml par puits. Le milieu est changé après 10 20 jours. Après 15 jours, certains puits contiennent des foyers de cellules qui se sont multipliées à partir de la cellule ensemencée au départ, donc toutes ces cellules sont identiques et sont issues du même clone. Quand la surface occupée par les cellules représente au moins la moitié de la 25 surface totale du puits, le milieu est prélevé et analysé comme précédemment. A ce stade, on peut sélectionner les clones producteurs d'anticorps et connaître leur spécificité pour les anticorps antiidiotypiques.

Une fois les clones identifiés, leur nature 30 monoclonale est affirmée par l'opération classique consistant à ensemencer une plaque de 96 puits avec des cellules issues du même clone diluées en conditions limites comme précédemment. Les clones sécréteurs doivent donc tous sécréter un anticorps de même spécificité pour que l'on déclare cet anticorps monoclonal.

Un troisième clonage est alors effectué pour s'assurer que les clones sont bien monoclonaux.

IV - Analyse des propriétés des anticorps de type 3.

1) Les anticorps 3 sont criblés par une batterie de tests, notamment par un test ELISA mesurant le titre des anticorps de type 3. Les fragments Fab des anticorps 2 tels 10 que préparés comme décrit précédemment sont tapissés dans du tampon carbonate 50 mM pH 9 à une dilution de 10 pg/ml. La surface des puits est ensuite incubée avec de la sérumalbumine à 0,5%. Les surnageants d'hybridomes sont ensuite incubés dans les boîtes et leur présence est révélée 15 par les anticorps anti-immunoglobulines de souris conjugués à la peroxydase.

Ces anticorps Ac3 reconnaissent des anticorps dirigés contre un ligand d'un motif présent sur les substances cibles, notamment un récepteur, en particulier des 20 récepteurs sur les cellules endothéliales quand l'immunogène utilisé est une cellule, une préparation membranaire, un constituant purifié, un fragment de protéine obtenue par transfection d'une séquence codante dans un vecteur d'expression, ou que le vecteur d'expression lui-même ait 25 été injecté par voie intramusculaire ou par voie intra dermique, ou que l'anticorps provienne du sérum d'un humain présentant une pathologie auto-immune. Ils se comportent comme les ligands des substances cibles. Ces anticorps Ac3 peuvent exercer une activité agoniste (voir plus bas) sur la 30 substance cible, en particulier des récepteurs sur les cellules endothéliales, en mimant l'action de ligands encore inconnus.

Alternativement il s'agit d'anticorps dirigés contre un récepteur d'une cellule endothéliale quand l'immunogène correspondant a été purifié à partir d'un milieu conditionné d'une cellule susceptible d'interagir avec une cellule endothéliale et il peut exercer soit une action agoniste (stimulatrice) soit antagoniste (inhibitrice) de la fonction du récepteur.

2) Validation des anticorps monoclonaux.

Les anticorps monoclonaux sont criblés par le test ELISA de type 3 et leur caractérisation fonctionnelle se 10 fait en 2 temps a) Caractérisation des anticorps monoclonaux anticellule endothéliale.

La mesure de l'activité de liaison des anticorps de type 3 sur les cellules endothéliales est effectuée 15 indistinctement sur le sérum prélevé ou les surnageants des hybridomes.

- ELISA sur cellules endothéliales.

000 cellules HUVEC (cellules endothéliales de veine de cordon ombilical humain) sont ensemencées par puits dans 20 des plaques 96 puits (100 pl /puits) dans du milieu EGM (Clonetics) contenant 5% de sérum de veau fetal. Après 36 h, les cellules sous-confluentes sont rincées 3 fois dans une solution de PBS contenant 0, 05% de Tween 20. Les sites potentiels de liaison non spécifique des anticorps sont 25 bloqués par incubation dans une solution de glycine 1 M, pH 8,1 (2h à température ambiante) suivie de 3 lavages (PBS/Tween 0,05%) et d'une incubation d'une nuit à 4 C dans une solution d'IgG irrelevantes à 10 pg/ml dans du PBS. La solution de blocage est éliminée, puis les anticorps à 30 tester sont ajoutés. Après 2 h d'incubation à température ambiante, les cellules sont lavées 3 fois en PBS / Tween 0,05% pour éliminer les anticorps non fixés. Les complexes cellules-anticorps sont incubés pendant 1 heure en présence d'un anticorps secondaire anti-souris couplé à la péroxydase (Amersham NA 931) dilué au 1 / 4000 dans du PBS contenant 0,05% de Tween et 0,5% de BSA. Après 3 lavages (PBS / Tween 0,05%), le substrat de la péroxydase (OPD Sigma) est ajouté à raison de 100 pl/puits. Après 10 à 30 min d'incubation à 5 l'abri de la lumière, la réaction colorimétrique est stoppée par ajout de 100 pi de H2SO4 4M. L'intensité du signal est mesurée par spectrophotométrie à 490 nm.

- Cytométrie Le surnageant (ou le sérum) à tester est incubé avec 10 des cellules HUVEC pendant 45 minutes à 4 C. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois dans du PBS-BSA 0,02%. Un deuxième anticorps anti-IgG de souris couplé à la fluorescéine isothiocyanate est rajouté sur les cellules (F877, Sigma Immuno Chemicals). L'intensité de fluorescence 15 des cellules est mesurée par cytométrie de flux en utilisant des cellules HUVEC comme cellules cibles.

- Isotypage.

La caractérisation isotypique de chaque clone est mesurée à l'aide du test rapide d'isotypage des anticorps 20 murins MABTEST (Adiatec).

b) Caractérisation des anticorps monoclonaux stimulant ou inhibant la fonction des cellules endothéliales.

Une fois les anticorps anti cellules endothéliales 25 sélectionnés par ELISA et cytométrie de flux, leur fonction pro ou anti-angiogénique est analysée.

- Prolifération.

Des plaques de 12 puits sont ensemencées avec des cellules HUVEC à faible densité (5000 à 10000 30 cellules/puits), dans du milieu EBM (Clonetics) contenant 5% de sérum. Après 24 heures, la prolifération des cellules est stimulée par ajout d'anticorps de la présente invention en présence ou absence de facteur angiogénique tel que FGF2 ou VEGF. Les cellules sont restimulées après 48 heures et puis, après un total de cinq jours en culture, les cellules sont trypsinisées et comptées avec un compteur Coulter.

Ainsi un anticorps peut soit inhiber soit stimuler la prolifération quand il est utilisé seul ou en conjonction avec un facteur angiogénique.

- Angiogenèse in vitro.

Le collagène utilisé dans ce test a été produit dans notre laboratoire: quatre queues de rat ont été dépiautées et disséquées pour récupérer les faisceaux blancs qui sont 10 constitués en majeure partie de collagène de type I. Le collagène est extrait de ces fibres dans 50ml d'acide acétique 0.5M froid et agités sur une nuit. Le liquide est ensuite centrifugé à 5000g pendant 40 minutes et le surnageant est récupéré. L'extraction est refaite une fois 15 avec 20ml d'acide acétique, les surnageants sont mélangés et puis dialysés contre 11 d'acide acétique 0.2M. La concentration en collagène est ajustée à 3 mg/ml par pesée.

La préparation des gels pour l'angiogenèse in vitro s'effectue sur de la glace pour conserver la solution de 20 collagène sous forme liquide. Un ml de collagène (5 mg/ml) est mélangé à 0,5 ml de DMEM 10X (contenant une concentration 0lX en antibiotiques et en glutamine), 0,9 ml de H20 stérile et 0,1 ml de bicarbonate de sodium 1M. Une fois le pH ajusté à 7, 4, il est ajouté un volume égal de 25 matrigel (Becton Dickinson).

Le gel est coulé dans des puits de culture (2 mm d'épaisseur) et incubé à 37 C pour se solidifier. Les cellules HUVEC sont rajoutées après 15 minutes (100 000 cellules/cm2) sur la surface du gel. Après 2 h, les 30 différents facteurs solubles sont ajoutés et les cellules sont observées et photographiées après 24 h. - Tumoriqenèse.

000 cellules de mélanome B16 sont injectées en sous-cutané à des souris C57BL/6. 8 jours après, quand les tumeurs ont donné naissance à des nodules palpables, les anticorps sont injectés 2 fois par semaine par voie intrapéritonéale à la dose de 50 pg dilués dans 200 pl de PBS. Le volume de la tumeur est mesuré 2 fois par semaine au 5 pied à coulisse et exprimé par la formule V= _ x L x 12 (L et 1 désignant respectivement la plus grande et la plus petite dimension).

Un anticorps favorisant la croissance tumorale sera dit proangiogénique, un anticorps inhibant la croissance 10 tumorale sera dit antiangiogénique.

c) Identification des antigènes reconnus par les anticorps monoclonaux.

Les anticorps monoclonaux sont purifiés par une technique conventionnelle (par exemple protéine A sepharose) 15 et couplés à une matrice de sepharose activée par le CNBr à raison de 5 mg d'anticorps par ml de gel. L'immunogène de départ, soit les membranes des cellules endothéliales, soit le milieu conditionné des cellules interagissant avec les cellules endothéliales est déposé sur cette colonne 20 d'immunoadsorbant. Après rinçage, les constituants accrochés à cette colonne sont élués par un tampon acide ou basique et leur séquence est analysée par une technique conventionnelle.

Ainsi, l'obtention des anticorps 3 permet d'identifier 25 la nature moléculaire de l'immunogène ayant servi à générer l'anticorps Acl, c'està-dire respectivement un récepteur endothélial ou un ligand sécrété par une cellule interagissant avec une cellule endothéliale.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1) Procédé de préparation d'anticorps mimétiques d'une substance, à l'exception de tout procédé de traitement thérapeutique ou chirurgical, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes suivantes: (i) on administre à un troisième hôte capable de réagir immunologiquement à cette administration, une composition d'anticorps (Ac2) dirigée contre des anticorps (Acl), lesdits anticorps Ac2 ayant été préalablement purifiés à partir du sang 10 d'un deuxième hôte capable de réagir immunologiquement à l'administration desdits anticorps Acl, lesdits anticorps Acl ayant été préalablement administrés audit deuxième hôte après avoir été préalablement purifiés à partir du sang d'un premier hôte capable de réagir immunologiquement à l'administration 15 d'une substance cible, immunogène ou rendue immunogène, ledit premier hôte ayant été préalablement immunisé par administration de ladite substance cible, immunogène ou rendue immunogène; (ii) on prépare à partir dudit troisième hôte une troisième 20 composition d'anticorps (Ac3) dirigée contre les anticorps (Ac2) de la deuxième composition, (iii) on sacrifie ledit troisième hôte, et (iv) éventuellement, on analyse les propriétés des anticorps de ladite troisième composition.

2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape (iv) l'analyse des propriétés de l'anticorps est réalisée par rapport aux propriétés de la substance cible.

3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les anticorps (Acl, Ac2, Ac3) de chacune desdites compositions sont des anticorps 30 polyclonaux, des anticorps monoclonaux ou fragments de ceuxci, des anticorps chimériques comme des anticorps humanisés.

4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la substance cible est toute substance immunogène ou rendue immunogène, comme un antigène ou mélange d'antigènes, un extrait protéique, des cellules, partie ou constituant purifiés de cellules, un vecteur d'expression de protéine.

5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 5 caractérisé en ce que la substance cible est choisie parmi des cellules endothéliales cultivées in vitro en présence d'un facteur angiogénique tel qu'un membre de la famille du FGF ou du VEGF, des membranes purifiées à partir de ces cellules endothéliales, des constituants purifiés à partir des membranes de cellules endothéliales, du milieu conditionné de cellules en culture exerçant une 10 activité sur des cellules endothéliales.

6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la substance cible est l'un des partenaires d'un couple de substances complémentaires.

7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la substance 15 cible est un récepteur ou un ligand d'un récepteur.

8) Un anticorps (Ac3) susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il imite l'image d'un anticorps idiotypique (Acl) dirigé contre une substance cible immunogène ou rendu immunogène.

9) Un anticorps selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il constitue un inhibiteur d'un processus biologique dont est responsable ladite substance cible.

10) Un anticorps selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il constitue un activateur d'un processus biologique dont est responsable ladite substance 25 cible.

11) Une composition comprenant un ou plusieurs anticorps identiques ou

différents selon l'une des revendications 8 à 10.