EP1244773A1 - Mutated hepatitis b virus, its nucleic and protein constituents and uses thereof - Google Patents

Mutated hepatitis b virus, its nucleic and protein constituents and uses thereof

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EP1244773A1
EP1244773A1 EP01903881A EP01903881A EP1244773A1 EP 1244773 A1 EP1244773 A1 EP 1244773A1 EP 01903881 A EP01903881 A EP 01903881A EP 01903881 A EP01903881 A EP 01903881A EP 1244773 A1 EP1244773 A1 EP 1244773A1
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EP
European Patent Office
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seq
protein
dna
fragment
sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01903881A
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German (de)
French (fr)
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Christian Trepo
Bernard Mandrand
Alan Kay
Isabelle Chemin
Florence Komurian-Pradel
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Biomerieux SA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Biomerieux SA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Publication date
Application filed by Biomerieux SA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP1244773A1 publication Critical patent/EP1244773A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • hepatitis A, B, C, D, E Five types of viral hepatitis, hepatitis A, B, C, D, E, are fairly well known to date. In each case, the virus invades the liver and causes an inflammatory state with destruction of the liver cells
  • Hepatitis B is caused by a virus, the human hepatitis B virus (HBV).
  • HBV virus was discovered by Blumberg et al. A "new" antigen in leukemia sera, JAMA 1 91: 541, (1 965). The virus is transmitted through the blood, sexual contact or the perinatal route.
  • HBV infection in most cases does not cause any symptoms and is responsible for asymptomatic acute hepatitis.
  • Acute hepatitis is characterized by digestive disorders, abdominal pain, discoloration of the urine and discoloration of the abnormal faeces, asthenia and jaundice. Acute hepatitis can progress to a fulminant form with rapid necrosis of the liver.
  • Viral infection can also progress to a chronic form, either in patients with acute hepatitis, or in individuals for whom the infection was asymptomatic.
  • Chronic carriers have varying degrees of liver damage and a high risk of progression to cirrhosis and the development of primary liver cancer.
  • primary liver cancers represent a crucial public health problem.
  • chronic carriers represent reservoirs for the virus and allow its spread transposing the public health problem on a global level.
  • HBV infection is one of the most common viral infections in humans. It is a ubiquitous disease with a distinct geographic incidence. In Europe and North America between approximately 0, 1% and 1% of the population is infected, while in Asia and Africa up to 20% of the population is a carrier of HBV. It is estimated that around 350 million people are infected with HBV worldwide. A hierarchy of viral infections following a transfusion shows that the transmission of HBV is the first, followed by HCV and then by HIV.
  • HBV is a small DNA virus 42 nm in diameter which belongs to the group of hepatotropic DNA viruses (hepadnavirus) and is classified in the family of Hepadnaviridae. Its genomic structure is remarkably compact.
  • the virus includes an outer shell and a nucleocapsid.
  • the envelope is mainly composed of three surface antigens (HBsAgs: hepatitis B surface antigens) which play a major role in the diagnosis of HBV infections.
  • the nucleocapsid contains the core antigen (HBcAg), a DNA polymerase / reverse transcriptase, as well as the viral genome.
  • the viral nucleus constitutes the infectious element of the virus and the outer membrane carries the main antigenic determinant of the virus, the HBs antigen.
  • the viral nucleus remains inside the nucleocapsid. Its diameter is approximately 28 nm. Despite its small size (3200 base pairs) the circular, partially double-stranded DNA of HBV encodes four types of viral products from its overlapping genes S, C, P, and X.
  • the S gene codes for the HBsAg envelope protein expressed on the outer surface of the virion.
  • the HBsAg envelope protein consists of two major polypeptides, a 24 kDa polypeptide and its 28 kDa glycosylated form.
  • a number of sub-determinants of HBsAg have been identified.
  • the sub-determinant a is carried by all HBsAg isolates.
  • HBsAg may also contain an antigen specific for the d or y, w or r subtypes.
  • the Pre-S genes code for various HBV surface antigens.
  • the P gene encodes DNA polymerase / reverse transcriptase, which is very important in the mechanism of viral replication.
  • the C gene encodes two nucleocapsid proteins, HBeAg which is a soluble secreted protein and HBcAg, the intracellular core protein.
  • HBeAg is a serological marker for high viral replication.
  • the X gene codes for HBxAg which has different biological effects and which can in particular transactivate the transcription of viral and cellular genes. When HBV infects an individual, the viral DNA replicates completely inside the liver cells of the host.
  • the first detectable marker in patient serum is the HBsAg antigen, but this marker rarely persists beyond six months. After the HBs antigen has disappeared in the serum, the anti-HBsAg antibodies become detectable and persist. Because the HBc antigen is sequestered by the HBs envelope antigen, it is not routinely detectable in the sera of patients, but the presence of anti-HBc antibodies is easily demonstrated in one to two weeks following the appearance of the HBs antigen.
  • HBV variants have been suspected for many years. This presumption is based on the detection of viral DNA in the serum and / or the liver of patients with chronic hepatitis, in the absence of evidence of conventional serological markers (HBsAg and anti-HBc).
  • HBsAg in patients carrying DNA sequences from the virus could have several explanations, such as a weak expression of the surface antigen or the presence of mutations in the antigenic determinant of protein S.
  • a viral co-infection could suppress the replication of HBV (Jilg W et al., J. Hepatol, 1 995, 23: 14-20, Jylberberg et al., Clinical infection diseases, 1 996, 23: 1 1 1 7-1 1 25, Ushida et al., J. of Med. Virol. 1 997, 52: 399-405, Hofer et al., Eur. J. Clin; Microbiol. Infect.
  • HBs antigen is masked during the in vivo formation of immune complexes with anti-HBs antibodies.
  • the present inventors have now identified and characterized a new variant or mutant of hepatitis B, the detection of which escapes certain commercial serological tests using a polyclonal antibody both for capture and for detection.
  • the new variant or mutant exhibits, among other things, mutations in the gene coding for the HBs antigen. For the purposes of this patent application, they have called this new variant or mutant HBVm.
  • the present inventors have moreover shown that the negativity of the commercially available tests could be due to these mutations at the level of the sub-determinant a of the HBs antigen. Indeed, the sub-determinant a is a major antigenic site of the HBV surface antigen and mutations at this level explain an absence of detection by existing tests.
  • the subject of the present invention is the HBVm virus whose genomic DNA comprises a nucleotide sequence of the S gene which codes for an HBsm antigen (mutated HBs antigen), said nucleotide sequence being referenced SEQ ID NO 1.
  • the genomic DNA of HBVm also comprises a nucleotide sequence of the Pre-S gene referenced in SEQ ID NO 3.
  • the Pre-S gene coding for surface antigens the S gene coding for an HBsAg envelope protein, the C gene coding for an HBeAg protein and an HBcAg protein, the P gene coding for a DNA polymerase enzyme / reverse transcriptase and the X gene coding for a HBxAg protein and is characterized in that the S gene comprises a DNA nucleotide sequence referenced SEQ ID NO 1 and in that the Pre-S region comprises a DNA nucleotide sequence referenced SEQ ID NO 3; it being understood that the rest of the genome of the HBVm virus is substantially identical to the genome of the wild HBV virus, as the inventors have shown by complete sequencing of the genome of the HBVm virus.
  • the invention also relates to a DNA molecule, characterized in that it comprises a DNA nucleotide sequence chosen from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, their fragments as defined below, and their complementary sequences and an RNA molecule, characterized in that it comprises an RNA nucleotide sequence which is the product of transcription of a DNA nucleotide sequence chosen from SEQ ID N01, SEQ ID NO 3, their fragments and their complementary sequences.
  • the invention also relates to a modified surface protein, characterized in that it comprises or consists of a peptide sequence chosen from SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 and their fragments as defined below.
  • the subject of the invention is also a nucleotide fragment of DNA or RNA of at least 12 nucleotides, preferably at least 15 nucleotides or 18 nucleotides and advantageously at least 21 nucleotides and which comprises a sequence DNA nucleotide which comprises nucleotides 325 to 336 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 235 to 237 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 391 to 393 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 478 to 480 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 28 to 30 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 39 to 41 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 358 to 360 of SEQ ID NO 1 and
  • fragments comprise the nucleotides 628 to 630 of SEQ ID NO 1
  • said fragments also include the nucleotides 325 to 336, and / or 235 to 237, and / or 391 to 393, and / or 478 to 480 , and / or 28 to 30, and / or 39 to 41, and / or 358 to 360, and / or 385 to 387, and / or 1 18 to 120 of SEQ ID NO 1, and / or nucleotides 250 to 252 of SEQ ID NO 3.
  • the invention also relates to a protein fragment, characterized in that it comprises a peptide sequence of at least 4 amino acids, preferably at least 5 or 6 amino acids and advantageously at least 7 amino acids, in particular from 6 to 1 5 amino acids and advantageously from 6 to 10 or from 8 to 1 2 amino acids, and which comprises amino acids 109-1 1 2 and / or 79 and / or 131 and / or 1 60 and / or 10 and / or 14 and / or 1 20 and / or 1 29 and / or 40 and / or 210 of SEQ ID NO 2 and / or amino acid 84 of SEQ ID NO 4; a protein fragment which comprises or consists of a peptide sequence which comprises the peptide sequences SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 4; a protein fragment whose peptide sequence consists of a sequence chosen from SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 4.
  • the above-mentioned fragments comprising amino acid 84 of SEQ ID NO 4 are fragments comprising at least 7 amino acids.
  • fragments comprise the nucleotides amino acid 210 of SEQ ID NO 2
  • said fragments also comprise amino acids 109-1 12 and / or 79 and / or 13 and / or 160 and / or 10 and / or 14 and / or 120 and / or 129 and / or 40 of SEQ ID NO 2 and / or amino acid 84 of SEQ ID NO 4.
  • the mutated HBsAg protein has antigenic and / or immunological characteristics different from the wild HBsAg protein and is in particular not recognized by polyclonal antibodies directed against the wild protein.
  • the mutated protein (HBsAgm) and / or the mutated Pre-S surface protein (Pre-Sm) can be obtained by peptide synthesis or by genetic recombination techniques well known to those skilled in the art.
  • HBVm mutations have been identified and demonstrated by cloning, sequencing and alignment of the HBVm nucleotide and protein sequences with respect to the 102 sequences of the HBs antigen of the NBRF / PIR base, available on the Infobiogen server in Villejuif.
  • DNA synthesis can be carried out using commercial elements.
  • An example of such DNA synthesis is described by Hayden and Mandecki, DNA 7: 571 (1,988).
  • Another method is the cloning, in an appropriate single-stranded vector, of an appropriate restriction fragment from a vector which already comprises the HBV genome and then carrying out site-directed mutagenesis in vitro, as described for example by Bolstein et al., Science, 229, 1,193 (1982). A culture of E.
  • coli K12, strain C600 containing the recombinant plasmid pRIT10601 comprising an HBV genome of the ay type cloned in pBR322 was the subject of a deposit at ATCC on June 2, 1 982 under the number accession ATCC 391 32, in accordance with the provisions of the Budapest Treaty.
  • the sequence of the S gene coding for the HBsAgm protein or longer sequences also coding for the Pre-S polypeptides can be excised from such clones by conventional techniques.
  • a suitable restriction fragment is for example the Xbal-Accl fragment of the coding region of the S gene of pRIT1 0601. Vectorization systems for in vitro mutagenesis are commercially available.
  • the mutated gene fragment is then reintroduced into the S gene.
  • Another method for obtaining the desired sequence modifications is the use of PCR (Polymerase Chain Reaction) as described by Ho et al. Gene, 77, 51 (1 989).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the coding sequence for a mutated protein is expressed in an appropriate host cell under the control of an appropriate promoter. It is thus possible to use a functional expression cassette in a cell originating from a eukaryotic or prokaryotic organism allowing the expression of the S gene coding for the HBsAgm protein and / or the expression of the mutated surface protein coded by the Pre-S gene or the expression of fragments of these proteins, the gene being placed under the control of the elements necessary for its expression.
  • the cell is a cell from a eukaryotic organism, such as CHO or COS cells and advantageously a cell from a lower eukaryotic organism, such as yeast cells.
  • the recombinant protein HBsAgm can be obtained in a Saccharomyces cerevisiae cell as described by Harford et al., Develop. Biol. Standard.
  • HBVm surface proteins can also be expressed in a mutant strain of Saccharomyces cerevisiae as described by Kniskern et al. in US Patent 5,614,384.
  • the present invention also encompasses a functional expression cassette in a cell originating from a prokaryotic or eukaryotic organism allowing the expression of a DNA sequence or a DNA fragment as defined above, placed under element control necessary for its expression; the vector comprising the expression cassette and the cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably a lower eukaryotic organism and advantageously a cell derived from Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris comprising the expression cassette or the vector, as well as the surface protein produced by the expression cassette, the vector or the cell.
  • the method for preparing a recombinant modified surface protein of the invention consists in cultivating a host cell as defined above in an appropriate culture medium, said host cell being transformed with an expression vector which contains a DNA nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO 1 and / or SEQ ID NO 3, their fragments and their complementary sequences or a nucleotide fragment as defined above and, in purifying said modified surface protein produced to a required degree of purity.
  • Another subject of the invention is an immunogenic peptide which has a peptide sequence as defined above or which consists of a recombinant protein obtained according to the abovementioned protocols and its use for the production of a monoclonal or polyclonal antibody by immunization of a mammalian animal, preferably a mouse, rat or rabbit, with said immunogenic peptide.
  • a mammalian animal preferably a mouse, rat or rabbit
  • the production of polyclonal and monoclonal antibodies is part of the general knowledge of those skilled in the art.
  • Antibodies can also be produced by immunizing mice or rabbits with the viral particles of HBVm.
  • the immunogen can be coupled to Lymphet Keyhole hemocyanin (peptide KLH) as a support for immunization or to serum albumin (peptide SA). The animals are injected with immunogen using complete Freund's adjuvant.
  • Serums and Hybridoma culture supernatants from immunized animals are analyzed for their specificity and selectivity using standard techniques, such as for example ELISA or Western Blot tests.
  • the hybridomas producing the most specific and sensitive antibodies are selected.
  • Monoclonal antibodies can also be produced in vitro by cell culture of the hybridomas produced or by recovery of ascites fluid, after intraperitoneal injection of the hybridomas in mice. Whatever the mode of production, by supernatant or ascites, the antibodies are then purified.
  • the purification methods used are essentially filtration on an ion exchange gel and exclusion chromatography or affinity chromatography (protein A or G). A sufficient number of antibodies are screened in functional tests to identify the best performing antibodies.
  • the in vitro production of antibodies, antibody fragments or antibody derivatives, such as chimeric antibodies produced by genetic engineering is well known to those skilled in the art.
  • antibody fragment is meant the fragments F (ab) 2, Fab, Fab ', sFv (Blazar et al., 1 997, Journal of Immunology 159: 5821-5833 and Bird et al., 1 988, Science 242: 423-426) of a native antibody and by derivative means, inter alia, a chimeric derivative of a native antibody (see for example Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120: 657-662 and Chaudray et al., 1 989, Nature 339: 394-397).
  • the monoclonal or polyclonal antibody thus obtained is incorporated into a diagnostic composition which is used in a method for detecting at least one mutated surface protein which consists of SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 in a biological sample, according to which the biological sample is brought into contact with said diagnostic composition under predetermined conditions which allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected.
  • the monoclonal antibodies obtained are specific for the mutated protein sought and do not recognize the wild protein, for example a wild HBsAg protein.
  • the invention also relates to a diagnostic composition for the detection of autoantibodies in a biological sample, said composition comprising, inter alia, a mutated protein or protein fragment as defined above and the method for detecting said autoantibodies directed against at least one mutated surface protein which consists of SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 in a biological sample, according to which the biological sample is brought into contact with the diagnostic composition under predetermined conditions which allow the formation of complexes antibody / antigen and the formation of said complexes is detected.
  • the cloning of the genome of hepatitis B virions of different serotypes is well known. Mention may, among others, be made for reference to Miller et al., Hepatology, 9 (1,989), page 322.
  • the present invention also relates to a vaccine against the HBVm virus.
  • This vaccine is prepared according to known methods already used for the preparation of commercially available vaccines.
  • This vaccine comprises at least the HBsAgm protein and / or the Pre-Sm protein, either in native form, or in recombinant form, or a synthetic polypeptide whose peptide sequence corresponds to the amino acid sequence of HBsAgm and / or Pre- Sm, or fragments of said proteins and said polypeptide.
  • the HBsAgm and / or Pre-Sm proteins in native form are recovered from the plasma of patients infected with HBVm.
  • the HBsAgm and / or Pre-Sm proteins in recombinant form are obtained by using a functional expression cassette in a cell derived from a eukaryotic or prokaryotic organism allowing the expression of the S gene coding for the HBsAgm protein and / or of the Pré-Sm gene coding for the Pré-Sm region, placed under the control of the elements necessary for its expression.
  • the cell is a cell originating from a eukaryotic organism, such as yeast cells.
  • Recombinant HBsAgm and / or Pre-Sm proteins for vaccine production can be obtained in a Saccharomyces cerevisiae cell as described by Harford et al., Develop. Biol. Standard.
  • the vaccines can also be prepared from hybrid immunogenic particles comprising the HBsAgm protein and / or the Pre-Sm protein, as described in patent application EP 0 278 940. Such particles can contain, for example, all or part of the precursor protein of HBsAgm coded by the coding sequence which immediately precedes the S gene in the HBV genome, ie the coding sequence Pre-S.
  • the vaccine may further comprise the Pre-Sm protein of the invention, either isolated and purified from the plasma of patients, or obtained by genetic recombination, or also obtained by peptide synthesis or a fragment of said protein.
  • the vaccine comprises the HBsAgm and Pre-Sm proteins defined above, optionally combined with the HBsAgm 'and / or Pre-Sm' proteins, defined below, or their fragments and / or the HBsAg and / or Pre-S proteins. or their fragments, wild type; it being understood that the proteins HBsAgm ', Pré-Sm', HBsAg and Pré-S meet the general definitions given for the proteins HBsAgm and Pré-Sm.
  • An immunogenic or vaccine composition according to the invention is a composition which comprises a protein or a protein fragment as defined above, optionally combined with a suitable vehicle and / or or adjuvant and / or a pharmaceutically acceptable excipient.
  • Vaccines comprising the HBsAgm protein and / or the Pre-Sm protein or their fragments are prepared in a conventional manner and contain an immunoprotective amount of the HBsAgm protein and / or the Pre-Sm protein and / or their fragments, preferably in a buffered saline solution and mixed or adsorbed using known adjuvants, such as aluminum hydroxide and phosphate.
  • the present invention also relates to vaccines including nucleic acid molecules which code for a protein (s) of the invention or for immunogenic peptides or their fragment (s).
  • the nucleic acid vaccines in particular the DNA vaccines, are generally administered in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle by intramuscular or subcutaneous injection.
  • the aforementioned nucleic acid vaccines may further comprise nucleic acid molecules which code for the proteins HBsAgm 'and / or Pre-Sm' and / or HBsAg and / or Pre-S defined above.
  • These vaccines are composed of at least one gene coding for at least one protein or antigen of the invention, the expression of which is regulated by a strong promoter, preferably a mammalian promoter, expressed on a plasmid or DNA vector of bacterial origin. .
  • a strong promoter preferably a mammalian promoter
  • DNA vaccines When administered by intramuscular or subcutaneous injection, DNA vaccines are transcribed and translated and the protein they encode is presented to the immune system inducing a humoral and cellular response.
  • DNA vaccines are transcribed and translated and the protein they encode is presented to the immune system inducing a humoral and cellular response.
  • One of the main advantages of DNA vaccines is that they can be built and manipulated. They are likely to provide their own adjuvant in the form of CpG sequences present in bacterial DNA.
  • DNA vaccines cause de novo synthesis of proteins in transfected cells leading to the association of antigenic peptides with MHC I determinants and therefore the activation of cytotoxic T cells. In addition, DNA vaccines do not induce measurable immune responses to the vector or plasmid, thus allowing repeated use.
  • immunoprotective means that a sufficient quantity of protein, in particular HBsAgm protein and / or Pre-Sm protein or their fragments, is administered to an individual to induce production of antibodies (humoral immune response ) sufficient for it to be protective or an immune response mediated by cytotoxic cells (cellular immune response) to confer protection against the infectious agent without inducing side effects.
  • the two types of response are distinguished in that the antibodies recognize the antigens in their three-dimensional form whereas the cytotoxic cells recognize portions of said antigens, associated with giycoproteins coded by the major histocompatibility complex (MHC).
  • MHC major histocompatibility complex
  • Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) play an essential role in the defense of cells infected with viruses. They act directly by cytotoxicity but also by providing specific and non-specific help to other immunocytes, such as macrophages, B cells and other T cells. Infected cells transform the antigen through intracellular events involving proteases. The transformed antigen is then presented on the surface of the cells in the form of peptides linked to HLA class I molecules at the level of the T cell receptors on the CTLs.
  • Molecules of MHC class I can also bind exogenous peptides and present them to CTLs without intracellular transformation.
  • Chisari et al. (Microbiol. Pathogen. 6:31 (1,989)) suggested that liver damage could be mediated by a HLA class I-restricted CD8 + cytotoxic T cell response to antigens encoded by HBV.
  • the commercially available HBV vaccines which use either the HBsAg protein purified from the plasma of HBV carriers at a chronic stage of the disease, or a recombinant HBsAg protein or synthetic peptides do not confer a real protection for the person only in approximately 90% of cases.
  • HBV envelope antigen HBsAg
  • the present invention also relates to peptides which induce responses of cytotoxic T lymphocytes restricted by MHC class I molecules, derived from SEQ ID NO 2, the peptide sequence of which consists of a sequence of at least 6 amino acids, preferably at least 8 or 9 amino acids and advantageously 8 to 12 contiguous amino acids, said sequence being selected in SEQ ID NO 2 and inducing a cytotoxic T lymphocyte response restricted by MHC class I molecules and their uses in an immunogenic composition.
  • the amount of protein or peptide administered depends on the addition or not of an adjuvant, but generally is between 10 and 50 ⁇ g / ml of protein or peptide. Thus, commonly, 20 / g / 0.5 ml of protein is administered per dose in adults and 10 / g / 0.5 ml in children.
  • HBsAgm protein and / or Pre-Sm protein or their fragments can also be mixed with HBsAg and / or Pre-S proteins or fragments of said wild-type proteins for the formulation of a vaccine. They can be also mixed with hybrid particles carrying epitopes of proteins from other organisms or with other immunogenic compounds for the formulation of bivalent or multivalent vaccines. The preparation of vaccines is described in particular in "Vaccines", ed. Voiler et al., University Park Press, Baltimore, Md., USA, 1,978.
  • the vaccine is administered at a determined dose in one or more injection (s) intramuscularly or subcutaneously, followed by booster (s), if necessary.
  • the immunizing effect of the vaccine is followed by an assay of anti-HBsAgm antibodies and / or anti-Pre-Sm protein in the vaccinated individual.
  • the concentration of nucleic acid in the composition used for administration in vivo is approximately 100 ⁇ g / ml to 10 mg / ml, preferably 1 mg / ml.
  • protein (s) or peptide (s) derived from interest or their fragment (s), alone or in combination is used for prophylaxis and / or therapy.
  • proteins or peptides administered are characterized in that they do not exhibit the virulence of HBV but are capable of inducing an immune response, humoral or cellular, in the individual to whom they are administered.
  • Such proteins are said to be "modified", but their immunogenicity is preserved.
  • the modified molecules can be obtained by synthetic or / and recombinant techniques or from natural molecules modified by chemical or physical treatments.
  • the identification of vaccine protein (s) or peptide (s) is carried out as follows: the “modified” candidate molecules are analyzed in a functional test to ensure that they have lost their toxicity and to verify their immunogenicity (i) by performing an in vitro test for proliferation of CD4 + T cells specific for the administered antigen (T cell assay) or an in vitro cytotoxicity test for CD8 + lymphocytes specific for the administered antigen, and (ii) by measuring, among other things, the level of circulating antibodies directed against the natural protein. These modified forms are used to immunize men by standardized procedures with appropriate adjuvants.
  • the nucleic acids for vaccine use are also analyzed (i) by carrying out an in vitro test for proliferation of CD4 + T lymphocytes specific for the administered antigen (T cell assay) or an in vitro cytotoxicity test for CD8 + lymphocytes specific to the administered antigen and, (ii) by measuring, among other things, the level of circulating antibodies directed against the protein encoded by l 'Viral DNA.
  • the vaccines prepared are injectable, that is to say in liquid solution or in suspension.
  • the preparation can also be emulsified.
  • the antigenic molecule can be mixed with excipients which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient.
  • the vaccine may contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents or adjuvants such as aluminum hydroxide, dipeptide muramyl or their variations.
  • auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents or adjuvants such as aluminum hydroxide, dipeptide muramyl or their variations.
  • peptides their coupling to a larger molecule (KLH, tetanus toxin) sometimes increases immunogenicity.
  • the vaccines are administered conventionally by injection, for example intramuscularly. Additional formulations favorable with other modes of administration include suppositories and sometimes oral formulations.
  • pharmaceutically acceptable vehicle is meant the supports and vehicles which can be administered to humans or to an animal, as described for example in Remington's Pharmaceutical Sciences 1 6 th ed., Mack Publishing Co.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic , hypotonic or has low hypertonicity and has a relatively low ionic strength.
  • the definitions of pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants are also given in Remington's Pharmaceutical Sciences supra.
  • One aspect of the invention also relates to a therapeutic or prophylactic preparation for the treatment or prevention of an infection with the HBVm virus which comprises a therapeutic or prophylactic agent, ie at least anti-HBSAgm protein antibodies and / or pre-Sm anti-protein and / or antibodies directed against fragments of said proteins, possibly associated with anti-wild-type HBsAg antibodies and / or wild-type Pre-S anti-protein and / or antibodies directed against fragments of said proteins, in particular neutralizing antibodies and their uses for the treatment or prevention of disease.
  • a therapeutic or prophylactic agent ie at least anti-HBSAgm protein antibodies and / or pre-Sm anti-protein and / or antibodies directed against fragments of said proteins, possibly associated with anti-wild-type HBsAg antibodies and / or wild-type Pre-S anti-protein and / or antibodies directed against fragments of said proteins, in particular neutralizing antibodies and their uses for the treatment or prevention of disease.
  • Immunoglobulins whose antibody titer, in particular anti-HBs antibody, has been controlled can be used in prophylaxis in subjects not vaccinated against hepatitis B, accidentally contaminated, and in children new born to an infected mother. Also included in the definition of therapeutic or prophylactic preparation are the aforementioned vaccine or immunogenic compositions.
  • At least one protein of the invention HbsAgm or Pre-Sm is injected into an animal, obtained by isolation and purification from serum or plasma, by genetic recombination or by peptide synthesis, optionally combined. to the protein HBsAgm 'and / or Pre-Sm' and / or to a protein HBsAg wild and / or wild Pre-S.
  • the injections are carried out, at various established concentrations, in mammalian animals, such as mice or rats, intramuscularly, subcutaneously or others.
  • a negative control is carried out in parallel.
  • the injections are given in a single dose or in repeated doses, with different time intervals between each administration. A few hours to a few weeks after administration, biological samples, preferably blood or serum, are taken. These samples are made:
  • an assay of the cellular immune response induced against the protein (s) or peptide (s) of interest or their fragments and against any immunogenic peptide derived from said proteins or peptides or their fragments by carrying out, for example, an in vitro activation test of helper T lymphocytes specific for the antigen administered, by quantifying the cytotoxic T lymphocytes according to the so-called ELISPOT technique, described by Scheibenbogen et al., 1 997 Clinical Cancer Research 3: 221-222 .
  • Such a determination is particularly advantageous for the evaluation of the effectiveness of a vaccination approach in an individual or for diagnose and / or predict a potential medical condition by seeking to demonstrate an immune response that would naturally develop in a patient.
  • the animal is then sacrificed and the effectiveness of the therapeutic agent is demonstrated.
  • nucleic acid fragments or oligonucleotides defined from knowledge of the nucleotide sequences which code for the proteins of interest or for their fragments or from knowledge of polypeptide sequences of said proteins of interest or their fragments;
  • the evaluation of the efficacy of a therapeutic or prophylactic agent and the ex vivo therapeutic monitoring in humans is determined as follows: the therapeutic agents to be tested for a therapeutic activity and / or for a therapeutic monitoring are administered by different routes to humans, such as intramuscular, subcutaneous or other routes. Different doses are administered to humans.
  • the clinical record of the patient at the time of the first administration is perfectly known. One or more administrations can be carried out with different intervals between each administration, which can range from a few days to a few years.
  • Biological samples are taken at determined time intervals after administration of the therapeutic agent, preferably blood, serum. Different analyzes are carried out from these samples. Just before the first administration of the therapeutic agent, these samples and these same analyzes are also carried out. A classic clinical and biological examination is also carried out in parallel with the additional analyzes which are described below, at different times of the analysis.
  • the therapeutic agent preferably blood, serum.
  • Different analyzes are carried out from these samples. Just before the first administration of the therapeutic agent, these samples and these same analyzes are also carried out.
  • a classic clinical and biological examination is also carried out in parallel with the additional analyzes which are described below, at different times of the analysis.
  • Analyses carried out are: a qualitative and quantitative measurement of the proteins of interest in serum or in the blood by ELISA and / or Western Blot, using antibodies or antibody fragments capable of binding to at least one of the proteins or to one of their fragment and / or a measurement of the activity of said proteins and / or a determination of antibodies specific for the proteins of interest or of their fragments in blood or serum samples by ELISA and / or Western Blot using an isolated and purified natural protein or a fragment of the natural protein and / or a recombinant protein or a fragment of this recombinant protein or a synthetic polypeptide, and / or an assay of the cellular immune response induced against the protein (s) ) of interest and any immunogenic peptide derived from these proteins, as described above, and / or a detection of DNA and / or RNA fragments coding for the protein (s) of interest or a fra said proteins of interest by nucleotide hybridization according to techniques well known to those skilled in the art (Souther
  • the patient is administered either neutralizing soluble antibodies or antibody fragments to inhibit protein activity , either specific soluble antibodies or antibody fragments to remove the protein by formation of complex i muns.
  • Neutralizing antibodies are polyclonal or monoclonal or are fragments of antibodies which recognize the active site of the protein and by binding, inhibits the function of the protein.
  • Non-neutralizing antibodies are polyclonal or monoclonal antibodies or fragments of said antibodies which are capable of recognizing an immunodominant region of the protein and of eliminating it by formation of an immune complex.
  • the ability to the antibody to bind specifically to the protein is analyzed by conventional techniques described, such as for example by ELISA or Western Blot tests using the protein or the natural or synthetic immunogenic peptide.
  • the titer of the antibody is determined.
  • the ability of the antibody to neutralize the function of the protein can be analyzed by various means, for example by determining the decrease in the activity of the immunogenic protein or peptide in the presence of the antibody.
  • Monoclonal or polyclonal antibodies to a target protein or a portion of that protein are produced by conventional techniques used to produce antibodies against surface antigens.
  • mice or rabbits are immunized (i) either with a natural or recombinant protein, (ii) or with any immunogenic peptide derived from this protein, (iii) or with murine cells which express the protein of interest or the peptide and MHC molecules.
  • the murine line Balb / c is the most frequently used.
  • the present invention therefore relates to a biological material for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of human beings infected with at least the HBVm virus, said composition comprising:
  • the present inventors have in fact identified after cloning, sequencing and alignment with the protein sequences available in the NBRF-PIR library, another variant of genotype D, isolated from the same individual and which has two significant mutations.
  • the first mutation concerns the amino acid Arg, in position 201 of the HBsAg protein identified in SEQ ID NO 5 and the second mutation relates to the amino acid Gly, in position 102 of the Pre-S region identified in SEQ ID NO 6.
  • Codons coding respectively for these two amino acids are the AGG codons at position 628-630 in the S gene and at position 782-784 relative to the complete genome sequence and the GGA codon at position 304-306 in the region Pre- S and at position 31 51 -31 53 relative to the complete genome sequence; - (ii) either at least one monoclonal or polyclonal antibody or a fragment of said antibodies, specific for at least one of said proteins or of its fragments, said antibodies or fragments being able to be used alone or in combination and being capable of binding to the minus one of the proteins meeting the above definitions.
  • This antibody can be neutralizing or non-neutralizing, that is to say capable of neutralizing or not neutralizing protein activity.
  • the invention also relates to ligands capable of associating with a nucleotide sequence of DNA or RNA or with a nucleotide fragment as defined above.
  • ligand is meant any molecule capable of associating with a nucleotide sequence of DNA or RNA or with a nucleotide fragment, such as a partially or completely complementary nucleotide fragment, a complementary polynucleotide, an anti- nucleic acid.
  • nucleotide fragments or polynucleotides are part of the general knowledge of a person skilled in the art. Mention may in particular be made of the use of restriction enzymes, and chemical synthesis on an automatic synthesizer. Probes and primers capable of hybridizing under stringency conditions determined to a nucleotide sequence of DNA or RNA or to a nucleotide fragment as defined above are part of this definition. It is within the reach of the skilled person to define the appropriate stringency conditions. Characteristic stringency conditions are those which correspond to a combination of the temperature and the salt concentration chosen approximately between 1 2 at 20 ° C under the Tm ("melting temperature") of the hybrid under study.
  • nucleotide fragment is meant either fragments associated with the same molecular unit, or fragments in a molecular complex comprising several homologous or heterologous subunits obtained in a natural or artificial manner, in particular by differential multi-splicing or by selective synthesis.
  • a diagnostic composition is thus defined which comprises at least one probe or a primer or an anti-nucleic acid antibody.
  • the primers, probes and anti-nucleic acid antibodies of the invention are moreover used in a method of diagnosis of DNA and / or viral RNA, according to which a sample of serum or plasma is taken from a patient, said sample is treated if necessary to extract DNA and / or RNA therefrom, said sample is contacted with at least one probe or an anti-nucleic acid primer or antibody as defined above, under stringency conditions determined when the ligand is a probe or a primer and the presence of DNA and / or viral RNA in the sample is detected either by demonstrating a hybridization of said DNA and / or viral RNA with at least one probe , either by amplification of said DNA and / or RNA, or under determined incubation conditions when the ligand is anti-nucleic acid antibody and the complex thus formed is detected.
  • the antibody may itself be labeled with any marker suitable for revealing the complex formed or else the formation of the complex may be revealed by the addition to the medium of incubation of an anti-labeled nucleic acid antibody.
  • the hybridization complex can be demonstrated directly by using a probe which is complementary or substantially complementary to the sequence of the target, said probe being marked with any appropriate marker or by work of the so-called “sandwich” technique in one or two stages which consists in using a capture probe complementary or substantially complementary to a part of the target sequence and a so-called labeled detection probe complementary or substantially complementary to another part of the target sequence.
  • primers these can be directly marked for the detection of an amplification product.
  • the present invention also relates to a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions intended for the treatment of an infection with at least HBVm, said composition comprising (i) either at least one nucleic acid sequence capable of hybridizing to at least one nucleic acid sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3 or their complementary sequences, in particular to the nucleic acid sequence SEQ ID NO 1 or its complementary sequence, optionally in combination with a nucleic acid sequence capable of hybridize to at least one of the nucleotide sequences coding for SEQ ID NO 5 and for SEQ ID NO 6 or their complementary sequences and / or with at least one nucleic acid sequence of wild HBV type; or fragments of said aforementioned sequences, (ii) either at least one nucleic acid sequence comprising at least one gene of therapeutic interest and elements ensuring expression of said gene in vivo in target cells intended to be genetically modified by said nucleic sequence, (iii) either at least one mammalian cell which does not naturally produce the protein (s) of the invention
  • the present invention also relates to a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions comprising at least one nucleic acid sequence capable of hybridizing to a nucleic acid sequence as defined above.
  • the nucleic acid and / or vector sequences make it possible in particular to target the cells in which a gene is expressed.
  • Antisense nucleic acid sequences or oligonucleotides are capable of specifically interfering with the synthesis of a target protein of interest, by inhibiting the formation and / or functioning of the polysome, depending on the positioning of the anti -sense in the target mRNA. Therefore, the frequent choice of the sequence surrounding the translation initiation codon as a target for inhibition by an antisense oligonucleotide aims to prevent the formation of the initiation complex.
  • antisense oligonucleotides involve activation of ribonuclease H which digests antisense oligonucleotide / mRNA hybrids or interference at splicing sites with antisense oligonucleotides whose target is a mRNA splicing site.
  • the antisense oligonucleotides are also complementary to DNA sequences and can therefore interfere at the transcription level by the formation of a triple helix, the antisense oligonucleotide paired by so-called Hoogsteen hydrogen bonds at the level of the large groove. of the DNA double helix. In this particular case, we talk more specifically antigen oligonucleotides.
  • the antisense oligonucleotides can be strictly complementary to the DNA or RNA target to which they must hybridize, but also not strictly complementary provided that they hybridize to the target. Likewise, they may be antisense oligonucleotides which are unmodified or modified at the level of the inter-nucleotide bonds. All these notions are part of the general knowledge of a person skilled in the art.
  • the present invention therefore relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, inter alia, an antisense nucleic sequence or oligonucleotide as defined above.
  • the present invention also relates to the use of vectors comprising at least one gene of therapeutic interest relative to the genes of the proteins of interest identified in the present invention and a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions intended for the treatment of patients infected with at least the HBVm virus, said composition comprising a nucleic acid sequence comprising a gene of therapeutic interest and elements of expression of said gene of interest.
  • Genes can be unmutated or mutated. They may also consist of modified nucleic acids so that it is not possible for them to integrate into the genome of the target cell or nucleic acids stabilized with the aid of agents, such as spermine.
  • Such a gene of therapeutic interest codes in particular:
  • It can in particular be a native transmembrane antibody, or a fragment or derivative of such an antibody, provided that said antibody, fragment or derivative of antibody is expressed on the surface of a target cell of a genetically mammal modified for the purposes of the present invention and is capable of binding to a polypeptide present on the surface of a cytotoxic effector cell or of a “helper” T lymphocyte involved in the process of activation of such a cell; - (iii) either at least for an inhibitor molecule of at least one protein of the invention;
  • transmembrane antibody an antibody whose at least the functional region capable of recognizing and binding to its specific antigen is expressed on the surface of the target cells to allow said recognition and fixation. More particularly, the antibodies according to the present invention consist of fusion polypeptides comprising the amino acids defining said functional region and an amino acid sequence (transmembrane polypeptide) allowing anchoring within the double lipid membrane layer of the target cell. or on the external surface of this bilayer.
  • the nucleic sequences encoding many transmembrane polypeptides are described in the literature.
  • elements ensuring the expression of said gene in vivo we refer in particular to the elements necessary to ensure the expression of said gene after its transfer to a target cell.
  • These include promoter sequences and / or regulatory sequences effective in said cell, and optionally the sequences required to allow expression on the surface of target cells of a polypeptide.
  • the promoter used can be a viral, ubiquitous or tissue-specific promoter or a synthetic promoter.
  • the promoters such as the promoters of the RSV virus (Rous Sarcoma Virus), MPSV, SV40 (Simian Virus), CMV (Cytomegalovirus) or of the vaccinia virus. It is also possible to choose a promoter sequence specific for a given cell type, or activatable under defined conditions.
  • the literature provides a great deal of information relating to such promoter sequences.
  • the therapeutic gene consists of a nucleic acid sequence of naked DNA or RNA, that is to say free of any compound facilitating its introduction into cells (transfer of acid sequence nucleic).
  • the nucleic acid sequence may be in the form of a "vector", and more particularly in the form of a viral vector, such as by example an adenoviral, retroviral vector, a vector derived from a poxvirus, in particular derived from the vaccinia virus or the Modified Virus Ankara (MVA) or from a non-viral vector such as, for example, a vector consisting of at least one nucleic acid sequence complexed or conjugated to at least one molecule or carrier substance.
  • a viral vector such as by example an adenoviral, retroviral vector, a vector derived from a poxvirus, in particular derived from the vaccinia virus or the Modified Virus Ankara (MVA)
  • a non-viral vector such as, for example, a vector consisting of at least
  • Such vectors may further and preferably comprise targeting elements which can make it possible to direct the transfer of nucleic acid sequences to certain cell types or certain specific tissues, such as cytotoxic cells and cells presenting the antigen). They can also make it possible to direct the transfer of an active substance to certain preferred intracellular compartments, such as the nucleus or the peroxisomes. They may also be elements which facilitate penetration into the interior of the cell or the lysis of intracellular compartments.
  • targeting elements are widely described in the literature. It may for example be all or part of peptides, oligonucleotides, antigens, antibodies, ligands specific for membrane receptors, ligands capable of reacting with an anti-ligand, alone or in combination.
  • the present invention relates to a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions comprising at least one vector containing a therapeutic gene, capable of being introduced into a target cell in vivo and of expressing the gene of therapeutic interest in vivo.
  • the advantage of this invention lies in the possibility of maintaining, over the long term, a basic level of molecules expressed in the treated patient.
  • Vectors or nucleic acids encoding genes of therapeutic interest are injected. These vectors and nucleic acids must be transported to the target cells and transfect these cells in which they must be expressed in vivo.
  • the invention also relates to the in vivo expression of nucleotide sequences and / or of vectors as described in the preceding paragraph, that is to say sequences corresponding to genes of therapeutic interest coding in particular for:
  • a polyclonal or monoclonal antibody capable of binding to at least one protein of the invention. It may be a native transmembrane antibody, or a fragment or derivative of such an antibody, provided that said antibody, fragment or derivative of antibody is expressed on the surface of the target cell of a genetically modified mammal and in that said antibody is capable of binding to a polypeptide present on the surface of a cytotoxic effector cell or of a “helper” T lymphocyte and involved in the process of activation of such a cell.
  • They may be fragments of antibodies expressed by cells capable of secreting said antibodies into the bloodstream of a mammal carrying cells genetically modified by the gene coding for the antibody, or at least for a molecule inhibitor of at least one protein chosen from the proteins of the invention, either at least for a ligand or any part of the ligand capable of binding to at least one protein of the invention, and / or of inhibiting its function.
  • gene therapy is used so as to direct the immune response against at least one protein, in particular HBsAgm, of the invention, and / or against any molecule inhibiting the function and / or the expression and / or metabolism of at least one protein of the invention, and / or against ligands of at least one of the proteins of the invention, in particular against one or more receptors.
  • the cells to target for the transformation with a vector are cells belonging to the immune system, either cells of the lymphocyte type (CD4 / CD8), or cells presenting the antigen.
  • the cells presenting the antigen are genetically modified, in particular in vivo.
  • CPAs such as macrophages, dendritic cells, microgliocytes, astrocytes play a role in the initiation of the immune response. They are the first cellular components which capture the antigen, prepare it intracellularly and express CMHI and CMHII molecules. transmembrane cells involved in the presentation of the immunogen to CD4 + and CD8 + T cells, they produce specific accessory proteins which participate in the activation of T cells (Debrick et al;, 1 991, J.
  • a gene therapy system which can target gene transfer in such APCs cells, ie a gene which codes for a polypeptide which can, after its intracellular production and its transformation, to be presented to CD8 + and / or CD4 + cells by the molecules of the CMHI and CMHII complexes respectively on the surface of these cells.
  • CPAs cells in vivo all or part of an antibody and / or a ligand such as for example a receptor, capable of reacting with a protein of the invention. Such cells will then specifically phagocyte the protein, transforming it so that fragments are presented on the surface of the cells presenting the antigen.
  • the literature offers a large number of examples of genes coding for antibodies capable of reacting with polypeptides or receptors. It is within the ability of those skilled in the art to obtain the nucleic acid sequences encoding such antibodies.
  • genes coding for the light and heavy chains of the antibody YTH 1 2.5 (anti-CD3) (Routledge et al. 1991, Eur J Immunol 21: 271 7-2725), of anti-CD3 according to Arakawa et al ; 1 996, J. Biochem. 1 20: 657-662.
  • the nucleic acid sequences of such antibodies are easily identifiable from the databases commonly used by those skilled in the art.
  • hybridomas available from the ATCC it is also possible from hybridomas available from the ATCC to clone the nucleic acid sequences coding for the heavy and / or light chains of these different antibodies by amplification methods such as RT-PCR at 1 using specific oligonucleotides or techniques using cDNA libraries (Maniatis et al., 1 982, Molecular cloning. A laboratory manual CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). The sequences thus cloned are then available for cloning into vectors.
  • the nucleic acid sequence coding for the heavy chain of the antibody is fused by homologous recombination with the nucleic acid sequence coding for a transmembrane polypeptide such as the rabies glycoprotein or the gp1 60.
  • a transmembrane polypeptide such as the rabies glycoprotein or the gp1 60.
  • the immunogenic peptide encoded by the nucleic acid or polynucleotide introduced into the vertebrate cell in vivo can be produced and / or secreted, primed and then presented to an antigen presenting cell (APC) in the context of MHC molecules.
  • APC antigen presenting cell
  • APCs have different mechanisms for capturing antigens: (a) capture of antigens by membrane receptors such as immunoglobulin (Fc) receptors or for the complement available on the surface of granulocytes, monocytes or macrophages allowing efficient delivery of l antigen in intracellular compartments after receptor-mediated phagocytosis, (b) entry into APCs by pinocytosis in the fluid phase.
  • membrane receptors such as immunoglobulin (Fc) receptors or for the complement available on the surface of granulocytes, monocytes or macrophages allowing efficient delivery of l antigen in intracellular compartments after receptor-mediated phagocytosis
  • Fc immunoglobulin
  • the cytotoxic effector cells u the “helper” T lymphocytes are modified genetically in vivo in particular so that they express on their surface a polypeptide or one or more ligand (s) of said polypeptide, naturally not expressed by these cells, and capable of inducing their activation, by the introduction into these cells of nucleic acid sequences containing the gene coding for the polypeptide.
  • cytotoxic effector cells macrophages, astrocytes, cytotoxic T lymphocytes (TCLs) and killer cells (NKs) as well as their derivatives such as for example LAK (Versteeg 1 992 Immunology today 1 3: 244-247; Brittende et al 1 996, Cancer 77: 1 226-1 243).
  • LAK Very Steeg 1 992 Immunology today 1 3: 244-247; Brittende et al 1 996, Cancer 77: 1 226-1 243.
  • helper T lymphocytes is understood to mean in particular the CD4 cells which allow, after activation, the secretion of activating factors of the effector cells of the immune response.
  • the polypeptides and in particular the receptors expressed on the surface of these cells and which are involved in the activation of such cells consist in particular of all or part of the TCR complex or CD3, all or part of the complexes CD8, CD4, CD28, LFA- 1, 4-1 BB (Melero et al., 1 998, Eur J Immunol 28: 1 1 1 6-1 1 21), CD47, CD2, CD1, CD9, CD45, CD30, CD40, all or part of the receptors for cytokines (Finke et al., 1 998, Gene therapy 5: 31-39), such as IL-7, IL-4, IL-2, IL-1 5 or GM-CSF, all or part of the receptor complex of NK cells such as for example NKAR, Nkp46, ..; (Kawano et al., 1 998 Immunology 95: 5690-5693; Pessino et al., 1 998 J Exp Med1 88: 953-960
  • the first category involves physical techniques such as micro-injection, electroporation or bombardment of particles.
  • the second category is based on the use of techniques in molecular and cellular biology with which the gene is transferred with a biological or synthetic vector which facilitates the introduction of the material into the cell in vivo.
  • the most effective vectors are the viral vectors, in particular the adenovirals and retrovirals. These viruses have natural properties for crossing plasma membranes, preventing the degradation of their genetic material and introducing their genome into the nucleus of the cell.
  • non-viral methods such as co-precipitation with calcium phosphate, the use of receptors which mimic the viral systems (for a summary see Cotten and Wagner 1 993, Current Opinion in Biotehcnology, 4: 705- 710), or the use of polymers such as polyamidoamines (Haensler and Szoka 1 993, Bioconjugate Chem 4: 372-379).
  • Other non-viral techniques are based on the use of liposomes, the efficacy of which for the introduction of biological macromolecules such as DNA, RNA of proteins or of active pharmaceutical ingredients has been widely described in the scientific literature.
  • cationic lipids with a strong affinity for cell membranes and / or nucleic acids.
  • a nucleic acid molecule itself can cross the plasma membrane of certain cells in vivo (WO 90/1 1 092), the efficiency being dependent in particular on the polyanionic nature of the nucleic acid.
  • 1,989 cationic lipids have been proposed to facilitate the introduction of large anionic molecules, which neutralizes the negative charges of these molecules and promotes their introduction into cells.
  • DOTMA cationic lipids
  • DOGS or Transfectam TM Behr et al., 1 989, PNAS 86: 6982-6986
  • DMRIE and DORIE DMRIE and DORIE
  • DOTAP TM McLachlan et al., 1995, Gene therapy 2: 674-622
  • Lipofectamine TM Lipofectamine TM
  • the present invention also relates to a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions, the composition comprising at least one cell, in particular a cell which does not naturally produce antibodies, in a form allowing its administration in a mammalian, human or animal organism, as well as 'optionally its prior culture, said cell being genetically modified in vitro by at least one nucleic acid sequence containing at least one therapeutic gene coding in vivo for at least one protein or a fragment of a protein of the invention or for at least one molecule that inhibits the function and / or the binding and / or the expression of at least one protein or of a protein fragment of the invention or for at least one antibody or part of an antibody capable to bind to at least one protein of the invention.
  • said target cell comes either from the individual to be treated, or from another mammal. In the latter case, it should be noted that said target cell will have undergone a treatment making it compatible with humans.
  • These cells are established in cell lines and are preferably CMHII + or CMHII + inducible such as lymphocytes, monocytes, astrocytes, oligodendrocytes.
  • the invention also relates to the modified cells and a method for preparing a cell as described above, characterized in that one introduces into a mammalian cell which does not naturally produce antibodies, by any appropriate means, at least one nucleic acid sequence containing at least one gene of therapeutic interest and elements ensuring the expression of said gene in said cell, said gene of therapeutic interest containing a nucleic acid sequence coding for a molecule or a fragment of a molecule in vivo, as described above.
  • eukaryotic cells in particular COS and CHO cells and cells derived from lower eukaryotic organisms, such as yeast cells, in particular cells derived from Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris, in particular cells transformed by at least one nucleotide sequence and / or a vector as described above.
  • the cells dendritic cells, macrophages, astrocytes, CD4 + T lymphocytes, CD8 + T lymphocytes or others
  • the patient or allogenic cells are placed in contact with a preparation purified of at least one protein or of a protein fragment of the invention.
  • the protein or its fragment is internalized, prepared and presented on the surface of the cell and associated with the CMHI and / or CMHII molecules to induce a specific immune response against the protein or its fragment.
  • the cells thus “activated” are then administered to the patient in whom they will induce an immune response specific for the antigens.
  • the antigen presenting cells are modified in vitro to express the antigens in the transformed cell which will associate with the CMHI and / or CMHII molecules and be presented on the surface of the cells to induce in the patient, in which the modified cell is administered, a perfectly targeted immune reaction.
  • Vaccine approaches are not always entirely satisfactory and can lead to limited immune reactions directed only against immunodominant epitopes. Similarly, an incorrect presentation of antigens by the glycoproteins of the MHC system on the surface of the cells does not make it possible to develop in the treated patient an adequate anti-protein immunity.
  • some authors have proposed, within the framework of vaccine methods, to select the minimum antigenic fragments corresponding to the portions of peptide capable of being recognized specifically by cytotoxic T lymphocytes, to express them in the cells so that they associate with CMHI molecules and be presented on the surface of the cells to induce in the patient treated a perfectly targeted immune reaction (Toes et al. 1 997, PNAS 94: 14660-14665).
  • CMHI molecules The presentation of the antigenic fragments by the CMHI molecules is based on an identified intracellular process (see Groettrup et al., 1 996 Immunology Today 1 7: 429-435 for a review) during which very short antigenic peptides (about 7 to 1 3 or 8 to 1 2 amino acids) are produced by degradation of a more complex polypeptide against which the final immune reaction will be directed. These short peptides are then associated with the CMHI or CMHII molecules to form a protein complex which is transported to the cell surface in order to present said peptides to the circulating cytotoxic T lymphocytes or to the circulating helper T lymphocytes, respectively.
  • the cells such as dendritic cells, macrophages, astrocytes, CD4 + T lymphocytes, CD8 + T lymphocytes, are modified so as to express on their surface antibodies specific for the targeted peptide.
  • the peptide is neutralized by the antibodies expressed on the surface of the cells.
  • These cells which preferably have been removed from the patient are cells of the immune system, preferably cytotoxic, modified to express all or part of an antibody specific for the target polypeptide.
  • the mononuclear cells sediment at the PBS-Ficoll interface, in a dense, opalescent layer, while almost all of the red blood cells and polymorphonuclear cells sediment at the bottom of the tube.
  • the mononuclear cells are recovered and washed in sterile PBS.
  • the antigen presenting cells are washed beforehand with a PBS-BSA buffer at 0.5% (weight / volume) and then counted.
  • 8.1 0 6 cells are internalized in the presence of a saturated amount of proteins radiolabelled with iodine 1 25 (1 ⁇ g) in microwells. After one hour of incubation at 4 ° C with shaking, the antigens are fixed to the cell surface. The cell suspension is washed twice in PBS-BSA and the cell pellets are taken up in 70 ⁇ l of buffer and incubated at 37 ° C. for different periods of up to 2 hours. Cells and supernatants are separated by centrifugation at 800g for 5 minutes at 4 ° C. For longer incubation periods, the preliminary step of pre-fixing antigens to the cell surface is omitted.
  • the cells are diluted in RPMI-10% FCS medium in the presence of 20 mM Hepes, to 10 6 cells / ml.
  • the cells are incubated in the presence of an excess of antigen for different periods at 37 ° C. (1 ⁇ g of molecules / 5.10 7 monocyte / macrophage cells or / 1 0 8 B-EBV cells).
  • All the therapeutic agents defined within the framework of the present invention are used to prevent and / or treat an infection by at least the HBVm virus. They can also be used to assess their effectiveness in vitro or in vivo.
  • the biological material is administered in vivo, in particular in injectable form by intramuscular or subcutaneous route or any other equivalent means.
  • the administration can take place in single or repeated dose, one or more times after a certain interval of interval.
  • the most suitable route and dosage vary according to different parameters such as, for example, the individual, the stage and / or the course of the disease, or the nucleic acid and / or the protein. and / or peptide and / or molecule and / or cell to be transferred or from the target organ / tissue.
  • compositions comprising a biological material as previously described, advantageously combined with a pharmaceutically acceptable vehicle for administration to humans or animals.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle for administration to humans or animals.
  • This pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic, hypotonic or has low hypertonicity and has a relatively low ionic strength, such as for example a sucrose solution.
  • said composition may contain solvents, aqueous or partially aqueous vehicles such as sterile water, free of pyrogenic agents and dispersion media for example.
  • the pH of these pharmaceutical compositions is suitably adjusted and buffered according to conventional techniques.
  • the invention therefore therefore also relates to (i) a method for the treatment of a patient infected with the HBVm virus of the invention according to which a biological material as defined above is administered to said patient, optionally combined with an adjuvant and / or a diluent and / or a pharmaceutically acceptable excipient and / or a vehicle and (ii) a method for preventing infection with at least the HBVm virus of the invention according to which an individual is administered a biological material as defined above optionally associated with a pharmaceutically acceptable adjuvant and / or diluent and / or vehicle, in particular a vaccine composition.
  • the subject of the invention is a composition
  • a composition comprising a DNA sequence coding for a mutated surface protein of the HBVm virus (HBsAgm) or its fragments, said HBsAgm protein comprising a modified determinant of an HBs protein represented in SEQ ID NO 2, said DNA being mixed with a vehicle and / or an adjuvant and / or an excipient and / or a suitable diluent and may also comprise a mutated Pre-S coding sequence which codes for a mutated surface protein, referenced in SEQ ID NO 4 and / or a DNA sequence coding for a mutated surface protein referenced in SEQ ID NO 5 or its fragments and / or a DNA sequence coding for a mutated Pre-S region referenced in SEQ ID NO 6 or its fragments.
  • HBsAgm HBVm virus
  • FIG. 1 represents the complete sequence of the clone x27_1 6 of genotype A of the invention.
  • the underlined sequences correspond to the initiation and termination codons for the various genes.
  • FIG. 2 represents the complete sequence of the clone x27_9 of genotype D of the invention.
  • the underlined sequences correspond to the initiation and termination codons for the various genes.
  • FIGS. 3 and 4 respectively represent the amino acid sequences of the HBs gene and of the entire Pre-S region of the clones x27_1 6 and x27_9, aligned with 1 02 HBs or Pre-S sequences found in the library.
  • Example 1 Identification of the HBVm variant or mutant.
  • the patient is an 86-year-old man with a history of non-A, non-B chronic hepatitis, whose pathology has progressed to the cirrhosis stage. He had no identified risk factors. His level of transaminases in the blood was significantly higher than normal (1 to 2 times compared to normal). He was neither HCV, HGV, nor HDV positive by PCR RNA detection tests. Potential detection of the TTV virus was also carried out by PCR which turned out to be negative.
  • the HBsAg antigen was detected in the patient's serum first with the MonoLisa test (trade name) second generation marketed by Sanofi Diagnostics Pasteur and secondly with the VIDAS ® HBsAg detection kit marketed by bioMérieux. The results were negative with each of the detection tests used.
  • the detection of anti-HBs antibodies was carried out using the ELISA test DiaSorin (trade name) marketed by the company Sorin in the patient's serum.
  • the results of the anti-HBs antibody test were also negative.
  • the detection of total anti-HBc antibodies was carried out by a CORAB rDNA (trade name) competition test from the company Abbott Diagnostics and using the ELISA Ortho HBc Elisa test marketed by Ortho Diagnostic System. The results show the presence of 10 4 DNA molecules per ml of serum in the patient against the 10 8 DNA molecules / ml usually found in HBV positive patients at a chronic stage of the disease.
  • PCR viral genome detection test PCR detection of the viral genome in serum was carried out using the Expand High Fidelity PCR System test, marketed by Roche for HBV and using the test AMPLICOR (trade name) of Abbott for HCV. 140 ⁇ ⁇ of serum was used for the extraction of nucleic acids. The nucleic acid was extracted using a nucleic acid extraction kit sold by the company Qiagen, which makes it possible to purify both the DNA and the RNA. The serum was incubated in the presence of lysis buffer for 10 min. At room temperature, then passed over columns of silica. DNA was eluted from the column with 50 ⁇ l of sterile water. Total nucleic acid content from whole blood or liver biopsies was extracted using the kits sold by the company Quiagen, respectively for blood and for tissues.
  • Detection of HBv DNA was accomplished by nested two-step amplification using primers selected from a region known to be well conserved in the HBV S gene.
  • First amplification step the first 35 amplification cycles are preceded by preheating at 95 ° C for 5 min., 95 ° C for 45 seconds, 48 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 1 min. An elongation step for 10 min. was then carried out.
  • Primer 2 (P0R4): 5 'TAC CCA AAG ACA AAA GAA AAT TGG 3'
  • the second amplification step is 40 cycles with preheating at 95 ° C for 5 min., 5 amplification cycles at 95 ° C for 25 seconds, 37 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 1 min . and the other 35 cycles at 95 ° C for 45 seconds, 48 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 1 min. At the end, an elongation step is carried out.
  • Primer 3 5 'TAG TAA ACT GAG CCA RGA GAA AC 3'
  • Primer 4 5 'GTT GAC AAR AAT CCT CAC AAT AC 3'
  • R represents A or G.
  • PCR is carried out on 10 ⁇ ⁇ of total nucleic acids which have been extracted from 140 ⁇ ⁇ of serum, 200 ⁇ l of whole blood, 25 mg of a liver biopsy frozen or fixed with formalin in paraffin.
  • PCR amplification of the X gene was also carried out according to the technique described by Uchida et al., Microbiol, Immunol, 1 994, 38, 281-285.
  • the amplification of the X gene is interesting because the product of the X gene activates the HBV promoters and because the HBV core promoter overlaps the X gene. Consequently, mutations affecting either the X gene product or the core promoter or both, could lead to a decrease in virus transcription and replication levels, explaining its non-detectability by commercial tests.
  • the Expand High Fidelity kit (trade name) marketed by the Roche company containing 1.5 mmol / l of MgCl 2 , 200 mol / l of deoxynucleoside triphosphate, 2.6 U of a mixture of Taq and Pwo DNA polymerase (High Fidelity , sold by the company Roche) were used with 1 ⁇ mol / l of each primer described above.
  • the technique exploits the fact that although the HBV genome found in circulating virions is circular, the strands are not covalently closed and can therefore quickly hybridize to PCR primers and the fact that there is a short redundancy terminal at the 5 'and 3' ends of the minus strand.
  • the 3 'end of primer P1 is complementary to the 5' end of the minus strand, including the redundant sequence, while the 3 'end of primer P2 is complementary to the strand plus sequence, starting with the redundant sequence.
  • the 5 'ends of the two primers contain the restriction enzyme sites for Hind III, Sac I and Sap I which are rarely found in the genomes of HBV.
  • PCR amplification products the cloning strategies used depend on the nature of the PCR amplification products. Amplifications of HBs and HBx under genonics were carried out with Taq polymerase which has a natural terminal transferase activity and the addition of a nucleotide, usually adenosine, to the 3 'ends of the amplified fragments. These fragments are cloned directly into the vector pGEM-T (Promega), a linearized cloning vector containing an additional codon which codes for thymine at its 3 'end.
  • pGEM-T Promega
  • ligation products are purified using a PCR Preps resin resin, marketed by Promega, and eluted in water. Aliquots are used to transform E. coli XL-2 Blue cells by electroporation. The transformed cells are spread on LB agar plates containing ampicillin (1 00 g / ml), IPTG (80 ⁇ l) and X-gal (70 ⁇ g / ml) and incubated for overnight at 37 ° C.
  • the initial screening involves the selection of the white colonies which may contain the insert of interest, as opposed to the blue colonies which are supposed to contain no insert. If the transformation seems to be particularly successful, that is to say if there is a significant amount of white colonies compared to the blue colonies which constitute the negative control, the white colonies are then directly amplified in a liquid medium (Terrifie Broth containing 1 00 // g / ml of ampicillin) overnight at 37 ° C with stirring. Otherwise, the white colonies are subcultured on two LB agar plates containing ampicillin. One of the plates includes a nylon membrane on the surface of the agar. About 100 colonies can be subcultured on each plate.
  • the plates are incubated overnight at 37 ° C.
  • the plate without the nylon membrane is stored at 4 ° C.
  • the nylon membrane is treated with NaOH to lyse the bacteria, then neutralized and dried. After fixing the DNA by UV irradiation, the membrane is subjected to hybridization with specific HBV probes labeled with 32 P. The appropriate colonies are then taken up from the main plate and amplified in liquid medium.
  • the DNA is purified by mini preps using Qtips-20, sold by the company Qiagen, according to the instructions recommended by the company. Other DNAs are prepared manually by alkaline lysis, precipitation of supernatant with isopropanol, resuspension and treatment of the pellet with phenol then chloroform and precipitation with ethanol. In both cases, the DNA is finally resuspended in 30 ⁇ ⁇ of TE. The amounts of DNA are estimated by agarose gel electrophoresis. 1 1.
  • Sequencing approximately 350 ng of plasmid are sequenced with 5 pmol of primers, using the BigDye sequencing kit sold by the company Perkin Elmer and an amplification device (9600 thermal cycler from Perkin Elmer). After purification of the sequencing products by spin chromatography on Sephadex G50, the sequencing products are analyzed on an ABI Prism 377 sequencing device, sold by the company Applied Biosystems. The initial sequencing is usually carried out with primers complementary to the sequences of the T7 and SP6 promoters which overlap the cloning kit in both the pGEM-T and pSTBLue-1 vectors.
  • Sequence analysis most of the computer analyzes were carried out using programs available on the INFOBIOGEN server (Villejuif, France). Raw sequence data is corrected using the sequencing machine program. At this stage, only the ambiguities (called N by the machine) and the basic obvious errors near the ambiguities are corrected. A BLAST search is then carried out, in the majority of cases, to identify the HBV sequence of the base which is closest to that of the clone of the invention. Complete alignment, using CLUSTAL W software, of this sequence and the clone sequence allows for further correction. Only obvious errors, such as the omission of bases by the machine or the addition of bases at the end of the sequence are corrected. The partially corrected sequences on the two strands of the clone are assembled and aligned.
  • the clones are cut with the restriction enzyme Sap I.
  • the recognition and cleavage sites of this enzyme are CTCTTCNNNN. This site is present in the primers P1 and P2 used for the amplification of the whole genome. This results in the release of a whole genome insert with cohesive ends and, due to the terminal redundancy of the less strand, recircularization in a complete HBV genome without superfluous sequences.
  • the restriction enzyme Sap I the DNA is extracted with phenol and precipitated with ethanol. The DNA is then transfected into HuH7 cells, a permissive human hepatocarcinoma cell line for the replication of HBV, using the transfection reagent FuGene-6, sold by the company Roche.
  • the recircularization of the insert takes place in the cells and allows transcription and viral replication.
  • the negative control consists of cells transformed with a pGEM vector without insert and the positive controls are a dimer of the complete genomes of a wild-type HBV cloned at the EcoRI site, intact or cut with the restriction enzyme EcoRI.
  • the transfection is controlled by a co-transfection with pSEAP, a plasmid expressing the soluble secreted alkaline phosphatase, the activity of which is measured in the culture medium 48 hours after the transfection. The media are changed every day and the media for days 2 to the end of the experiment (normally day 5 or 6) are collected.
  • the presence of the HBs antigen in the medium is measured using the Ausria kit, sold by the company Abbott.
  • the cells are lysed and the DNA, RNA and proteins are extracted.
  • the medium is stored and concentrated by precipitation with PEG.
  • the presence of viral proteins, DNA or RNA is analyzed in the different preparations.
  • the fragments are inserted into HBV expression vectors, either in the context of a complete genome to study the effects of mutations in the HBs gene, the HBx gene or the core promoter on the replication cycle, either in expression vectors for HBs or HBx to study the properties of the mutated proteins, in particular whether mutated HBs proteins are normally synthesized and secreted and if they are recognized by commercial detection tests.
  • results according to the protocols described above, the patient's complete HBV genome was amplified by PCR and cloned. Two PCR amplifications were carried out and independent cloning was carried out. Phylogenic analysis shows that the genome is of genotype A, but that it is on the border of the family and that it could represent a new subgroup in genotype A. The important elements of structure and regulation are preserved in the nucleotide sequences and there are no major modifications in the amino acid sequences deduced from HBx and pol compared to the wild type. The genome is therefore competent for its replication.
  • the amino acid sequence and the HBsAg protein have numerous substitutions, particularly in the determinants a, which corresponds to a part of the antigen exposed on the surface of the viral particles and which is recognized by the serological tests available on the market. . It is particularly interesting to note that there are successive substitutions at positions 1 09-1 1 2 of the amino acid sequence of the protein HBsAgm and other substitutions isolated at the level of HBsAgm. The major substitutions are in HBsAgm QTTR (amino acids 109 to 1 1 2) instead of LIPG found at the protein of wild HBsAg.
  • nucleotide sequences coding for SEQ ID NO 6 and SEQ ID NO 5 have not been introduced in the present description, but the inventors have carried out a complete sequencing which makes it possible to affirm that Gly is coded by the codon GGA, in position 304-306 of the Pre-S region or in position 31 51 -31 53 relative to the complete genome sequence and that Arg is coded by the codon AGG, in position 628-630 of the S gene or in position 782-784 relative to the sequence of the complete genome.

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Abstract

The invention concerns an isolated mHBV having the following characteristics: (i) a genome with partly double-strand circular DNA, (ii) said genome including the Pre-S, S, C, P and X genes, (iii) the Pre-S genes coding for surface antigens, the S gene coding for a HBsAg envelope protein, the C gene coding for a HBeAg protein and aHBcAg protein, the P gene coding for a DNA reverse polymerase/transcriptase enzyme and the X gene coding for a HBxAg protein. The invention is characterised in that the gene S comprises a DNA nucleotide sequence referenced SEQ ID NO 1 and the Pre-S gene comprises a nucleotide sequence referenced SED ID NO 3. The invention also concerns DNA molecule, RNA molecule, modified surface proteins and their uses in particular for diagnostic, therapeutic and vaccine purposes.

Description

VIRUS MUTE DE L ' HEPATITE B , SES CONSTINUANTS NUCLEIQUES ET PROTEIQUES ET LEURS APPLICATIONSHEPATITIS B MUTE VIRUS, ITS NUCLEIC AND PROTEIN CONTINUENTS AND THEIR APPLICATIONS
Cinq types d'hépatites virales, les hépatites A, B, C, D, E, sont assez bien connues à ce jour. Dans chaque cas, le virus envahit le foie et provoque un état inflammatoire avec une destruction des cellules hépatiquesFive types of viral hepatitis, hepatitis A, B, C, D, E, are fairly well known to date. In each case, the virus invades the liver and causes an inflammatory state with destruction of the liver cells
L'hépatite B est causée par un virus, le virus de l'hépatite B humain (HBV). Le virus HBV a été découvert par Blumberg et al. A « new » antigen in leukemia sera, JAMA 1 91 : 541 , (1 965). Le virus est transmis par voie sanguine, par contact sexuel ou par voie périnatale.Hepatitis B is caused by a virus, the human hepatitis B virus (HBV). The HBV virus was discovered by Blumberg et al. A "new" antigen in leukemia sera, JAMA 1 91: 541, (1 965). The virus is transmitted through the blood, sexual contact or the perinatal route.
L'infection par HBV dans la majorité des cas n'entraîne aucun symptôme et est responsable d'hépatites aiguës asymptomatiques. L'hépatite aiguë se caractérise par des troubles digestifs, des douleurs abdominales, une coloration des urines et une décoloration des fèces anormales, une asthénie et un ictère. L'hépatite aiguë peut évoluer vers une forme fulminante avec une nécrose rapide du foie.HBV infection in most cases does not cause any symptoms and is responsible for asymptomatic acute hepatitis. Acute hepatitis is characterized by digestive disorders, abdominal pain, discoloration of the urine and discoloration of the abnormal faeces, asthenia and jaundice. Acute hepatitis can progress to a fulminant form with rapid necrosis of the liver.
L'infection virale peut également évoluer vers une forme chronique, soit chez des patients ayant présenté une hépatite aiguë, soit chez des individus pour lesquels l'infection était asymptomatique. Les porteurs chroniques présentent des lésions hépatiques d'importance variable et un risque élevé d'évolution vers une cirrhose et le développement d'un cancer primitif du foie. En Asie et en Afrique où la chronicité des infections est fréquente, les cancers primitifs du foie représentent un problème crucial de santé publique. Par ailleurs, les porteurs chroniques représentent des réservoirs pour le virus et permettent sa propagation transposant le problème de santé publique au niveau mondial.Viral infection can also progress to a chronic form, either in patients with acute hepatitis, or in individuals for whom the infection was asymptomatic. Chronic carriers have varying degrees of liver damage and a high risk of progression to cirrhosis and the development of primary liver cancer. In Asia and Africa, where chronic infections are common, primary liver cancers represent a crucial public health problem. In addition, chronic carriers represent reservoirs for the virus and allow its spread transposing the public health problem on a global level.
L'infection par HBV est une des infections virales les plus courantes chez l'homme. C'est une maladie ubiquitaire avec une incidence géographique distincte. En Europe et en Amérique du Nord entre environ 0, 1 % et 1 % de la population est infectée, alors qu'en Asie et en Afrique jusqu'à 20% de la population est porteuse de HBV. On estime à environ 350 millions le nombre de personnes infectées par HBV à travers le monde. Une hiérarchisation des infections virales suite à une transfusion montre que la transmission de HBV est la première, suivie de HCV et ensuite de HIV.HBV infection is one of the most common viral infections in humans. It is a ubiquitous disease with a distinct geographic incidence. In Europe and North America between approximately 0, 1% and 1% of the population is infected, while in Asia and Africa up to 20% of the population is a carrier of HBV. It is estimated that around 350 million people are infected with HBV worldwide. A hierarchy of viral infections following a transfusion shows that the transmission of HBV is the first, followed by HCV and then by HIV.
HBV est un petit virus à ADN de 42 nm de diamètre qui appartient au groupe des virus à ADN hepatotropes (hepadnavirus) et est classé dans la famille des Hepadnaviridae. Sa structure génomique est remarquablement compacte. Le virus comprend une enveloppe externe et une nucleocapside. L'enveloppe est composée principalement de trois antigènes de surface (HBsAgs : hepatitis B surface antigens) qui jouent un rôle majeur dans le diagnostic des infections par HBV. La nucleocapside contient l'antigène du core (HBcAg), une ADN polymerase/transcriptase inverse, ainsi que le génome viral. Le noyau viral constitue l'élément infectieux du virus et la membrane externe porte le principal déterminant antigénique du virus, l'antigène HBs. Le noyau viral demeure à l'intérieur de la nucleocapside. Son diamètre est d'environ 28 nm. En dépit de sa petite taille (3200 paires de bases) l'ADN circulaire, partiellement double brin, de HBV code pour quatre types de produits viraux à partir de ses gènes chevauchants S, C, P, et X.HBV is a small DNA virus 42 nm in diameter which belongs to the group of hepatotropic DNA viruses (hepadnavirus) and is classified in the family of Hepadnaviridae. Its genomic structure is remarkably compact. The virus includes an outer shell and a nucleocapsid. The envelope is mainly composed of three surface antigens (HBsAgs: hepatitis B surface antigens) which play a major role in the diagnosis of HBV infections. The nucleocapsid contains the core antigen (HBcAg), a DNA polymerase / reverse transcriptase, as well as the viral genome. The viral nucleus constitutes the infectious element of the virus and the outer membrane carries the main antigenic determinant of the virus, the HBs antigen. The viral nucleus remains inside the nucleocapsid. Its diameter is approximately 28 nm. Despite its small size (3200 base pairs) the circular, partially double-stranded DNA of HBV encodes four types of viral products from its overlapping genes S, C, P, and X.
Le gène S code pour la protéine d'enveloppe HBsAg exprimée sur la surface externe du virion. La protéine d'enveloppe HBsAg est constituée de deux polypeptides majeurs, un polypeptide de 24 kDa et sa forme glycosylée de 28 kDa. Un certains nombre de sous déterminants de HBsAg ont été identifiés. Le sous déterminant a est porté par tous les isolats de HBsAg. Mais HBsAg peut de plus contenir un antigène spécifique des sous types d ou y, w ou r. En amont du gène S, les gènes Pré-S codent pour divers antigènes de surface de HBV. Le gène P code pour l'ADN polymerase/transcriptase inverse, très importante dans le mécanisme de la réplication virale.The S gene codes for the HBsAg envelope protein expressed on the outer surface of the virion. The HBsAg envelope protein consists of two major polypeptides, a 24 kDa polypeptide and its 28 kDa glycosylated form. A number of sub-determinants of HBsAg have been identified. The sub-determinant a is carried by all HBsAg isolates. But HBsAg may also contain an antigen specific for the d or y, w or r subtypes. Upstream of the S gene, the Pre-S genes code for various HBV surface antigens. The P gene encodes DNA polymerase / reverse transcriptase, which is very important in the mechanism of viral replication.
Le gène C code pour deux protéines de la nucleocapside, HBeAg qui est une protéine sécrétée soluble et HBcAg, la protéine core intracellulaire. HBeAg est un marqueur sérologique d'une réplication virale élevée. Le gène X code pour HBxAg qui a différents effets biologiques et qui peut notamment transactiver la transcription de gènes viraux et cellulaires. Quand HBV infecte un individu, l'ADN viral se réplique totalement à l'intérieur des cellules hépatiques de l'hôte.The C gene encodes two nucleocapsid proteins, HBeAg which is a soluble secreted protein and HBcAg, the intracellular core protein. HBeAg is a serological marker for high viral replication. The X gene codes for HBxAg which has different biological effects and which can in particular transactivate the transcription of viral and cellular genes. When HBV infects an individual, the viral DNA replicates completely inside the liver cells of the host.
Après infection par HBV, le premier marqueur détectable dans le sérum de patient est l'antigène HBsAg, mais ce marqueur persiste rarement au delà de six mois. Après que l'antigène HBs ait disparu dans le sérum, les anticorps anti-HBsAg deviennent détectables et persistent. Parce que l'antigène HBc est séquestré par l'antigène d'enveloppe HBs, il n'est pas détectable en routine dans les sérums de patients, mais la présence d'anticorps anti-HBc est facilement mise en évidence dans les une à deux semaines suivant l'apparition de l'antigène HBs.After infection with HBV, the first detectable marker in patient serum is the HBsAg antigen, but this marker rarely persists beyond six months. After the HBs antigen has disappeared in the serum, the anti-HBsAg antibodies become detectable and persist. Because the HBc antigen is sequestered by the HBs envelope antigen, it is not routinely detectable in the sera of patients, but the presence of anti-HBc antibodies is easily demonstrated in one to two weeks following the appearance of the HBs antigen.
Il est cependant maintenant certain que les tests sérologiques conventionnels, mettant en œuvre les marqueurs précités, ne permettent pas de détecter les variants de HBV. Or, le fait que des patients porteurs de HBV et ayant développé une hépatite B chronique existent, sans qu'il soit possible de mettre en évidence une infection par HBV à l'aide des marqueurs sérologiques traditionnels, est de la plus haute importance et montre la nécessité de développer de meilleurs tests, en particulier dans le contexte de transplantation d'organes et pour le traitement des patients.However, it is now certain that conventional serological tests, using the above-mentioned markers, do not make it possible to detect variants of HBV. However, the fact that patients with HBV and who have developed chronic hepatitis B exist, without it being possible to demonstrate an infection with HBV using traditional serological markers, is of the utmost importance and shows the need to develop better tests, especially in the context of organ transplantation and for the treatment of patients.
L'existence de variants de HBV est suspectée depuis de nombreuses années. Cette présomption est basée sur la détection d'ADN viral dans le sérum et/ou le foie de patients présentant une hépatite chronique, en l'absence de mise en évidence des marqueurs sérologiques conventionnels (HBsAg et anti-HBc).HBV variants have been suspected for many years. This presumption is based on the detection of viral DNA in the serum and / or the liver of patients with chronic hepatitis, in the absence of evidence of conventional serological markers (HBsAg and anti-HBc).
L'incapacité à détecter HBsAg chez des patients porteurs de séquences ADN du virus pourraient avoir plusieurs explications, telles qu'une faible expression de l'antigène de surface ou la présence de mutations au niveau du déterminant antigénique de la protéine S. Dans le premier cas, une co- infection virale pourrait supprimer la réplication de HBV (Jilg W et al., J. Hepatol, 1 995, 23 : 14-20, Jylberberg et al., Clinical infection diseases, 1 996, 23 : 1 1 1 7-1 1 25, Ushida et al., J. of Med. Virol. 1 997, 52 : 399-405, Hofer et al., Eur. J. Clin ; Microbiol. Infect. Dis., 1 998, 1 7 : 6-13. Une autre explication pourrait être que l'antigène HBs est masqué lors de la formation in vivo de complexes immuns avec les anticorps anti-HBs. Les présents inventeurs ont maintenant identifié et caractérisé un nouveau variant ou mutant de l'hépatite B, dont la détection échappe à certains tests sérologiques du commerce utilisant un anticorps polyclonal à la fois en capture et en détection. Le nouveau variant ou mutant présente, entre autres, des mutations au niveau du gène codant pour l'antigène HBs. Aux fins de la présente demande de brevet, ils ont dénommé ce nouveau variant ou mutant HBVm.The inability to detect HBsAg in patients carrying DNA sequences from the virus could have several explanations, such as a weak expression of the surface antigen or the presence of mutations in the antigenic determinant of protein S. In the first case, a viral co-infection could suppress the replication of HBV (Jilg W et al., J. Hepatol, 1 995, 23: 14-20, Jylberberg et al., Clinical infection diseases, 1 996, 23: 1 1 1 7-1 1 25, Ushida et al., J. of Med. Virol. 1 997, 52: 399-405, Hofer et al., Eur. J. Clin; Microbiol. Infect. Dis., 1 998, 1 7 : 6-13 Another explanation could be that the HBs antigen is masked during the in vivo formation of immune complexes with anti-HBs antibodies. The present inventors have now identified and characterized a new variant or mutant of hepatitis B, the detection of which escapes certain commercial serological tests using a polyclonal antibody both for capture and for detection. The new variant or mutant exhibits, among other things, mutations in the gene coding for the HBs antigen. For the purposes of this patent application, they have called this new variant or mutant HBVm.
Les présents inventeurs ont par ailleurs montré que la négativité des tests disponibles commercialement pourrait être due à ces mutations au niveau du sous déterminant a de l'antigène HBs. En effet, le sous déterminant a est un site antigénique majeur de l'antigène de surface de HBV et des mutations à ce niveau expliquent une absence de détection par les tests existants.The present inventors have moreover shown that the negativity of the commercially available tests could be due to these mutations at the level of the sub-determinant a of the HBs antigen. Indeed, the sub-determinant a is a major antigenic site of the HBV surface antigen and mutations at this level explain an absence of detection by existing tests.
Aussi, la présente invention a pour objet le virus HBVm dont l'ADN génomique comprend une séquence nucléotidique du gène S qui code pour un antigène HBsm (antigène HBs muté), ladite séquence nucléotidique étant référencée SEQ ID NO 1 . L'ADN génomique de HBVm comprend également une séquence nucléotidique du gène Pré-S référencée en SEQ ID NO 3.Also, the subject of the present invention is the HBVm virus whose genomic DNA comprises a nucleotide sequence of the S gene which codes for an HBsm antigen (mutated HBs antigen), said nucleotide sequence being referenced SEQ ID NO 1. The genomic DNA of HBVm also comprises a nucleotide sequence of the Pre-S gene referenced in SEQ ID NO 3.
Le virus HBVm présente les caractéristiques suivantes :The HBVm virus has the following characteristics:
(i) un génome à ADN circulaire partiellement double brin, (ii) ledit génome comprenant les gènes Pré-S, S, C, P et X,(i) a partially double-stranded circular DNA genome, (ii) said genome comprising the Pre-S, S, C, P and X genes,
(iii) le gène Pré-S codant pour des antigènes de surface, le gène S codant pour une protéine d'enveloppe HBsAg, le gène C codant pour une protéine HBeAg et une protéine HBcAg, le gène P codant pour une enzyme ADN polymerase/transcriptase inverse et le gène X codant pour une protéine HBxAg et est caractérisé en ce que le gène S comprend une séquence nucléotidique ADN référencée SEQ ID NO 1 et en ce que la région Pré-S comprend une séquence nucléotidique ADN référencée SEQ ID NO 3 ; étant entendu que le reste du génome du virus HBVm est sensiblement identique au génome du virus HBV sauvage, comme l'ont montré les inventeurs par un séquençage complet du génome du virus HBVm.(iii) the Pre-S gene coding for surface antigens, the S gene coding for an HBsAg envelope protein, the C gene coding for an HBeAg protein and an HBcAg protein, the P gene coding for a DNA polymerase enzyme / reverse transcriptase and the X gene coding for a HBxAg protein and is characterized in that the S gene comprises a DNA nucleotide sequence referenced SEQ ID NO 1 and in that the Pre-S region comprises a DNA nucleotide sequence referenced SEQ ID NO 3; it being understood that the rest of the genome of the HBVm virus is substantially identical to the genome of the wild HBV virus, as the inventors have shown by complete sequencing of the genome of the HBVm virus.
L'invention concerne également une molécule d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique ADN choisie parmi SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, leurs fragments tels que définis ci-après, et leurs séquences complémentaires et une molécule d'ARN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique ARN qui est le produit de transcription d'une séquence nucléotidique ADN choisie parmi SEQ ID N01 , SEQ ID NO 3, leurs fragments et leurs séquences complémentaires.The invention also relates to a DNA molecule, characterized in that it comprises a DNA nucleotide sequence chosen from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, their fragments as defined below, and their complementary sequences and an RNA molecule, characterized in that it comprises an RNA nucleotide sequence which is the product of transcription of a DNA nucleotide sequence chosen from SEQ ID N01, SEQ ID NO 3, their fragments and their complementary sequences.
L'invention concerne aussi une protéine de surface modifiée, caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en une séquence peptidique choisie parmi SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 et leurs fragments tels que définis ci- après. L'invention a aussi pour objet un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN d'au moins 1 2 nucléotides, de préférence d'au moins 1 5 nucléotides ou 18 nucléotides et avantageusement d'au moins 21 nucléotides et qui comprend une séquence nucléotidique ADN qui comprend les nucléotides 325 à 336 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 235 à 237 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 391 à 393 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 478 à 480 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 28 à 30 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 39 à 41 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 358 à 360 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 385 à 387 de SEQ ID NO 1 et/ou et/ou les nucléotides 1 18 à 1 20 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 628 à 630 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 249 à 251 de SEQ ID NO 3, et/ou les nucléotides 250 à 252 de SEQ ID NO 3, ou est le produit de transcription desdites séquences nucléotidiques ADN ; un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN qui comprend une séquence nucléotidique qui comprend les séquences nucléotiques d'ADN SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou les séquences complémentaires desdites séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 ou les séquences nucléotidiques d'ARN qui sont les produits de transcription de séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ; et un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence nucléotidique d'ADN qui correspond à SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou les séquences complémentaires desdites séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou en ce qu'il consiste en une séquence nucléotidique d'ARN qui correspond aux produits de transcription de séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3. Avantageusement, les fragments susmentionnés comprenant les nucléotides 250 à 252 de SEQ ID NO 3, sont des fragment comprenant au moins 21 nucléotides.The invention also relates to a modified surface protein, characterized in that it comprises or consists of a peptide sequence chosen from SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 and their fragments as defined below. The subject of the invention is also a nucleotide fragment of DNA or RNA of at least 12 nucleotides, preferably at least 15 nucleotides or 18 nucleotides and advantageously at least 21 nucleotides and which comprises a sequence DNA nucleotide which comprises nucleotides 325 to 336 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 235 to 237 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 391 to 393 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 478 to 480 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 28 to 30 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 39 to 41 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 358 to 360 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 385 to 387 of SEQ ID NO 1 and / or and / or nucleotides 1 18 to 1 20 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 628 to 630 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 249 to 251 of SEQ ID NO 3, and / or nucleotides 250 to 252 of SEQ ID NO 3, or is the transcript of said DNA nucleotide sequences; a nucleotide fragment of DNA or RNA which comprises a nucleotide sequence which comprises the nucleotic DNA sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3 or the sequences complementary to said sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 or the sequences nucleotides of RNA which are the transcripts of sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3; and a nucleotide fragment of DNA or RNA, characterized in that it consists of a DNA nucleotide sequence which corresponds to SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3 or the sequences complementary to said sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3 or that it consists of an RNA nucleotide sequence which corresponds to the transcription products of sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3. Advantageously, the above-mentioned fragments comprising nucleotides 250 to 252 of SEQ ID NO 3, are fragments comprising at least 21 nucleotides.
Avantageusement encore, lorsque les fragments susmentionnés comprennent les nucléotides 628 à 630 de SEQ ID NO 1 , alors lesdits fragments comprennent également les nucléotides 325 à 336, et/ou 235 à 237, et/ou 391 à 393, et/ou 478 à 480, et/ou 28 à 30, et/ou 39 à 41 , et/ou 358 à 360, et/ou 385 à 387, et/ou 1 18 à 120 de SEQ ID NO 1 , et/ou les nucléotides 250 à 252 de SEQ ID NO 3. L'invention concerne encore un fragment protéique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique d'au moins 4 acides aminés, de préférence d'au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 1 5 acides aminés et avantageusement de 6 à 10 ou de 8 à 1 2 acides aminés, et qui comprend les acides aminés 109-1 1 2 et/ou 79 et/ou 131 et/ou 1 60 et/ou 10 et/ou 14 et/ou 1 20 et/ou 1 29 et/ou 40 et/ou 210 de SEQ ID NO 2 et/ou l'acide aminé 84 de SEQ ID NO 4 ; un fragment protéique qui comprend ou consiste en une séquence peptidique qui comprend les séquences peptidiques SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4 ; un fragment protéique dont la séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4.Advantageously still, when the abovementioned fragments comprise the nucleotides 628 to 630 of SEQ ID NO 1, then said fragments also include the nucleotides 325 to 336, and / or 235 to 237, and / or 391 to 393, and / or 478 to 480 , and / or 28 to 30, and / or 39 to 41, and / or 358 to 360, and / or 385 to 387, and / or 1 18 to 120 of SEQ ID NO 1, and / or nucleotides 250 to 252 of SEQ ID NO 3. The invention also relates to a protein fragment, characterized in that it comprises a peptide sequence of at least 4 amino acids, preferably at least 5 or 6 amino acids and advantageously at least 7 amino acids, in particular from 6 to 1 5 amino acids and advantageously from 6 to 10 or from 8 to 1 2 amino acids, and which comprises amino acids 109-1 1 2 and / or 79 and / or 131 and / or 1 60 and / or 10 and / or 14 and / or 1 20 and / or 1 29 and / or 40 and / or 210 of SEQ ID NO 2 and / or amino acid 84 of SEQ ID NO 4; a protein fragment which comprises or consists of a peptide sequence which comprises the peptide sequences SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 4; a protein fragment whose peptide sequence consists of a sequence chosen from SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 4.
Avantageusement, les fragments susmentionnés comprenant l'acide aminé 84 de SEQ ID NO 4, sont des fragment comprenant au moins 7 acides aminés.Advantageously, the above-mentioned fragments comprising amino acid 84 of SEQ ID NO 4, are fragments comprising at least 7 amino acids.
Avantageusement encore, lorsque les fragments susmentionnés comprennent les nucléotides l'acide aminé 210 de SEQ ID NO 2, alors lesdits fragments comprennent également les acides aminés 1 09-1 1 2 et/ou 79 et/ou 1 31 et/ou 1 60 et/ou 10 et/ou 14 et/ou 120 et/ou 129 et/ou 40 de SEQ ID NO 2 et/ou l'acide aminé 84 de SEQ ID NO 4.Advantageously still, when the abovementioned fragments comprise the nucleotides amino acid 210 of SEQ ID NO 2, then said fragments also comprise amino acids 109-1 12 and / or 79 and / or 13 and / or 160 and / or 10 and / or 14 and / or 120 and / or 129 and / or 40 of SEQ ID NO 2 and / or amino acid 84 of SEQ ID NO 4.
La protéine HBsAg mutée présente des caractéristiques antigéniques et/ou immunologiques différentes de la protéine HBsAg sauvage et n'est notamment pas reconnue par des anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine sauvage. La protéine mutée (HBsAgm) et/ou la protéine de surface Pré-S mutée (Pré-Sm) peuvent être obtenues par synthèse peptidique ou par des techniques de recombinaison génétique bien connues de l'homme du métier.The mutated HBsAg protein has antigenic and / or immunological characteristics different from the wild HBsAg protein and is in particular not recognized by polyclonal antibodies directed against the wild protein. The mutated protein (HBsAgm) and / or the mutated Pre-S surface protein (Pre-Sm) can be obtained by peptide synthesis or by genetic recombination techniques well known to those skilled in the art.
Les méthodes de construction, de manipulation et de vérification de molécules d'ADN recombinant et de séquences nucléotidiques sont bien connues de l'homme du métier. Pour modifier le gène qui code pour la protéine HBsAgm et/ou la protéine Pré-Sm et obtenir les protéines HBsAgm et/ou Pré-Sm de l'invention, il convient d'insérer les codons CAA, ACT, ACA, AGA, CAT, AAA, AGC, AGA, GGG, CGC, AGT, AGG ou tout autre codon qui code pour les acides aminés Gin, Thr, Thr, Arg, His, Lys, Ser, Arg, Gly, Arg, Ser, Arg respectivement aux positions 109, 1 10, 1 1 1 , 1 1 2, 79, 1 31 , 1 60, 10, 14, 129, 40 et 210 de SEQ ID NO 2 et/ou le codon ACA qui code pour la Thr ou tout autre codon qui code pour cet acide aminé en position 84 de SEQ ID NO 4.The methods of construction, manipulation and verification of recombinant DNA molecules and nucleotide sequences are well known to those skilled in the art. To modify the gene which codes for the HBsAgm protein and / or the Pre-Sm protein and to obtain the HBsAgm and / or Pre-Sm proteins of the invention, it is necessary to insert the codons CAA, ACT, ACA, AGA, CAT , AAA, AGC, AGA, GGG, CGC, AGT, AGG or any other codon which codes for the amino acids Gin, Thr, Thr, Arg, His, Lys, Ser, Arg, Gly, Arg, Ser, Arg respectively at the positions 109, 1 10, 1 1 1, 1 1 2, 79, 1 31, 1 60, 10, 14, 129, 40 and 210 of SEQ ID NO 2 and / or the codon ACA which codes for Thr or any other codon which codes for this amino acid in position 84 of SEQ ID NO 4.
Les mutations significatives de HBVm ont été identifiées et mises en évidence par clonage, séquençage et alignement des séquences nucléotidiques et protéiques de HBVm par rapport aux 102 séquences de l'antigène HBs de la base NBRF/PIR, disponible sur le serveur Infobiogen de Villejuif.The significant HBVm mutations have been identified and demonstrated by cloning, sequencing and alignment of the HBVm nucleotide and protein sequences with respect to the 102 sequences of the HBs antigen of the NBRF / PIR base, available on the Infobiogen server in Villejuif.
Plusieurs procédés sont disponibles pour effectuer les modifications appropriées de séquences. Un des procédé approprié est la synthèse de novo, par la chimie des phosphoramidite ou phosphite, de la séquence souhaitée en utilisant les fréquences de codons de virus ou de levures. La synthèse d'ADN est réalisable à partir d'éléments commerciaux. Un exemple d'une telle synthèse d'ADN est décrite par Hayden and Mandecki, DNA 7 : 571 (1 988). Une autre méthode est le clonage, dans un vecteur simple brin approprié, d'un fragment de restriction approprié à partir d'un vecteur qui comprend déjà le génome de HBV et d'effectuer ensuite in vitro une mutagènèse dirigée, comme décrit par exemple par Bolstein et al., Science, 229, 1 193 (1982). Une culture de E. coli K12, souche C600 contenant le plasmide recombinant pRIT10601 comprenant un génome de HBV de sous type ay clone dans pBR322 a fait l'objet d'un dépôt à l'ATCC le 2 juin 1 982 sous le numéro d'accession ATCC 391 32, conformément aux dispositions du Traité de Budapest. La séquence du gène S codant pour la protéine HBsAgm ou des séquences plus longues codant également pour les polypeptides Pré-S peuvent être excisées de tels clones par des techniques conventionnelles. Un fragment de restriction approprié est par exemple le fragment Xbal-Accl de la région codante du gène S de pRIT1 0601 . Des systèmes de vectorisation pour la mutagènèse in vitro sont disponibles dans le commerce. Le fragment de gène muté est ensuite réintroduit dans le gène S. Une autre méthode pour obtenir les modifications de séquences souhaitées est l'utilisation de la PCR (Polymerase Chain Reaction) comme décrit par Ho et al.. Gène, 77, 51 (1 989). Dans chaque cas la séquence codante pour une protéine mutée est exprimée dans une cellule hôte appropriée sous le contrôle d'un promoteur approprié. Il est ainsi possible d'utiliser une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme eucaryote ou procaryote permettant l'expression du gène S codant pour la protéine HBsAgm et/ou l'expression de la protéine de surface mutée codée par le gène Pré-S ou l'expression de fragments de ces protéines, le gène étant placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. Parmi les systèmes microbiens , Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiae ont largement été utilisés pour l'expression de protéines recombinantes, mais l'expression de l'antigène HBs en système procaryote, tel que E. coli, s'est révélée très difficile. De préférence, la cellule est une cellule issue d'un organisme eucaryote, telle que les cellules CHO ou COS et avantageusement une cellule issue d'un organisme eucaryote inférieur, telle que les cellules de levures. La protéine recombinante HBsAgm peut être obtenue dans une cellule dé Saccharomyces cerevisiae comme décrit par Harford et al., Develop. Biol. Standard. 54 : page 1 25 (1 983), Valenzuela et al., Nature 298, page 347 (1 982) et Bitter et al. , J. Med. Virol. 25, page 1 23 (1 988) ou exprimée dans Pichia pastoris, comme décrit par Gregg et al., Biotechnology, 5, page 479 (1987) . Les protéines de surface de HBVm peuvent être également exprimées dans une souche mutante de Saccharomyces cerevisiae comme décrit par Kniskern et al. dans le brevet américain US 5,614,384.Several methods are available to effect appropriate sequence modifications. One of the suitable methods is the de novo synthesis, by phosphoramidite or phosphite chemistry, of the desired sequence using the frequencies of codons of virus or yeast. DNA synthesis can be carried out using commercial elements. An example of such DNA synthesis is described by Hayden and Mandecki, DNA 7: 571 (1,988). Another method is the cloning, in an appropriate single-stranded vector, of an appropriate restriction fragment from a vector which already comprises the HBV genome and then carrying out site-directed mutagenesis in vitro, as described for example by Bolstein et al., Science, 229, 1,193 (1982). A culture of E. coli K12, strain C600 containing the recombinant plasmid pRIT10601 comprising an HBV genome of the ay type cloned in pBR322 was the subject of a deposit at ATCC on June 2, 1 982 under the number accession ATCC 391 32, in accordance with the provisions of the Budapest Treaty. The sequence of the S gene coding for the HBsAgm protein or longer sequences also coding for the Pre-S polypeptides can be excised from such clones by conventional techniques. A suitable restriction fragment is for example the Xbal-Accl fragment of the coding region of the S gene of pRIT1 0601. Vectorization systems for in vitro mutagenesis are commercially available. The mutated gene fragment is then reintroduced into the S gene. Another method for obtaining the desired sequence modifications is the use of PCR (Polymerase Chain Reaction) as described by Ho et al. Gene, 77, 51 (1 989). In each case the coding sequence for a mutated protein is expressed in an appropriate host cell under the control of an appropriate promoter. It is thus possible to use a functional expression cassette in a cell originating from a eukaryotic or prokaryotic organism allowing the expression of the S gene coding for the HBsAgm protein and / or the expression of the mutated surface protein coded by the Pre-S gene or the expression of fragments of these proteins, the gene being placed under the control of the elements necessary for its expression. Among the microbial systems, Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae have been widely used for the expression of recombinant proteins, but the expression of the HBs antigen in the prokaryotic system, such as E. coli, has proved to be very difficult. Preferably, the cell is a cell from a eukaryotic organism, such as CHO or COS cells and advantageously a cell from a lower eukaryotic organism, such as yeast cells. The recombinant protein HBsAgm can be obtained in a Saccharomyces cerevisiae cell as described by Harford et al., Develop. Biol. Standard. 54: page 1 25 (1,983), Valenzuela et al., Nature 298, page 347 (1,982) and Bitter et al. , J. Med. Virol. 25, p. 123 (1,988) or expressed in Pichia pastoris, as described by Gregg et al., Biotechnology, 5, p. 479 (1987). HBVm surface proteins can also be expressed in a mutant strain of Saccharomyces cerevisiae as described by Kniskern et al. in US Patent 5,614,384.
Aussi, la présente invention englobe également une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote permettant l'expression d'une séquence d'ADN ou d'un fragment d'ADN tel que défini précédemment, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; le vecteur comprenant la cassette d'expression et la cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence un organisme eucaryote inférieur et avantageusement une cellule issue de Saccharomyces cerevisiae ou de Pichia pastoris comprenant la cassette d'expression ou le vecteur, ainsi que la protéine de surface produite par la cassette d'expression, le vecteur ou la cellule.Also, the present invention also encompasses a functional expression cassette in a cell originating from a prokaryotic or eukaryotic organism allowing the expression of a DNA sequence or a DNA fragment as defined above, placed under element control necessary for its expression; the vector comprising the expression cassette and the cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably a lower eukaryotic organism and advantageously a cell derived from Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris comprising the expression cassette or the vector, as well as the surface protein produced by the expression cassette, the vector or the cell.
Le procédé pour préparer une protéine de surface modifiée recombinante de l'invention consiste à cultiver une cellule hôte telle que définie précédemment dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence nucléotidique d'ADN telle que représentée en SEQ ID NO 1 et/ou SEQ ID NO 3, leurs fragments et leurs séquences complémentaires ou un fragment nucléotidique tel que défini précédemment et, à purifier ladite protéine de surface modifiée produite jusqu'à un degré de pureté requis. Un autre objet de l'invention est un peptide immunogène qui présente une séquence peptidique telle que définie précédemment ou qui consiste en une protéine recombinante obtenue selon les protocoles précités et son utilisation pour la production d'un anticorps monoclonal ou polyclonal par immunisation d'un animal mammifère, de préférence une souris, un rat ou un lapin, avec ledit peptide immunogène. La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut citer à titre de référence Kόhler G. et Milstein C. (1 975) : Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 :495-497 et Galfre G. et al. (1 977) Nature, 266 : 522-550 pour la production d'anticorps monoclonaux et Roda A., Bolelli G. F. : Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1 980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Des anticorps peuvent également être produits par immunisation de souris ou de lapins avec les particules virales de HBVm. Pour la production d'anticorps monoclonaux, l'immunogène peut être couplé à de l'hémocyanine de Lymphet Keyhole (peptide KLH) comme support pour l'immunisation ou à de l'albumine sérique (peptide SA). Les animaux sont soumis à une injection d'immunogène en utilisant de l'adjuvant complet de Freund. Les sérums et les surnageants de culture d'hybridome issus des animaux immunisés sont analysés pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hybridomes produisant les anticorps les plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés. Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vitro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d'ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quelque soit le mode de production, en surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d'ions et la chromatographie d'exclusion ou la chromatographie d'affinité (protéine A ou G). Un nombre suffisant d'anticorps sont criblés dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vitro d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier.The method for preparing a recombinant modified surface protein of the invention consists in cultivating a host cell as defined above in an appropriate culture medium, said host cell being transformed with an expression vector which contains a DNA nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO 1 and / or SEQ ID NO 3, their fragments and their complementary sequences or a nucleotide fragment as defined above and, in purifying said modified surface protein produced to a required degree of purity. Another subject of the invention is an immunogenic peptide which has a peptide sequence as defined above or which consists of a recombinant protein obtained according to the abovementioned protocols and its use for the production of a monoclonal or polyclonal antibody by immunization of a mammalian animal, preferably a mouse, rat or rabbit, with said immunogenic peptide. The production of polyclonal and monoclonal antibodies is part of the general knowledge of those skilled in the art. By way of reference, we can cite Kόhler G. and Milstein C. (1 975): Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256: 495-497 and Galfre G. et al. (1 977) Nature, 266: 522-550 for the production of monoclonal antibodies and Roda A., Bolelli GF: Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1,980) for the production of polyclonal antibodies. Antibodies can also be produced by immunizing mice or rabbits with the viral particles of HBVm. For the production of monoclonal antibodies, the immunogen can be coupled to Lymphet Keyhole hemocyanin (peptide KLH) as a support for immunization or to serum albumin (peptide SA). The animals are injected with immunogen using complete Freund's adjuvant. Serums and Hybridoma culture supernatants from immunized animals are analyzed for their specificity and selectivity using standard techniques, such as for example ELISA or Western Blot tests. The hybridomas producing the most specific and sensitive antibodies are selected. Monoclonal antibodies can also be produced in vitro by cell culture of the hybridomas produced or by recovery of ascites fluid, after intraperitoneal injection of the hybridomas in mice. Whatever the mode of production, by supernatant or ascites, the antibodies are then purified. The purification methods used are essentially filtration on an ion exchange gel and exclusion chromatography or affinity chromatography (protein A or G). A sufficient number of antibodies are screened in functional tests to identify the best performing antibodies. The in vitro production of antibodies, antibody fragments or antibody derivatives, such as chimeric antibodies produced by genetic engineering is well known to those skilled in the art.
Plus particulièrement, par fragment d'anticorps on entend les fragments F(ab)2, Fab, Fab', sFv (Blazar et al., 1 997, Journal of Immunology 159 : 5821 -5833 et Bird et al., 1 988, Science 242 : 423-426) d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif (voir par exemple Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120 : 657-662 et Chaudray et al., 1 989, Nature 339 : 394-397).More particularly, by antibody fragment is meant the fragments F (ab) 2, Fab, Fab ', sFv (Blazar et al., 1 997, Journal of Immunology 159: 5821-5833 and Bird et al., 1 988, Science 242: 423-426) of a native antibody and by derivative means, inter alia, a chimeric derivative of a native antibody (see for example Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120: 657-662 and Chaudray et al., 1 989, Nature 339: 394-397).
L'anticorps monoclonal ou polyclonal ainsi obtenu est incorporé dans une composition diagnostique qui est utilisée dans un procédé pour détecter au moins une protéine de surface mutée qui consiste en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec ladite composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. En particulier les anticorps monoclonaux obtenus sont spécifiques de la protéine mutée recherchée et ne reconnaissent pas la protéine sauvage, par exemple une protéine HBsAg sauvage. L'invention concerne aussi une composition diagnostique pour la détection d'auto-anticorps dans un échantillon biologique, ladite composition comprenant, entre autre, une protéine ou un fragment protéique muté tel que défini précédemment et le procédé pour détecter lesdits auto-anticorps dirigés contre au moins une protéine de surface mutée qui consiste en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec la composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. Le clonage du génome de virions de l'hépatite B de différents sérotypes est bien connu. On peut, entre autres, citer à titre de référence Miller et al., Hepatology, 9 (1 989), page 322.The monoclonal or polyclonal antibody thus obtained is incorporated into a diagnostic composition which is used in a method for detecting at least one mutated surface protein which consists of SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 in a biological sample, according to which the biological sample is brought into contact with said diagnostic composition under predetermined conditions which allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected. In particular, the monoclonal antibodies obtained are specific for the mutated protein sought and do not recognize the wild protein, for example a wild HBsAg protein. The invention also relates to a diagnostic composition for the detection of autoantibodies in a biological sample, said composition comprising, inter alia, a mutated protein or protein fragment as defined above and the method for detecting said autoantibodies directed against at least one mutated surface protein which consists of SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 in a biological sample, according to which the biological sample is brought into contact with the diagnostic composition under predetermined conditions which allow the formation of complexes antibody / antigen and the formation of said complexes is detected. The cloning of the genome of hepatitis B virions of different serotypes is well known. Mention may, among others, be made for reference to Miller et al., Hepatology, 9 (1,989), page 322.
La présente invention a aussi pour objet un vaccin contre le virus HBVm. Ce vaccin est préparé selon des méthodes connues déjà utilisées pour la préparation de vaccins disponibles dans le commerce. Ce vaccin comprend au moins la protéine HBsAgm et/ou la protéine Pré-Sm, soit sous forme native, soit sous forme recombinante, soit un polypeptide de synthèse dont la séquence peptidique correspond à la séquence en acides aminés de HBsAgm et/ou Pré-Sm, ou des fragments desdites protéines et dudit polypeptide. Les protéines HBsAgm et/ou Pré-Sm sous forme native sont récupérées à partir du plasma de patients infectés par HBVm. Les protéines HBsAgm et/ou Pré-Sm sous forme recombinante sont obtenues par utilisation d'une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme eucaryote ou procaryote permettant l'expression du gène S codant pour la protéine HBsAgm et/ou du gène Pré-Sm codant pour la région Pré-Sm, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. De préférence, la cellule est une cellule issue d'un organisme eucaryote, telle que les cellules de levures. Les protéines recombinantes HBsAgm et/ou Pré-Sm pour la production de vaccins peuvent être obtenues dans une cellule de Saccharomyces cerevisiae comme décrit par Harford et al., Develop. Biol. Standard. 54 : page 1 25 (1 983), Valenzuela et al., Nature 298, page 347 (1 982) et Bitter et al. , J. Med. Virol. 25, page 1 23 (1 988) ou exprimées dans Pichia pastoris, comme décrit par Gregg et al.,The present invention also relates to a vaccine against the HBVm virus. This vaccine is prepared according to known methods already used for the preparation of commercially available vaccines. This vaccine comprises at least the HBsAgm protein and / or the Pre-Sm protein, either in native form, or in recombinant form, or a synthetic polypeptide whose peptide sequence corresponds to the amino acid sequence of HBsAgm and / or Pre- Sm, or fragments of said proteins and said polypeptide. The HBsAgm and / or Pre-Sm proteins in native form are recovered from the plasma of patients infected with HBVm. The HBsAgm and / or Pre-Sm proteins in recombinant form are obtained by using a functional expression cassette in a cell derived from a eukaryotic or prokaryotic organism allowing the expression of the S gene coding for the HBsAgm protein and / or of the Pré-Sm gene coding for the Pré-Sm region, placed under the control of the elements necessary for its expression. Preferably, the cell is a cell originating from a eukaryotic organism, such as yeast cells. Recombinant HBsAgm and / or Pre-Sm proteins for vaccine production can be obtained in a Saccharomyces cerevisiae cell as described by Harford et al., Develop. Biol. Standard. 54: page 1 25 (1,983), Valenzuela et al., Nature 298, page 347 (1,982) and Bitter et al. , J. Med. Virol. 25, p. 123 (1,988) or expressed in Pichia pastoris, as described by Gregg et al.,
il Biotechnology, 5, page 479 (1 987). Les vaccins peuvent également être préparé à partir de particules immunogènes hybrides comprenant la protéine HBsAgm et/ou la protéine Pré-Sm, comme décrit dans la demande de brevet EP 0 278 940. De telles particules peuvent contenir, par exemple, tout ou partie de la protéine précurseur de HBsAgm codée par la séquence codante qui précède immédiatement le gène S dans le génome HBV, c'est à dire la séquence codante Pré-S. Le vaccin peut comprendre de plus la protéine Pré-Sm de l'invention, soit isolée et purifiée à partir du plasma de patients, soit obtenue par recombinaison génétique, soit encore obtenue par synthèse peptidique ou un fragment de ladite protéine. Avantageusement, le vaccin comprend les protéines HBsAgm et Pré-Sm définies précédemment, éventuellement associées aux protéines HBsAgm' et/ou Pré-Sm', définies par la suite, ou à leurs fragments et/ou aux protéines HBsAg et/ou Pré-S ou leurs fragments, de type sauvage ; étant entendu que les protéines HBsAgm', Pré-Sm', HBsAg et Pré-S répondent aux définitions générales données pour les protéines HBsAgm et Pré-Sm.he Biotechnology, 5, page 479 (1,987). The vaccines can also be prepared from hybrid immunogenic particles comprising the HBsAgm protein and / or the Pre-Sm protein, as described in patent application EP 0 278 940. Such particles can contain, for example, all or part of the precursor protein of HBsAgm coded by the coding sequence which immediately precedes the S gene in the HBV genome, ie the coding sequence Pre-S. The vaccine may further comprise the Pre-Sm protein of the invention, either isolated and purified from the plasma of patients, or obtained by genetic recombination, or also obtained by peptide synthesis or a fragment of said protein. Advantageously, the vaccine comprises the HBsAgm and Pre-Sm proteins defined above, optionally combined with the HBsAgm 'and / or Pre-Sm' proteins, defined below, or their fragments and / or the HBsAg and / or Pre-S proteins. or their fragments, wild type; it being understood that the proteins HBsAgm ', Pré-Sm', HBsAg and Pré-S meet the general definitions given for the proteins HBsAgm and Pré-Sm.
Une composition immunogène ou vaccinale selon l'invention est une composition qui comprend une protéine ou un fragment protéique tel que défini ci dessus , éventuellement associé à un véhicule et/ou ou adjuvant approprié et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable. Les vaccins comprenant la protéine HBsAgm et/ou la protéine Pré-Sm ou leurs fragments sont préparés de manière conventionnelle et contiennent une quantité immunoprotectrice de la protéine HBsAgm et/ou de a protéine Pré-Sm et/ou de leurs fragments, de préférence dans une solution saline tamponnée et mélangée ou adsorbée à l'aide d'adjuvants connus, tels que l'hydroxyde et le phosphate d'aluminium. La présente invention concerne également des vaccins incluant des molécules d'acides nucléiques qui codent pour une ou des protéine(s) de l'invention ou pour des peptides immunogènes ou leur(s) fragments. Les vaccins d'acides nucléiques, en particulier les vaccins ADN, sont administrés généralement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable en injection intramusculaire ou sous-cutanée. Les vaccins d'acides nucléiques précités peuvent comprendre de plus des molécules d'acides nucléiques qui codent pour les protéines HBsAgm' et/ou Pré-Sm' et/ou HBsAg et/ou Pré-S définies ci-dessus. Ces vaccins sont composés d'au moins un gène codant pour au moins une protéine ou antigène de l'invention dont l'expression est régulée par un promoteur fort, de préférence un promoteur mammifère, exprimé sur un plasmide ou vecteur ADN d'origine bactérienne. Quand ils sont administrés par injection intramusculaire ou sous cutanée les vaccins ADN sont transcrits et traduits et la protéine qu'ils codent est présentée au système immunitaire induisant une réponse humorale et cellulaire. Un des principaux avantages des vaccins ADN est qu'ils peuvent être construits et manipulés. Ils sont susceptibles de fournir leur propre adjuvant sous la forme de séquences CpG présentes dans l'ADN bactérien. Les vaccins ADN provoque la synthèse de novo de protéines dans les cellules transfectées conduisant à l'association de peptides antigéniques avec les déterminants du CMH I et donc l'activation des cellules T cytotoxiques. De plus les vaccins ADN n'induisent pas de réponses immunes mesurables au vecteur ou plasmide, permettant ainsi une utilisation répétée. Le terme « immunoprotecteur » signifie qu'une quantité suffisante de protéine, en particulier de la protéine HBsAgm et/ou de la protéine Pré-Sm ou de leurs fragments, est administrée à un individu pour induire une production d'anticorps (réponse immunitaire humorale) suffisante pour qu'elle soit protectrice ou une réponse immune médiée par les cellules cytotoxiques (réponse immunitaire cellulaire) pour conférer une protection contre l'agent infectieux sans induire d'effets secondaires. Les deux types de réponse se distinguent en ce que les anticorps reconnaissent les antigènes sous leur forme tridimensionnelle alors que les cellules cytotoxiques reconnaissent des portions desdits antigènes, associés à des giycoprotéines codées par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) jouent un rôle essentiel dans la défense des cellules infectées par des virus. Ils agissent directement par cytotoxicité mais également en fournissant une aide spécifique et non spécifique à d'autres immunocytes, tels que les macrophages, les cellules B et les autres cellules T. Les cellules infectées transforment l'antigène au travers d'événements intracellulaires impliquant des protéases. L'antigène transformé est ensuite présenté à la surface des cellules sous la forme de peptides liés aux molécules du HLA classe I au niveau des récepteurs des cellules T sur les CTLs. Les molécules du CMH classe I peuvent également lier des peptides exogènes et les présenter aux CTLs sans transformation intracellulaire. Chisari et al. (Microbiol. Pathogen. 6 :31 (1 989)) ont suggérés que les lésions du foie pouvaient être médiées par une réponse des cellules T cytotoxiques CD8 + restreinte par le HLA classe I aux antigènes codés par HBV. Or, les vaccins contre HBV, disponibles dans le commerce, qui utilisent soit la protéine HBsAg purifiée à partir du plasma de porteurs d'HBV à un stade chronique de la maladie, soit une protéine HBsAg recombinante, soit des peptides de synthèse ne confèrent une réelle protection à la personne que dans environ 90% des cas. En conséquence, les personnes qui sont soit non immunisées, soit immunisées mais non protégées constituent un réservoir significatif pour une infection potentielle. Il est donc important de stimuler le réponse immune cellulaire des individus pour obtenir une réponse appropriée aux antigènes de HBV. Moriyama et al., Science, 248 : 361 -364 (1 990) ont rapporté que l'antigène majeur d'enveloppe de HBV (HBsAg) est exprimé à la surface des hépatocytes sous une forme qui est reconnaissable par des anticorps spécifiques de l'enveloppe et par les lymphocytes T cytotoxiques CD8 + restreints par les molécules du CMH de classe I.An immunogenic or vaccine composition according to the invention is a composition which comprises a protein or a protein fragment as defined above, optionally combined with a suitable vehicle and / or or adjuvant and / or a pharmaceutically acceptable excipient. Vaccines comprising the HBsAgm protein and / or the Pre-Sm protein or their fragments are prepared in a conventional manner and contain an immunoprotective amount of the HBsAgm protein and / or the Pre-Sm protein and / or their fragments, preferably in a buffered saline solution and mixed or adsorbed using known adjuvants, such as aluminum hydroxide and phosphate. The present invention also relates to vaccines including nucleic acid molecules which code for a protein (s) of the invention or for immunogenic peptides or their fragment (s). The nucleic acid vaccines, in particular the DNA vaccines, are generally administered in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle by intramuscular or subcutaneous injection. The aforementioned nucleic acid vaccines may further comprise nucleic acid molecules which code for the proteins HBsAgm 'and / or Pre-Sm' and / or HBsAg and / or Pre-S defined above. These vaccines are composed of at least one gene coding for at least one protein or antigen of the invention, the expression of which is regulated by a strong promoter, preferably a mammalian promoter, expressed on a plasmid or DNA vector of bacterial origin. . When administered by intramuscular or subcutaneous injection, DNA vaccines are transcribed and translated and the protein they encode is presented to the immune system inducing a humoral and cellular response. One of the main advantages of DNA vaccines is that they can be built and manipulated. They are likely to provide their own adjuvant in the form of CpG sequences present in bacterial DNA. DNA vaccines cause de novo synthesis of proteins in transfected cells leading to the association of antigenic peptides with MHC I determinants and therefore the activation of cytotoxic T cells. In addition, DNA vaccines do not induce measurable immune responses to the vector or plasmid, thus allowing repeated use. The term "immunoprotective" means that a sufficient quantity of protein, in particular HBsAgm protein and / or Pre-Sm protein or their fragments, is administered to an individual to induce production of antibodies (humoral immune response ) sufficient for it to be protective or an immune response mediated by cytotoxic cells (cellular immune response) to confer protection against the infectious agent without inducing side effects. The two types of response are distinguished in that the antibodies recognize the antigens in their three-dimensional form whereas the cytotoxic cells recognize portions of said antigens, associated with giycoproteins coded by the major histocompatibility complex (MHC). Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) play an essential role in the defense of cells infected with viruses. They act directly by cytotoxicity but also by providing specific and non-specific help to other immunocytes, such as macrophages, B cells and other T cells. Infected cells transform the antigen through intracellular events involving proteases. The transformed antigen is then presented on the surface of the cells in the form of peptides linked to HLA class I molecules at the level of the T cell receptors on the CTLs. Molecules of MHC class I can also bind exogenous peptides and present them to CTLs without intracellular transformation. Chisari et al. (Microbiol. Pathogen. 6:31 (1,989)) suggested that liver damage could be mediated by a HLA class I-restricted CD8 + cytotoxic T cell response to antigens encoded by HBV. However, the commercially available HBV vaccines which use either the HBsAg protein purified from the plasma of HBV carriers at a chronic stage of the disease, or a recombinant HBsAg protein or synthetic peptides do not confer a real protection for the person only in approximately 90% of cases. As a result, people who are either unimmunized or immunized but unprotected constitute a significant reservoir for potential infection. It is therefore important to stimulate the cellular immune response of individuals to obtain an appropriate response to HBV antigens. Moriyama et al., Science, 248: 361-364 (1,990) reported that the major HBV envelope antigen (HBsAg) is expressed on the surface of hepatocytes in a form which is recognizable by antibodies specific for envelope and by CD8 + cytotoxic T lymphocytes restricted by MHC class I molecules.
Aussi, la présente invention concerne également les peptides qui induisent des réponses des lymphocytes T cytotoxiques restreintes par les molécules du CMH de classe I, dérivés de SEQ ID NO 2, dont la séquence peptidique consiste en une séquence d'au moins 6 acides aminés, de préférence d'au moins 8 ou 9 acides aminés et avantageusement de 8 à 12 acides aminés contigus, ladite séquence étant sélectionnée dans SEQ ID NO 2 et induisant une réponse des lymphocytes T cytotoxiques restreinte par les molécules du CMH de classe I et leurs utilisations dans une composition immunogène.Also, the present invention also relates to peptides which induce responses of cytotoxic T lymphocytes restricted by MHC class I molecules, derived from SEQ ID NO 2, the peptide sequence of which consists of a sequence of at least 6 amino acids, preferably at least 8 or 9 amino acids and advantageously 8 to 12 contiguous amino acids, said sequence being selected in SEQ ID NO 2 and inducing a cytotoxic T lymphocyte response restricted by MHC class I molecules and their uses in an immunogenic composition.
La quantité de protéine ou de peptide administré(e) est fonction de l'addition ou non d'un adjuvant, mais généralement est comprise entre 10 et 50 //g/ml de protéine ou de peptide. Ainsi, de manière courante, on administre par dose 20 /g/0,5 ml de protéine chez l'adulte et 1 0 /g/0,5 ml chez l'enfant. La protéine HBsAgm et/ou la protéine Pré-Sm ou leurs fragments peuvent également être mélangées avec des protéines HBsAg et/ou Pré-S ou des fragments desdites protéines de type sauvage pour la formulation d'un vaccin. Elles peuvent être également mélangées avec des particules hybrides portant des épitopes de protéines d'autres organismes ou avec d'autres composés immunogènes pour la formulation de vaccins bivalents ou multivalents. La préparation de vaccins est notamment décrite dans « Vaccines », éd. Voiler et al., University Park Press, Baltimore, Md., USA, 1 978.The amount of protein or peptide administered depends on the addition or not of an adjuvant, but generally is between 10 and 50 μg / ml of protein or peptide. Thus, commonly, 20 / g / 0.5 ml of protein is administered per dose in adults and 10 / g / 0.5 ml in children. HBsAgm protein and / or Pre-Sm protein or their fragments can also be mixed with HBsAg and / or Pre-S proteins or fragments of said wild-type proteins for the formulation of a vaccine. They can be also mixed with hybrid particles carrying epitopes of proteins from other organisms or with other immunogenic compounds for the formulation of bivalent or multivalent vaccines. The preparation of vaccines is described in particular in "Vaccines", ed. Voiler et al., University Park Press, Baltimore, Md., USA, 1,978.
Le vaccin est administré à une dose déterminée en une ou plusieurs injection(s) par voie intramusculaire ou sous cutanée, suivie(s) de rappel(s), si nécessaire. L'effet immunisant du vaccin est suivi par un dosage d'anticorps anti- HBsAgm et/ou anti-protéine Pré-Sm chez l'individu vacciné. Dans le cas de vaccins d'acides nucléiques la concentration en acide nucléique dans la composition utilisée pour une administration in vivo est d'environ 100 μg /ml à 10 mg/ml, de préférence 1 mg/ml.The vaccine is administered at a determined dose in one or more injection (s) intramuscularly or subcutaneously, followed by booster (s), if necessary. The immunizing effect of the vaccine is followed by an assay of anti-HBsAgm antibodies and / or anti-Pre-Sm protein in the vaccinated individual. In the case of nucleic acid vaccines, the concentration of nucleic acid in the composition used for administration in vivo is approximately 100 μg / ml to 10 mg / ml, preferably 1 mg / ml.
L'administration de protéine(s) ou peptide(s) dérivés d'intérêt ou de leur(s) fragment(s), seuls ou en combinaison est utilisée pour la prophylaxie et/ou la thérapie. Ces protéines ou peptides administrés sont caractérisés en ce qu'ils ne présentent pas la virulence de HBV mais sont susceptibles d'induire une réponse immunitaire, humorale ou cellulaire, chez l'individu auquel ils sont administrés. De telles protéines sont dites « modifiées », mais leur immunogenicité est conservée. Les molécules modifiées peuvent être obtenues par des techniques synthétiques ou/et recombinantes ou à partir de molécules naturelles modifiées par des traitements chimiques ou physiques.The administration of protein (s) or peptide (s) derived from interest or their fragment (s), alone or in combination is used for prophylaxis and / or therapy. These proteins or peptides administered are characterized in that they do not exhibit the virulence of HBV but are capable of inducing an immune response, humoral or cellular, in the individual to whom they are administered. Such proteins are said to be "modified", but their immunogenicity is preserved. The modified molecules can be obtained by synthetic or / and recombinant techniques or from natural molecules modified by chemical or physical treatments.
L'identification de protéine(s) ou peptide(s) vaccin(s) est réalisée comme suit : les molécules candidates « modifiées » sont analysées dans un test fonctionnel pour s'assurer qu'elles ont perdues leur toxicité et pour vérifier leur immunogenicité (i) en réalisant un test in vitro de prolifération de lymphocytes T CD4 + spécifiques de l'antigène administré (T cell assay) ou un test in vitro de cytotoxicité des lymphocytes CD8 + spécifiques de l'antigène administré et, (ii) en mesurant, entre autres, le taux d'anticorps circulants dirigés contre la protéine naturelle. Ces formes modifiées sont utilisées pour immuniser des hommes par des procédures standardisées avec des adjuvants appropriés.The identification of vaccine protein (s) or peptide (s) is carried out as follows: the “modified” candidate molecules are analyzed in a functional test to ensure that they have lost their toxicity and to verify their immunogenicity (i) by performing an in vitro test for proliferation of CD4 + T cells specific for the administered antigen (T cell assay) or an in vitro cytotoxicity test for CD8 + lymphocytes specific for the administered antigen, and (ii) by measuring, among other things, the level of circulating antibodies directed against the natural protein. These modified forms are used to immunize men by standardized procedures with appropriate adjuvants.
Les acides nucléiques à usage vaccinal sont également analysés (i) en réalisant un test in vitro de prolifération de lymphocytes T CD4 + spécifiques de l'antigène administré (T cell assay) ou un test in vitro de cytotoxicité des lymphocytes CD8 + spécifiques de l'antigène administré et, (ii) en mesurant, entre autres, le taux d'anticorps circulants dirigés contre la protéine codée par l'ADN viral. Les vaccins préparés sont injectables, c'est-à-dire en solution liquide ou en suspension. En option, la préparation peut aussi être émulsifiée. La molécule antigénique peut être mélangée avec des excipients qui sont pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec l'ingrédient actif. Des exemples d'excipients favorables sont l'eau, une solution saline, le dextrose, le glycérol, l'éthanol ou des équivalents et leurs combinaisons. Si désiré, le vaccin peut contenir des quantités mineures de substances auxiliaires comme des agents mouillants ou émulsifiants, des agents qui tamponnent le pH ou des adjuvants comme l'hydroxide d'aluminium, le dipeptide muramyl ou leurs variations. Dans le cas des peptides, leur couplage à une plus grosse molécule (KLH, toxine tétanique) augmente quelquefois l'immunogénicité. Les vaccins sont administrés conventionnellement par injection par exemple intramusculaire. Des formulations additionnelles favorables avec d'autres modes d'administration incluent des suppositoires et quelquefois des formulations orales.The nucleic acids for vaccine use are also analyzed (i) by carrying out an in vitro test for proliferation of CD4 + T lymphocytes specific for the administered antigen (T cell assay) or an in vitro cytotoxicity test for CD8 + lymphocytes specific to the administered antigen and, (ii) by measuring, among other things, the level of circulating antibodies directed against the protein encoded by l 'Viral DNA. The vaccines prepared are injectable, that is to say in liquid solution or in suspension. Optionally, the preparation can also be emulsified. The antigenic molecule can be mixed with excipients which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient. Examples of favorable excipients are water, saline, dextrose, glycerol, ethanol or the like and combinations thereof. If desired, the vaccine may contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents or adjuvants such as aluminum hydroxide, dipeptide muramyl or their variations. In the case of peptides, their coupling to a larger molecule (KLH, tetanus toxin) sometimes increases immunogenicity. The vaccines are administered conventionally by injection, for example intramuscularly. Additional formulations favorable with other modes of administration include suppositories and sometimes oral formulations.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » on entend les supports et véhicules administrables à l'être humain ou à un animal, tels que décrits par exemple dans Remington's Pharmaceutical Sciences 1 6th éd., Mack Publishing Co. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable est de préférence isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativerhent basse. Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont également données dans Remington's Pharmaceutical Sciences précité.By “pharmaceutically acceptable vehicle” is meant the supports and vehicles which can be administered to humans or to an animal, as described for example in Remington's Pharmaceutical Sciences 1 6 th ed., Mack Publishing Co. The pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic , hypotonic or has low hypertonicity and has a relatively low ionic strength. The definitions of pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants are also given in Remington's Pharmaceutical Sciences supra.
Un aspect de l'invention concerne également une préparation thérapeutique ou prophylactique pour le traitement ou la prévention d'une infection par la virus HBVm qui comprend un agent thérapeutique ou prophylactique, c'est à dire au moins des anticorps anti-protéine HBSAgm et/ou anti-protéine Pré-Sm et/ou des anticorps dirigés contre des fragments desdites protéines, éventuellement associés à des anticorps anti-HBsAg sauvage et/ou anti-protéine Pré-S sauvage et/ou des anticorps dirigés contre des fragments desdites protéines, en particulier des anticorps neutralisants et leurs utilisations pour le traitement ou la prévention de la maladie. Des immunoglobulines dont le titre en anticorps, en particulier en anticorps anti-HBs a été contrôlé peuvent être utilisés en prophylaxie chez des sujets non vaccinés contre l'hépatite B, accidentellement contaminés, et chez les enfants nouveaux nés de mère infectée. Dans la définition de préparation thérapeutique ou prophylactique sont également incluses les compositions vaccinales ou immunogènes précitées.One aspect of the invention also relates to a therapeutic or prophylactic preparation for the treatment or prevention of an infection with the HBVm virus which comprises a therapeutic or prophylactic agent, ie at least anti-HBSAgm protein antibodies and / or pre-Sm anti-protein and / or antibodies directed against fragments of said proteins, possibly associated with anti-wild-type HBsAg antibodies and / or wild-type Pre-S anti-protein and / or antibodies directed against fragments of said proteins, in particular neutralizing antibodies and their uses for the treatment or prevention of disease. Immunoglobulins whose antibody titer, in particular anti-HBs antibody, has been controlled can be used in prophylaxis in subjects not vaccinated against hepatitis B, accidentally contaminated, and in children new born to an infected mother. Also included in the definition of therapeutic or prophylactic preparation are the aforementioned vaccine or immunogenic compositions.
L'évaluation de l'efficacité d'un agent thérapeutique ou prophylactique est effectuée en utilisant un modèle animal. A un animal sont injectées au moins une protéine de l'invention HbsAgm ou Pré-Sm, de préférence les deux, obtenue par isolement et purification à partir de sérum ou de plasma, par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, éventuellement associée(s) à la protéine HBsAgm' et/ou Pré-Sm' et/ou à une protéine HBsAg sauvage et/ou Pré-S sauvage. Les injections sont effectuées, à différentes concentrations établies, à des animaux mammifères, tels que souris ou rat, par voie intramusculaire, sous cutanée ou autres. Un contrôle négatif est effectué en parallèle. Les injections sont réalisées en une seule dose ou en doses répétées, avec différents temps d'intervalle entre chaque administration. Quelques heures à quelques semaines après l'administration, des échantillons biologiques, de préférence du sang ou du sérum sont prélevés. Sur ces échantillons sont réalisés :The evaluation of the efficacy of a therapeutic or prophylactic agent is carried out using an animal model. At least one protein of the invention HbsAgm or Pre-Sm, preferably both, is injected into an animal, obtained by isolation and purification from serum or plasma, by genetic recombination or by peptide synthesis, optionally combined. to the protein HBsAgm 'and / or Pre-Sm' and / or to a protein HBsAg wild and / or wild Pre-S. The injections are carried out, at various established concentrations, in mammalian animals, such as mice or rats, intramuscularly, subcutaneously or others. A negative control is carried out in parallel. The injections are given in a single dose or in repeated doses, with different time intervals between each administration. A few hours to a few weeks after administration, biological samples, preferably blood or serum, are taken. These samples are made:
- (i) un dosage d'anticorps spécifiques des protéine(s) ou peptide(s) d'intérêt ou de leurs fragments, seuls ou en combinaison, et/ou- (i) an assay of antibodies specific for the protein (s) or peptide (s) of interest or their fragments, alone or in combination, and / or
- (ii) un dosage de la réponse immune cellulaire induite contre les protéine(s) ou peptide(s) d'intérêt ou leurs fragments et contre tout peptide immunogène dérivant desdites protéines ou peptides ou de leurs fragments, en réalisant, par exemple, un test d'activation in vitro de cellules lymphocytes T « helper » spécifiques de l'antigène administré, en quantifiant les lymphocytes T cytotoxiques selon la technique dite ELISPOT, décrite par Scheibenbogen et al., 1 997 Clinical Cancer Research 3 : 221 -226.(ii) an assay of the cellular immune response induced against the protein (s) or peptide (s) of interest or their fragments and against any immunogenic peptide derived from said proteins or peptides or their fragments, by carrying out, for example, an in vitro activation test of helper T lymphocytes specific for the antigen administered, by quantifying the cytotoxic T lymphocytes according to the so-called ELISPOT technique, described by Scheibenbogen et al., 1 997 Clinical Cancer Research 3: 221-222 .
Une telle détermination est particulièrement avantageuse pour l'évaluation de l'efficacité d'une approche vaccinale chez un individu ou pour diagnostiquer et/ou pronostiquer un état pathologique potentiel en cherchant à mettre en évidence une réponse immune qui serait naturellement développée chez un patient.Such a determination is particularly advantageous for the evaluation of the effectiveness of a vaccination approach in an individual or for diagnose and / or predict a potential medical condition by seeking to demonstrate an immune response that would naturally develop in a patient.
L'animal est ensuite sacrifié et l'efficacité de l'agent thérapeutique est mis en évidenceThe animal is then sacrificed and the effectiveness of the therapeutic agent is demonstrated.
- (i) par des analyses d'immunohistologie classiques en utilisant des ligands des protéines d'intérêt et/ou de leurs fragments, en particulier des anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des fragments desdits anticorps, et/ou- (i) by conventional immunohistology analyzes using ligands of the proteins of interest and / or their fragments, in particular monoclonal or polyclonal antibodies or fragments of said antibodies, and / or
- (ii) par des techniques d'hybridation in situ classiques en utilisant des fragments d'acides nucléiques ou des oligonucléotides définis à partir des connaissances des séquences nucléotidiques qui codent pour les protéines d'intérêt ou pour leurs fragments ou à partir des connaissances des séquences polypeptidiques desdites protéiques d'intérêt ou de leurs fragments ; et/ou(ii) by conventional in situ hybridization techniques using nucleic acid fragments or oligonucleotides defined from knowledge of the nucleotide sequences which code for the proteins of interest or for their fragments or from knowledge of polypeptide sequences of said proteins of interest or their fragments; and or
- (iii) par des techniques d'amplification par PCR in situ en utilisant des fragments d'acides nucléiques ou des amorces définis à partir des séquences nucléotidiques ou polypeptidiques des protéiques d'intérêt ou de leurs fragments. L'évaluation de l'efficacité d'un agent thérapeutique ou prophylactique et le suivi thérapeutique ex vivo, chez l'homme est déterminé de la manière suivante : les agents thérapeutiques à tester pour une activité thérapeutique et/ou pour un suivi thérapeutique sont administrés par différentes voies à l'homme, telles que les voies intramusculaire, sous cutanée ou autres. Différentes doses sont administrées à l'être humain. Le dossier clinique du patient au moment de la première administration est parfaitement connu. Une ou plusieurs administrations peuvent être réalisées avec des temps d'intervalle différents entre chaque administration pouvant aller de quelques jours à quelques années. Des échantillons biologiques sont prélevés à des intervalles de temps déterminés après administration de l'agent thérapeutique, de préférence du sang, du sérum. Différentes analyses sont réalisées à partir de ces échantillons. Juste avant la première administration de l'agent thérapeutique, ces prélèvements et ces mêmes analyses sont également réalisés. Un examen clinique et biologique classique est réalisé également en parallèle des analyses supplémentaires qui sont être décrites ci dessous, à différentes temps de l'analyse. Les analyses réalisées sont : une mesure qualitative et quantitative des protéines d'intérêt dans le sérum ou dans le sang par ELISA et/ou Western Blot, en utilisant des anticorps ou des fragments d'anticorps capables de se fixer à au moins une des protéines ou à un de leur fragment et/ou une mesure de l'activité desdites protéines et/ou un dosage d'anticorps spécifiques des protéines d'intérêt ou de leurs fragments dans des échantillons de sang ou de sérum par ELISA et/ou Western Blot en utilisant une protéine naturelle isolée et purifiée ou un fragment de la protéine naturelle et/ou une protéine recombinante ou un fragment de cette protéine recombinante ou un polypeptide de synthèse, et/ou un dosage de la réponse immune cellulaire induite contre la ou les protéine(s) d'intérêt et tout peptide immunogène dérivant de ces protéines, comme décrit précédemment, et/ou une détection de fragments d'ADN et/ou d'ARN codant pour la ou les protéine(s) d'intérêt ou un fragment desdites protéines d'intérêt par hybridation nucléotidique selon les techniques bien connues de l'homme de l'art (Southern blot, Northern blot, ELOSA « Enzyme-Linked Oligosorbent Assay » (Katz JB et al., Am. J. Vet. Res., 1 993 Dec ; 54 (1 2) :2021 -6 et François Mallet et al., Journal of Clinical Microbiology, June 1 993, p1444-1449)) et/ou par méthode d'amplification de l'ADN et/ou l'ARN , par exemple par PCR, RT-PCR, en utilisant des fragments d'acides nucléiques codant pour la ou les protéine(s) d'intérêt, et/ou par biopsie de tissus, de préférence du foie, et observation des effets caractéristiques de la ou des protéine(s).- (iii) by in situ PCR amplification techniques using nucleic acid fragments or primers defined from the nucleotide or polypeptide sequences of the proteins of interest or their fragments. The evaluation of the efficacy of a therapeutic or prophylactic agent and the ex vivo therapeutic monitoring in humans is determined as follows: the therapeutic agents to be tested for a therapeutic activity and / or for a therapeutic monitoring are administered by different routes to humans, such as intramuscular, subcutaneous or other routes. Different doses are administered to humans. The clinical record of the patient at the time of the first administration is perfectly known. One or more administrations can be carried out with different intervals between each administration, which can range from a few days to a few years. Biological samples are taken at determined time intervals after administration of the therapeutic agent, preferably blood, serum. Different analyzes are carried out from these samples. Just before the first administration of the therapeutic agent, these samples and these same analyzes are also carried out. A classic clinical and biological examination is also carried out in parallel with the additional analyzes which are described below, at different times of the analysis. Analyses carried out are: a qualitative and quantitative measurement of the proteins of interest in serum or in the blood by ELISA and / or Western Blot, using antibodies or antibody fragments capable of binding to at least one of the proteins or to one of their fragment and / or a measurement of the activity of said proteins and / or a determination of antibodies specific for the proteins of interest or of their fragments in blood or serum samples by ELISA and / or Western Blot using an isolated and purified natural protein or a fragment of the natural protein and / or a recombinant protein or a fragment of this recombinant protein or a synthetic polypeptide, and / or an assay of the cellular immune response induced against the protein (s) ) of interest and any immunogenic peptide derived from these proteins, as described above, and / or a detection of DNA and / or RNA fragments coding for the protein (s) of interest or a fra said proteins of interest by nucleotide hybridization according to techniques well known to those skilled in the art (Southern blot, Northern blot, ELOSA "Enzyme-Linked Oligosorbent Assay" (Katz JB et al., Am. J. Vet. Res., 1 993 Dec; 54 (1 2): 2021 -6 and François Mallet et al., Journal of Clinical Microbiology, June 1 993, p1444-1449)) and / or by DNA and / or RNA amplification method, by example by PCR, RT-PCR, using nucleic acid fragments coding for the protein (s) of interest, and / or by biopsy of tissues, preferably of the liver, and observation of the characteristic effects of the or protein (s).
Quand l'agent thérapeutique est un anticorps, un fragment d'anticorps ou un mélange d'anticorps et/ou de fragments d'anticorps, on administre au patient soit des anticorps solubles neutralisants ou des fragments d'anticorps pour inhiber l'activité protéique, soit des anticorps solubles spécifiques ou des fragments d'anticorps pour éliminer la protéine par formation de complexes i muns. Les anticorps neutralisants sont polyclonaux ou monoclonaux ou sont des fragments d'anticorps qui reconnaissent le site actif de la protéine et en se fixant, inhibe la fonction de la protéine. Les anticorps non neutralisants sont des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments desdits anticorps qui sont capables de reconnaître une région immunodominante de la protéine et de l'éliminer par formation d'un complexe immun. La capacité de l'anticorps à se fixer spécifiquement à la protéine est analysé par des techniques conventionnelle décrites, comme par exemple par des tests ELISA ou de Western Blot en utilisant la protéine ou le peptide immunogène naturel ou synthétique. Le titre de l'anticorps est déterminé. La capacité de l'anticorps à neutraliser la fonction de la protéine peut être analysée par différents moyens, par exemple en déterminant la diminution de l'activité de la protéine ou du peptide immunogène en présence de l'anticorps. Des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre une protéine cible ou une partie de cette protéine sont produits par des techniques conventionnelles utilisées pour produire des anticorps contre des antigènes de surface. Des souris ou des lapins sont immunisées (i) soit avec une protéine naturelle ou recombinante, (ii) soit avec tout peptide immunogène dérivé de cette protéine, (iii) soit avec des cellules murines qui expriment la protéine d'intérêt ou le peptide et des molécules du CMH. La lignée murine Balb/c est la plus fréquemment utilisée. La présente invention concerne donc un matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des êtres humains infectés par au moins le virus HBVm, ladite composition comprenant :When the therapeutic agent is an antibody, an antibody fragment or a mixture of antibodies and / or antibody fragments, the patient is administered either neutralizing soluble antibodies or antibody fragments to inhibit protein activity , either specific soluble antibodies or antibody fragments to remove the protein by formation of complex i muns. Neutralizing antibodies are polyclonal or monoclonal or are fragments of antibodies which recognize the active site of the protein and by binding, inhibits the function of the protein. Non-neutralizing antibodies are polyclonal or monoclonal antibodies or fragments of said antibodies which are capable of recognizing an immunodominant region of the protein and of eliminating it by formation of an immune complex. The ability to the antibody to bind specifically to the protein is analyzed by conventional techniques described, such as for example by ELISA or Western Blot tests using the protein or the natural or synthetic immunogenic peptide. The titer of the antibody is determined. The ability of the antibody to neutralize the function of the protein can be analyzed by various means, for example by determining the decrease in the activity of the immunogenic protein or peptide in the presence of the antibody. Monoclonal or polyclonal antibodies to a target protein or a portion of that protein are produced by conventional techniques used to produce antibodies against surface antigens. Mice or rabbits are immunized (i) either with a natural or recombinant protein, (ii) or with any immunogenic peptide derived from this protein, (iii) or with murine cells which express the protein of interest or the peptide and MHC molecules. The murine line Balb / c is the most frequently used. The present invention therefore relates to a biological material for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of human beings infected with at least the HBVm virus, said composition comprising:
- (i) soit au moins une protéine naturelle et/ou une protéine recombinante et/ou un polypeptide de synthèse ou leurs fragments dont la séquence correspond à tout ou partie des séquences référencées SEQ ID NO 2 et 4, indépendamment ou en combinaison, et éventuellement associées avec tout ou partie d'au moins une protéine naturelle et/ou une protéine recombinante et/ou un polypeptide ou leurs fragments dont les séquences sont référencées en SEQ ID NOs 5 et 6 et/ou à tout ou partie d'une protéine naturelle et/ou recombinante et/ou d'un polypeptide de synthèse ou de leurs fragments de type HBV sauvage. Les présents inventeurs ont en effet identifié après clonage, séquençage et alignement avec les séquences protéiques disponibles dans la banque NBRF-PIR, un autre variant de génotype D, isolé à partir du même individu et qui présente deux mutations significatives. La première mutation concerne l'acide aminé Arg, en position 201 de la protéine HBsAg identifiée en SEQ ID NO 5 et la deuxième mutation concerne l'acide aminé Gly, en position 102 de la région Pré-S identifiée en SEQ ID NO 6. Les codons codant respectivement pour ces deux acides aminés sont les codons AGG à la position 628-630 dans le gène S et à la position 782-784 par rapport à la séquence du génome complet et le codon GGA à la position 304-306 dans la région Pré-S et à la position 31 51 -31 53 par rapport à la séquence du génome complet ; - (ii) soit au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal ou un fragment desdits anticorps, spécifique d'au moins une desdites protéines ou de ses fragments, lesdits anticorps ou fragments pouvant être utilisés seuls ou en combinaison et étant capables de se fixer à au moins une des protéines répondant aux définitions ci dessus. Cet anticorps peut être neutralisant ou non neutralisant, c'est à dire capable de neutraliser ou non l'activité protéique. Ces anticorps sont très utiles notamment pour permettent la mise en œuvre de compositions thérapeutiques car ils conduisent par exemple, à des réactions immunes, dirigées spécifiquement à encontre d'épitopes immunodominants ou contre les antigènes. L'invention concerne aussi des ligands susceptibles de s'associer à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique tel que défini ci dessus. Ainsi, par ligand, on entend toute molécule susceptible de s'associer à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique, telle qu'un fragment nucléotidique partiellement ou totalement complémentaire, un polynucléotide complémentaire, un anticorps anti-acide nucléique. La production de fragments nucléotidiques ou de polynucléotides fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut notamment citer l'utilisation d'enzymes de restriction, et la synthèse chimique sur synthétiseur automatique. Les sondes et amorces susceptibles de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique tel que défini précédemment font partie de cette définition. Il est à la portée de l'homme du métier de définir les conditions de stringence appropriées. Des conditions de stringence caractéristiques sont celles qui correspondent à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 1 2 à 20°C sous le Tm (« melting température ») de l'hybride à l'étude. Les conditions de stringence pour discriminer même une seule mutation ponctuelle sont connues depuis au moins les années 1 979 ; On peut citer à titre d'exemples Wallace R. B et al., DNA. Nucleic. Acids. Res. 6, 3543-3557 (1 979), Wallace R. B et al., Science, 209, 1 396-1400 (1 980), Itakura K. and Riggs A.D., Science, 209, 1 401 -1 405 (1 980), Suggs S.V. et al., PNAS, 78, 661 3-661 7 (1.981 ), Wallace R.B et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9, 3647-3656 ( 1 981 ), Wallace R.B et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9, 879-894 (1 981 ) et Conner B.J. étal, PNAS, 80, 278-282 (1 983) . Par ailleurs, on connaît des techniques pour la production d'anticorps anti-acides nucléiques. On peut citer à titre d'exemples Philippe Cros et al., Nucleic Acides Researc, 1994, Vol. 22, N ° . 1 5, 2951 -2957 ; Anderson, W.F. et al. (1 988) Bioessays, 8 (2), 69-74 ; Lee, J.S. et al. ( 1 984) FEBS Lett., 1 68, 303-306 ; Malfoy, B. et al. (1 982) Biochemistry, 21 (22), 5463-5467 ; Stollar, B.D. et al., J.J. (eds) Methods in Enzymology, Académie Press, pp 70- 85 ; Traincard, F. et al. (1 989) J. Immunol. Meth., 1 23, 83-91 et Traincard, F. et al. ( 1 989) Mol. Cell. Probes, 3, 27-38). Par fragment nucléotidique, on entend soit des fragments associés à une même unité moléculaire, soit des fragments dans un complexe moléculaire comprenant plusieurs sous-unités homologues ou hétérologues obtenues de manière naturelle ou artificielle, notamment par multi-épissage différentiel ou par synthèse sélective. On définit ainsi une composition diagnostique qui comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique.(i) either at least one natural protein and / or a recombinant protein and / or a synthetic polypeptide or their fragments, the sequence of which corresponds to all or part of the sequences referenced SEQ ID NO 2 and 4, independently or in combination, and optionally associated with all or part of at least one natural protein and / or a recombinant protein and / or a polypeptide or their fragments whose sequences are referenced in SEQ ID NOs 5 and 6 and / or all or part of a protein natural and / or recombinant and / or a synthetic polypeptide or their wild type HBV fragments. The present inventors have in fact identified after cloning, sequencing and alignment with the protein sequences available in the NBRF-PIR library, another variant of genotype D, isolated from the same individual and which has two significant mutations. The first mutation concerns the amino acid Arg, in position 201 of the HBsAg protein identified in SEQ ID NO 5 and the second mutation relates to the amino acid Gly, in position 102 of the Pre-S region identified in SEQ ID NO 6. Codons coding respectively for these two amino acids are the AGG codons at position 628-630 in the S gene and at position 782-784 relative to the complete genome sequence and the GGA codon at position 304-306 in the region Pre- S and at position 31 51 -31 53 relative to the complete genome sequence; - (ii) either at least one monoclonal or polyclonal antibody or a fragment of said antibodies, specific for at least one of said proteins or of its fragments, said antibodies or fragments being able to be used alone or in combination and being capable of binding to the minus one of the proteins meeting the above definitions. This antibody can be neutralizing or non-neutralizing, that is to say capable of neutralizing or not neutralizing protein activity. These antibodies are very useful in particular for allowing the implementation of therapeutic compositions because they lead, for example, to immune reactions, directed specifically against immunodominant epitopes or against antigens. The invention also relates to ligands capable of associating with a nucleotide sequence of DNA or RNA or with a nucleotide fragment as defined above. Thus, by ligand is meant any molecule capable of associating with a nucleotide sequence of DNA or RNA or with a nucleotide fragment, such as a partially or completely complementary nucleotide fragment, a complementary polynucleotide, an anti- nucleic acid. The production of nucleotide fragments or polynucleotides is part of the general knowledge of a person skilled in the art. Mention may in particular be made of the use of restriction enzymes, and chemical synthesis on an automatic synthesizer. Probes and primers capable of hybridizing under stringency conditions determined to a nucleotide sequence of DNA or RNA or to a nucleotide fragment as defined above are part of this definition. It is within the reach of the skilled person to define the appropriate stringency conditions. Characteristic stringency conditions are those which correspond to a combination of the temperature and the salt concentration chosen approximately between 1 2 at 20 ° C under the Tm ("melting temperature") of the hybrid under study. The stringency conditions for discriminating even a single point mutation are known since at least the years 1 979; Examples include Wallace R. B et al., DNA. Nucleic. Acids. Res. 6, 3543-3557 (1 979), Wallace R. B et al., Science, 209, 1 396-1400 (1 980), Itakura K. and Riggs AD, Science, 209, 1 401 -1 405 (1 980 ), SV Suggs et al., PNAS, 78, 661 3-661 7 (1. 981), RB Wallace et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9, 3647-3656 (1,981), Wallace RB et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9, 879-894 (1 981) and Conner BJ et al, PNAS, 80, 278-282 (1 983). Furthermore, techniques are known for the production of anti-nucleic acid antibodies. As examples, Philippe Cros et al., Nucleic Acides Researc, 1994, Vol. 22, no. 15, 2951-2957; Anderson, WF et al. (1,988) Bioessays, 8 (2), 69-74; Lee, JS et al. (1,984) FEBS Lett., 1,68, 303-306; Malfoy, B. et al. (1,982) Biochemistry, 21 (22), 5463-5467; Stollar, BD et al., JJ (eds) Methods in Enzymology, Académie Press, pp 70-85; Traincard, F. et al. (1,989) J. Immunol. Meth., 1 23, 83-91 and Traincard, F. et al. (1,989) Mol. Cell. Probes, 3, 27-38). By nucleotide fragment is meant either fragments associated with the same molecular unit, or fragments in a molecular complex comprising several homologous or heterologous subunits obtained in a natural or artificial manner, in particular by differential multi-splicing or by selective synthesis. A diagnostic composition is thus defined which comprises at least one probe or a primer or an anti-nucleic acid antibody.
Les amorces, sondes et anticorps anti-acides nucléiques de l'invention sont par ailleurs utilisées dans un procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon de sérum ou de plasma d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tels que défini précédemment, dans des conditions de stringence déterminées quand le ligand est une sonde ou une amorce et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN, ou dans des conditions d'incubation déterminées lorsque le ligand est anticorps anti-acide nucléique et on détecte le complexe ainsi formé. Dans le cas de l'utilisation d'un anticorps anti-acide nucléique, l'anticorps peut lui même être marqué par tout marqueur approprié pour la révélation du complexe formé ou bien la formation du complexe peut être révélée par l'addition au milieu d'incubation d'un anticorps anti- anticorps acide nucléique marqué. Dans le cas d'utilisation de sondes la mise en évidence du complexe d'hybridation peut être effectuée directement par utilisation d'une sonde complémentaire ou sensiblement complémentaire de la séquence de la cible, ladite sonde étant marquée par tout marqueur approprié ou par mise en œuvre de la technique dite « sandwich » en une ou deux étapes qui consiste à utiliser une sonde de capture complémentaire ou sensiblement complémentaire d'une partie de la séquence de la cible et une sonde dite de détection marquée complémentaire ou sensiblement complémentaire d'une autre partie de la séquence de la cible. Dans le cas d'utilisation d'amorces, celles ci peuvent être directement marquées pour la mise en évidence d'un produit d'amplification.The primers, probes and anti-nucleic acid antibodies of the invention are moreover used in a method of diagnosis of DNA and / or viral RNA, according to which a sample of serum or plasma is taken from a patient, said sample is treated if necessary to extract DNA and / or RNA therefrom, said sample is contacted with at least one probe or an anti-nucleic acid primer or antibody as defined above, under stringency conditions determined when the ligand is a probe or a primer and the presence of DNA and / or viral RNA in the sample is detected either by demonstrating a hybridization of said DNA and / or viral RNA with at least one probe , either by amplification of said DNA and / or RNA, or under determined incubation conditions when the ligand is anti-nucleic acid antibody and the complex thus formed is detected. In the case of the use of an anti-nucleic acid antibody, the antibody may itself be labeled with any marker suitable for revealing the complex formed or else the formation of the complex may be revealed by the addition to the medium of incubation of an anti-labeled nucleic acid antibody. When probes are used, the hybridization complex can be demonstrated directly by using a probe which is complementary or substantially complementary to the sequence of the target, said probe being marked with any appropriate marker or by work of the so-called “sandwich” technique in one or two stages which consists in using a capture probe complementary or substantially complementary to a part of the target sequence and a so-called labeled detection probe complementary or substantially complementary to another part of the target sequence. In the case of the use of primers, these can be directly marked for the detection of an amplification product.
La présente invention concerne également un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées au traitement d'une infection au moins par HBVm, ladite composition comprenant (i) soit au moins une séquence d'acide nucléique capable de s'hybrider à au moins une des séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou leurs séquences complémentaires, en particulier à la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO 1 ou sa séquence complémentaire, éventuellement en association avec une séquence d'acide nucléique susceptible de s'hybrider à au moins une des séquences nucléotidiques codant pour SEQ ID NO 5 et pour SEQ ID NO 6 ou leurs séquences complémentaires et/ou avec au moins une séquence d'acide nucléique de type HBV sauvage ; ou des fragments desdites séquences précitées, (ii) soit au moins une séquence d'acide nucléique comprenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique et des éléments assurant l'expression dudit gène in vivo dans des cellules cibles destinées à être génétiquement modifiées par ladite séquence nucléique, (iii) soit au moins une cellule de mammifère ne produisant pas naturellement la ou les protéine(s) de l'invention ou leurs fragments ou des anticorps spécifiques d'au moins une desdites protéines ou de ses fragments ; ladite cellule mammifère étant génétiquement modifiée in vitro par au moins une séquence d'acide nucléique ou un fragment d'une séquence d'acide nucléique ou une association de séquences d'acides nucléiques correspondant à des fragments d'acides nucléiques issus d'un même gène ou de gènes différents, ledit gène d'intérêt thérapeutique codant pour tout ou partie de la ou des protéine(s) d'intérêt ou leur(s) fragment(s) ou pour un anticorps spécifique de la ou des protéine(s) d'intérêt qui sera exprimé à la surface de ladite cellule de mammifère (Toes et al., 1 997, PNAS 94 : 14660-1 4665). La composition pharmaceutique peut contenir un agent thérapeutique seul dirigé contre une cible seule ou des agents pris en combinaison dirigés contre plusieurs cibles.The present invention also relates to a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions intended for the treatment of an infection with at least HBVm, said composition comprising (i) either at least one nucleic acid sequence capable of hybridizing to at least one nucleic acid sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3 or their complementary sequences, in particular to the nucleic acid sequence SEQ ID NO 1 or its complementary sequence, optionally in combination with a nucleic acid sequence capable of hybridize to at least one of the nucleotide sequences coding for SEQ ID NO 5 and for SEQ ID NO 6 or their complementary sequences and / or with at least one nucleic acid sequence of wild HBV type; or fragments of said aforementioned sequences, (ii) either at least one nucleic acid sequence comprising at least one gene of therapeutic interest and elements ensuring expression of said gene in vivo in target cells intended to be genetically modified by said nucleic sequence, (iii) either at least one mammalian cell which does not naturally produce the protein (s) of the invention or their fragments or antibodies specific for at least one of said proteins or of its fragments; said mammalian cell being genetically modified in vitro by at least one nucleic acid sequence or a fragment of a nucleic acid sequence or a combination of nucleic acid sequences corresponding to nucleic acid fragments originating from the same gene or different genes, said gene of therapeutic interest coding for all or part of the protein (s) of interest or their fragment (s) or for an antibody specific for the protein (s) of interest which will be expressed on the surface of said mammalian cell (Toes et al., 1 997, PNAS 94: 14660-1 4665). The pharmaceutical composition may contain a therapeutic agent alone directed against a single target or agents taken in combination directed against several targets.
Aussi, la présente invention concerne également un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques comprenant au moins une séquence d'acide nucléique capable de s'hybrider à une séquence d'acide nucléique telle que définie ci dessus. Les séquences d'acides nucléiques et/ou vecteurs (anti-sens ou codant pour une protéine) permettent notamment de cibler les cellules dans lesquelles un gène est exprimé.Also, the present invention also relates to a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions comprising at least one nucleic acid sequence capable of hybridizing to a nucleic acid sequence as defined above. The nucleic acid and / or vector sequences (antisense or coding for a protein) make it possible in particular to target the cells in which a gene is expressed.
Des séquences d'acides nucléiques ou des oligonucléotides anti-sens sont capables d'interférer spécifiquement avec la synthèse d'une protéine cible d'intérêt, par inhibition de la formation et/ou du fonctionnement du polysome, selon le positionnement de l'anti-sens dans l'ARNm de la cible. Donc le choix fréquent de la séquence entourant le codon d'initiation de la traduction comme cible pour une inhibition par un oligonucléotide anti-sens vise à prévenir la formation du complexe d'initiation. D'autres mécanismes dans l'inhibition par des oligonucléotides anti-sens impliquent une activation de la ribonucléase H qui digère les hybrides oligonucléotide anti-sens/ARNm ou une interférence au niveau de sites d'épissage par des oligonucléotides anti-sens dont la cible est un site d'épissage de l'ARNm. Les oligonucléotides anti-sens sont également complémentaires de séquences ADN et peuvent donc interférer au niveau de la transcription par la formation d'une triple hélice, l'oligonucléotide anti-sens s'appariant par des liaisons hydrogène dites de Hoogsteen au niveau du grand sillon de la double hélice d'ADN. Dans ce cas particulier, on parle plus précisément d'oligonucléotides antigènes. Il est bien entendu que les oligonucléotides anti-sens peuvent être strictement complémentaires de la cible ADN ou ARN à laquelle ils doivent s'hybrider, mais aussi non strictement complémentaires à la condition qu'ils s'hybrident à la cible. De même, il peut s'agir d'oligonucléotides anti-sens non modifiés ou modifiés au niveau des liaisons inter-nucléotidiques. Toutes ces notions font partie des connaissances générales de l'homme de l'art.Antisense nucleic acid sequences or oligonucleotides are capable of specifically interfering with the synthesis of a target protein of interest, by inhibiting the formation and / or functioning of the polysome, depending on the positioning of the anti -sense in the target mRNA. Therefore, the frequent choice of the sequence surrounding the translation initiation codon as a target for inhibition by an antisense oligonucleotide aims to prevent the formation of the initiation complex. Other mechanisms in inhibition by antisense oligonucleotides involve activation of ribonuclease H which digests antisense oligonucleotide / mRNA hybrids or interference at splicing sites with antisense oligonucleotides whose target is a mRNA splicing site. The antisense oligonucleotides are also complementary to DNA sequences and can therefore interfere at the transcription level by the formation of a triple helix, the antisense oligonucleotide paired by so-called Hoogsteen hydrogen bonds at the level of the large groove. of the DNA double helix. In this particular case, we talk more specifically antigen oligonucleotides. It is understood that the antisense oligonucleotides can be strictly complementary to the DNA or RNA target to which they must hybridize, but also not strictly complementary provided that they hybridize to the target. Likewise, they may be antisense oligonucleotides which are unmodified or modified at the level of the inter-nucleotide bonds. All these notions are part of the general knowledge of a person skilled in the art.
La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant, entre autres, une séquence nucléique ou oligonucléotide anti-sens tels que définis ci-dessus.The present invention therefore relates to a pharmaceutical composition comprising, inter alia, an antisense nucleic sequence or oligonucleotide as defined above.
La présente invention concerne aussi l'utilisation de vecteurs comprenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique par rapport aux gènes des protéines d'intérêt identifiées dans la présente invention et un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées au traitement de patients infectés par au moins le virus HBVm, ladite composition comprenant une séquence d'acide nucléique comprenant un gène d'intérêt thérapeutique et des éléments d'expression dudit gène d'intérêt. Les gènes peuvent être non mutés ou mutés. Ils peuvent également consister en des acides nucléiques modifiés de sorte qu'il ne leur est pas possible de s'intégrer dans le génome de la cellule cible ou des acides nucléiques stabilisés à l'aide d'agents, tels que la spermine. Un tel gène d'intérêt thérapeutique code notamment :The present invention also relates to the use of vectors comprising at least one gene of therapeutic interest relative to the genes of the proteins of interest identified in the present invention and a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions intended for the treatment of patients infected with at least the HBVm virus, said composition comprising a nucleic acid sequence comprising a gene of therapeutic interest and elements of expression of said gene of interest. Genes can be unmutated or mutated. They may also consist of modified nucleic acids so that it is not possible for them to integrate into the genome of the target cell or nucleic acids stabilized with the aid of agents, such as spermine. Such a gene of therapeutic interest codes in particular:
- (i) soit au moins pour une protéine ou un fragment de protéine de l'invention ;- (i) either at least for a protein or a protein fragment of the invention;
- (ii) soit au moins pour tout ou partie d'un anticorps polyclonal ou monoclonal capable de se fixer à au moins une protéine de la présente invention.- (ii) either at least for all or part of a polyclonal or monoclonal antibody capable of binding to at least one protein of the present invention.
Il peut notamment s'agir d'anticorps transmembranaire natif, ou de fragment ou dérivé d'un tel anticorps, pour autant que ledit anticorps, fragment ou dérivé d'anticorps soit exprimé à la surface d'une cellule cible d'un mammifère génétiquement modifiée aux fins de la présente invention et soit capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T « helper » impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule ; - (iii) soit au moins pour une molécule inhibitrice d'au moins une protéine de l'invention ;It can in particular be a native transmembrane antibody, or a fragment or derivative of such an antibody, provided that said antibody, fragment or derivative of antibody is expressed on the surface of a target cell of a genetically mammal modified for the purposes of the present invention and is capable of binding to a polypeptide present on the surface of a cytotoxic effector cell or of a “helper” T lymphocyte involved in the process of activation of such a cell; - (iii) either at least for an inhibitor molecule of at least one protein of the invention;
- (iv) soit au moins pour un ligand ou toute partie d'un ligand capable de se fixer à au moins une protéine ou un fragment de protéine de l'invention et/ou d'inhiber sa fonction.- (iv) either at least for a ligand or any part of a ligand capable of binding to at least one protein or a protein fragment of the invention and / or of inhibiting its function.
Par anticorps transmembranaire on entend un anticorps dont au moins la région fonctionnelle capable de reconnaître et de se fixer à son antigène spécifique est exprimée à la surface des cellules cibles pour permettre lesdites reconnaissance et fixation. Plus particulièrement, les anticorps selon la présente invention consistent en des polypeptides de fusion comprenant les amino acides définissant ladite région fonctionnelle et une séquence d'amino acides (polypeptide transmembranaire) permettant l'ancrage au sein de la double couche lipidique membranaire de la cellule cible ou à la surface externe de cette bi- couche. Les séquences nucléiques codant pour de nombreux polypeptides transmembranaires sont décrites dans la littérature.By transmembrane antibody is meant an antibody whose at least the functional region capable of recognizing and binding to its specific antigen is expressed on the surface of the target cells to allow said recognition and fixation. More particularly, the antibodies according to the present invention consist of fusion polypeptides comprising the amino acids defining said functional region and an amino acid sequence (transmembrane polypeptide) allowing anchoring within the double lipid membrane layer of the target cell. or on the external surface of this bilayer. The nucleic sequences encoding many transmembrane polypeptides are described in the literature.
Par éléments assurant l'expression dudit gène in vivo on fait notamment référence aux éléments nécessaires pour assurer l'expression dudit gène après son transfert dans une cellule cible. Il s'agit notamment des séquences promotrices et/ou des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule, et éventuellement les séquences requises pour permettre l'expression à la surface des cellules cibles d'un polypeptide. Le promoteur utilisé peut être un promoteur viral, ubiquitaire ou spécifique de tissu ou encore un promoteur synthétique. A titre d'exemple, on mentionnera les promoteurs, tels que les promoteurs des virus RSV (Rous Sarcoma Virus), MPSV, SV40 (Simian Virus), CMV (Cytomegalovirus) ou du virus de la vaccine. Il est en outre possible de choisir une séquence promotrice spécifique d'un type cellulaire donné, ou activable dans des conditions définies. La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à de telles séquences promotrices.By elements ensuring the expression of said gene in vivo we refer in particular to the elements necessary to ensure the expression of said gene after its transfer to a target cell. These include promoter sequences and / or regulatory sequences effective in said cell, and optionally the sequences required to allow expression on the surface of target cells of a polypeptide. The promoter used can be a viral, ubiquitous or tissue-specific promoter or a synthetic promoter. By way of example, mention will be made of the promoters, such as the promoters of the RSV virus (Rous Sarcoma Virus), MPSV, SV40 (Simian Virus), CMV (Cytomegalovirus) or of the vaccinia virus. It is also possible to choose a promoter sequence specific for a given cell type, or activatable under defined conditions. The literature provides a great deal of information relating to such promoter sequences.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le gène thérapeutique consiste en une séquence d'acide nucléique d'ADN ou ARN nue, c'est à dire libre de tout composé facilitant son introduction dans les cellules (transfert de séquence d'acide nucléique). Toutefois, afin de favoriser son introduction dans les cellules cibles et afin d'obtenir les cellules génétiquement modifiées de l'invention, la séquence d'acide nucléique peut être sous la forme d'un « vecteur », et plus particulièrement sous la forme d'un vecteur viral, tel que par exemple un vecteur adénoviral, rétroviral, un vecteur dérivé d'un poxvirus, notamment dérivé du virus de la vaccine ou du Modified Virus Ankara (MVA) ou d'un vecteur non viral tel que, par exemple, un vecteur consistant en au moins une séquence d'acide nucléique complexée ou conjuguée à au moins une molécule ou substance porteuse. La littérature procure un nombre important d'exemples de tels vecteurs viraux et non viraux. De tels vecteurs peuvent en outre et de préférence comprendre des éléments de ciblage pouvant permettre de diriger le transfert de séquences d'acide nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus particuliers, tels que les cellules cytotoxiques et les cellules présentatrices de l'antigène). Ils peuvent également permettre de diriger le transfert d'une substance active vers certains compartiments intracellulaires préférés, tels que le noyau ou les peroxysomes. Il peut en outre s'agir d'éléments facilitant la pénétration à l'intérieur de la cellule ou la lyse de compartiments intracellulaires. De tels éléments de ciblage sont largement décrits dans la littérature. Il peut par exemple s'agir de tout ou partie de peptides, d'oligonucléotides, d'antigènes, d'anticorps, de ligands spécifiques de récepteurs membranaires, de ligands susceptibles de réagir avec un anti-ligand, seuls ou en combinaison.According to one embodiment of the invention, the therapeutic gene consists of a nucleic acid sequence of naked DNA or RNA, that is to say free of any compound facilitating its introduction into cells (transfer of acid sequence nucleic). However, in order to encourage its introduction into the target cells and in order to obtain the genetically modified cells of the invention, the nucleic acid sequence may be in the form of a "vector", and more particularly in the form of a viral vector, such as by example an adenoviral, retroviral vector, a vector derived from a poxvirus, in particular derived from the vaccinia virus or the Modified Virus Ankara (MVA) or from a non-viral vector such as, for example, a vector consisting of at least one nucleic acid sequence complexed or conjugated to at least one molecule or carrier substance. The literature provides a large number of examples of such viral and non-viral vectors. Such vectors may further and preferably comprise targeting elements which can make it possible to direct the transfer of nucleic acid sequences to certain cell types or certain specific tissues, such as cytotoxic cells and cells presenting the antigen). They can also make it possible to direct the transfer of an active substance to certain preferred intracellular compartments, such as the nucleus or the peroxisomes. They may also be elements which facilitate penetration into the interior of the cell or the lysis of intracellular compartments. Such targeting elements are widely described in the literature. It may for example be all or part of peptides, oligonucleotides, antigens, antibodies, ligands specific for membrane receptors, ligands capable of reacting with an anti-ligand, alone or in combination.
La présente invention concerne un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques comprenant au moins un vecteur contenant un gène thérapeutique, capable d'être introduit dans une cellule cible in vivo et d'exprimer le gène d'intérêt thérapeutique in vivo. L'avantage de cette invention repose sur la possibilité de maintenir sur le long terme un niveau basai de molécules exprimées chez le patient traité. Des vecteurs ou acides nucléiques codant pour des gènes d'intérêt thérapeutique sont injectés. Ces vecteurs et acides nucléiques doivent être transportés jusqu'aux cellules cibles et transfecter ces cellules dans lesquelles ils doivent être exprimés in vivo.The present invention relates to a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions comprising at least one vector containing a therapeutic gene, capable of being introduced into a target cell in vivo and of expressing the gene of therapeutic interest in vivo. The advantage of this invention lies in the possibility of maintaining, over the long term, a basic level of molecules expressed in the treated patient. Vectors or nucleic acids encoding genes of therapeutic interest are injected. These vectors and nucleic acids must be transported to the target cells and transfect these cells in which they must be expressed in vivo.
L'invention concerne aussi l'expression in vivo de séquences nucléotidiques et/ou de vecteurs tels que décrits dans le paragraphe précédent, c'est-à-dire des séquences correspondant à des gènes d'intérêt thérapeutique codant notamment pour:The invention also relates to the in vivo expression of nucleotide sequences and / or of vectors as described in the preceding paragraph, that is to say sequences corresponding to genes of therapeutic interest coding in particular for:
- (i) soit au moins pour une protéine invention, ou ses fragments,- (i) either at least for an invention protein, or its fragments,
- (ii) soit au moins pour tout ou partie d'un anticorps polyclonal ou monoclonal capable de se fixer à au moins une protéine de l'invention. Il peut s'agir d'anticorps transmembranaire natif, ou de fragment ou dérivé d'un tel anticorps, pour autant que ledit anticorps, fragment ou dérivé d'anticorps soit exprimé à la surface de la cellule cible d'un mammifère génétiquement modifiée et en ce que ledit anticorps soit capable de se fixer à un polypeptide présent à la surface d'une cellule effectrice cytotoxique ou d'un lymphocyte T « helper » et impliqué dans le procédé d'activation d'une telle cellule. Il peut s'agir de fragments d'anticorps exprimés par des cellules capables de sécréter lesdits anticorps dans la circulation sanguine d'un mammifère porteur des cellules génétiquement modifiées par le gène codant pour l'anticorps, soit au moins pour une molécule inhibitrice d'au moins une protéine choisie parmi les protéines de l'invention, soit au moins pour un ligand ou toute partie du ligand capable de se fixer sur au moins une protéine de l'invention, et/ou d'inhiber sa fonction.- (ii) either at least for all or part of a polyclonal or monoclonal antibody capable of binding to at least one protein of the invention. It may be a native transmembrane antibody, or a fragment or derivative of such an antibody, provided that said antibody, fragment or derivative of antibody is expressed on the surface of the target cell of a genetically modified mammal and in that said antibody is capable of binding to a polypeptide present on the surface of a cytotoxic effector cell or of a “helper” T lymphocyte and involved in the process of activation of such a cell. They may be fragments of antibodies expressed by cells capable of secreting said antibodies into the bloodstream of a mammal carrying cells genetically modified by the gene coding for the antibody, or at least for a molecule inhibitor of at least one protein chosen from the proteins of the invention, either at least for a ligand or any part of the ligand capable of binding to at least one protein of the invention, and / or of inhibiting its function.
Selon un mode de réalisation particulier, on utilise la thérapie génique de manière à diriger la réponse immune contre au moins une protéine, en particulier HBsAgm, de l'invention, et/ou contre toute molécule inhibitrice de la fonction et/ou de l'expression et/ou du métabolisme d'au moins une protéine de l'invention, et/ou contre des ligands d'au moins une des protéines de l'invention, en particulier contre un ou des récepteur(s). Pour cela il est évident que les cellules à cibler pour la tansformation avec un vecteur sont des cellules appartenant au système immun, soit des cellules de type lymphocytes (CD4/CD8), soit des cellules présentatrices de l'antigène.According to a particular embodiment, gene therapy is used so as to direct the immune response against at least one protein, in particular HBsAgm, of the invention, and / or against any molecule inhibiting the function and / or the expression and / or metabolism of at least one protein of the invention, and / or against ligands of at least one of the proteins of the invention, in particular against one or more receptors. For this it is obvious that the cells to target for the transformation with a vector are cells belonging to the immune system, either cells of the lymphocyte type (CD4 / CD8), or cells presenting the antigen.
Selon un mode de réalisation particulier, on modifie génétiquement, notamment in vivo, les cellules présentatrices de l'antigène (CPAs). Les CPAs comme les macrophages, les cellules dendritiques, les microgliocytes, les astrocytes jouent un rôle dans l'initiation de la réponse immune. Elles sont les premiers composants cellulaires qui capturent l'antigène, l'apprête intracellulairement et expriment des molécules du CMHI et CMHII transmembranaires impliquées dans la présentation de l'immunogène aux cellules T CD4 + et CD8 + , elles produisent des protéines accessoires spécifiques qui participent à l'activation des cellules T (Debrick et al ;, 1 991 , J. Immunol 147 : 2846 ; Reis et al., 1 993, J Ep Med 1 78 : 509 ; Kovacsovics-bankowski et al., 1 993, PNAS 90 : 4942; Kovacsovics-bankowski et al., 1 995 Science 267 : 243 ; Svensson et al., 1 997, J Immunol 1 58 : 4229 ; Norbury et al ;, 1 997, Eur J Immunol 27 : 280). Pour une vaccination, il peut être avantageux de disposer d'un système de thérapie génique qui peut cibler le transfert de gène dans de telles cellules APCs, c'est à dire un gène qui code pour un polypeptide qui peut, après sa production intracellulaire et sa transformation, être présenté aux cellules CD8 + et/ou CD4 + par les molécules des complexes CMHI et CMHII respectivement à la surface de ces cellules.According to a particular embodiment, the cells presenting the antigen (CPAs) are genetically modified, in particular in vivo. CPAs such as macrophages, dendritic cells, microgliocytes, astrocytes play a role in the initiation of the immune response. They are the first cellular components which capture the antigen, prepare it intracellularly and express CMHI and CMHII molecules. transmembrane cells involved in the presentation of the immunogen to CD4 + and CD8 + T cells, they produce specific accessory proteins which participate in the activation of T cells (Debrick et al;, 1 991, J. Immunol 147: 2846; Reis et al., 1 993, J Ep Med 1 78: 509; Kovacsovics-bankowski et al., 1 993, PNAS 90: 4942; Kovacsovics-bankowski et al., 1 995 Science 267: 243; Svensson et al., 1 997, J Immunol 1 58: 4229; Norbury et al;, 1 997, Eur J Immunol 27: 280). For vaccination, it may be advantageous to have a gene therapy system which can target gene transfer in such APCs cells, ie a gene which codes for a polypeptide which can, after its intracellular production and its transformation, to be presented to CD8 + and / or CD4 + cells by the molecules of the CMHI and CMHII complexes respectively on the surface of these cells.
On choisit d'exprimer à la surface des cellules CPAs in vivo tout ou partie d'un anticorps et/ou d'un ligand comme par exemple un récepteur, capable de réagir avec une protéine de l'invention. De telles cellules vont alors spécifiquement phagocyter la protéine, la transformer de façon à ce que des fragments soient présentés à la surface des cellules présentatrices de l'antigène.We choose to express on the surface of CPAs cells in vivo all or part of an antibody and / or a ligand such as for example a receptor, capable of reacting with a protein of the invention. Such cells will then specifically phagocyte the protein, transforming it so that fragments are presented on the surface of the cells presenting the antigen.
La littérature propose un grand nombre d'exemples de gènes codant pour des anticorps capables de réagir avec des polypeptides ou récepteurs. Il est à la portée de l'homme de l'art d'obtenir les séquences d'acides nucléiques codant pour de tels anticorps. Citons par exemple les gènes codant pour les chaînes légère et lourde de l'anticorps YTH 1 2.5 (anti-CD3) (Routledge et al. 1991 , Eur J Immunol 21 : 271 7-2725), de l'anti-CD3 selon Arakawa et al ; 1 996, J. Biochem. 1 20 : 657-662. Les séquences d'acide nucléique de tels anticorps sont aisément identifiables à partir des bases de données communément utilisées par l'homme du métier. Il est également possible à partir d'hybridomes disponibles auprès de l'ATCC de cloner les séquences d'acides nucléiques codant pour les chaînes lourdes et/ou légères de ces différents anticorps par les méthodes d'amplification telles que la RT-PCR à l'aide d'oligonucléotides spécifiques ou les techniques mettant en œuvre des banques de cDNA (Maniatis et al ., 1 982, Molecular cloning. A laboratory manual CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Les séquences ainsi clonées sont alors disponibles pour leur clonage dans des vecteurs. Selon un cas préféré de l'invention, la séquence d'acide nucléique codant pour la chaîne lourde de l'anticorps est fusionnée par recombinaison homologue avec la séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide transmembranaire tel que la glycoprotéine rabique ou la gp1 60 (Polydefkis et al., 1 990J Exp Med 1 71 : 875-887). Ces techniques de biologie moléculaire ont été parfaitement bien décrites.The literature offers a large number of examples of genes coding for antibodies capable of reacting with polypeptides or receptors. It is within the ability of those skilled in the art to obtain the nucleic acid sequences encoding such antibodies. Let us quote for example the genes coding for the light and heavy chains of the antibody YTH 1 2.5 (anti-CD3) (Routledge et al. 1991, Eur J Immunol 21: 271 7-2725), of anti-CD3 according to Arakawa et al ; 1 996, J. Biochem. 1 20: 657-662. The nucleic acid sequences of such antibodies are easily identifiable from the databases commonly used by those skilled in the art. It is also possible from hybridomas available from the ATCC to clone the nucleic acid sequences coding for the heavy and / or light chains of these different antibodies by amplification methods such as RT-PCR at 1 using specific oligonucleotides or techniques using cDNA libraries (Maniatis et al., 1 982, Molecular cloning. A laboratory manual CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). The sequences thus cloned are then available for cloning into vectors. According to a preferred case of the invention, the nucleic acid sequence coding for the heavy chain of the antibody is fused by homologous recombination with the nucleic acid sequence coding for a transmembrane polypeptide such as the rabies glycoprotein or the gp1 60. (Polydefkis et al., 1 990J Exp Med 1 71: 875-887). These molecular biology techniques have been perfectly described.
On choisit d'exprimer à la surface des cellules CPA in vivo des fragments immunogènes correspondant à au moins une protéine de l'invention. Pour cela, on peut choisir de faire exprimer par le vecteur soit un polypeptide complet, soit des polypeptides sélectionnés pour réagir avec des ligands et/ou récepteurs spécifiques. Le peptide immunogène codé par l'acide nucléique ou le polynucléotide introduit dans la cellule du vertébré in vivo peut être produit et/ou sécrété, apprêté puis présenté à une cellule présentatrice de l'antigène (APC) dans le contexte des molécules du CMH. Les APCs ainsi transférées in vivo induisent une réponse immune dirigée contre T'immunogène exprimé in vivo. Les APCs possèdent différents mécanismes pour capturer les antigènes : (a) la capture des antigènes par des récepteurs membranaires comme les récepteurs aux immunoglobulines (Fc) ou pour le complément disponibles à la surface des granulocytes, des monocytes ou macrophages permettant une délivrance efficace de l'antigène dans les compartiments intracellulaires après phagocytose médiée par les récepteurs, (b) l'entrée dans les APC par pinocytose en phase fluide.We choose to express on the surface of the CPA cells in vivo immunogenic fragments corresponding to at least one protein of the invention. For this, it is possible to choose to cause the vector to express either a complete polypeptide, or polypeptides selected to react with specific ligands and / or receptors. The immunogenic peptide encoded by the nucleic acid or polynucleotide introduced into the vertebrate cell in vivo can be produced and / or secreted, primed and then presented to an antigen presenting cell (APC) in the context of MHC molecules. The APCs thus transferred in vivo induce an immune response directed against the immunogen expressed in vivo. APCs have different mechanisms for capturing antigens: (a) capture of antigens by membrane receptors such as immunoglobulin (Fc) receptors or for the complement available on the surface of granulocytes, monocytes or macrophages allowing efficient delivery of l antigen in intracellular compartments after receptor-mediated phagocytosis, (b) entry into APCs by pinocytosis in the fluid phase.
Selon un mode de réalisation particulier, on modifie génétiquement notamment in vivo, les cellules effectrices cytotoxiques u les lymphocytes T « helper » de façon à ce qu'elles expriment à leur surface un polypeptide ou un ou des ligand(s) dudit polypeptide, naturellement non exprimé(s) par ces cellules, et capables d'induire leur activation, par l'introduction dans ces cellules de séquences d'acide nucléique renfermant le gène codant pour le polypeptide.According to a particular embodiment, the cytotoxic effector cells u the “helper” T lymphocytes are modified genetically in vivo in particular so that they express on their surface a polypeptide or one or more ligand (s) of said polypeptide, naturally not expressed by these cells, and capable of inducing their activation, by the introduction into these cells of nucleic acid sequences containing the gene coding for the polypeptide.
Conformément à la présente invention, il est également possible de sélectionner une séquence d'acide nucléique contenant un gène d'intérêt thérapeutique codant pour tout ou partie d'un anticorps dirigé contre au moins une protéine de l'invention et susceptible d'être exprimé à la surface des cellules cibles du patient à traiter, ledit anticorps étant capable de se fixer à un polypeptide naturellement non exprimé par les cellules effectrices cytotoxiques ou lymphocytes T « helper ».In accordance with the present invention, it is also possible to select a nucleic acid sequence containing a gene of therapeutic interest coding for all or part of an antibody directed against at least one protein of the invention and capable of being expressed on the surface of the target cells of the patient to be treated, said antibody being capable of binding to a naturally occurring polypeptide not expressed by cytotoxic effector cells or "helper" T cells.
Par cellules effectrices cytotoxiques, on entend les macrophages, les astrocytes, les lymphocytes T cytotoxiques (TCLs) et les cellules tueuses (NKs) ainsi que leurs dérivés tels que par exemple les LAK (Versteeg 1 992 Immunology today 1 3 : 244-247 ;Brittende et al 1 996, Cancer 77 : 1 226-1 243). Par « lymphocytes T helper », on entend notamment les CD4 qui permettent, après activation, la sécrétion de facteurs d'activation des cellules effectrices de la réponse immune. Les polypeptides et notamment les récepteurs exprimés à la surface de ces cellules et qui sont impliqués dans l'activation de telles cellules consistent notamment en tout ou partie du complexe TCR ou le CD3, tout ou partie des complexes CD8, CD4, CD28, LFA-1 , 4-1 BB (Melero et al., 1 998, Eur J Immunol 28 : 1 1 1 6-1 1 21 ), CD47, CD2, CD1 , CD9, CD45, CD30, CD40, tout ou partie des récepteurs de cytokines (Finke étal., 1 998, Gène therapy 5 : 31 -39), telles que IL-7, IL-4, IL-2, IL-1 5 ou GM-CSF, tout ou partie du complexe récepteur des cellules NK tel que par exemple NKAR, Nkp46, .. ; (Kawano et al., 1 998 Immunology 95 :5690-5693 ; Pessino et al., 1 998 J Exp Med1 88 :953- 960), Nkp44, tout ou partie des récepteurs de macrophages tels que par exemple le récepteur Fc (Deo et al., 1 997, Immunology Today 1 8 : 1 27-1 35) . De nombreux outils ont été développés pour introduire différents gènes hétérologues et/ou vecteurs dans des cellules, en particulier des cellules de mammifères. Ces techniques peuvent être divisées en deux catégories : la première catégorie implique des technique physiques comme la micro-injection, l'électroporation ou le bombardement de particules. La seconde catégorie est basée sur l'utilisation de techniques en biologie moléculaire et cellulaire avec lesquelles le gène est transféré avec un vecteur biologique ou synthétique qui facilite l'introduction du matériel dans la cellule in vivo. Aujourd'hui, les vecteurs les plus efficaces sont les vecteurs viraux en particulier les adénoviraux et rétroviraux. Ces virus possèdent des propriétés naturelles pour traverser les membranes plasmiques, éviter la dégradation de leur matériel génétique et introduire leur génome dans le noyau de la cellule. Ces virus ont été largement étudiés et certains sont déjà utilisés expérimentalement dans des applications humaines en vaccination, en immunothérapie, ou pour compenser des déficiences génétiques. Cependant cette approche virale a des limitations notamment due à la capacité de clonage restreinte dans ces génomes viraux, le risque de disséminer les particules virales produites dans l'organisme et l'environnement, le risque de mutagénèse artéfactuelle par insertion dans la cellule hôte dans le cas des rétrovirus, et la possibilité d'induire une forte réponse immune inflammatoire in vivo pendant le traitement, ce qui limite le nombre d'injections possibles (Me Coy et al. 1 1 995, human Gène Therapy 6 : 1 553-1 560 ; Yang et al., 1 996 Immunity 1 : 433-422). D'autres systèmes alternatifs à ces vecteurs viraux existent. L'utilisation de méthodes non virales comme par exemple la co- précipitation avec le phosphate de calcium, l'utilisation de récepteurs qui miment les systèmes viraux (pour un résumé voir Cotten et Wagner 1 993, Current Opinion in Biotehcnology, 4 : 705-710), ou l'utilisation de polymères comme les polyamidoamines (Haensler et Szoka 1 993, Bioconjugate Chem 4 : 372-379). D'autres techniques non virales sont basées sur l'utilisation de liposomes dont l'efficacité pour l'introduction de macromolécules , biologiques comme l'ADN, l'ARN des protéines ou des substances pharmacteutiques actives a été largement décrite dans la littérature scientifique. Dans ce domaine des équipes ont proposé l'utilisation de lipides cationiques ayant une forte affinité pour les membranes cellulaires et/ou les acides nucléiques. En fait il a été montré qu'une molécule d'acide nucléique elle-même pouvait traverser la membrane plasmique de certaines cellules in vivo (WO 90/1 1 092), l'efficacité étant dépendante en particulier de la nature polyanionique de l'acide nucléique. Dès 1 989 (Felgner et al ;, Nature 337 : 387-388) les lipides cationiques ont été proposés pour faciliter l'introduction de larges molécules anioniques, ce qui neutralise les charges négatives de ces molécules et favorise leur introduction dans les cellules. Différentes équipes ont développés de tels lipides cationiques : le DOTMA (Felgner et al., 1 987, PNAS 84 : 7413-741 7), leDOGS ou Transfectam™ (Behr et al., 1 989, PNAS 86 : 6982-6986), le DMRIE et le DORIE (Felgner et al., 1 993 methods 5 : 67-75), le DC-CHOL (Gao et Huang 1 991 , BBRC 1 79 : 280-285), le DOTAP™ (McLachlan et al., 1995, Gène therapy 2 : 674-622) ou la Lipofectamine™, et les autres molécules décrites, dans les brevets W091 1 6024, W09514651 , W09405624. D'autre groupes ont développés des polymères cationiques qui facilitent le transfert de macromolécules en particulier des macromolécules anioniques dans les cellules. Le brevet W095/24221 décrit l'utilisation de polymères dendritiques, le document WO96/02655 décrit l'utilisation du polyéthylèneimine ou polypropylèneimine et les document US-A- 5595897 et FR 271931 6, l'utilisation des conjugués polylysine.By cytotoxic effector cells is meant macrophages, astrocytes, cytotoxic T lymphocytes (TCLs) and killer cells (NKs) as well as their derivatives such as for example LAK (Versteeg 1 992 Immunology today 1 3: 244-247; Brittende et al 1 996, Cancer 77: 1 226-1 243). The term “helper T lymphocytes” is understood to mean in particular the CD4 cells which allow, after activation, the secretion of activating factors of the effector cells of the immune response. The polypeptides and in particular the receptors expressed on the surface of these cells and which are involved in the activation of such cells consist in particular of all or part of the TCR complex or CD3, all or part of the complexes CD8, CD4, CD28, LFA- 1, 4-1 BB (Melero et al., 1 998, Eur J Immunol 28: 1 1 1 6-1 1 21), CD47, CD2, CD1, CD9, CD45, CD30, CD40, all or part of the receptors for cytokines (Finke et al., 1 998, Gene therapy 5: 31-39), such as IL-7, IL-4, IL-2, IL-1 5 or GM-CSF, all or part of the receptor complex of NK cells such as for example NKAR, Nkp46, ..; (Kawano et al., 1 998 Immunology 95: 5690-5693; Pessino et al., 1 998 J Exp Med1 88: 953-960), Nkp44, all or part of the macrophage receptors such as for example the Fc receptor (Deo et al., 1 997, Immunology Today 1 8: 1 27-1 35). Many tools have been developed to introduce different heterologous genes and / or vectors into cells, in particular mammalian cells. These techniques can be divided into two categories: the first category involves physical techniques such as micro-injection, electroporation or bombardment of particles. The second category is based on the use of techniques in molecular and cellular biology with which the gene is transferred with a biological or synthetic vector which facilitates the introduction of the material into the cell in vivo. Today, the most effective vectors are the viral vectors, in particular the adenovirals and retrovirals. These viruses have natural properties for crossing plasma membranes, preventing the degradation of their genetic material and introducing their genome into the nucleus of the cell. These viruses have been widely studied and some are already used experimentally in applications human vaccination, immunotherapy, or to compensate for genetic deficiencies. However, this viral approach has limitations notably due to the limited cloning capacity in these viral genomes, the risk of disseminating the viral particles produced in the organism and the environment, the risk of artefactual mutagenesis by insertion into the host cell in the retroviruses, and the possibility of inducing a strong inflammatory immune response in vivo during treatment, which limits the number of possible injections (Me Coy et al. 1 1 995, human Gene Therapy 6: 1 553-1 560 ; Yang et al., 1 996 Immunity 1: 433-422). Other alternative systems to these viral vectors exist. The use of non-viral methods such as co-precipitation with calcium phosphate, the use of receptors which mimic the viral systems (for a summary see Cotten and Wagner 1 993, Current Opinion in Biotehcnology, 4: 705- 710), or the use of polymers such as polyamidoamines (Haensler and Szoka 1 993, Bioconjugate Chem 4: 372-379). Other non-viral techniques are based on the use of liposomes, the efficacy of which for the introduction of biological macromolecules such as DNA, RNA of proteins or of active pharmaceutical ingredients has been widely described in the scientific literature. In this area, teams have proposed the use of cationic lipids with a strong affinity for cell membranes and / or nucleic acids. In fact it has been shown that a nucleic acid molecule itself can cross the plasma membrane of certain cells in vivo (WO 90/1 1 092), the efficiency being dependent in particular on the polyanionic nature of the nucleic acid. As early as 1,989 (Felgner et al .; Nature 337: 387-388) cationic lipids have been proposed to facilitate the introduction of large anionic molecules, which neutralizes the negative charges of these molecules and promotes their introduction into cells. Different teams have developed such cationic lipids: DOTMA (Felgner et al., 1 987, PNAS 84: 7413-741 7), DOGS or Transfectam ™ (Behr et al., 1 989, PNAS 86: 6982-6986), DMRIE and DORIE (Felgner et al., 1 993 methods 5: 67-75), DC-CHOL (Gao and Huang 1 991, BBRC 1 79: 280-285), DOTAP ™ (McLachlan et al., 1995, Gene therapy 2: 674-622) or Lipofectamine ™, and the other molecules described, in patents WO91,6024, W09514651, W09405624. Other groups have developed cationic polymers which facilitate the transfer of macromolecules in particular anionic macromolecules in cells. The patent WO95 / 24221 describes the use of dendritic polymers, the document WO96 / 02655 describes the use of polyethyleneimine or polypropyleneimine and the documents US-A-5595897 and FR 271931 6, the use of polylysine conjugates.
Etant donné que l'on souhaite obtenir in vivo une transformation ciblée vers un type cellulaire donné, il est évident que le vecteur utilisé doit pouvoir être lui-même « ciblé ». La présente invention concerne aussi un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques, la composition comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des anticorps, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène thérapeutique codant in vivo pour au moins une protéine ou un fragment d'une protéine de l'invention ou pour au moins une molécule inhibitrice de la fonction et/ou de la fixation et/ou de l'expression d'au moins une protéine ou d'un fragment de protéine de l'invention ou pour au moins un anticorps ou une partie d'anticorps capable de se lier à au moins une protéine de l'invention.Since it is desired to obtain a targeted transformation in vivo towards a given cell type, it is obvious that the vector used must be able to be itself "targeted". The present invention also relates to a biological material for the preparation of pharmaceutical compositions, the composition comprising at least one cell, in particular a cell which does not naturally produce antibodies, in a form allowing its administration in a mammalian, human or animal organism, as well as 'optionally its prior culture, said cell being genetically modified in vitro by at least one nucleic acid sequence containing at least one therapeutic gene coding in vivo for at least one protein or a fragment of a protein of the invention or for at least one molecule that inhibits the function and / or the binding and / or the expression of at least one protein or of a protein fragment of the invention or for at least one antibody or part of an antibody capable to bind to at least one protein of the invention.
Plus particulièrement, ladite cellule cible provient soit de l'individu à traiter, soit d'un autre mammifère. Dans ce dernier cas, il convient de noter que ladite cellule cible aura subi un traitement la rendant compatible avec l'homme. Ces cellules sont établies en lignées cellulaires et sont préférentiellement CMHII + ou CMHII + inductibles comme les lymphocytes, les monocytes, les astrocytes, les oligodendrocytes.More particularly, said target cell comes either from the individual to be treated, or from another mammal. In the latter case, it should be noted that said target cell will have undergone a treatment making it compatible with humans. These cells are established in cell lines and are preferably CMHII + or CMHII + inducible such as lymphocytes, monocytes, astrocytes, oligodendrocytes.
L'invention concerne également les cellules modifiées et un procédé de préparation d'une cellule telle que décrite ci dessus caractérisé en ce que l'on introduit dans une cellule de mammifère ne produisant pas naturellement d'anticorps, par tout ou moyen approprié, au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique et des éléments assurant l'expression dudit gène dans ladite cellule, ledit gène d'intérêt thérapeutique contenant une séquence d'acide nucléique codant pour une molécule ou un fragment de molécule in vivo, comme décrit ci-dessus. Plus particulièrement, elle concerne des cellules eucaryotes , en particulier les cellules COS et CHO et des cellules issues d'organismes eucaryotes inférieurs, telles que des cellules de levure, en particulier les cellules isuues de Saccharomyces cerevisiae et de Pichia pastoris , en particulier des cellules transformées par au moins une séquence nucléotidique et/ou un vecteur tel que décrit précédemment. Selon un mode de réalisation particulier, les cellules (cellules dendritiques, macrophages, astrocytes, lymphocytes T CD4 + , lymphocytes T CD8 + ou autres) du patient ou cellules allogéniques sont placées en contact d'une préparation purifiée d'au moins une protéine ou d'un fragment de protéine de l'invention. La protéine ou son fragment est internalisé, apprêté et présenté à la surface de la cellule et associé aux molécules du CMHI et/ou CMHII pour induire une réponse immune spécifique contre la protéine ou son fragment. Les cellules ainsi « activées » sont ensuite administrées au patient chez lequel elles vont induire une réponse immune spécifique des antigènes.The invention also relates to the modified cells and a method for preparing a cell as described above, characterized in that one introduces into a mammalian cell which does not naturally produce antibodies, by any appropriate means, at least one nucleic acid sequence containing at least one gene of therapeutic interest and elements ensuring the expression of said gene in said cell, said gene of therapeutic interest containing a nucleic acid sequence coding for a molecule or a fragment of a molecule in vivo, as described above. More particularly, it relates to eukaryotic cells, in particular COS and CHO cells and cells derived from lower eukaryotic organisms, such as yeast cells, in particular cells derived from Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris, in particular cells transformed by at least one nucleotide sequence and / or a vector as described above. According to a particular embodiment, the cells (dendritic cells, macrophages, astrocytes, CD4 + T lymphocytes, CD8 + T lymphocytes or others) of the patient or allogenic cells are placed in contact with a preparation purified of at least one protein or of a protein fragment of the invention. The protein or its fragment is internalized, prepared and presented on the surface of the cell and associated with the CMHI and / or CMHII molecules to induce a specific immune response against the protein or its fragment. The cells thus “activated” are then administered to the patient in whom they will induce an immune response specific for the antigens.
Dans un cas particulier, les cellules présentatrices d'antigène sont modifiées in vitro pour exprimer les antigènes dans la cellule transformée qui vont s'associer aux molécules du CMHI et/ou CMHII et être présentées à la surface des cellules pour induire chez le patient, chez lequel on administre la cellule modifiée, une réaction immune parfaitement ciblée.In a particular case, the antigen presenting cells are modified in vitro to express the antigens in the transformed cell which will associate with the CMHI and / or CMHII molecules and be presented on the surface of the cells to induce in the patient, in which the modified cell is administered, a perfectly targeted immune reaction.
Les approches vaccinales ne sont pas toujours entièrement satisfaisantes et peuvent conduire à des réactions immunes limitées dirigées uniquement à encontre d'épitopes immunodominants. De même une présentation incorrecte des antigènes par les glycoprotéines du système CMH à la surface des cellules, ne permet pas de développer chez le patient traité une immunité anti-protéique convenable. Afin de pallier ces problèmes, des auteurs ont proposé dans le cadre de procédés vaccinaux, de sélectionner les fragments minimaux antigéniques correspondant aux portions de peptide susceptibles d'être reconnus spécifiquement par les lymphocytes T cytotoxiques, de les exprimer dans les cellules afin qu'ils s'associent aux molécules du CMHI et soient présentés à la surface des cellules pour induire chez le patient traité une réaction immunitaire parfaitement ciblée (Toes et al. 1 997, PNAS 94 : 14660-14665) . Plus particulièrement, il a été montré que des épitopes de très petites tailles (variant de 7 à environ 1 3 acides aminés) qui sont exprimés à partir de minigènes introduits dans un virus de la vaccine, pouvaient induire une immunisation de type cellulaire. Il a par ailleurs été montré que plusieurs minigènes pouvaient être exprimés conjointement à partir d'un même vecteur (cette construction particulière est appelée « string of beads »). Une telle construction présente l'avantage d'induire une réaction immune de type CTL synergique (Whitton et al ;, 1 993 J. of Virology 67 : 348-352).Vaccine approaches are not always entirely satisfactory and can lead to limited immune reactions directed only against immunodominant epitopes. Similarly, an incorrect presentation of antigens by the glycoproteins of the MHC system on the surface of the cells does not make it possible to develop in the treated patient an adequate anti-protein immunity. In order to overcome these problems, some authors have proposed, within the framework of vaccine methods, to select the minimum antigenic fragments corresponding to the portions of peptide capable of being recognized specifically by cytotoxic T lymphocytes, to express them in the cells so that they associate with CMHI molecules and be presented on the surface of the cells to induce in the patient treated a perfectly targeted immune reaction (Toes et al. 1 997, PNAS 94: 14660-14665). More particularly, it has been shown that very small epitopes (varying from 7 to approximately 13 amino acids) which are expressed from minigens introduced into a vaccinia virus, can induce cell-type immunization. It has also been shown that several minigens could be expressed jointly from the same vector (this particular construction is called "string of beads"). Such a construction has the advantage of inducing a synergistic CTL type immune reaction (Whitton et al;, 1 993 J. of Virology 67: 348-352).
La présentation des fragments antigéniques par les molécules CMHI repose sur un procédé intracellulaire identifié (voir Groettrup et al., 1 996 Immunology Today 1 7 : 429-435 pour une revue) au cours duquel des peptides antigéniques de très courtes tailles (environ 7 à 1 3 ou 8 à 1 2 acides aminés) sont produits par dégradation d'un polypeptide plus complexe contre lequel la réaction immune finale sera dirigée. Ces peptides courts sont ensuite associés aux molécules du CMHI ou du CMHII pour former un complexe protéique qui est transporté à la surface cellulaire afin de présenter lesdits peptides aux lymphocytes T cytotoxiques circulants ou aux lymphocytes T helper circulants, respectivement.The presentation of the antigenic fragments by the CMHI molecules is based on an identified intracellular process (see Groettrup et al., 1 996 Immunology Today 1 7: 429-435 for a review) during which very short antigenic peptides (about 7 to 1 3 or 8 to 1 2 amino acids) are produced by degradation of a more complex polypeptide against which the final immune reaction will be directed. These short peptides are then associated with the CMHI or CMHII molecules to form a protein complex which is transported to the cell surface in order to present said peptides to the circulating cytotoxic T lymphocytes or to the circulating helper T lymphocytes, respectively.
Selon un mode de réalisation particulier, les cellules, telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les astrocytes, les lymphocytes T CD4 + , les lymphocytes T CD8 + , sont modifiées de manière à exprimer à leur surface des anticorps spécifiques du peptide ciblé. Le peptide est neutralisé par les anticorps exprimés à la surface des cellules. Ces cellules qui de préférence ont été prélevées chez le patient sont des cellules du système immunitaire, de préférence cytotoxiques, modifiées pour exprimer tout ou partie d'un anticorps spécifique du polypeptide cible.According to a particular embodiment, the cells, such as dendritic cells, macrophages, astrocytes, CD4 + T lymphocytes, CD8 + T lymphocytes, are modified so as to express on their surface antibodies specific for the targeted peptide. The peptide is neutralized by the antibodies expressed on the surface of the cells. These cells which preferably have been removed from the patient are cells of the immune system, preferably cytotoxic, modified to express all or part of an antibody specific for the target polypeptide.
En 1 968, Boyum décrivit une technique rapide qui permet par centrifugation du sang sur gradient de densité, de séparer les cellules mononuclées (lymphocytes et monocytes) avec un bon rendement (rendement théorique 50%, c'est-à-dire 1 06 cellules/ml de sang). Selon ce protocole, 50 ml de sang périphérique prélevés stérilement sont centrifugés 20 minutes à 1 50g à 20°C. Les cellules récupérées sont diluées dans deux volumes de sang périphérique initial de PBS stérile. 1 0 ml de cette suspension sont déposés sur 3ml d'une solution de Ficoll-Hypaque (milieu de séparation des lymphocytes, Flow) . Après centrifugation pendant 20 minutes à 400g et 20 °C sans freinage de décélération , les cellules mononuclées sédimentent à l'interface PBS-Ficoll, en une couche dense, opalescente, alors que la quasi-totalité des globules rouges et des polynucléaires sédimentent au fond du tube. Les cellules mononuclées sont récupérées et lavées en PBS stérile. Les cellules présentatrices de l'antigène sont préalablement lavées avec un tampon PBS-BSA à 0.5 % (poids/volume) puis comptées. Elles sont ensuite préincubées en présence de différents inhibiteurs de réduction, trois fois dans du PBS-BSA 0.5% contenant de 10 / M à 1 0 mM final de DTNB (acide 5,5'- dithio-bis-2-nitrobenzoïque) ou de NEM (N-éthylmaléimide) . Les étapes ultérieures de fixation d'antigènes à la surface cellulaire ou d'internalisation d'antigènes se réalisent aussi en présence des différentes concentrations d'inhibiteurs.In 1 968, Boyum described a rapid technique which makes it possible, by centrifugation of the blood on a density gradient, to separate the mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) with good yield (theoretical yield 50%, that is to say 1 0 6 cells / ml of blood). According to this protocol, 50 ml peripheral blood collected sterile are centrifuged for 20 minutes at 150g at 20 ° C. The recovered cells are diluted in two volumes of initial peripheral blood of sterile PBS. 10 ml of this suspension are deposited on 3 ml of a Ficoll-Hypaque solution (lymphocyte separation medium, Flow). After centrifugation for 20 minutes at 400g and 20 ° C without deceleration braking, the mononuclear cells sediment at the PBS-Ficoll interface, in a dense, opalescent layer, while almost all of the red blood cells and polymorphonuclear cells sediment at the bottom of the tube. The mononuclear cells are recovered and washed in sterile PBS. The antigen presenting cells are washed beforehand with a PBS-BSA buffer at 0.5% (weight / volume) and then counted. They are then preincubated in the presence of different reduction inhibitors, three times in PBS-BSA 0.5% containing from 10 / M to 10 mM final DTNB (5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid) or NEM (N-ethylmaleimide). The subsequent steps of fixing antigens to the cell surface or internalizing antigens are also carried out in the presence of different concentrations of inhibitors.
8.1 06 cellules sont internalisées en présence de quantité saturante de protéines radiomarquées à l'iode 1 25 (1 //g) dans des micropuits. Après une heure d'incubation à 4°C sous agitation, les antigènes sont fixés à la surface des cellules. La suspension cellulaire est lavée deux fois en PBS-BSA et les culots cellulaires sont repris dans 70 μ\ de tampon et incubées à 37 °C pendant différentes périodes allant jusqu'à 2 heures. Cellules et surnageants sont séparés par centrifugation à 800g pendant 5 minutes 4°C. Pour des plus longues périodes d'incubation, l'étape préliminaire de pré-fixation des antigènes à la surface des cellules est supprimée. Les cellules sont diluées dans un milieu RPMI- 10% SVF en présence de 20 mM Hépès, à 1 06cellules /ml. Les cellules sont incubées en présence d'un excès d'antigène pendant différentes périodes à 37 °C (1 μg de molécules / 5.107 cellules monocytes/macrophages ou /1 08 cellules B- EBV) . Tous les agents thérapeutiques définis dans le cadre de la présente invention sont utilisés pour prévenir et/ou traiter une infection par au moins le virus HBVm. Ils peuvent être utilisés également pour évaluer leur efficacité in vitro ou in vivo.8.1 0 6 cells are internalized in the presence of a saturated amount of proteins radiolabelled with iodine 1 25 (1 μg) in microwells. After one hour of incubation at 4 ° C with shaking, the antigens are fixed to the cell surface. The cell suspension is washed twice in PBS-BSA and the cell pellets are taken up in 70 μl of buffer and incubated at 37 ° C. for different periods of up to 2 hours. Cells and supernatants are separated by centrifugation at 800g for 5 minutes at 4 ° C. For longer incubation periods, the preliminary step of pre-fixing antigens to the cell surface is omitted. The cells are diluted in RPMI-10% FCS medium in the presence of 20 mM Hepes, to 10 6 cells / ml. The cells are incubated in the presence of an excess of antigen for different periods at 37 ° C. (1 μg of molecules / 5.10 7 monocyte / macrophage cells or / 1 0 8 B-EBV cells). All the therapeutic agents defined within the framework of the present invention are used to prevent and / or treat an infection by at least the HBVm virus. They can also be used to assess their effectiveness in vitro or in vivo.
Le matériel biologique est administré in vivo notamment sous forme injectable par voie intramusculaire ou sous cutanée ou tout autre moyen équivalent. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée, une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage les mieux appropriés varient en fonction de différents paramètres tels que par exemple l'individu, le stade et/ou l'évolution de la maladie, ou encore de l'acide nucléique et/ou de la protéine et/ou peptide et/ou molécule et/ou cellule à transférer ou de l'organe/tissus cible.The biological material is administered in vivo, in particular in injectable form by intramuscular or subcutaneous route or any other equivalent means. The administration can take place in single or repeated dose, one or more times after a certain interval of interval. The most suitable route and dosage vary according to different parameters such as, for example, the individual, the stage and / or the course of the disease, or the nucleic acid and / or the protein. and / or peptide and / or molecule and / or cell to be transferred or from the target organ / tissue.
Pour la mise en œuvre du traitement, il est possible de disposer de compositions pharmaceutiques comprenant un matériel biologique tel que précédemment décrit, avantageusement associé avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour l'administration à l'homme ou à l'animal. L'utilisation de tels supports est décrite dans la littérature (voir par exemple Remington's Pharmaceutical Sciences 16th éd. 1980, Mack Publishing- Co). Ce véhicule pharmaceutiquement acceptable est préférentiellement isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse, tel que par exemple une solution de sucrose. Par ailleurs, ladite composition peut contenir des solvants, des véhicules aqueux ou partiellement aqueux tels que de l'eau stérile, libre d'agents pyrogène et des milieux de dispersion par exemple. Le pH de ces compositions pharmaceutiques est convenablement ajusté et tamponné selon les techniques conventionnelles.For the implementation of the treatment, it is possible to have available pharmaceutical compositions comprising a biological material as previously described, advantageously combined with a pharmaceutically acceptable vehicle for administration to humans or animals. The use of such supports is described in the literature (see for example Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th ed. 1980, Mack Publishing-Co). This pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic, hypotonic or has low hypertonicity and has a relatively low ionic strength, such as for example a sucrose solution. Furthermore, said composition may contain solvents, aqueous or partially aqueous vehicles such as sterile water, free of pyrogenic agents and dispersion media for example. The pH of these pharmaceutical compositions is suitably adjusted and buffered according to conventional techniques.
L'invention concerne donc également (i) un procédé pour le traitement d'un patient infecté par le virus HBVm de l'invention selon lequel on administre audit patient un matériel biologique tel que défini précédemment, éventuellement associé à un adjuvant et/ou un diluant et/ou un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable et (ii) un procédé pour prévenir une infection par au moins le virus HBVm de l'invention selon lequel on administre à un individu un matériel biologique tel que défini ci-dessus éventuellement associé à un adjuvant et/ou diluant et/ou véhicule pharmaceutiquement acceptable, en particulier une composition vaccinale. Enfin, l'invention a pour objet une composition comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine de surface mutée du virus HBVm (HBsAgm) ou ses fragments, ladite protéine HBsAgm comprenant un déterminant a modifié d'une protéine HBs représenté en SEQ ID NO 2, ledit ADN étant mélangé avec un véhicule et/ou un adjuvant et/ou un excipient et/ou un diluant approprié et pouvant comprendre également une séquence codante Pré-S mutée qui code pour une protéine de surface mutée, référencée en SEQ ID NO 4 et/ou une séquence d'ADN codant pour une protéine de surface mutée référencée en SEQ ID NO 5 ou ses fragments et/ou une séquence d'ADN codant pour une région Pré-S mutée référencée en SEQ ID NO 6 ou ses fragments.The invention therefore therefore also relates to (i) a method for the treatment of a patient infected with the HBVm virus of the invention according to which a biological material as defined above is administered to said patient, optionally combined with an adjuvant and / or a diluent and / or a pharmaceutically acceptable excipient and / or a vehicle and (ii) a method for preventing infection with at least the HBVm virus of the invention according to which an individual is administered a biological material as defined above optionally associated with a pharmaceutically acceptable adjuvant and / or diluent and / or vehicle, in particular a vaccine composition. Finally, the subject of the invention is a composition comprising a DNA sequence coding for a mutated surface protein of the HBVm virus (HBsAgm) or its fragments, said HBsAgm protein comprising a modified determinant of an HBs protein represented in SEQ ID NO 2, said DNA being mixed with a vehicle and / or an adjuvant and / or an excipient and / or a suitable diluent and may also comprise a mutated Pre-S coding sequence which codes for a mutated surface protein, referenced in SEQ ID NO 4 and / or a DNA sequence coding for a mutated surface protein referenced in SEQ ID NO 5 or its fragments and / or a DNA sequence coding for a mutated Pre-S region referenced in SEQ ID NO 6 or its fragments.
La figure 1 représente la séquence complète du clone x27_1 6 de génotype A de l'invention. Les séquences soulignées correspondent aux codons d'initiation et de terminaison pour les différents gènes. La figure 2 représente la séquence complète du clone x27_9 de génotype D de l'invention. Les séquences soulignées correspondent aux codons d'initiation et de terminaison pour les différents gènes.FIG. 1 represents the complete sequence of the clone x27_1 6 of genotype A of the invention. The underlined sequences correspond to the initiation and termination codons for the various genes. FIG. 2 represents the complete sequence of the clone x27_9 of genotype D of the invention. The underlined sequences correspond to the initiation and termination codons for the various genes.
Les figures 3 et 4 représentent respectivement les séquences en acides aminés du gène HBs et de la totalité de la région Pré-S des clones x27_1 6 et x27_9, alignées avec 1 02 séquences HBs ou Pré-S trouvées dans la banqueFIGS. 3 and 4 respectively represent the amino acid sequences of the HBs gene and of the entire Pre-S region of the clones x27_1 6 and x27_9, aligned with 1 02 HBs or Pre-S sequences found in the library.
NBRF/PIR.NBRF / PIR.
Exemple 1 : Identification du variant ou mutant HBVm.Example 1: Identification of the HBVm variant or mutant.
Le patient est un homme de 86 ans avec un historique d'hépatite non A, non B chronique, dont la pathologie a évoluée jusqu'au stade de cirrhose. Il ne présentait aucun facteur de risque identifié. Son taux de transaminases dans le sang était sensiblement plus élevé que la normale (1 à 2 fois par rapport à la normale). Il n'était ni HCV, ni HGV, ni HDV positif par les tests de détection d'ARN par PCR. Une détection potentielle du virus TTV a également été effectuée par PCR qui est s'est révélée négative.The patient is an 86-year-old man with a history of non-A, non-B chronic hepatitis, whose pathology has progressed to the cirrhosis stage. He had no identified risk factors. His level of transaminases in the blood was significantly higher than normal (1 to 2 times compared to normal). He was neither HCV, HGV, nor HDV positive by PCR RNA detection tests. Potential detection of the TTV virus was also carried out by PCR which turned out to be negative.
1 . Tests sérologiques : la détection de l'antigène HBsAg a été réalisée dans le sérum du patient premièrement avec le test MonoLisa (nom commercial) de seconde génération commercialisé par Sanofi Diagnostics Pasteur et deuxièmement avec le kit de détection VIDAS® HBsAg commercialisé par la société bioMérieux. Les résultats étaient négatifs avec chacun des test de détection utilisé. La détection d'anticorps anti-HBs a été effectuée à l'aide du test ELISA DiaSorin (nom commercial) commercialisé par la société Sorin dans le sérum du patient. Les résultats du test de détection d'anticorps anti-HBs s'est révélé également négatif. La détection d'anticorps anti-HBc totaux a été réalisée par un test de compétition CORAB rDNA (nom commercial) de la société Abbott Diagnostics et à l'aide du test ELISA Ortho HBc Elisa commercialisé par Ortho Diagnostic System. Les résultats montrent la présence de 104 molécules d'ADN par ml de sérum chez le patient contre les 108 molécules d'ADN/ml habituellement trouvées chez les patients HBV positifs à un stade chronique de la maladie.1. Serological tests: the HBsAg antigen was detected in the patient's serum first with the MonoLisa test (trade name) second generation marketed by Sanofi Diagnostics Pasteur and secondly with the VIDAS ® HBsAg detection kit marketed by bioMérieux. The results were negative with each of the detection tests used. The detection of anti-HBs antibodies was carried out using the ELISA test DiaSorin (trade name) marketed by the company Sorin in the patient's serum. The results of the anti-HBs antibody test were also negative. The detection of total anti-HBc antibodies was carried out by a CORAB rDNA (trade name) competition test from the company Abbott Diagnostics and using the ELISA Ortho HBc Elisa test marketed by Ortho Diagnostic System. The results show the presence of 10 4 DNA molecules per ml of serum in the patient against the 10 8 DNA molecules / ml usually found in HBV positive patients at a chronic stage of the disease.
2. Immunomarquage dans le foie : l'immunomarquage a été réalisé sur des prélèvements de foie par immunofluorescence pour l'antigène HBsAg en utilisant des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre HBsAg (commercialisés par la société Janssen) et des anticorps anti-lapin fluorescents (commercialisés par la société DAKO). Le marquage par la peroxydase a été réalisé en utilisant un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre l'antigène HBc et des anticorps anti- lapin (commercialisés par DAKO) comme décrit par Vitvitski-Trepo et al., Hepatology, 6 : 1 278-1283 (1990). Ces tests se sont révélés être négatifs pour la présence des antigènes HBsAg et HBcAg dans le foie du patient.2. Immunostaining in the liver: the immunostaining was carried out on liver samples by immunofluorescence for the HBsAg antigen using polyclonal rabbit antibodies directed against HBsAg (marketed by the company Janssen) and fluorescent anti-rabbit antibodies ( marketed by the company DAKO). Labeling with peroxidase was carried out using a polyclonal rabbit antibody directed against the HBc antigen and anti-rabbit antibodies (marketed by DAKO) as described by Vitvitski-Trepo et al., Hepatology, 6: 1 278-1283 (1990). These tests were found to be negative for the presence of the HBsAg and HBcAg antigens in the patient's liver.
3. Test de détection du génome viral par PCR : une détection par PCR du génome viral dans le sérum a été réalisée à l'aide du test Expand High Fidelity PCR System, commercialisé par la société Roche pour HBV et à l'aide du test AMPLICOR (nom commercial) de la société Abbott pour HCV. 140 μ\ de sérum ont été utilisés pour l'extraction des acides nucléiques. L'acide nucléique a été extrait en utilisant un kit d'extraction des acides nucléiques commercialisé par la société Qiagen, qui permet de purifier à la fois l'ADN et l'ARN. Le sérum a été soumis à une incubation en présence d'un tampon de lyse pendant 1 0 min. A température ambiante, puis passé sur colonnes de silice. L'ADN a été elué de la colonne avec 50 μ\ d'eau stérile. Le contenu en acides nucléiques total provenant de sang total ou de biopsies du foie a été extrait en utilisant les kits commercialisés par la société Quiagen, respectivement pour le sang et pour les tissus.3. PCR viral genome detection test: PCR detection of the viral genome in serum was carried out using the Expand High Fidelity PCR System test, marketed by Roche for HBV and using the test AMPLICOR (trade name) of Abbott for HCV. 140 μ \ of serum was used for the extraction of nucleic acids. The nucleic acid was extracted using a nucleic acid extraction kit sold by the company Qiagen, which makes it possible to purify both the DNA and the RNA. The serum was incubated in the presence of lysis buffer for 10 min. At room temperature, then passed over columns of silica. DNA was eluted from the column with 50 μl of sterile water. Total nucleic acid content from whole blood or liver biopsies was extracted using the kits sold by the company Quiagen, respectively for blood and for tissues.
La détection de l'ADN de HBv a été réalisée par une amplification nichée en deux étapes, au moyen d'amorces sélectionnées dans une région connue pour être bien conservée dans le gène S de HBV.Detection of HBv DNA was accomplished by nested two-step amplification using primers selected from a region known to be well conserved in the HBV S gene.
Première étape d'amplification : les premiers 35 cycles d'amplification sont précédés par un pré-chauffage à 95°C pendant 5 min., 95°C pendant 45 secondes, 48°C pendant 45 secondes et 72°C pendant 1 min. Une étape d'élongation pendant 10 min. a ensuite été réalisée.First amplification step: the first 35 amplification cycles are preceded by preheating at 95 ° C for 5 min., 95 ° C for 45 seconds, 48 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 1 min. An elongation step for 10 min. was then carried out.
Amorce 1 (Pol 1 ) : 5' CCT GCT GGT GGC TCC AGT TC 3' (Pichoud ét al., Hepatology, 1999, 1 :230-237)Primer 1 (Pol 1): 5 'CCT GCT GGT GGC TCC AGT TC 3' (Pichoud et al., Hepatology, 1999, 1: 230-237)
Amorce 2 (P0R4) : 5' TAC CCA AAG ACA AAA GAA AAT TGG 3'Primer 2 (P0R4): 5 'TAC CCA AAG ACA AAA GAA AAT TGG 3'
La seconde étape d'amplification est de 40 cycles avec un pré- chauffage à 95 °C pendant 5 min., 5 cycles d'amplification à 95°C pendant 25 secondes, 37°C pendant 45 secondes, 72°C pendant 1 min. et les 35 autres cycles à 95 °C pendant 45 secondes, 48 °C pendant 45 secondes et 72 °C pendant 1 min. A la fin une étape d'élongation est réalisée.The second amplification step is 40 cycles with preheating at 95 ° C for 5 min., 5 amplification cycles at 95 ° C for 25 seconds, 37 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 1 min . and the other 35 cycles at 95 ° C for 45 seconds, 48 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 1 min. At the end, an elongation step is carried out.
Amorce 3 : 5' TAG TAA ACT GAG CCA RGA GAA AC 3' Amorce 4 : 5' GTT GAC AAR AAT CCT CAC AAT AC 3'Primer 3: 5 'TAG TAA ACT GAG CCA RGA GAA AC 3' Primer 4: 5 'GTT GAC AAR AAT CCT CAC AAT AC 3'
R représente A ou G.R represents A or G.
La PCR est réalisée à partir de 1 0 μ\ d'acides nucléiques totaux qui ont été extraits de 140 μ\ de sérum, 200 /I de sang total, 25 mg d'une biopsie du foie congelée ou fixée à la formaline dans de la paraffine. Une amplification par PCR du gène X a également été réalisée en suivant la technique décrite par Uchida et al., Microbiol, Immunol, 1 994, 38, 281 -285. L'amplification du gène X est intéressante parce que le produit du gène X transactive les promoteurs HBV et parce que le promoteur du core de HBV chevauche le gène X. En conséquence, des mutations affectant soit le produit du gène X ou le promoteur du core ou les deux, pourraient conduire à une diminution des niveaux de transcription et de réplication du virus, expliquant sa non-détectabilité par les tests commerciaux. 1 er tour : amorce 1 : 5' CCA TAC TGC GGA ACT CCT AG 3' amorce 2 : 5' ATT TGC TCG CAG CCG GTC TG 3' 2e tour : amorce 3 : 5' TTT TGC CAG CCG GTC TG 3' amorce 4 : 5' ATT TGC TCG CAG CCG GTC TG 3' Des dilutions en série de plasmide dilué dans un sérum de contrôle ont permis de déterminer la sensibilité de la PCR. La PCR nichée dans les gènes S et X de HBV permet de détecter dix génomes de HBV.The PCR is carried out on 10 μ \ of total nucleic acids which have been extracted from 140 μ \ of serum, 200 μl of whole blood, 25 mg of a liver biopsy frozen or fixed with formalin in paraffin. PCR amplification of the X gene was also carried out according to the technique described by Uchida et al., Microbiol, Immunol, 1 994, 38, 281-285. The amplification of the X gene is interesting because the product of the X gene activates the HBV promoters and because the HBV core promoter overlaps the X gene. Consequently, mutations affecting either the X gene product or the core promoter or both, could lead to a decrease in virus transcription and replication levels, explaining its non-detectability by commercial tests. Round 1: Primer 1: 5 'CCA TAC TGC GGA ACT CTC AG 3' Primer 2: 5 'ATT TGC TCG CAG GCC GTC TG 3' Round 2: Primer 3: 5 'TTT TGC CAG CGC GTC TG 3' primer 4: 5 'ATT TGC TCG CAG CCG GTC TG 3' Serial dilutions of diluted plasmid in a control serum made it possible to determine the sensitivity of the PCR. PCR nested in HBV S and X genes can detect ten HBV genomes.
4. Quantification de l'ADN de HBV dans le sérum : la quantification a été réalisée en utilisant le test Amplicor HBV monitor (nom commercial), commercialisé par la société ROCHE. Le test comprend des amorces choisies dans la région pré-C/C de HBV qui permettent la détection de 4 x 1 02 à 4 x 107 copies d'ADN de HBV/ml. 50 μ\ de sérum ont été utilisés dans ce test (Kessler et al., Clin. Chem., 1 998 ; 36 : 601 -604).4. Quantification of HBV DNA in serum: the quantification was carried out using the Amplicor HBV monitor test (commercial name), sold by the company ROCHE. The test comprises primers chosen from the pre-C / C region of HBV which allow the detection of 4 × 10 2 to 4 × 10 7 copies of HBV DNA / ml. 50 μl of serum were used in this test (Kessler et al., Clin. Chem., 1,998; 36: 601-604).
5. Amplification du génome complet de HBV : l'amplification du génome de HBV a été exécutée en utilisant la technique décrite par Gϋnther et al., Journal of Virology, Sept. 1 995, pages 5437-5444 en utilisant les amorces suivantes :5. Amplification of the complete HBV genome: the amplification of the HBV genome was carried out using the technique described by Gϋnther et al., Journal of Virology, Sept. 1 995, pages 5437-5444 using the following primers:
Amorce 1 (P1) : 5' CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCAPrimer 1 (P1): 5 'CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA
CCT CTG CCT AAT CA 3' Amorce 2 (P2) : 5' CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGTCCT CTG CCT AAT CA 3 'Primer 2 (P2): 5' CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT
TGC ATG GTG CTG G 3'TGC ATG GTG CTG G 3 '
Le kit Expand High Fidelity (nom commercial) commercialisé par la société Roche contenant 1 ,5 mmol/l de MgCI2, 200 mol/l de désoxynucléoside triphosphate, 2,6 U d'un mélange de Taq et Pwo ADN polymérase (High Fidelity, commercialisé par la société Roche) ont été utilisés avec 1 //mol/l de chaque amorce décrite ci-dessus.The Expand High Fidelity kit (trade name) marketed by the Roche company containing 1.5 mmol / l of MgCl 2 , 200 mol / l of deoxynucleoside triphosphate, 2.6 U of a mixture of Taq and Pwo DNA polymerase (High Fidelity , sold by the company Roche) were used with 1 μmol / l of each primer described above.
La technique exploite le fait que bien que le génome de HBV trouvé dans les virions circulants soit circulaire, les brins ne sont pas fermés de manière covalente et peuvent donc rapidement s'hybrider aux amorces de PCR et le fait qu'il existe une courte redondance terminale aux extrémités 5' et 3' du brin moins. L'extrémité 3' de l'amorce P1 est complémentaire à l'extrémité 5' du brin moins, incluant la séquence redondante, tandis que l'extrémité 3' de l'amorce P2 est complémentaire à la séquence du brin plus, commençant avec la séquence redondante. Les extrémités 5' des deux amorces contiennent les sites d'enzymes de restriction pour Hind III, Sac I et Sap I qui sont rarement trouvés dans les génomes de HBV. Après un démarrage à chaud, 40 cycles de PCR ont été réalisés avec une dénaturation à 94° C pendant 40 secondes, une hybridation à 60° C pendant 1 ,30 min. et une élongation à 72° C pendant 3 min., avec une incrémentation de 10 secondes après chaque cycle, dans un appareil pour amplification par PCR commercialisé par la société Perkin Elmer. Une extension finale de 10 min. est réalisée à la fin des cycles.The technique exploits the fact that although the HBV genome found in circulating virions is circular, the strands are not covalently closed and can therefore quickly hybridize to PCR primers and the fact that there is a short redundancy terminal at the 5 'and 3' ends of the minus strand. The 3 'end of primer P1 is complementary to the 5' end of the minus strand, including the redundant sequence, while the 3 'end of primer P2 is complementary to the strand plus sequence, starting with the redundant sequence. The 5 'ends of the two primers contain the restriction enzyme sites for Hind III, Sac I and Sap I which are rarely found in the genomes of HBV. After a hot start, 40 PCR cycles were carried out with denaturation at 94 ° C for 40 seconds, hybridization at 60 ° C for 1, 30 min. and an elongation at 72 ° C. for 3 min., with an increment of 10 seconds after each cycle, in an apparatus for PCR amplification sold by the company Perkin Elmer. A final extension of 10 min. is performed at the end of the cycles.
L'obtention du brin ADN positif par l'action de la polymérase virale a été réalisée comme décrit par Hantz et al., Antimicrobiol. Agent Chemether, 1984, 25 : 240-246, avec incubation du sérum en présence de DNTPs, à une température de 37° C pendant une nuit. Quand le génome n'était pas amplifié ou peu amplifié, des aliquotes de PCR du génome entier ont été réamplifiés en utilisant une combinaison de l'amorce P1 et de l'amorce Por1 ou de l'amorce P2 et de l'amorce PoM . Ces PCR semi-nichées permettent chacune d'obtenir un fragment d'environ 1800 paires de bases, avec des chevauchements de l'une à l'autre d'environ 300 paires de bases. 6. Analyse des produits de PCR : des aliquotes des produits de réaction PCR ont été passés en électrophorèse sur gels d'agarose (1 à 2 % en fonction de la taille du produit amplifié supposée). Les gels ont été colorés avec du bromure d'éthydium ou avec la coloration de GELSTAR et photographiés. L'ADN est ensuite été transféré sur une membrane de nylon (Hybon N + nylon membrane) commercialisée par Amersham, en présence de 0,4 M de NaOH. La membrane de nylon a été ensuite soumise ensuite à une hybridation avec une sonde ADN de HBV de 3,2 kb, marquée au 32P en utilisant le kit «Ready to go » Random Primer Kit , commercialisé par la société Pharmacia Biotech.Obtaining the positive DNA strand by the action of the viral polymerase was carried out as described by Hantz et al., Antimicrobiol. Agent Chemether, 1984, 25: 240-246, with incubation of the serum in the presence of DNTPs, at a temperature of 37 ° C. overnight. When the genome was not amplified or poorly amplified, aliquots of whole genome PCR were re-amplified using a combination of primer P1 and primer Por1 or primer P2 and primer PoM. These semi-nested PCRs each make it possible to obtain a fragment of approximately 1800 base pairs, with overlaps from one to the other of approximately 300 base pairs. 6. Analysis of the PCR products: aliquots of the PCR reaction products were passed by electrophoresis on agarose gels (1 to 2% depending on the size of the amplified product assumed). The gels were stained with ethydium bromide or with GELSTAR staining and photographed. The DNA is then transferred onto a nylon membrane (Hybon N + nylon membrane) sold by Amersham, in the presence of 0.4 M NaOH. The nylon membrane was then subjected to hybridization with a 3.2 kb HBV DNA probe, labeled with 32 P using the “Ready to go” Random Primer Kit, sold by the company Pharmacia Biotech.
7. Purification des produits de PCR : quand les bandes spécifiques de HBV ont été amplifiées, le reste des produits de réaction PCR est passé en électrophorèse sur gels d'agarose, coloré, et les bandes spécifiques sont excisées à l'aide d'un scalpel sous irradiation UV à la longueur d'ondes 31 2 nm. L'ADN est ensuite isolée du gel d'agarose en utilisant le kit Geneclean, commercialisé par Bio 1 01 , et élue dans un faible volume d'eau.7. Purification of the PCR products: when the specific HBV bands have been amplified, the rest of the PCR reaction products are passed by electrophoresis on agarose gels, colored, and the specific bands are excised using a scalpel under UV irradiation at wavelength 31 2 nm. The DNA is then isolated from the agarose gel using the Geneclean kit, marketed by Bio 1 01, and eluted in a small volume of water.
8. Clonage des produits d'amplification de PCR : les stratégies de clonage utilisées sont fonction de la nature des produits d'amplification PCR. Les amplifications de HBs et HBx sous génoniques, ont été exécutées avec la Taq polymérase qui possède une activité de type transférase terminale naturelle et l'addition d'un nucleotide, habituellement l'adénosine, aux extrémités 3' des fragments amplifiés. Ces fragments sont clones directement dans le vecteur pGEM-T (Promega), un vecteur de clonage linéarisé contenant un codon supplémentaire qui code pour la thymine à son extrémité 3'. Les amplifications du génome complet par PCR ou les amplifications PCR semi-nichées subséquentes ont été exécutées avec un mélange de Taq et Pwo polymérases et les fragments amplifiés sont des fragments à extrémité franche ou sont un mélange de molécules avec des extrémités franches ou encore un résidu A supplémentaire à l'extrémité 3'. De tels fragments sont soit clones dans un vecteur à extrémité franche, le vecteur pSTBLUe-1 , après conversion de tous les fragments en fragments à extrémité franche, (Perfectly Blunt Cloning Kit, Novagen) ou un résidu A est ajouté aux extrémités 3' en incubant les fragments avec la Taq polymérase en présence de dATP et en les clonant ensuite dans le vecteur pGEM-T.' Après ligation, selon les instructions préconisées par le fabricant, les produits de ligation sont purifiés en utilisant une résine PCR Preps resin, commercialisée par la société Promega, et élues dans l'eau. Des aliquotes sont utilisés pour transformer les cellules de E. coli XL-2 Blue par électroporation. Les cellules transformées sont étalées sur des plaques d'agar LB contenant de I'ampicilline (1 00 g/ml), de l'IPTG (80 μl) et de la X-gal (70 //g/ml) et incubées pendant une nuit à 37° C.8. Cloning of PCR amplification products: the cloning strategies used depend on the nature of the PCR amplification products. Amplifications of HBs and HBx under genonics were carried out with Taq polymerase which has a natural terminal transferase activity and the addition of a nucleotide, usually adenosine, to the 3 'ends of the amplified fragments. These fragments are cloned directly into the vector pGEM-T (Promega), a linearized cloning vector containing an additional codon which codes for thymine at its 3 'end. Full genome amplifications by PCR or subsequent semi-nested PCR amplifications were performed with a mixture of Taq and Pwo polymerases and the amplified fragments are blunt-ended fragments or are a mixture of molecules with blunt ends or a residue Has extra at the 3 'end. Such fragments are either cloned into a blunt-ended vector, the vector pSTBLUe-1, after conversion of all the fragments into blunt-ended fragments, (Perfectly Blunt Cloning Kit, Novagen) or a residue A is added to the 3 'ends in incubating the fragments with Taq polymerase in the presence of dATP and then cloning them into the vector pGEM-T. 'After ligation, according to the instructions specified by the manufacturer, ligation products are purified using a PCR Preps resin resin, marketed by Promega, and eluted in water. Aliquots are used to transform E. coli XL-2 Blue cells by electroporation. The transformed cells are spread on LB agar plates containing ampicillin (1 00 g / ml), IPTG (80 μl) and X-gal (70 μg / ml) and incubated for overnight at 37 ° C.
9. Identification des plasmides recombinants d'HBV : le criblage initial implique la sélection des colonies blanches qui peuvent contenir l'insert d'intérêt, par opposition aux colonies bleues qui sont supposées ne pas contenir d'insert. Si la transformation semble être particulièrement réussie, c'est à dire si on observe une quantité conséquente de colonies blanches par rapport aux colonies bleues qui constituent le contrôle négatif, les colonies blanches sont ensuite directement amplifiées dans un milieu liquide (Terrifie Broth contenant 1 00 //g/ml d'ampicilline) pendant une nuit à 37° C sous agitation. Autrement, les colonies blanches sont repiquées sur deux plaques LB agar contenant de I'ampicilline. Une des plaques comprend une membrane de nylon à la surface de l'agar. Environ 100 colonies peuvent être repiquées sur chaque plaque. Les plaques sont incubées une nuit à 37° C. La plaque sans la membrane de nylon est conservée à 4° C. La membrane de nylon est traitée avec NaOH pour lyser les bactéries, puis neutralisée et séchée. Après fixation de l'ADN par irradiation UV, la membrane est soumise à une hybridation avec des sondes spécifiques de HBV marquées au 32P. Les colonies appropriées sont ensuite reprises de la plaque principale et amplifiées en milieu liquide.9. Identification of the recombinant HBV plasmids: the initial screening involves the selection of the white colonies which may contain the insert of interest, as opposed to the blue colonies which are supposed to contain no insert. If the transformation seems to be particularly successful, that is to say if there is a significant amount of white colonies compared to the blue colonies which constitute the negative control, the white colonies are then directly amplified in a liquid medium (Terrifie Broth containing 1 00 // g / ml of ampicillin) overnight at 37 ° C with stirring. Otherwise, the white colonies are subcultured on two LB agar plates containing ampicillin. One of the plates includes a nylon membrane on the surface of the agar. About 100 colonies can be subcultured on each plate. The plates are incubated overnight at 37 ° C. The plate without the nylon membrane is stored at 4 ° C. The nylon membrane is treated with NaOH to lyse the bacteria, then neutralized and dried. After fixing the DNA by UV irradiation, the membrane is subjected to hybridization with specific HBV probes labeled with 32 P. The appropriate colonies are then taken up from the main plate and amplified in liquid medium.
1 0. Purification de l'ADN du plasmide : l'ADN est purifié par mini preps en utilisant le Qtips-20, commercialisé par la société Qiagen, selon les instructions préconisées par la société. D'autres ADN sont préparés manuellement par lyse alcaline, précipitation de surnageant avec de l'isopropanol, resuspension et traitement du culot avec du phénol puis chloroforme et précipitation avec de l'éthanol. Dans les deux cas, l'ADN est finalement resuspendu dans 30 μ\ de TE. Les quantités d'ADN sont estimées par électrophorèse de gel d'agarose. 1 1 . Séquençage : approximativement 350 ng de plasmide sont séquences avec 5 pmoles d'amorces, en utilisant le kit de séquençage BigDye commercialisé par la société Perkin Elmer et un appareil d'amplification (9600 thermal cycler de Perkin Elmer) . Après purification des produits de séquençage par spin chromatographie sur Sephadex G50, les produits du séquençage sont analysés sur une appareil de séquençage ABI Prism 377, commercialisé par la société Applied Biosystems. Le séquençage initial est habituellement réalisé avec des amorces complémentaires aux séquences des promoteurs T7 et SP6 qui chevauchent le kit de clonage à la fois dans les vecteurs pGEM-T et pSTBLue-1 . Pour les fragments courts, de moins de 500 à 600 paires de bases, une bonne information sur les séquences des deux brins de l'insert peut habituellement être obtenue avec ces deux amorces. Pour des inserts plus longs, tels des génomes de HBV entiers, des amorces spécifiques d'HBV sont choisies dans le génome d'HBV, grossièrement à des intervalles de 500 paires de bases, dans les deux sens, afin que les deux brins puissent être complètement séquences. Plusieurs clones de chaque fragment sont séquences.1 0. Purification of the DNA of the plasmid: the DNA is purified by mini preps using Qtips-20, sold by the company Qiagen, according to the instructions recommended by the company. Other DNAs are prepared manually by alkaline lysis, precipitation of supernatant with isopropanol, resuspension and treatment of the pellet with phenol then chloroform and precipitation with ethanol. In both cases, the DNA is finally resuspended in 30 μ \ of TE. The amounts of DNA are estimated by agarose gel electrophoresis. 1 1. Sequencing: approximately 350 ng of plasmid are sequenced with 5 pmol of primers, using the BigDye sequencing kit sold by the company Perkin Elmer and an amplification device (9600 thermal cycler from Perkin Elmer). After purification of the sequencing products by spin chromatography on Sephadex G50, the sequencing products are analyzed on an ABI Prism 377 sequencing device, sold by the company Applied Biosystems. The initial sequencing is usually carried out with primers complementary to the sequences of the T7 and SP6 promoters which overlap the cloning kit in both the pGEM-T and pSTBLue-1 vectors. For short fragments, of less than 500 to 600 base pairs, good information on the sequences of the two strands of the insert can usually be obtained with these two primers. For longer inserts, such as whole HBV genomes, specific HBV primers are chosen from the genome of HBV, roughly at 500 base pair intervals, back and forth, so that the two strands can be completely sequenced. Several clones of each fragment are sequenced.
12. Analyse de séquences : la plupart des analyses informatiques ont été exécutées en utilisant des programmes disponibles sur le serveur INFOBIOGEN (Villejuif, France). Les données des séquences brutes sont corrigées en utilisant le programme de la machine de séquençage. A cette étape, seules les ambiguïtés (appelées N par la machine) et les erreurs évidentes de base à proximité des ambiguïtés sont corrigées. Une recherche par BLAST est ensuite effectuée, dans la majorité des cas, pour identifier la séquence de HBV de la base qui est la plus proche de celle du clone de l'invention. Un alignement complet, en utilisant le logiciel CLUSTAL W, de cette séquence et de la séquence du clone permet une correction supplémentaire. Seules des erreurs évidentes, telles que l'omission de bases par la machine ou l'addition de bases à l'extrémité de la séquence sont corrigées. Les séquences corrigées partiellement sur les deux brins du clone sont assemblées et alignées. Des conflits éventuels sont résolus en choisissant la séquence la mieux supportée par les données. Finalement, les séquences corrigées des différents clones provenant du même patient sont comparées et les différences sont vérifiées de nouveau. Pour faciliter l'analyse biologique des séquences amplifiées, 81 séquences du génome complet de HBV trouvées dans les bases de données ont été alignées en utilisant CLUSTAL W. L'analyse phylogénique de cet alignement montre que les séquences de l'invention appartiennent aux 6 groupes majeurs, correspondant aux génotypes A à F, déterminés antérieurement par alignement de séquences du gène HBs. L'addition à cet alignement de séquences dérivées de génomes d'HBV cryptiques permet d'attribuer ces génomes à un génotype particulier ou permet d'établir que les génomes de HBV cryptiques appartiennent à un génotype encore inconnu. De plus, les séquences en acides aminés des différentes protéines de HBV trouvées dans les bases de données (PréS/s, HBs, HBc, HBx, PréC/c et pol) ont été alignées. Ceci permet une comparaison des séquences en acides aminés déduites des séquences nuclélotidiques des clones de l'invention avec des séquences protéiques d'HBV déjà décrites, qui vraisemblablement sont dérivées de génomes de HBV non cryptiques. Il a été ainsi possible d'identifier des mutations dans les protéines du virus HBV ctyptique de l'invention qui sont absentes dans les isolats de HBV décrit antérieurement et qui ne sont pas dues simplement à une variation du génotype. 1 3. Analyse fonctionnelle : l'analyse fonctionnelle a été effectuée avec les clones dérivés des amplifications du génome complet. Les clones sont coupés avec l'enzyme de restriction Sap I. Les sites de reconnaissance et de coupure de cet enzyme sont CTCTTCNNNN. Ce site est présent dans les amorces P1 et P2 utilisées pour l'amplification du génome entier. Ceci a pour conséquence la libération d'un insert du génome entier avec des extrémités cohésives et, en raison de la redondance terminale du brin moins, une recircularisation dans un génome HBV complet sans séquences superflues. Après coupure avec l'enzyme de restriction Sap I, l'ADN est extrait avec du phénol et précipitée avec de l'éthanol. L'ADN est ensuite transfecté dans des cellules HuH7, une lignée cellulaire d'hépatocarcinome humain permissive pour la réplication d'HBV, en utilisant le réactif de transfection FuGene-6, commercialisé par la société Roche. La recircularisation de l'insert a lieu dans les cellules et permet la transcription et la réplication virale . Le contrôle négatif est constitué par des cellules transformées avec un vecteur pGEM sans insert et les contrôles positifs sont un dimère des génomes complets d'un HBV de type sauvage clone au niveau du site EcoRI, intact ou coupé avec l'enzyme de restriction EcoRI. La transfection est contrôlée par une co-transfection avec pSEAP, un plasmide exprimant la Phosphatase Alcaline Sécrétée Soluble, dont l'activité est mesurée dans le milieu de culture 48 heures après la transfection. Les milieux sont changés chaque jour et les milieux des jours 2 à la fin de l'expérience (normalement jour 5 ou 6) sont collectés. La présence de l'antigène HBs dans le milieu est mesurée en utilisant le kit Ausria, commercialisé par la société Abbott. A la fin de l'expérience, 'les cellules sont lysées et l'ADN, l'ARN et les protéines sont extraites. Le milieu est stocké et concentré par précipitation avec du PEG. La présence de protéines virales, d'ADN ou d'ARN est analysée dans les différentes préparation. Pour les clones sous-génomiques, les fragments sont insérés dans des vecteurs d'expression de HBV, soit dans le contexte d'un génome complet pour étudier les effets des mutations du gène HBs, du gène HBx ou du promoteur du core sur le cycle de réplication, soit dans des vecteurs d'expression pour HBs ou HBx pour étudier les propriétés des protéines mutées, en particulier pour savoir si les protéines HBs mutées sont normalement synthétisées et sécrétées et si elles sont reconnues par les tests de détection du commerce.12. Sequence analysis: most of the computer analyzes were carried out using programs available on the INFOBIOGEN server (Villejuif, France). Raw sequence data is corrected using the sequencing machine program. At this stage, only the ambiguities (called N by the machine) and the basic obvious errors near the ambiguities are corrected. A BLAST search is then carried out, in the majority of cases, to identify the HBV sequence of the base which is closest to that of the clone of the invention. Complete alignment, using CLUSTAL W software, of this sequence and the clone sequence allows for further correction. Only obvious errors, such as the omission of bases by the machine or the addition of bases at the end of the sequence are corrected. The partially corrected sequences on the two strands of the clone are assembled and aligned. Any conflicts are resolved by choosing the sequence best supported by the data. Finally, the corrected sequences of different clones from the same patient are compared and the differences are checked again. To facilitate the biological analysis of the amplified sequences, 81 sequences of the complete HBV genome found in the databases were aligned using CLUSTAL W. The phylogenic analysis of this alignment shows that the sequences of the invention belong to the 6 groups major, corresponding to genotypes A to F, previously determined by alignment of HBs gene sequences. The addition to this alignment of sequences derived from cryptic HBV genomes makes it possible to assign these genomes to a particular genotype or makes it possible to establish that the cryptic HBV genomes belong to a genotype still unknown. In addition, the amino acid sequences of the various HBV proteins found in the databases (PreS / s, HBs, HBc, HBx, PreC / c and pol) were aligned. This allows a comparison of the amino acid sequences deduced from the nucleotide sequences of the clones of the invention with the HBV protein sequences already described, which are probably derived from genomes. of non-cryptic HBVs. It was thus possible to identify mutations in the proteins of the ctyptic HBV virus of the invention which are absent in the HBV isolates described previously and which are not due simply to a variation in the genotype. 1 3. Functional analysis: the functional analysis was carried out with the clones derived from the amplifications of the whole genome. The clones are cut with the restriction enzyme Sap I. The recognition and cleavage sites of this enzyme are CTCTTCNNNN. This site is present in the primers P1 and P2 used for the amplification of the whole genome. This results in the release of a whole genome insert with cohesive ends and, due to the terminal redundancy of the less strand, recircularization in a complete HBV genome without superfluous sequences. After cleavage with the restriction enzyme Sap I, the DNA is extracted with phenol and precipitated with ethanol. The DNA is then transfected into HuH7 cells, a permissive human hepatocarcinoma cell line for the replication of HBV, using the transfection reagent FuGene-6, sold by the company Roche. The recircularization of the insert takes place in the cells and allows transcription and viral replication. The negative control consists of cells transformed with a pGEM vector without insert and the positive controls are a dimer of the complete genomes of a wild-type HBV cloned at the EcoRI site, intact or cut with the restriction enzyme EcoRI. The transfection is controlled by a co-transfection with pSEAP, a plasmid expressing the soluble secreted alkaline phosphatase, the activity of which is measured in the culture medium 48 hours after the transfection. The media are changed every day and the media for days 2 to the end of the experiment (normally day 5 or 6) are collected. The presence of the HBs antigen in the medium is measured using the Ausria kit, sold by the company Abbott. At the end of the experiment, the cells are lysed and the DNA, RNA and proteins are extracted. The medium is stored and concentrated by precipitation with PEG. The presence of viral proteins, DNA or RNA is analyzed in the different preparations. For the subgenomic clones, the fragments are inserted into HBV expression vectors, either in the context of a complete genome to study the effects of mutations in the HBs gene, the HBx gene or the core promoter on the replication cycle, either in expression vectors for HBs or HBx to study the properties of the mutated proteins, in particular whether mutated HBs proteins are normally synthesized and secreted and if they are recognized by commercial detection tests.
14. Résultats : selon les protocoles décrits ci dessus, le génome complet de HBV du patient a été amplifié par PCR et clone. Deux amplifications par PCR ont été réalisées et des clonages indépendants ont été effectués. L'analyse phylogénique montre que le génome est de génotype A, mais qu'il est à la frontière de la famille et qu'il pourrait représenter un nouveau sous-groupe dans le génotype A. Les éléments importants de structure et de régulation sont conservés dans les séquences nucléotidiques et il n'y a pas de modifications majeures dans les séquences en acides aminés déduites de HBx et de pol par rapport au type sauvage. Le génome est donc en compétent pour sa réplication. Toutefois, la séquence en acides aminés et la protéine HBsAg présente des substitutions nombreuses, particulièrement dans les déterminant a, qui correspond à une partie de l'antigène exposé à la surface des particules virales et qui est reconnu par les tests sérologiques disponibles dans le commerce. Il est particulièrement intéressant de noter qu'il existe des substitutions successives aux positions 1 09-1 1 2 de la séquence en acides aminés de la protéine HBsAgm et d'autres substitutions isolées au niveau de HBsAgm. Les substitutions majeures sont dans HBsAgm QTTR (acides aminés 109 à 1 1 2) au lieu de LIPG trouvé au niveau de la protéine de HBsAg sauvage. Ces substitutions, entre autre, peuvent induire une altération de l'antigénicité de la protéine HBsAgm et expliquer qu'elle ne soit pas reconnu par les tests disponibles commercialement. Par ailleurs, une mutation est également retrouvée au niveau de la protéine Pré- Sm qui consiste en un remplacement de l'acide aminé Ile trouvé en position 84 de la protéine sauvage, en référence à SEQ ID NO 4, par l'acide aminé Thr dans la protéine Pré-Sm (position 84 de SEQ ID NO 4). Exemple 2 : Identification d'un mutant ou variant HBVm'. Chez ce même patient de 86 ans avec un historique d'hépatite non A, non B chronique a également été identifié un autre virus HBV muté (HBVm'). Le génome de ce virus a été amplifié, clone et séquence comme décrit dans l'exemple 1 . L'analyse phylogénique montre que son génome est de génotype D. L'analyse des séquences montre que HBVm' est un mutant pré-core avec un codon stop dans PréC/c, juste avant le gène HBc. Par ailleurs, il présente une mutation dans la partie Pré-S, juste avec le début de HBs, qui consiste dans le remplacement d'une Arg par une Gly à la position 102 de le protéine Pré-Sm' identifiée en SEQ ID NO 6 et une mutation près de la fin de HBs, également partagée avec HBsm qui consiste dans le remplacement d'une serine par une arginine à la position 210 de SEQ ID NO 5. A des fins de simplification les séquences nucléotidiques codant pour SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 5 n'ont pas été introduites dans la présente description, mais les inventeurs ont réalisé un séquençage complet qui permet d'affirmer que Gly est codée par le codon GGA, en position 304-306 de la région Pré-S ou en position 31 51 -31 53 par rapport à la séquence du génome complet et que Arg est codée par le codon AGG, en position 628-630 du gène S ou en position 782-784 par rapport à la séquence du génome complet. 14. Results: according to the protocols described above, the patient's complete HBV genome was amplified by PCR and cloned. Two PCR amplifications were carried out and independent cloning was carried out. Phylogenic analysis shows that the genome is of genotype A, but that it is on the border of the family and that it could represent a new subgroup in genotype A. The important elements of structure and regulation are preserved in the nucleotide sequences and there are no major modifications in the amino acid sequences deduced from HBx and pol compared to the wild type. The genome is therefore competent for its replication. However, the amino acid sequence and the HBsAg protein have numerous substitutions, particularly in the determinants a, which corresponds to a part of the antigen exposed on the surface of the viral particles and which is recognized by the serological tests available on the market. . It is particularly interesting to note that there are successive substitutions at positions 1 09-1 1 2 of the amino acid sequence of the protein HBsAgm and other substitutions isolated at the level of HBsAgm. The major substitutions are in HBsAgm QTTR (amino acids 109 to 1 1 2) instead of LIPG found at the protein of wild HBsAg. These substitutions, among others, can induce an alteration in the antigenicity of the HBsAgm protein and explain why it is not recognized by commercially available tests. In addition, a mutation is also found at the level of the Pre-Sm protein which consists in replacing the amino acid Ile found in position 84 of the wild protein, with reference to SEQ ID NO 4, by the amino acid Thr in the Pre-Sm protein (position 84 of SEQ ID NO 4). Example 2: Identification of a mutant or variant HBVm '. In this same 86-year-old patient with a history of chronic non-A, non-B hepatitis, another mutated HBV virus (HBVm ') was also identified. The genome of this virus was amplified, cloned and sequenced as described in Example 1. Phylogenic analysis shows that its genome is genotype D. Sequence analysis shows that HBVm 'is a pre-core mutant with a stop codon in PréC / c, just before the HBc gene. Furthermore, it has a mutation in the Pre-S part, just with the start of HBs, which consists in replacing an Arg with a Gly at position 102 of the Pre-Sm 'protein identified in SEQ ID NO 6 and a mutation near the end of HBs, also shared with HBsm which consists in replacing a serine with an arginine at position 210 of SEQ ID NO 5. For the purpose of simplification the nucleotide sequences coding for SEQ ID NO 6 and SEQ ID NO 5 have not been introduced in the present description, but the inventors have carried out a complete sequencing which makes it possible to affirm that Gly is coded by the codon GGA, in position 304-306 of the Pre-S region or in position 31 51 -31 53 relative to the complete genome sequence and that Arg is coded by the codon AGG, in position 628-630 of the S gene or in position 782-784 relative to the sequence of the complete genome.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Virus HBVm isolé présentant les caractéristiques suivantes : (i) un génome à ADN circulaire partiellement double brin, (ii) ledit génome comprenant les gènes Pré-S, S, C, P et X,1. Isolated HBVm virus having the following characteristics: (i) a partially double-stranded circular DNA genome, (ii) said genome comprising the Pre-S, S, C, P and X genes,
(iii) le gène Pré-S codant pour des antigènes de surface, le gène S codant pour une protéine d'enveloppe HBsAg, le gène C codant pour une protéine HBeAg et une protéine HBcAg, le gène P codant pour une enzyme ADN polymerase/transcriptase inverse et le gène X codant pour une protéine HBxAg, caractérisé en ce que le gène S comprend une séquence nucléotidique ADN référencée SEQ ID NO 1 et en ce que le gène Pré-S comprend une séquence nucléotidique ADN référencée SEQ ID NO 3.(iii) the Pre-S gene coding for surface antigens, the S gene coding for an HBsAg envelope protein, the C gene coding for an HBeAg protein and an HBcAg protein, the P gene coding for a DNA polymerase enzyme / reverse transcriptase and the X gene coding for a HBxAg protein, characterized in that the S gene comprises a DNA nucleotide sequence referenced SEQ ID NO 1 and in that the Pre-S gene comprises a DNA nucleotide sequence referenced SEQ ID NO 3.
2. Protéine de surface modifiée, caractérisée en ce qu'elle consiste en une séquence peptidique choisie parmi SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4.2. Modified surface protein, characterized in that it consists of a peptide sequence chosen from SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 4.
3. Fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique ADN ou ARN d'au moins 12 nucléotides, de préférence d'au moins 1 5 ou 1 8 nucléotides et avantageusement d'au moins 21 nucléotides qui comprend les nucléotides 325 à 336 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 235 à 237 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 391 à 393 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 478 à 480 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 28 à 30 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 39 à 41 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 358 à 360 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 385 à 387 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 1 1 8 à 1 20 de SEQ ID NO 1 et/ou les nucléotides 628 à 630 de SEQ ID NO 1 , et/ou un fragment qui comprend une séquence d'au moins 21 nucléotides comprenant les nucléotides 250 à 252 de SEQ ID NO 3, ou est le produit de transcription desdites séquences nucléotidiques ADN, sous réserve que lorsque le fragment comprend les nucléotides 628 à 630 de SEQ ID NO 1 , alors ledit fragment comprend également les nucléotides 325 à 336, et/ou 235 à 237, et/ou 391 à 393, et/ou 478 à 480, et/ou 28 à 30, et/ou 39 à 41 , et/ou 358 à 360, et/ou 385 à 387, et/ou 1 1 8 à 1 20 de SEQ ID NO 1 , et/ou les nucléotides 250 à 252 de SEQ ID NO 3.3. Nucleotide fragment of DNA or RNA, characterized in that it comprises a DNA or RNA nucleotide sequence of at least 12 nucleotides, preferably at least 1 5 or 1 8 nucleotides and advantageously at least 21 nucleotides which comprises nucleotides 325 to 336 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 235 to 237 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 391 to 393 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 478 to 480 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 28 to 30 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 39 to 41 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 358 to 360 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 385 to 387 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 1 1 8 to 1 of SEQ ID NO 1 and / or nucleotides 628 to 630 of SEQ ID NO 1, and / or a fragment which comprises a sequence of at least 21 nucleotides comprising nucleotides 250 to 252 of SEQ ID NO 3, or is the transcript of said DNA nucleotide sequences, provided that when the fragment comprises the nucle otides 628 to 630 of SEQ ID NO 1, then said fragment also includes nucleotides 325 to 336, and / or 235 to 237, and / or 391 to 393, and / or 478 to 480, and / or 28 to 30, and / or 39 to 41, and / or 358 to 360, and / or 385 to 387, and / or 1 1 8 to 1 20 of SEQ ID NO 1, and / or the nucleotides 250 to 252 of SEQ ID NO 3.
4. Fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique qui comprend les séquences nucléotidiques d'ADN SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou les séquences complémentaires desdites séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou les séquences nucléotidiques d'ARN qui sont les produits de transcription de séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3.4. Nucleotide fragment of DNA or RNA, characterized in that it comprises a nucleotide sequence which comprises the nucleotide DNA sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3 or the sequences complementary to said sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3 or the nucleotide sequences of RNA which are the transcripts of sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3.
5. Fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence nucléotidique d'ADN qui correspond à SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3 ou les séquences complémentaires desdites séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID MO 3 ou en ce qu'il consiste en une séquence nucléotidique d'ARN qui correspond aux produits de transcription de séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 3.5. Nucleotide fragment of DNA or RNA, characterized in that it consists of a DNA nucleotide sequence which corresponds to SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3 or the sequences complementary to said sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID MO 3 or in that it consists of an RNA nucleotide sequence which corresponds to the transcripts of sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 3.
6. Molécule d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique ADN choisie parmi SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, leurs fragments selon l'une des revendications 3 à 5, et leurs séquences complémentaires.6. DNA molecule, characterized in that it comprises a DNA nucleotide sequence chosen from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, their fragments according to one of claims 3 to 5, and their complementary sequences.
7. Molécule d'ARN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique ARN qui est le produit de transcription d'une séquence nucléotidique ADN choisie parmi SEQ ID N01 , SEQ ID NO 3, leurs fragments selon l'une des revendications 3 à 5, et leurs séquences complémentaires.7. RNA molecule, characterized in that it comprises an RNA nucleotide sequence which is the transcription product of a DNA nucleotide sequence chosen from SEQ ID N01, SEQ ID NO 3, their fragments according to one of claims 3 to 5, and their complementary sequences.
8. Fragment protéique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique d'au moins 4 acides aminés, de préférence d'au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 1 5 acides aminés et avantageusement de 6 à 10 ou de 8 à 1 2 acides aminés et qui comprend les acides aminés 109-1 1 2 et/ou 79 et/ou 131 et/ou 1 60 et/ou 10 et/ou 1 4 et/ou 1 20 et/ou 129 et/ou 40 et/ou 210 de SEQ ID NO 2, et/ou un fragment qui comprend une séquence peptidique d'au moins 7 acides aminés comprenant l'acide aminé 84 de SEQ ID NO 4, sous réserve que lorsque le fragment comprend l'acide aminé 210 de SEQ ID NO 2, alors ledit fragment comprend également les acides aminés 109-1 12 et/ou 79 et/ou 1 31 et/ou 1 60 et/ou 10 et/ou 1 4 et/ou 1 20 et/ou 1 29 et/ou 40 de SEQ ID NO 2 et/ou l'acide aminé 84 de SEQ ID NO 4.8. Protein fragment, characterized in that it comprises a peptide sequence of at least 4 amino acids, preferably at least 5 or 6 amino acids and advantageously at least 7 amino acids, in particular from 6 to 1 5 amino acids and advantageously from 6 to 10 or from 8 to 1 2 amino acids and which comprises amino acids 109-1 1 2 and / or 79 and / or 131 and / or 1 60 and / or 10 and / or 1 4 and / or 1 20 and / or 129 and / or 40 and / or 210 of SEQ ID NO 2, and / or a fragment which comprises a peptide sequence of at least 7 amino acids comprising the amino acid 84 of SEQ ID NO 4, provided that when the fragment comprises amino acid 210 of SEQ ID NO 2, then said fragment also comprises amino acids 109-1 12 and / or 79 and / or 1 31 and / or 1 60 and / or 10 and / or 1 4 and / or 1 20 and / or 1 29 and / or 40 of SEQ ID NO 2 and / or amino acid 84 of SEQ ID NO 4.
9. Fragment protéique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique qui comprend les séquences peptidiques SEQ9. Protein fragment according to claim 8, characterized in that it comprises a peptide sequence which comprises the peptide sequences SEQ
ID NO 2 et SEQ ID NO 4.ID NO 2 and SEQ ID NO 4.
10. Fragment selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence peptidique choisie parmi SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4.10. Fragment according to claim 8, characterized in that it consists of a peptide sequence chosen from SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 4.
1 1 . Fragment protéique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il consiste en SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4.1 1. Protein fragment according to claim 8, characterized in that it consists of SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 4.
1 2. Protéine de surface modifiée, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence peptidique choisie parmi SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 et leurs fragments selon l'une des revendications 8 à 1 1 .1 2. Modified surface protein, characterized in that it comprises a peptide sequence chosen from SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 and their fragments according to one of claims 8 to 1 1.
13. Cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote permettant l'expression d'un fragment d'ADN tel que défini dans les revendications 7 ou 8, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression.13. Functional expression cassette in a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism allowing the expression of a DNA fragment as defined in claims 7 or 8, placed under the control of the elements necessary for its expression.
14. Cassette d'expression selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle est fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme eucaryote ou eucaryote inférieur. 14. Expression cassette according to claim 13, characterized in that it is functional in a cell derived from a eukaryotic or lower eukaryotic organism.
1 5. Cassette d'expression selon la revendication 14, caractérisée en ce que la cellule issue d'un organisme eucaryote est sélectionnée parmi les cellules COS et CHO et en ce que la cellule issue d'un organisme eucaryote inférieur est sélectionnée parmi les cellules de Saccharomyces cerevisiae et de Pichia pastoris.1 5. Expression cassette according to claim 14, characterized in that the cell derived from a eukaryotic organism is selected from COS and CHO cells and that the cell derived from a lower eukaryotic organism is selected from cells Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris.
1 6. Vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 13 à 15.1 6. Vector comprising an expression cassette according to one of claims 13 to 15.
1 7. Cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, de préférence un organisme eucaryote ou eucaryote inférieur et avantageusement une cellule COS ou CHO ou une cellule issue de Saccharomyces cerevisiae ou de Pichia pastoris comprenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 13 à 1 5 ou un vecteur selon la revendication 1 6.1 7. Cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism, preferably a lower eukaryotic or eukaryotic organism and advantageously a COS or CHO cell or a cell derived from Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris comprising an expression cassette according to one of the claims 13 to 1 5 or a vector according to claim 1 6.
1 8. Protéine de surface produite par une cassette d'expression selon l'une des revendications 1 3 à 1 5, un vecteur selon la revendication 1 6 ou une cellule selon la revendication 1 7.1 8. A surface protein produced by an expression cassette according to one of claims 1 3 to 1 5, a vector according to claim 1 6 or a cell according to claim 1 7.
1 9. Procédé pour préparer une protéine de surface modifiée selon les revendications 4 ou 5 ou un fragment protéique selon les revendications 9 à 1 2 qui consiste à cultiver une cellule hôte selon la revendication 1 7 dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence nucléotidique d'ADN telle que définie dans la revendication 6 ou un fragment nucléotidique tel que défini dans les revendications 3 à 5 et, à purifier ladite protéine de surface modifiée produite jusqu'à un degré de pureté requis.1 9. A process for preparing a modified surface protein according to claims 4 or 5 or a protein fragment according to claims 9 to 1 2 which consists in cultivating a host cell according to claim 1 7 in an appropriate culture medium, said host cell being transformed with an expression vector which contains a DNA nucleotide sequence as defined in claim 6 or a nucleotide fragment as defined in claims 3 to 5 and, purifying said modified surface protein produced up to a degree of purity required.
20. Peptide immunogène, caractérisé en ce qu'il présente une séquence peptidique telle que définie dans les revendications 2, et 8 à 1 2 ou en ce qu'il consiste en une protéine telle que définie dans les revendications 1 8 et 1 9. 20. Immunogenic peptide, characterized in that it has a peptide sequence as defined in claims 2, and 8 to 12 or in that it consists of a protein as defined in claims 1 8 and 1 9.
21 . Anticorps monoclonal ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation d'un animal mammifère avec un peptide immunogène tel que défini dans la revendication 20.21. Monoclonal or polyclonal antibody, characterized in that it is obtained by immunization of a mammalian animal with an immunogenic peptide as defined in claim 20.
22. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, une protéine ou un fragment protéique tel que défini dans les revendications 2, 8 à 1 2, 1 8 et 1 9.22. Diagnostic composition, characterized in that it comprises, inter alia, a protein or a protein fragment as defined in claims 2, 8 to 1 2, 1 8 and 1 9.
23. Procédé pour détecter des anticorps dirigés contre au moins une protéine de surface mutée qui consiste en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec une composition diagnostique telle que définie dans la revendication 22 dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes.23. Method for detecting antibodies directed against at least one mutated surface protein which consists of SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 in a biological sample, according to which the biological sample is brought into contact with a diagnostic composition such as as defined in claim 22 under predetermined conditions which allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected.
24. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal tel que défini dans la revendication 21 .24. Diagnostic composition, characterized in that it comprises, inter alia, a monoclonal antibody or a polyclonal antibody as defined in claim 21.
25. Procédé pour détecter au moins une protéine de surface mutée qui consiste en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec une composition diagnostique telle que définie dans la revendication 24 dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes.25. Method for detecting at least one mutated surface protein which consists of SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 in a biological sample, according to which the biological sample is brought into contact with a diagnostic composition as defined in the claim 24 under predetermined conditions which allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected.
26. Matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des êtres humains infectés par au moins le virus HBVm, ladite composition comprenant : (i) soit au moins une protéine naturelle et/ou une protéine recombinante et/ou un polypeptide de synthèse ou leurs fragments dont la séquence correspond à tout ou partie de la séquence identifiée en SEQ ID NO 2 et/ou de la séquence identifiée en SEQ ID NO 4, éventuellement associée à au moins une protéine naturelle et/ou une protéine recombinante et/ou un polypeptide de synthèse ou leurs fragments dont la séquence correspond à tout ou partie de la séquence identifiée en SEQ ID NO 5 et/ou de la séquence identifiée en SEQ ID NO 6 et/ou à au moins une protéine naturelle et/ou une protéine recombinante et/ou un polypeptide de synthèse ou leurs fragments d'un antigène HBs de type sauvage et/ou d'une protéine Pré-S de type sauvage ; soit26. Biological material for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of human beings infected with at least the HBVm virus, said composition comprising: (i) either at least one natural protein and / or a recombinant protein and / or a polypeptide of synthesis or their fragments whose sequence corresponds to all or part of the sequence identified in SEQ ID NO 2 and / or the sequence identified in SEQ ID NO 4, optionally associated with at least one natural protein and / or a recombinant protein and / or a synthetic polypeptide or their fragments, the sequence of which corresponds to all or part of the sequence identified in SEQ ID NO 5 and / or the sequence identified in SEQ ID NO 6 and / or at least one natural protein and / or a recombinant protein and / or a synthetic polypeptide or their fragments of a wild type HBs antigen and / or a wild type Pre-S protein; is
(ii) au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal ou un fragment desdits anticorps, spécifique d'au moins une des protéines référencées SEQ ID NO 2 et 4 ou de leurs fragments, éventuellement associé avec au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal ou un fragment desdits anticorps spécifique d'au moins une protéines référencées SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 6 et/ou avec au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal ou un fragment desdits anticorps spécifique d'au moins une protéine HBs ou Pré-S de type sauvage.(ii) at least one monoclonal or polyclonal antibody or a fragment of said antibodies, specific for at least one of the proteins referenced SEQ ID NO 2 and 4 or of their fragments, optionally associated with at least one monoclonal or polyclonal antibody or a fragment of said said antibody specific for at least one protein referenced SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 6 and / or with at least one monoclonal or polyclonal antibody or a fragment of said antibody specific for at least one wild-type HBs or Pre-S protein.
27. Composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine ou un fragment protéique tel que défini dans les revendications 2, 8 à 1 2, 1 8 et 1 9, éventuellement associé à un véhicule et/ou adjuvant et/ou diluant approprié et à un excipient pharmaceutiquement acceptable.27. Immunogenic or vaccine composition, characterized in that it comprises a protein or a protein fragment as defined in claims 2, 8 to 1 2, 1 8 and 1 9, optionally associated with a vehicle and / or adjuvant and / or suitable diluent and a pharmaceutically acceptable excipient.
28. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un matériel biologique tel que défini dans la revendicatipn 26, éventuellement associé à un véhicule et/ou adjuvant et/ou diluant approprié et à un excipient pharmaceutiquement acceptable.28. Pharmaceutical composition, characterized in that it comprises a biological material as defined in claim 26, possibly associated with a suitable vehicle and / or adjuvant and / or diluent and with a pharmaceutically acceptable excipient.
29. Sonde, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 6 et 7 ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans les revendications 3 à 5. 29. Probe, characterized in that it is capable of hybridizing under stringency conditions determined to a nucleotide sequence of DNA or RNA as defined in claims 6 and 7 or to a nucleotide fragment as defined in claims 3 to 5.
30. Amorce, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 6 et 7 ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans les revendications 3 à 5.30. Primer, characterized in that it is capable of hybridizing under stringency conditions determined to a nucleotide sequence of DNA or RNA as defined in claims 6 and 7 or to a nucleotide fragment as defined in claims 3 to 5.
31 . Anticorps anti-acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est susceptible de se lier à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 6 et 7 ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans les revendications 3 à 5.31. Anti-nucleic acid antibody, characterized in that it is capable of binding to a nucleotide sequence of DNA or RNA as defined in claims 6 and 7 or to a nucleotide fragment as defined in claims 3 to 5.
32. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tel(le) que défini(e) dans les revendications 29, 30 et 31 .32. Diagnostic composition, characterized in that it comprises at least one probe or a primer or an anti-nucleic acid antibody as defined in claims 29, 30 and 31.
33. Procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon de sérum ou de plasma d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraite l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce telle que définie dans les revendications 29 et 30, dans des conditions de stringence déterminées et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN.33. Method for diagnosing DNA and / or viral RNA, according to which a sample of serum or plasma is taken from a patient, said sample is treated if necessary to extract the DNA and / or RNA therefrom , said sample is brought into contact with at least one probe or primer as defined in claims 29 and 30, under determined stringency conditions and the presence of DNA and / or viral RNA is detected in the sample either by demonstrating a hybridization of said DNA and / or viral RNA with at least one probe, or by amplification of said DNA and / or RNA.
34. Procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon de sérum ou de plasma d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraite l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps anti-acide nucléique tel que défini dans la revendication 31 , ledit anticorps étant éventuellemnt marqué par tout marqueur approprié et on met en évidence la formation d'un complexe acide nucléique/anticorps. 34. A method of diagnosing DNA and / or viral RNA, according to which a serum or plasma sample is taken from a patient, said sample is treated if necessary to extract the DNA and / or RNA therefrom , said sample is brought into contact with at least one anti-nucleic acid antibody as defined in claim 31, said antibody being optionally labeled with any suitable marker and the formation of a nucleic acid / antibody complex is demonstrated.
35. Composition vaccinale comprenant une séquence d'ADN codant pour au moins une protéine de surface mutée du virus HBVm (HBsAgm) ou ses fragments, ladite protéine HBsAgm comprenant un déterminant a modifié d'une protéine HBs représenté en SEQ ID NO 2, ledit ADN étant mélangé avec un véhicule ou un diluant approprié.35. A vaccine composition comprising a DNA sequence coding for at least one mutated surface protein of the HBVm virus (HBsAgm) or its fragments, said HBsAgm protein comprising a modified determinant of an HBs protein represented in SEQ ID NO 2, said DNA being mixed with an appropriate vehicle or diluent.
36. Composition selon la revendication 35, caractérisée en ce qu'elle comprend de plus une séquence d'ADN codant pour au moins une protéine de surface mutée représentée en SEQ ID NO 4 ou ses fragments et/ou une séquence d'ADN codant pour au moins une protéine de surface ou ses fragments représentée en SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6 et/ou une séquence d'ADN codant pour au moins un antigène HBs de type sauvage et/ou une région Pré-S de type sauvage.36. Composition according to claim 35, characterized in that it further comprises a DNA sequence coding for at least one mutated surface protein represented in SEQ ID NO 4 or its fragments and / or a DNA sequence coding for at least one surface protein or its fragments represented in SEQ ID NO 5 and / or SEQ ID NO 6 and / or a DNA sequence coding for at least one wild type HBs antigen and / or a Pre-S type region wild.
37. Oligonucléotide anti-sens ou anti-gène, caractérisé en ce qu'il est capable d'interférer spécifiquement avec la synthèse d'au moins une protéine choisie parmi les protéines identifiées en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 et/ou SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6.37. Anti-sense or anti-gene oligonucleotide, characterized in that it is capable of specifically interfering with the synthesis of at least one protein chosen from the proteins identified in SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 and / or SEQ ID NO 5 and / or SEQ ID NO 6.
38. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, au moins un oligonucléotide anti-sens ou un oligonucléotide anti-gène tel que défini dans la revendication 37.38. Pharmaceutical composition, characterized in that it comprises, inter alia, at least one antisense oligonucleotide or an anti-gene oligonucleotide as defined in claim 37.
39. Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un gène d'intérêt thérapeutique ou vaccinal, ledit gène codant notamment39. Vector, characterized in that it comprises at least one gene of therapeutic or vaccine interest, said gene coding in particular
- (i) soit au moins pour une protéine ou un fragment de protéine choisie parmi les protéines identifiées en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 et/ou SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6;- (i) either at least for a protein or a protein fragment chosen from the proteins identified in SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 and / or SEQ ID NO 5 and / or SEQ ID NO 6;
- (ii) - soit au moins pour tout ou partie d'un anticorps polyclonal ou monoclonal capable de se fixer à au moins une des protéines définies en (i) ou à ses fragments ; - (iii) soit au moins pour une molécule inhibitrice d'au moins une des protéines définies en (i) ;- (ii) - either at least for all or part of a polyclonal or monoclonal antibody capable of binding to at least one of the proteins defined in (i) or to its fragments; - (iii) either at least for an inhibitor molecule of at least one of the proteins defined in (i);
- (iv) soit au moins pour un ligand ou toute partie d'un ligand capable de se fixer à au moins une protéine des protéines définies en (i) ou à un fragment desdites protéines et/ou d'inhiber sa fonction.- (iv) either at least for a ligand or any part of a ligand capable of binding to at least one protein of the proteins defined in (i) or to a fragment of said proteins and / or of inhibiting its function.
40. Composition thérapeutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, un vecteur tel que défini dans la revendication 39 et en ce que ledit gène d'intérêt est placé sous la dépendance d'éléments assurant son expression in vivo.40. Therapeutic or vaccine composition, characterized in that it comprises, inter alia, a vector as defined in claim 39 and in that said gene of interest is placed under the dependence of elements ensuring its expression in vivo.
41 . Matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique ou vaccinale, comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des anticorps, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène codant in vivo pour au moins une protéine ou un fragment d'une protéine choisie parmi les protéines identifiées en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 et/ou SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6 ou codant pour au moins une molécule inhibitrice de la fonction et/ou de la fixation et/ou de l'expression d'au moins une protéine ou d'un fragment de protéine choisie parmi les protéines identifiées en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 et/ou SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6 ou codant pour au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à au moins une protéine ou un fragment de protéines choisie parmi les protéines identifiées en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4 et/ou SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6.41. Biological material for the preparation of a pharmaceutical or vaccine composition, comprising at least one cell, in particular a cell which does not naturally produce antibodies, in a form allowing its administration in a mammalian, human or animal organism, as well as possibly its culture prior, said cell being genetically modified in vitro by at least one nucleic acid sequence containing at least one gene coding in vivo for at least one protein or a fragment of a protein chosen from the proteins identified in SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 and / or SEQ ID NO 5 and / or SEQ ID NO 6 or coding for at least one molecule that inhibits the function and / or the fixation and / or the expression of at least one protein or of a protein fragment chosen from the proteins identified in SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 and / or SEQ ID NO 5 and / or SEQ ID NO 6 or coding for at least one antibody or an antibody fragment able to link to at least one protein or a protein fragment chosen from the proteins identified in SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 and / or SEQ ID NO 5 and / or SEQ ID NO 6.
42. Cellule génétiquement modifiée, en particulier choisie parmi les cellules d'eucaryotes, telles que les cellules COS et CHO et les cellules d'eucaryotes inférieurs, telles que les cellules de levure, en particulier les cellules issues de Saccaromyces cerevisiae et de Pichia pastoris, transformées par au moins une séquence nucléotidique ou un fragment nucléotidique tel que défini dans les revendications 6, 7 et 3 à 5 ou par un vecteur tel que défini dans la revendication 39.42. Genetically modified cell, in particular chosen from eukaryotic cells, such as COS and CHO cells and lower eukaryotic cells, such as yeast cells, in particular cells derived from Saccaromyces cerevisiae and Pichia pastoris , transformed by at at least one nucleotide sequence or a nucleotide fragment as defined in claims 6, 7 and 3 to 5 or by a vector as defined in claim 39.
43. Composition pharmaceutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, une cellule telle que définie dans les revendication 41 et 42.43. Pharmaceutical or vaccine composition, characterized in that it comprises, inter alia, a cell as defined in claims 41 and 42.
44. Procédé d'évaluation d'un agent thérapeutique selon lequel on administre à un animal des doses déterminées, en une dose ou en des doses répétées et à des intervalles de temps déterminés, au moins une des protéines naturelles, recombinantes ou de synthèse ou leurs fragments, ou encore obtenues à partir de plasma ou de sérum, lesdites protéines étant identifiée en SEQ ID NO 2 et/ou SEQ ID NO 4, de préférence SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO 4 et éventuellement au moins une des protéines naturelles, recombinantes ou de synthèse ou leurs fragments, ou encore obtenues à partir de plasma ou de sérum, lesdites protéines étant identifiée en SEQ ID NO 5 et/ou SEQ ID NO 6, de préférence SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 6 et/ou au moins une des protéines naturelles, recombinantes ou de synthèse ou leurs fragments, ou encore obtenues à partir de plasma ou de sérum correspondant à un antigène HBs de type sauvage et/ou à la protéine Pré-S de type sauvage, de préférence l'antigène HBs de type sauvage et la protéine Pré-S de type sauvage, on prélève un échantillon biologique de l'animal, de préférence du sang ou du sérum et on réalise : - (i) un dosage d'anticorps spécifique(s) de la ou desdites protéine(s) ; et/ou44. Method for evaluating a therapeutic agent according to which an animal is administered determined doses, in one dose or in repeated doses and at determined time intervals, at least one of the natural, recombinant or synthetic proteins or their fragments, or alternatively obtained from plasma or serum, said proteins being identified in SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4, preferably SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 4 and optionally at least one of the natural proteins , recombinant or synthetic or their fragments, or also obtained from plasma or serum, said proteins being identified in SEQ ID NO 5 and / or SEQ ID NO 6, preferably SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 6 and / or at least one of the natural, recombinant or synthetic proteins or their fragments, or alternatively obtained from plasma or serum corresponding to a wild type HBs antigen and / or to the wild type Pre-S protein, preferably the wild-type HBs antigen and the wild-type Pre-S protein, a biological sample of the animal, preferably blood or serum, is taken and: - (i) a specific antibody assay (s) ) of said protein (s); and or
- (ii) un dosage de la réponse immune cellulaire induite contre la ou lesdites protéine(s) ou leurs fragments, par exemple par un test d'activation in vitro de celules lymphocytes T « helper » spécifique(s) de la ou desdites protéine(s). - (ii) an assay of the cellular immune response induced against the said protein (s) or their fragments, for example by an in vitro activation test of “helper” T lymphocyte cells specific for the said protein (s) (s).
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