L'invention concerne un procédé enzymatique perfectionné de préparation d'oligomères de L-lysine.
Les oligomères de lysine sont des produits intéressants dans le domaine cosmétique, en particulier pour éviter ou retarder le vieillissement cutané résultant de la rigidification des fibres de collagène.
Les protéines (collagène et élastine) ou acides aminés incorporés actuellement dans des préparations cosmétiques ne peuvent éviter la rigidification des fibres de collagène : les premières ont une masse molaire trop élevée qui les empêche de pénétrer jusqu'au derme, et les seconds sont très rapidement métabolisés au niveau de l'épiderme.
Un procédé de synthèse enzymatique d'oligomères de l'arginine, de la lysine ou de l'ornithine, en particulier les di- et tri-peptides, est connu par JP-A-92-128237 (Chisso) publiée le 06.03.92. Ce procédé implique la mise en contact d'un ester de l'amino-acide et de trypsine en milieu aqueux tamponné à pH 10. Ce procédé est conçu de façon à préparer exclusivement des di- et tri-peptides. La réaction de synthèse se déroule en milieu exclusivement aqueux sur une période de temps suffisamment longue (jusqu'à 24 heures) et avec une concentration d'enzyme adéquate pour permettre l'hydrolyse enzymatique des peptides de degré de polymérisation supérieur à 3. La trypsine étant inactive sur des dipeptides, ceux-ci s'accumulent finalement dans le milieu réactionnel avec notamment de la L-lysine sous forme libre.L'obtention des oligomères nécessite des opérations de concentration à partir d'un volume de réaction aqueux important et le substrat (ester alkylique de L-acide-a-aminé) subit une hydrolyse (chimique et enzymatique) importante, d'où des coûts de matières premières relativement élevés.
Il existe donc un besoin pour un procédé perfectionné qui permettrait d'abaisser les coûts de production et permettrait aussi, si désiré, d'obtenir des oligomères d'un degré de polymérisation plus élevé.
L'invention vise à satisfaire ce besoin.
Plus précisément, l'invention concerne un procédé de synthèse enzymatique d'oligomères de lysine, comprenant la soumission d'un substrat constitué d'un ester d'alkyle inférieur de L-lysine ou d'un dérivé de celui-ci, à l'action d'au moins une enzyme protéase ou d'une préparation à activité protéolytique, dans un milieu réactionnel agité, caractérisé en ce que ledit milieu réactionnel est un mélange de 70 à 90% en volume de 1propanol et/ou de 2-propanol et de 10 à 30% en volume d'eau et en ce qu'on poursuit la réaction au moins jusqu'à formation de deux phases distinctes.
L'invention réside dans l'utilisation, comme milieu réactionnel, d'un mélange de propanol et d'eau homogène dans lequel l'ester de L-lysine est soluble, qui se sépare en deux phases distinctes au cours de la formation des oligomères, ces derniers étant concentrés dans la phase aqueuse relativement lourde du fait de leur solubilité élevée dans l'eau et de leur plus faible solubilité dans l'alcool.
Le partage du milieu réactionnel en deux phases distinctes lourde et légère avec concentration des oligomères recherchés dans la phase aqueuse lourde minoritaire facilite beaucoup la récupération desdits oligomères. En outre, la présence d'un solvant organique pendant la réaction d'oligomérisation permet d'accroître le rendement de la synthèse enzymatique et d'élever le degré de polymérisation moyen des oligomères (peptides) de lysine formés.
Par "ester d'alkyle inférieur de L-lysine" on désigne des esters d'alkyle en C1 à C3 de L-lysine, tant sous forme de base libre que sous forme saline, par exemple de dichlorhydrate. On préfère particulièrement utiliser l'ester éthylique de L-lysine, 2HC1.
L'ester d'alkyle inférieur de la L-lysine est avantageusement présent dans le milieu réactionnel à une concentration légèrement inférieure à sa limite de solubilité dans les conditions opératoires (pH, température, concentration de propanol) utilisées, afin de faciliter l'obtention d'une concentration d'oligomères produisant la séparation de phases recherchée. A titre indicatif, une concentration initiale de l'ester de Llysine représentant 80 à 95% de la concentration à saturation est habituellement satisfaisante. Par exemple, dans le cas d'un pH de 9,0 et d'une température de réaction de 25[deg]C, la solubilité limite de l'ester éthylique de L-lysine, 2HC1 dans le 2-propanol est voisine de 100 g/1.Dans un litre de solvant mixte 2-propanol-eau (80:20 V/V) contenant donc 800 cm de 2-propanol et pouvant donc dissoudre environ 80 g de l'ester de Llysine, on a trouvé que l'emploi d'une concentration de l'ester de L-lysine d'environ 75 g/1, soit 75/80 94% de la solubilité limite dans le 2-propanol, était optimale.
Comme indiqué, on poursuit la réaction au moins jusqu'à formation de deux phases distinctes. La séparation des phases résulte de l'accumulation des oligomères de Llysine au cours de la réaction (accumulation qui dépend des concentrations d'enzyme, de substrat et de propanol, de la température et du pH). Ainsi, il a été observé une séparation de phases lorsque des oligomères de L-lysine ayant un degré de polymérisation moyen de 2,5, atteignaient une concentration - d'environ 10 g/1 en présence de 2-propanol-eau à 80/20 v/v, - d'environ 20 g/1 en présence de 2-propanol-eau à 70/30 v/v, - d'environ 15 g/1 en présence de 1-propanol-eau à 70/30 v/v, les valeurs de concentrations des oligomères de L-lysine étant rapportées au volume total.
On pourra trouver des valeurs de la concentration minimale d'oligomères de L-lysine produisant une séparation des phases plus faibles que celles indiquées ci-dessus dans le cas d ' oligomères de L-lysine ayant un degré de polymérisation moyen plus élevé que 2,5.
Toutes les conditions opératoires conduisant à de telles concentrations d'oligomères de L-lysine conviennent pour la préparation des oligomères de L-lysine selon le procédé de l'invention.
Les protéases et préparations à activité protéolytique qui sont utilisables dans le procédé de l'invention sont celles qui effectuent : a) l'hydrolyse de l'ester éthylique de la L-lysine, 2HC1 (10 mM, pH optimal de la protéase, 25[deg]C) b) l'hydrolyse du substrat N-a-benzoyl-L-lysine pnitroanilide (0,3 mM, pH optimal de la protéase, 25[deg]C) c) l'hydrolyse de l'ester éthylique de N-a-benzoylL-arginine (méthode USP, pH optimal de la protéase).
Des exemples de protéases qui conviennent sont la trypsine (par exemple de pancréas de boeuf), des protéases à sérine (EC 3.4.21.) telles que la pronase (de Streptomyces griseus) ou la protéase d'Achromobacter, des protéases à cystéine (EC 3.4.22.) telles que la papaïne, la ficine, la protéase de Streptococcus, la clostripaïne, la bromélaïne, la cathepsine B, la cathepsine C, etc... On préfère la trypsine pour des raisons de disponibilité et de coût.
Fréquemment, pour des raisons de coût, on utilisera des préparations plus ou moins diluées et plus ou moins pures de telles enzymes, plutôt que des enzymes purifiées.
La concentration d'enzyme à utiliser dépendra principalement du type d'enzyme ou des préparations enzymatiques utilisées.
A titre indicatif, dans le cas d'une préparation enzymatique à base de trypsine pancréatique de boeuf, on a trouvé qu'environ 75 à 7500 Unités enzymatiques (USP)/ml de milieu réactionnel, soit environ 0,1 à 10 g/1 d'une préparation ayant une activité de 740 U (USP)/mg de préparation, étaient appropriées.
La concentration de l'enzyme est un paramètre important qui influence la nature des oligomères ou peptides produits. Si la concentration d'enzyme est initialement relativement faible (par exemple inférieure à 0,5 g/1 pour une préparation ayant une activité de 740 U(USP)/mg de préparation ; autres conditions : 2-propanol: 80% v/v ; température : 25[deg]C ; ester éthylique de Llysine : 75 g/1 ; pH initial : 9,0), on observera un arrêt rapide de la réaction enzymatique par dénaturation de l'enzyme par le propanol avant que l'ester de L-lysine soit totalement consommé, avec pour résultat la production majoritaire d'oligomères de degrés de polymérisation (D.P.) élevés (D.P. 4 > D.P. 3 > D.P. 2).Si au contraire, la concentration d'enzyme est initialement relativement élevée (par exemple supérieure à 1,2 g/1 pour une préparation ayant une activité de 740 U(USP)/mg de préparation autres conditions : 2-propanol : 80% v/v ; température : 25[deg]C ; ester éthylique de L-lysine : 75 g/1; pH initial : 9,0), on observera une consommation totale de l'ester de L-lysine puis une poursuite de l'activité enzymatique tendant à dégrader les oligomères de D.P. élevé en oligomères de D.P. plus faible, d'où la production majoritaire d'oligomères de bas D.P. (D.P. 2 > D.P. 3 >D.P. 4). Ainsi, en ajustant la concentration initiale de l'enzyme, on peut obtenir au choix des mélanges d'oligomères de lysine dont les D.P. peuvent aller, par exemple, de 2 à 6, de 2 à 8, ou même de 2 à 15, avec des degrés de polymérisation moyens allant de 2,5 à 6.On préfère notamment les mélanges dont les D.P. vont de 2 à 8, avec un D.P. moyen supérieur à 3.
Le mélange propanol-eau utilisé comme milieu réactionnel est initialement homogène, le propanol étant miscible à l'eau. La présence du propanol permet de limiter la réaction d'hydrolyse de l'ester de lysine (substrat). Le propanol peut être du 1-propanol ou du 2propanol. Pour minimiser autant que possible l'hydrolyse du substrat, l'eau ne doit pas représenter plus de 30% en volume du mélange propanol-eau, mais elle doit représenter au moins 10% en volume dudit mélange pour pouvoir dissoudre convenablement l'ester de L-lysine puis les oligomères. On préfère utiliser un mélange propanol-eau contenant 70 à 80% en volume de propanol et 20 à 30% en volume d'eau. On préfère tout particulièrement utiliser un mélange contenant environ 80% de propanol et 20% d'eau.Le 1- et le 2-propanol sont les seuls solvants organiques trouvés par la Demanderesse qui, à la fois : - soient miscibles à l'eau - dissolvent le substrat (ester de lysine) au pH souhaité en présence d'eau - permettent le phénomène de démixtion de phases au cours de la formation des oligomères - soient aisément disponibles, non toxiques et bon marché.
Avec d'autres alcools, tels que l'éthanol ou le méthanol, on n'observe pas de phénomène de démixtion de phases.
La réaction peut s'effectuer à une température de 10 à 45[deg]C environ, de préférence d'environ 25[deg]C. Plus la température est élevée, plus l'enzyme sera rapidement dénaturée.
Le pH de réaction devra se trouver dans la gamme de pH recommandée pour l'enzyme utilisée. Par exemple, dans le cas de la trypsine, un pH de 7,5 à 10,5, de préférence d'environ 9, convient.
La durée de réaction peut aller de 1 à 20 h environ, selon les conditions opératoires.
Pendant la réaction, il faut assurer une agitation vigoureuse du milieu réactionnel pour assurer un bon contact entre les phases.
Après réaction, si désiré, l'enzyme peut être éliminée par ultrafiltration (membrane poreuse de seuil de coupure 10 kDa), l'enzyme étant retenue alors que les oligomères de lysine traversent totalement la membrane poreuse.
Les exemples non limitatifs suivants sont donnés dans le but d'illustrer l'invention.The invention relates to an improved enzymatic process for the preparation of L-lysine oligomers.
Oligomers of lysine are products of interest in the cosmetic field, in particular for preventing or delaying skin aging resulting from the stiffening of collagen fibers.
The proteins (collagen and elastin) or amino acids currently incorporated in cosmetic preparations can not prevent the stiffening of collagen fibers: the former have too high a molar mass that prevents them from penetrating to the dermis, and the latter are very rapidly metabolized at the level of the epidermis.
A process for the enzymatic synthesis of oligomers of arginine, lysine or ornithine, in particular di- and tri-peptides, is known from JP-A-92-128237 (Chisso) published on 06.03.92 . This process involves contacting an amino acid ester with trypsin in a buffered aqueous medium at pH 10. This process is designed to exclusively prepare di- and tri-peptides. The synthesis reaction is carried out in an exclusively aqueous medium over a sufficiently long period of time (up to 24 hours) and with an adequate enzyme concentration to allow the enzymatic hydrolysis of peptides with a degree of polymerization greater than 3. Trypsin being inactive on dipeptides, they finally accumulate in the reaction medium, in particular with L-lysine in free form. Obtaining the oligomers requires concentration operations from a large aqueous reaction volume and Substrate (L-acid-α-amino alkyl ester) undergoes significant (chemical and enzymatic) hydrolysis, resulting in relatively high raw material costs.
There is therefore a need for an improved process that would lower production costs and would also, if desired, provide oligomers with a higher degree of polymerization.
The invention aims to satisfy this need.
More specifically, the invention relates to a process for the enzymatic synthesis of lysine oligomers, comprising subjecting a substrate consisting of a lower alkyl ester of L-lysine or a derivative thereof to action of at least one protease enzyme or of a proteolytically active preparation, in a stirred reaction medium, characterized in that said reaction medium is a mixture of 70 to 90% by volume of 1propanol and / or 2-propanol and from 10 to 30% by volume of water and in that the reaction is continued at least until two distinct phases are formed.
The invention resides in the use, as a reaction medium, of a mixture of propanol and homogeneous water in which the L-lysine ester is soluble, which separates into two distinct phases during the formation of the oligomers these latter being concentrated in the relatively heavy aqueous phase because of their high solubility in water and their lower solubility in alcohol.
The partitioning of the reaction medium into two distinct, heavy and light phases with concentration of the desired oligomers in the minor heavy aqueous phase greatly facilitates the recovery of said oligomers. In addition, the presence of an organic solvent during the oligomerization reaction makes it possible to increase the efficiency of the enzymatic synthesis and to increase the average degree of polymerization of the lysine oligomers (peptides) formed.
By "lower alkyl ester of L-lysine" is meant C1-C3 alkyl esters of L-lysine, both in free base and salt form, for example dihydrochloride. It is particularly preferred to use L-lysine ethyl ester, 2HCl.
The lower alkyl ester of L-lysine is advantageously present in the reaction medium at a concentration slightly lower than its solubility limit under the operating conditions (pH, temperature, concentration of propanol) used, in order to facilitate obtaining a concentration of oligomers producing the desired phase separation. As an indication, an initial concentration of the Lysine ester representing 80 to 95% of the saturation concentration is usually satisfactory. For example, in the case of a pH of 9.0 and a reaction temperature of 25 [deg] C, the limiting solubility of L-lysine ethyl ester, 2HC1 in 2-propanol is close to In 1 liter of 2-propanol-water (80:20 V / V) mixed solvent containing 800 cm 2 of 2-propanol and thus able to dissolve about 80 g of the Lysine ester, it was found that the use of a concentration of L-lysine ester of about 75 g / l, 75/80 94% of the limiting solubility in 2-propanol, was optimal.
As indicated, the reaction is continued at least until two distinct phases are formed. The phase separation results from the accumulation of Llysine oligomers during the reaction (accumulation which depends on enzyme, substrate and propanol concentrations, temperature and pH). Thus, phase separation was observed when L-lysine oligomers having an average degree of polymerization of 2.5, reached a concentration of about 10 g / l in the presence of 2-propanol-water at 80 ° C. 20 v / v, - about 20 g / l in the presence of 2-propanol-water at 70/30 v / v, - about 15 g / l in the presence of 1-propanol-water at 70/30 v v, the concentration values of L-lysine oligomers being relative to the total volume.
L-lysine oligomer lower phase-producing concentration values lower than those indicated above can be found in the case of L-lysine oligomers having an average degree of polymerization greater than 2, 5.
All the operating conditions leading to such concentrations of L-lysine oligomers are suitable for the preparation of oligomers of L-lysine according to the method of the invention.
Proteases and proteolytically active preparations which are useful in the process of the invention are those which effect: a) hydrolysis of L-lysine ethyl ester, 2HCl (10 mM, optimal pH of the protease, [deg.] C) b) hydrolysis of the substrate Na-benzoyl-L-lysine pnitroanilide (0.3 mM, optimal pH of the protease, 25 [deg] C) c) hydrolysis of the ethyl ester of Na benzoyl-arginine (USP method, optimal pH of the protease).
Examples of suitable proteases are trypsin (eg, beef pancreas), serine proteases (EC 3.4.21) such as pronase (from Streptomyces griseus) or Achromobacter protease, cysteine proteases ( EC 3.4.22.) Such as papain, ficin, Streptococcus protease, clostripain, bromelain, cathepsin B, cathepsin C, etc. Trypsin is preferred for reasons of availability and cost.
Frequently, for cost reasons, more or less dilute and more or less pure preparations of such enzymes will be used, rather than purified enzymes.
The concentration of enzyme to be used will depend mainly on the type of enzyme or enzyme preparations used.
As an indication, in the case of an enzyme preparation based on pancreatic bovine trypsin, it has been found that approximately 75 to 7500 Enzyme Units (USP) / ml of reaction medium, ie approximately 0.1 to 10 g / 1 of a preparation having an activity of 740 U (USP) / mg of preparation, were appropriate.
The concentration of the enzyme is an important parameter that influences the nature of the oligomers or peptides produced. If the enzyme concentration is initially relatively low (eg less than 0.5 g / l for a preparation having an activity of 740 U (USP) / mg of preparation; other conditions: 2-propanol: 80% v / v temperature: 25 [deg] C, Lysine ethyl ester: 75 g / l, initial pH: 9.0), the enzymatic reaction will be rapidly stopped by denaturation of the enzyme with propanol before the ester L-lysine is completely consumed, resulting in the majority production of oligomers with high degrees of polymerization (DP) (DP 4> DP 3> DP 2). On the contrary, the enzyme concentration is initially relatively high ( for example greater than 1.2 g / l for a preparation having an activity of 740 U (USP) / mg of preparation other conditions: 2-propanol: 80% v / v; temperature: 25 [deg] C; L-lysine: 75 g / l, initial pH: 9.0), a total consumption of the L-lysine ester will be observed and then a continuation of the activity. The enzymatic enzyme tends to degrade the high DP oligomers into lower DP oligomers, hence the majority production of low DP oligomers (DP 2> DP 3> DP 4). Thus, by adjusting the initial concentration of the enzyme, it is possible to obtain mixtures of lysine oligomers whose DP can range, for example, from 2 to 6, from 2 to 8, or even from 2 to 15, with average degrees of polymerization ranging from 2.5 to 6. Particularly preferred are mixtures whose DP range from 2 to 8, with an average DP greater than 3.
The propanol-water mixture used as a reaction medium is initially homogeneous, the propanol being miscible with water. The presence of propanol makes it possible to limit the hydrolysis reaction of the lysine ester (substrate). The propanol may be 1-propanol or 2-propanol. To minimize hydrolysis of the substrate as much as possible, the water must not represent more than 30% by volume of the propanol-water mixture, but it must represent at least 10% by volume of said mixture in order to be able to dissolve the ester of L-lysine and oligomers. It is preferred to use a propanol-water mixture containing 70 to 80% by volume of propanol and 20 to 30% by volume of water. It is particularly preferred to use a mixture containing about 80% of propanol and 20% of water. 1- and 2-propanol are the only organic solvents found by the Applicant which both: - are miscible with water - dissolve the substrate (lysine ester) at the desired pH in the presence of water - allow phase demixing during oligomer formation - be readily available, non-toxic and inexpensive.
With other alcohols, such as ethanol or methanol, no phase demixing phenomenon is observed.
The reaction can be carried out at a temperature of about 10 to 45 [deg] C, preferably about 25 [deg] C. The higher the temperature, the faster the enzyme will be denatured.
The reaction pH should be within the recommended pH range for the enzyme used. For example, in the case of trypsin, a pH of 7.5 to 10.5, preferably about 9, is suitable.
The reaction time can range from 1 to 20 hours, depending on the operating conditions.
During the reaction, it is necessary to ensure vigorous stirring of the reaction medium to ensure good contact between the phases.
After reaction, if desired, the enzyme can be removed by ultrafiltration (porous 10 kDa cutoff membrane), the enzyme being retained while the lysine oligomers pass completely through the porous membrane.
The following nonlimiting examples are given for the purpose of illustrating the invention.
Exemple 1
Dans cet exemple on a utilisé le mode opératoire général suivant :
Dans un bécher équipé d'un barreau-agitateur magnétique, on introduit 1 litre de mélange eau/2-propanol comprenant 80% en volume de 2-propanol à 25[deg]C. Sous agitation énergique ( 500 tours/minute), on ajoute 74,2 g (0,3 mole) d'ester éthylique de L-lysine, 2HC1. On ajuste le pH initial à 9,0 au moyen d'une solution 5N de soude. On ajoute alors 17 ml d'une préparation aqueuse contenant 50g de trypsine pancréatique par litre. La trypsine pancréatique utilisée provenait de la Société NOVO INDUSTRI AS (Danemark) et avait une activité de 740 U (USP)/mg de matière sèche. La quantité de préparation de trypsine ajoutée correspondait à 555 U (USP)/ml de milieu réactionnel. Après addition de la trypsine, le volume réactionnel total est de 1,13 litre et la concentration de l'ester de L-lysine est de 65,7 g/1.On laisse la réaction se dérouler à 25[deg]C jusqu'à ce que la composition du mélange réactionnel n'évolue plus, soit pendant 5 heures. Au bout de ce temps, on arrête l'agitation, on laisse reposer le milieu réactionnel qui se sépare en 2 phases, une phase supérieure riche en 2-propanol et représentant 91% du volume réactionnel et une phase inférieure aqueuse représentant 9% du volume réactionnel.
Ces phases ont été analysées eu égard à leurs teneurs en ester éthylique de L-lysine, en L-lysine, et en peptides de L-lysine, avec les résultats suivants, exprimés en millimoles de chacun des composés :
On a également déterminé le rendement R de la réaction d'oligomérisation (nombre de moles de peptides dans la phase inférieure/nombre de moles du substrat de départ) et le degré de polymérisation moyen (DP moyen) des produits contenus dans la phase inférieure, avec les résultats suivants :
R = 76% et DP moyen : 3,3 Plus de 98% des produits de la réaction ont donc été extraits dans un volume correspondant à 9% du volume réactionnel, ce qui est particulièrement avantageux pour la récupération des produits.
Exemple comparatif A Dans un bécher équipé d'un barreau-agitateur magnétique, on introduit 1 litre d'eau à 30[deg]C. Sous agitation à 500 t/mn, on ajoute 47,0 g (190 millimoles) d'ester éthylique de L-lysine, 2HC1. On ajuste le pH initial à 9,0 avec une solution 5N de soude. On ajoute alors 0,125 g (5 umoles) de trypsine fournie par la Société SIGMA sous la désignation T0134, et 0,11 g (1 millimole) de CaCl2 (stabilisant pour l'enzyme). On laisse alors la réaction se dérouler à 30[deg]C, sous agitation, jusqu'à ce que la composition du mélange réactionnel n'évolue plus, soit pendant 2 heures.
On n'observe pas de séparation de phases.
Le produit obtenu contient, d'après analyse :
Le rendement R est de 41% et le degré de polymérisation DP moyen est de 2,8.
Exemple comparatif B On opère comme dans l'exemple comparatif A, si ce n'est qu'on opère les modifications suivantes : - on remplace l'eau par un mélange éthanol/eau contenant 80% en volume d'éthanol - on introduit 49,4 g (200 millimoles) d'ester éthylique de L-lysine, 2HC1 au lieu de 47,0 g - on ajuste le pH initial à 8,8 au lieu de 9,0. - on ajoute 1,0 g (25 umoles) de trypsine pancréatique NOVO de l'exemple 1 à la place des 0,125 g de trypsine SIGMA. - on poursuit la réaction pendant 5 heures au lieu de 2 heures.
On n'observe pas de séparation de phases dans le produit obtenu, qui contient, d'après analyse :
Le rendement R de la réaction d'oligomérisation est de 50% et le degré de polymérisation DP moyen est de 2,5.
Une comparaison des résultats obtenus dans l'exemple 1 et dans les exemples comparatifs A et B montre à l'évidence la supériorité du procédé de l'invention.
Il va de soi que le mode de réalisation décrit n'est qu'un exemple et que l'on pourrait le modifier, notamment par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour cela du cadre de l'invention.Example 1
In this example, the following general procedure was used:
In a beaker equipped with a magnetic stir bar, 1 liter of water / 2-propanol mixture comprising 80% by volume of 2-propanol at 25 ° C. is introduced. With vigorous stirring (500 rpm), 74.2 g (0.3 mol) of L-lysine ethyl ester, 2HCl, are added. The initial pH is adjusted to 9.0 with 5N sodium hydroxide solution. 17 ml of an aqueous preparation containing 50 g of pancreatic trypsin per liter are then added. The pancreatic trypsin used was from NOVO INDUSTRI AS (Denmark) and had an activity of 740 U (USP) / mg dry matter. The amount of trypsin preparation added was 555 U (USP) / ml of reaction medium. After addition of the trypsin, the total reaction volume is 1.13 liters and the concentration of the L-lysine ester is 65.7 g / l. The reaction is allowed to proceed at 25 ° C. until the reaction is complete. the composition of the reaction mixture no longer evolves, ie for 5 hours. At the end of this time, the stirring is stopped, the reaction medium which separates in 2 phases is left to stand, an upper phase rich in 2-propanol and representing 91% of the reaction volume and a lower aqueous phase representing 9% of the volume. reaction.
These phases were analyzed with regard to their L-lysine ethyl ester, L-lysine, and L-lysine peptide contents, with the following results, expressed in millimoles of each of the compounds:
The yield R of the oligomerization reaction (number of moles of peptides in the lower phase / number of moles of the starting substrate) and the average degree of polymerization (average DP) of the products contained in the lower phase were also determined. with the following results:
R = 76% and average DP: 3.3 More than 98% of the reaction products were thus extracted in a volume corresponding to 9% of the reaction volume, which is particularly advantageous for the recovery of the products.
Comparative Example A In a beaker equipped with a magnetic stir bar, 1 liter of water is introduced at 30 ° C. Under stirring at 500 rpm, 47.0 g (190 mmol) of L-lysine ethyl ester, 2HCl, are added. The initial pH is adjusted to 9.0 with 5N sodium hydroxide solution. 0.125 g (5 μmoles) of trypsin supplied by the company SIGMA under the designation T0134, and 0.11 g (1 millimole) of CaCl 2 (stabilizer for the enzyme) are then added. The reaction is then allowed to proceed at 30 ° C., with stirring, until the composition of the reaction mixture no longer changes, ie for 2 hours.
No phase separation is observed.
The product obtained contains, according to analysis:
The yield R is 41% and the average degree of polymerization DP is 2.8.
Comparative Example B The procedure is as in Comparative Example A, except that the following modifications are carried out: the water is replaced by an ethanol / water mixture containing 80% by volume of ethanol; 4 g (200 mmol) of L-lysine ethyl ester, 2HC1 instead of 47.0 g - the initial pH is adjusted to 8.8 instead of 9.0. 1.0 g (25 μmoles) of NOVO pancreatic trypsin from Example 1 were added in place of the 0.125 g of trypsin SIGMA. the reaction is continued for 5 hours instead of 2 hours.
No phase separation is observed in the product obtained, which contains, according to analysis:
The yield R of the oligomerization reaction is 50% and the average degree of polymerization DP is 2.5.
A comparison of the results obtained in Example 1 and Comparative Examples A and B clearly demonstrates the superiority of the process of the invention.
It goes without saying that the described embodiment is only an example and that it could be modified, in particular by substitution of technical equivalents, without departing from the scope of the invention.
REVENDICATIONS
1. Procédé de synthèse enzymatique d'oligomères de lysine, comprenant la soumission d'un substrat constitué d'un ester d'alkyle inférieur de L-lysine ou d'un dérivé de celui-ci, à l'action d'au moins un enzyme protéase ou d'une préparation à activité protéolytique, dans un milieu réactionnel agité, caractérisé en ce que ledit milieu réactionnel est un mélange de 70 à 90% en volume de 1propanol et/ou de 2-propanol et de 10 à 30% en volume d'eau et en ce qu'on poursuit la réaction au moins jusqu'à formation de deux phases distinctes. A process for the enzymatic synthesis of lysine oligomers, comprising subjecting a substrate of a lower alkyl ester of L-lysine or a derivative thereof to the action of at least one a protease enzyme or a proteolytically active preparation, in a stirred reaction medium, characterized in that said reaction medium is a mixture of 70 to 90% by volume of 1propanol and / or 2-propanol and 10 to 30% in volume of water and in that the reaction is continued at least until two distinct phases are formed.