KR100885545B1 - A polypeptide inhibiting RANK, pharmaceutical composition comprising the same, method of inhibiting osteoclast differentiation, a method of treating or preventing a disease caused by differentiation or activation of osteoclast, nucleic acid encoding the polypeptide, vector comprising the nucleic acid and a host cell transformed with the vector - Google Patents

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KR100885545B1 KR1020070037155A KR20070037155A KR100885545B1 KR 100885545 B1 KR100885545 B1 KR 100885545B1 KR 1020070037155 A KR1020070037155 A KR 1020070037155A KR 20070037155 A KR20070037155 A KR 20070037155A KR 100885545 B1 KR100885545 B1 KR 100885545B1
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Abstract

본 발명은 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드, 그를 포함하는 약학적 조성물, 그를 이용한 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법 및 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 그를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포를 제공한다.The present invention provides a polypeptide having RANK inhibitory activity, a pharmaceutical composition comprising the same, a method for inhibiting osteoclast differentiation of an individual using the same, and a method for treating or preventing a disease caused by the differentiation and activation of osteoclasts, Provided are nucleic acids, vectors comprising said nucleic acids, and host cells.

RANK, 파골세포 RANK, osteoclast

Description

ＲＡＮＫ 저해 활성을 갖는 폴리펩티드, 그를 포함하는 약학적 조성물, 그를 이용한 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법 및 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 그를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포{A polypeptide inhibiting RANK, pharmaceutical composition comprising the same, method of inhibiting osteoclast differentiation, a method of treating or preventing a disease caused by differentiation or activation of osteoclast, nucleic acid encoding the polypeptide, vector comprising the nucleic acid and a host cell transformed with the vector}Polypeptides having RANK inhibitory activity, pharmaceutical compositions comprising the same, methods for inhibiting osteoclast differentiation of individuals using the same, and methods for treating or preventing diseases caused by differentiation and activation of osteoclasts, nucleic acids encoding the same A polypeptide inhibiting RANK, pharmaceutical composition comprising the same, method of inhibiting osteoclast differentiation, a method of treating or preventing a disease caused by differentiation or activation of osteoclast, nucleic acid encoding the polypeptide, vector comprising the nucleic acid and a host cell transformed with the vector}

도 1은 인간과 생쥐의 RANK 세포질 내 꼬리 부위의 RANK 저해 활성을 나타내는 영역 (A) 및 세포 투과성 서열과 연결된 융합 펩티드 (B)를 나타내는 도면이다.1 is a diagram showing a region (A) showing RANK inhibitory activity of the tail region in the RANK cytoplasm of humans and mice and a fusion peptide (B) linked to a cell permeable sequence.

도 2는 생쥐 골수에서 분리한 파골 전구세포가 RANKL 처리에 의한 파골세포로 분화되는 과정에서 RANK 저해 펩티드의 효과를 농도 별도 처리하여 TRAP 염색한 사진 (B) 및 분화정도를 측정한 그래프 (B)이다. 분화 정도는 액틴 고리가 완전히 형성된 파골세포를 세 번의 독립된 실험결과에서 평균 (mean) 값을 얻었고, 이에 대한 표준편차를 도표로 나타내었다. 도 2B에서, No of TRAP+ OCL는 TRAP 양성 파골세포의 수를 나타낸다. FIG. 2 is a graph illustrating the differentiation of the effect of RANK inhibitory peptides in the process of differentiating osteoclast progenitor cells from mouse bone marrow into osteoclasts by RANKL treatment (B) and a graph measuring the degree of differentiation. to be. The degree of differentiation of the osteoclasts in which the actin rings were completely formed was obtained from the mean of three independent experiments, and the standard deviations were plotted. In FIG. 2B, No of TRAP + OCL represents the number of TRAP positive osteoclasts.

도 3은 실험군 융합 펩티드 1-6 (A)과 대조군 융합 펩티드 1-6 (B)의 구성을 나타내는 도면이다. Fig. 3 shows the structure of the experimental group fusion peptide 1-6 (A) and the control group fusion peptide 1-6 (B).

도 4는 실험군 융합 펩티드 1-6과 대조군 융합 펩티드 1-6이 파골세포 분화에 미치는 영향을 TRAP 염색한 사진 (A) 및 분화정도를 측정한 그래프 (B)를 나타낸다. 분화정도는 융합 펩티드 1-6을 처리한 시료를 각각 독립된 3회의 실험에서 액틴 고리를 완전한 형태로 가지고 있는 파골세포 수를 얻어 평균값을 구하고 이에 대한 표준편차를 도표로 나타내었다. 도 4에서, TRAP+ OCL #는 TRAP 양성 파골세포의 수를 나타낸다. Figure 4 shows a TRAP stained picture (A) and the graph (B) measuring the degree of differentiation of the effects of experimental group fusion peptide 1-6 and control group fusion peptide 1-6 on osteoclast differentiation. The degree of differentiation was obtained from the samples treated with the fusion peptides 1-6 in three independent experiments. The average number of osteoclasts with the complete actin ring was obtained, and the standard deviations were plotted. In FIG. 4, TRAP + OCL # represents the number of TRAP positive osteoclasts.

도 5는 서열번호 8의 세포 투과성 RANK 저해 펩티드가 활성화된 파골세포의 뼈 흡수 활성을 억제하는 것을 나타내는 사진 (A) 및 그 정도를 정량화한 그래프 (B)이다. 뼈 흡수 정도는 뼈 흡수 측정 배양 용기인 OAASTM((주)오스코텍: 한국)의 전체 면적에서 흡수된 면적의 비를 서로 다른 3회의 실험으로 평균 (mean) 값을 구하고 이에 대한 표준편차를 구해서 나타내었다. 도 5에서 Control은 대조군을 나타내고, Mt-1 및 WT-1은 각각 서열번호 14와 8의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 나타낸다. 5 is a photograph (A) and a graph (B) quantifying the extent that the cell-permeable RANK inhibitory peptide of SEQ ID NO: 8 inhibits bone resorption activity of activated osteoclasts. The degree of bone resorption is the average of the absorbed area of the total area of OAAS TM (Oscotec Co., Ltd.), a bone resorption culture vessel. It was. In Figure 5 Control represents a control, Mt-1 and WT-1 represents a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and 8, respectively.

도 6은 세포투과성 RANK 저해 펩티드가 파골세포에서 액틴 고리 형성을 억제하는 것을 나타내는 사진이다. 도 6에서 Mt-1 및 WT-1은 각각 서열번호 14와 8의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 나타낸다. Figure 6 is a photograph showing that the cell permeable RANK inhibitory peptide inhibits actin ring formation in osteoclasts. In FIG. 6, Mt-1 and WT-1 represent peptides having amino acid sequences of SEQ ID NOs: 14 and 8, respectively.

도 7은 RANKL 또는 LPS (리포폴리사카리드) 주입에 의해 생쥐에서 발생되는 뼈의 파괴를 세포 투과성 RANK 저해 펩티드가 억제함을 보여주는 사진 (A) 및 그 정도를 정량한 그래프 (B)이다. 상기 그래프의 정량화는 두개관의 종단면의 전체 면적에서 흡수한 면적의 비율로 하였다. 흡수 면적이란 뼈 구조 내 골수강 (marrow cavity)의 면적을 의미하며 이 면적의 증가 또는 억제 정도를 대조군과 비교하여 정량화하였다. 서로 다른 6개 시료를 통해서 평균 (mean) 값을 얻고 이에 대한 표준 편차를 구하였다. 대조군을 1로 하였을 때, RANKL 또는 LPS 주입에 의해서는 골구강의 파괴가 증가하여 대조군 1 보다 큰 값을 나타내며, RANKL 저해 펩티드 처리에 의해서도 대조군 수준으로 감소됨을 확인하였다. FIG. 7 is a photograph (A) showing a cell permeable RANK inhibitory peptide inhibits the destruction of bone in mice by RANKL or LPS (lipopolysaccharide) injection and a graph (B) quantifying the extent thereof. Quantification of the graph was made by the ratio of the area absorbed from the total area of the longitudinal section of the cranial tube. Absorption area means the area of the bone marrow cavity (marrow cavity) in the bone structure and the increase or inhibition of this area was quantified by comparison with the control. Mean values were obtained from six different samples and standard deviations were calculated. When the control group was set to 1, the destruction of bone oral cavity was increased by RANKL or LPS injection, which was higher than that of the control group 1, and it was confirmed that the control group also decreased to the control level by the RANKL inhibitory peptide treatment.

본 발명은 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드, 그를 포함하는 약학적 조성물, 그를 이용한 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법 및 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 그를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포에 관한 것이다. The present invention provides a polypeptide having RANK inhibitory activity, a pharmaceutical composition comprising the same, a method for inhibiting osteoclast differentiation of an individual using the same, and a method for treating or preventing a disease caused by the differentiation and activation of osteoclasts, It relates to a nucleic acid, a vector comprising the nucleic acid and a host cell.

뼈는 우리 몸을 지탱하고 신체 장기를 보호하는 중추기관이다. 아울러 신체 기능에 필수적인 무기질의 저장소 역할을 한다. 뼈 세포는 콜라겐 단백질과 무기질로 이루어진 뼈 성분을 만들어내는 조골세포 (osteoblast)와 그 성분을 녹이는 파골세포 (osteoclast)로 이루어져 있다. 이들 두 세포는 뼈의 파괴와 형성의 재형성 (bone remodeling) 과정을 담당하며 두 세포 간의 상호 평형은 건강한 뼈 형성에 필수적이다. Bones are the central organs that support our bodies and protect our organs. It also acts as a reservoir for minerals that are essential for body function. Bone cells are composed of osteoblasts, which produce bone components consisting of collagen proteins and minerals, and osteoclasts, which dissolve the components. These two cells are responsible for bone destruction and bone remodeling, and mutual equilibrium between the two cells is essential for healthy bone formation.

Imunex 사 연구자들은 수지상 세포 (dendritic cell)의 새로운 유전자를 탐색하는 과정에 RANK (receptor activator of NF-kB)로 명명된 새로운 TNF (tumor necrosis factor) 계열의 수용체를 클로닝하였다. 동시에 RANK에 대한 리간드로서 RANKL (RANK ligand)을 클로닝하였다.Imunex researchers cloned a new tumor necrosis factor (TNF) family of receptors called the receptor activator of NF-kB (RANK) in the search for new genes in dendritic cells. At the same time RANKL (RANK ligand) was cloned as ligand for RANK.

뼈 생물학을 연구하는 생명과학자들의 오랜 난제 중의 하나는 파골세포의 분화인자를 찾는 일이었다. 1990년대 초에 일본 Suda 그룹에 의해 두개관 (calvaria)에서 분리한 조골세포와 파골 전구세포 (osteoclast precursor)의 공동배양 (co-culture) 시, 비타민 D3와 프로스타글랜딘 E2의 자극에 의해 파골세포가 분화된다는 사실로부터 분화인자는 조골세포에서 유래될 가능성이 처음으로 제시되었다. 1997년 미국의 Amgen 사 연구자들은 새로운 TNF 계열의 수용체를 탐색하는 과정에 OPG (osteoprotegerin) 라는 세포 밖으로 분비되는 수용체를 발견하고 형질전환 생쥐를 이용 OPG의 과발현 시, 뼈의 밀도가 증가함을 알게 되었다. 이들은 OPG에 결합하는 리간드로서 OPGL (OPG ligand)을 클로닝하였다. OPGL은 Immunex 사 연구자들이 클로닝한 RANKL과 일치하는 사이토카인이었으며, 조골세포와의 공동배양법이 아닌 파골 전구세포 단독으로 존재할 경우라도 OPGL 처리에 의해 파골세포의 분화가 가능하게 되었다.One of the longest challenges for life scientists studying bone biology has been to find osteoclast differentiation factors. During co-culture of osteoblasts and osteoclast precursors isolated from calvaria by Japanese Suda group in the early 1990s, osteoclasts were stimulated by vitamin D3 and prostaglandin E2. From the fact that the cells differentiated, it was first suggested that the differentiation factor could be derived from osteoblasts. In 1997, Amgen researchers in the United States discovered a receptor secreted out of the cell called osteoprotegerin (OPG) in the search for a new TNF family of receptors and found that bone density increased when overexpression of OPG using transgenic mice. . They cloned OPGL (OPG ligand) as a ligand that binds to OPG. OPGL was a cytokine consistent with RANKL cloned by Immunex researchers, and it was possible to differentiate osteoclasts by OPGL treatment even if they existed alone in osteoclast progenitors rather than in coculture with osteoblasts.

파골세포 분화 인자로서 판명된 RANKL의 기능은 유전자 결손 (knock-out) 생쥐를 이용한 실험 결과, 심각한 골석회증 (osteopetrosis)을 나타내었고 치아 돌출 (tooth eruption)이 일어나지 않았으며 생쥐의 발육이 저해되었다. 이와 같은 표현 형은 RANKL 수용체 (RANK)의 유전자 결손 생쥐에서 그대로 재현됨으로써 조골세포/기질세포에서 만들어진 RANKL과 파골 전구세포에 존재하는 수용체 (RANK) 간의 상호작용이 파골세포 분화에 절대적임이 입증되었다.RANKL's function as an osteoclast differentiation factor showed severe osteopetrosis, no tooth eruption and inhibition of mouse development as a result of experiments using knock-out mice. . These phenotypes were reproduced in mice with a genetically deficient RANKL receptor (RANK), demonstrating that the interaction between RANKL produced in osteoblast / stromal cells and the receptor (RANK) present in osteoclast progenitor cells is crucial for osteoclast differentiation.

RANKL 수용체 RANK는 CD40와 가장 유사한 TNF 수용체 패밀리에 속한다. RANK는 비장, 림프절, 골수에서 유래된 수지상 세포, 활성화된 T 임파구, 파골 전구세포, 성숙된 파골세포, 콘드로사이트 (chondrocyte) 등에서 발현된다. RANK의 세포질내 꼬리 (cytoplasmic tail)에는 잘 알려진 신호 모티프 (signaling motif)가 없는 점으로 미루어 어떤 연결 (adaptor) 단백질이 신호전달에 관여할 것으로 추정되고 실제로 TRAF (TNF receptor-associated factor) 계열의 단백질이 결합하며 그들 가운데 TRAF6가 수용체 하류의 파골세포 분화 신호 전달에 가장 중요함이 알려져 있다.RANKL receptor RANK belongs to the TNF receptor family most similar to CD40. RANK is expressed in the spleen, lymph nodes, dendritic cells derived from bone marrow, activated T lymphocytes, osteoclast progenitors, mature osteoclasts, chondrocytes and the like. RANK's cytoplasmic tail lacks a well-known signaling motif, suggesting that some adator protein is involved in signaling and is actually a family of TRAF (TNF receptor-associated factor) families. It is known that TRAF6 among them is most important for signaling of osteoclast differentiation downstream of the receptor.

파골세포와 조골세포의 상호작용에 의한 뼈의 재형성 과정은 노화, 호르몬 이상, 염증 등의 작용에 의해 그 항상성을 잃게 된다. 그 결과 성인의 경우 40세 이후에 뼈의 형성보다 파괴가 우세하게 되며 여성의 경우에는 폐경기 이후, 에스트로젠 호르몬이 분비되지 않음에 따라 전체 여성의 3 분의 1 이상에서 골밀도 손실이 심각한 골다공증이 빈발하게 된다. 또한 면역계의 이상으로 발생하는 만성염증은 연골과 뼈의 파괴를 유발하는 류마티스 관절염의 주요 원인으로 인식되고 있다. 이러한 과정 중에 공통적으로 발생하는 뼈의 손실 (파괴)에는 파골세포가 주 원인세포이며 파골세포의 분화에는 RANKL과 그 수용체인 RANK의 작용이 필수적이다. 따라서 파골세포 분화 제어는 골다공증을 비롯한 관절염 치료제 개발의 핵심 전략이 다.The bone remodeling process by the interaction of osteoclasts and osteoblasts loses their homeostasis due to aging, hormonal abnormalities, and inflammation. As a result, in adults, destruction is superior to bone formation after age 40. In women, postmenopausal, estrogen hormones are not secreted. do. Chronic inflammation caused by abnormalities of the immune system is also recognized as a major cause of rheumatoid arthritis that causes cartilage and bone destruction. Osteoclasts are the main causative cells for bone loss (destruction) that commonly occur during this process, and RANKL and its receptor, RANK, are essential for osteoclast differentiation. Thus, controlling osteoclast differentiation is a key strategy for developing osteoarthritis and other arthritis drugs.

미국 Amgen 사는 RANKL에 대한 인간화 단일클론항체 (humanized monoclonal antibody)인 Denosumab을 개발하여 골다공증, 관절염, 호르몬 이상에 의한 뼈 손실, 유방암의 뼈 전이에 의한 파괴 등에 대한 질환에 임상시험을 진행 중에 있다. 또한, 미국특허 제6,998,383호에는 TRAF6 결합 도메인을 포함하는 TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6)에 의하여 매개되는 신호절단을 억제하는 폴리펩티드가 개시되어 있다. Amgen, USA, has developed Denosumab, a humanized monoclonal antibody against RANKL, and is conducting clinical trials on diseases such as osteoporosis, arthritis, bone loss caused by hormonal abnormalities, and destruction by bone metastasis of breast cancer. In addition, US Pat. No. 6,998,383 discloses polypeptides that inhibit signal cleavage mediated by TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) comprising a TRAF6 binding domain.

본 발명자들은 파골세포 분화를 제어하는 새로운 방법을 개발하여 뼈의 파괴에 작용하는 기능을 규명하고자 예의 연구 노력한 결과, RANK의 작용을 억제하는 펩티드들을 개발하게 되었다. 이들 펩티드는 RANKL에 의한 파골세포 분화의 억제, RANKL에 의한 활성화된 파골세포의 뼈 파괴 작용의 억제, RANKL에 의한 파골 전구세포의 세포융합의 억제, RANKL에 의한 파골세포 내 액틴 (actin) 단백질의 고리 형성의 억제 및 생쥐에 RANKL의 주입에 의해 발생하는 뼈 파괴 과정의 억제 및 리포폴리사카리드 (LPS)의 주입에 의해 유발되는 뼈 파괴 과정을 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors have intensively researched and developed a new method of controlling osteoclast differentiation to identify a function that acts on bone destruction, and as a result, peptides that inhibit the action of RANK have been developed. These peptides can be used to inhibit osteoclast differentiation by RANKL, inhibition of bone destruction by activated osteoclasts by RANKL, inhibition of cell fusion of osteoclast progenitor cells by RANKL, and inhibition of actin protein in osteoclasts by RANKL. The present invention was completed by confirming that inhibition of ring formation and the bone destruction process caused by the injection of RANKL into mice and the bone destruction process caused by the injection of lipopolysaccharide (LPS) can be suppressed. .

따라서, 본 발명의 목적은 RANK를 표적으로 하는 신규 RANK 저해 펩티드를 제공하는 것이다.  Accordingly, it is an object of the present invention to provide novel RANK inhibitory peptides targeting RANK.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩티드를 포함하는, 뼈 파괴를 유발하는 질병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease causing bone destruction, comprising the peptide.

본 발명의 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 이용한 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법 및 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting osteoclast differentiation of an individual using the pharmaceutical composition and a method for treating or preventing a disease caused by the differentiation and activation of osteoclasts.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩티드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the peptide, a vector comprising the nucleic acid, and a host cell.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택되는 6 내지 12개의 연속 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 4번 내지 9번 아미노산 서열을 포함하는, RANK (receptor activator of NF-kB) 저해 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. The present invention is a polypeptide consisting of 6 to 12 consecutive amino acid sequences selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, comprising the amino acid sequence 4 to 9 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: RANK (receptor activator of NF- kB) provides a polypeptide having inhibitory activity.

상기 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 4로 구성되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 4의 폴리펩티드는 각각 12, 10, 8 및 6개의 아미노산으로 구성되며, 각각 서열번호 1의 4번 내지 9번 아미노산 서열 (IIVVYV : 서열번호 4)을 포함한다. 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, RANK 유도된 활성을 저해하는 활성을 가진 폴리펩티드는 모두 IIVVYV (서열번호 4) 도메인을 포함하고 있었으며 (예를 들면, 서열번호 1 내지 4, 및 서열번호 8 내지 11), IIVVYV (서열번호 4) 도메인으로부터 각각 하나의 아미노산이 제거되어 5개 아미노산으로 구성된 IVVYV (서열번호 5) 및 IIVVY (서열번호 6) 서열 및 이들이 세포투과성 서열에 연결된 폴리펩티드 (서열번호 12 및 13)는 RANK 유도된 활성을 저해하는 활성을 가지고 있지 않았다. 또한, IIVVYV (서열번호 4) 도메인 및 이를 포함하는 서열 중에서 IIVVYV (서열번호 4) 도메인의 2번 및 3번 아미노산 서열 IV를 LA로 치환하여 얻어지는 폴리펩티드 (서열번호 14 내지 19)도 RANK 유도된 활성을 저해하는 활성을 가지고 있지 않았다. 따라서, 본원 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 4번 내지 9번 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택되는 6 내지 12개의 연속 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드는 어느 것이든지 포함된다. 비록 본원의 실시예에는 아미노산의 수가 6,8,10 및 12개로 이루어진 폴리펩티드만이 예시적으로 기재되어 있으나, 당업자라면 이들 내용으로부터 실시예에 기재되어 있지 않은 서열번호 1의 아미노산 서열의 4번 내지 9번 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택되는 6 내지 12개의 연속 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드도 동일한 활성을 가지고 있는 것으로 당연히 이해할 수 있는 것이다 The polypeptide having RANK inhibitory activity may be selected from the group consisting of polypeptides consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4. The polypeptides of SEQ ID NOs: 1 to 4 are composed of 12, 10, 8, and 6 amino acids, respectively, and include amino acid sequences 4 to 9 of SEQ ID NO: 1 (IIVVYV: SEQ ID NO: 4), respectively. As described in the Examples herein, polypeptides with activity that inhibit RANK induced activity all contained IIVVYV (SEQ ID NO: 4) domains (eg, SEQ ID NOs: 1-4, and SEQ ID NOs: 8-11). ), IVVYV (SEQ ID NO: 5) and IIVVY (SEQ ID NO: 6) sequences consisting of five amino acids, each of which has one amino acid removed from the IIVVYV (SEQ ID NO: 4) domain, and the polypeptides that are linked to the cell permeable sequence (SEQ ID NOs: 12 and 13) ) Did not have activity that inhibits RANK induced activity. In addition, polypeptides obtained by substituting amino acid sequences IV and II of IIVVYV (SEQ ID NO: 4) domain with LA in the IIVVYV (SEQ ID NO: 4) domain and the sequences including the same (SEQ ID NOS: 14 to 19) are also RANK induced activity It did not have activity to inhibit. Accordingly, the polypeptide of the present invention comprises amino acid sequence 4 to 9 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and any polypeptide consisting of 6 to 12 consecutive amino acid sequences selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 do. Although in the examples herein, only polypeptides consisting of 6, 8, 10 and 12 amino acids are exemplarily described, those of ordinary skill in the art will appreciate from 4 to 4 of the amino acid sequence of SEQ ID NO. A polypeptide comprising the amino acid sequence of 9 and consisting of 6 to 12 consecutive amino acid sequences selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is naturally understood to have the same activity.

본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드는, 세포 투과성 폴리펩티드가 연결된 것일 수 있다. 상기 세포 투과성 폴리펩티드는 상기 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 것일 수 있다. 바람직하게는, N 말단에 연결된 것이다.  The polypeptide having RANK inhibitory activity of the present invention may be a cell permeable polypeptide linked thereto. The cell permeable polypeptide may be linked to the N terminus or C terminus of the polypeptide having the RANK inhibitory activity. Preferably, it is connected to the N terminal.

본 발명에 있어서, "세포 투과성 폴리펩티드"란 세포막 투과성을 가지고 있어 그와 융합된 융합 파트너를 세포 내로 전달하는 기능을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 세포 투과성 폴리펩티드는 당업계에 널리 알려져 있으며, 본 발명에는 당업계에 알려진 임의의 세포 투과성 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포 투과성 폴리펩티드는 리더 신호 서열인 것일 수 있다. 상기 리더 신 호 서열은 예를 들면, 카포시 섬유아세포 성장인자 신호서열, HIV-1 tat (48-60), D-아미노산 치환된 HIV-1 tat (48-60), 아르기닌 치환된 HIV-1 tat (48-60), 드로소필라 안테나피디아 (Drosophila Antennapaedia)(43-58), 7 개 이상의 아미노산을 포함하는 바이러스 RNA 결합 펩티드, 7개 이상의 아르기닌을 포함하는 DNA 결합 펩티드 및 6 내지 8개 아르기닌을 갖는 폴리아르기닌 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 바이러스 RNA 결합 펩티드는 HIV-1 rev (34-50), HTLV-II rev (4-16), 브롬 모자이크 바이러스 Gag (7-25) 및 플록 하우스 바이러스 코트 단백질 (35-49)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 DNA 결합 펩티드는 인간 c-Fos (139-164), 인간 c-Jun (252-279), 및 효모 전사 인자 GCN4 (231-252)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. In the present invention, the term "cell permeable polypeptide" means a polypeptide having cell membrane permeability and having a function of delivering a fusion partner fused therewith into a cell. Such cell permeable polypeptides are well known in the art, and any cell permeable polypeptide known in the art can be used. For example, the cell permeable polypeptide may be a leader signal sequence. The leader signal sequence is, for example, Kaposi fibroblast growth factor signal sequence, HIV-1 tat (48-60), D-amino acid substituted HIV-1 tat (48-60), arginine substituted HIV-1 tat (48-60), Drosophila Antennapaedia (43-58), viral RNA binding peptides comprising 7 or more amino acids, DNA binding peptides comprising 7 or more arginine and 6-8 arginine It may be selected from the group consisting of polyarginine polypeptide having, but is not limited to these examples. The viral RNA binding peptide is from the group consisting of HIV-1 rev (34-50), HTLV-II rev (4-16), Bromine Mosaic Virus Gag (7-25) and Flock House Virus Coat Protein (35-49) It may be selected. In addition, the DNA binding peptide may be selected from the group consisting of human c-Fos (139-164), human c-Jun (252-279), and yeast transcription factor GCN4 (231-252).

본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 폴리펩티드는 또한, 서열번호 7의 인간 전사 인자 Hph-1의 세포 투과성 폴리펩티드인 것일 수 있다. In the present invention, the cell penetrating polypeptide may also be a cell penetrating polypeptide of human transcription factor Hph-1 of SEQ ID NO: 7.

본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드는, 서열번호 7의 인간 전사 인자 Hph-1의 세포 투과성 폴리펩티드가 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택되는 6 내지 12개의 연속 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 4번 내지 9번 아미노산 서열을 포함하는, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드의 N 말단에 연결되어 있는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 서열번호 8 내지 11의 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이다.The polypeptide having RANK inhibitory activity of the present invention is a polypeptide in which the cell permeable polypeptide of human transcription factor Hph-1 of SEQ ID NO: 7 is composed of 6 to 12 consecutive amino acid sequences selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: It is preferable to be connected to the N terminus of the polypeptide which has RANK inhibitory activity containing amino acid sequence 4-9 of the amino acid sequence of 1. Most preferably, it is selected from the group consisting of the polypeptides of SEQ ID NOs: 8-11.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. The present invention also provides a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease caused by differentiation and activation of osteoclasts, comprising a polypeptide having RANK inhibitory activity according to the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

상기 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드에 대하여는 전술한 바와 같다. 상기 폴리펩티드는 인간 또는 생쥐의 RANK의 세포질 내 꼬리 영역에서 유래한 것이다. 상기 폴리펩티드는 인간 RNAK 아미노산 서열의 546-551의 IIVVYV (서열번호 4) 서열을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 RANKL (RANK-ligand)에 의한 파골세포 분화의 억제, RANKL에 의한 활성화된 파골세포의 뼈 파괴 작용의 억제, RANKL에 의한 파골 전구세포의 세포융합의 억제, RANKL에 의한 파골세포 내 액틴 (actin) 단백질의 고리 (ring) 형성의 억제, 및 생쥐에 RANKL의 주입에 의하여 발생하는 뼈 파괴 과정의 억제 및 생쥐에 리포폴리사카리드 (lipopolysaccharide: LPS)의 주입에 의해 유발되는 뼈 파괴 과정의 억제 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 용도로서 사용될 수 있다.The polypeptide having the RANK inhibitory activity is as described above. The polypeptide is derived from the tail region in the cytoplasm of RANK in humans or mice. The polypeptide comprises the IIVVYV (SEQ ID NO: 4) sequence of 546-551 of the human RNAK amino acid sequence. The pharmaceutical composition of the present invention is inhibiting osteoclast differentiation by RANKL (RANK-ligand), inhibition of bone destruction activity of activated osteoclasts by RANKL, inhibition of cell fusion of osteoclast progenitor cells by RANKL, by RANKL Inhibition of ring formation of actin protein in osteoclasts, inhibition of the bone destruction process caused by the injection of RANKL in mice, and injection of lipopolysaccharide (LPS) in mice Has inhibitory activity in the process of bone destruction. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a use for treating or preventing a disease caused by the differentiation and activation of osteoclasts.

상기 약학적으로 허용가능한 담체에는, 희석제, 부형제, 붕해제, 결합제, 및 활택제 등이 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 조성물이 주사제인 경우, 멸균 수나 생리적 조건에 적합한 버퍼 (예, PBS)가 담체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구 및 비경구형 제형으로 제조될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용가능한"이란 개체에 투여되는 경우 알러지 또는 원하지 않은 반응을 유발하지 않는 것을 의미한다. 활성 성분으로서 단백질을 포 함하는 수성 조성물을 제조하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. The pharmaceutically acceptable carrier may include, but is not limited to, diluents, excipients, disintegrants, binders, glidants, and the like. For example, when the composition of the present invention is an injection, a sterile water or buffer suitable for physiological conditions (eg PBS) may be used as the carrier. The compositions of the present invention can be prepared in oral and parenteral formulations. By "pharmaceutically acceptable" is meant that it will not cause an allergic or unwanted reaction when administered to a subject. It is well known in the art to prepare aqueous compositions comprising proteins as active ingredients.

당업자라면 과도한 실험 없이, 본 발명의 조성물의 적절한 투여량 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 치료를 위하여 인 비보에서 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 치료학적으로 효과적인 양, 즉 RANKL 매개된 파골세포 분화 또는 기능을 억제하는 양으로 동물 또는 인간에게 투여된다. Remingto's Pharmaceutical Science, 17th Ed. (1990) Mark, Publishing Co., Easton, Penn. 참조.One skilled in the art can readily determine the appropriate dosage and route of administration of the compositions of the present invention without undue experimentation. When used in vivo for treatment, the compositions of the present invention are administered to an animal or human in a therapeutically effective amount, ie, an amount that inhibits RANKL mediated osteoclast differentiation or function. Remingto's Pharmaceutical Science, 17th Ed. (1990) Mark, Publishing Co., Easton, Penn. Reference.

본 발명의 조성물은 예를 들면, 활성 성분인 상기 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드의 양을 기준으로, 개체 당 1nM 내지 1M, 바람직하게는 1μM 내지 1mM, 더욱 바람직하게는 0.1mM 내지 0.2mM 의 양으로 투여될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구를 통하여 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 주사제의 형태로 개체에 주사를 통하여 투여될 수 있다. The composition of the present invention is, for example, 1 nM to 1 M, preferably 1 μM to 1 mM, more preferably 0.1 mM to 0.2 mM, per individual, based on the amount of the polypeptide having the RANK inhibitory activity as an active ingredient It may be administered in an amount of, but is not limited to these examples. The composition of the present invention can be administered to an individual orally or parenterally. For example, it may be administered by injection to an individual in the form of an injection.

파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병에는 골다공증, 관절염, 암에 의한 뼈 파괴, 대사성 뼈 질환, 백혈병 (leukemia) 및 다발성 마이엘로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. Diseases caused by the differentiation and activation of osteoclasts include those selected from the group consisting of osteoporosis, arthritis, bone destruction by cancer, metabolic bone disease, leukemia and multiple myeloma, but are limited to these examples It is not.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 폴리펩티드는 리포좀에 포집되어 있거나, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 포함된 바이러스 및 벡터의 형태로 존재하는 것일 수 있다. In the pharmaceutical composition of the present invention, the polypeptide may be entrapped in liposomes or present in the form of a virus and a vector containing the gene encoding the polypeptide.

본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여하여, RANK를 매개로 한 신호 전달을 저해하는 단계를 포함하는, 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method of inhibiting osteoclast differentiation of a subject, comprising administering to the subject a pharmaceutical composition of the present invention as described above, thereby inhibiting RANK-mediated signal transduction.

상기 본 발명의 약학적 조성물, 그의 약리학적 효과, 투여량 및 투여방법에 대하여는 상기 본 발명의 약학적 조성물에 대하여 설명한 바와 동일하다.The pharmaceutical composition of the present invention, its pharmacological effects, dosages and administration methods are the same as those described for the pharmaceutical composition of the present invention.

RANK를 매개로 한 신호 전달의 저해에 의하여, RANKL (RANK-ligand)에 의한 파골세포 분화의 억제, RANKL에 의한 활성화된 파골세포의 뼈 파괴 작용의 억제, RANKL에 의한 파골 전구세포의 세포융합의 억제, RANKL에 의한 파골세포 내 액틴 (actin) 단백질의 고리 (ring) 형성의 억제, 및 생쥐에 RANKL의 주입에 의하여 발생하는 뼈 파괴 과정의 억제 및 생쥐에 리포폴리사카리드 (lipopolysaccharide: LPS)의 주입에 의해 유발되는 뼈 파괴 과정의 억제와 같은 효과가 발생한다. 그 결과, RANK를 매개로 한 신호 전달의 저해에 의하여 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방할 수 있는 효과가 발생한다.By inhibition of RANK-mediated signal transduction, inhibition of osteoclast differentiation by RANKL (RANK-ligand), inhibition of bone destruction by activated osteoclasts by RANKL, and cell fusion of osteoclast progenitor cells by RANKL Inhibition, inhibition of ring formation of actin protein in osteoclasts by RANKL, inhibition of the bone destruction process caused by RANKL injection in mice and the induction of lipopolysaccharide (LPS) in mice. Effects such as suppression of the bone destruction process caused by infusion occur. As a result, an effect of treating or preventing a disease caused by the differentiation and activation of osteoclasts occurs by inhibition of RANK-mediated signal transduction.

따라서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여, RANK를 매개로 한 신호 전달을 저해하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention also provides for the treatment or prevention of diseases caused by the differentiation and activation of osteoclasts, comprising the step of administering a pharmaceutical composition according to the invention to a subject, thereby inhibiting RANK-mediated signal transduction. Provide a way to.

상기 질병은 골다공증, 관절염, 암에 의한 뼈 파괴, 대사성 뼈 질환, 백혈병 (leukemia) 및 다발성 마이엘로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. The disease includes, but is not limited to, osteoporosis, arthritis, bone destruction by cancer, metabolic bone disease, leukemia and multiple myeloma.

본 발명은 또한, 본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. The present invention also provides a nucleic acid encoding a polypeptide having the RANK inhibitory activity of the present invention.

본 발명은 또한, 본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. The present invention also provides a vector comprising a nucleic acid encoding a polypeptide having the RANK inhibitory activity of the present invention.

본 발명은 또한, 본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 원핵 세포 및 진핵 세포일 수 있다. The present invention also provides a host cell transformed with a vector comprising a nucleic acid encoding a polypeptide having the RANK inhibitory activity of the present invention. The host cell may be a prokaryotic cell and a eukaryotic cell.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example

실시예Example 1: 세포 투과성 서열과  1: cell permeable sequence RANKRANK 세포질 내 꼬리 영역 서열의 융합 폴리펩티드의 제조 Preparation of Fusion Polypeptides of Tail Region Sequences in the Cytoplasm

본 실시예에서는 11개 아미노산으로 구성되는 인간전사 인자 Hph-1의 세포 투과성 서열 YARVRRRGPRR (서열번호 7)이 인간 RANK 세포질 내 꼬리 영역 유래의 폴리펩티드의 N 말단에 연결된 융합 폴리펩티드를 제조하였다. 상기 RANK 유래의 폴리펩티드는 인간 RANK의 아미노산 서열 543-554 (생쥐 RANK의 아미노산 서열 531-542에 해당)에 해당하는 서열 KGDIIVVYVSQT (서열번호 1)의 4-9번 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 1의 5-12개 연속 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드단편이다. 본 실시예에서 사용된 상기 단편은 각각 서열번호 1-6의 아미노산 서열을 가지며, 이들의 N 말단에 서열번호 7의 세포 투과성 서열이 융합된 폴리펩티드(이하 "실험군 융합 펩티드 1-6"라 한다)는 서열번호 8-13의 아미노산 서열을 갖는 다. 대조군으로써, 서열번호 8-13의 아미노산 서열에서 IV 서열이 LA로 치환된 서열번호 14-19의 폴리펩티드 (이하 "대조군 융합 펩티드 1-6"라 한다)를 사용하였다. 실험군과 대조군 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.In this example, a fusion polypeptide was prepared in which the cell permeable sequence YARVRRRGPRR (SEQ ID NO: 7) of human transcription factor Hph-1 consisting of 11 amino acids was linked to the N terminus of a polypeptide derived from a tail region in human RANK cytoplasm. The RANK-derived polypeptide of SEQ ID NO: 1 comprising amino acid sequences 4-9 of sequence KGDIIVVYVSQT (SEQ ID NO: 1) corresponding to amino acid sequence 543-554 of human RANK (corresponding to amino acid sequence 531-542 of mouse RANK) Polypeptide fragment consisting of 5-12 consecutive amino acid sequences. The fragments used in this example each have an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-6, and a polypeptide in which the cell permeable sequence of SEQ ID NO: 7 is fused to their N terminus (hereinafter referred to as "experimental group fusion peptide 1-6"). Has the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 8-13. As a control, a polypeptide of SEQ ID NOs: 14-19 in which the IV sequence was substituted with LA in the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 8-13 (hereinafter referred to as "control fusion peptide 1-6") was used. The amino acid sequences of the experimental and control polypeptides are shown in Table 1 below.

표 1. Table 1.

실험군 Experimental group 대조군Control YARVRRRGPRRKGDIIVVYVSQTYARVRRRGPRRKGDIIVVYVSQT (서열번호 8) (SEQ ID NO: 8) YARVRRRGPRRKGDILAVYVSQTYARVRRRGPRRKGDILAVYVSQT (서열번호 14) (SEQ ID NO: 14) YARVRRRGPRRGDIIVVYVSQYARVRRRGPRRGDIIVVYVSQ (서열번호 9) (SEQ ID NO: 9) YARVRRRGPRRGDILAVYVSQYARVRRRGPRRGDILAVYVSQ (서열번호 15) (SEQ ID NO: 15) YARVRRRGPRRDIIVVYVSYARVRRRGPRRDIIVVYVS (서열번호 10) (SEQ ID NO: 10) YARVRRRGPRRDILAVYVSYARVRRRGPRRDILAVYVS (서열번호 16) (SEQ ID NO: 16) YARVRRRGPRRIIVVYVYARVRRRGPRRIIVVYV (서열번호 11) (SEQ ID NO: 11) YARVRRRGPRRILAVYVYARVRRRGPRRILAVYV (서열번호 17) (SEQ ID NO: 17) YARVRRRGPRRIVVYVYARVRRRGPRRIVVYV (서열번호 12) (SEQ ID NO: 12) YARVRRRGPRRLAVYVYARVRRRGPRRLAVYV (서열번호 18) (SEQ ID NO: 18) YARVRRRGPRRIIVVYYARVRRRGPRRIIVVY (서열번호 13) (SEQ ID NO: 13) YARVRRRGPRRILAVYYARVRRRGPRRILAVY (서열번호 19) (SEQ ID NO: 19)

상기 표 1의 폴리펩티드는 펩트론 (주) (한국)에 의뢰하여 합성하였다. The polypeptide of Table 1 was synthesized by Peptron Co., Ltd. (Korea).

도 1은 인간과 생쥐의 RANK 세포질 내 꼬리 부위의 RANK 저해 활성을 나타내는 영역 (A) 및 세포 투과성 서열과 연결된 융합 펩티드 (B)를 나타내는 도면이다.1 is a diagram showing a region (A) showing RANK inhibitory activity of the tail region in the RANK cytoplasm of humans and mice and a fusion peptide (B) linked to a cell permeable sequence.

실시예Example 2: 세포 투과성  2: cell permeability RANKRANK 저해 펩티드에 의한 파골세포 분화 억제 효과 Inhibitory Effect of Inhibiting Peptides on Osteoclast Differentiation

태어난 지 5주 되는 생쥐 (C57BL/6J)로부터 채취한 골수세포를 48-웰 플레이트에 넣고, 대식세포 (macrophage) 분화 인자인 hM-CSF (R&D system Inc.)를 30ng/ml의 농도로 포함하는 분화배지 (α-MEM (Invitrogen. co.,), 10%(v/v) 우태아혈청 (FBS), 100units/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신)에서 3일 동안 4x104 세포/웰로 37℃, 95%(v/v) 공기, 5% (v/v) CO2에서 배양하여 골수세포로부터 파생된 대식세포를 얻었다. 여기에 상기 30ng/ml의 농도의 hM-CSF에 더하여, 파골세포분화 인자인 생쥐 RANKL을 대장균에서 발현시켜 순수 분리 정제하여 100ng/ml의 농도로 첨가한 후 동일한 조건에서 배양을 계속하여 파골세포로의 세포분화를 유도하였다.Bone marrow cells harvested from 5 week old mice (C57BL / 6J) were placed in a 48-well plate and contained hM-CSF (R & D system Inc.), a macrophage differentiation factor, at a concentration of 30 ng / ml. In differentiation medium (α-MEM (Invitrogen. Co.,), 10% (v / v) fetal bovine serum (FBS), 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin) for 4 days at 4 × 10 4 cells / well 37 Macrophages derived from bone marrow cells were obtained by culturing at 95 ° C., 95% (v / v) air, and 5% (v / v) CO 2 . In addition to the hM-CSF at a concentration of 30 ng / ml, mouse RANKL, an osteoclast differentiation factor, was expressed in Escherichia coli, purified, purified, and added at a concentration of 100 ng / ml, followed by culturing in osteoclasts under the same conditions. Cell differentiation was induced.

이때 본 발명에서 개발한 실험군 융합 펩티드 1과 대조군 융합 펩티드 1을 각각 1μM, 2.5μM, 5μM의 농도로 첨가하여 세포 배양하였다. 실험시 분화배지의 교환은 2일 간격으로 해 주었다. 그 결과 파골세포로의 정상적인 분화가 이루어지는 대조군과는 달리 실험군에서는 세포분화가 이루어지지 않음을 알 수 있었다. At this time, the experimental group fusion peptide 1 and the control group fusion peptide 1 developed in the present invention were added at a concentration of 1 μM, 2.5 μM, and 5 μM, respectively, and the cells were cultured. During the experiment, the differentiation medium was exchanged every two days. As a result, it was found that in the experimental group, cell differentiation was not performed, unlike the control group in which normal differentiation into osteoclasts.

도 2는 생쥐 골수에서 분리한 파골 전구세포가 RANKL 처리에 의한 파골세포로 분화되는 과정에서 RANK 저해 펩티드의 효과를 농도 별도 처리하여 TRAP 염색한 사진 (B) 및 분화정도를 측정한 그래프 (B)이다. 도 1은 융합 펩티드 1과 대조군 융합 펩티드 1을 첨가하여 배양하기 시작한 날로부터 4일째에 TRAP (tartrate resistant acid phosphatase) 염색하고 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 구체적으로, 상기 TRAP 염색은 세포를 3.7% 포름알데히드로 15분 동안 실온에서 고정시키고 증류수로 2회 세척한 후 Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) kitTM (Sigma Co.)의 사용설명서에 기재된 비율로 아세테이트, 패스트 가르넷 GBC 염기 (Fast Gargnet GBC base), 나프톨 AS-BI 인산, 소듐 니트라이트, 타르트레이트를 섞어 만든 염색액을 200㎕/웰을 넣고 37℃에서 20분 동안 반응시켜 이루어졌 다. FIG. 2 is a graph illustrating the differentiation of the effect of RANK inhibitory peptides in the process of differentiating osteoclast progenitor cells from mouse bone marrow into osteoclasts by RANKL treatment (B) and a graph measuring the degree of differentiation. to be. FIG. 1 is a diagram showing the results obtained by staining with TRAP (tartrate resistant acid phosphatase) on day 4 from the day of incubation with addition of the fusion peptide 1 and the control fusion peptide 1. FIG. Specifically, the TRAP staining was performed by fixing the cells at room temperature for 15 minutes in 3.7% formaldehyde and washing twice with distilled water, followed by acetate at the rate described in the instructions of Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit TM (Sigma Co.). , Fast Gargnet GBC base (Fast Gargnet GBC base), naphthol AS-BI phosphate, sodium nitrite, tartrate was mixed with 200μl / well in a dye solution was made by reacting for 20 minutes at 37 ℃.

실시예Example 3: 길이가 축소된 세포 투과성  3: reduced cell permeability RANKRANK 저해 펩티드에 의한 파골세포 분화 억제 효과 Inhibitory Effect of Inhibiting Peptides on Osteoclast Differentiation

본 실시예에서는 RANK 저해 펩티드의 최소 활성 부위를 확인하기 위하여, 서열번호 8 내지 13의 실험군 융합 펩티드 1-6과 같이 일부 서열이 결실된 폴리펩티드를 사용하여 파골세포 분화 억제 효과가 있는지 확인하였다. 대조군으로는, 서열번호 14-19의 대조군 융합 펩티드 1-6을 사용하였다. In this example, in order to identify the minimum active site of the RANK inhibitory peptide, it was confirmed whether there was an osteoclast differentiation inhibitory effect using a polypeptide which had some sequences deleted, such as experimental group fusion peptide 1-6 of SEQ ID NOs: 8 to 13. As a control, the control fusion peptide 1-6 of SEQ ID NOs: 14-19 was used.

파골세포 분화 억제 실험은 실험군 융합 펩티드 1-6과 대조군 융합 펩티드 1-6을 각각 5μM의 농도로 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 하였다. The osteoclast differentiation inhibition experiment was the same as in Example 2 except that experimental group fusion peptide 1-6 and control group fusion peptide 1-6 were each used at a concentration of 5 μM.

도 3은 실험군 융합 펩티드 1-6과 대조군 융합 펩티드 1-6의 구성을 나타내는 도면이다. 3 is a diagram showing the configuration of the experimental group fusion peptide 1-6 and the control group fusion peptide 1-6.

도 4는 실험군 융합 펩티드 1-6과 대조군 융합 펩티드 1-6이 파골세포 분화에 미치는 영향을 TRAP 염색한 사진 (A) 및 분화정도를 측정한 그래프 (B)를 나타낸다. Figure 4 shows a TRAP stained picture (A) and the graph (B) measuring the degree of differentiation of the effects of experimental group fusion peptide 1-6 and control group fusion peptide 1-6 on osteoclast differentiation.

도 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 RANK 저해 모티프의 최소 활성 단편은 IIVVYV (서열번호 4)를 포함하는 6 내지 12개의 연속 아미노산 단편이 파골세포 분화 저해 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 또한, IIVVYV (서열번호 4) 서열로부터 N 말단의 I 및 C 말단의 V가 제거된 서열번호 5 및 6의 폴리펩티드는 파골세포 분화 저해 활성이 없었다. As shown in Figure 4, the minimum active fragment of the RANK inhibitory motif of SEQ ID NO: 1 it can be seen that 6 to 12 consecutive amino acid fragments including IIVVYV (SEQ ID NO: 4) has osteoclast differentiation inhibitory activity. In addition, the polypeptides of SEQ ID NOs: 5 and 6 from which the N-terminal I and C-terminal V were removed from the IIVVYV (SEQ ID NO: 4) sequence had no osteoclast differentiation inhibitory activity.

실시예Example 4: 세포투과성  4: cell permeability RANKRANK 저해 펩티드 Inhibitory peptide 의of 파골세포 뼈 흡수작용 억제 효능 Osteoclast Bone Resistant Effect

파골세포 뻐 흡수작용 억제능을 살펴보기 위하여 칼슘포스페이트 나노크리스탈로 코팅한 연구용 뼈 흡수 측정용 세포 배양 용기인 OAASTM ((주)오스코텍: 한국)을 사용하였다. OAAS TM , a cell culture vessel for the measurement of bone absorption, coated with calcium phosphate nanocrystals (Oscotec Co., Ltd., Korea) was used.

태어난 지 5주 되는 생쥐 (C57BL/6J)로부터 채취한 골수세포를 OAASTM 48-웰 플레이트에 넣고, 대식세포 (macrophage) 분화 인자인 hM-CSF (R&D system Inc.)를 30ng/ml의 농도로 포함하는 분화배지 (α-MEM (invitrogen. co.,), 10%(v/v) 우태아혈청 (FBS), 100units/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신)에서 3일 동안 4x104 세포/웰로 37℃, 95%(v/v) 공기, 5%(v/v) CO2에서 배양하여 골수세포로부터 파생된 대식세포를 얻었다. 여기에 상기 30ng/ml의 농도의 hM-CSF에 더하여, 파골세포분화 인자인 생쥐 RANKL을 대장균에서 순수 분리정제하여 100ng/ml의 농도로 첨가한 후 동일한 조건에서 배양을 계속하여 파골세포로의 세포분화를 유도하였다. The bone marrow cells collected from five ju mice (C57BL / 6J) which were born OAAS TM Differentiation medium (α-MEM (invitrogen. Co.,), 10% (m-CSF (R & D system Inc.)), which is placed in a 48-well plate and contains macrophage differentiation factor hM-CSF (R & D system Inc.) at a concentration of 30 ng / ml v / v) 37 ° C., 95% (v / v) air, 5% (v / v) at 4 × 10 4 cells / well for 3 days in fetal bovine serum (FBS), 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin) ) Were cultured in CO 2 to obtain macrophages derived from bone marrow cells. In addition to the hM-CSF at a concentration of 30 ng / ml, mouse RANKL, an osteoclast differentiation factor, was purified and purified from E. coli and added at a concentration of 100 ng / ml, and then cultured under the same conditions. Differentiation was induced.

48-웰 플페이트에서 파골세포로 분화를 시킨 후 새로운 분화 배지로 교환시에 서열번호 8과 14의 합성 펩티드를 각각 5μM 농도로 처리하고 48시간 동안 뼈 흡수작용을 살펴 보았다. 48 시간 후에 OAASTM 플레이트에서 세포배양 후 붙어 있는 세포들을 제거하기 위하여 OAASTM 플레이트를 증류수로 세척한 후 4-5% 소듐 히포클로라이트 (sodium hypochlorite) 용액을 넣어 5분간 방치하였다. 다시 증류수로 깨끗이 세척한 후 말린 다음 흡수된 부위를 관찰하였다. 파골세포에 의한 흡수와의 조직 계측을 위하여 광학현미경에 CCD 카메라가 내장된 Axiovert 200 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany)로 화상을 얻었다. 얻은 화상을 면적계측 프로그램인 Image-pro Plus4.5 (Media Cybernetics, Inc.)를 사용하여 분석하였다. After 48-well plate differentiation into osteoclasts, the synthetic peptides of SEQ ID NOs: 8 and 14 were treated at 5 μM concentrations, respectively, and exchanged for fresh differentiation medium, and bone absorption was observed for 48 hours. OAAS TM after 48 hours OAAS ™ to remove adherent cells after cell culture in plate The plate was washed with distilled water and then placed in a 5-5% sodium hypochlorite solution for 5 minutes. Again washed with distilled water, dried and observed the absorbed site. Images were taken with an Axiovert 200 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany) equipped with a CCD camera in an optical microscope for tissue measurement with absorption by osteoclasts. The obtained images were analyzed using Image-pro Plus4.5 (Media Cybernetics, Inc.), an area measurement program.

도 5는 서열번호 8의 세포 투과성 RANK 저해 펩티드가 활성화된 파골세포의 뼈 흡수 활성을 억제하는 것을 나타내는 사진 (A) 및 그 정도를 정량화한 그래프 (B)이다. 5 is a photograph (A) and a graph (B) quantifying the extent that the cell-permeable RANK inhibitory peptide of SEQ ID NO: 8 inhibits bone resorption activity of activated osteoclasts.

도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 RANK 저해 펩티드를 처리한 실험군에서는 파골세포의 뼈 흡수 활성이 88% 감소됨을 알 수 있었다. 이는 파골세포로의 분화뿐만 아니라 이미 완전한 형태의 파골세포의 유지 및 기능을 억제하여 뼈 흡수작용을 못 하게 함을 나타내고 있다.As shown in Figure 5, compared with the control group treated with RANK inhibitory peptides it can be seen that the bone resorption activity of osteoclasts 88% reduced. This indicates that not only the differentiation into osteoclasts but also the maintenance and function of the already complete osteoclasts prevents bone resorption.

실시예Example 5: 세포 투과성  5: cell permeability RANKRANK 저해 펩티드 Inhibitory peptide 의of 액틴Actin 고리 형성 ( Ring formation ( actinactin ringring formation) 억제 효능 formation) inhibitory effect

완전한 형태의 파골세포의 액틴 고리 형성을 억제하는 활성을 살펴보기 위하여, 실시예 2에 나타낸 바와 같이 48-웰 플레이트에서 파골세포로 분화를 시킨 후 6시간 동안 RANKL를 공급하지 않고 RANKL에 의한 세포신호전달을 중지시켰다. In order to examine the activity of inhibiting the actin ring formation of the osteoclasts in the complete form, as shown in Example 2, after the differentiation into osteoclasts in a 48-well plate, the cell signal by RANKL without feeding RANKL for 6 hours The delivery was stopped.

다음으로, RANKL과 RNAK 저해 펩티드(서열번호 8) 및 대조군 펩티드 (서열번호 14)를 처리한 후 36시간 동안 배양하였다. 배양 후, 3.7%(v/v) 포름알데히드 (formaldehyde)로 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 0.1%(v/v) TritonX-100으로 세포에 구멍을 내고 Phalloidin-FITC (Sigma Chem. co., U.S.A)를 2μg/ml로 실온 에서 1시간 30분 동안 처리한 후 형광현미경을 통하여 액틴 고리형성을 관찰하였다. Next, after treatment with RANKL and RNAK inhibitory peptide (SEQ ID NO: 8) and control peptide (SEQ ID NO: 14) and incubated for 36 hours. After incubation, cells were fixed with 3.7% (v / v) formaldehyde. The immobilized cells were punctured with 0.1% (v / v) TritonX-100, and treated with Phalloidin-FITC (Sigma Chem. Co., USA) at 2 μg / ml at room temperature for 1 hour 30 minutes, followed by fluorescence microscopy. Actin ring formation was observed through.

도 6은 세포투과성 RANK 저해 펩티드가 파골세포에서 액틴 고리 형성을 억제하는 것을 나타내는 사진이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 액틴 고리가 정상적으로 만들어지고 유지되었지만, RANK 저해 펩티드 (서열번호 8)를 처리한 실험군에서는 무작위적이며 비정상적인 형태로 액틴 고리가 형성됨을 알 수 있었다.Figure 6 is a photograph showing that the cell permeable RANK inhibitory peptide inhibits actin ring formation in osteoclasts. As shown in FIG. 6, the actin ring was normally made and maintained in the control group, but in the experimental group treated with the RANK inhibitory peptide (SEQ ID NO: 8), the actin ring was formed in a random and abnormal form.

실시예Example 6:  6: RANKLRANKL 또는  or LPSLPS 에 의해 유도되는 뼈 파괴작용에 On bone destruction induced by RANKRANK 저해 펩티드의 억제 효능 Inhibitory efficacy of inhibitory peptides

실제 생쥐에서 RANKL 혹은 LPS에 의해 유도되는 뼈 파괴작용의 억제 효능을 살펴보기 위하여 생후 7주 되는 생쥐의 머리뼈 두개관 (頭蓋冠; calvaria)에 대조군 펩티드를 10mg/kg으로 처리한 대조군 3그룹 (아무것도 처리하지 않은 무처리군, LPS (12.5mg/kg) 및 RANKL (2mg/kg) 처리 그룹으로 구성)과 서열번호 8의 RNAK 저해 펩티드를 10mg/kg으로 처리한 실험군 3그룹 (아무것도 처리하지 않은 무처리군, LPS(12.5mg/kg) 및 RANKL (2mg/kg) 처리 그룹으로 구성)의 총 6그룹을 4일간 매일 주입하였다. 5일째 생쥐 두개관을 채취해 그 단면을 H&E 염색하여 살펴 보았고, Image-pro Plus4.5 (Media Cybernetics, Inc.)를 이용하여 뼈 파괴작용 억제 정도를 분석하였다. To examine the inhibitory effect of RANKL or LPS-induced bone destruction in real mice, three control groups treated with 10 mg / kg of the control peptide in the calvaria of the head bone of the 7-week-old mouse ( Untreated group, consisting of LPS (12.5 mg / kg) and RANKL (2 mg / kg) treatment groups, and 3 groups of experimental groups treated with 10 mg / kg of the RNAK inhibitory peptide of SEQ ID NO: 8 (no treatment) A total of six groups of untreated, LPS (12.5 mg / kg) and RANKL (2 mg / kg) treated groups) were injected daily for 4 days. On day 5, the two cranial tubes were taken and their cross-sections were examined by H & E staining. Image-pro Plus4.5 (Media Cybernetics, Inc.) was used to analyze the degree of inhibition of bone destruction.

도 7은 RANKL 또는 LPS 주입에 의해 생쥐에서 발생되는 뼈의 파괴를 세포 투 과성 RANK 저해 펩티드가 억제함을 보여주는 사진 (A) 및 그 정도를 정량한 그래프 (B)이다. FIG. 7 is a photograph (A) showing a cell permeable RANK inhibitory peptide inhibits the destruction of bone generated in mice by RANKL or LPS injection, and a graph (B).

도 7에 나타낸 바와 같이, 서열번호 8의 세포투과성 RANK 저해 펩티드를 함께 투여함으로써, LPS 주입에 의해 발생하는 뼈의 파괴가 평균 52% 저해됨을 알 수 있었고, RANKL 주입에 의한 뼈의 파괴가 평균 60% 저해되는 효과를 얻었다.As shown in Figure 7, by administering the cell-permeable RANK inhibitor peptide of SEQ ID NO: 8, it can be seen that the destruction of bone caused by LPS injection on average 52%, the average destruction of bone by RANKL injection 60 % Inhibition effect was obtained.

본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드는, RANK 저해 활성을 가지고 있어, RANKL (RANK-ligand)에 의한 파골세포 분화의 억제, RANKL에 의한 활성화된 파골세포의 뼈 파괴 작용의 억제, RANKL에 의한 파골 전구세포의 세포융합의 억제, RANKL에 의한 파골세포 내 액틴 (actin) 단백질의 고리 (ring) 형성의 억제, 및 생쥐에 RANKL의 주입에 의하여 발생하는 뼈 파괴 과정의 억제 및 생쥐에 리포폴리사카리드 (lipopolysaccharide: LPS)의 주입에 의해 유발되는 뼈 파괴 과정의 억제 활성을 갖는다.Polypeptides having RANK inhibitory activity of the present invention have RANK inhibitory activity, and thus inhibit osteoclast differentiation by RANKL (RANK-ligand), inhibition of bone destruction of activated osteoclasts by RANKL, and osteoclasts by RANKL. Inhibition of cell fusion of progenitor cells, inhibition of ring formation of actin proteins in osteoclasts by RANKL, inhibition of bone destruction processes caused by RANKL injection in mice and lipopolysaccharide in mice (lipopolysaccharide: LPS) has an inhibitory activity of the bone destruction process caused by the injection.

본 발명의 약학적 조성물에 의하면, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 용도로 사용될 수 있다.According to the pharmaceutical composition of the present invention, it can be used for the treatment or prevention of diseases caused by the differentiation and activation of osteoclasts.

본 발명의 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법에 의하면, 개체의 파골세포 분화를 억제할 수 있다.According to the method for inhibiting osteoclast differentiation of an individual of the present invention, osteoclast differentiation of an individual can be suppressed.

본 발명의 치료 또는 예방하는 방법에 의하면, 개체의 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방할 수 있다. The method of treating or preventing the present invention can treat or prevent diseases caused by the differentiation and activation of osteoclasts in a subject.

<110> SungkyunKwan University Foundation for Corporation Collaboration <120> A polypeptide inhibiting RANK, pharmaceutical composition comprising the same, method of inhibiting osteoclast differentiation, a method of treating or preventing a disease caused by differentiation or activation of osteoclast, nucleic acid encoding the polypeptide, vector comprising the nucleic acid and a host cell transformed with the vector <130> PN072903 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo sapiens RANK cytomplasmic tail domain. <400> 1 Lys Gly Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser Gln Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo sapiens RANK cytomplasmic tail domain. <400> 2 Gly Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser Gln 1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo sapiens RANK cytomplasmic tail domain. <400> 3 Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo sapiens RANK cytomplasmic tail domain. <400> 4 Ile Ile Val Val Tyr Val 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide derived from homo sapiens RANK cytomplasmic tail domain. <400> 5 Ile Val Val Tyr Val 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide derived from homo sapiens RANK cytomplasmic tail domain. <400> 6 Ile Ile Val Val Tyr 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain of human transcription factor Hph-1. <400> 7 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 1 <400> 8 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Lys Gly Asp Ile Ile 1 5 10 15 Val Val Tyr Val Ser Gln Thr 20 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 2 <400> 9 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Asp Ile Ile Val 1 5 10 15 Val Tyr Val Ser Gln 20 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion proetin 3 <400> 10 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Asp Ile Ile Val Val 1 5 10 15 Tyr Val Ser <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 4 <400> 11 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Ile Val Val Tyr 1 5 10 15 Val <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 5 <400> 12 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Val Val Tyr Val 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 6 <400> 13 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Ile Val Val Tyr 1 5 10 15 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 1 <400> 14 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Lys Gly Asp Ile Leu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Val Ser Gln Thr 20 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 2 <400> 15 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Asp Ile Leu Ala 1 5 10 15 Val Tyr Val Ser Gln 20 <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 3 <400> 16 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Asp Ile Leu Ala Val 1 5 10 15 Tyr Val Ser <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 4 <400> 17 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Leu Ala Val Tyr 1 5 10 15 Val <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 5 <400> 18 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Leu Ala Val Tyr Val 1 5 10 15 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 6 <400> 19 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Leu Ala Val Tyr 1 5 10 15 <210> 20 <211> 31 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gln Val Met Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile 1 5 10 15 Val Val Tyr Val Ser Gln Thr Ser Gln Glu Gly Pro Gly Ser Ala 20 25 30 <210> 21 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gln Val Met Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile 1 5 10 15 Val Val Tyr Val Ser Gln Thr Ser Gln Glu Gly Ala Ala Ala Ala 20 25 30 <110> Sungkyun Kwan University Foundation for Corporation Collaboration <120> A polypeptide inhibiting RANK, pharmaceutical composition          comprising the same, method of inhibiting osteoclast          differentiation, a method of treating or preventing a disease          caused by differentiation or activation of osteoclast, nucleic          acid encoding the polypeptide, vector comprising the nucleic acid          and a host cell transformed with the vector <130> PN072903 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo          sapiens RANK cytomplasmic tail domain. <400> 1 Lys Gly Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser Gln Thr   1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo          sapiens RANK cytomplasmic tail domain. <400> 2 Gly Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser Gln   1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo          sapiens RANK cytomplasmic tail domain. <400> 3 Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser   1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo          sapiens RANK cytomplasmic tail domain. <400> 4 Ile Ile Val Val Tyr Val   1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide derived from homo sapiens RANK cytomplasmic tail          domain. <400> 5 Ile Val Val Tyr Val   1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide derived from homo sapiens RANK cytomplasmic tail          domain. <400> 6 Ile Ile Val Val Tyr   1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain of human transcription factor Hph-1. <400> 7 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg   1 5 10 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 1 <400> 8 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Lys Gly Asp Ile Ile   1 5 10 15 Val Val Tyr Val Ser Gln Thr              20 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 2 <400> 9 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Asp Ile Ile Val   1 5 10 15 Val Tyr Val Ser Gln              20 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion proetin 3 <400> 10 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Asp Ile Ile Val Val   1 5 10 15 Tyr val ser             <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 4 <400> 11 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Ile Val Val Tyr   1 5 10 15 Val     <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 5 <400> 12 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Val Val Tyr Val   1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 6 <400> 13 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Ile Val Val Tyr   1 5 10 15 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 1 <400> 14 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Lys Gly Asp Ile Leu   1 5 10 15 Ala Val Tyr Val Ser Gln Thr              20 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 2 <400> 15 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Asp Ile Leu Ala   1 5 10 15 Val Tyr Val Ser Gln              20 <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 3 <400> 16 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Asp Ile Leu Ala Val   1 5 10 15 Tyr val ser             <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 4 <400> 17 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Leu Ala Val Tyr   1 5 10 15 Val     <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 5 <400> 18 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Leu Ala Val Tyr Val   1 5 10 15 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control fusion protein 6 <400> 19 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Leu Ala Val Tyr   1 5 10 15 <210> 20 <211> 31 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gln Val Met Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile   1 5 10 15 Val Val Tyr Val Ser Gln Thr Ser Gln Glu Gly Pro Gly Ser Ala              20 25 30 <210> 21 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gln Val Met Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile   1 5 10 15 Val Val Tyr Val Ser Gln Thr Ser Gln Glu Gly Ala Ala Ala Ala              20 25 30  

Claims (19)

서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택되는 6 내지 12개의 연속 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 4번 내지 9번 아미노산 서열을 포함하는, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드로서, 서열번호 8 내지 11의 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드. A polypeptide consisting of 6 to 12 contiguous amino acid sequences selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, comprising polypeptides 4 to 9 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 having a RANK inhibitory activity, A polypeptide having RANK inhibitory activity, which is selected from the group consisting of 8 to 11 polypeptides. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 따른 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 질병은 골다공증, 관절염, 암에 의한 뼈 파괴, 대사성 뼈 질환, 백혈병 (leukemia) 및 다발성 마이엘로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for treating or preventing a disease caused by the differentiation and activation of osteoclasts, comprising the polypeptide having a RANK inhibitory activity according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the disease is osteoporosis, arthritis , Bone destruction by cancer, metabolic bone disease, leukemia and multiple myeloma. 삭제delete 제11항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 리포좀에 포집되어 있거나, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 포함된 바이러스 및 벡터의 형태로 존재하는 약학적 조성물. The pharmaceutical composition of claim 11, wherein the polypeptide is entrapped in liposomes or in the form of a virus and a vector comprising a gene encoding the polypeptide. 삭제delete 제11항에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여, RANK를 매개로 한 신호 전달을 저해하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 질병은 골다공증, 관절염, 암에 의한 뼈 파괴, 대사성 뼈 질환, 백혈병 (leukemia) 및 다발성 마이엘로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, 상기 개체는 인간이 아닌 포유동물인 것인 방법. A method for treating or preventing a disease caused by the differentiation and activation of osteoclasts, comprising the step of administering the pharmaceutical composition according to claim 11 to an individual, thereby inhibiting RANK-mediated signal transduction. Is selected from the group consisting of osteoporosis, arthritis, bone destruction by cancer, metabolic bone disease, leukemia and multiple myeloma, wherein the subject is a non-human mammal. 삭제delete 제1항에 따른 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.A nucleic acid encoding a polypeptide having a RANK inhibitory activity according to claim 1. 제17항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.A vector comprising a nucleic acid according to claim 17. 제18항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주세포. A host cell transformed with the vector according to claim 18.
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