FR2808277A1 - TTV POLYPEPTIDE, NUCLEIC ACID ENCODING THIS POLYPEPTIDE AND USES - Google Patents
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Abstract
Description
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Récemment, un virus à ADN linéaire, simple brin, circulaire, non enveloppé, appelé virus TT (TTV) a été identifié. TTV appartient à la famille des Circoviridae. Recently, a linear, single-stranded, circular, non-enveloped linear virus called TT virus (TTV) has been identified. TTV belongs to the family Circoviridae.
A l'origine, TTV a été isolé à partir du sérum d'un patient japonais transfusé, qui présentait une hépatite d'étiologie non connue (non-A à E). Il a par ailleurs été montré qu'il était associé à des taux de transaminases élevés chez des patients ayant subi une transfusion, de même que chez des patients atteints d'hépatites non-A à G en phase aiguë et chronique de la maladie (Nishizawa et al., (1997), Okamoto et al. Originally, TTV was isolated from the serum of a transfused Japanese patient who had hepatitis of unknown etiology (non-A to E). It has also been shown to be associated with elevated transaminase levels in transfused patients, as well as in patients with acute and chronic non-A-G hepatitis (Nishizawa). et al., (1997), Okamoto et al.
(1998a)). (1998a)).
L'ADN génomique du virus TTV a été cloné à partir du plasma d'un donneur de sang qui présentait un taux de transaminases élevé mais qui n'avait pas de marqueur sérologique pour des virus connus de l'hépatite (Okamoto et al. (1998a). Son génome, de polarité négative, consiste en une séquence de 3852 nucléotides et comprend deux cadres de lecture ouverts, ORF1 et ORF2, qui codent respectivement pour une protéine de manteau ou capside et une protéine non structurale putatives, respectivement de 770 et 202 acides aminés. TTV a une densité de 1,26 g/cm3 dans le sucrose, densité qui ne change pas après un traitement avec du Tween 80. Le génome viral est sensible au traitement à l'ADNase 1 et à la nucléase Mung Bean. The TTV genomic DNA was cloned from the plasma of a blood donor that had elevated transaminase levels but did not have a serologic marker for known hepatitis viruses (Okamoto et al. 1998a), whose negative polarity genome consists of a sequence of 3852 nucleotides and comprises two open reading frames, ORF1 and ORF2, which respectively code for a putative coat protein or capsid and a non-structural protein of 770 and 770, respectively. 202 amino acids TTV has a density of 1.26 g / cm3 in sucrose, a density that does not change after treatment with Tween 80. The viral genome is sensitive to DNase 1 and Mung Bean nuclease treatment .
La comparaison d'une séquence partielle de 356 nucléotides avec d'autres séquences de TTV provenant d'isolats obtenus à partir des sérums de 78 donneurs de sang et de patients atteints d'hépatite a permis de montrer une divergence importante avec des différences pouvant atteindre jusqu'à 30 %. La variabilité du génome viral est élevée, Mushawar et al. (1999) pouvant atteindre 52% ce qui permet de le classifier dans au moins 16 génotypes différents (Okamoto et al. (1999)). Comparison of a 356 nucleotide partial sequence with other TTV sequences from isolates obtained from sera from 78 blood donors and patients with hepatitis showed significant divergence with differences that could reach up to 30%. The variability of the viral genome is high, Mushawar et al. (1999) up to 52%, which makes it possible to classify it into at least 16 different genotypes (Okamoto et al., 1999).
TTV est trouvé dans le foie des patients avec des titres plus élevés de 10 à 100 fois que ceux de sérums correspondants provenant de patients atteints d'hépatites chroniques non-A à G. Il est sécrété dans les fèces et dans le sérum. Il pourrait être transmis par voies orale et fécale, en plus de la transmission parentérale par transfusion (Okamoto et al. TTV is found in the liver of patients with titers 10 to 100 times higher than those of corresponding sera from patients with chronic non-A to G hepatitis. It is secreted in feces and in serum. It could be transmitted by oral and fecal routes, in addition to parenteral transfusion transmission (Okamoto et al.
(1998b)). (1998b)).
Dans des études antérieures, la prévalence des infections par TTV a été déterminée par PCR nichée en utilisant deux jeux d'amorces In previous studies, the prevalence of TTV infections was determined by nested PCR using two sets of primers
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différents définis à partir du clone N22 (Nishizawa et al. précité). Les premiers résultats ont révélé une fréquence de l'infection par TTV plus élevée chez les patients avec des hépatites fulminantes (Okamoto et al. different defined from clone N22 (Nishizawa et al., supra). Early results revealed a higher incidence of TTV infection in patients with fulminant hepatitis (Okamoto et al.
(1998)), chez des patients hémophiles ou chez des patients atteints d'une maladie du foie chronique d'étiologie non connue (Okamoto et al. (1998a), que chez des donneurs de sang. Mais des études complémentaires n'ont pas permis de montrer de différences significatives entre chacun de ces groupes (Fukuda et al. (1999), Desai et al. (1999), Irving et al. (1999)), laissant supposer que TTV n'était probablement pas le principal agent causal des hépatites sporadiques aiguës d'origine inconnue. (1998)), in patients with hemophilia or in patients with chronic liver disease of unknown etiology (Okamoto et al (1998a), only in blood donors, but further studies have not been allowed to show significant differences between each of these groups (Fukuda et al (1999), Desai et al (1999), Irving et al (1999)), suggesting that TTV was probably not the main causal agent sporadic acute hepatitis of unknown origin.
Les différences observées dans ces données épidémiologiques pourraient être expliquées par un manque de détection de certains isolats en raison de la divergence dans la séquence nucléotidique et de l'utilisation de paires d'amorces non optimales (Desai et al. (1999)). De plus, la charge virale est faible dans les sérums humains puisqu'elle n'excède pas 104 copies/ml (Nishizawa et al., (1999)) et nécessiterait donc l'utilisation de techniques particulièrement sensibles, fiables et robustes. The differences observed in these epidemiological data could be explained by a lack of detection of some isolates due to divergence in the nucleotide sequence and the use of non-optimal primer pairs (Desai et al (1999)). In addition, the viral load is low in human sera since it does not exceed 104 copies / ml (Nishizawa et al., (1999)) and would therefore require the use of particularly sensitive, reliable and robust techniques.
Jusqu'à ce jour une seule méthode a été publiée pour la détection d'anticorps anti-TTV qui consiste en une technique indirecte utilisant la précipitation de particules de TTV dans des sérums, suivie par une amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) des séquences d'ADN virales à partir de complexes immuns (Tsuda et al. (1999)). Cette technique n'est toutefois pas adaptée à des essais en routine, sur une large échelle, et son intérêt est restreint du fait de l'utilisation d'une technique d'amplification par PCR et des limitations afférentes, comme décrit ci-dessus, en particulier liées à la divergence nucléotidique, à la détermination d'amorces appropriées et aux problèmes de contamination. To date, only one method has been published for the detection of anti-TTV antibodies which consists of an indirect technique using the precipitation of TTV particles in sera, followed by PCR amplification (Polymerase Chain Reaction) of the sequences. viral DNA from immune complexes (Tsuda et al (1999)). However, this technique is not suitable for routine large-scale trials and is of limited interest because of the use of a PCR amplification technique and related limitations as described above. particularly related to nucleotide divergence, determination of appropriate primers and contamination problems.
Par ailleurs, une amplification par PCR n'est possible qu'en présence de virus circulants dans le matériel biologique testé et ne peut donc rendre compte d'une infection passée. Moreover, a PCR amplification is only possible in the presence of circulating viruses in the biological material tested and can not therefore account for a past infection.
Il y avait donc un besoin pressant de développer un test sérologique qui pallie les inconvénients précités et qui, de plus, soit plus fiable et plus rapide qu'une détection par PCR. There was therefore a pressing need to develop a serological test that overcomes the aforementioned drawbacks and which, moreover, is more reliable and faster than detection by PCR.
Les présents inventeurs ont maintenant mis en évidence de manière surprenante que la région 3' terminale de l'ORF1 de TTV, qui commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la The present inventors have now surprisingly demonstrated that the terminal 3 'region of TTV ORF1, which starts at amino acid 15 and terminates at amino acid 263 of the
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séquence identifiée en SEQ ID NO 1, était une région très conservée, antigénique et montré qu'elle était utilisable pour détecter la présence du virus TTV dans un échantillon biologique, en particulier dans des sérums, avec un taux de prévalence avoisinant les 100%, indépendamment de l'origine de l'échantillon, à savoir chez des donneurs de sang, chez des patients atteints d'hépatites, chez des adultes ou des enfants et même chez des animaux. Ces données sont très intéressantes étant donnée la très grande variabilité protéique reconnue jusqu'à ce jour par de nombreux auteurs. sequence identified in SEQ ID NO 1, was a highly conserved, antigenic region and shown to be useful for detecting the presence of TTV virus in a biological sample, particularly in sera, with a prevalence rate approaching 100%, regardless of the origin of the sample, ie blood donors, patients with hepatitis, adults or children and even animals. These data are very interesting given the great protein variability recognized until now by many authors.
Aussi, la présente invention a pour objet : - (a) un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO 1, ou - (b) un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 70%, de préférence au moins 80% et avantageusement au moins 90% ou au moins 95% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), ou - (c) un fragment desdites séquences peptidiques qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 12 ou de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés. Also, the subject of the present invention is: - (a) a polypeptide whose peptide sequence begins at amino acid 15 and terminates at amino acid 263 of the sequence identified in SEQ ID NO 1, or - (b) a polypeptide whose peptide sequence has at least 70%, preferably at least 80% and advantageously at least 90% or at least 95% homology or identity with the sequence defined in (a), or - (c) a fragment of said peptide sequences which comprises at least 4 amino acids, preferably at least 5 or 6 amino acids and advantageously at least 7 amino acids, in particular from 6 to 15 amino acids and advantageously from 6 to 12 or 6 to 10 or 8 to 12 amino acids.
Par polypeptide, on entend une séquence qui correspond à un enchaînement d'acides aminés et cette définition inclus les protéines recombinantes et les polypeptides de synthèse ou leurs fragments qui sont obtenus par des méthodes bien connues de l'homme du métier. By polypeptide is meant a sequence which corresponds to a sequence of amino acids and this definition includes recombinant proteins and synthetic polypeptides or fragments thereof which are obtained by methods well known to those skilled in the art.
Par polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 70%, de préférence au moins 80% et avantageusement au moins 90 ou au moins 95% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), on entend un polypeptide qui répond à la définition donnée ci-dessus et qui présente au moins la même antigénicité et/ou immunogénécité que le peptide de référence (a). By polypeptide whose peptide sequence exhibits at least 70%, preferably at least 80% and advantageously at least 90% or at least 95% homology or identity with the sequence defined in (a), is meant a polypeptide which responds to the definition given above and which has at least the same antigenicity and / or immunogenicity as the reference peptide (a).
L'invention concerne également : - (a) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique The invention also relates to: - (a) a DNA molecule that comprises a nucleotide sequence that encodes a polypeptide whose peptide sequence
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commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEO ID NO 1, ou - (b) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 70%, de préférence au moins 80% et avantageusement au moins 90% ou 95% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), ou - (c) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un fragment desdites séquences peptidiques (a) ou (b) et qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à
12, de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés, - (d) les séquences complémentaires desdites séquences (a) à (c), et - (e) une molécule d'ARN qui est le produit de transcription desdites séquences ADN définies en (a) à (d). starts at amino acid 15 and terminates at amino acid 263 of the sequence identified in SEO ID NO 1, or - (b) a DNA molecule which comprises a nucleotide sequence which encodes a polypeptide whose peptide sequence present at least 70%, preferably at least 80% and advantageously at least 90% or 95% homology or identity with the sequence defined in (a), or - (c) a DNA molecule which comprises a nucleotide sequence which encodes a fragment of said peptide sequences (a) or (b) and which comprises at least 4 amino acids, preferably at least 5 or 6 amino acids and advantageously at least 7 amino acids, in particular from 6 to 15 amino acids and advantageously from 6 to
12, 6 to 10 or 8 to 12 amino acids, - (d) the complementary sequences of said sequences (a) to (c), and - (e) an RNA molecule which is the product of transcription of said DNA sequences defined in (a) to (d).
Les méthodes de construction, de manipulation et de vérification de molécules d'ADN recombinant et de séquences nucléotidiques sont bien connues de l'homme du métier. Methods of constructing, manipulating, and verifying recombinant DNA molecules and nucleotide sequences are well known to those skilled in the art.
Les inventeurs ont, entre autres, obtenu une protéine recombinante qui correspond à la région 3' de la trame de lecture ORF1, telle que définie précédemment et dont la séquence en acides aminés commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la SEQ ID NO 1. Dans SEO ID NO 1, les acides aminés 1 à 14 correspondent à des acides aminés du plasmide utilisé pour la construction et l'expression de ladite protéine recombinante et les acides aminés 264 à 280 correspondent à des acides aminés dudit plasmide et à l'addition d'une queue polyhistidine (tagHis). La séquence nucléotidique codante pour SEQ ID NO 1 est représentée en SEQ ID NO 2. The inventors have, among other things, obtained a recombinant protein which corresponds to the 3 'region of the ORF1 reading frame, as defined above and whose amino acid sequence begins at the amino acid and terminates at the acid. Amine 263 of SEQ ID NO 1. In SEO ID NO 1, amino acids 1 to 14 correspond to amino acids of the plasmid used for the construction and expression of said recombinant protein and amino acids 264 to 280 correspond to amino acids of said plasmid and addition of a polyhistidine tail (tagHis). The nucleotide sequence coding for SEQ ID NO 1 is represented in SEQ ID NO 2.
La séquence codante a été générée à partir d'une séquence nucléotidique codant pour l'ORF1 obtenue chez un patient infecté par TTV et amplifiée à l'aide d'amorces spécifiques de la région 3' ou carboxyterminale d'intérêt. Le fragment obtenu a été cloné et sous cloné dans un vecteur approprié pour l'expression du polypeptide d'intérêt dans une cellule hôte appropriée sous le contrôle d'un promoteur approprié. Il est The coding sequence was generated from a nucleotide sequence coding for ORF1 obtained in a patient infected with TTV and amplified using primers specific for the 3 'or carboxyterminal region of interest. The resulting fragment was cloned and subcloned into a vector suitable for the expression of the polypeptide of interest in a suitable host cell under the control of a suitable promoter. It is
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ainsi possible d'utiliser une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote inférieur permettant l'expression du gène d'intérêt codant pour le polypeptide de l'invention ou pour un fragment dudit polypeptide, tels que défini précédemment. Parmi les systèmes microbiens et eucaryotes inférieurs Escherichia coli, Schizosaccharomyces pombe et Saccharomyces cerevisiae ont largement été utilisés pour la production de protéines recombinantes. De préférence, la cellule est une cellule d'Escherichia coli, mais il est à la portée de l'homme du métier de définir d'autres systèmes d'expression appropriés, en particulier dans des cellules issues d'organismes eucaryotes supérieurs, telles que les cellules CHO, COS ou HeLa ou dans d'autres types cellulaires infectés par le virus de la Forêt de SemLiki recombinant avec le gène d'intérêt. L'invention n'est donc pas limitée à un système d'expression particulier. thus possible to use a functional expression cassette in a cell derived from a prokaryotic or lower eukaryotic organism allowing the expression of the gene of interest coding for the polypeptide of the invention or for a fragment of said polypeptide, as defined previously. Among the lower microbial and eukaryotic systems Escherichia coli, Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae have been widely used for the production of recombinant proteins. Preferably, the cell is an Escherichia coli cell, but it is within the abilities of those skilled in the art to define other suitable expression systems, in particular in cells from higher eukaryotic organisms, such as CHO, COS or HeLa cells or other cell types infected with the SemLiki Forest virus recombinant with the gene of interest. The invention is therefore not limited to a particular expression system.
Aussi, la présente invention englobe également une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote inférieur permettant l'expression d'une séquence d'ADN ou d'un fragment d'ADN tel que défini précédemment, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; le vecteur comprenant la cassette d'expression et la cellule issue de l'organisme procaryote ou eucaryote inférieur, en particulier Escherichia coli, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, et la protéine ainsi produite par la cassette d'expression, le vecteur ou la cellule. Elle concerne aussi un procédé pour préparer un polypeptide de l'invention qui consiste à cultiver une cellule hôte ci-dessus, dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence nucléotidique d'ADN telle que définie précédemment et, à purifier ledit polypeptide produit jusqu'à un degré de pureté requis. Also, the present invention also encompasses a functional expression cassette in a cell derived from a prokaryotic or lower eukaryotic organism allowing the expression of a DNA sequence or a DNA fragment as defined above, placed under the control of the elements necessary for its expression; the vector comprising the expression cassette and the cell derived from the prokaryotic or lower eukaryotic organism, in particular Escherichia coli, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, and the protein thus produced by the expression cassette, the vector or the cell. It also relates to a method for preparing a polypeptide of the invention which comprises culturing a host cell above, in a suitable culture medium, said host cell being transformed with an expression vector which contains a nucleotide sequence of DNA as defined above and, to purify said product polypeptide to a required degree of purity.
L'invention concerne aussi une composition diagnostique pour la détection d'anticorps dans un échantillon biologique, d'origine humaine ou animale, en particulier dans le sérum, le plasma, le foie, les fèces, ladite composition comprenant, entre autres, un polypeptide tel que défini précédemment et un procédé pour détecter et/ou quantifier lesdits anticorps dirigés contre au moins ledit polypeptide de l'invention dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec la composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. On peut ainsi mettre en évidence la présence d'anticorps par Western Blot, sandwich ou compétition, en particulier en utilisant la technologie ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbant Assay), en utilisant des anticorps ou des The invention also relates to a diagnostic composition for the detection of antibodies in a biological sample, of human or animal origin, in particular in serum, plasma, liver, feces, said composition comprising, inter alia, a polypeptide as defined above and a method for detecting and / or quantifying said antibodies directed against at least said polypeptide of the invention in a biological sample, wherein the biological sample is brought into contact with the diagnostic composition under predetermined conditions which permit the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected. It is thus possible to demonstrate the presence of antibodies by Western Blot, sandwich or competition, in particular by using the Enzyme Linked-Immunosorbant Assay (ELISA) technology, using antibodies or antibodies.
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fragments d'anticorps capables de se fixer au polypeptide de l'invention ou à ses fragments. Toutes ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. antibody fragments capable of binding to the polypeptide of the invention or its fragments. All these techniques are well known to those skilled in the art.
Un autre objet de l'invention est un polypeptide immunogène qui présente une séquence peptidique telle que définie précédemment ou qui consiste en une protéine recombinante obtenue selon le protocole précité et son utilisation pour la production d'un anticorps monoclonal ou polyclonal par immunisation d'un animal mammifère, de préférence une souris, un rat ou un lapin, avec ledit peptide immunogène. La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut citer à titre de référence Kôhler G. et Milstein C. (1975) : Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 : 495-497 et Galfre G. et al. Another subject of the invention is an immunogenic polypeptide which has a peptide sequence as defined above or which consists of a recombinant protein obtained according to the abovementioned protocol and its use for the production of a monoclonal or polyclonal antibody by immunization of a mammalian animal, preferably a mouse, a rat or a rabbit, with said immunogenic peptide. The production of polyclonal and monoclonal antibodies is part of the general knowledge of those skilled in the art. By reference Kohler G. and Milstein C. (1975): Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256: 495-497 and Galfre G et al.
(1977) Nature, 266 : pour la production d'anticorps monoclonaux et Roda A., Bolelli G.F. : Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Des anticorps peuvent également être produits par immunisation de souris ou de lapins avec les particules virales de TTV. Pour la production d'anticorps monoclonaux, l'immunogène peut être couplé à de l'hémocyanine de Lymphet Keyhole (peptide KLH) comme support pour l'immunisation ou à de l'albumine sérique (peptide SA). Les animaux sont soumis à une injection d'immunogène en utilisant de l'adjuvant complet de Freund. Les sérums et les surnageants de culture d'hybridome issus des animaux immunisés sont analysés pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hybridomes produisant les anticorps les plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés. Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vitro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d'ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quelque soit le mode de production, en surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d'ions et la chromatographie d'exclusion ou la chromatographie d'affinité (protéine A ou G). Un nombre suffisant d'anticorps est criblé dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vitro d'anticorps, de (1977) Nature, 266: for the production of monoclonal antibodies and Roda A., Bolelli G.F .: Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1980) for the production of polyclonal antibodies. Antibodies can also be produced by immunizing mice or rabbits with TTV viral particles. For the production of monoclonal antibodies, the immunogen can be coupled to Lymphet Keyhole hemocyanin (KLH peptide) as a carrier for immunization or to serum albumin (SA peptide). The animals are injected with immunogen using Freund's complete adjuvant. Sera and hybridoma culture supernatants from the immunized animals are analyzed for their specificity and selectivity using standard techniques, such as for example ELISA or Western Blot assays. Hybridomas producing the most specific and sensitive antibodies are selected. Monoclonal antibodies can also be produced in vitro by cell culture of the produced hybridomas or by ascitic fluid recovery, after intraperitoneal injection of the hybridomas in the mouse. Whatever the mode of production, supernatant or ascites, the antibodies are then purified. The purification methods used are essentially ion exchange gel filtration and exclusion chromatography or affinity chromatography (protein A or G). A sufficient number of antibodies are screened in functional assays to identify the best performing antibodies. In vitro production of antibodies,
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fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier. Plus particulièrement, par fragment d'anticorps on entend les fragments F (ab)2, Fab', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of
Immunology 159 : 5821-5833 et Bird et al., 1988, Science 242 : d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif (voir par exemple Arakawa et al., 1996, J. Antibody or antibody derivative fragments, such as chimeric antibodies produced by genetic engineering, are well known to those skilled in the art. More particularly, by antibody fragment is meant the F (ab) 2, Fab ', sFv fragments (Blazar et al., 1997, Journal of
Immunology 159: 5821-5833 and Bird et al., 1988, Science 242: a native antibody and derivative is understood to mean, inter alia, a chimeric derivative of a native antibody (see for example Arakawa et al., 1996, J.
Biochem 120 : et Chaudray et al., 1989, Nature 339 : L'anticorps monoclonal ou polyclonal ainsi obtenu est incorporé dans une composition diagnostique qui est utilisée dans un procédé pour détecter et/ou quantifier au moins un polypeptide de l'invention dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec ladite composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. En particulier les anticorps monoclonaux obtenus sont spécifiques de la protéine recherchée. Biochem 120: and Chaudray et al., 1989, Nature 339: The monoclonal or polyclonal antibody thus obtained is incorporated into a diagnostic composition which is used in a method for detecting and / or quantifying at least one polypeptide of the invention in a biological sample, wherein the biological sample is contacted with said diagnostic composition under predetermined conditions that allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected. In particular, the monoclonal antibodies obtained are specific for the desired protein.
L'invention concerne aussi des ligands susceptibles de s'associer à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique du virus TTV tels que définis ci-dessus. Ainsi, par ligand, on entend toute molécule susceptible de s'associer à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique, telle qu'un fragment nucléotidique partiellement ou totalement complémentaire, un polynucléotide complémentaire, un anticorps anti-acide nucléique. La production de fragments nucléotidiques ou de polynucléotides fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut notamment citer l'utilisation d'enzymes de restriction, et la synthèse chimique sur synthétiseur automatique. Les sondes et amorces susceptibles de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique tels que définis précédemment font partie de cette définition. Il est à la portée de l'homme du métier de définir les conditions de stringence appropriées. Des conditions de stringence caractéristiques sont celles qui correspondent à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20 C sous le Tm ( melting température ) de l'hybride à l'étude. Les conditions de stringence pour discriminer même The invention also relates to ligands capable of associating with a nucleotide sequence of DNA or RNA or with a nucleotide fragment of the TTV virus as defined above. Thus, by ligand is meant any molecule capable of associating with a nucleotide sequence of DNA or RNA or with a nucleotide fragment, such as a partially or completely complementary nucleotide fragment, a complementary polynucleotide, an anti-human antibody, nucleic acid. The production of nucleotide fragments or polynucleotides is part of the general knowledge of those skilled in the art. These include the use of restriction enzymes, and chemical synthesis on automatic synthesizer. The probes and primers capable of hybridizing under stringent conditions determined to a nucleotide sequence of DNA or RNA or to a nucleotide fragment as defined above form part of this definition. It is within the abilities of those skilled in the art to define the appropriate stringency conditions. Characteristic stringency conditions are those that correspond to a combination of temperature and saline concentration selected at approximately 12 to 20 ° C below the Tm (melting temperature) of the hybrid under study. The conditions of stringency to discriminate even
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une seule mutation ponctuelle sont connues depuis au moins les années
1979 ; On peut citer à titre d'exemples Wallace R. B et al., DNA. Nucleic. a single point mutation have been known for at least the years
1979; As examples Wallace R. B et al., DNA. Nucleic.
Acids. Res. 6,3543-3557 (1979), Wallace R. B et al., Science, 209,
1396-1400 (1980), Itakura K. and Riggs A. D., Science, 209,1401-1405 (1980), Suggs S. V. et al., PNAS, 78,6613-6617 (1981), Wallace R. B et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9,3647-3656 (1981), Wallace R.B et al. Acids. Res. 6.3543-3557 (1979), Wallace R. B et al., Science, 209,
1396-1400 (1980), Itakura K. and Riggs AD, Science, 209, 1401-1405 (1980), Suggs SV et al., PNAS, 78, 6613-6617 (1981), Wallace R. B et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9, 367-3656 (1981), Wallace RB et al.
DNA. Nucleic. Acids. Res., 9,879-894 (1981) et Conner B. J. et al., PNAS, 80,278-282 (1983). Par ailleurs, on connaît des techniques pour la production d'anticorps anti-acides nucléiques. On peut citer à titre d'exemples Philippe Cros et al., Nucleic Acides Researc, 1994, Vol. 22, N . 15,2951-2957 ; Anderson, W. F. et al. (1988) Bioessays, 8 (2), 69- 74 ; Lee, J. S. et al. (1984) FEBS Lett., 168,303-306 ; Malfoy, B. et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9, 899-894 (1981) and Conner, B.J. et al., PNAS, 80, 278-282 (1983). In addition, techniques are known for the production of anti-nucleic acid antibodies. By way of examples, mention may be made of Philippe Cros et al., Nucleic Acids Researc, 1994, Vol. 22, N. 15, 1951-2957; Anderson, W.F. et al. (1988) Bioessays, 8 (2), 69-74; Lee, J. S. et al. (1984) FEBS Lett., 168, 303-306; Malfoy, B. et al.
(1982) Biochemistry, 21(22), 5463-5467 ; Stollar, B. D. et al., J. J. (eds) Methods in Enzymology, Academic Press, pp 70-85 ; F. et al. (1982) Biochemistry, 21 (22), 5463-5467; Stollar, B.D. et al., J.J. (eds) Methods in Enzymology, Academic Press, pp 70-85; F. et al.
(1989) J. Immunol. Meth., 123,83-91 et Traincard, F. et al. (1989) Mol. (1989) J. Immunol. Meth., 123, 83-91 and Traincard, F. et al. (1989) Mol.
Cell. Probes, 3,27-38). Cell. Probes, 3.27-38).
Par fragment nucléotidique, on entend soit des fragments associés à une même unité moléculaire, soit des fragments dans un complexe moléculaire comprenant plusieurs sous-unités homologues ou hétérologues obtenues de manière naturelle ou artificielle, notamment par multi-épissage différentiel ou par synthèse sélective. By nucleotide fragment is meant either fragments associated with the same molecular unit, or fragments in a molecular complex comprising several homologous or heterologous subunits obtained naturally or artificially, in particular by differential multi-splicing or by selective synthesis.
On définit ainsi une composition diagnostique qui comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique. Thus, a diagnostic composition is defined which comprises at least one probe or a primer or an anti-nucleic acid antibody.
Les amorces, sondes et anticorps anti-acides nucléiques de l'invention sont par ailleurs utilisées dans un procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon d'origine humaine ou animale (sérum, plasma, extrait tissulaire de foie, extraits fécaux, salive) patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tels que défini précédemment, dans des conditions de stringence déterminées quand le ligand est une sonde ou une amorce et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN, ou dans des conditions d'incubation déterminées lorsque le ligand est anticorps anti-acide nucléique et on The primers, probes and anti-nucleic acid antibodies of the invention are moreover used in a method for diagnosing DNA and / or viral RNA, according to which a sample of human or animal origin (serum, plasma) is taken. , patient tissue extract, fecal extracts, saliva) patient, if necessary treated the sample to extract DNA and / or RNA, said sample is brought into contact with at least one probe or a primer or an anti-antibody nucleic acid as defined above, under determined stringency conditions when the ligand is a probe or primer and the presence of DNA and / or viral RNA is detected in the sample either by evidence of a hybridization of said viral DNA and / or RNA with at least one probe, either by amplification of said DNA and / or RNA, or under determined incubation conditions when the ligand is anti-nucleic acid antibody and
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détecte le complexe ainsi formé. Dans le cas de l'utilisation d'un anticorps anti-acide nucléique, l'anticorps peut lui même être marqué par tout marqueur approprié pour la révélation du complexe formé ou bien la formation du complexe peut être révélée par l'addition au milieu d'incubation d'un anticorps anti-anticorps acide nucléique marqué. Dans le cas d'utilisation de sondes la mise en évidence du complexe d'hybridation peut être effectuée directement par utilisation d'une sonde complémentaire ou sensiblement complémentaire de la séquence de la cible, ladite sonde étant marquée par tout marqueur approprié ou par mise en #uvre de la technique dite sandwich en une ou deux étapes qui consiste à utiliser une sonde de capture complémentaire ou sensiblement complémentaire d'une partie de la séquence de la cible et une sonde dite de détection marquée complémentaire ou sensiblement complémentaire d'une autre partie de la séquence de la cible. Dans le cas d'utilisation d'amorces, celles ci peuvent être directement marquées pour la mise en évidence d'un produit d'amplification. detects the complex thus formed. In the case of the use of an anti-nucleic acid antibody, the antibody can itself be labeled with any suitable marker for the disclosure of the complex formed or the formation of the complex can be revealed by the addition to the medium of incubation of a labeled anti-nucleic acid antibody antibody. In the case of using probes, the detection of the hybridization complex can be carried out directly by using a probe complementary to or substantially complementary to the target sequence, said probe being labeled by any appropriate marker or by setting the work of the so-called sandwich technique in one or two steps which consists in using a capture probe complementary or substantially complementary to a part of the target sequence and a so-called marked detection probe complementary or substantially complementary to another part of the target sequence. In the case of using primers, these can be directly labeled for the demonstration of an amplification product.
De nombreux outils ont déjà été développés pour introduire des gènes hétérologues et/ou vecteurs dans des cellules, en particulier des cellules de mammifères. Ces techniques peuvent être divisées en deux catégories : la première catégorie implique des technique physiques comme la micro-injection, l'électroporation ou le bombardement de particules. La seconde catégorie est basée sur l'utilisation de techniques en biologie moléculaire et cellulaire avec lesquelles le gène est transféré avec un vecteur biologique ou synthétique qui facilite l'introduction du matériel dans la cellule in vivo. Aujourd'hui, les vecteurs les plus utilisés sont les vecteurs adénoviraux et rétroviraux. Les virus possèdent des propriétés naturelles pour traverser les membranes plasmiques, éviter la dégradation de leur matériel génétique et introduire leur génome dans le noyau de la cellule. Ces virus ont été largement étudiés et certains sont déjà utilisés expérimentalement dans des applications humaines en vaccination, en immunothérapie, ou pour compenser des déficiences génétiques. Toutefois l'utilisation de certains vecteurs adénoviraux en thérapie génique présente des inconvénients et peut même avoir des effets dommageables pour la santé publique, comme relevé récemment. En particulier, il existe un risque de disséminer les particules virales produites dans l'organisme et l'environnement. Numerous tools have already been developed for introducing heterologous and / or vector genes into cells, in particular mammalian cells. These techniques can be divided into two categories: the first category involves physical techniques such as microinjection, electroporation or particle bombardment. The second category is based on the use of techniques in molecular and cellular biology with which the gene is transferred with a biological or synthetic vector that facilitates the introduction of the material into the cell in vivo. Today, the most used vectors are the adenoviral and retroviral vectors. Viruses have natural properties to cross the plasma membranes, avoid the degradation of their genetic material and introduce their genome into the nucleus of the cell. These viruses have been widely studied and some are already used experimentally in human applications in vaccination, immunotherapy, or to compensate for genetic deficiencies. However, the use of certain adenoviral vectors in gene therapy has drawbacks and may even have damaging effects on public health, as recently noted. In particular, there is a risk of spreading viral particles produced in the body and the environment.
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L'utilisation de l'ADN viral ou de la protéine identifiés par la présente invention permet de pallier ces risques potentiels. En effet, comme illustré dans les exemples, les inventeurs ont montré que le polypeptide de l'invention était ubiquitaire, ce qui laisse supposer un mécanisme de tolérance de l'hôte et permet donc d'envisager à moindres risques l'utilisation dudit polypeptide ou de l'ADN recombinant codant pour ledit polypeptide comme vecteur en thérapie, soit pour introduire ex vivo, in vivo ou in vitro dans des cellules un gène d'intérêt thérapeutique ou une protéine d'intérêt thérapeutique, soit pour introduire ex vivo, in vivo ou in vitro des substances pharmaceutiquement actives. Des cellules cibles peuvent ainsi être transformées par des techniques connues de l'homme du métier, telles que la transfection, la transduction ou la transformation et être ensuite introduites chez un patient pour exercer leurs propriétés. The use of the viral DNA or of the protein identified by the present invention overcomes these potential risks. Indeed, as illustrated in the examples, the inventors have shown that the polypeptide of the invention was ubiquitous, which suggests a mechanism of tolerance of the host and thus makes it possible to consider at lower risk the use of said polypeptide or recombinant DNA encoding said polypeptide as a vector in therapy, either to introduce ex vivo, in vivo or in vitro into cells a gene of therapeutic interest or a protein of therapeutic interest, or to introduce ex vivo, in vivo or in vitro pharmaceutically active substances. Target cells can thus be transformed by techniques known to those skilled in the art, such as transfection, transduction or transformation and then be introduced into a patient to exert their properties.
L'invention concerne donc aussi l'utilisation d'ADN recombinant ou d'un polypeptide recombinant de TTV, répondant aux définitions précédentes, comme vecteur de thérapie, ledit ADN recombinant étant placé sous la dépendance d'un promoteur autologue ou hétérologue, de préférence un promoteur fort. Par promoteur autologue on entend un promoteur (UTR) du virus TTV et par promoteur hétérologue on entend tout promoteur qui ne soit pas un promoteur de TTV, d'origine virale, rétrovirale ou cellulaire, éventuellement modifiée, à la condition qu'il soit fonctionnel. Une telle utilisation n'a pas encore été décrite. Etant donné que l'on souhaite obtenir in vivo une transformation ciblée vers un type cellulaire ciblé, il est évident que le vecteur utilisé doit pouvoir être lui-même ciblé. Un autre objet de l'invention est ainsi une composition thérapeutique comprenant, entre autres, un tel vecteur. The invention therefore also relates to the use of recombinant DNA or a recombinant TTV polypeptide, as defined above, as a therapy vector, said recombinant DNA being placed under the control of an autologous or heterologous promoter, preferably a strong promoter. By autologous promoter is meant a promoter (UTR) of the TTV virus and by heterologous promoter is meant any promoter which is not a promoter of TTV, of viral, retroviral or cellular origin, possibly modified, provided that it is functional. . Such use has not yet been described. Since it is desired to obtain in vivo a targeted transformation towards a targeted cell type, it is obvious that the vector used must be able to be itself targeted. Another object of the invention is thus a therapeutic composition comprising, inter alia, such a vector.
La présente invention concerne aussi un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques, la composition comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des protéines déterminées, telles que des anticorps, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique codant in vivo pour au moins une protéine ou un fragment d'une protéine d'intérêt ou pour au moins une molécule inhibitrice de la fonction et/ou de la fixation et/ou de l'expression d'au moins une protéine The present invention also relates to a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions, the composition comprising at least one cell, especially a cell not naturally producing specific proteins, such as antibodies, in a form allowing its administration in a mammalian organism, human or animal, as well as possibly its prior culture, said cell being genetically modified in vitro by at least one nucleic acid sequence containing at least one gene of therapeutic interest coding in vivo for at least one protein or a fragment of a protein of interest or for at least one molecule inhibiting the function and / or the binding and / or the expression of at least one protein
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ou d'un fragment de protéine d'intérêt ou pour au moins un anticorps ou une partie d'anticorps capable de se lier à au moins une protéine d'intérêt. or a protein fragment of interest or for at least one antibody or part of antibody capable of binding at least one protein of interest.
Plus particulièrement, ladite cellule cible provient soit de l'individu à traiter, soit d'un autre mammifère. Dans ce dernier cas, il convient de noter que ladite cellule cible aura subi un traitement la rendant compatible avec l'homme. More particularly, said target cell comes either from the individual to be treated or from another mammal. In the latter case, it should be noted that said target cell has undergone a treatment making it compatible with humans.
Ces cellules sont établies en lignées cellulaires et sont préférentiellement CMHII + ou CMHII + inductibles comme les lymphocytes, les monocytes, les astrocytes, les oligodendrocytes. These cells are established in cell lines and are preferentially CMHII + or CMHII + inducible cells such as lymphocytes, monocytes, astrocytes, oligodendrocytes.
L'invention concerne également les cellules modifiées et un procédé de préparation d'une cellule telle que décrite ci dessus caractérisé en ce que l'on introduit dans une cellule de mammifère ne produisant pas naturellement des protéines identifiées, par tout ou moyen approprié, au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique et des éléments assurant l'expression dudit gène dans ladite cellule, ledit gène d'intérêt thérapeutique contenant une séquence d'acide nucléique codant pour une molécule ou un fragment de molécule in vivo, comme décrit ci-dessus. Plus particulièrement, elle concerne des cellules eucaryotes transfectées par au moins une séquence nucléotidique et/ou un vecteur tel que décrit précédemment. Elle concerne aussi une composition thérapeutique comprenant, entre autres, une telle cellule. The invention also relates to the modified cells and to a process for preparing a cell as described above, characterized in that a mammalian cell which does not naturally produce identified proteins is introduced, by any or appropriate means, into the cell. least one nucleic acid sequence containing at least one gene of therapeutic interest and elements ensuring the expression of said gene in said cell, said gene of therapeutic interest containing a nucleic acid sequence coding for a molecule or a fragment of molecule in vivo, as described above. More particularly, it relates to eukaryotic cells transfected with at least one nucleotide sequence and / or a vector as described above. It also relates to a therapeutic composition comprising, inter alia, such a cell.
La figure 1 représente les séquences nucléotidique et protéique complètes et reconstruites de l'ORF1 du clone X94-TTV de l'invention. FIG. 1 represents the complete and reconstructed nucleotide and protein sequences of the ORF1 of the X94-TTV clone of the invention.
La figure 2 représente la construction d'un arbre phylogénique et montre que la séquence de X94-TTV est de génotype 1 et appartient au sous type 1 a. Figure 2 shows the construction of a phylogenetic tree and shows that the X94-TTV sequence is of genotype 1 and belongs to subtype 1a.
Exemple 1 : Obtention de la séquence nucléotidique de la trame de lecture ORF1
La séquence nucléotidique qui code pour le cadre de lecture ORF1 a été obtenue à partir d'un patient transplanté (X94) de sexe masculin, âgé de 30 ans, qui présentait des taux d'alanine aminotransférase élevés, sans virémie détectable pour le virus de l'hépatite B (HBV ou VHB) et le virus de l'hépatite C (HCV ou VHC), ni réponse immune développée contre ces virus et pour lequel un diagnostic pour une hépatite d'étiologie non connue a été établi. La négativité de son sérum pour HBV/HCV a été confirmée par PCR (Polymerase Chain Reaction) et EXAMPLE 1 Obtaining the Nucleotide Sequence of the ORF1 Reading Frame
The nucleotide sequence encoding the ORF1 reading frame was obtained from a 30-year-old male transplant patient (X94) who had elevated alanine aminotransferase levels without detectable viremia for hepatitis B (HBV or HBV) and hepatitis C virus (HCV or HCV), nor an immune response developed against these viruses and for which a diagnosis for hepatitis of unknown etiology has been established. Serum negativity for HBV / HCV was confirmed by PCR (Polymerase Chain Reaction) and
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hybridation par Southern blot. Il a été montré qu'il était infecté par le virus TTV par mise en évidence de l'ADN du virus par PCR nichée effectuée sur la base de la méthode décrite par Simmonds et al. (1998). Southern blot hybridization. It has been shown to be infected with the TTV virus by demonstration of the DNA of the virus by nested PCR carried out on the basis of the method described by Simmonds et al. (1998).
Le acides nucléiques totaux ont été extraits à partit de 140 l du sérum du patient à l'aide du kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (nom commercial), commercialisé par la société QIAGEN, selon le protocole établi selon les instructions du vendeur et soumis à amplification par PCR pour la région codant pour l'ORF1 de TTV. The total nucleic acids were extracted from 140 l of the patient's serum using the QIAamp Viral RNA Kit Mini Kit (commercial name), marketed by the company QIAGEN, according to the protocol established according to the instructions of the seller and submitted to PCR amplification for the ORF1 coding region of TTV.
Un premier clone (7-94X) comprenant la séquence aminoterminale de l'ORF1 de TTV, s'étendant du nucléotide 582 à 2192 par rapport à la séquence de référence de l'isolat TA278 (DDBJ, EMBL, GenBank, numéro d'accès AB008394), a été obtenu par PCR nichée en utilisant des oligonucléotides déduits de régions bien conservées dans des isolats de TTV de différents génotypes et sous types disponibles dans la base de données GenBank. A first clone (7-94X) comprising the amino terminal sequence of TTV ORF1, extending from nucleotide 582 to 2192 relative to the reference sequence of TA278 isolate (DDBJ, EMBL, GenBank, accession number AB008394), was obtained by nested PCR using oligonucleotides deduced from well conserved regions in TTV isolates of different genotypes and subtypes available in the GenBank database.
Amorce externe sens (C06+) :
5' AGCGAAACCTGCCCCTCCG 3' (position 519-537 sur l'isolat TA278)
Amorce interne sens (C014+D) :
5' GAGCACCATGGCCTATGGSTGG 3' (position 582-603)
Amorce externe anti-sens 5427 et amorce interne anti-sens 5432, décrites par Simmonds et al. (1998). External priming sense (C06 +):
5 'AGCGAAACCTGCCCCTCCG 3' (position 519-537 on isolate TA278)
Internal sense primer (C014 + D):
5 'GAGCACCATGGCCTATGGSTGG 3' (heading 582-603)
5427 antisense outer primer and 5432 antisense inner primer, described by Simmonds et al. (1998).
Des amorces spécifiques ont été définies à l'extrémité carboxyterminale (C015 + et CO 16 + ) de cette séquence et ont été utilisées pour générer un second fragment s'étendant des nucléotides 2062 à 2857 par rapport à l'isolat TA278, par PCR semi nichée, qui présentait une région chevauchante de 92 nucléotides avec la séquence du clone 7-94X et qui recouvrait la région carboxy-terminale de l'ORF1 de TTV. Ce fragment a été cloné et appelé 1 1-94X. Specific primers were defined at the carboxyterminal end (C015 + and CO 16 +) of this sequence and were used to generate a second fragment extending from nucleotides 2062 to 2857 relative to isolate TA278, by semi-PCR. nested, which had an overlapping region of 92 nucleotides with the sequence of clone 7-94X and which covered the carboxy-terminal region of TTV ORF1. This fragment was cloned and called 1-94X.
Amorce externe sens (CO15+) :
5' TACACATGAATGCCAGACTAC 3'
Amorce interne sens (CO 16 +) :
5' TACAGACCCCCAACTAATAGTAC 3'
Amorce anti-sens (C012-)/
5' GTAACAAGGTAGGGTTGATATC 3' (position 2836-2857 sur l'isolat TA278). External sense primer (CO15 +):
5 'TACACATGAATGCCAGACTAC 3'
Internal sense primer (CO 16 +):
5 'TACAGACCCCCAACTAATAGTAC 3'
Anti-sense primer (C012 -) /
5 'GTAACAAGGTAGGGTTGATATC 3' (position 2836-2857 on isolate TA278).
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La première amplification a été réalisée à l'aide du kit ExpandTM High Fidelity PCR System (commercialisé par la société Roche Diagnostics) sur la totalité des acides nucléiques extraits comme suit : 94 C pendant
10 min. ; 35 cycles de 94 C pendant 1 min., 50 C pendant 1 min., 68 C pendant 2 min. ; extensionfinale à 68 C pendant 7 min. Le second tour a été réalisé dans les mêmes conditions à partir de 10 l de produits d'amplification du premier tour. Les produits de PCR ont été analysés sur gels d'agarose 0,8% et détectés par exposition aux ultra violets après coloration au bromure d'éthidium. The first amplification was carried out using the ExpandTM High Fidelity PCR System Kit (sold by Roche Diagnostics) on all the nucleic acids extracted as follows: 94 C during
10 minutes. ; 35 cycles of 94 C for 1 min, 50 C for 1 min, 68 C for 2 min. ; final extension at 68 C for 7 min. The second round was made under the same conditions from 10 l of amplification products of the first round. The PCR products were analyzed on 0.8% agarose gels and detected by ultraviolet exposure after staining with ethidium bromide.
Les fragments amplifiés des parties N- et C-terminales de l'ORF1 ont été clonés séparément dans le plasmide pCR2.1-TOPO en utilisant le kit TOPOTMTA Cloning Kit, commercialisé par la société Invitrogen. Ces deux fragments ont été séquences dans les deux directions en utilisant le kit Prism Ready Reaction Kit Dye Deoxyterminator Cycle Sequencing Kit (nom commercial), commercialisé par la société Applied Biosystems, à l'aide des séquenceurs d'ADN automatisés 377 et 373A de la société Applied Biosystems, en utilisant les oligonucléotides habituels. Amplified fragments of the N- and C-terminal portions of ORF1 were cloned separately into plasmid pCR2.1-TOPO using the TOPOTMTA Cloning Kit, marketed by Invitrogen. These two fragments were sequenced in both directions using the Prism Ready Reaction Kit Kit Dye Deoxyterminator Cycle Sequencing Kit (commercial name), marketed by Applied Biosystems, using the automated DNA sequencers 377 and 373A of the Applied Biosystems company, using the usual oligonucleotides.
L'analyse des séquences obtenues a été réalisée à l'aide des logiciels GeneWorks (IntelliGenetics) et MacVector 4. 5 (Kodak). Les recherches dans les bases de données ont été réalisées par BLAST (http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) sur toutes les banques de données principales (GEnBank, EMBL, PIR, SWISS-PROT, Dbest) pour générer des alignements multiples à la fois au niveau nucléotidique et protéique. The analysis of the sequences obtained was performed using the software GeneWorks (IntelliGenetics) and MacVector 4.5 (Kodak). Database searches were performed by BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) on all major databases (GEnBank, EMBL, PIR, SWISS-PROT, Dbest) for generate multiple alignments at both the nucleotide and protein levels.
L'analyse des séquences obtenues à partir des clones 7-94X et 11-94X a révélé 100 % d'identité au niveau de la région de chevauchement. En combinant toutes les parties chevauchantes, une séquence proche de la séquence complète de l'ORF1 de TTV, recouvrant les nucléotides 589 à 2857, par rapport à la séquence de l'isolat de référence TA278, a été reconstruite et il a été montré qu'elle contenait un cadre de lecture ouvert codant pour une protéine de 756 acides aminés. Une comparaison par alignement des séquences nucléotidiques de X94 et TA278 a montré une similarité importante, avec une identité de 95 %. Sequence analysis from 7-94X and 11-94X clones revealed 100% identity at the overlapping region. By combining all the overlapping parts, a sequence close to the complete ORF1 sequence of TTV, covering nucleotides 589-2857, relative to the sequence of the TA278 reference isolate, was reconstructed and it was shown that it contained an open reading frame encoding a protein of 756 amino acids. An alignment comparison of the nucleotide sequences of X94 and TA278 showed significant similarity, with 95% identity.
Exemple 2 : Caractérisation de la protéine de l'ORF1. Example 2 Characterization of the Protein of ORF1
La séquence en acides aminés prédite, codée par la séquence de l'ORF1 de X94-TTV a été analysée. Comme montrée à la figure 1 The predicted amino acid sequence encoded by the X94-TTV ORF1 sequence was analyzed. As shown in Figure 1
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annexée, elle contient à son extrémité N-terminale un domaine très riche en arginine (et lysine), comme cela avait déjà été montré antérieurement pour les protéines de capside des circovirus (Niagro et al., (1998) ; Takahashi et al,. (1998) ; Mushahwar et al., (1999)), et quatre sites de glycosylation liés à l'asparagine dans la région centrale. De plus, trois des quatre motifs conservés de la protéine Rep (FTL) et (YXXK) décrits antérieurement (Niagro et al., (1998) chez les circovirus ont été trouvés dans la protéine de l'ORF1 de X94-TTV suggérant une possibilité de réplication virale par un mécanisme de cycles tournant (Mushahwar et al., (1999)). appended, it contains at its N-terminal end a very rich arginine (and lysine) domain, as had previously been shown for the capsid proteins of circoviruses (Niagro et al., (1998); Takahashi et al. (1998), Mushahwar et al., (1999)), and four asparagine-linked glycosylation sites in the central region. In addition, three of the four conserved motifs of the previously described Rep (FTL) and (YXXK) protein (Niagro et al., (1998) in circoviruses were found in the X94-TTV ORF1 protein suggesting a possibility viral replication by a rotating cycle mechanism (Mushahwar et al., (1999)).
La caractérisation de la protéine de l'ORF1 par analyse de l'hydrophilie, en utilisant la méthode de Hopp et Woods (1981) a permis de mettre en évidence la présence de deux régions hydrophiles majeures. The characterization of the ORF1 protein by hydrophilicity analysis, using the method of Hopp and Woods (1981), made it possible to demonstrate the presence of two major hydrophilic regions.
La première région hydrophile est localisée au niveau de la partie Nterminale de la séquence en acides aminés et contient un domaine riche en arginine, et la seconde est localisée à proximité de l'extrémité C-terminale de la séquence de l'ORF1. The first hydrophilic region is localized at the N-terminal portion of the amino acid sequence and contains an arginine-rich domain, and the second is located near the C-terminus of the ORF1 sequence.
Exemple 3 : Analyse phylogénique
Un arbre phylogénique a été construit par la méthode décrite par Saitou et al. (1987), après alignement de la protéine ORF1 de X94TTV avec 26 séquences complètes disponibles dans les bases de données de l'ORF1 de TTV. Trois branches majeures ont été observées avec des supports significatifs de bootstrap de 100 % qui correspondaient aux génotypes 1,2 et 3 (Mushahwar et al., 1999 et Erker et al., 1999). Des résultats similaires ont été observés après construction d'un arbre phylogénique sur la base des séquences nucléotidiques. La relation génétique de la séquence de X94-TTV a été déterminée comme étant la plus proche des séquences du génotype 1 et il en a été déduit qu'il appartenait au sous type 1a. Example 3: Phylogenetic Analysis
A phylogenetic tree was constructed by the method described by Saitou et al. (1987), after alignment of the X94TTV ORF1 protein with 26 complete sequences available in the TTV ORF1 databases. Three major branches were observed with 100% significant bootstrap supports that corresponded to genotypes 1,2 and 3 (Mushahwar et al., 1999 and Erker et al., 1999). Similar results were observed after construction of a phylogenetic tree based on nucleotide sequences. The genetic relationship of the X94-TTV sequence was determined to be the closest to genotype 1 sequences and it was inferred that it belonged to subtype 1a.
Exemple 4: Expression et purification de la protéine recombinante de la partie C- terminale de l'ORF1 . Example 4 Expression and purification of the recombinant protein of the C-terminal portion of ORF1.
Le clone positif 11-94X correspondant à la région C-terminale de l'ORF1 a été ré-amplifié en utilisant les oligonucléotides ci-dessous pour The 11-94X positive clone corresponding to the C-terminal region of ORF1 was re-amplified using the oligonucleotides below to
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les sites de restriction BamHl et SacI aux extrémités 5' et 3', respectivement. the BamHI and SacI restriction sites at the 5 'and 3' ends, respectively.
5' TCTCTGGATCCGGACAGACCCCCAACTAATA 3'
5' TCTCTCGAGCTCGGGTTGATATCTTGATTTTG 3'
Le produit de PCR digéré BamHI-SacI a été lié dans les sites BamHl et Sacl du vecteur d'expression pET21 b (Novagen) en amont d'une queue polyhistidine. La transformation du mélange de ligation a été réalisée dans la souche JM109 d'Escherichia coli et l'ADN recombinant des clones sélectionnés a été extrait à l'aide du kit QIAfilter Plasmid Midi Kit (nom commercial), commercialisé par la société QIAGEN. L'expression des protéines recombinantes a ensuite été réalisée dans la souche BL21 d'Escherichia coli. Après culture une nuit à 37 C dans le milieu de Luria Bertani (LB) contenant 100 g/ml d'ampicilline, une dilution au 1 :50ème a été soumise à croissance jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm atteigne 0,6 à 1 unité. Les cultures ont ensuite été amenées à la concentration finale de 1 mM par addition pendant trois heures d'isopropyl- P-D-thiogalactopyranoside. Les bactéries ont été centifugées à 3000 tpm pendant 20 min., à 4 C, puis le culot de centrifugation a été resuspendu dans 1 :10 volume de tampon PBS et une lyse a été réalisée par sonication sur glace jusqu'à ce que le surnageant devienne clair. Le fait que la protéine recombinante surexprimée soit récupérée à partir de la fraction insoluble du lysat cellulaire, suggère une agrégation protéique dans des corps d'inclusion insolubles ou une co-précipitation avec des débris cellulaires bactériens non solubles. Les corps d'inclusion ont été traités avec du sarcosyl 1,5% dans du tampon STE (10 mmoles/I Tris, pH 8,100 mmoles/I EDTA, pH 8) pour obtenir la partie C-terminale de l'ORF1 dans la fraction soluble. Alternativement, la protéine recombinante a été solubilisée avec de l'urée 8M dans Na2HP04 0,1 M, Tris-HCI 0,01 M, Tween 20 0,05%, pH 8. Cette dernière condition a permis de purifier la protéine sur des billes d'agarose magnétiques Ni-NTA (Ni-NTA Magnetic Agarose Beads, QIAGEN) en conditions dénaturantes. Les résidus histidine de la protéine recombinante se lient efficacement sur une colonne d'affinité avec un agent chélatant Ni2 +, dans des conditions dénaturantes. 5 'TCTCTGGATCCGGACAGACCCCCAACTAATA 3'
5 'TCTCTCGAGCTCGGGTTGATATCTTGATTTTG 3'
The digested BamHI-SacI PCR product was ligated into the BamHI and SacI sites of the pET21 b expression vector (Novagen) upstream of a polyhistidine tail. The transformation of the ligation mixture was carried out in Escherichia coli strain JM109 and the recombinant DNA of the selected clones was extracted using the QIAfilter Plasmid Midi Kit (trade name) kit, marketed by QIAGEN. The expression of the recombinant proteins was then carried out in the Escherichia coli strain BL21. After culturing overnight at 37 ° C in Luria Bertani (LB) medium containing 100 g / ml ampicillin, a 1: 50 dilution was grown until the optical density at 600 nm reached 0, 6 to 1 unit. The cultures were then brought to the final concentration of 1 mM by addition for three hours of isopropyl-PD-thiogalactopyranoside. The bacteria were centrifuged at 3000 rpm for 20 min at 4 C, then the centrifugation pellet was resuspended in 1: 10 volume of PBS buffer and lysis was performed by sonication on ice until the supernatant become clear. The fact that the overexpressed recombinant protein is recovered from the insoluble fraction of the cell lysate suggests protein aggregation in insoluble inclusion bodies or co-precipitation with non-soluble bacterial cell debris. The inclusion bodies were treated with 1.5% sarcosyl in STE buffer (10 mmol / l Tris, pH 8,100 mmol / I EDTA, pH 8) to obtain the C-terminal portion of the ORF1 in the fraction. soluble. Alternatively, the recombinant protein was solubilized with 8M urea in 0.1M Na2HPO4, 0.01M Tris-HCl, 0.05% Tween 20, pH 8. This latter condition made it possible to purify the protein on Magnetic agarose beads Ni-NTA (Ni-NTA Magnetic Agarose Beads, QIAGEN) under denaturing conditions. The histidine residues of the recombinant protein efficiently bind to an affinity column with a Ni2 + chelating agent under denaturing conditions.
La protéine tag-His a ensuite été éluée des billes en réduisant le pH à 4,5. The tag-His protein was then eluted from the beads by reducing the pH to 4.5.
La protéine éluée a été analysée par coloration au Bleu Brillant de Coomassie après électrophorèse sur gel SDS PAGE 10%, en conditions The eluted protein was analyzed by Coomassie Brilliant Blue staining after 10% SDS PAGE gel electrophoresis, under conditions of
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dénaturantes (Laemmli (1970)). La pureté de la fraction éluée était supérieure à 95 % Une analyse par Western blot de la protéine purifiée avec un anticorps anti-histidine a confirmé la masse moléculaire prédite de l'extrémité C-terminale de l'ORF1, par détection d'un signal positif aux alentours de 32 kDa. denaturing (Laemmli (1970)). The purity of the fraction eluted was greater than 95% Western blot analysis of the purified protein with an anti-histidine antibody confirmed the predicted molecular mass of the C-terminal end of the ORF1, by detection of a signal positive around 32 kDa.
Exemple 5 : Détection d'anticorps anti-TTV dans des sérums humains. Example 5: Detection of anti-TTV antibodies in human sera.
L'immunoréactivité de la partie C-terminale de l'ORF1 de la protéine contre des sérums humains a été testée par Western blot. Après migration sur gel préparatif SDS PAGE 10 %, la protéine recombinante purifiée ou solubilisée dans le sarcozyl a été transférée par électrophorèse sur des membranes de fluorure de polyvinylidiène de la société Millipore, selon la méthode de Towbin et al. (1979). Les blots ont été bloqués 30 min. à température ambiante avec la poudre de lait non gras à 5% dans une solution tamponnée par du Tris (TBS. Tris 20 mmoles/l, pH 7,5, NaCI 500 mmoles/l) avant incubation pendant une nuit à 4 C avec des sérums humains dilués au 1 :100 dans du TBS contenant du Tween 20 (0,5 ml/l) (TBS-T). 70 sérums incluant 30 donneurs de sang volontaires, 30 patients atteints d'hépatites non A à G et 10 enfants sains âgés de 2 à 5 ans ont été testés. Les membranes ont été lavées trois fois avec TBS-T et incubées à température ambiante pendant 1 heure avec des anticorps antiIgA+IgG+IgM humaines de chèvre conjuguées à la phosphatase alcaline ou avec des anticorps monoclonaux anti- IgM humaine de souris conjugués à la phosphatase alcaline à une dilution au 1 : 2000 dans du TBS-T. Les membranes ont ensuite été lavées deux fois avec du TBS-T, une fois avec du tampon borate (borate 31,5 mmoles/l, pH 9,7, MgS04 10 mmoles/l) et incubées avec une solution de substrat (o-dianisidine tétra-azotée 0,5g/l et phosphate d'acide ss-naphtylique 0,5/1 dans du tampon borate). De manière alternative, des blots ont été révélés en utilisant soit un conjugué Ni2+NTA-phosphatase alcaline avec une procédure en une étape (QIAGEN), soit avec un anticorps monoclonal anti-penta-histidine avec une procédure en deux étapes (QIAGEN), en utilisant les protocoles du fabricant. Les résultats ont révélé la présence d'anticorps anti-TTV, dirigés contre la protéine recombinante de 32 kDa. Une analyse complémentaire avec la protéine recombinante purifiée a conduit à des résultats identiques avec Immunoreactivity of the C-terminal portion of the ORF1 of the protein against human sera was tested by Western blotting. After migration on SDS PAGE 10% preparative gel, the recombinant protein purified or solubilized in sarcozyl was electrophoretically transferred to polyvinylidiene fluoride membranes from Millipore, according to the method of Towbin et al. (1979). The blots were blocked for 30 minutes. at room temperature with 5% non-fat milk powder in a Tris-buffered solution (TBS, 20 mmol / l Tris, pH 7.5, 500 mmol / l NaCl) before incubation overnight at 4 ° C. with human sera diluted 1: 100 in TBS containing Tween 20 (0.5 ml / l) (TBS-T). 70 sera including 30 volunteer blood donors, 30 patients with non-A to G hepatitis and 10 healthy children aged 2 to 5 years were tested. The membranes were washed three times with TBS-T and incubated at room temperature for 1 hour with alkaline phosphatase conjugated anti-IgA + IgG + IgM human IgM antibodies or with phosphatase-conjugated mouse anti-human IgM monoclonal antibodies. alkaline at 1: 2000 dilution in TBS-T. The membranes were then washed twice with TBS-T, once with borate buffer (borate 31.5 mmol / l, pH 9.7, MgSO 4 10 mmol / l) and incubated with a substrate solution (o- 0.5 g / l tetra-nitrogen dianisidine and 0.5 / 1 ss-naphthyl phosphate in borate buffer). Alternatively, blots were revealed using either a Ni2 + NTA-alkaline phosphatase conjugate with a one-step procedure (QIAGEN), or with an anti-penta-histidine monoclonal antibody with a two-step procedure (QIAGEN), using the manufacturer's protocols. The results revealed the presence of anti-TTV antibodies, directed against the recombinant protein of 32 kDa. Further analysis with the purified recombinant protein led to identical results with
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des sérums, sans réactivité croisée avec des protéines de E. coli, ce qui confirme le caractère immunogène de la protéine native. La spécificité de la réponse IgG anti-TTV a été contrôlée par des dilutions successives de 3 sérums positifs qui donnaient pour chacun un signal positif jusqu'à la dilution au 1/1000. De plus, la réactivité de deux sérums anti-TTV était réduite de manière significative quand ces échantillons de sérums avaient été antérieurement pré-incubés avec la protéine recombinante fixée sur des billes d'agarose Ni-NTA. Tous les sérums humains testés, excepté un, montraient une immunoréactivité contre la protéine recombinante, révélée par les anticorps anti-lgG, IgM et IgA humaines, indiquant une prévalence élevée de 98,5 % de la réponse anti-TTV chez les humains. De plus, la réponse IgM anti-TTV a été testée sur 26 sérums d'adultes et 10 sérums d'enfants avec la protéine recombinante solubilisée dans le sarcozyl par Western blot. Aucune réponse primaire n'a été détectée, suggérant qu'il n'y avait pas eu d'infection récente des hôtes infectés. sera, without cross-reactivity with E. coli proteins, which confirms the immunogenic nature of the native protein. The specificity of the anti-TTV IgG response was monitored by successive dilutions of 3 positive sera which gave each a positive signal up to 1/1000 dilution. In addition, the reactivity of two anti-TTV sera was significantly reduced when these sera samples had previously been preincubated with the recombinant protein fixed on Ni-NTA agarose beads. All but one of the tested human sera showed immunoreactivity against the recombinant protein, revealed by human anti-IgG, IgM, and IgA antibodies, indicating a high prevalence of 98.5% of the anti-TTV response in humans. In addition, the anti-TTV IgM response was tested on 26 sera of adults and 10 sera of children with the recombinant protein solubilized in sarcozyl by Western blotting. No primary response was detected, suggesting that there was no recent infection of the infected hosts.
Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous. The results are shown in the table below.
Tableau
<tb>
<tb> Solubilisation <SEP> au <SEP> sarcozyl <SEP> Purification <SEP> par <SEP> chélation
<tb> métallique
<tb> Sérums <SEP> humains <SEP> IgG <SEP> + <SEP> IgM <SEP> + <SEP> IgA <SEP> IgM <SEP> IgG <SEP> + <SEP> IgM <SEP> + <SEP> IgA <SEP>
<tb> Donneurs <SEP> sang <SEP> 30/30 <SEP> (100%) <SEP> 0/18 <SEP> 18/18 <SEP> (100%)
<tb> Hépatite* <SEP> 29/30 <SEP> (96,6%) <SEP> 0/8 <SEP> 10/11 <SEP> (90,9%)
<tb> Enfants <SEP> 10/10 <SEP> (100%) <SEP> 0/10 <SEP> 10/10 <SEP> (100%)
<tb>
Hépatite d'étiologie inconnue Exemple 6 : d'anticorps anti-TTV chez des animaux. <Tb>
<tb> Solubilization <SEP> with <SEP> sarcozyl <SEP> Purification <SEP> with <SEP> chelation
<tb> metallic
<tb> Human sera <SEP><SEP> IgG <SEP> + <SEP> IgM <SEP> + <SEP> IgA <SEP> IgM <SEP> IgG <SEP> + <SEP> IgM <SEP> + <SEP > IgA <SEP>
<tb> Donors <SEP> blood <SEP> 30/30 <SEP> (100%) <SEP> 0/18 <SEP> 18/18 <SEP> (100%)
<tb> Hepatitis * <SEP> 29/30 <SEP> (96.6%) <SEP> 0/8 <SEP> 10/11 <SEP> (90.9%)
<tb> Children <SEP> 10/10 <SEP> (100%) <SEP> 0/10 <SEP> 10/10 <SEP> (100%)
<Tb>
Hepatitis of unknown etiology Example 6: anti-TTV antibodies in animals.
En raison de la prévalence immune très élevée chez les humains, et parce que des séquences du virus TTV ont été détectées dans des sérums d'animaux domestiqués, la recherche d'anticorps anti-TTV a été effectuée dans les sérums de chien, de chat, de chèvre, de mouton et de lapin. Un échantillon sérique de chacune de ces cinq espèces d'animaux a été testé. L'incubation et le traitement des membranes ont été réalisés dans les mêmes conditions que celles décrites à l'exemple 5, avec l'utilisation d'anti-IgG pour chaque espèce conjuguées à la Due to the very high immune prevalence in humans, and because TTV virus sequences have been detected in sera from domesticated animals, the search for anti-TTV antibodies has been carried out in dog, cat and dog sera. , goat, sheep and rabbit. A serum sample of each of these five animal species was tested. Incubation and treatment of the membranes were carried out under the same conditions as those described in Example 5, with the use of anti-IgG for each species conjugated to the
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phosphatase alcaline. Des anticorps anti-TTV ont ainsi été détectés par Western blot dans tous les échantillons de sérums animaux testés, avec une intensité de signal forte, comme celle observée à partir des sérums humains. alkaline phosphatase. Anti-TTV antibodies were thus detected by Western blotting in all animal sera samples tested, with a strong signal intensity, such as that observed from human sera.
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SEQ ID NO 1 MASMTGGQQM GRDPTDPQLI VHTNPTKGFV PYSLNFGNGK MPGGSSNVPI 50 RMRAKWYPTL FHQQEVLEAL AQSGPFAYHS DIKKVSLGMK YRFKWIWGGN 100 PVRQQVVRNP CKDSHSSGNR VPRSLQIVDP KYNSPELTFH TWDFRRGLFG 150 QKAIERMQQQ PTTTDIFSAG RKRPRRDTEV YHSSQEGEQK ESLLFPPVKL 200 LRRVPPWEDS QQEESGSQSS EEETQTVSQQ LKQQLQQQRI LGVKLRLLFN 250 QVQKIQQNQD INPSSVDKLA AALEHHHHHH 280 SEQ ID NO 2 ATGGCTAGCA TGACTGGTGG ACAGCAAATG GGTCGGGATC CGACAGACCC 50 CCAACTAATA GTACACACAA ACCCCACAAA AGGCTTTGTT CCCTACTCTT 100 TAAACTTTGG AAATGGTAAA ATGCCAGGAG GTAGTAGTAA TGTGCCTATT 150 AGAATGAGAG CTAAATGGTA TCCAACATTG TTTCACCAGC AAGAAGTACT 200 AGAGGCCTTA GCACAGTCAG GCCCCTTTGC ATACCACTCA GACATTAAAA 250 AAGTATCTCT GGGTATGAAA TACCGTTTTA AGTGGATCTG GGGTGGAAAC 300 CCCGTTCGCC AACAGGTTGT TAGAAATCCC TGCAAAGACT CCCACTCCTC 350 GGGCAATAGA GTCCCTAGAA GCTTACAAAT CGTTGACCCG AAATACAACT 400 CACCGGAACT CACATTCCAT ACCTGGGACT TCAGACGTGG CCTCTTTGGC 450 CAGAAAGCTA TTGAGAGAAT GCAACAACAA CCAACAACTA CTGACATTTT 500 TTCAGCAGGC CGCAAGAGAC CCAGGAGGGA CACCGAGGTG TACCACTCCA 550 GCCAAGAAGG GGAGCAAAAA GAAAGCTTAC TTTTCCCCCC AGTCAAGCTC 600 CTCAGACGAG TCCCCCCGTG GGAAGACTCG CAGCAGGAGG AAAGCGGGTC 650 GCAAAGCTCA GAGGAAGAGA CGCAGACCGT CTCCCAGCAG CTCAAGCAGC 700 AGCTGCAGCA ACAGCGAATC CTGGGAGTCA AACTCAGACT CCTGTTCAAC 750 CAAGTCCAAA AAATCCAACA AAATCAAGAT ATCAACCCGA GCTCCGTCGA 800 CAAGCTTGCG GCCGCACTCG AGCACCACCA CCACCACCACT GA 842 SEQ ID NO 1 MASMTGGQQM GRDPTDPQLI VHTNPTKGFV PYSLNFGNGK MPGGSSNVPI 50 RMRAKWYPTL FHQQEVLEAL AQSGPFAYHS DIKKVSLGMK YRFKWIWGGN 100 PVRQQVVRNP CKDSHSSGNR VPRSLQIVDP KYNSPELTFH TWDFRRGLFG 150 QKAIERMQQQ PTTTDIFSAG RKRPRRDTEV YHSSQEGEQK ESLLFPPVKL 200 LRRVPPWEDS QQEESGSQSS EEETQTVSQQ LKQQLQQQRI LGVKLRLLFN 250 QVQKIQQNQD INPSSVDKLA AALEHHHHHH 280 SEQ ID NO: 2 ATGGCTAGCA TGACTGGTGG ACAGCAAATG GGTCGGGATC CGACAGACCC 50 CCAACTAATA GTACACACAA ACCCCACAAA AGGCTTTGTT CCCTACTCTT 100 TAAACTTTGG AAATGGTAAA ATGCCAGGAG GTAGTAGTAA TGTGCCTATT 150 AGAATGAGAG CTAAATGGTA TCCAACATTG TTTCACCAGC AAGAAGTACT 200 AGAGGCCTTA GCACAGTCAG GCCCCTTTGC ATACCACTCA GACATTAAAA 250 AAGTATCTCT GGGTATGAAA TACCGTTTTA AGTGGATCTG GGGTGGAAAC 300 CCCGTTCGCC AACAGGTTGT TAGAAATCCC TGCAAAGACT CCCACTCCTC 350 GGGCAATAGA GTCCCTAGAA GCTTACAAAT CGTTGACCCG AAATACAACT 400 CACCGGAACT CACATTCCAT ACCTGGGACT TCAGACGTGG CCTCTTTGGC 450 CAGAAAGCTA TTGAGAGAAT GCAACAACAA CCAACAACTA CTGACATTTT 500 TTCAGCAGGC CGCAAGAGAC CCAGGAGGGA CACCGAGGTG TACCACTCCA 5 50 GCCAAGAAGG GGAGCAAAAA GAAAGCTTAC TTTTCCCCCC AGTCAAGCTC 600 CTCAGACGAG TCCCCCCGTG GGAAGACTCG CAGCAGGAGG AAAGCGGGTC 650 GCAAAGCTCA GAGGAAGAGA CGCAGACCGT CTCCCAGCAG CTCAAGCAGC 700 AGCTGCAGCA ACAGCGAATC CTGGGAGTCA AACTCAGACT CCTGTTCAAC 750 CAAGTCCAAA AAATCCAACA AAATCAAGAT ATCAACCCGA GCTCCGTCGA 800 CAAGCTTGCG GCCGCACTCG AGCACCACCA CCACCACCACT GA 842
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