FR2720069A1 - Variants of transforming growth factor-beta proteins - Google Patents

Abstract

Novel derivs. of hormones and growth factors from the transforming growth factor (TGF)- beta superfamily having alterations, deletions and/or mutations in the C-terminal portion that render them inhibitors of the corresp. wild-type TGF beta proteins. Also claimed are: (1) DNA or RNA clones coding for the amino acid sequences of the derivs. above; (2) DNA or RNA mols. capable of hybridising with DNA or RNA mols. of (1); (3) a DNA or RNA mol. coding for a fish activin beta B variant in which Phe-21 is replaced by Ile; (4) recombinant expression or transcription vectors contg. at least part of the DNA or RNA sequences of (1)-(3) under the control of a promoter; and (5) host cells transformed with the vectors of (4).

Description

DERIVES DE FACTEURS DE CROISSANCE ET D'HORMONES DE LA SUPERFAMILLE DES TGFB, PROCEDE POUR LEUR OBTENTION ET
LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES
L'invention a pour objet des dérivés de facteurs de croissance et d'hormones membres de la superfamille des protéines "Transforming Growth Factor
Beta" (TGFB), leur procédé d'obtention et leurs applications biologiques.DERIVATIVES OF GROWTH FACTORS AND HORMONES FROM THE TGFB SUPERFAMILY, PROCESS FOR OBTAINING THEM AND
THEIR BIOLOGICAL APPLICATIONS
The subject of the invention is derivatives of growth factors and member hormones of the "Transforming Growth Factor" protein superfamily.
Beta "(TGFB), their production process and their biological applications.

La superfamille des TGFss regroupe de nombreux membres, initialement isolés grâce à l'activité des différentes hormones/facteurs de croissance. The TGFss superfamily includes many members, initially isolated by the activity of different hormones / growth factors.

Chaque membre peut être classé dans une sousfamille et possède en général plusieurs activités. Each member can be classified in a subfamily and generally has several activities.

Les TGFB, au nombre d'au moins 5, sont capables notamment de stimuler la croissance en milieu gélifié, en présence d'EGF (Epidermal Growth Factor), de certaines lignées fibroblastiques, d'inhiber la croissance d'autres lignées, de faciliter le processus de cicatrisation et d'avoir une activité chimiotactique vis-à-vis des macrophages. The TGFBs, at least 5 in number, are capable in particular of stimulating growth in a gelled medium, in the presence of EGF (Epidermal Growth Factor), of certain fibroblastic lines, of inhibiting the growth of other lines, of facilitating the healing process and to have chemotactic activity vis-à-vis macrophages.

Les activines stimulent la sécrétion de l'hormone FSH par l'hypophyse, mais aussi la différenciation érythrocytaire invitro, la formation de mésoderme chez les Amphibiens et permettent la survie neuronale invitro.  Activins stimulate the secretion of the hormone FSH by the pituitary gland, but also the erythrocyte differentiation invitro, the formation of mesoderm in Amphibians and allow invitro neuronal survival.

Les inhibines inhibent la sécrétion de FSH (follicle stimulating hormone), mais surtout agissent comme des supresseurs de tumeur chez la souris. The inhibins inhibit the secretion of FSH (follicle stimulating hormone), but above all act as tumor suppressors in mice.

Les protéines BMP (Bone Morphogenesis proteins) induisent la formation de cartilage et d'os quand on les implante sous la peau, ont également une activité chimiotactique vis-à-vis des macrophages et stimulent la formation du mésoderme chez les Amphibiens.  Bone Morphogenesis proteins (BMP) induce the formation of cartilage and bone when implanted under the skin, also have chemotactic activity against macrophages and stimulate the formation of mesoderm in Amphibians.

L'hormone anti-mullérienne (MIS) induit la régression des voies génitales femelles chez les
Mammifères et les oiseaux mâles.The anti-Mullerian hormone (MIS) induces the regression of the female genital tract in
Mammals and male birds.

D'autres membres existent comme le gène nodal, impliqué dans le développement précoce de la souris, certains gènes de Drosophile (gène DPP), de Xénopes (gènes Vg ou DVR), ou de poulet (dorsaline). Other members exist such as the nodal gene, involved in the early development of the mouse, certain Drosophila genes (DPP gene), Xenopus genes (Vg or DVR genes), or chicken (dorsalin).

Le regroupement dans la superfamille vient du fait que toutes ces protéines ont un fort degré d'homologie, c'est-à-dire de ressemblance, dans les 120 à 130 acides aminés de leur partie C-terminale. En particulier, cette partie C-terminale, qui correspond à la partie active, comporte pour la plupart 7 cystéines que l'on peut aligner entre les différents membres, et d'autres résidus consensus à des positions précises. Par exemple, l'avant-dernier acide aminé est toujours une cystéine, ainsi que le quatrième acide aminé en partant de l'extrémité terminale. The grouping in the superfamily comes from the fact that all these proteins have a high degree of homology, that is to say of resemblance, in the 120 to 130 amino acids of their C-terminal part. In particular, this C-terminal part, which corresponds to the active part, comprises for the most part 7 cysteines which can be aligned between the different members, and other consensus residues at precise positions. For example, the penultimate amino acid is always a cysteine, as well as the fourth amino acid starting from the terminal end.

Dans le cadre de travaux sur l'étude du rôle de l'activine dans le développement d'embryons, en utilisant comme modèle expérimental le poisson, les inventeurs ont construit de nouveaux dérivés agissant comme variants dominants négatifs. In the context of work on the study of the role of activin in the development of embryos, using fish as an experimental model, the inventors have constructed new derivatives acting as dominant negative variants.

L'invention a donc pour but de fournir de tels dérivés qui sont des variants des produits naturels ou de type sauvage. The invention therefore aims to provide such derivatives which are variants of natural or wild type products.

Elle vise également un procédé permettant de produire ces variants, en particulier de les construire par recombinaison génétique ou de les obtenir par voie de synthèse. It also relates to a process making it possible to produce these variants, in particular to construct them by genetic recombination or to obtain them by way of synthesis.

L'invention vise en outre les applications biologiques de ces variants. The invention further relates to the biological applications of these variants.

Les dérivés selon l'invention de facteurs de croissance et d'hormones de la superfamille des TGFss sont caractérisés en ce qu'il s'agit de variants des produits de type sauvage comportant, dans la partie C-terminale, une ou plusieurs altérations, délétions et/ou mutations, leur conférant des propriétés inhibitrices vis-à-vis des produits de type sauvage. The derivatives according to the invention of growth factors and hormones of the TGFss superfamily are characterized in that they are variants of the wild type products comprising, in the C-terminal part, one or more alterations, deletions and / or mutations, giving them inhibitory properties vis-à-vis wild-type products.

On observera que, du fait des altérations effectuées dans la partie C-terminale, ces variants ne présentent plus l'activité biologique des produits naturels, mais sont toutefois capables d'inhiber l'activité de ces derniers in vitre et invivo, et ce de manière spécifique. It will be observed that, due to the alterations carried out in the C-terminal part, these variants no longer exhibit the biological activity of natural products, but are nevertheless capable of inhibiting the activity of the latter in vitro and invivo, and this of specific way.

L'invention vise en particulier les variants de facteurs de croissance et d'hormones du groupe comprenant les TGFB, activines, protéines BMP, inhibines, hormones antimullériennes, dorsalines. The invention relates in particular to variants of growth factors and of hormones of the group comprising TGFBs, activins, BMP proteins, inhibins, antimulleric hormones, dorsalins.

Ces facteurs de croissance et hormones sont d'origine animale ou humaine. These growth factors and hormones are of animal or human origin.

De manière préférée, ces variants sont dépourvus de la partie N-terminale. Ils correspondent donc à tout ou partie de la région C-terminale des produits de type sauvage, c'est-à-dire la région sécrétée, celle-ci étant toutefois altérée dans les variants comme indiqué ci-dessus. Preferably, these variants are devoid of the N-terminal part. They therefore correspond to all or part of the C-terminal region of the wild-type products, that is to say the secreted region, the latter however being altered in the variants as indicated above.

Selon une disposition avantageuse de l'invention, l'altération, mutation et/ou délétion, de la partie C-terminale concerne au moins un acide aminé conservé dans tous les membres de la superfamille, ou tout au moins dans pratiquement tous les membres. According to an advantageous arrangement of the invention, the alteration, mutation and / or deletion of the C-terminal part relates to at least one amino acid conserved in all the members of the superfamily, or at least in practically all the members.

Cet acide aminé se trouve plus spécialement dans la région qui pourrait être impliquée pour les membres de la superfamille dans l'activation du récepteur ou pourrait être requise pour le couplage de fonctions de liaison et d'activation.  This amino acid is more specifically found in the region which could be involved for the members of the superfamily in the activation of the receptor or could be required for the coupling of binding and activation functions.

Des variants selon cette disposition comportent ainsi une altération affectant un groupe phénylalanine du produit de type sauvage. Variants according to this arrangement thus include an alteration affecting a phenylalanine group of the wild-type product.

De manière préférée, le motif phénylalanine est remplacé par un motif isoleucine, alanine ou sérine ou, en variante est délété. Preferably, the phenylalanine motif is replaced by an isoleucine, alanine or serine motif or, as a variant, is deleted.

On citera des variants d'activine ssA, ssB ou ssAB dans lesquels le motif phénylalanine est remplacé par un motif isoleucine. Mention will be made of activin variants ssA, ssB or ssAB in which the phenylalanine motif is replaced by an isoleucine motif.

Dans l'activine de poisson ssB, le motif phénylalanine altéré occupe la position 21. In ssB fish activin, the altered phenylalanine motif occupies position 21.

On rappelle que les activines actives se présentent sous forme d'homo ou d'hétéro-dimères formés après dimérisation de deux chaînes communes d'activine ss, comme représenté sur la figure 2. It is recalled that the active activins are in the form of homo or hetero-dimers formed after dimerization of two common chains of activin ss, as shown in FIG. 2.

L'invention vise également les clones d'ADN et d'ARNm capables de coder ou de transcrire pour les séquences d'acides aminés des variants définis ci-dessus. The invention also relates to DNA and mRNA clones capable of encoding or transcribing for the amino acid sequences of the variants defined above.

Les séquences de ces ADN et ARN sont caractérisées en ce qu'elles comportent au moins un codon délété ou muté par rapport aux séquences codant pour les hormones et facteurs de croissance de type sauvage. The sequences of these DNAs and RNAs are characterized in that they comprise at least one codon deleted or mutated with respect to the sequences coding for the hormones and growth factors of wild type.

Le ou les codons mutés ou délétés sont tels qu'ils codent pour un ou des acides aminés conférant à la protéine correspondante des propriétés inhibitrices visà-vis de la protéine naturelle. The mutated or deleted codon (s) are such that they code for one or more amino acids which confer on the corresponding protein inhibitory properties with respect to the natural protein.

L'invention vise également les séquences de nucléotides caractérisées en ce qu'elles sont capables de s'hybrider avec celles portant l'information génétique pour coder pour les variants de l'invention et qu'elles portent l'information génétique pour un variant de membres de la superfamille ayant les propriétés inhibitrices soulignées ci-dessus.  The invention also relates to the nucleotide sequences characterized in that they are capable of hybridizing with those carrying the genetic information to code for the variants of the invention and that they carry the genetic information for a variant of members of the superfamily with the inhibitory properties outlined above.

Par l'expression "capables de s'hybrider", on se réfère aux conditions d'hybridation classiques, de préférence aux conditions d'hybridation dans lesquelles la valeur de Tm est de l'ordre de 60"C en milieu 15 mM ENa+). Ces conditions d'hybridation sont le plus généralement des conditions stringentes, avec l'utilisation d'une température de l'ordre de 50"C.  By the expression "capable of hybridizing", we refer to the conventional hybridization conditions, preferably to the hybridization conditions in which the value of Tm is of the order of 60 "C in a medium 15 mM ENa +) These hybridization conditions are most generally stringent conditions, with the use of a temperature of the order of 50 "C.

Entrent également dans le cadre de l'invention, les séquences de nucléotides résultant de la dégénération du code génétique et qui codent pour les variants définis ci-dessus. Also within the scope of the invention are the nucleotide sequences resulting from the degeneration of the genetic code and which code for the variants defined above.

L'invention vise notamment les séquences des gènes codant pour la partie C-terminale des activines, ssB A ou pAB, tel que clonés par PCR à partir d'une banque d'ADN génomique d'une espèce donnée et comportant un ou plusieurs acides aminés mutés ou délétés. The invention relates in particular to the sequences of the genes coding for the C-terminal part of the activins, ssB A or pAB, as cloned by PCR from a genomic DNA library of a given species and comprising one or more acids mutated or deleted amines.

L'invention vise en particulier la séquence d'ADN capable de coder pour la partie C-terminale de 1'activine pB, et comportant un codon ATC codant pour une isoleucine en remplacement du codon TTC codant pour une phénylalanine. The invention relates in particular to the DNA sequence capable of coding for the C-terminal part of the activin pB, and comprising an ATC codon coding for an isoleucine in replacement of the TTC codon coding for a phenylalanine.

Elle vise également tout spécialement les ARN m correspondants. It also specifically targets the corresponding mRNAs.

Les constructions de vecteurs recombinants d'expression ou de transcription font également partie de l'invention. The constructs of recombinant expression or transcription vectors also form part of the invention.

Ces constructions sont caractérisées en ce qu'elles renferment au moins une partie des séquences d'ADN définies ci-dessus sous le contrôle d'un promoteur approprié. These constructs are characterized in that they contain at least part of the DNA sequences defined above under the control of an appropriate promoter.

De même, l'invention vise les cellules hôtes transformées par ces constructions. Il s'agit le plus généralement de cellules d'eucaryotes, de procaryotes ou de bactéries. On citera un système de haute expression comme le virus de la vaccine. Likewise, the invention relates to host cells transformed by these constructions. They are most generally cells of eukaryotes, prokaryotes or bacteria. We can cite a high expression system such as vaccinia virus.

L'invention a également pour objet un procédé de production des variants définis ci-dessus. The subject of the invention is also a process for producing the variants defined above.

Ces variants peuvent être obtenus selon des méthodes classiques de synthèse peptidique en établissant une séquence en acides aminés, plus spécialement de la seule partie C-terminale ou d'une portion de celle-ci, selon la séquence de l'hormone ou du facteur de croissance naturel, et en modifiant ou en délétant à l'endroit souhaité un ou plusieurs des acides aminés. These variants can be obtained according to conventional methods of peptide synthesis by establishing an amino acid sequence, more particularly of the single C-terminal part or of a portion thereof, according to the sequence of the hormone or of the factor. natural growth, and by modifying or deleting in the desired place one or more of the amino acids.

Les variants de l'invention peuvent être également produits par recombinaison génétique en transformant des cellules hôtes à l'aide des constructions de vecteurs d'expression évoquées plus haut et en établissant les conditions de culture appropriées de ces cellules hôtes de manière à obtenir une expression du variant, qui sera ensuite isolé du milieu. The variants of the invention can also be produced by genetic recombination by transforming host cells using the expression vector constructs mentioned above and by establishing the appropriate culture conditions for these host cells so as to obtain expression variant, which will then be isolated from the medium.

On procède par exemple comme suit en insérant 1'ADNc d'un variant dans un plasmide, sous le contrôle d'un promoteur viral. The procedure is for example as follows by inserting the cDNA of a variant into a plasmid, under the control of a viral promoter.

On utilise le fragment de restriction BspHI/Nsil de 1260 pb isolé de 1'ADNc d'un variant (voir le fragment décrit dans les exemples en rapport avec l'activine ssB de poisson). Ce fragment, éventuellement taggé afin d'être reconnu par un anticorps monoclonal (voir référence bibliographique (1) donnée en fin de description), est introduit dans un vecteur tel que le vecteur eucaryote PCMV5 au site EcoRI et PstI pour engendrer un plasmide du type appelé dans les exemples pCpB. Le plasmide est introduit, selon les techniques classiques, dans des cellules hôtes, par exemple des cellules eucaryotes. On citera des cellules humaines comme les cellules COS.  The 1260 bp BspHI / Nsil restriction fragment isolated from the variant cDNA is used (see the fragment described in the examples relating to the fish ssB activin). This fragment, optionally tagged in order to be recognized by a monoclonal antibody (see bibliographic reference (1) given at the end of the description), is introduced into a vector such as the eukaryotic vector PCMV5 at the EcoRI and PstI site to generate a plasmid of the type called in the examples pCpB. The plasmid is introduced, according to conventional techniques, into host cells, for example eukaryotic cells. Mention will be made of human cells such as COS cells.

Par culture de ces cellules, on produit le variant qu'on recueille dans le surnageant. Avec les cellules COS, on opère à environ 37"C pendant 60 heures. By culturing these cells, the variant is produced which is collected in the supernatant. With COS cells, the operation is carried out at approximately 37 "C for 60 hours.

Le milieu de culture dépourvu de sérum est prélevé et utilisé aux fins de purification. Cette étape de purification consiste par exemple en une chromatographie liquide sous haute pression en phase inverse (2). Lorsqu'on utilise des produits taggés, on fait réagir le surnageant avec un anticorps monoclonal pour obtenir le variant sous forme purifiée. The culture medium devoid of serum is removed and used for purification. This purification step consists for example of liquid chromatography under high pressure in reverse phase (2). When using tagged products, the supernatant is reacted with a monoclonal antibody to obtain the variant in purified form.

L'invention fournit ainsi les moyens d'obtenir des inhibiteurs spécifiques pour chacun des membres de la superfamille des TGFB.  The invention thus provides the means of obtaining specific inhibitors for each of the members of the TGFB superfamily.

Etant donné la large distribution des hormones et facteurs de croissance de cette superfamille et leur implication dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, les variants de l'invention présentent un grand intérêt dans de nombreuses applications. Given the wide distribution of the hormones and growth factors of this superfamily and their implication in numerous physiological and pathological processes, the variants of the invention are of great interest in numerous applications.

Les exemples donnés ci-après, en utilisant comme modèle expérimental le poisson, mettent en évidence l'effet inhibiteur spécifique vis-à-vis de l'hormone naturelle d'une activine ssB mutée. The examples given below, using fish as an experimental model, demonstrate the specific inhibitory effect vis-à-vis the natural hormone of a mutated ssB activin.

L'utilisation de ce variant permet d'élucider le rôle de l'activine durant les stades précoces de l'embryogénèse et tout spécialement le rôle de l'activine dans l'induction du mésoderme et la formation de l'axe in vivo. Comme le montrent les résultats obtenus, l'hormone mutée perturbe la formation du mésoderme et de l'axe d'une manière dose-dépendante. The use of this variant makes it possible to elucidate the role of activin during the early stages of embryogenesis and especially the role of activin in the induction of the mesoderm and the formation of the axis in vivo. As the results show, the mutated hormone disrupts the formation of the mesoderm and the axis in a dose-dependent manner.

D'autres travaux ont été effectués avec des hormones ou des facteurs de croissance mutés et/ou délétés sur des cellules de petits mammifères ou encore des cellules humaines, confirmant le pouvoir inhibiteur de ces produits vis-à-vis de ceux de type sauvage.  Other work has been carried out with mutated and / or deleted hormones or growth factors on cells of small mammals or even human cells, confirming the inhibitory power of these products vis-à-vis those of wild type.

Ainsi des tests ont été effectués à l'aide de l'activine ssB mutée sur la différenciation érythroïde ou sur la phosphatase alcaline dans les ostéoblastes. Thus, tests were carried out using activated ssB mutated on erythroid differentiation or on alkaline phosphatase in osteoblasts.

Les variants de l'invention constituent des outils de grand intérêt pour étudier les domaines d'activité des hormones et facteurs de croissance de la superfamille des TGFB.  The variants of the invention constitute tools of great interest for studying the domains of activity of hormones and growth factors of the TGFB superfamily.

Ils sont ainsi utilisables dans des études fonctionnelles et pharmacologiques. They can thus be used in functional and pharmacological studies.

Ils permettent en particulier l'étude des fonctions des hormones et facteurs de croissance dans un système physiologique donné, par analyse de toute perturbation introduite par l'utilisation du variant. They allow in particular the study of the functions of hormones and growth factors in a given physiological system, by analysis of any disturbance introduced by the use of the variant.

Ils sont également utilisables comme agents thérapeutiques des maladies dues à la surexpression d'une de ces hormones ou facteurs de croissance, par exemple dans des leucémies ou des maladies auto-immunes. A titre d'exemple, on citera à cet égard, le lien suggéré entre des néphropathies apparaissant lors de diabètes et la surexpression de TGFss au niveau du rein. They can also be used as therapeutic agents for diseases due to the overexpression of one of these hormones or growth factors, for example in leukemias or autoimmune diseases. By way of example, mention may be made in this connection of the suggested link between nephropathies appearing in diabetics and overexpression of TGFss in the kidney.

La surexpression de ces hormones peut être régulée et/ou contrôlée à l'aide de quantités appropriées et efficaces de variants. The overexpression of these hormones can be regulated and / or controlled using appropriate and effective amounts of variants.

Ces variants qui sont des protéines solubles (injectables), peuvent être administrés au patient selon les voies habituelles, par exemple intrapéritonéale, intramus- culaire, intraveineuse ou par injection souscutanée. Les formes d'administration et doses seront choisies selon le mode d'administration utilisé. These variants, which are soluble proteins (injectable), can be administered to the patient according to the usual routes, for example intraperitoneal, intramuscular, intravenous or by subcutaneous injection. The forms of administration and doses will be chosen according to the mode of administration used.

Les propriétés des variants de l'invention sont également mises avantageusement à profit pour inhiber l'expression de la FSH. The properties of the variants of the invention are also advantageously used to inhibit the expression of FSH.

L'invention vise donc les compositions contraceptives correspondantes contenant une quantité efficace de variant en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable. The invention therefore relates to the corresponding contraceptive compositions containing an effective amount of variant in association with a pharmacologically acceptable excipient.

Ces compositions seront formulées et administrées selon une posologie déterminée, aux fins de contrôle de la reproduction, ou de stérilisation des animaux. These compositions will be formulated and administered according to a determined dosage, for the purposes of reproductive control or sterilization of animals.

Les variants de l'invention constituent également des facteurs de contrôle de la régulation hormonale de la différenciation érythrocytaire. The variants of the invention also constitute factors for controlling the hormonal regulation of erythrocyte differentiation.

Dans cette application, on administre les variants, en association avec un véhicule inerte, sous une forme et selon une posologie appropriées au traitement à effectuer. In this application, the variants are administered, in association with an inert vehicle, in a form and according to a dosage appropriate to the treatment to be carried out.

D'autres applications encore comprennent l'utilisation des variants de l'invention pour bloquer la morphogénèse osseuse ou pour intervenir dans des processus cicatriciels. Still other applications include the use of the variants of the invention to block bone morphogenesis or to intervene in scar processes.

Ils sont également utilisables comme modèles en culture cellulaire. On citera leur application pour contrôler la survie neuronale. They can also be used as cell culture models. We will cite their application to control neuronal survival.

A titre d'exemples, pour illustrer l'invention, on rapporte ci-après des résultats de travaux effectués en utilisant comme modèle expérimental le médaka (Oryzias latipes), ou le danio (Brachydanio rerio), appelé ciaprès le danio. By way of examples, to illustrate the invention, the results of work carried out using the medaka (Oryzias latipes), or the danio (Brachydanio rerio), called below the danio, are reported below.

Ces travaux portent plus particulièrement sur l'élaboration de variants de l'activine ssB, et l'isolement de séquences d'ADN et d'ARN codant pour ces variants. This work relates more particularly to the development of variants of the activin ssB, and the isolation of DNA and RNA sequences coding for these variants.

Ils concernent également l'étude de leur activité et leur utilisation pour démontrer le rôle de 1'activine maternelle comme inducteur dans la formation du mésoderme et de l'axe.  They also relate to the study of their activity and their use to demonstrate the role of maternal activin as an inducer in the formation of the mesoderm and the axis.

Ces résultats peuvent être aisément mis à profit par l'homme de l'art sur d'autres modèles expérimentaux et notamment de Vertébrés supérieurs. These results can be easily used by those skilled in the art on other experimental models and in particular of higher vertebrates.

Plusieurs travaux montrent en effet que les facteurs et mécanismes impliqués dans l'induction embryonnique chez le poisson sont similaires à ceux observés chez les vertébrés supérieurs.Several studies show that the factors and mechanisms involved in embryonic induction in fish are similar to those observed in higher vertebrates.

Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 10, qui représentent respectivement
- la figure 1, la partie C-terminale de séquences d'acides aminés d'activines de différentes espèces, déduites de fragments d'amplification par PCR,
- la figure 2, une représentation schématique d'une activine dimère,
- la figure 3, les résultats d'une analyse électrophorétique se rapportant aux protéines sécrétées à partir d'ovocytes de Xénope, après injection d'ARN de variant,
- la figure 4, une photo d'un transfert de
Northern d'ARNm extraits de calottes de Xénope après incubation avec des surnageants de cultures infectées par 1'ADN codant pour un variant selon l'invention ou pour le produit naturel correspondant,
- la figure 5, les courbes de l'expression relative de l'actinie en fonction du pourcentage variant d'activine/activine naturelle,
- la figure 6, des photos montrant l'hybridation de 1'ARN de calottes de Xénope, après incubation avec des milieux conditionnés pCssBv et pCpBs, avec de 1'ARN de Mix.l et une sonde pour 1'ARN de Ef-la,
- la figure 7, les courbes de l'expression relative de Mix.l en fonction de dilutions d'activine pB,
- la figure 8, l'effet d'un variant de l'invention sur la différenciation de cellules SAOS induite par BMP-4,
- les figures 9A à 9F l'effet d'ARN de variant sur la formation de l'axe chez le médaka, et
- la figure lOA à lOP l'effet obtenu par injection d'ARN de variant sur des marqueurs d'expression de mésoderme et neuronaux chez des embryons de médaka.In these examples, reference is made to FIGS. 1 to 10, which respectively represent
FIG. 1, the C-terminal part of amino acid sequences of activins of different species, deduced from PCR amplification fragments,
FIG. 2, a schematic representation of a dimeric activin,
FIG. 3, the results of an electrophoretic analysis relating to the proteins secreted from Xenopus oocytes, after injection of variant RNA,
- Figure 4, a photo of a transfer of
Northern mRNA extracted from Xenopus caps after incubation with culture supernatants infected with DNA coding for a variant according to the invention or for the corresponding natural product,
FIG. 5, the curves of the relative expression of actinia as a function of the varying percentage of activin / natural activin,
FIG. 6, photos showing the hybridization of the RNA of Xenope caps, after incubation with conditioned media pCssBv and pCpBs, with RNA from Mix.l and a probe for the RNA from Ef-la ,
FIG. 7, the curves of the relative expression of Mix.l as a function of dilutions of activin pB,
FIG. 8, the effect of a variant of the invention on the differentiation of SAOS cells induced by BMP-4,
FIGS. 9A to 9F the effect of variant RNA on the formation of the axis in the medaka, and
- Figure lOA to lOP the effect obtained by injection of variant RNA on mesoderm and neuronal expression markers in medaka embryos.

MATIRIELS ET METHODES plification par PCR et clonage des produits de la PCR. MATERIALS AND METHODS PCR plification and cloning of PCR products.

On utilise des oligonucléotides modifiés, dégénérés. Modified, degenerate oligonucleotides are used.

L'amorce N-terminale est constituée par 1 : 5' GGI (CT) TI GA (AG) TG (CT) GA (CT) GG -3', et l'amorce C-terminale, par l'oligonucléotide 5'- ICC (AG) CA (CT) TC (CT) TC IAC IAT -3'
L'amplification par PCR est réalisée sur 10 ng d'ADN génomique de médaka et de danio.The N-terminal primer is constituted by 1: 5 'GGI (CT) TI GA (AG) TG (CT) GA (CT) GG -3', and the C-terminal primer, by the oligonucleotide 5'- ICC (AG) CA (CT) TC (CT) TC IAC IAT -3 '
The PCR amplification is carried out on 10 ng of genomic DNA from medaka and danio.

Le milieu réactionnel de 50 p1 est constitué par 1 x tampon (1 x = 1 fois concentré) ; 0,2 mM de chacun des composés suivants : dATP, dCTP, dGTP et dTTP ; 4 WM de chaque amorce et 2 U d'ADN polymérase Taq (tel que le produit commercialisé par Cetus). The 50 p1 reaction medium consists of 1 x buffer (1 x = 1 time concentrated); 0.2 mM of each of the following compounds: dATP, dCTP, dGTP and dTTP; 4 WM of each primer and 2 U of Taq DNA polymerase (such as the product marketed by Cetus).

Les réactions sont répétées 35 fois selon un cycle de 1 min. à 92"C, à 43"C et à 72"C dans une machine à PCR à effet Peltier. The reactions are repeated 35 times according to a cycle of 1 min. at 92 "C, 43" C and 72 "C in a Peltier effect PCR machine.

Au cours des cycles 1 à 4, on augmente la température d'hybridation de 37"C à 43"C en ayant recours à des paliers de 37, 39, 41 et 43"C.  During cycles 1 to 4, the hybridization temperature is increased from 37 "C to 43" C using steps of 37, 39, 41 and 43 "C.

Après l'amplification, les réactions sont développées sur un gel 3 + 1% de NuSieve agarose R dans lx TAE (TAE = tris acétate d'EDTA). Le produit de 350 pb est découpé du gel, purifié et TA-cloné dans un vecteur PCR-1000 (Invitrogen). After amplification, the reactions are developed on a 3 + 1% gel of NuSieve agarose R in 1 × TAE (TAE = tris acetate of EDTA). The 350 bp product is cut from the gel, purified and TA-cloned in a vector PCR-1000 (Invitrogen).

Clonage de 1'ADNc entier de 1'activine ssB de danio
On procède au criblage d'une banque d'ADNc préparée à partir d'embryons de danio de 20 à 28 h. On utilise comme sonde l'activine ssB de médaka.Cloning of danio ssB activin whole cDNA
We proceed to the screening of a cDNA library prepared from danio embryos from 20 to 28 h. The medaka ssB activin is used as the probe.

On procède au séquençage d'un clone contenant 3,02 kb d'ADNc dans les deux directions par le biais de délétions induites par l'exonucléase III en utilisant un kit Séquénase R (USB)
Un fragment de 1260pb BspHI/Nsil contenant la région codante complète pour l'activine ssB est sous-cloné dans les sites EcoRI et PstI du vecteur de transcription eucaryotique pCMV5 (3) qui contient une origine de réplication SV40 et le promoteur CMV.Sequencing of a clone containing 3.02 kb of cDNA in both directions is carried out using exonuclease III-induced deletions using a Sequenase R kit (USB)
A 1260 bp BspHI / Nsil fragment containing the complete coding region for ssB activin is subcloned into the EcoRI and PstI sites of the eukaryotic transcription vector pCMV5 (3) which contains an origin of replication SV40 and the promoter CMV.

On génère ainsi des plasmides pCssB comportant la région codante pour une activine ssB.  Plasmids pCssB are thus generated comprising the coding region for an activin ssB.

Ces plasmides sont appelés ci-après pCssBs lorsqu'ils renferment la région codant pour une activine de type de sauvage. These plasmids are hereinafter called pCssBs when they contain the region coding for wild type activin.

Lorsqu'on effectue le sous-clonage d'un fragment muté ou délété selon l'invention, on obtient des plasmides appelés ci-après pCssBv comportant la région codant pour un variant d'activine. When the subcloning of a mutated or deleted fragment according to the invention is carried out, plasmids are obtained hereinafter called pCssBv comprising the region coding for an activin variant.

Pour vérifier l'activité des clones d'activines, des cellules COS sont transfectées selon la méthode au DEAE-Dextrane comme décrit par Sambrook et al (4). To verify the activity of the activin clones, COS cells are transfected according to the DEAE-Dextran method as described by Sambrook et al (4).

Des cellules humaines 293 sont transfectées de manière stable à l'aide de constructions activine-pCMV et d'un plasmide portant un gène de résistance à la néomycine (pNEOBGal, Stratagene) sous sélection G 418 comme décrit par Chen et al (5).  Human 293 cells are stably transfected using activin-pCMV constructs and a plasmid carrying a neomycin resistance gene (pNEOBGal, Stratagene) under G 418 selection as described by Chen et al (5).

Un milieu DMEM dépourvu de sérum est conditionné par les cellules transfectées pendant 60 heures, puis utilisé sur des explants du pôle animal d'embryons de stade 8 de Xénope à une dilution de 1:4 dans lxMMR.  A DMEM medium devoid of serum is conditioned by the transfected cells for 60 hours, then used on explants from the animal pole of Xenope stage 8 embryos at a dilution of 1: 4 in 1 × MMR.

Les cellules SAOS sont traitées avec un surnageant approprié. L'induction de phosphatase alcaline est réalisée dans des essais en quadruple comme décrit par Gray et al (6). SAOS cells are treated with an appropriate supernatant. The induction of alkaline phosphatase is carried out in quadruple tests as described by Gray et al (6).

Mutagenèse dirigée sur un site. constructions de placides et transcriptions in vitro
On effectue une mutagénèse dirigée sur un site d'ADNc de l'activine ssB dans un pBluescript R (Stratagène) en utilisant l'oligonucléotide à effet mutagène 5-TCG ACA TCC GGC TCA T-3. On opère selon
Kunkel (7) à l'aide du kit de mutagénèse BioRad.Site-directed mutagenesis. placid constructs and in vitro transcriptions
Site-directed mutagenesis is carried out at a ssB activin cDNA site in a pBluescript R (Stratagene) using the mutagenic oligonucleotide 5-TCG ACA TCC GGC TCA T-3. We operate according to
Kunkel (7) using the BioRad mutagenesis kit.

Le fragment de 1260 pb BspHI/Nsil mentionné cidessus est ligué dans pSP64T linéarisé par Bgl II.  The 1260 bp fragment BspHI / Nsil mentioned above is ligated into pSP64T linearized with Bgl II.

Injection d'ARN dans des embryons à 2 cellules
On injecte environ 25 fg à 60 pg d'ARNm de variant dans un blastomère ou dans les deux au stade à deux cellules.Injection of RNA into 2 cell embryos
Approximately 25 µg to 60 µg of variant mRNA is injected into a blastomer or both at the two cell stage.

Pour les injections, les embryons sont maintenus dans un milieu physiologique (Ringer pour les médakas), à 18"C, fixés dans un puits d'agar. For injections, the embryos are kept in a physiological medium (Ringer for the medakas), at 18 "C, fixed in an agar well.

L'ARN est dilué dans un tampon Ringer concentré 1 fois, contenant du rouge de phénol (0,1%) et 20 ng/ml d'ARN non poly-adénylé d'embryons de médaka de stade 15. The RNA is diluted in a 1-fold concentrated Ringer buffer, containing phenol red (0.1%) and 20 ng / ml of non-polyadenylated RNA from stage 15 medaka embryos.

Après les injections, les embryons sont transférés dans un incubateur à 27"C et 12 heures après, le milieu est changé pour un milieu contenant 1 % de
NaCl, 0,03 % de KC1, 0,04 % de CaC12, 0,16 % de MgSO4 et 0,0001 % de bleu de méthylène. After the injections, the embryos are transferred to an incubator at 27 "C and 12 hours later, the medium is changed to a medium containing 1% of
NaCl, 0.03% KC1, 0.04% CaCl2, 0.16% MgSO4 and 0.0001% methylene blue.

Injection dans des ovocytes et analyse des protéines
En opérant comme décrit par Krieg et al. (8), on prépare des ovocytes de Xénope auxquels on injecte de 10 à 30 ng d'ARN de variant. On soumet 10 de ces ovocytes à un marquage court dans 50 p1 de milieu OR2 avec 30 pCi de 35S méthionine pendant 2 h.Oocyte injection and protein analysis
By operating as described by Krieg et al. (8), Xenopus oocytes are prepared to which 10 to 30 ng of variant RNA are injected. 10 of these oocytes are subjected to short labeling in 50 μl of OR2 medium with 30 μCi of 35S methionine for 2 h.

Les ovocytes sont ensuite soumis à incubation une nuit dans du milieu OR2 frais. The oocytes are then incubated overnight in fresh OR2 medium.

Les surnageants sont analysés sur un gel de polyacrylamide à 12 % SDS-PAGE et traités pour une autoradiographie. The supernatants are analyzed on a 12% SDS-PAGE polyacrylamide gel and treated for autoradiography.

Analyse d'ARN
L'ARN total est extrait comme décrit par
Sargent et al (9) et analysé par transfert de Northern ou par protection avec de la RNase selon les procédés standards (4).RNA analysis
Total RNA is extracted as described by
Sargent et al (9) and analyzed by Northern blot or by protection with RNase according to standard methods (4).

Isol-it et analyse par RT-PCR de l'ARMm des variants
500 ng d'ARN total sont traités avec de l'ADNase, extraits à l'aide de phénol, précipités et soumis à une transcription inverse en utilisant une amorce d'oligonucléotide dT et 200 U de transcriptase inverse MoMuLV (Gibco-BRL). Les ADNc résultants sont amplifiés par PCR avec l'amorce 5' 5-CGA CAC GGG GGC TTA - 3 et l'amorce 3' : 5-GTA GTA CAG CAT GGA CA-3, spécifiques pour l'activine ssB de médaka.Isol-it and RT-PCR analysis of the ARMm of the variants
500 ng of total RNA are treated with DNAse, extracted with phenol, precipitated and subjected to reverse transcription using a primer of oligonucleotide dT and 200 U of MoMuLV reverse transcriptase (Gibco-BRL). The resulting cDNAs are amplified by PCR with the 5 ′ primer 5-CGA CAC GGG GGC TTA-3 and the 3 ′ primer: 5-GTA GTA CAG CAT GGA CA-3, specific for the medaka ssB activin.

Le milieu de réaction (50 p1) est constitué par 1 x tampon, 0,2 mM de chaque dNTP, 1 pM de chaque amorce et 0,1 U de Taq DNA polymérase (Stehelin). Les réactions sont réalisées en 25 cycles (92"C, 1 min, 52"C, 1 min et 72 C, 1 min), qui comprennent une première étape à 920C sans Taq DNA polymérase.  The reaction medium (50 μl) consists of 1 × buffer, 0.2 mM of each dNTP, 1 μM of each primer and 0.1 U of Taq DNA polymerase (Stehelin). The reactions are carried out in 25 cycles (92 "C, 1 min, 52" C, 1 min and 72 C, 1 min), which include a first step at 920C without Taq DNA polymerase.

Anticorps et im unohistochimie
Pour détecter la chorde dorsale dans les embryons de médaka, on utilise l'anticorps monoclonal
MZ 15 (voir Zanetti et al, (10) ) à une dilution de 10-3.Antibodies and im unohistochemistry
To detect the dorsal chord in medaka embryos, we use the monoclonal antibody
MZ 15 (see Zanetti et al, (10)) at a dilution of 10-3.

Un antisérum monoclonal formé contre l'homologue de danio de la protéine de Brachyurie de souris (protéine T) et dilué à 0,2 x 10-4 pour détecter la protéine T de médaka. A monoclonal antiserum formed against the danio homolog of mouse Brachyuria protein (protein T) and diluted to 0.2 x 10-4 to detect protein T of medaka.

Pour détecter N-CAM de médaka, on utilise l'anticorps monoclonal D-3 (11) qui donne une réaction croisée avec les molécules N-CAM (neuro cell adhesion molecule) de poisson rouge (12) à une dilution de 10-4. To detect N-CAM from medaka, we use the monoclonal antibody D-3 (11) which gives a cross-reaction with the N-CAM molecules (neuro cell adhesion molecule) of goldfish (12) at a dilution of 10-4 .

Les embryons, dépourvus de chorions, sont fixés pour au moins 6 heures avec du paraformaldéhyde (4 %) dans un tampon phosphate 0,1 M à pH 7,4. The embryos, devoid of chorions, are fixed for at least 6 hours with paraformaldehyde (4%) in 0.1 M phosphate buffer at pH 7.4.

Histologie
Les embryons de médaka sont fixés durant environ 14 heures à température ambiante dans du paraformaldéhyde à 4 % dans 1 x PBS. Après avoir éliminé les chorions, les embryons sont déshydratés et traités selon les méthodes histologiques standards comportant la coloration avec de l'hématoxyline et de l'éosine.Histology
Medaka embryos are fixed for approximately 14 hours at room temperature in 4% paraformaldehyde in 1 x PBS. After removing the chorions, the embryos are dehydrated and treated according to standard histological methods, including staining with hematoxylin and eosin.

REsULTLSTS
1) Isolement D'ADNc d'activine de poisson
Les techniques rapportées ci-dessus conduisent à l'isolement de l'ADNc de l'activine ssB de danio et à l'obtention de fragments PCR correspondant à la partie Cterminale des chaînes d'activine de médaka et de danio.RESsULTLSTS
1) Isolation of cDNA from fish activin
The techniques reported above lead to the isolation of the cDNA from danio ssB activin and to obtaining PCR fragments corresponding to the Cminminal part of the activin chains of medaka and danio.

Les séquences des peptides d'activine correspondant aux fragments PCR sont données sur la figure 1. The sequences of the activin peptides corresponding to the PCR fragments are given in FIG. 1.

Sur cette figure, on compare la séquence de l'activine ssB de mammifère (M), SEQ ID N" 1, avec celles, homologues des activines ssB1 et pB2 de Xénope (xl et X2), respectivement SEQ ID N" 2 et N" 3, BB1 et ssB2 de poisson rouge (R1 et R2), respectivement SEQ ID N" 4 et N" 5, de médaka (m) SEQ ID N" 6 et de danio (d), SEQ ID N" 7
Les blancs indiquent les acides aminés identiques, les espaces introduits pour un meilleur alignement sont représentés par un point.In this figure, we compare the sequence of mammalian ssB activin (M), SEQ ID N "1, with those homologous to Xenope ssB1 and pB2 activins (xl and X2), respectively SEQ ID N" 2 and N "3, BB1 and ssB2 of goldfish (R1 and R2), respectively SEQ ID N" 4 and N "5, of medaka (m) SEQ ID N" 6 and of danio (d), SEQ ID N "7
The blanks indicate the identical amino acids, the spaces introduced for better alignment are represented by a point.

Les régions codées par les amorces PCR ne sont pas indiquées. L'ADNc cloné à partir du danio est identique à Zact ssB.  The regions coded by the PCR primers are not indicated. The cDNA cloned from danio is identical to Zact ssB.

La comparaison de ces séquences montre une identité de séquences à 92 % pour les activines ssB de médaka et de danio. The comparison of these sequences shows a 92% sequence identity for the medaka and danio ssB activins.

On constate également une identité globale de 73 % (similarité de 87 %) de l'activine de danio avec celle de mammifère qui comprend tous les résidus conservés lors de l'évolution. There is also a global identity of 73% (similarity of 87%) of danio activin with that of mammal which includes all the residues preserved during evolution.

La protéine codée comprend un peptide signal pour la sécrétion. The encoded protein includes a signal peptide for secretion.

La région tribasique précédant la partie
C-terminale conservée doit servir comme site de processus protéolytique pour libérer le peptide actif carboxy terminal.The tribas region preceding the game
The conserved C-terminal should serve as the site of the proteolytic process to release the active carboxy terminal peptide.

On rapporte sur la figure 2, une représentation schématique d'une activine sous forme dimère. La partie restante du précurseur est hachurée et la partie
C-terminale active ombrée. La région de mutation du variant est indiquée par un cercle.FIG. 2 reports a schematic representation of an activin in dimeric form. The remaining part of the precursor is hatched and the part
C-terminal active shaded. The variant mutation region is indicated by a circle.

2) Mutagénèse
En appliquant la technique de mutagénèse, on remplace dans le fragment de 1260 bp d'ADNc de danio le codon TTC qui code pour la phénylalanine en position 21 de l'activine ssB dans la partie C-terminale, par le codon
ATC, qui code pour une isoleucine. On notera que le motif phénylalanine, conservé comme indiqué plus haut dans toute la superfamille des TGFB, à l'exception des hormones anti-mullériennes, précède le premier domaine a-hélicoloidal considéré comme étant une partie de la surface d'interaction entre le ligand et le récepteur.2) Mutagenesis
By applying the mutagenesis technique, the codon TTC which codes for phenylalanine at position 21 of the activin ssB in the C-terminal part is replaced in the 1260 bp fragment of danio cDNA by the codon
ATC, which codes for an isoleucine. It will be noted that the phenylalanine motif, conserved as indicated above in the entire TGFB superfamily, with the exception of anti-Mullerian hormones, precedes the first α-helicoloidal domain considered to be part of the interaction surface between the ligand. and the receiver.

A moins d'indications contraires, le variant utilisé dans les essais rapportés ci-après correspond à ce variant d'activine ssB comportant un motif isoleucine en position 21. Unless otherwise indicated, the variant used in the tests reported below corresponds to this variant of ssB activin comprising an isoleucine motif in position 21.

3) Analyse de l'activité in vitre du variant de 1 'activine
- étude des protéines sécrétées à partir d'ovocytes de Xénope.3) Analysis of the in vitro activity of the activin variant
- study of proteins secreted from Xenopus oocytes.

L'ARN est transcrit à partir de plasmides pSP64T portant respectivement de l'ADNc d'activine du produit naturel du variant et injecté dans les ovocytes. The RNA is transcribed from pSP64T plasmids carrying respectively activin cDNA from the variant natural product and injected into the oocytes.

Les ovocytes sont soumis à un marquage court en utilisant de la 35S méthionine. Des quantités égales de surnageant sont analysées dans des conditions réductrices (red) et non réductrices (non red) sur un gel SDS-PAGE à 12 % et autoradiographiées (voir figure 3).Oocytes are subjected to short labeling using 35S methionine. Equal amounts of supernatant are analyzed under reducing (red) and non-reducing (non red) conditions on a 12% SDS-PAGE gel and autoradiographed (see FIG. 3).

La taille moléculaire des marqueurs (en kD) est indiquée sur la droite de la figure. The molecular size of the markers (in kD) is indicated on the right of the figure.

L'activine naturelle est sécrétée et traitée par l'ovocyte pour générer un peptide de 15 kD (C-terminal) et un peptide de 41 kD (restant du précurseur) dans des conditions réductrices comme décrit par Huylebroech et al (11) pour l'activine sécrétée à partir de cellules de tissus en culture infectés par le virus de la vaccine. Natural activin is secreted and processed by the oocyte to generate a 15 kD peptide (C-terminal) and a 41 kD peptide (remaining precursor) under reducing conditions as described by Huylebroech et al (11) for l activin secreted from cultured tissue cells infected with vaccinia virus.

Dans des conditions non réductrices, l'espèce de 15 kD est déplacée à 25 kD ce qui est en accord avec la structure dimère de l'activine. Under non-reducing conditions, the 15 kD species is displaced to 25 kD which is in agreement with the dimeric structure of activin.

- transfection de cellules COS et de cellules 293 à l'aide de pCMV5s et de pCMV5v.  - transfection of COS cells and 293 cells using pCMV5s and pCMV5v.

On étudie l'effet de milieux conditionnés dérivés de ces cellules tranfectées sur l'induction du mésoderme chez des explants de pôle animal de Xénope (calottes de Xénope). We study the effect of conditioned media derived from these transfected cells on the induction of the mesoderm in explants of the Xenopus animal pole (Xenopus caps).

On soumet à incubation des calottes de Xénope au stade 8 avec des surnageants de cellules transfectées selon le rapport indiqué avec pCMV5 (témoin), pCssB comportant la région codante de l'activine de type sauvage (ou pCpBs), pCssB comportant la région codante de l'activine du variant (ou pCssBv).  Xenope caps in stage 8 are incubated with transfected cell supernatants according to the ratio indicated with pCMV5 (control), pCssB comprising the coding region of wild-type activin (or pCpBs), pCssB comprising the coding region of variant activin (or pCssBv).

L'incubation est poursuivie jusqu'au stade 17 de l'embryon témoin. Incubation is continued until stage 17 of the control embryo.

L'ARN est extrait des calottes animales selon la méthode de Sargent et al (7) et analysé par transfert de Northern avec une sonde d'a-actine. Comme témoin pour l'induction, on utilise le milieu XTC. Les symboles utilisés sont les suivants : V = variant ; s = produit de type sauvage. The RNA is extracted from animal caps according to the method of Sargent et al (7) and analyzed by Northern blot with an α-actin probe. As control for the induction, the XTC medium is used. The symbols used are: V = variant; s = wild type product.

L'autoradiographie est représentée sur la figure 4. Le milieu XTC correspond à la piste de droite. Autoradiography is shown in Figure 4. The XTC medium corresponds to the right track.

Dans la partie inférieure, on indique le témoin (filtre coloré avec du bleu de méthylène et de 1'ARNn 18S.In the lower part, the control is indicated (filter colored with methylene blue and 18S nRNA.

La figure 5 donne les courbes de l'expression relative de l'actine en fonction du pourcentage variant d'activine/activine sauvage dans la co-transfection. La courbe --W-- correspond à une co-transfection avec pCMV5 + pCssBs, et la courbe -- -- à une co-transfection avec pCssBv + pCpBs. Ces courbes représentent une moyenne de 3 expériences. FIG. 5 gives the curves of the relative expression of actin as a function of the varying percentage of activin / wild-type activin in the co-transfection. The curve --W-- corresponds to a co-transfection with pCMV5 + pCssBs, and the curve - - to a co-transfection with pCssBv + pCpBs. These curves represent an average of 3 experiments.

L'examen de ces résultats montre que les milieux conditionnés provenant de cellules co-transfectées avec les ADN de pCBBs et pCMV5 (rapport 2:1) induisent fortement l'expression de l'actine cardiaque.  The examination of these results shows that the conditioned media originating from cells co-transfected with the DNAs of pCBBs and pCMV5 (ratio 2: 1) strongly induce the expression of cardiac actin.

Le remplacement de pCMV5 par pCssBv (selon le même rapport) conduit au contraire à une inhibition de l'expression de l'actine et à un faible allongement des calottes animales. The replacement of pCMV5 by pCssBv (according to the same report) leads on the contrary to an inhibition of the expression of actin and to a weak elongation of the animal caps.

Lorsqu'on augmente la proportion de variant (plus de 50 %) dans la co-transfection, on obtient un surnageant dépourvu de toute activité inductrice du mésoderme. On observe au contraire une induction significative vis-à-vis du mésoderme avec le témoin correspondant. When the proportion of variant (more than 50%) is increased in co-transfection, a supernatant devoid of any inducing activity of the mesoderm is obtained. On the contrary, a significant induction is observed with respect to the mesoderm with the corresponding control.

Pour déterminer le niveau auquel le variant d'activine interfère avec l'activité de l'activine naturelle, on a mélangé des milieux de cellules transfectées avec soit pCssBs, soit pCssBv et testé leur activité sur l'induction de l'allongement des calottes animales ou 1'ARN de Mix.1. To determine the level at which the activin variant interferes with the activity of natural activin, media of transfected cells were mixed with either pCssBs or pCssBv and tested for their activity on inducing the extension of animal caps. or Mix.1 RNA.

On prépare de 1'ARN à partir de calottes animales incubées dans des milieux conditionnés de cellules 293 transfectées avec pCssBs ou pCssBv ou un mélange des surnageants. L'incubation est effectuée jusqu'au stade 10,5 du témoin (gastrula précoce). RNA is prepared from animal caps incubated in conditioned media of 293 cells transfected with pCssBs or pCssBv or a mixture of the supernatants. Incubation is carried out up to stage 10.5 of the control (early gastrula).

Dans cette expérience, la concentration en surnageant du variant est maintenue constante et le surnageant est mélangé avec différentes dilutions du surnageant de cellules transfectées par pCpBs.  In this experiment, the concentration of variant supernatant is kept constant and the supernatant is mixed with different dilutions of the supernatant of cells transfected with pCpBs.

L'ARN de 2 calottes est hybridé avec une sonde d'ARN de Mit.1 et une sonde pour 1'ARN de Ef-la. On effectue une protection avec une RNase comme décrit dans la partie "Méthodes" ci-dessus. The RNA of 2 caps is hybridized with a RNA probe from Mit.1 and a probe for the RNA from Ef-la. Protection is carried out with RNase as described in the "Methods" section above.

Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 6 où v = variant, s = produit de type sauvage et m = milieu témoin. Les parties supérieures et moyennes correspondent respectivement à une exposition longue (6 h) et à une courte (16 h) du même gel (Mix.1). La partie inférieure montre l'expression de Ef.la. The results obtained are shown in Figure 6 where v = variant, s = wild type product and m = control medium. The upper and middle parts correspond respectively to a long (6 h) and a short (16 h) exposure of the same gel (Mix.1). The lower part shows the expression of Ef.la.

Sur la figure 7, on rapporte les courbes de l'expression relative Mixai en fonction de la dilution de l'active ssB. La courbe --C > - correspond aux expériences avec le milieu et pCssBs, la courbe --#-- à celles avec pCssBv + pCssBs, w à pCssBv et # au milieu témoin. In FIG. 7, the curves of the relative Mixai expression are reported as a function of the dilution of the active ssB. The curve --C> - corresponds to the experiments with the medium and pCssBs, the curve - # - to those with pCssBv + pCssBs, w to pCssBv and # to the control medium.

L'induction est appréciée par rapport à la quantité d'ARN de Ef-la et exprimée par rapport à l'effet maximum observé lorsque les calottes s ont été incubées avec du surnageant de cellules 293 transfectées par pCssB (activine sauvage et témoin). The induction is assessed relative to the amount of Ef-1a RNA and expressed relative to the maximum effect observed when the caps are incubated with supernatant of 293 cells transfected with pCssB (wild-type activin and control).

La courbe représente une moyenne de deux expériences indépendantes. The curve represents an average of two independent experiments.

On constate que le variant d'activine inhibe l'induction par l'activine ssB.  It is found that the activin variant inhibits induction by activin ssB.

La spécificité de l'interaction des variants d'activine avec l'activine naturelle a été analysée en utilisant un autre inducteur potentiel du mésoderme appartenant à la superfamille des TGFB, à savoir BMP-4 de
Xénope. BMP-4 induit la différenciation des cellules de la lignée cellulaire de sarcome ostéogénique SAOS-2 invitro. The specificity of the interaction of activin variants with natural activin was analyzed using another potential inducer of the mesoderm belonging to the TGFB superfamily, namely BMP-4 of
Xenopus. BMP-4 induces the differentiation of cells from the osteogenic sarcoma SAOS-2 invitro cell line.

Des cellules SAOS-2 sont mises à incuber pendant 36 h dans un milieu conditionné obtenu à partir de cellules COS co-transfectées avec une quantité constante d'ADN de variant ou de témoin (pCMV5). Les dilutions de BMP-4 sont indiquées sur la figure 8 ( correspond au variant d'activine, ia à pCMV5, p à
BMP-4 et # aux cellules non traitées).SAOS-2 cells are incubated for 36 h in conditioned medium obtained from COS cells co-transfected with a constant amount of variant or control DNA (pCMV5). The dilutions of BMP-4 are indicated in FIG. 8 (corresponds to the activin variant, ia to pCMV5, p to
BMP-4 and # to untreated cells).

En variante, les milieux conditionnés de cellules COS co-transfectées avec BMP-4 et les variants d'activine ou le témoin (pCMV5) sont mélangés et appliqués aux cellules SAOS dans des conditions identiques. On utilise une quantité constante de variant de témoin et les dilutions indiquées de milieu conditionnés de BMP4. Les surnageants témoins proviennent de cellules COS transfectées respectivement avec pCssBv, pCMVs ou de cellules non traitées. As a variant, the conditioned media of COS cells co-transfected with BMP-4 and the activin variants or the control (pCMV5) are mixed and applied to the SAOS cells under identical conditions. A constant amount of control variant and the indicated dilutions of conditioned medium of BMP4 are used. The control supernatants come from COS cells transfected with pCssBv, pCMVs respectively or from untreated cells.

L'activité de la phosphatase alcaline est donnée en fonction du plasmide utilisé. The activity of alkaline phosphatase is given according to the plasmid used.

La co-expression dans les cellules COS du variant d'activine avec BMP-4 de Xénope n'inhibe pas de manière significative la capacité d'induction de BMP-4 de
Xénope vis-à-vis de la différenciation des cellules SAOS.Co-expression in COS cells of the activin variant with Xenope BMP-4 does not significantly inhibit the BMP-4 induction capacity of
Xenopus vis-à-vis the differentiation of SAOS cells.

Lorsqu'on ajoute les surnageants de pCBBv aux surnageants de cellules transfectées par BMP-4 de Xénope, on n'observe pas d'inhibition de la différenciation des cellules SAOS par BMP-4. When the supernatants of pCBBv are added to the supernatants of cells transfected with Xenope BMP-4, no inhibition of the differentiation of SAOS cells by BMP-4 is observed.

Les variants de l'invention exercent donc une activité spécifique de dominant négatif vis-à-vis de l'activine, mais n'interfèrent pas avec l'activité de
BMP-4.The variants of the invention therefore exert a specific activity of dominant negative with respect to activin, but do not interfere with the activity of
BMP-4.

4) Utilisation de variants de l'invention pour étudier le rôle de l'activine invivo.  4) Use of variants of the invention to study the role of invivo activin.

Effet de 1'ARNm de variant sur la formation de l'axe chez le médaka
On rapporte ci-après les résultats d'expériences effectuées avec l'ARNm du variant mis en oeuvre dans les essais ci-dessus.Effect of variant mRNA on axis formation in the medaka
The results of experiments carried out with the mRNA of the variant used in the above tests are reported below.

Il s'agit dans ces expériences d'étudier le rôle de l'activine dans les processus d'induction du mésoderme et de formation de l'axe. In these experiments, it is a question of studying the role of activin in the processes of induction of the mesoderm and formation of the axis.

A cet effet, on injecte différentes quantités d'ARN du variant dans l'un des deux blastomères d'un embryon de médaka (plus de 1500 embryons ont été utilisés). Les embryons sont conservés à 28"C, puis 32 heures après les injections, on procède aux analyses lorsque les témoins ont terminé la gastrulation et se trouvent au stade somite 12. To this end, different amounts of variant RNA are injected into one of the two blastomers of a medaka embryo (more than 1,500 embryos have been used). The embryos are stored at 28 "C, then 32 hours after the injections, analyzes are carried out when the controls have finished gastrulation and are in the somite 12 stage.

Les résultats obtenus sont donnés sur les figures 9A à 9F, où
- la figure 9A représente les calottes animales obtenues après injection de 500 fg d'ARN du variant,
- la figure 9B correspond à une coupe histologique des calottes de la figure 9A, montrant une structure de type blastula,
- la figure 9C montre le phénotype obtenu de manière prédominante avec un calotte avec structure et une structure de type somite (indiquée par la tête de la flèche) lorsqu'on injecte des quantités intermédiaires d'ARN de variant (100 fg)
- la figure 9D la perte des structures antérieures induite par l'injection de faibles quantités d'ARN du variant (25 fg),
- la figure 9E, représente, à titre de comparaison, un embryon témoin n'ayant pas reçu d'injection, et
- la figure 9F une coupe transversale de la région du tronc de l'embryon témoin.The results obtained are given in FIGS. 9A to 9F, where
FIG. 9A represents the animal caps obtained after injection of 500 μg of RNA of the variant,
FIG. 9B corresponds to a histological section of the caps of FIG. 9A, showing a structure of the blastula type,
- Figure 9C shows the phenotype obtained predominantly with a cap with structure and a somite type structure (indicated by the head of the arrow) when injecting intermediate amounts of variant RNA (100 fg)
FIG. 9D the loss of the anterior structures induced by the injection of small amounts of RNA of the variant (25 fg),
FIG. 9E represents, for comparison, a control embryo which has not received an injection, and
- Figure 9F a cross section of the trunk region of the control embryo.

Dans les embryons qui reçoivent des quantités injectées élevées (500 fg) d'ARN de synthèse du variant, appelés embryons à taux élevé de variant, le phénotype observé est uniforme. In embryos which receive high injected quantities (500 fg) of variant synthetic RNA, called embryos with a high variant rate, the phenotype observed is uniform.

Après 32 heures, toutes les cellules de l'embryon sont localisées à un pôle de la membrane vitelline formant une calotte complètement non structurée. After 32 hours, all the cells of the embryo are located at a pole of the vitelline membrane forming a completely unstructured cap.

Aucun axe évident n'apparaît formé comme le montre la figure 9A. No obvious axis appears formed as shown in Figure 9A.

Par vidéo-microscopie, on constate que lorsque les témoins commencent à gastruler, les cellules des blastulas à teneur élevée en variant ne montrent aucun mouvement évident de gastrulation. Les cellules de ces embryons sont encore vivantes, le bleu de méthylène contenu dans le milieu étant efficacement rejeté par les embryons. Le taux d'embryons morts n'augmente pas de manière significative (figure 9A). L'analyse histologique révèle seulement deux types de cellules - une seule couche de cellules avec des noyaux plats
couvrant le vitellus, et - une région multicouche (la calotte) composée d'une
population plutôt uniforme de cellules rappelant des
blastomères non différenciés. (figure 9B).By video microscopy, it is found that when the controls begin to gastrulate, the cells of the blastulas with a high content of variant do not show any obvious movement of gastrulation. The cells of these embryos are still alive, the methylene blue contained in the medium being effectively rejected by the embryos. The rate of dead embryos does not increase significantly (Figure 9A). Histological analysis reveals only two types of cells - a single layer of cells with flat nuclei
covering the yolk, and - a multilayer region (the cap) composed of a
rather uniform population of cells reminiscent of
undifferentiated blastomers. (Figure 9B).

La réduction de la quantité d'ARN du variant injectée (100 fg) conduit à un déplacement du phénotype prédominant. The reduction in the amount of RNA of the variant injected (100 fg) leads to a shift in the predominant phenotype.

La plupart des embryons (55 %) forment alors quelques structures du type somites (figure 9C "calotte avec structure"). Most of the embryos (55%) then form some somite-type structures (Figure 9C "cap with structure").

Bien qu'on n'observe aucun signe de formation propre de l'axe dans ces embryons, des dérivés du mésoderme comme les cellules de globules rouges sont observés de façon importante après une incubation à long terme des embryons avec le variant. Although there is no evidence of proper axis formation in these embryos, derivatives of the mesoderm such as red blood cell are observed significantly after long-term incubation of the embryos with the variant.

Les embryons dans lesquels on a injecté 25 fg d'ARN de variant (embryons à faible teneur en variant) expriment des structures morphologiques distinctes. Embryos injected with 25 fg of variant RNA (low variant embryos) express distinct morphological structures.

Le phénotype le plus important dans ce groupe (figure 9D) ("axe réduit", 48 % de tous les embryons ayant reçu une injection, figure 9A) contient un axe avec des défauts évidents dans la partie antérieure, tel qu'un manque de tête ou d'yeux et de cerveau à l'avant ou au milieu. The most important phenotype in this group (Figure 9D) ("reduced axis", 48% of all embryos given an injection, Figure 9A) contains an axis with obvious defects in the anterior part, such as a lack of head or eyes and brain in the front or in the middle.

Une fraction mineure d'embryons à faible teneur en variant montre la formation de deux queues.  A minor fraction of low variant embryos shows the formation of two tails.

En résumé, l'injection d'ARN du variant conduit à une perte progressive, dose-dépendante, des structures axiales. In summary, the injection of RNA of the variant leads to a progressive, dose-dependent loss of the axial structures.

On observe une gamme plutôt étroite de phénotypes chez les embryons auxquels on a injecté une quantité donnée d 'ARN.  A fairly narrow range of phenotypes is observed in embryos to which a given amount of RNA has been injected.

Effet de l'ARNm de variant sur l'expression de marqueurs du mésoderme et neuronaux chez le médaka
Pour affiner l'analyse phénotypique et histologique, on utilise des anticorps reconnaissant de manière spécifique les structures du mésoderme.Effect of variant mRNA on the expression of mesoderm and neuronal markers in the medaka
To refine the phenotypic and histological analysis, antibodies are used which specifically recognize the structures of the mesoderm.

On effectue les analyses sur des embryons de médaka auxquels on injecte différentes quantités d'ARN de variant (voir les trois photos du bas de la figure 10 où la quantité injectée est indiquée sur la droite), ou bien sur lesquels on n'effectue aucune injection (voir les deux photos dans la partie supérieure). On récupère les embryons après 32 h à 28"C (les embryons ayant reçu des injections et les embryons témoins sont représentés sur les figures 9 D, E et F), ou après 24 h (figure 10A), 16 heures (figure 10B) ou 18 heures (figure 10C). Les embryons sont soumis à un traitement de fixation et traités pour immunocoloration avec les anticorps (indiqués en haut). The analyzes are carried out on medaka embryos to which different amounts of variant RNA are injected (see the three photos at the bottom of FIG. 10 where the amount injected is indicated on the right), or else on which no injection (see the two photos at the top). The embryos are recovered after 32 h at 28 "C (the embryos which have received injections and the control embryos are represented in FIGS. 9 D, E and F), or after 24 h (FIG. 10A), 16 hours (FIG. 10B) or 6 pm (Figure 10C) The embryos are subjected to a fixation treatment and treated for immunostaining with the antibodies (indicated above).

On utilise l'anticorps monoclonal MZ15 qui permet d'identifier la notochorde, dérivé dorsal du mésoderme.  The monoclonal antibody MZ15 is used which identifies the notochord, a dorsal derivative of the mesoderm.

Une coloration dans l'embryon de type sauvage est d'abord détectée après 24 heures dans la notochorde ombilical postérieure (figure 10A, D). Staining in the wild type embryo is first detected after 24 hours in the posterior umbilical notochord (Figure 10A, D).

La protéine de brachyurie (protéine T), exprimée immédiatement lorsqu'on induit le mésoderme chez les amphibiens et le poisson, est utilisée comme marqueur général du mésoderme.  The brachyuria protein (protein T), expressed immediately when the mesoderm is induced in amphibians and fish, is used as a general marker of the mesoderm.

Son modèle d'expression dans les embryons de médaka de type sauvage (figure 9B, E), étudié avec un anti-sérum s'avère très voisine de celle décrite pour le danio. Its expression model in wild type medaka embryos (FIG. 9B, E), studied with an anti-serum, turns out to be very close to that described for danio.

Les embryons à teneur élevée en variant n'expriment pas de manière décelable d'antigène MZ15 ou de protéine T (figure 10G, H). High variant variant embryos do not detectably express MZ15 antigen or T protein (Figure 10G, H).

Dans les "calottes avec structure", les anticorps MZ15 et de protéine T marquent des cellules apparaissant dans une chorde reliée. Contrairement aux résultats obtenus avec des embryons normaux, cette coloration est presque exclusivement détectée à la surface de l'embryon plutôt qu'à l'intérieur (figure lOn,
J, L), ce qui suggère que du mésoderme a été différencié sans être capable de gastruler à l'intérieur de l'embryon.In "caps with structure", antibodies MZ15 and protein T mark cells appearing in a connected chord. Contrary to the results obtained with normal embryos, this staining is almost exclusively detected on the surface of the embryo rather than inside (figure lOn,
J, L), suggesting that mesoderm has been differentiated without being able to gastrulate inside the embryo.

Quelques embryons avec le variant (expériences 32 h après l'injection) ressemblent à des gastrulas retardées (50 % d'épibolie). Some embryos with the variant (experiments 32 h after the injection) resemble delayed gastrulas (50% epibolia).

Cependant, aucun d'eux n' exprime de protéine T sous forme d'anneau complet comme on l'observe habituellement dans les gastrulas à 50 % d'épibolie (figure 9B). However, none of them express T protein in the form of a complete ring as is usually observed in gastrulas with 50% epibolia (FIG. 9B).

Les embryons à faible teneur en variant avec un axe réduit, dans la plupart des cas, montrent une expression de protéine T "antérieure" à la formation du tronc de l'axe (figure 10 0), ce qui suggère que la partie antérieure de l'embryon a acquis un caractère postérieur suite à l'expression du variant. Low variant variant embryos with a reduced axis, in most cases, show expression of T protein "anterior" to the formation of the axis trunk (Figure 10 0), suggesting that the anterior part of the embryo has acquired a posterior character following the expression of the variant.

Ces résultats permettent de conclure que l'injection d'ARN de variant inhibe de manière efficace l'induction du mésoderme chez les embryons de médaka.  These results make it possible to conclude that the injection of variant RNA effectively inhibits the induction of the mesoderm in medaka embryos.

Dans une autre série d'expériences, on a étudié l'effet de l'ARNm du variant sur l'induction neuronale chez le médaka. In another series of experiments, the effect of the variant mRNA on neuronal induction in the medaka was studied.

On utilise à cet effet un anticorps monoclonal donnant une réaction croisée avec N-CAM de poisson rouge (anticorps monoclonal D3 (10)). A monoclonal antibody is used for this purpose, giving a cross-reaction with N-CAM of red fish (monoclonal antibody D3 (10)).

Dans les embryons naturels, D3 détecte l'expression de N-CAM à la surface des cellules du tissu neuronal
Les résultats obtenus sont donnés sur les figures 10G à 10 O. Les embryons avec des calottes (figures 10G, M, I) n'expriment pas l'antigène MZ15 ou la protéine T mais exprimant une faible teneur en N-CAM dans un petit amas de cellules (voir flèche).In natural embryos, D3 detects the expression of N-CAM on the surface of neural tissue cells
The results obtained are given in FIGS. 10G to 10 O. The embryos with caps (FIGS. 10G, M, I) do not express the MZ15 antigen or the T protein but expressing a low N-CAM content in a small cluster of cells (see arrow).

Les embryons avec des calottes avec structure expriment les trois marqueurs de manière désorganisée. Embryos with structured caps express the three markers in a disorganized fashion.

On notera que le marqueur est exprimé à la surface de l'embryon (flèche dans figure lOL). La tête de la flèche dans la figure 10L montre une structure rappelant la carène neurale. Les embryons "à axe réduit" sont donnés sur les figures 10N, O, P. Note that the marker is expressed on the surface of the embryo (arrow in figure lOL). The head of the arrow in Figure 10L shows a structure reminiscent of the neural hull. The "reduced axis" embryos are given in FIGS. 10N, O, P.

N-CAM apparaît tout d'abord au stade neurula dans la carène neurale. Dans les embryons plus âgés, le système nerveux central est coloré (figure 10 C, F). N-CAM first appears at the neurula stage in the neural carina. In older embryos, the central nervous system is colored (Figure 10 C, F).

N-CAM est exprimé dans seulement 55 % des embryons à forte teneur en variant (figure 10 I, l'expression de N-CAM est indiquée par la flèche). N-CAM is expressed in only 55% of embryos with a high variant content (Figure 10 I, the expression of N-CAM is indicated by the arrow).

Dans les embryons avec le variant, on observe clairement une expression de N-CAM dans les cellules organisées à la manière de tissus (figure 10 M). In the embryos with the variant, an expression of N-CAM is clearly observed in the cells organized in the manner of tissues (FIG. 10 M).

Les embryons à faible teneur en variant avec un axe réduit montrent une expression abondante de N-CAM (figure 10P).  Embryos with low variant content with a reduced axis show abundant expression of N-CAM (Figure 10P).

Ainsi, bien qu'on observe une expression accrue de N-CAM dans les embryons ayant reçu des injections de faibles quantités d'ARN de variant, l'injection de quantités élevées d'ARN de variant ne conduit pas, comme on aurait pu s'y attendre, à la formation de grande quantité de tissu neuronal. Thus, although an increased expression of N-CAM is observed in embryos which have received injections of small quantities of variant RNA, the injection of high quantities of variant RNA does not lead, as one could have 'expect it, the formation of large amount of neural tissue.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1/ Basler K. et al, Cell, 73, 685-701, 1993. BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES 1 / Basler K. et al, Cell, 73, 685-701, 1993.

2/ Schmelzer C.H. et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1039, 135-141, 1990.2 / Schmelzer C.H. et al., Biochimica and Biophysica Acta, 1039, 135-141, 1990.

3/ Andersson S. et al, J. Biol. Chem.264:8222-8229, 1989.3 / Andersson S. et al, J. Biol. Chem. 264: 8222-8229, 1989.

4/ Sambrook J. et al, Molecular Cloning : A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York, 1989.4 / Sambrook J. et al, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York, 1989.

5/ Chen C. et al, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752, 1987.5 / Chen C. et al, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752, 1987.

6/ Gray K. et al, Proc Nat. Acad. Sci USA 84:6267-6271, 1987.6 / Gray K. et al, Proc Nat. Acad. Sci USA 84: 6267-6271, 1987.

7/ Kunkel T.A., Proc. Natal. Acad. Sci. USA 82: 488-492, 1985.7 / Kunkel T.A., Proc. Native. Acad. Sci. USA 82: 488-492, 1985.

8/ Krieg P.A., et al, Nucl. Acids Res. 12:7057-7070, 1984.8 / Krieg P.A., et al, Nucl. Acids Res. 12: 7057-7070, 1984.

9/ Sargent T.D. et al, Dev. Biol. 114: 238-246, 1986.9 / Sargent T.D. et al, Dev. Biol. 114: 238-246, 1986.

10/ Zanetti M. et al, J. Cell Biol. 101:53-59, 1985.10 / Zanetti M. et al, J. Cell Biol. 101: 53-59, 1985.

11/ Schlosshauer B. J. Neurochem 52:82-92, 1989.11 / Schlosshauer B. J. Neurochem 52: 82-92, 1989.

12/ Blastmeyer M. et al, Development 108:299-311, 1990.12 / Blastmeyer M. et al, Development 108: 299-311, 1990.

13/ Huylebroeck et al, Mol. Endocrinol 4: 1153-1165, 1990. 13 / Huylebroeck et al, Mol. Endocrinol 4: 1153-1165, 1990.

LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE (INSERM)
(B) RUE: 101 rue de Tolbiac
(C) VILLE: PARIS
(D) PROVINCE: FRANCE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75654
(ii) TITRE DE L' INVENTION: DERIVES DE FACTEURS DE
CROISSANCE ET D'HORMONES DE LA SUPERFAMILLE DES TGFB, PROCEDE
POUR LEUR OBTENTION ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 7
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 100 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
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1 5 10 15
Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro Thr Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr
20 25 30
Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala
35 40 45
Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn Gln Tyr Arg Met Arg Gly Leu
50 55 60
Asn Pro Gly Thr Val Asn Ser Cys Cys Ile Pro Thr Lys Leu Ser Thr 65 70 75 80
Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp
85 90 95
Val Pro Asn Met
100 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 100 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
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Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ala Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr
20 25 30
Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala
35 40 45
Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn Gln Tyr Arg Met Arg Gly Leu
50 55 60
Asn Pro Gly Thr Val Asn Ser Cys Cys Ile Pro Thr Lys Leu Ser Thr 65 70 75 80
Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp
85 90 95
Val Pro Asn Met
100 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 100 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Thr Asn Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe Tyr Val Asp Phe Arg Leu Ile 1 5 10 15
Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ala Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr
20 25 30
Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala
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Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp
85 90 95
Val Pro Asn Met
100 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 101 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Asn Gly Gly Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe Tyr Ile Asp Phe Arg Leu 1 5 10 15
Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile lie Ala Pro Ala Gly Tyr Tyr Gly Asn
20 25 30
Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Met Ala Gly Val Pro Gly Ser
35 40 45
Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn Gln Tyr Arg Met Arg Gly
50 55 60
Ile Ser Pro Gly Ser Val Asn Ser Cys Cys île Pro Thr Lys Leu Ser
65 70 75 80
Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Ile Val Lys Arg
85 90 95
Asp Val Pro Asn Met
100 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 101 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
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Asn Gly Gly Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe Tyr Ile Asp Phe Arg Leu
1 5 10 15 île Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ala Gly Tyr Tyr Gly Asn
20 25 30
Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Phe Leu Ala Gly Val Pro Gly Ser
35 40 45
Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn Gln Tyr Arg Met Arg Gly
50 55 60
Met Ser Pro Gly Thr Ser Asn Ser Cys Cys Ile Pro Thr Lys Leu Ser 65 70 75 80
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85 90 95
Asp Val Pro Asn Met
100 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
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His Gly Gly Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe Tyr île Asp Phe Arg Ile
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20 25 30
Tyr Cys Gln Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Met Ala Gly Val Pro Gly Ser
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50 55 60
Met Asn Thr Gly Ser Val Ser Ser Cys Cys Ile Pro Thr Lys Leu Ser 65 70 75 80
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85 90 95
Asp Val Pro Asn Met
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(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 101 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
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Asn Gly Gly Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe Tyr Ile Asp Phe Arg Leu
1 5 10 15 île Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ala Gly Tyr Tyr Gly Asn
20 25 30
Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Met Ala Gly Val Pro Gly Ser
35 40 45
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50 55 60
Met Ser Pro Gly Ser Val Asn Ser Cys Cys île Pro Thr Lys Leu Ser 65 70 75 80
Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Ile Ile Lys Arg
85 90 95
Asp Val Pro Asn Met
100 LIST OF SEQUENCES (1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSITOR:
(A) NAME: NATIONAL RESEARCH INSTITUTE
SCIENTIST (INSERM)
(B) STREET: 101 rue de Tolbiac
(C) CITY: PARIS
(D) PROVINCE: FRANCE
(E) COUNTRY: FRANCE
(F) POSTAL CODE: 75654
(ii) TITLE OF THE INVENTION: DERIVATIVES OF FACTORS
GROWTH AND HORMONES OF THE TGFB SUPERFAMILY, PROCESS
FOR THEIR OBTAINING AND THEIR BIOLOGICAL APPLICATIONS
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 7
(iv) COMPUTER-READABLE FORM:
(A) TYPE OF SUPPORT: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25
(EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 100 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
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Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala
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Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp
85 90 95
Val Pro Asn Met
100 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 100 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Thr Asn Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe Tyr island Asp Phe Arg Leu island
1 5 10 15
Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ala Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr
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Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp
85 90 95
Val Pro Asn Met
100 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 100 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Thr Asn Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe Tyr Val Asp Phe Arg Leu Ile 1 5 10 15
Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ala Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr
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85 90 95
Val Pro Asn Met
100 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 101 amino acids
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100 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 101 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(zi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Asn Gly Gly Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe Tyr Ile Asp Phe Arg Leu
1 5 10 15 Gly Trp Asn Island Asp Trp Ile Ala Pro Ala Gly Tyr Tyr Gly Asn
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Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Phe Leu Ala Gly Val Pro Gly Ser
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Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Val Lys Arg Island
85 90 95
Asp Val Pro Asn Met
100 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 101 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
His Gly Gly Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe Tyr île Asp Phe Arg Ile
1 5 10 15
Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ala Pro Ala Gly Tire Tyr Tyr Gly Asn
20 25 30
Tyr Cys Gln Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Met Ala Gly Val Pro Gly Ser
35 40 45 Ser Ser Phe Island His Thr Ala Val Val Asn Gln Tyr Arg Arg Island Gly
50 55 60
Met Asn Thr Gly Ser Val Ser Ser Cys Cys Ile Pro Thr Lys Leu Ser 65 70 75 80
Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Ile Val Lys Arg
85 90 95
Asp Val Pro Asn Met
100 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 101 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Asn Gly Gly Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe Tyr Ile Asp Phe Arg Leu
1 5 10 15 Gly Trp Asn Island Asp Trp Ile Ala Pro Ala Gly Tyr Tyr Gly Asn
20 25 30
Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Met Ala Gly Val Pro Gly Ser
35 40 45
Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn Gln Tyr Arg Met Arg Gly
50 55 60
Met Ser Pro Gly Ser Val Asn Ser Cys Cys Île Pro Thr Lys Leu Ser 65 70 75 80
Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Ile Lys Arg
85 90 95
Asp Val Pro Asn Met
100

Claims (22)

REVENDICATIONS 1. Dérivés de facteurs de croissance et d'hormones de la superfamille des TGFB, caractérisés en ce qu'il s'agit de variants des produits de type sauvage comportant, dans la partie C-terminale, une ou plusieurs altérations, délétions et/ou mutations, leur conférant des propriétés inhibitrices vis-à-vis des produits de type sauvage. 1. Growth factor and hormone derivatives of the TGFB superfamily, characterized in that they are variants of the wild type products comprising, in the C-terminal part, one or more alterations, deletions and / or mutations, giving them inhibitory properties towards wild type products. 2. Dérivés selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit de variants de facteurs de croissance et d'hormones du groupe comprenant les TGFB, activines, protéines BMP, inhibines, hormones antimullériennes, dorsalines. 2. Derivatives according to claim 1, characterized in that they are variants of growth factors and hormones of the group comprising TGFB, activins, BMP proteins, inhibins, antimuller hormones, dorsalins. 3. Dérivés selon la revendication 2, caractérisés en ce que les facteurs de croissance et hormones sont d'origine animale ou humaine. 3. Derivatives according to claim 2, characterized in that the growth factors and hormones are of animal or human origin. 4. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus de la partie 4. Derivatives according to one of claims 1 to 3, characterized in that they are devoid of the part N-terminale.N-terminal. 5. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que l'altération, mutation ou délétion, de la partie C-terminale concerne au moins un acide aminé conservé dans tous les membres de la superfamille ou tout au moins dans pratiquement tous les membres. 5. Derivatives according to one of claims 1 to 4, characterized in that the alteration, mutation or deletion, of the C-terminal part relates to at least one amino acid conserved in all the members of the superfamily or at least in practically all the members. 6. Dérivés selon la revendication 5 dans lesquels l'altération concerne un groupe phénylalanine du produit de type sauvage. 6. Derivatives according to claim 5 in which the alteration relates to a phenylalanine group of the wild type product. 7. Dérivés selon la revendication 6, caractérisés en ce que le motif phénylalanine est remplacé par un motif isoleucine, alanine ou sérine, ou est délété.  7. Derivatives according to claim 6, characterized in that the phenylalanine motif is replaced by an isoleucine, alanine or serine motif, or is deleted. 8. Dérivés selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'il s'agit de variants d'activine ssA, ssB ou ssAB.  8. Derivatives according to claim 5, characterized in that they are activin variants ssA, ssB or ssAB. 9. Dérivés selon la revendication 8, caractérisés en ce qu'il s'agit de variants d'activine de poisson ssB dans lesquels le motif phénylalanine en position 21 est remplacé par un motif isoleucine. 9. Derivatives according to claim 8, characterized in that they are ssB fish activin variants in which the phenylalanine motif at position 21 is replaced by an isoleucine motif. 10. Clones d'ADN ou d'ARN, caractérisés en ce qu'ils sont capables de coder ou de transcrire pour les séquences d'acides aminés des variants selon l'une des revendications 1 à 9. 10. DNA or RNA clones, characterized in that they are capable of coding or transcribing for the amino acid sequences of the variants according to one of claims 1 to 9. 11. Molécules d'ADN ou d'ARN capables de s'hybrider avec celles portant l'information génétique pour coder pour les variants selon l'une des revendications 1 à 9. 11. DNA or RNA molecules capable of hybridizing with those carrying genetic information to code for the variants according to one of claims 1 to 9. 12. Molécule d'ADN ou d'ARN capable de coder pour le variant selon la revendication 9. 12. DNA or RNA molecule capable of coding for the variant according to claim 9. 13. Vecteurs recombinants d'expression ou de transcription, caractérisés en ce qu'ils renferment au moins une partie des séquences d'ADN ou d'ARN selon les revendications 10 à 12, sous le contrôle d'un promoteur. 13. Recombinant expression or transcription vectors, characterized in that they contain at least part of the DNA or RNA sequences according to claims 10 to 12, under the control of a promoter. 14. Les cellules hôtes transformées par les vecteurs selon la revendication 13. 14. The host cells transformed by the vectors according to claim 13. 15. Procédé d'obtention des variants selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par la mise en oeuvre de techniques de synthèse peptidique, comprenant l'enchaînement d'acides aminés donnés, dans l'ordre souhaité, ou en variante, par recombinaison génétique, comprenant l'utilisation d'une séquence d'ADN mutée, comportant l'information génétique pour coder pour la séquence d'acides aminés recherchée, l'insertion de cette séquence dans un vecteur, l'expression du vecteur dans une cellule hôte et la récupération du variant exprimé, soumis si on le désire à au moins une étape de purification. 15. Method for obtaining variants according to one of claims 1 to 9, characterized by the use of peptide synthesis techniques, comprising the chain of given amino acids, in the desired order, or as a variant, by genetic recombination, comprising the use of a mutated DNA sequence, comprising the genetic information to code for the desired amino acid sequence, the insertion of this sequence into a vector, the expression of the vector in a host cell and the recovery of the expressed variant, subjected if at least to a purification step. 16. Application des variants selon l'une des revendications 1 à 9 en tant qu'inhibiteurs des facteurs de croissance et hormones correspondants naturels. 16. Application of the variants according to one of claims 1 to 9 as inhibitors of growth factors and corresponding natural hormones. 17. Application selon la revendication 16 pour des études fonctionnelles de facteurs de croissance et hormones de la superfamille des TGFB.  17. Application according to claim 16 for functional studies of growth factors and hormones of the TGFB superfamily. 18. Application selon la revendication 16, comme agents thérapeutiques pour réguler et/ou contrôler la surexpression d'une hormone ou d'un facteur de croissance. 18. Use according to claim 16, as therapeutic agents for regulating and / or controlling the overexpression of a hormone or a growth factor. 19. Application selon la revendication 16, comme compositions contraceptives. 19. Use according to claim 16, as contraceptive compositions. 20. Application selon la revendication 16, pour le contrôle de la régulation hormonale de la différenciation érythrocytaire. 20. Application according to claim 16, for controlling the hormonal regulation of erythrocyte differentiation. 21. Application selon la revendication 16, dans des processus cicatriciels ou pour bloquer la morphogénèse osseuse. 21. Use according to claim 16, in scar processes or to block bone morphogenesis. 22. Application selon la revendication 16, comme modèle de culture cellulaire, par exemple pour le contrôle de la survie neuronale.  22. Application according to claim 16, as a model of cell culture, for example for the control of neuronal survival.