FR2858326A1 - Preparing antibodies that mimic a selected substance, useful particularly for activating or inhibiting biological processes, e.g. for inhibiting angiogenesis, comprises series of three immunizations - Google Patents

Abstract

Preparing non-therapeutic and non-surgical antibodies (Ac3) that mimic a substance (I), is new. Non-therapeutic and non-surgical process for preparing antibodies (Ac3) that mimic a substance (I) comprises: (a) administering to a third host an antibody composition (Ac2), directed against an antibody (Ac1), where Ac2 has been purified from the blood of a second host that has reacted immunologically to administration of Ac1 (which itself has been purified from the blood of a first host immunized with (I) that was, or had been made, immunogenic); (b) allowing Ac3 to form in the third host; (c) killing the third host; and (d) optionally analyzing the properties of antibodies in Ac3. An independent claim is also included for Ac3 produced by the new method and imitating the image of (I). ACTIVITY : Antidiabetic; Ophthalmological; Antiarthritic; Cytostatic. No biological data given. MECHANISM OF ACTION : Inhibition of angiogenesis.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'ANTICORPS MIMETIQUES D'UNEPROCESS FOR PREPARING MIMETIC ANTIBODIES OF A

SUBSTANCE ET LES ANTICORPS AINSI OBTENUS  SUBSTANCE AND ANTIBODIES THUS OBTAINED

L'invention concerne la préparation d'anticorps 5 mimétiques d'une substance cible et donc capables d'inhiber ou d'activer un processus biologique dont est responsable cette substance.  The invention relates to the preparation of mimetic antibodies of a target substance and thus capable of inhibiting or activating a biological process for which this substance is responsible.

On connaît dans l'art antérieur, la préparation d'anticorps (Acl) notamment monoclonaux spécifiques d'une 10 substance cible immunogène et utiles tant dans le domaine thérapeutique que du diagnostic ou encore pour transporter des molécules d'intérêts vers des cellules cibles à partir desquelles lesdits anticorps ont été fabriqués.  In the prior art, the preparation of antibodies (Acl) in particular monoclonal specific for an immunogenic target substance and useful both in the therapeutic field and in the diagnosis or for transporting molecules of interest to target cells is known. from which said antibodies were made.

On connaît également dans l'art antérieur la 15 préparation des anticorps anti-idiotypique (Ac2), notamment monoclonaux destinés à mimer la substance cible immunogène à partir de laquelle ont été préparés les premiers anticorps (Acl), et utiles également tant dans le domaine thérapeutique que du diagnostic ou encore pour transporter 20 des molécules d'intérêt.  It is also known in the prior art the preparation of anti-idiotypic (Ac2) antibodies, in particular monoclonal antibodies intended to mimic the immunogenic target substance from which the first antibodies (Acl) have been prepared, and which are also useful both in the field. therapeutic or diagnostic, or to transport molecules of interest.

La Demanderesse a maintenant mis au point une technique de triple immunisation permettant de préparer des anticorps (Ac3) mimétiques d'une substance cible et donc 25 capables d'inhiber ou d'activer un processus biologique dont est responsable cette substance.  The Applicant has now developed a triple immunization technique for preparing antibodies (Ac3) mimicking a target substance and therefore capable of inhibiting or activating a biological process which is responsible for this substance.

Ce but est atteint grâce à un procédé de préparation d'anticorps mimétiques d'une substance, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivants: (i) on administre une substance cible, immunogène ou rendue immunogène, à un premier hôte capable de réagir immunologiquement à cette administration, et (ii) on prépare à partir dudit hôte une première composition d'anticorps dirigée contre ladite substance, puis (iii) on administre ladite première composition 5 d'anticorps à un deuxième hôte capable de réagir immunologiquement à ladite administration, et (iv) on prépare à partir dudit deuxième hôte une deuxième composition d'anticorps dirigée contre les anticorps de la première composition, puis (v) on administre ladite deuxième composition d'anticorps à un troisième hôte capable de réagir immunologiquement à cette administration, et (vi) on prépare à partir dudit troisième hôte une troisième composition d'anticorps dirigée contre les 15 anticorps de la deuxième composition, et (vii) éventuellement, on analyse les propriétés des anticorps de ladite troisième composition par exemple par rapport à celles de la substance cible.  This object is achieved by means of a process for the preparation of mimetic antibodies of a substance, characterized in that it comprises the following steps: (i) a target substance, immunogenic or rendered immunogenic, is administered to a first host capable of immunologically react to this administration, and (ii) a first antibody composition directed against said substance is prepared from said host, and then (iii) said first antibody composition is administered to a second host capable of immunologically reacting to said administration, and (iv) a second antibody composition directed against the antibodies of the first composition is prepared from said second host, and then (v) said second antibody composition is administered to a third host capable of immunologically reacting thereto. administration, and (vi) a third anti-antibody antibody composition is prepared from said third host. s of the second composition, and (vii) optionally, the properties of the antibodies of said third composition are analyzed, for example with respect to those of the target substance.

On entend par composition d'anticorps, tant des 20 anticorps polyclonaux que des anticorps monoclonaux ou fragments de ceux-ci, de même que des anticorps chimériques, comme des anticorps humanisés.  By antibody composition is meant both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies or fragments thereof, as well as chimeric antibodies, such as humanized antibodies.

Ainsi la présente invention se rapporte à un anticorps (Ac3) imitant l'image d'un anticorps idiotypique (Acl) 25 dirigé contre une substance immunogène ou rendu immunogène.  Thus the present invention relates to an antibody (Ac3) imitating the image of an idiotypic antibody (Acl) directed against an immunogenic substance or rendered immunogenic.

L'avantage des anticorps de type 3 (Ac3) par rapport aux anticorps de type 1 réside dans le fait que la succession d'immunisations permet, grâce à la restriction idiotypique, d'obtenir une sélection rapide d'anticorps 30 dirigés contre des structures conformationnelles plus que contre des séquences de l'antigène considéré. Cette stratégie permet aussi d'identifier les antigènes reconnus par les anticorps naturels et fonctionnels, en particulier les anticorps anti cellules endothéliales présents chez certains malades.  The advantage of the type 3 antibodies (Ac3) over the type 1 antibodies lies in the fact that the succession of immunizations makes it possible, thanks to the idiotypic restriction, to obtain a rapid selection of antibodies directed against structures conformational rather than against sequences of the antigen under consideration. This strategy also makes it possible to identify the antigens recognized by the natural and functional antibodies, in particular the endothelial cell antibodies present in certain patients.

La substance cible de la première administration (i) peut être toute substance immunogène ou rendue immunogène, 5 comme un antigène ou mélange d'antigènes, un extrait protéique, des cellules ou partie de cellule, par exemple un récepteur ou un ligand d'un récepteur.  The target substance of the first administration (i) may be any immunogenic or immunogenic substance, such as an antigen or mixture of antigens, a protein extract, cells or part of a cell, for example a receptor or a ligand of a receiver.

La substance cible est ainsi par exemple l'un des partenaires d'un couple de substances complémentaires, comme 10 un couple récepteur ligand.  The target substance is thus for example one of the partners of a pair of complementary substances, such as a ligand receptor pair.

Les hôtes auxquels sont administrées les compositions d'anticorps de chaque étape du procédé ci-dessus peuvent identiques ou différents.  The hosts to which the antibody compositions of each step of the above process are administered may be the same or different.

L'invention concerne aussi un anticorps mimétique 15 (Ac3) d'une substance cible comme défini précédemment et donc susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus. Cet anticorps peut constituer un inhibiteur ou un activateur d'un processus biologique dont est responsable ladite substance cible.  The invention also relates to a mimetic antibody (Ac3) of a target substance as defined above and thus obtainable by the above method. This antibody may be an inhibitor or activator of a biological process for which said target substance is responsible.

Ces anticorps (Ac3) sont utiles tant dans le domaine thérapeutique que du diagnostic ou encore pour transporter des molécules d'intérêt.  These antibodies (Ac3) are useful in the therapeutic field as well as in the diagnosis or for transporting molecules of interest.

L'invention se rapporte donc aussi aux compositions pharmaceutiques comprenant un ou plusieurs anticorps (Ac3) 25 ci-dessus.  The invention thus also relates to pharmaceutical compositions comprising one or more antibodies (Ac3) above.

L'invention trouve en particulier un intérêt pour obtenir des anticorps spécifiques de cellules cibles, notamment de cellules endothéliales.  The invention finds particular interest in obtaining antibodies specific for target cells, especially endothelial cells.

Les cellules endothéliales tapissent l'intérieur de 30 tous les vaisseaux sanguins de l'organisme. Ces cellules ont un phénotype quiescent, elles ne prolifèrent quasiment pas.  Endothelial cells line the interior of all the blood vessels of the body. These cells have a quiescent phenotype, they hardly proliferate.

En effet, seulement 0,01% des cellules endothéliales sont engagées dans la division cellulaire à un moment donné. Le rôle physiologique des cellules endothéliales est très vaste, elles participent à de nombreux phénomènes vitaux pour l'organisme: coagulation sanguine, maintien de la pression artérielle, recrutement de cellules circulantes, synthèse de facteurs de croissance. Quand un territoire 5 requiert un apport accru en oxygène et en nutriments, il réagit en relarguant des facteurs solubles qui convertissent le phénotype des cellules endothéliales en un phénotype activé, et des facteurs mitogènes pour les cellules endothéliales de phénotype activé. Ces cellules 10 endothéliales acquièrent enfin un phénotype angiogénique et deviennent capables d'effectuer le programme d'angiogenèse, c'est-à-dire le développement de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau préexistant. Ce phénomène est normal et contrôlé lors d'une blessure ou dans la maturation du corps 15 jaune de l'ovaire. En revanche, il devient dangereux dans des situations pathologiques où l'angiogenèse n'est plus contrôlée, par exemple dans la rétinopathie diabétique, la polyarthrite et le développement tumoral.  Indeed, only 0.01% of endothelial cells are involved in cell division at any given time. The physiological role of endothelial cells is very large, they participate in many vital phenomena for the body: blood coagulation, maintenance of blood pressure, recruitment of circulating cells, synthesis of growth factors. When a territory requires an increased supply of oxygen and nutrients, it reacts by releasing soluble factors that convert the endothelial cell phenotype into an activated phenotype, and mitogenic factors for activated phenotype endothelial cells. These endothelial cells finally acquire an angiogenic phenotype and become capable of performing the angiogenesis program, i.e. the development of new blood vessels from the preexisting network. This phenomenon is normal and controlled during an injury or in the maturation of the yellow body of the ovary. On the other hand, it becomes dangerous in pathological situations where angiogenesis is no longer controlled, for example in diabetic retinopathy, polyarthritis and tumor development.

Il est donc utile de disposer d'agents spécifiques des 20 cellules endothéliales et capables de détruire les vaisseaux associés à ces pathologies.  It is therefore useful to have specific endothelial cell agents capable of destroying the vessels associated with these pathologies.

Ce but est atteint grâce aux anticorps selon l'invention qui sont des mimétiques de ligands activant ou inhibant la prolifération de ces cellules. Dans cette 25 application aux cellules endothéliales, la substance cible est avantageusement choisie parmi: - Des cellules endothéliales cultivées in vitro en présence d'un facteur angiogénique tel qu'un membre de la famille du FGF ou du VEGF.  This goal is achieved thanks to the antibodies according to the invention which are ligand mimetics activating or inhibiting the proliferation of these cells. In this application to endothelial cells, the target substance is advantageously chosen from: Endothelial cells cultured in vitro in the presence of an angiogenic factor such as a member of the FGF or VEGF family.

- Des membranes purifiées à partir de ces cellules endothéliales.  Membranes purified from these endothelial cells.

- Des constituants purifiés à partir des membranes de cellules endothéliales.  Constituents purified from endothelial cell membranes.

- Du milieu conditionné de cellules en culture exerçant une activité sur des cellules endothéliales.  Conditioned medium of cultured cells exerting activity on endothelial cells.

- Des vecteurs d'expression de protéines, choisis notamment parmi la famille du pcDNA 3, contenant une 5 séquence d'intérêt. Cette séquence peut avoir été sélectionnée dans des banques publiées comme une séquence homologue à un récepteur ou à un ligand connu.  Protein expression vectors, chosen in particular from the family of pcDNA 3, containing a sequence of interest. This sequence may have been selected from published libraries as a sequence homologous to a known receptor or ligand.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention 10 apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation d'anticorps mimétiques de substances cibles constituées par des cellules endothéliales ou partie de celles-ci ou encore de molécule ou de composé capable d'interagir avec ces cellules endothéliales. 15 I - Immunisation primaire.  Other advantages and characteristics of the invention will become apparent from the following examples relating to the preparation of mimetic antibodies of target substances consisting of endothelial cells or part thereof or of a molecule or compound capable of interacting with these substances. endothelial cells. I - Primary immunization.

1) Immunisation chez un animal de laboratoire, par  1) Immunization in a laboratory animal, by

exemple la souris.example the mouse.

souris Balbc de 6 semaines sont immunisées par une 20 injection par voie sous-cutanée de 100 pl de PBS contenant pg de la substance cible choisie et de 100 pl d'adjuvant de Freund complet (Sigma). Alternativement 1-5 x 106 cellules endothéliales peuvent être injectées par voie intrapéritonéale. Alternativement 100 pg de plasmide peut 25 être injecté par voie intradermique ou intramusculaire. 15 et 30 jours après, les souris reçoivent une injection du même produit par une voie identique, excepté que l'adjuvant complet est remplacé par de l'adjuvant incomplet. Entre les Jours 40 et 50, l'évaluation de la réponse de chaque souris 30 à l'immunisation est faite par ELISA à partir d'un prélèvement de sérum.  6 week Balbc mice are immunized by subcutaneous injection of 100 μl of PBS containing pg of the selected target substance and 100 μl of complete Freund's adjuvant (Sigma). Alternatively 1-5 x 10 6 endothelial cells can be injected intraperitoneally. Alternatively 100 μg of plasmid can be injected intradermally or intramuscularly. 15 and 30 days later, the mice are injected with the same product by an identical route, except that the complete adjuvant is replaced by incomplete adjuvant. Between Days 40 and 50, evaluation of the response of each mouse to immunization is made by ELISA from a serum sample.

Le sang des animaux présentant les titres les plus élevés d'anticorps est prélevé par ponction transcutanée et les immunoglobulines sont purifiées par chromatographie d'affinité pour la protéine A. 2) Immunoglobulines humaines.  The blood of the animals with the highest titres of antibodies is taken by transcutaneous puncture and the immunoglobulins are purified by affinity chromatography for protein A. 2) Human immunoglobulins.

Certains malades affectés de pathologies, en 5 particulier auto-immunes, présentent dans leur sérum un titre élevé en anticorps dirigés contre la substance cible, comme cela peut-être le cas vis-à-vis d'anticorps visant les cellules endothéliales. Ces anticorps peuvent être purifiés du sérum par chromatographie sur protéine A et utilisés 10 comme anticorps de première immunisation.  Some patients with pathologies, particularly autoimmune, have high levels of antibodies to the target substance in their serum, as may be the case with endothelial cell antibodies. These antibodies can be purified from the serum by protein A chromatography and used as the first immunization antibody.

A l'issue de la purification des lots d'anticorps 1, les fragments Fab sont préparés par une technique classique comportant une étape de clivage à la papaïne et une purification par protéine A sepharose (les fragments Fab 15 n'étant pas retenus alors que les fragments Fc et les IgG non clivées le sont).  After the purification of the batches of antibodies 1, the Fab fragments are prepared by a conventional technique comprising a step of cleavage with papain and purification by protein A sepharose (the Fab fragments are not retained whereas uncleaved Fc and IgG fragments are).

Ces anticorps de type 1 reconnaissent soit un motif présent sur la substance cible, notamment un récepteur, en particulier des récepteurs sur les cellules endothéliales, 20 quand l'immunogène utilisé est une cellule, une préparation membranaire, un constituant purifié, un fragment de protéine obtenu par transfection d'une séquence codante dans un vecteur d'expression, ou que le vecteur d'expression luimême a été injecté dans le muscle ou par voie intra 25 dermique, ou que l'anticorps provienne du sérum d'un humain présentant une pathologie auto-immune. Il peut s'agir d'un anticorps dirigé contre la substance cible, en particulier un ligand d'une cellule endothéliale, quand l'immunogène correspond à un milieu conditionné de la substance cible, en 30 particulier dans le cas d'une cellule susceptible d'interagir avec une cellule endothéliale.  These type 1 antibodies recognize either a motif present on the target substance, in particular a receptor, in particular receptors on endothelial cells, when the immunogen used is a cell, a membrane preparation, a purified component, a protein fragment obtained by transfection of a coding sequence into an expression vector, or that the expression vector itself has been injected into the muscle or intradermally, or that the antibody originates from the serum of a human with autoimmune pathology. It may be an antibody directed against the target substance, in particular a ligand of an endothelial cell, when the immunogen corresponds to a conditioned medium of the target substance, in particular in the case of a cell capable of to interact with an endothelial cell.

II - Deuxième immunisation: préparation des anticorps de type 2.  II - Second immunization: preparation of type 2 antibodies.

On injecte à des souris par voie sous-cutanée 10 pg d'un anticorps polyclonal dirigé contre la substance cible, ledit anticorps étant obtenu selon lors de l'immunisation primaire décrit ci-dessus.  Mice are injected subcutaneously with 10 μg of a polyclonal antibody directed against the target substance, said antibody being obtained according to the primary immunization described above.

15 et 30 jours après, les souris reçoivent une injection du même produit par une voie identique, excepté que l'adjuvant complet est remplacé par de l'adjuvant incomplet. Entre les Jours 40 et 50, l'évaluation de la réponse de chaque souris immunisée est faite par ELISA à 10 partir d'un prélèvement de sérum.  15 and 30 days later, the mice are injected with the same product by an identical route, except that the complete adjuvant is replaced by incomplete adjuvant. Between Days 40 and 50, the evaluation of the response of each immunized mouse is made by ELISA from a serum sample.

Les titres d'anticorps 2 sont évalués dans les sérums des souris par un ELISA de type 2 Les fragments Fab des anticorps 1 sont tapissés dans du tampon carbonate 50 mM pH 9 à une dilution de 0,1-10 15 pg/ml. La surface des puits est ensuite incubée avec de la sérumalbumine à 0,5%. Les sérums sont ensuite incubés dans les boîtes et leur présence est révélée par les anticorps anti-immunoglobulines de souris conjugués à la peroxydase.  Antibody titers 2 are evaluated in mouse sera by ELISA type 2 Fab fragments of antibodies 1 are lined in 50 mM carbonate buffer pH 9 at a dilution of 0.1-10 μg / ml. The surface of the wells is then incubated with 0.5% serum albumin. The sera are then incubated in the dishes and their presence is revealed by the anti-mouse immunoglobulin antibodies conjugated to peroxidase.

Une fois les titres déterminés le sang est recueilli 20 par ponction veineuse des souris, le sérum préparé et les IgG purifiées par chromatographie d'affinité pour la protéine A sepharose.  Once the titers were determined, the blood was collected by venipuncture from the mice, the serum prepared, and the IgG purified by affinity chromatography for protein A sepharose.

A l'issue de la purification des lots d'anticorps 2, les fragments Fab sont préparés par une technique classique 25 comportant une étape de clivage à la papaïne et une purification par protéine A sepharose (les fragments Fab n'étant pas retenus alors que les fragments Fc et les IgG non clivées le sont).  At the end of the purification of the antibody lots 2, the Fab fragments are prepared by a conventional technique comprising a papain cleavage step and purification by protein A Sepharose (the Fab fragments not being retained whereas uncleaved Fc and IgG fragments are).

Ces anticorps de type 2 reconnaissent des anticorps 30 dirigés contre un motif présent sur la substance cible, notamment un récepteur, en particulier des récepteurs sur les cellules endothéliales, quand l'immunogène utilisé est une cellule, une préparation membranaire, un constituant purifié, un fragment de protéine obtenu par transfection d'une séquence codante dans un vecteur d'expression, ou que le vecteur d'expression lui-même ait été injecté par voie intramusculaire ou par voie intra dermique, ou que l'anticorps provienne du sérum d'un humain présentant une 5 pathologie auto-immune. Ils se comportent comme les motifs désolidarisés des substances cible, notamment des récepteurs solubles, et en particulier des récepteurs sur les cellules endothéliales. Ces anticorps de type 2 entrent en compétition avec le ligand de la substance cible et se 10 comportent comme des anticorps mimant ou neutralisant des ligands encore inconnus de la substance cible.  These type 2 antibodies recognize antibodies directed against a motif present on the target substance, in particular a receptor, in particular receptors on endothelial cells, when the immunogen used is a cell, a membrane preparation, a purified constituent, a a protein fragment obtained by transfection of a coding sequence into an expression vector, or that the expression vector itself has been injected intramuscularly or intradermally, or that the antibody originates from the serum of a human with an autoimmune pathology. They behave as unconnected motifs of the target substances, in particular soluble receptors, and in particular receptors on endothelial cells. These type 2 antibodies compete with the ligand of the target substance and behave as antibodies mimicking or neutralizing ligands still unknown to the target substance.

Alternativement il s'agit d'anticorps dirigés contre un récepteur d'une cellule endothéliale quand l'immunogène correspondant a été purifié à partir d'un milieu conditionné 15 d'une cellule susceptible d'interagir avec une cellule endothéliale.  Alternatively, they are antibodies directed against a receptor of an endothelial cell when the corresponding immunogen has been purified from a conditioned medium of a cell capable of interacting with an endothelial cell.

III - Troisième immunisation: préparation des anticorps de type 3.  III - Third immunization: preparation of type 3 antibodies.

On injecte à des souris 10 pg d'un anticorps 2, tel qu'obtenu selon le procédé décrit dans le paragraphe précédent, en association avec 100 pl d'adjuvant complet de Freund. L'injection est répétée 15 et 30 jours après dans des conditions similaires, excepté que l'adjuvant est 25 remplacé par un adjuvant incomplet de Freund.  Mice were injected with 10 μg of antibody 2, as obtained according to the method described in the previous paragraph, in combination with 100 μl of complete Freund's adjuvant. The injection is repeated 15 and 30 days later under similar conditions except that the adjuvant is replaced by an incomplete Freund's adjuvant.

jours après la première injection, on injecte à des souris 10 pg d'anticorps par voie intrapéritonéale, sans adjuvant. 43 jours après, les souris sont sacrifiées et leurs rates sont prélevées et dilacérées dans du milieu 30 ISCOVE pour libérer les splénocytes. Les splénocytes sont fusionnés avec des cellules de myélome de souris, notamment des cellules SP2A ou AG8X 63, et incubés à raison de 100 000 cellules/puits.  days after the first injection, mice were injected with 10 μg of antibody intraperitoneally, without adjuvant. 43 days later, the mice are sacrificed and their spleens removed and dilated in ISCOVE medium to release the splenocytes. The splenocytes are fused with mouse myeloma cells, in particular SP2A or AG8X 63 cells, and incubated at a rate of 100,000 cells / well.

La fusion s'effectue par ajout de 20 fois 50 pi de polyéthylène glycol (PEG) à 30 secondes d'intervalle. Quatre ml de milieu ISCOVE préchauffé à 37 C sont alors ajoutés goutte à goutte sur la suspension cellulaire, puis après une 5 période d'incubation de 4 minutes à 37 C, 4 ml sont ajoutés.  The fusion is carried out by adding 20 times 50 μl of polyethylene glycol (PEG) at 30 seconds intervals. Four ml of ISCOVE medium preheated to 37 ° C. are then added dropwise to the cell suspension, and after an incubation period of 4 minutes at 37 ° C., 4 ml are added.

La suspension est centrifugée puis le culot cellulaire est alors repris dans 100 ml de milieu ISCOVE complémenté avec 20% de sérum de veau foetal et du HAT 1X (50X: Hypoxanthine 5 mM, Aminoptérine 20 pM et Thymidine 0,8 mM) et distribuée 10 à raison de 100 pl par puits sur les macrophages.  The suspension is centrifuged and the cell pellet is then taken up in 100 ml of ISCOVE medium supplemented with 20% fetal calf serum and 1X HAT (50X: 5 mM hypoxanthine, 20 μM Aminopterin and 0.8 mM Thymidine) and distributed. at a rate of 100 μl per well on macrophages.

Après 5 jours, 100 pl de milieu HAT sont ajoutés, et, entre 8 et 14 jours, le milieu conditionné de chaque hybridome est prélevé pour mesurer les anticorps dirigés contre les anticorps anti-idiotypiques.  After 5 days, 100 μl of HAT medium is added, and between 8 and 14 days the conditioned medium of each hybridoma is removed to measure the antibodies against the anti-idiotypic antibodies.

Les hybridomes sélectionnés par leur capacité à sécréter des anticorps dirigés contre des anticorps 2 sont alors clones, c'est-à-dire que les cellules sont ensemencées en condition de dilution limite (5 cellules/ml) sous un volume de 0,1 ml par puits. Le milieu est changé après 10 20 jours. Après 15 jours, certains puits contiennent des foyers de cellules qui se sont multipliées à partir de la cellule ensemencée au départ, donc toutes ces cellules sont identiques et sont issues du même clone. Quand la surface occupée par les cellules représente au moins la moitié de la 25 surface totale du puits, le milieu est prélevé et analysé comme précédemment. A ce stade, on peut sélectionner les clones producteurs d'anticorps et connaître leur spécificité pour les anticorps antiidiotypiques.  Hybridomas selected by their ability to secrete antibodies directed against antibodies 2 are then cloned, that is to say that the cells are seeded under limiting dilution conditions (5 cells / ml) in a volume of 0.1 ml. per well. The medium is changed after 10 days. After 15 days, some wells contain foci of cells that have multiplied from the cell seeded initially, so all these cells are identical and are from the same clone. When the area occupied by the cells is at least half of the total area of the well, the medium is taken and analyzed as before. At this stage, the antibody producing clones can be selected and their specificity known for the antiidiotypic antibodies.

Une fois les clones identifiés, leur nature 30 monoclonale est affirmée par l'opération classique consistant à ensemencer une plaque de 96 puits avec des cellules issues du même clone diluées en conditions limites comme précédemment. Les clones sécréteurs doivent donc tous sécréter un anticorps de même spécificité pour que l'on déclare cet anticorps monoclonal.  Once the clones have been identified, their monoclonal nature is asserted by the conventional procedure of inoculating a 96-well plate with cells from the same clone diluted under limiting conditions as before. Secreting clones must therefore all secrete an antibody of the same specificity for this monoclonal antibody to be declared.

Un troisième clonage est alors effectué pour s'assurer que les clones sont bien monoclonaux.  A third cloning is then performed to ensure that the clones are monoclonal.

IV - Analyse des propriétés des anticorps de type 3.  IV - Analysis of the properties of type 3 antibodies

1) Les anticorps 3 sont criblés par une batterie de tests, notamment par un test ELISA mesurant le titre des anticorps de type 3. Les fragments Fab des anticorps 2 tels 10 que préparés comme décrit précédemment sont tapissés dans du tampon carbonate 50 mM pH 9 à une dilution de 10 pg/ml. La surface des puits est ensuite incubée avec de la sérumalbumine à 0,5%. Les surnageants d'hybridomes sont ensuite incubés dans les boîtes et leur présence est révélée 15 par les anticorps anti-immunoglobulines de souris conjugués à la peroxydase.  1) The antibodies 3 are screened by a battery of tests, in particular by an ELISA test measuring the titre of the type 3 antibodies. The Fab fragments of the antibodies 2 as prepared as previously described are lined in 50 mM carbonate buffer pH 9 at a dilution of 10 μg / ml. The surface of the wells is then incubated with 0.5% serum albumin. The hybridoma supernatants are then incubated in the dishes and their presence is revealed by peroxidase conjugated anti-mouse immunoglobulin antibodies.

Ces anticorps Ac3 reconnaissent des anticorps dirigés contre un ligand d'un motif présent sur les substances cibles, notamment un récepteur, en particulier des 20 récepteurs sur les cellules endothéliales quand l'immunogène utilisé est une cellule, une préparation membranaire, un constituant purifié, un fragment de protéine obtenue par transfection d'une séquence codante dans un vecteur d'expression, ou que le vecteur d'expression lui-même ait 25 été injecté par voie intramusculaire ou par voie intra dermique, ou que l'anticorps provienne du sérum d'un humain présentant une pathologie auto-immune. Ils se comportent comme les ligands des substances cibles. Ces anticorps Ac3 peuvent exercer une activité agoniste (voir plus bas) sur la 30 substance cible, en particulier des récepteurs sur les cellules endothéliales, en mimant l'action de ligands encore inconnus.  These Ac3 antibodies recognize antibodies directed against a ligand of a motif present on the target substances, in particular a receptor, in particular receptors on the endothelial cells, when the immunogen used is a cell, a membrane preparation or a purified constituent. a protein fragment obtained by transfection of a coding sequence into an expression vector, or that the expression vector itself has been injected intramuscularly or intradermally, or that the antibody originates from the serum of a human presenting an autoimmune pathology. They behave like the ligands of the target substances. These Ac3 antibodies can exert agonist activity (see below) on the target substance, particularly receptors on endothelial cells, by mimicking the action of yet unknown ligands.

Alternativement il s'agit d'anticorps dirigés contre un récepteur d'une cellule endothéliale quand l'immunogène correspondant a été purifié à partir d'un milieu conditionné d'une cellule susceptible d'interagir avec une cellule endothéliale et il peut exercer soit une action agoniste (stimulatrice) soit antagoniste (inhibitrice) de la fonction du récepteur.  Alternatively, it is antibodies directed against a receptor of an endothelial cell when the corresponding immunogen has been purified from a conditioned medium of a cell capable of interacting with an endothelial cell and it can exert either a agonist (stimulatory) action is antagonistic (inhibitory) to the function of the receptor.

2) Validation des anticorps monoclonaux.  2) Validation of monoclonal antibodies.

Les anticorps monoclonaux sont criblés par le test ELISA de type 3 et leur caractérisation fonctionnelle se 10 fait en 2 temps a) Caractérisation des anticorps monoclonaux anticellule endothéliale.  The monoclonal antibodies are screened by the ELISA type 3 assay and their functional characterization is done in 2 steps. A) Characterization of endothelial cell monoclonal antibodies.

La mesure de l'activité de liaison des anticorps de type 3 sur les cellules endothéliales est effectuée 15 indistinctement sur le sérum prélevé ou les surnageants des hybridomes.  Measurement of the binding activity of type 3 antibodies to endothelial cells is performed indistinctly on the serum taken or hybridoma supernatants.

- ELISA sur cellules endothéliales.  - ELISA on endothelial cells.

000 cellules HUVEC (cellules endothéliales de veine de cordon ombilical humain) sont ensemencées par puits dans 20 des plaques 96 puits (100 pl /puits) dans du milieu EGM (Clonetics) contenant 5% de sérum de veau fetal. Après 36 h, les cellules sous-confluentes sont rincées 3 fois dans une solution de PBS contenant 0, 05% de Tween 20. Les sites potentiels de liaison non spécifique des anticorps sont 25 bloqués par incubation dans une solution de glycine 1 M, pH 8,1 (2h à température ambiante) suivie de 3 lavages (PBS/Tween 0,05%) et d'une incubation d'une nuit à 4 C dans une solution d'IgG irrelevantes à 10 pg/ml dans du PBS. La solution de blocage est éliminée, puis les anticorps à 30 tester sont ajoutés. Après 2 h d'incubation à température ambiante, les cellules sont lavées 3 fois en PBS / Tween 0,05% pour éliminer les anticorps non fixés. Les complexes cellules-anticorps sont incubés pendant 1 heure en présence d'un anticorps secondaire anti-souris couplé à la péroxydase (Amersham NA 931) dilué au 1 / 4000 dans du PBS contenant 0,05% de Tween et 0,5% de BSA. Après 3 lavages (PBS / Tween 0,05%), le substrat de la péroxydase (OPD Sigma) est ajouté à raison de 100 pl/puits. Après 10 à 30 min d'incubation à 5 l'abri de la lumière, la réaction colorimétrique est stoppée par ajout de 100 pi de H2SO4 4M. L'intensité du signal est mesurée par spectrophotométrie à 490 nm.  000 HUVEC cells (human umbilical cord vein endothelial cells) are inoculated per well in 96 well plates (100 μl / well) in EGM medium (Clonetics) containing 5% fetal calf serum. After 36 hours, the subconfluent cells are rinsed 3 times in a solution of PBS containing 0.05% Tween 20. The potential non-specific binding sites of the antibodies are blocked by incubation in a 1 M glycine solution, pH 8.1 (2h at room temperature) followed by 3 washes (PBS / Tween 0.05%) and overnight incubation at 4C in an irrelevant IgG solution at 10μg / ml in PBS. The blocking solution is removed, and the antibodies to be tested are added. After incubation for 2 h at room temperature, the cells are washed 3 times with PBS / 0.05% Tween to remove unbound antibodies. The cell-antibody complexes are incubated for 1 hour in the presence of a secondary anti-mouse antibody coupled to peroxidase (Amersham NA 931) diluted 1/4000 in PBS containing 0.05% Tween and 0.5% of BSA. After 3 washes (PBS / 0.05% Tween), the peroxidase substrate (OPD Sigma) is added at a rate of 100 μl / well. After 10 to 30 minutes of incubation in the dark, the colorimetric reaction is stopped by adding 100 μl of 4M H 2 SO 4. The intensity of the signal is measured spectrophotometrically at 490 nm.

- Cytométrie Le surnageant (ou le sérum) à tester est incubé avec 10 des cellules HUVEC pendant 45 minutes à 4 C. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois dans du PBS-BSA 0,02%. Un deuxième anticorps anti-IgG de souris couplé à la fluorescéine isothiocyanate est rajouté sur les cellules (F877, Sigma Immuno Chemicals). L'intensité de fluorescence 15 des cellules est mesurée par cytométrie de flux en utilisant des cellules HUVEC comme cellules cibles.  Cytometry The supernatant (or serum) to be tested is incubated with HUVEC cells for 45 minutes at 4 ° C. The cells are then washed 3 times in 0.02% PBS-BSA. A second anti-mouse IgG antibody coupled to fluorescein isothiocyanate is added to the cells (F877, Sigma Immuno Chemicals). The fluorescence intensity of the cells is measured by flow cytometry using HUVEC cells as target cells.

- Isotypage.- Isotyping.

La caractérisation isotypique de chaque clone est mesurée à l'aide du test rapide d'isotypage des anticorps 20 murins MABTEST (Adiatec).  The isotypic characterization of each clone is measured using the MABTEST (Adiatec) murine antibody rapid isotyping test.

b) Caractérisation des anticorps monoclonaux stimulant ou inhibant la fonction des cellules endothéliales.  b) Characterization of monoclonal antibodies stimulating or inhibiting the function of endothelial cells.

Une fois les anticorps anti cellules endothéliales 25 sélectionnés par ELISA et cytométrie de flux, leur fonction pro ou anti-angiogénique est analysée.  Once the endothelial cell antibodies have been selected by ELISA and flow cytometry, their pro or anti-angiogenic function is analyzed.

- Prolifération.- Proliferation.

Des plaques de 12 puits sont ensemencées avec des cellules HUVEC à faible densité (5000 à 10000 30 cellules/puits), dans du milieu EBM (Clonetics) contenant 5% de sérum. Après 24 heures, la prolifération des cellules est stimulée par ajout d'anticorps de la présente invention en présence ou absence de facteur angiogénique tel que FGF2 ou VEGF. Les cellules sont restimulées après 48 heures et puis, après un total de cinq jours en culture, les cellules sont trypsinisées et comptées avec un compteur Coulter.  12-well plates are inoculated with low density HUVEC cells (5000 to 10,000 cells / well) in EBM (Clonetics) medium containing 5% serum. After 24 hours, cell proliferation is stimulated by addition of antibodies of the present invention in the presence or absence of angiogenic factor such as FGF2 or VEGF. The cells are restimulated after 48 hours and then, after a total of five days in culture, the cells are trypsinized and counted with a Coulter counter.

Ainsi un anticorps peut soit inhiber soit stimuler la prolifération quand il est utilisé seul ou en conjonction avec un facteur angiogénique.  Thus an antibody can either inhibit or stimulate proliferation when used alone or in conjunction with an angiogenic factor.

- Angiogenèse in vitro.In vitro angiogenesis

Le collagène utilisé dans ce test a été produit dans notre laboratoire: quatre queues de rat ont été dépiautées et disséquées pour récupérer les faisceaux blancs qui sont 10 constitués en majeure partie de collagène de type I. Le collagène est extrait de ces fibres dans 50ml d'acide acétique 0.5M froid et agités sur une nuit. Le liquide est ensuite centrifugé à 5000g pendant 40 minutes et le surnageant est récupéré. L'extraction est refaite une fois 15 avec 20ml d'acide acétique, les surnageants sont mélangés et puis dialysés contre 11 d'acide acétique 0.2M. La concentration en collagène est ajustée à 3 mg/ml par pesée.  The collagen used in this test has been produced in our laboratory: four rat tails have been punctuated and dissected to recover the white bundles which consist mostly of type I collagen. The collagen is extracted from these fibers in 50 ml of 0.5M acetic acid cold and stirred on a night. The liquid is then centrifuged at 5000g for 40 minutes and the supernatant is recovered. Extraction is repeated once with 20 ml of acetic acid, the supernatants are mixed and then dialyzed against 11 ml of 0.2M acetic acid. The collagen concentration is adjusted to 3 mg / ml by weighing.

La préparation des gels pour l'angiogenèse in vitro s'effectue sur de la glace pour conserver la solution de 20 collagène sous forme liquide. Un ml de collagène (5 mg/ml) est mélangé à 0,5 ml de DMEM 10X (contenant une concentration 0lX en antibiotiques et en glutamine), 0,9 ml de H20 stérile et 0,1 ml de bicarbonate de sodium 1M. Une fois le pH ajusté à 7, 4, il est ajouté un volume égal de 25 matrigel (Becton Dickinson).  The preparation of the gels for in vitro angiogenesis is performed on ice to preserve the collagen solution in liquid form. One ml of collagen (5 mg / ml) is mixed with 0.5 ml of 10X DMEM (containing a 0.1X concentration of antibiotics and glutamine), 0.9 ml of sterile H20 and 0.1 ml of 1M sodium bicarbonate. Once the pH is adjusted to 7.4, an equal volume of matrigel (Becton Dickinson) is added.

Le gel est coulé dans des puits de culture (2 mm d'épaisseur) et incubé à 37 C pour se solidifier. Les cellules HUVEC sont rajoutées après 15 minutes (100 000 cellules/cm2) sur la surface du gel. Après 2 h, les 30 différents facteurs solubles sont ajoutés et les cellules sont observées et photographiées après 24 h. - Tumoriqenèse.  The gel is poured into culture wells (2 mm thick) and incubated at 37 ° C to solidify. The HUVEC cells are added after 15 minutes (100,000 cells / cm 2) to the surface of the gel. After 2 h, the 30 different soluble factors are added and the cells are observed and photographed after 24 h. - Tumoriqenesis.

000 cellules de mélanome B16 sont injectées en sous-cutané à des souris C57BL/6. 8 jours après, quand les tumeurs ont donné naissance à des nodules palpables, les anticorps sont injectés 2 fois par semaine par voie intrapéritonéale à la dose de 50 pg dilués dans 200 pl de PBS. Le volume de la tumeur est mesuré 2 fois par semaine au 5 pied à coulisse et exprimé par la formule V= _ x L x 12 (L et 1 désignant respectivement la plus grande et la plus petite dimension).  000 B16 melanoma cells are injected subcutaneously into C57BL / 6 mice. 8 days later, when the tumors gave rise to palpable nodules, the antibodies are injected twice a week intraperitoneally at a dose of 50 μg diluted in 200 μl of PBS. The volume of the tumor is measured twice a week by caliper and expressed by the formula V = _ x L x 12 (L and 1 respectively denoting the largest and the smallest dimension).

Un anticorps favorisant la croissance tumorale sera dit proangiogénique, un anticorps inhibant la croissance 10 tumorale sera dit antiangiogénique.  An antibody promoting tumor growth will be said to be proangiogenic, an antibody inhibiting tumor growth will be said antiangiogenic.

c) Identification des antigènes reconnus par les anticorps monoclonaux.  c) Identification of antigens recognized by monoclonal antibodies.

Les anticorps monoclonaux sont purifiés par une technique conventionnelle (par exemple protéine A sepharose) 15 et couplés à une matrice de sepharose activée par le CNBr à raison de 5 mg d'anticorps par ml de gel. L'immunogène de départ, soit les membranes des cellules endothéliales, soit le milieu conditionné des cellules interagissant avec les cellules endothéliales est déposé sur cette colonne 20 d'immunoadsorbant. Après rinçage, les constituants accrochés à cette colonne sont élués par un tampon acide ou basique et leur séquence est analysée par une technique conventionnelle.  The monoclonal antibodies are purified by a conventional technique (e.g. protein A sepharose) and coupled to a CNBr-activated sepharose matrix at 5 mg antibody per ml of gel. The starting immunogen, either the endothelial cell membranes or the conditioned medium of the cells interacting with the endothelial cells is deposited on this immunoadsorbent column. After rinsing, the constituents attached to this column are eluted with an acidic or basic buffer and their sequence is analyzed by a conventional technique.

Ainsi, l'obtention des anticorps 3 permet d'identifier 25 la nature moléculaire de l'immunogène ayant servi à générer l'anticorps Acl, c'està-dire respectivement un récepteur endothélial ou un ligand sécrété par une cellule interagissant avec une cellule endothéliale.  Thus, obtaining antibodies 3 makes it possible to identify the molecular nature of the immunogen used to generate the Acl antibody, that is to say respectively an endothelial receptor or a ligand secreted by a cell interacting with an endothelial cell. .

Claims (11)

REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'anticorps mimétiques d'une substance, à l'exception de tout procédé de traitement thérapeutique ou chirurgical, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes suivantes: (i) on administre à un troisième hôte capable de réagir immunologiquement à cette administration, une composition d'anticorps (Ac2) dirigée contre des anticorps (Acl), lesdits anticorps Ac2 ayant été préalablement purifiés à partir du sang 10 d'un deuxième hôte capable de réagir immunologiquement à l'administration desdits anticorps Acl, lesdits anticorps Acl ayant été préalablement administrés audit deuxième hôte après avoir été préalablement purifiés à partir du sang d'un premier hôte capable de réagir immunologiquement à l'administration 15 d'une substance cible, immunogène ou rendue immunogène, ledit premier hôte ayant été préalablement immunisé par administration de ladite substance cible, immunogène ou rendue immunogène; (ii) on prépare à partir dudit troisième hôte une troisième 20 composition d'anticorps (Ac3) dirigée contre les anticorps (Ac2) de la deuxième composition, (iii) on sacrifie ledit troisième hôte, et (iv) éventuellement, on analyse les propriétés des anticorps de ladite troisième composition.  1) Process for the preparation of mimetic antibodies of a substance, with the exception of any method of therapeutic or surgical treatment, characterized in that it comprises the following steps: (i) a third host capable of reacting is administered immunologically to this administration, an antibody (Ac2) composition directed against antibodies (Acl), said Ac2 antibodies having been previously purified from the blood of a second host capable of immunologically reacting to the administration of said Acl antibodies, said Acl antibodies having been previously administered to said second host after being previously purified from the blood of a first host capable of immunologically reacting to the delivery of a target immunogenic or immunogenic substance, said first host having been previously immunized by administration of said target substance, immunogenic or rendered immunogenic; (ii) a third antibody composition (Ac3) directed against the antibodies (Ac2) of the second composition is prepared from said third host, (iii) said third host is sacrificed, and (iv) optionally, the properties of the antibodies of said third composition. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape (iv) l'analyse des propriétés de l'anticorps est réalisée par rapport aux propriétés de la substance cible.  2) Method according to claim 1, characterized in that in step (iv) the analysis of the properties of the antibody is carried out with respect to the properties of the target substance. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les anticorps (Acl, Ac2, Ac3) de chacune desdites compositions sont des anticorps 30 polyclonaux, des anticorps monoclonaux ou fragments de ceuxci, des anticorps chimériques comme des anticorps humanisés.  3) Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that the antibodies (Acl, Ac2, Ac3) of each of said compositions are polyclonal antibodies, monoclonal antibodies or fragments thereof, chimeric antibodies such as antibodies humanized. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la substance cible est toute substance immunogène ou rendue immunogène, comme un antigène ou mélange d'antigènes, un extrait protéique, des cellules, partie ou constituant purifiés de cellules, un vecteur d'expression de protéine.  4) Process according to any one of the preceding claims, characterized in that the target substance is any immunogenic substance or rendered immunogenic, such as an antigen or mixture of antigens, a protein extract, cells, part or component purified cells, a protein expression vector. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 5 caractérisé en ce que la substance cible est choisie parmi des cellules endothéliales cultivées in vitro en présence d'un facteur angiogénique tel qu'un membre de la famille du FGF ou du VEGF, des membranes purifiées à partir de ces cellules endothéliales, des constituants purifiés à partir des membranes de cellules endothéliales, du milieu conditionné de cellules en culture exerçant une 10 activité sur des cellules endothéliales.  5) Process according to any one of the preceding claims, characterized in that the target substance is chosen from endothelial cells cultured in vitro in the presence of an angiogenic factor such as a member of the FGF or VEGF family, membranes purified from these endothelial cells, constituents purified from endothelial cell membranes, conditioned medium from cultured cells exerting activity on endothelial cells. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la substance cible est l'un des partenaires d'un couple de substances complémentaires.  6) Process according to any one of the preceding claims, characterized in that the target substance is one of the partners of a pair of complementary substances. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la substance 15 cible est un récepteur ou un ligand d'un récepteur.  7. Process according to claim 6, characterized in that the target substance is a receptor or ligand of a receptor. 8) Un anticorps (Ac3) susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il imite l'image d'un anticorps idiotypique (Acl) dirigé contre une substance cible immunogène ou rendu immunogène.  8) An antibody (Ac3) obtainable by a method according to any one of the preceding claims, characterized in that it imitates the image of an idiotypic antibody (Acl) directed against an immunogenic target substance or rendered immunogenic. 9) Un anticorps selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il constitue un inhibiteur d'un processus biologique dont est responsable ladite substance cible.  9) An antibody according to claim 8, characterized in that it constitutes an inhibitor of a biological process which is responsible for said target substance. 10) Un anticorps selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il constitue un activateur d'un processus biologique dont est responsable ladite substance 25 cible.  10. An antibody according to claim 8, characterized in that it constitutes an activator of a biological process for which said target substance is responsible. 11) Une composition comprenant un ou plusieurs anticorps identiques ou  11) A composition comprising one or more identical or différents selon l'une des revendications 8 à 10.  different according to one of claims 8 to 10.