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"Protéase alcaline, sa préparation et son utilisation"
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"Protéase alcaline, sa préparation et son utilisation"
La présente invention est relative à une nouvelle protéase alcaline API-21 et au procédé de préparation de celle-ci. D'une manière plus spécifique, l'invention se rapporte à la protéase alcaline API-21 provenant d'une bactérie et ayant une activité enzymatique même à une température relativement basse (par exemple de la température ambiante jusqu'à environ 400C) sous des conditions alcalines et elle se rapporte également à un procédé de préparation de cette protéase à partir de la culture d'une nouvelle espèce de bactérie NKS-21 appartenant au genre Bacillus.
Les protéases alcalines sont largement utilisées dans lesdomaines teb que, par exemple, l'industrie du cuir, l'industrie alimentaire, l'industrie des fibres ou des matières textiles et l'industrie des produits médicinaux ou pharmaceutiques ; la raison de cela provient du fait que les protéases alcalines sont plutôt stables vis-à-vis de la chaleur comparativement aux protéases neutres. De plus, la demande sur le marché en enzymes comme additif de détergent s'est accrue récemment. Les enzymes utilisées ordinairement comme additif de détergent sont des protéases alcalines provenant de bactéries appartenant au genre Bacillus, qui montrent une activité
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maximale à un pH d'environ 9 à environ 10.
La plupart des enzymes susmentionnées montrent une activité maximale à une température relativement élevée, en particulier aux alentours des 60 C, mais sont inactives ou moins actives à une température relativement basse, en particulier aux alentours de la température ambiante. Ceci signifie que les caractéristiques des enzymes ne sont pas totalement utilisées dans des pays tels que le Japon, où les vêtements sont généralement lavés à la température ambiante. De plus, le développement d'enzymes ayant une activité enzymatique qui se'maintient même à une température relativement basse est nécessaire dû à l'utilisation accrue récente de vêtements en fibres chimiques ayant une stabilité à la chaleur relativement faible et également dû au récent mouvement d'économie d'énergie.
Par conséquent, le but de la présente invention consiste à palier aux inconvénients susmentionnés des protéases alcalines connues en prévoyant une nouvelle protéase alcaline ayant une activité enzymatique élevée à une température relativement basse.
Un autre but de la présente invention consiste à prévoir un procédé de préparation d'une nouvelle protéase alcaline ayant une activité enzymatique élevée à partir d'une nouvelle bactérie capable de produire celle-ci.
Les autres buts et avantages de la présente invention ressortiront de la description suivante.
Suivant la présente invention, on prévoit
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une protéase alcaline Api-21 ayant les propriétés physico-chimiques suivantes : (1) Activité : Elle hydrolyse la caséine sous des conditions alcalines, avec une gamme de pH
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optimale de 10 à 11, et a une gamme de températures optimale pour ce qui est de son activité de 450C à 50 C ; (2) Stabilité : Pas de diminution de l'activité enzymatique observée jusqu'à 40 C par chauffage sans substrat pendant 10 minutes à un pH de 10, mais diminution de 90% ou plus de l'activité enzymatique observée à 50 C pendant 10 minutes à un pH de 10.
Une désactivation apparatt à 50 C pendant 10 minutes à pH 8 et une désactivation complète se produit pratiquement à 60 C pendant 10 minutes à pH 8. La protéase est stable sous des conditions alcalines, en particulier dans une gamme de pH de 7 à 11, 5, et elle est stable vis-à-vis de la congélation et de la dessiccation par évaporation de la glace ou congélation ; (3) Molécule d'enzyme :
La protéase est une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 22000 tel que déterminé par filtration sur gel sur Séphatex G-75 (marque déposée) à pH 10, un point isoélectrique de 7,4 tel que déterminé par une méthode d'électrofocalisation, un pic d'absorption de 275 à 282 nm dans un spectre d'absorption UV, les caractéristiques d'absorption dans l'infrarouge telles que représentées sur la figure 5, et un résidu de sérine dans le site actif de celle-ci.
On prévoit également, suivant la présente invention, un procédé de préparation de protéase alca-
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line API-21 comprenant les étapes suivantes : (a) la culture d'une espèce de NKS-21 du genre Bacillus capable de produire de la protéase alcaline API-21 dans un milieu de culture alcalin ; et (b) la récupération de la protéase alcaline API-21 du produit cultivé.
D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description ci-après, donnée à titre d'exemple non limitatif et en se référant aux dessins annexés, dans lesquels :
La figure 1 représente graphiquement la gamme de pH optimale de l'enzyme suivant la présente invention.
La figure 2 représente graphiquement la stabilité vis-à-vis du pH de l'enzyme sans substrat suivant la présente invention.
La figure 3 représente graphiquement la gamme de températures actives et la température optimale de l'enzyme suivant la présente invention.
La figure 4A et 4B représentent graphiquement les stabilités vis-à-vis des températures de l'enzyme sans substrat suivant la présente invention respectivement à des pH de 10 et 8.
La figure 5 représente le spectre infrarouge avec transformation de Fourier de l'enzyme suivant la présente invention.
La demanderesse a étudié les bactéries qui pouvaient produire une protéase alcaline ayant une activité élevée à une température relativement faible.
Suite à la classification et à la recherche d'un grand nombre de souches de bactéries isolées à partir de
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terre ou de sol naturel, la nouvelle bactérie appartenant au genre Bacillus sp. nov. NKS-21 (appelée ciaprès NKS-21 qui peut produire de la protéase alcaline ayant une activité élevée à une température relativement basse a été isolée des sols naturels à Fuchu-shi, Tokyo, Japon. On a constaté d'après les propriétés microbiologiques de cette bactérie qu'une souche NKS-21 capable de produire de la protéase alcaline API-21 suivant la présente invention est une nouvelle bactérie à sporanges aérobie appartenant au genre Bacillus.
Cette bactérie NKS-21 a été déposée le 3 février 1982 au Fermentation Research Institute (FRI) (Japon) sous la dénomination de Bacillus sp. FERM BP-93 conformément au Traité de Budapest sur la reconnaissance internationale du dépôt des micro-organismes aux fins de la procédure en matière de brevets.
Les propriétés microbiologiques de cette bactérie sont expliquées ci-après. Les réactifs et les méthodes d'isolement utilisés pour la détermination des propriétés microbiologiques de la bactérie NKS- 21 sont ceux décrits dans le"Bergey"s Manual of Determinative Bacteriology" (8ème édition) (1974).
L'isolement de la bactérie du sol est réalisé de la façon suivante ; on ajoute une petite quantité de sol ou de terre à un milieu à base de peptone et on réalise la culture en utilisant un dispositif de culture à secousses sous des conditions de pH de 7 à 10 et de températures de 10 à 40 C pendant 40 à 150 heures.
On étend une partie du produit cultivé sur des plaques d'agar et on isole la souche par une méthode d'isole-
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ment pure usuelle.
Propriétés microbiologiques de la bactérie
NKS-21 (a) Caractéristiques morphologiques.
(1) Dimension des cellules végétatives :
0,6-0, 8 um x 2,5-3, 5 pm (microns).
(2) Pléomorphisme cellulaire :
Les cellules grossissent quelque fois jusqu'à une taille de 0,6-1, 0 pm x
4,5 pm.
(3) Coloration au Gram :
Positive mais se décolore aisément.
(4) Motilité :
Mobile avec le peritrichous flagella.
(5) Spores :
Ovales à elliptiques, subterminales,
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0, 8 um x 2 um.
(6) Sporanges :
Légèrement gonflés.
(7) Résistance aux acides :
Négative.
(b) Caractéristiques culturales dans diffé- rents milieux
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.
(1) Bouillon de peptone : (i) pH de 9, 5 : bonne croissance à la fois à 200C et 30 C. pH de 7, 2 : croissance peu dévelop- pée à 200C et bonne croissance à 300C (ii) température de croissance à pH de 9,5
Croissance entre 14 C et 41 C
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Pas de croissance au-dessus de 43 C ou en dessous de 12 C.
(2) Autres milieux :
Culture couchée d'agar à la peptone- extrait de viande :
Bonne croissance
Bouillon de peptone-extrait de viande contenant 7% de chlorure de sodium :
Bonne croissance
Bouillon de peptone-extrait de viande :
Bonne croissance
Culture couchée d'agar à la peptone- extrait de viande-caséine :
Bonne croissance
Bouillon de peptone-extrait de viande- caséine :
Bonne croissance
Bouillon de peptone-amidon :
Bonne croissance
Bouillon de peptone-glucoce :
Bonne croissance
Plaque d'agar à l'extrait de levure- triptone :
Bonne croissance
Bouillon d'extrait de levure-amidon :
Croissance culture en colonne à base de gélatine- extrait de viande :
(i) pH de 10,0, 300C
Croissance et liquéfaction (ii) pH de 10,0, 20 C
Faible croissance superficielle et fai- ble liquéfaction
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(iii) pH de 7,2, 300C
Croissance et liquéfaction (iv) pH de 4,2, 200C
Faible croissance superficielle et faible liquéfaction (3) Croissance dans des conditions d'anaé- robie :
Pas de croissance dans des conditions d'anaérobie, mais croissance dans des conditions d'aérobie.
(c) Caractéristiques physiologiques (1) Réduction des nitrates en nitrites :
Pas de réduction (2) Production anaérobie de gaz à partir de nitrate :
Négative (3) Essai au rouge de méthyle (MR) :
Négatif (4) Essai de Voges-Proskauer (VP) :
Négatif (5) Production d'indole :
Aucune (6) Production de H2S :
Aucune (7) Hydrolyse d'amidon :
Positive (8) Utilisation de citrate :
Positive (9) Utilisation de source d'azote inorganique :
Utilise des nitrates et des sels d'am- monium
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(10) Production de pigment :
Aucune (11) Essai à l'uréase :
Négatif (12) Essai à la cytochrome oxydase :
Positif (13) Essai à la catalase :
Positif (14) Essai O-F (milieu de Hugh et
Leifson) :
Faible fermentation (15) Production d'acide et production de gaz à partir d'hydrates de carbone :
EMI10.1
<tb>
<tb> Production <SEP> Production
<tb> d'acide <SEP> de <SEP> gaz
<tb> L-arabinoseD-xylose-D-glucose-D-mannose-D-fructose-D-galactose <SEP> +Maltose <SEP> +Sucrose <SEP> +LactoseTréhalose <SEP> +D-sorbitol <SEP> +D-mannitol <SEP> +Inositol <SEP> +
<tb> Glycérol <SEP> +Amidon <SEP> +RiboseRaffinose <SEP> +Cellobiose <SEP> +-
<tb> (Remarques) <SEP> +: <SEP> positive, <SEP> -: <SEP> négative
<tb>
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(16) Autres (i) Désamination de la phénylalanine :
Positive (ii) Hydrolyse de la caséine :
Positive (iii) Décomposition de la tyrosine :
Positive
Comme indiqué ci-dessus, la souche NKS-21 de la présente invention est une bactérie à sporanges aérobie, qui comme on le croit fermement, appartient au genre Bacillus.
Les caractéristiques de cette souche résident dans le fait que la souche croît dans des milieux neutre à alcalin, et que la gamme de pH optimale pour la croissance s'étend de 8 à 10. Ces propriétés r. ticrobiologiques sont similaires à celles des souches connues Bacillus pasteurii et Bacillus alcalophilus. La souche NKS-21 de la présente invention se distingue toutefois nettement des deux souches susmentionnées par certaines propriétés microbiologiques, bien que certaines propriétés microbiologiques de la souche NKS-21 soient les mêmes que celles des souches connues susmentionnées. Par exemple, les souches Bacillus pasteurii et Bacillus alcalophilus se développent toutes deux dans une région de pH alcalins mais cette dernière ne peut pas se développer à un pH de 7.
Par contre, la souche NKS-21 se développe bien non seulement dans une région de pH alcalins mais également à un pH neutre. Par conséquent, la souche NKS-21 diffère de la souche Bacillus alcalophilus sous ce rapport. De plus, Bacillus pasteurii n'hydrolyse pas l'amidon, tandis que la souche NKS-21 hydrolyse d'amidon. La souche NKS-21 se distingue
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encore de Bacillus pasteurii sous les rapport suivants : (1) Bacillus pasteurii réduit les nitrates, tandis que la souche NKS-21 ne réduit pas les nitrates ; (2) Bacillus pasteurii comporte des endospores en forme de sphère ou presque ovales, tandis que les endospores de NKS-21 sont ovales à elliptiques ; et (3) Bacillus pasteurii décompose l'urée, tandis que la souche NKS-21 ne décompose pas l'urée.
Compte tenu des différences susmentionnées dans les propriétés microbiologiques, la souche NKS- 21 se différencie nettement de la souche Bacillus pasteurii.
Les résultats de classification de Bacillus alcalophilus ne sont pas décrits en détail dans le "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology"susmentionné. Etant donné que la souche standard de Bacillus alcalophilus n'était pas disponible, les propriétés microbiologiques de NKS-21 ont été comparées expérimentalement à celles des souches d'origine Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et NCIB 10438 citées dans le"Bergey's Manual of Determinative Bacteriology". Les souches NCIB 10436 et NCIB 10438 étaient toutes deux légèrement positives dans la réaction de coloration au Gram et étaient facilement décolorées. Ces propriétés sont similaires à celles de la souche NKS-21.
Pour ce qui est des caractéristiques morphologiques des cellules végétatives, de courtes baguettes ayant une dimension de 0,7 pm x 2,0 pm et de longues baguettes ayant une dimension de 0,8 um x 4,6 um ont été remarquées au mi-
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croscope électronique chez la souche NCIB 10436, et des cellules végétatives ayant une dimension de 0,7 pm x 1,5 pm ont été remarquées chez la souche NCIB 10438. Par contre, on a déterminé au moyen du microscope électronique que la dimension des cellules végétatives de la souche NKS-21 était de 0,6-0, 8 pm x 2, cm et que les endospores avaient une forme ovale à elliptique d'une dimension de 0,8 pm x 1,2 u. m. Aucune motilité n'a été observée chez les souches NCIB 10436 et 10438, tandis que la souche NKS- 21 est mobile.
De plus, les propriétés physiologiques de NKS-21 sont nettement différentes de celles des souches NCIB 10436 et NCIB 10438 sous les points suivants : (1) Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et NCIB 10438 ne se développent pas dans un milieu à base de mannitol, tandis que NKS-21 s'y développe ; et (2) NCIB 10436 ne se développe pas dans un bouillon de peptone-extrait de viande contenant 7% de chlorure de sodium, tandis que NCIB 10438 et NKS-21 s'y développent.
D'après les différences susmentionnées, la souche NKS-21 se distingue de Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et NCIB 10438, bien que certaines propriétés microbiologiques de NKS-21 soient similaires à celles des Bacillus alcalophilus.
De plus, la souche NKS-21 est similaire à Bacillus subtilis en ce sens que les cellule végétatives de Bacillus subtilis ont de 0,7 à 0,8 pm de largeur et de 2 à 3 pm de longueur et que Bacillus subtilis décompose l'amidon. Toutefois, la
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souche NKS-21 se différencie de Bacillus subtilis par les points suivants : (1) Bacillus subtilis se développe bien à un pH de 5,5 à 8,5, mais ne se développe pas à un pH de 9 à 10, pH auquel la souche NKS-21 se développe bien ; et (2) La température de croissance maximale de Bacillus subtilis est de 45 C à 55 C, tandis que la souche NKS-21 ne croît pas au-dessus de 430C.
Par conséquent, la souche NKS-21 se différencie nettement de Bacillus subtilis.
C'est ainsi que la souche NKS-21 se distingue nettement par ses propriétés microbiologiques des souches connues de Bacillus pasteurii, Bacillus alcalophilus et Bacillus subtilis et que toute souche ayant les mêmes propriétés microbiologiques que NKS-21 n'est pas décrite dans le "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology". Par conséquent, la souche NKS-21 est identifié comme étant une nouvelle souche appartenant au genre Bacillus.
Suivant la présente invention, on prépare la nouvelle protéase alcaline API-21 ayant une activité élevée à une température relativement basse en cultivant la nouvelle souche NKS-21 dans un milieu de culture alcalin, et en la récupérant du produit cultivé. Les micro-organismes utilisables dans la culture ne sont pas limités à NKS-21, et les microorganismes tels que des mutants naturels ou artificiels de NKS-21 peuvent également être utilisés pour autant qu'ils puissent produire de la protéase alcaline API-21. Ces micro-organismes entrent dans le
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cadre de la présente invention.
La nouvelle protéase alcaline API-21 obtenue en cultivant la souche NKS-21 suivant la présente invention sera expliquée en détail.
La souche NKS-21 peut être cultivée aérobiquement, par exemple dans un milieu de culture à base de peptone ayant un pH de 8 à 10, la culture étant soumise à des secousses ou à une agitation aérobie après inoculation de NKS-21 dans le milieu de culture à une température de 10 C à 400C pendant 40 à 150 heures. Après l'achèvement de la culture, les cellules microbiennes cultivées sont aisément séparées du produit cultivé et l'on obtient une solution surnageante de culture claire. La protéase alcaline API- 21 est aisément précipitée par l'addition d'un solvant organique, tel que le méthanol, à la solution surnageante. On soumet la protéase alcaline API-21 précipitée à une séparation centrifuge et on la sèche par congélation sous vide.
C'est ainsi que l'on peut obtenir l'enzyme désirée, à savoir la protéase alcaline API-21.
L'activité de la protéase alcaline API-21 ainsi obtenue est déterminée de la façon suivante.
On dilue d'une façon appropriée la solution claire cultivée ou la solution enzymatique avec une solution tampon de carbonate de sodium 0,1 M-acide borique 0, 1 M-chlorure de potassium (pH de 10, 0).
On ajoute à 0,5 ml de la solution résultante, 0,5 ml d'une solution à 2% de caséine de lait ayant un pH de 10,0 et, ensuite, on effectue une réaction enzymatique à 30 C pendant 10 minutes. Une fois
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la réaction achevée, on ajoute au mélange de réaction pour terminer la réaction 2 ml d'acide trichloroacétique 0,1 M contenant de l'acide acétique 0,2 M et de l'acétate de sodium 0,2 M. On laisse le mélange au repos pendant 10 minutes ou plus à 300C et, ensuite, on le filtre à travers du papier filtre. On ajoute à 1 ml du filtrat obtenu ci-dessus 1 ml de carbonate de sodium 0,4 M et cinq fois 1 ml de"phénol réactif"dilué et on laisse le mélange au repos à 300C pendant 20 minutes pour que la couleur apparaisse.
Ensuite, on mesure l'absorption du mélange coloré à 660 nm.
L'unité d'enzyme est déterminée conformément à la "Commission sur la Nomenclature Biochimique" (Comprehensive Biochemistry volume 13, pages 26 et 27,1973), selon laquelle la quantité de protéase alcaline qui libère des substances solubles dans l'acide trichloroacétique montrant une production de couleur à 660 nm correspondant à 1 mole de tyrosine à partir d'un substrat de caséine (1%) ayant un pH de 10,0 à 30 C pendant 1 seconde est définie comme étant de"1 katal".
Les propriétés physicochimiques de la protéase alcaline API-21 (appelée ci-après enzyme de la présente invention) seront à présent décrites en détail.
(1) Activité
Elle hydrolyse des protéines telles que la caséine, l'hémoglobine, l'albumine, la globuline, la protéine de viande, la protéine de poisson et la protéine de graines de soja.
(2) Effet du pH sur l'activité enzymatique
Comme indiqué sur la figure 1, le pH optimal est d'environ 10 à environ 11. L'activité relati-
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ve a été déterminée de la façon suivante.
Chaque solution tampon (0,5 ml) mentionnée ci-après contenant 2% de caséine de lait a été ajoutée à 50 ul de la solution d'enzyme de la présente invention pour préparer une solution d'essai. pH Solution tampon 6-9 phosphate de potassium 0,1 M-borate de sodium 0,05 M karbonate de sodium 0,1 M-acide borique O, lM- chlorure de potassium 11-12 hydrogénophosphate disodique 0,1 M-hydroxyde de sodium
L'activité enzymatique de la solution d'essai a été déterminée de la manière telle que décrite ci-dessus. On a calculé l'activité relative (%), l'activité enzymatique à pH 10,0 ayant été définie comme étant de 100%.
(3) Effet du pH sur la stabilité sans substrat
Comme indiqué sur la figure 2, l'enzyme de la présente invention est stable dans la gamme de pH d'environ 7 à environ 11, 5.
La stabilité de l'enzyme de la présente invention a été évaluée de la façon suivante.
Chaque solution tampon (0,5 ml) mentionnée
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ci-après a été ajoutée à 50 ul de la solution d'enzy- me de la présente invention dialysée et diluée de façon appropriée et le mélange a été incubé à 30 C pendant 10 minutes.
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pH Solution tampon 3-8 acide citrique 0,1 M-hydrogénophosphate disodique 0,2 M 8-11 carbonate de sodium 0,1 M-acide borique
0,1 M-chlorure de potassium 11-12 hydrogénophosphate disodique 0,15 M-hydroxy- de de sodium
Après incubation, on ajoute au mélange 9,5 ml d'une solution tampon de carbonate 0,1 M conte- nant 2% de caséine et ayant un pH de 10, 0. L'activi- té enzymatique du mélange a été déterminée de la ma- nière telle que décrite ci-dessus.
On a calculé l'activité relative (%), l'activité enzymatique à pH 10,0 ayant été définie comme étant de 100%.
Comme indiqué sur la figure 2, l'enzyme de la présente invention s'est révélés le plus stable à un pH d'environ 10 à environ 11. Dans cette ré- gion de pH, l'activité initiale de l'enzyme de la présente invention était totalement conservée. De plus, l'enzyme a montré 80% ou plus de l'activité res- tante dans la gamme de pH allant de 7 à 11, 5.
(4) Effet de la température sur l'activité enzymatique
Comme indiqué sur la figure 3, l'enzyme de la présente invention s'est révélée active vis-à-vis de la caséine âme température de 5 à 650C et à un pH de 10,0. La température optimale était de 45 à 50 C.
(5) Effet de la température sur la stabili- té sans substrat
Comme indiqué sur les figures 4A et 4B, l'ac- tivité de l'enzyme de la présente invention est tota- lement conservée jusqu'à 40 C par chauffage sans
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substrat à un pH de 10,0 pendant 10 minutes, mais la majeure partie de l'activité est : perdue à 50 C. De plus, l'activité de l'enzyme de la présente inven-
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tion est conservée jusqu'à 45 C à un pH de 8 pendant 10 minutes, mais une désactivation se produit à 50 C et l'enzyme est pratiquement désactivéeà 60 C.
(6) Stabilité à la conservation
L'enzyme de la présente invention est stable vis-à-vis de la congélation et du séchage par congélationou évaporation de la glace. On n'a pas observé de diminution importante de l'activité de l'échantillon séché par congélation lorsqu'on laisse celui-ci à l'abandon à la température ambiante pendant 2 semaines. Lorsque l'on conserve l'échantillon séché par congélation dans un dessiccateur à la température ambiante, l'activité de l'enzyme de la présente invention est totalement maintenue.
(7) Inhibition
L'enzyme de la présente invention a été inhibée, d'une manière singulière, par un inhibiteur de résidu de sérine actif, tel que l'acide diisopropylfluorophosphorique (DFP) et le fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF). Elle a également été inhibée par la benzyloxycarbonyl-phénylalanine-chlorométhyl cétone (ZPCK). Toutefois, l'enzyme de la présente invention n'a pas été inhibés par la tosyl-phénylalanine-chlorométhyl cétone (TPCK), qui est un inhibiteur d'une protéase de sérine animale, la chymotrypsine et la tosyl-lysine-chlorométhyl cétone (TLCK), qui est un inhibiteur de la trypsine.
De plus, l'activité de l'enzyme de la pré-
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sente invention n'a pas été modifiée d'une façon défavorable par l'addition de benzoate de p-chloromercure (PCMB) et d'éthylènediaminetétraacétate (EDTA). De plus, l'activité de l'enzyme de la présente invention n'a pas été modifiée d'une façon défavorable par l'addition de pepstatine. Suite aux essais d'inhibition susmentionnés, il est clair que l'enzyme de la présente invention est une protéase ayant un résidu de sérine dans le site actif.
(8) Méthode de détermination de l'activité enzymatique
Telle que mentionnée ci-dessus.
(9) Poids moléculaire
Le poids moléculaire de l'enzyme de la présente invention est d'environ 22000 tel que déterminé par une filtration sur gel sur Séphatex (marque déposée) G-75 à un pH de 10.
(10) Point isoélectrique
Le point isoélectrique de l'enzyme de la présente invention est de 7,4 tel que déterminé par une méthode d'électrofocalisation.
(11) Absorption dans l'ultraviolet (UV)
Le pic d'absorption est présent à 275-282 um dans le spectre d'absorption UV.
(12) Spectre d'absorption dans l'infrarouge (IR)
Comme indiqué sur la figure 5.
(13) Analyse élémentaire
A été omise pour la raison que les différences caractéristiques dans ce type de substances de poids moléculaire élevé, comme l'enzyme de la présente invention, ne peuvent pas être bien mises en évidence
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par la comparaison de leurs teneurs en éléments, tels que le carbone, l'azote ou l'hydrogène.
(14) Composition en aminoacides
La composition en aminoacides de la protéase API-21 calculée sur la base des résultats obtenus par une hydrolyse acide de l'enzyme à l'exception de la cystéine/cystine et du tryptophane, par une décomposition d'acide performique pour l'analyse concernant la cystéine/cystine et par une décomposition alcaline pour l'analyse concernent le tryptophane, suivant la méthode décrite dans la littérature ("Methods in Enzymology"volume II, 1967, Academic Press, New York) est indiquée dans le Tableau I, en même temps que les compositions d'autres protéases alcalines,
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1 dont les résultats sont cités dans la 2).
Comme indiqué dans le Tableau I, il y a de grandes différences entre l'enzyme API-21 et les autres enzymes citées dans les compositions en aminoacides, tels que la sérine, l'arginine, la lysine, la valine, l'alanine, le tryptophane, la proline, etc.
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TABLEAU I Comparaison des compositions en aminoacides entre API-21 et d'autres protéases alcalines
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<tb>
<tb> Aminoacide <SEP> API-21 <SEP> Subtilisin <SEP> Subtilisin
<tb> Novo <SEP> 1) <SEP> Carlsberg <SEP> 2)
<tb> Lysine <SEP> 4 <SEP> 11 <SEP> 9
<tb> Histidine <SEP> 8 <SEP> 6 <SEP> 5
<tb> Arginine <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 4
<tb> Tryptophane <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 1
<tb> Acide <SEP> aspartique/2711 <SEP> 9
<tb> asparagine <SEP> 17 <SEP> 19
<tb> Thréonine <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 19
<tb> Sérine <SEP> 17 <SEP> 37 <SEP> 32
<tb> Acide <SEP> glutamique/14 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP>
<tb> gultamine <SEP> 11 <SEP> 7
<tb> Proline <SEP> 7 <SEP> 14 <SEP> 9
<tb> Glycine <SEP> 30 <SEP> 33 <SEP> 35
<tb> Alanine <SEP> 26 <SEP> 37 <SEP> 41
<tb> Valine <SEP> 20 <SEP> 30 <SEP> 31
<tb> Isoleucine <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 10
<tb> Leucine <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16
<tb> Tyrosine <SEP> 12 <SEP>
10 <SEP> 13
<tb> Phénylalannine <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Cystéine/0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> cystine
<tb>
*1) J. Biol. Chem., 243,5296 (1968) *2) J. Biol. Chem., 243,2134 (1968)
Comme on peut le voir d'après les résultats susmentionnés, l'enzyme de la présente invention, qui a un pH optimal de 10 à 11, conserve l'activité à une température relativement basse, mais est désactivée à
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une température relativement élevée (c'est-à-dire 500C ou plus). L'enzyme de la présente invention présentant ces propriétés physicochimiques sera à présent compara aux propriétés de protéases alcalines similaires connues.
Parmi les protéases alcalines extracellulaires provenant des bactéries Gram positives on connatt bien, par exemple, la protéase alcaline (subtilisine de Carlsberg) provenant de Bacillus licheniformis et la protéase alcaline (subtilisine de Novo) provenant de Bacillus subtilis.
Ces enzymes sont des protéases ayant un résidu de sérine dans le site actif, un poids moléculaire d'environ 27000 à 30000 et un point isoélectrique de 9 à 11. La plupart des autres protéases alcalines extracellulaires rapportées dérivées du genre Bacillus ont un poids moléculaire de 25000 à 30000 et un point isoélectrique de 9 à 11. La plupart des enzymes susmentionnées ne sont pas désactivée par chauffage à 50 C et à pH 10 pendant 10 minutes. Les protéases alcalines connues ayant un poids moléculaire inférieur provenant du genre Bacillus sont les protéases alcalines E-l et E-2 provenant de Bacillus nO D-6, toutes deux ayant un poids moléculaire de 20000, dont l'activité ne diminue pas du tout par
EMI23.1
chauffage à 50 C et à pH de 9, 0 (voir la demande de brevet japonais examinée nO 56-4236).
De plus, on connatt dans la technique comme protéase alcaline dérivée du genre Bacillus une protéase alcaline proverant de Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et une protéase alcaline provenant de Bacillus alcalophilus NCIB 10438.
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Ces enzymes conservent toutefois environ 90% de l'activité par chauffage à 500C et à pH 10 pendant 10 minutes, comme indiqué dans le Tableau II. De même, également comme indiqué dans le Tableau II, les protéases alcalines provenant de Bacillus licheniformis et de Bacillus subtilis conservent 70 à 80% de l'activité par chauffage à 500C et à pH 10 pendant 10 minutes. C'est ainsi que les protéases alcalines provenant de bactéries appartenant au genre Bacillus telles que Bacillus subtilis sont stables dans une région de températures relativement élevées.
Contrairement à. eci, tel que mentionné ci-dessus, l'enzyme de la présente invention perd la majeure partie de son activité par chauffage à 500C et à pH 10 pendant 10 minutes, tout en étant stable par chauffage à une température allant jusqu'à 40 C et à pH 10 pendant 10 minutes. De plus, la désactivation de l'enzyme de la présente invention se produit par chauffage à
EMI24.1
environ 500C et à pH 8 pendant 10 minutes et la majeure partie de son activité est perdue à 600C sous les mêmes conditions.
Compte tenu des différences que l'on trouve dans la stabilité à la température, le poids moléculaire et le point isoélectrique, l'enzyme de la présente invention se distingue nettement des protéases alcalines connues provenant de bactéries appartenant au genre Bacillus et n'a pas été rapportée dans des publications. Par conséquent, l'enzyme de la présente invention doit être considérée comme étant une nouvelle enzyme et est désignée par l'expression"protéase alcaline API-21".
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TABLEAU II
EMI25.1
<tb>
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> Poids <SEP> mole-Point <SEP> iso-Activité <SEP> restante <SEP> (%) <SEP> après
<tb> culaire <SEP> électrique <SEP> chauffage <SEP> à <SEP> pH <SEP> 10 <SEP> pen. <SEP> dant <SEP>
<tb> 10 <SEP> minutes
<tb> 500C <SEP> 600C <SEP>
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> provenant <SEP> *3) <SEP> *3)
<tb> de <SEP> Bacillus <SEP> licheniformis <SEP> 27.287 <SEP> 9,4 <SEP> 78 <SEP> < 2
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> provenant <SEP> *4) <SEP> *4)
<tb> de <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 27.537**) <SEP> 9,1**) <SEP> 70 <SEP> < 2
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> provenant
<tb> de <SEP> Bacillus <SEP> alcalophilus
<tb> NCIB <SEP> 10436--94 <SEP> 73
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> provenant
<tb> de <SEP> Bacillus <SEP> alcalophilus
<tb> NCIB <SEP> 10438 <SEP> 25.
<SEP> 000-85 <SEP> 63
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> provenant
<tb> de <SEP> Bacillus <SEP> NKS-21 <SEP> 22. <SEP> 000 <SEP> 7,4 <SEP> 6 <SEP> 1
<tb>
*3) Fette Seiten Anstrichmittel. 75, p49 (1973) *4) The Enzymes, vol III, p564 (1971)
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On peut utiliser l'enzyme"API-21"de la présente invention avec une substance favorisant l'action de nettoyage des détergents et on peut donc l'utiliser comme additif de détergent, puisque cette enzyme est stable à un pH de 7 à 11, 5 et que l'activité enzymatique maximale est atteinte à un pH de 10 à 11, comme mentionné ci-dessus.
En particulier, l'enzyme de la présente invention conserve son activité élevée même à une température relativement basse (par exemple 200C à 300C), comparativement aux enzymes usuelles utilisés avec les détergents. Par conséquent, l'enzyme de la présente invention est un type de protéase alcaline particulièrement intéressante comme additif pour les détergents ménagers dans les pays où on lave les vêtements à la température ambiante comme le Japon. De plus, l'enzyme de la présente invention peut être utilisée d'une manière efficace dans le traitement des résidus et dans le traitement des eaux usées aux fins d'une décomposition rapide des protéines et d'une réutilisation des ressources d'azote, puisque les teneurs en protéines dans les résidus domestiques et dans les eaux usées domestiques ont récemment augmenté.
En outre, l'utilisation de la protéase de la présente invention dans les industrie alimentaires, telles que dans le traitement des matières alimentaires, s'avère avantageuse, puisque l'enzyme peut être aisément désactivée après utilisation par chauffage à une température relativement basse, par exemple 50 à 60 C.
C'est ainsi que l'utilisation de l'enzyme de la présente invention est efficace du point de vue du contrô-
<Desc/Clms Page number 27>
le de la qualité de la matière alimentaire traitée.
Dans le cas où l'enzyme"API-21"de la présente invention est incorporée dans une composition détergente, on utilise d'une manière générale l'enzyme"API-21"en une quantité de 5 à 500 nKatals (ou zo Katal), de préférence à raison de 10 à 100 nKatals par rapport à 1 g de la composition détergente, bien qu'il n'y ait pas de limitation à la quantité d'enzyme utilisée.
En plus de l'enzyme"API-21", la composition détergente contenant l'enzyme peut contenir n'importe quel ingrédient pour détergent usuel sans modifier sa quantité par rapport aux compositions détergentes ordinaires. Des exemples caractéristiques de tels ingrédients pour détergent sont les agents tensioactifs en des quantités de 10 à 50% en poids, les substances favorisant l'action de nettoyage en des quantités de 0 à 50% en poids, les agents alcalins ou électrolytes inorganiques à raison de 1% à 50% en poids, et les agents anti-redépôt, les enzymes, les agents de blanchiment, les colorants optiques (ou fluorescents), les agents empêchant la formation de gateau et les antioxydants. L'incorporation de l'enzyme"API-21"peut être réalisée d'une manière classique quelconque.
Toutefois, l'enzyme est combinée de préférence dans la composition détergente sous la forme d'une solution ou sous une forme telle que toute formation de poussière, pour ce qui est de la protection de l'environnement, en est empêchée.
La présente invention sera à présent illustrée d'une manière plus détaillée par les exemples non
<Desc/Clms Page number 28>
limitatifs suivants, dans lesquels tous les pourcentages sont exprimés en poids, sauf indications contraires.
Exemple 1
On cultive la nouvelle souche NKS-21 de la présente invention dans un milieu de culture couché.
On met en suspension le produit cultivé dans de l'eau stérilisée et on utilise 0,5 ml de cette suspension comme produit d'inoculation.
On ajuste un milieu de culture producteur d'enzyme contenant 1% de caséine, 1% d'extrait de viande, 1% de polypeptone et 1% de bicarbonate de sodium à un pH de 9,5 ou de 7,2 en y ajoutant de l'hydroxyde de sodium aqueux ou de l'acide chlorhydrique.
Dans un processus de culture à secousses (A) utilisant une secoueuse rotative, on ajoute 100 ml, 200 ml ou 300 ml du milieu préparé ci-dessus ayant un pH de 9,5 à un récipient d'Erlenmeyer de 1 litre. Après stérilisation, on inocule 0,5 ml de la suspension de NKS-21 préparée ci-dessus dans le milieu de culture et on réalise la culture à 20 C et sous des conditions d'agitation de 200 tours par minute pendant 41,65 ou 89 heures.
D'un autre côté, dans un processus de culture à secousses à mouvement de va-et-vient (B), on ajoute 100 ml du milieu de culture préparé ci-dessus ayant un pH de 9,5 ou de 7,2 à un récipient de Sakaguchi de 500 ml. Après stérilisation, on inocule 0,5 ml de la suspension de NKS-21 préparés ci-dessus dans le milieu de culture et on réalise le processus
<Desc/Clms Page number 29>
de culture à secousses à mouvement de va-et-vient sous des conditions d'agitation de 110 coups par minute à 300C pendant 66 ou 90 heures.
Après le processus de culture, on centrifuge le produit cultivé à 28000 x g pendant 15 minutes et on récupère la solution surnageante résultante. On détermine l'activité de-la protéase alcaline de cette solution de la manière telle que décrite ci-dessus.
Les résultats sont donnés dans les Tableaux III et IV.
TABLEAU III Résultats du processus de culture à secousses rotatif (A) (20 C, pH initial du milieu = 9, 5)
EMI29.1
<tb>
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> Activité <SEP> enzymatique <SEP> (microkatal/litre)
<tb> milieu <SEP> (ml) <SEP> 41 <SEP> hres <SEP> 65 <SEP> hres <SEP> 89 <SEP> hres
<tb> 100 <SEP> 1,3 <SEP> 2,6 <SEP> 2,7
<tb> 200 <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> 4,3 <SEP> 4, <SEP> 0
<tb> 300 <SEP> 2,5 <SEP> 5,6 <SEP> 5,4
<tb>
TABLEAU IV Résultats du processus de culture à secousses à mouvement de va-et-vient (B) (300C)
EMI29.2
<tb>
<tb> pH <SEP> initial <SEP> Activité <SEP> enzymatique <SEP> (microkatal/litre
<tb> du <SEP> milieu <SEP> 66 <SEP> hres <SEP> 90 <SEP> hres
<tb> 9,6 <SEP> 4,5 <SEP> 3,0
<tb> 7,2 <SEP> 4,9 <SEP> 3,
4
<tb>
Lorsque l'on soumet la souche NKS-21 à une culture du type à secousses à mouvement de va-etvient à 30 C, la croissance de la souche NKS-21 est bonne non seulement à un pH de milieu initial de 9,5
<Desc/Clms Page number 30>
mais également à un pH de milieu initial de 7,2 et on obtient la protéase alcaline API-21 désirée à un taux élevé dans chaque cas. Comme dans le cas où l'on utilise un milieu initial avec un pH de 9,5, on obtient des résultats similaires lorsque l'on cultive la souche NKS-21 dans une secoueuse à mouvement de va-et-vient à 20 C et à un pH de milieu initial de 7, 2.
On refroidit jusqu'à 30C 7 litres de la solution surnageante après la séparation centrifuge du produit cultivé (NKS-21) obtenu ci-dessus.
Ensuite, on ajoute deux fois en volume d'alcool éthylique préalablement refroidi à 30C à la solution surnageante refroidie pour former des précipités. Les précipités résultants sont séparés par voie centrifuge à 11000 x g dans un dispositif de séparation centrifuge refroidi et" ensuite, les précipités séparés sont immédiatement séchés par congélation sous vide. C'est ainsi que l'on obtient 15,7 g de la poudre d'enzyme désirée.
L'activité spécifique de la protéase alcaline ainsi obtenue sur base de 1 kg de protéine est de 0,71 u. Katal (0,71 pKatal/kg de protéine) et le rendement de récupération est de 33%, la protéine étant déterminée suivant la méthode de Lowry.
L'échantillon d'enzyme séché par congélation ainsi obtenu est dissous dans une solution tampon de chlorure de potassium-acide bErique-carbona- te de sodium 0,01 M (pH de 10,0) contenant du chlorure de sodium 0,2 M. La solution enzymatique est filtrée sur gel sur une colonne (diamètre de 2 cm x
<Desc/Clms Page number 31>
74 cm) garnie de Séphadex G-75 (marque déposée de Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) préalablement équilibré avec la solution tampon susmentionnée et on récolte des fractions d'éluat de 3 ml. L'enzyme purifiée est obtenue à partir des fractions principales qui ont une activité enzymatique élevée.
L'enzyme ainsi obtenue a un poids moléculaire d'environ 22000 tel que mesuré par filtration sur gel sur Séphadex G-75 (marque déposée) à pH 10 et un point isoélectrique de 7,4 tel que mesuré par une méthode d'électrofocalisation. L'activité spécifique de l'enzyme ainsi obtenue a augmenté d'environ dix fois comparativement à celle sans filtration sur gel et l'activité spécifique obtenue sur base de 1 kg de protéine est de 7,0 pkatals. Le rendement de récupération est de 70%.
Exemple 2
La production de protéase alcaline dans un réservoir de fermentation de 500 litres et la production ultérieure de la préparation enzymatique sont réalisées en utilisant la souche NKS-21 productrice de protéase alcaline.
On ajuste à pH 9,5 un milieu de culture producteur d'enzyme contenant 1% de caséine, 1% d'extrait de viande, 1% de polypeptone et 1% de bicarbonate de sodium en y ajoutant ce l'hydroxyde de sodium aqueux. On ajoute une quantité de 300 ml du milieu préparé ci-dessus à un récipient d'Erlenmeyer de 1 litre. Après stérilisation, on inocule 0,5 ml de la suspension de NKS-21 préparée de la même manière que dans l'Exemple 1, dans le milieu de culture et on
<Desc/Clms Page number 32>
réalise la culture à 200C pendant 3 jours. On ajoute 300 ml du produit cultivé résultant à un récipient de fermentation de 30 litres stérilisé contenant 10 litres du milieu de culture préparé ci-dessus ayant un pH de 9,5.
Ensuite, on réalise une culture sous agitation aérobie à une température de 200C pendant 3 jours sous les conditions d'une vitesse d'agitation de 400 tours par minute et d'un taux d'aération de 12 litres/minute.
Après la culture dans le fermenteur de 30 litres pendant 3 jours, on transfère 10 litres du produit cultivé dans un réservoir de fermentation de 500 litres stérilisé contenant 220 litres du milieu de culture préparé ci-dessus ayant un pH de 9,5. Ensuite, on réalise une culture sous agitation aérobie à 200C pendant 4 jours sous les conditions d'une vitesse d'agitation de 400 tours par minute et d'un taux d'aération de 200 litres/minute.
Après le processus de culture, on centrifuge le produit cultivé à 11000 x g dans un séparateur centrifuge continu refroidi, et on obtient 200 litres d'une solution surnageante. On refroidit cette solution surnageante à 30C. Ensuite, on ajoute deux fois le volume d'alcool éthylique préalablement refroidi à 30C à la solution surnageante refroidie pour précipiter la protéase alcaline désirée. On sépare par voie centrifuge à environ 11000 x g la protéase alcaline API-21 précipitée dans un séparateur centrifuge continu refroidi et, ensuite, on sèche immédiatement par congélation sous vide la protéase alcaline API-21 séparée.
C'est ainsi que l'on obtient la préparation
<Desc/Clms Page number 33>
enzymatique à base de protéase alcaline API-21 séchée par congélation suivante :
Poids d'enzyme récupéré (g) 1230
Activité spécifique (microkatal/kg de protéine) 0,
Rendement de récupération (%) 70
L'enzyme ainsi obtenue est purifiée de la même manière que dans l'Exemple 1, pour obtenir une protéase alcaline ayant un poids moléculaire d'environ 22000 et un point isoélectrique de 7,4.
Exemple 3
La protéase alcaline"API-21"obtenue ci-dessus et, à titre d'exemple comparatif, une protéase alcaline disponible dans le commerce pour détergent sont examinées en les combinant dans différentes compositions détergentes. L'essai de blanchissage de tissus souillés par du sang est réalisé de la façon suivante :
A. Préparation de tissus de coton souillés par du sang entier
On trempe des échantillons de tissu, sous les conditions suivantes, dans un flot de sang entier de bovin frais et immédiatement après recueilli celui-ci, on ajoute. un volume d'une solution de citrate de sodium pour neuf volumes de sang de manière à empêcher la coagulation. Les échantillons de tissu souillés sont comprimés à 70% au moyen d'une essoreuse de manière à obtenir des tissus souillés uniformément.
Ensuite, les échantillons de tissu sont séchés à l'air dans une pièce sans être exposés directement à la lumière du soleil et sont ensuite conservés à une température de 0 C à 50C dans un endroit sombre au frais.
Après la préparation, les échantillons de tissu sont
<Desc/Clms Page number 34>
découpés à une dimension de 10 cm x 5 cm.
Echantillons de tissu : 10 cm x 15 cm
Liquide de souillure : 100 ml pour dix échantillons de tissu
Température de souillure : 10 20C
Temps de souillure : 5 minutes (le sens de l'agitation est changé toutes les 30 secondes)
B. Processus de lavage
On lave les échantillons de tissu et on les rince (trois fois) sous les conditions suivantes dans un Terg-O-Tomètre.
Conditions de lavage Tissus souillés : 5 cm x 10 cm Détergent : 0, 133% (0,7 nKat/ml d'enzyme Rapport de bain : 1/85 Agitation : 105 tpm Temps de lavage : 10 min.
Conditions de rinçage Tissus souillés : 5 cm x 10 cm Rapport de bain : 1/85 Agitation : 105 tpm Temps de rinçage : 3 min.
Après le rinçage, on sèche à l'air les échantillons de tissu dans une pièce sans les exposer directement à la lumière du soleil.
C. Détergent et enzyme utilisés
On utilise les six détergents phosphatés et non phosphatés suivants comme détergent.
<Desc/Clms Page number 35>
Compositions des détergents
EMI35.1
<tb>
<tb> Composition <SEP> Détergent <SEP> Détergent <SEP> non
<tb> phosphaté <SEP> phosphaté
<tb> Agent <SEP> tensio-actif <SEP> 15% <SEP> 15%
<tb> Tripolyphosphate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 17
<tb> Zéolite-17
<tb> Silicate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Carboxyméthylcellulose <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Eau <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> le <SEP> restant <SEP> le <SEP> restant
<tb>
Le pH de chaque détergent mesuré à une concentration de 0,133% à 250C est le suivant :
pH du détergent
EMI35.2
<tb>
<tb> Type <SEP> d'agent <SEP> tensio-actif <SEP> Détergent <SEP> Détergent <SEP> non
<tb> phosphaté <SEP> phosphaté
<tb> Détergent <SEP> du <SEP> type <SEP> LAS <SEP> *1 <SEP> 10,18 <SEP> 10,18
<tb> Détergent <SEP> du <SEP> type <SEP> SUDS <SEP> 2 <SEP> 9,76 <SEP> 9,86
<tb> Détergent <SEP> du <SEP> type <SEP> AOS <SEP> *3 <SEP> 9,95 <SEP> 10, <SEP> 17
<tb>
EMI35.3
X 1 LAS : alkylbenzènesulfonate de sodium linéaire 2 SDS : dodécylsulfate de sodium 3 AOS : sulfonate d'alpha oléfine
L'enzyme utilisée est une protéase alcaline délivrée dans le commerce pour composition détergente ou la protéase alcaline"API-21"obtenue ci-dessus.
Les résultats sont donnés dans le Tableau V.
L'efficacité en tant que détergent des compositions à base de protéine est déterminée de la fa- çon suivante :
<Desc/Clms Page number 36>
Des échantillons de liquide sont obtenus en extrayant thermiquement des tissus souillés avant et après lavage avec 100 ml d'une solution de NaOH aqueuse 0,1 N à une température de 90 +2 C pendant 120 minutes. On colore chimiquement l'échantillon de liquide avec un réactif de Folin à base de cuivre et on mesure son absorption à une longueur d'onde de 750 nm. On calcule l'efficacité en tant que détergent (D) d'après l'équation suivante :
EMI36.1
où De représente l'absorption de l'extrait obtenu à partir de tissus de coton standard (lg).
Ds représente l'absorption de l'extrait obtenu à partir de tissus souillés (1 g) avant lavage.
Dw représente l'absorption de l'extrait obtenu à partir de tissus souillés (1 g) après lavage.
<Desc/Clms Page number 37>
tableauV
EMI37.1
<tb>
<tb> Présence <SEP> Temp. <SEP> Efficacité <SEP> en <SEP> tant <SEP> que <SEP> détergent <SEP> (%)
<tb> Détergent <SEP> de <SEP> de <SEP> Détergent <SEP> Incorporation <SEP> Protéase <SEP> alcaliné <SEP> du
<tb> phosphate <SEP> lavage <SEP> eau <SEP> uniquement <SEP> de <SEP> API-21 <SEP> commerce <SEP> pour <SEP> détergent
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Oui <SEP> 68, <SEP> 6 <SEP> 85, <SEP> 7 <SEP> 78, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Non <SEP> 68,8 <SEP> 82,0 <SEP> 77,3
<tb> type <SEP> SDS <SEP> Oui <SEP> 100C <SEP> 35,0 <SEP> 68, <SEP> 0 <SEP> 85,6 <SEP> 77,7
<tb> Non <SEP> 70,2 <SEP> 85,8 <SEP> 80, <SEP> 9 <SEP>
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Oui <SEP> 69, <SEP> 4 <SEP> 87, <SEP> 0 <SEP> 80,4
<tb> Non <SEP> 68,0 <SEP> 86,9 <SEP> 80,
0
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Oui <SEP> 73,9 <SEP> 89, <SEP> 8 <SEP> 88,6
<tb> Non <SEP> 72,0 <SEP> 90,0 <SEP> 88,5
<tb> type <SEP> SDS <SEP> oui <SEP> 250C <SEP> 40, <SEP> 9 <SEP> 74, <SEP> 0 <SEP> 91, <SEP> 0 <SEP> 89, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Non <SEP> 69,4 <SEP> 91,3 <SEP> 87,7
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Oui <SEP> 75,9 <SEP> 91,6 <SEP> 91,6
<tb> Non <SEP> 74,5 <SEP> 90,0 <SEP> 91,6
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Oui <SEP> 73,8 <SEP> 91,7 <SEP> 90,0
<tb> Non <SEP> 74,8 <SEP> 94,3 <SEP> 92,1
<tb> type <SEP> SDS <SEP> Oui <SEP> 400C <SEP> 45,9 <SEP> 73, <SEP> 2 <SEP> 92, <SEP> 4 <SEP> 90, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Non <SEP> 74,2 <SEP> 91,7 <SEP> 89,7
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Oui <SEP> 80, <SEP> 3 <SEP> 92,6 <SEP> 90, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Non <SEP> 79,0 <SEP> 91,2 <SEP> 91,0
<tb>
<Desc/Clms Page number 38>
Exemple 4
On répète le processus d'essai de lavage de l'Exemple 3,
à l'exception que l'on modifie l'activité de la protéase dans la solution de lavage et la température de lavage dans le cas du détergent non phosphaté du type LAS contenant la protéase alcaline "API-21".
Les résultats sont donnés dans le Tableau VI.
TABLEAU VI : efficacité en tant que détergent (%)
EMI38.1
<tb>
<tb> Activité <SEP> de
<tb> la <SEP> protéase
<tb> dans <SEP> la <SEP> solu-Température <SEP> de <SEP> lavage
<tb> tion <SEP> de <SEP> lavage
<tb> (nKat/ml) <SEP> 10 C <SEP> 25 C <SEP> 40 C
<tb> 0 <SEP> 68,8 <SEP> 72,0 <SEP> 74,8
<tb> 0,7 <SEP> 78,2 <SEP> 87,8 <SEP> 89,4
<tb> 2,1 <SEP> 80,5 <SEP> 88,6 <SEP> 92,8
<tb> 3,5 <SEP> 80,8 <SEP> 89,4 <SEP> 92,8
<tb> 7 <SEP> 82,0 <SEP> 89,8 <SEP> 94,3
<tb>
Exemple 5
On réalise des essais de blanchissage de tissus de col en coton souillés en utilisant différents détergents contenant la protéase alcaline"API-21" obtenue ci-dessus ou une protéase alcaline disponible dans le commerce pour composition détergente de la façon suivante :
A.
Préparation de tissus de col souillés
On découpe 200 pièces de tissus de col de coton standard souillés pour des essais de détergence, d'une dimension de 7 cm x 37 cm en petits morceaux d'une dimension de 1 cm x 5 cm. Les tissus de col
<Desc/Clms Page number 39>
sont usés pendant 1 semaine suivant la méthode décrite dans Motoi Minagawa et Ikuko Okamoto"Seni Seihin Shohi Kagaku"19, 106-115 (1978). Les petits morceaux sont cousus par dix de manière à former des tissus d'essai ayant une dimension de 5 cm x 10 cm et sont conservés à une température de OOC à 50C dans un emplacement sombre et au frais.
B. Processus de lavage
Les échantillons de tissu sont lavés et rincés (trois fois) sous les conditions suivantes dans un dispositif Terg-O-Tomètre.
EMI39.1
<tb>
<tb>
Conditions <SEP> de <SEP> lavage
<tb> Tissus <SEP> souillés <SEP> : <SEP> 5 <SEP> cm <SEP> x <SEP> 10 <SEP> cm
<tb> Détergent <SEP> : <SEP> 0,133% <SEP> (0,7 <SEP> nKat/ml
<tb> d'enzyme)
<tb> Rapport <SEP> de <SEP> bain <SEP> : <SEP> 1/85
<tb> Agitation <SEP> : <SEP> 105 <SEP> tpm
<tb> Temps <SEP> de <SEP> lavage <SEP> : <SEP> 10 <SEP> minutes
<tb> Conditions <SEP> de <SEP> rinçage
<tb> Tissus <SEP> souillés <SEP> : <SEP> 5 <SEP> cm <SEP> x <SEP> 10 <SEP> cm
<tb> Rapport <SEP> de <SEP> bain <SEP> : <SEP> 1/85
<tb> Agitation <SEP> : <SEP> 105 <SEP> tpm
<tb> Temps <SEP> de <SEP> rinçage <SEP> : <SEP> 3 <SEP> min.
<tb>
Après le rinçage, les échantillons de tissu sont séchés à l'air dans une pièce sans être exposés directement à la lumière du soleil.
C. Détergent et enzyme utilisés
On utilise les quatre détergents phosphatés et non phosphatés suivants comme détergent.
<Desc/Clms Page number 40>
Composition du détergent
EMI40.1
<tb>
<tb> Composition <SEP> Détergent <SEP> Détergent <SEP> non
<tb> phosphaté <SEP> phosphaté
<tb> Agent <SEP> tensio-actif <SEP> 15% <SEP> 15%
<tb> Tripolyphosphate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 17Zéolite <SEP> (4A)-17
<tb> Silicate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Carboxyméthylcellulose <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Eau <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> le <SEP> restant <SEP> le <SEP> restant
<tb>
Le pH de chaque détergent mesuré à une concentration de 0,133% à 25 C est le suivant :
pH du détergent
EMI40.2
<tb>
<tb> Type <SEP> d'agent <SEP> tensio-actif <SEP> Détergent <SEP> Détergent <SEP> non
<tb> phosphaté <SEP> phosphaté
<tb> Détergent <SEP> du <SEP> type <SEP> LAS <SEP> xl <SEP> 10,18 <SEP> 10,18
<tb> Détergent <SEP> du <SEP> type <SEP> AOS <SEP> x2 <SEP> 9,95 <SEP> 10,17
<tb>
1 LAS : alkylbenzènesulfonate de sodium linéaire 2 AOS : sulfonate d'alpha-oléfine
L'enzyme utilisée est une protéase alcaline disponible dans le commerce pour composition détergente ou la protéase alcaline"API-21"obtenue ci-dessus.
Les résultats sont donnés dans le Tableau VII ciaprès.
<Desc/Clms Page number 41>
Tableau VII
EMI41.1
<tb>
<tb> Efficacité <SEP> en <SEP> tant <SEP> que <SEP> détergent <SEP> (%) <SEP>
<tb> Présence <SEP> Temp.
<tb>
Détergent <SEP> de <SEP> de <SEP> Détergent <SEP> Incorporation <SEP> Protéase <SEP> alcaline <SEP> du
<tb> Détergent <SEP> Phosphate <SEP> lavage <SEP> Eau <SEP> uniquement <SEP> de <SEP> API-21 <SEP> commerce <SEP> pour <SEP> détergent
<tb> type <SEP> LAS <SEP> oui <SEP> 70, <SEP> 1 <SEP> 82, <SEP> 0 <SEP> 77, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Non <SEP> 100C <SEP> 49,3 <SEP> 66, <SEP> 7 <SEP> 82, <SEP> 1 <SEP> 73, <SEP> 6 <SEP>
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Oui <SEP> 80, <SEP> 4 <SEP> 87,4 <SEP> 86,4
<tb> Non <SEP> 75,0 <SEP> 86,8 <SEP> 83,3
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Oui <SEP> 78, <SEP> 7 <SEP> 85, <SEP> 7 <SEP> 79,0
<tb> Non <SEP> 250C <SEP> 52, <SEP> 1 <SEP> 78,0 <SEP> 80,1 <SEP> 74,2
<tb> Oui <SEP> 80,4 <SEP> 89,6 <SEP> 87,3
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Non <SEP> 80, <SEP> 2 <SEP> 91, <SEP> 2 <SEP> 88, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Oui <SEP> 80,3 <SEP> 86,8 <SEP> 86,
8
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Non <SEP> 40 C <SEP> 58,3 <SEP> 81,0 <SEP> 91,2 <SEP> 89,7
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Oui <SEP> 82,6 <SEP> 90, <SEP> 1 <SEP> 89,0
<tb> Non <SEP> 86,1 <SEP> 89,1 <SEP> 90,4
<tb>
<Desc/Clms Page number 42>
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.
<Desc / Clms Page number 1>
"Alkaline protease, its preparation and use"
<Desc / Clms Page number 2>
"Alkaline protease, its preparation and use"
The present invention relates to a new alkaline protease API-21 and to the process for the preparation thereof. More specifically, the invention relates to the alkaline protease API-21 originating from a bacterium and having an enzymatic activity even at a relatively low temperature (for example from room temperature up to approximately 400C) under alkaline conditions and it also relates to a process for the preparation of this protease from the culture of a new species of bacteria NKS-21 belonging to the genus Bacillus.
Alkaline proteases are widely used in fields such as, for example, the leather industry, the food industry, the fiber or textile industry, and the medicinal or pharmaceutical industry; the reason for this comes from the fact that alkaline proteases are rather stable against heat compared to neutral proteases. In addition, market demand for enzymes as a detergent additive has increased recently. The enzymes commonly used as a detergent additive are alkaline proteases from bacteria belonging to the genus Bacillus, which show activity
<Desc / Clms Page number 3>
maximum at a pH of about 9 to about 10.
Most of the above-mentioned enzymes show maximum activity at a relatively high temperature, in particular around 60 C, but are inactive or less active at a relatively low temperature, in particular around room temperature. This means that the characteristics of enzymes are not fully used in countries such as Japan, where clothes are usually washed at room temperature. In addition, the development of enzymes having enzymatic activity which is maintained even at a relatively low temperature is necessary due to the recent increased use of clothing made of chemical fibers having a relatively low heat stability and also due to the recent movement. energy saving.
Therefore, the object of the present invention is to overcome the aforementioned drawbacks of known alkaline proteases by providing a new alkaline protease having a high enzymatic activity at a relatively low temperature.
Another object of the present invention is to provide a process for the preparation of a new alkaline protease having a high enzymatic activity from a new bacterium capable of producing the latter.
The other objects and advantages of the present invention will emerge from the following description.
According to the present invention, provision is made
<Desc / Clms Page number 4>
an alkaline protease Api-21 having the following physicochemical properties: (1) Activity: It hydrolyzes casein under alkaline conditions, with a pH range
EMI4.1
optimal from 10 to 11, and has an optimal temperature range with regard to its activity from 450C to 50 C; (2) Stability: No decrease in enzymatic activity observed up to 40 C by heating without substrate for 10 minutes at a pH of 10, but decrease of 90% or more in the enzymatic activity observed at 50 C for 10 minutes at a pH of 10.
Deactivation appears at 50 ° C. for 10 minutes at pH 8 and complete deactivation occurs practically at 60 ° C. for 10 minutes at pH 8. The protease is stable under alkaline conditions, in particular in a pH range from 7 to 11, 5, and it is stable vis-à-vis freezing and drying by evaporation of ice or freezing; (3) Enzyme molecule:
The protease is a protein with a molecular weight of approximately 22,000 as determined by gel filtration on Sephatex G-75 (registered trademark) at pH 10, an isoelectric point of 7.4 as determined by an electrofocusing method, an absorption peak of 275 to 282 nm in a UV absorption spectrum, the absorption characteristics in the infrared as shown in FIG. 5, and a serine residue in the active site thereof.
According to the present invention, there is also provided a process for the preparation of alkaline protease
<Desc / Clms Page number 5>
API-21 line comprising the following steps: (a) culturing a species of NKS-21 of the genus Bacillus capable of producing alkaline protease API-21 in an alkaline culture medium; and (b) recovering the API-21 alkaline protease from the cultured product.
Other details and particularities of the invention will emerge from the description below, given by way of nonlimiting example and with reference to the appended drawings, in which:
FIG. 1 graphically represents the optimal pH range of the enzyme according to the present invention.
FIG. 2 graphically represents the stability with respect to the pH of the enzyme without substrate according to the present invention.
FIG. 3 graphically represents the range of active temperatures and the optimal temperature of the enzyme according to the present invention.
FIGS. 4A and 4B graphically represent the stabilities with respect to the temperatures of the enzyme without substrate according to the present invention at pH 10 and 8 respectively.
FIG. 5 represents the infrared spectrum with Fourier transformation of the enzyme according to the present invention.
The Applicant has studied bacteria which could produce an alkaline protease having a high activity at a relatively low temperature.
Following the classification and research of a large number of strains of bacteria isolated from
<Desc / Clms Page number 6>
earth or natural soil, the new bacteria belonging to the genus Bacillus sp. nov. NKS-21 (referred to below as NKS-21 which can produce alkaline protease with high activity at relatively low temperature has been isolated from natural soils at Fuchu-shi, Tokyo, Japan. microbiological of this bacterium that a strain NKS-21 capable of producing alkaline protease API-21 according to the present invention is a new aerobic sporangium bacterium belonging to the genus Bacillus.
This bacterium NKS-21 was deposited on February 3, 1982 at the Fermentation Research Institute (FRI) (Japan) under the name of Bacillus sp. FERM BP-93 in accordance with the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure.
The microbiological properties of this bacterium are explained below. The reagents and isolation methods used to determine the microbiological properties of the NKS-21 bacteria are those described in the "Bergey" s Manual of Determinative Bacteriology "(8th edition) (1974).
The isolation of the bacteria from the soil is carried out as follows; a small amount of soil or earth is added to a peptone-based medium and the culture is carried out using a shaking culture device under pH conditions of 7 to 10 and temperatures of 10 to 40 C for 40 to 150 hours.
A part of the cultivated product is spread on agar plates and the strain is isolated by an isolating method.
<Desc / Clms Page number 7>
usually pure.
Microbiological properties of the bacteria
NKS-21 (a) Morphological characteristics.
(1) Dimension of vegetative cells:
0.6-0.8 µm x 2.5-3.5 µm (microns).
(2) Cellular pleomorphism:
Cells sometimes grow to a size of 0.6-1.0 µm x
4.5 pm.
(3) Gram staining:
Positive but discolours easily.
(4) Motility:
Mobile with peritrichous flagella.
(5) Spores:
Oval to elliptical, subterminal,
EMI7.1
0.8 µm x 2 µm.
(6) Sporangia:
Slightly swollen.
(7) Resistance to acids:
Negative.
(b) Cultural characteristics in different environments
EMI7.2
.
(1) Peptone broth: (i) pH 9.5, good growth at both 200C and 30 C. pH 7.2, poorly developed growth at 200C and good growth at 300C (ii) growth at pH 9.5
Growth between 14 C and 41 C
<Desc / Clms Page number 8>
No growth above 43 C or below 12 C.
(2) Other environments:
Culture of agar with peptone - meat extract:
Good growth
Peptone broth-meat extract containing 7% sodium chloride:
Good growth
Peptone broth-meat extract:
Good growth
Culture of agar with peptone- meat extract-casein:
Good growth
Peptone broth - meat extract - casein:
Good growth
Peptone-starch broth:
Good growth
Peptone-glucoce broth:
Good growth
Agar plate with yeast-triptone extract:
Good growth
Yeast starch extract broth:
Column growth based on gelatin - meat extract:
(i) pH 10.0, 300C
Growth and liquefaction (ii) pH 10.0, 20 C
Low surface growth and weak liquefaction
<Desc / Clms Page number 9>
(iii) pH of 7.2, 300C
Growth and liquefaction (iv) pH 4.2, 200C
Low surface growth and low liquefaction (3) Growth under anaerobic conditions:
No growth under anaerobic conditions, but growth under aerobic conditions.
(c) Physiological characteristics (1) Reduction of nitrates to nitrites:
No reduction (2) Anaerobic production of gas from nitrate:
Negative (3) Methyl red (MR) test:
Negative (4) Voges-Proskauer (VP) test:
Negative (5) Indole production:
None (6) Production of H2S:
None (7) Starch hydrolysis:
Positive (8) Use of citrate:
Positive (9) Use of inorganic nitrogen source:
Uses nitrates and ammonium salts
<Desc / Clms Page number 10>
(10) Pigment production:
None (11) Urease test:
Negative (12) Cytochrome oxidase test:
Positive (13) Catalase test:
Positive (14) Test O-F (middle of Hugh and
Leifson):
Low fermentation (15) Production of acid and production of gas from carbohydrates:
EMI10.1
<tb>
<tb> Production <SEP> Production
<tb> acid <SEP> from <SEP> gas
<tb> L-arabinoseD-xylose-D-glucose-D-mannose-D-fructose-D-galactose <SEP> + Maltose <SEP> + Sucrose <SEP> + LactoseTrehalose <SEP> + D-sorbitol <SEP> + D-mannitol <SEP> + Inositol <SEP> +
<tb> Glycerol <SEP> + Starch <SEP> + RiboseRaffinose <SEP> + Cellobiose <SEP> + -
<tb> (Notes) <SEP> +: <SEP> positive, <SEP> -: <SEP> negative
<tb>
<Desc / Clms Page number 11>
(16) Others (i) Deamination of phenylalanine:
Positive (ii) Hydrolysis of casein:
Positive (iii) Breakdown of tyrosine:
Positive
As indicated above, the NKS-21 strain of the present invention is an aerobic sporangium bacterium which, as it is firmly believed, belongs to the genus Bacillus.
The characteristics of this strain lie in the fact that the strain grows in neutral to alkaline media, and that the optimum pH range for growth extends from 8 to 10. These properties r. microbiological are similar to those of the known strains Bacillus pasteurii and Bacillus alcalophilus. The strain NKS-21 of the present invention is however clearly distinguished from the two strains mentioned above by certain microbiological properties, although certain microbiological properties of the strain NKS-21 are the same as those of the known strains mentioned above. For example, the Bacillus pasteurii and Bacillus alcalophilus strains both develop in an alkaline pH region, but the latter cannot develop at a pH of 7.
In contrast, the NKS-21 strain grows well not only in an alkaline pH region but also at neutral pH. Therefore, the NKS-21 strain differs from the Bacillus alcalophilus strain in this respect. In addition, Bacillus pasteurii does not hydrolyze starch, while the NKS-21 strain hydrolyzes starch. The NKS-21 strain stands out
<Desc / Clms Page number 12>
still Bacillus pasteurii in the following respects: (1) Bacillus pasteurii reduces the nitrates, while the strain NKS-21 does not reduce the nitrates; (2) Bacillus pasteurii has spherical or almost oval endospores, while the endospores of NKS-21 are oval to elliptical; and (3) Bacillus pasteurii breaks down urea, while the NKS-21 strain does not break down urea.
In view of the above-mentioned differences in microbiological properties, the NKS-21 strain clearly differs from the Bacillus pasteurii strain.
The classification results for Bacillus alcalophilus are not described in detail in the "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" mentioned above. Since the standard strain of Bacillus alcalophilus was not available, the microbiological properties of NKS-21 were compared experimentally with those of the original strains Bacillus alcalophilus NCIB 10436 and NCIB 10438 cited in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" . NCIB 10436 and NCIB 10438 were both slightly positive in the Gram stain reaction and were easily discolored. These properties are similar to those of the NKS-21 strain.
Regarding the morphological characteristics of the vegetative cells, short rods having a dimension of 0.7 µm x 2.0 µm and long rods having a dimension of 0.8 µm x 4.6 µm were noticed at mid
<Desc / Clms Page number 13>
electron croscope in the strain NCIB 10436, and vegetative cells having a dimension of 0.7 pm × 1.5 pm were noticed in the strain NCIB 10438. On the other hand, it was determined by means of the electron microscope that the size of the cells of the NKS-21 strain was 0.6-0.8 pm x 2, cm and that the endospores had an oval to elliptical shape with a dimension of 0.8 pm x 1.2 u. m. No motility was observed in the NCIB 10436 and 10438 strains, while the NKS-21 strain is mobile.
In addition, the physiological properties of NKS-21 are clearly different from those of strains NCIB 10436 and NCIB 10438 under the following points: (1) Bacillus alcalophilus NCIB 10436 and NCIB 10438 do not develop in a medium based on mannitol, while that NKS-21 develops there; and (2) NCIB 10436 does not develop in a peptone-meat extract broth containing 7% sodium chloride, while NCIB 10438 and NKS-21 develop there.
According to the above-mentioned differences, the NKS-21 strain is distinguished from Bacillus alcalophilus NCIB 10436 and NCIB 10438, although some microbiological properties of NKS-21 are similar to those of Bacillus alcalophilus.
In addition, the NKS-21 strain is similar to Bacillus subtilis in that the vegetative cells of Bacillus subtilis are 0.7 to 0.8 µm in width and 2 to 3 µm in length and that Bacillus subtilis breaks down the starch. However, the
<Desc / Clms Page number 14>
strain NKS-21 differs from Bacillus subtilis by the following points: (1) Bacillus subtilis develops well at a pH of 5.5 to 8.5, but does not develop at a pH of 9 to 10, pH at which the NKS-21 strain grows well; and (2) The maximum growth temperature of Bacillus subtilis is 45 C to 55 C, while the strain NKS-21 does not grow above 430C.
Consequently, the NKS-21 strain clearly differs from Bacillus subtilis.
Thus, the strain NKS-21 is clearly distinguished by its microbiological properties from the known strains of Bacillus pasteurii, Bacillus alcalophilus and Bacillus subtilis and that any strain having the same microbiological properties as NKS-21 is not described in the " Bergey's Manual of Determinative Bacteriology ". Therefore, the NKS-21 strain is identified as a new strain belonging to the genus Bacillus.
According to the present invention, the new alkaline protease API-21 having a high activity at a relatively low temperature is prepared by cultivating the new strain NKS-21 in an alkaline culture medium, and recovering it from the cultured product. Microorganisms usable in culture are not limited to NKS-21, and microorganisms such as natural or artificial mutants of NKS-21 can also be used as long as they can produce alkaline protease API-21. These microorganisms enter the
<Desc / Clms Page number 15>
part of the present invention.
The new alkaline protease API-21 obtained by cultivating the NKS-21 strain according to the present invention will be explained in detail.
The NKS-21 strain can be grown aerobically, for example in a peptone-based culture medium having a pH of 8 to 10, the culture being subjected to shaking or aerobic shaking after inoculation of NKS-21 in the medium culture at a temperature of 10 C to 400 C for 40 to 150 hours. After completion of the culture, the cultured microbial cells are easily separated from the cultured product and a clear culture supernatant solution is obtained. The alkaline protease API-21 is easily precipitated by the addition of an organic solvent, such as methanol, to the supernatant solution. The precipitated API-21 alkaline protease is subjected to centrifugal separation and dried by vacuum freezing.
This is how the desired enzyme, namely the alkaline protease API-21, can be obtained.
The activity of the API-21 alkaline protease thus obtained is determined as follows.
The cultured clear solution or the enzyme solution is appropriately diluted with a 0.1 M sodium carbonate-0.1 M boric acid buffer solution, 0.1 M potassium chloride (pH 10.0).
To 0.5 ml of the resulting solution is added 0.5 ml of a 2% solution of milk casein having a pH of 10.0 and then an enzymatic reaction is carried out at 30 ° C. for 10 minutes. Once
<Desc / Clms Page number 16>
the reaction completed, to the reaction mixture is added to complete the reaction 2 ml of 0.1 M trichloroacetic acid containing 0.2 M acetic acid and 0.2 M sodium acetate. The mixture is left at rest for 10 minutes or more at 300C and then filtered through filter paper. To 1 ml of the filtrate obtained above is added 1 ml of 0.4 M sodium carbonate and five times 1 ml of diluted "reactive phenol" and the mixture is left to stand at 300 ° C. for 20 minutes so that the color appears.
Then, the absorption of the colored mixture is measured at 660 nm.
The unit of enzyme is determined in accordance with the "Commission on Biochemical Nomenclature" (Comprehensive Biochemistry volume 13, pages 26 and 27,1973), according to which the amount of alkaline protease which releases substances soluble in trichloroacetic acid showing a color production at 660 nm corresponding to 1 mole of tyrosine from a casein substrate (1%) having a pH of 10.0 at 30 C for 1 second is defined as "1 katal".
The physicochemical properties of the alkaline protease API-21 (hereinafter called the enzyme of the present invention) will now be described in detail.
(1) Activity
It hydrolyzes proteins such as casein, hemoglobin, albumin, globulin, meat protein, fish protein and soybean protein.
(2) Effect of pH on enzyme activity
As shown in Figure 1, the optimal pH is from about 10 to about 11. The relative activity
<Desc / Clms Page number 17>
ve was determined as follows.
Each buffer solution (0.5 ml) mentioned below containing 2% milk casein was added to 50 µl of the enzyme solution of the present invention to prepare a test solution. pH Buffer solution 6-9 potassium phosphate 0.1 M-sodium borate 0.05 M sodium karbonate 0.1 M-boric acid O, 1M- potassium chloride 11-12 disodium hydrogen phosphate 0.1 M-sodium hydroxide sodium
The enzymatic activity of the test solution was determined as described above. The relative activity (%) was calculated, the enzymatic activity at pH 10.0 having been defined as being 100%.
(3) Effect of pH on stability without substrate
As shown in Figure 2, the enzyme of the present invention is stable in the pH range from about 7 to about 11.5.
The stability of the enzyme of the present invention was evaluated as follows.
Each buffer solution (0.5 ml) mentioned
EMI17.1
below was added to 50 µl of the enzyme solution of the present invention dialyzed and appropriately diluted and the mixture was incubated at 30 ° C for 10 minutes.
<Desc / Clms Page number 18>
pH Buffer solution 3-8 citric acid 0.1 M-disodium hydrogen phosphate 0.2 M 8-11 sodium carbonate 0.1 M-boric acid
0.1 M potassium chloride 11-12 sodium hydrogen phosphate 0.15 M sodium hydroxide
After incubation, 9.5 ml of a 0.1 M carbonate buffer solution containing 2% casein and having a pH of 10.0 is added to the mixture. The enzymatic activity of the mixture was determined from the way as described above.
The relative activity (%) was calculated, the enzymatic activity at pH 10.0 having been defined as being 100%.
As shown in Figure 2, the enzyme of the present invention has been found to be most stable at a pH of about 10 to about 11. In this pH region, the initial activity of the enzyme present invention was fully preserved. In addition, the enzyme showed 80% or more of the remaining activity in the pH range from 7 to 11.5.
(4) Effect of temperature on enzyme activity
As indicated in FIG. 3, the enzyme of the present invention has been found to be active vis-à-vis the casein core temperature from 5 to 650C and at a pH of 10.0. The optimum temperature was 45 to 50 C.
(5) Effect of temperature on stability without substrate
As indicated in FIGS. 4A and 4B, the activity of the enzyme of the present invention is completely preserved up to 40 ° C. by heating without
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substrate at a pH of 10.0 for 10 minutes, but most of the activity is: lost at 50 C. In addition, the activity of the enzyme of the present invention
EMI19.1
tion is stored up to 45 C at a pH of 8 for 10 minutes, but deactivation occurs at 50 C and the enzyme is practically deactivated at 60 C.
(6) Storage stability
The enzyme of the present invention is stable against freezing and drying by freezing or evaporation of ice. No significant decrease in the activity of the freeze-dried sample was observed when the sample was left at room temperature for 2 weeks. When the dried sample is frozen in a desiccator at room temperature, the activity of the enzyme of the present invention is fully maintained.
(7) Inhibition
The enzyme of the present invention has been singularly inhibited by an active serine residue inhibitor, such as diisopropylfluorophosphoric acid (DFP) and phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF). It was also inhibited by benzyloxycarbonyl-phenylalanine-chloromethyl ketone (ZPCK). However, the enzyme of the present invention was not inhibited by tosyl-phenylalanine-chloromethyl ketone (TPCK), which is an inhibitor of an animal serine protease, chymotrypsin and tosyl-lysine-chloromethyl ketone ( TLCK), which is a trypsin inhibitor.
In addition, the activity of the enzyme pre-
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The present invention has not been adversely modified by the addition of p-chloromercury benzoate (PCMB) and ethylenediaminetetraacetate (EDTA). In addition, the activity of the enzyme of the present invention was not adversely altered by the addition of pepstatin. Following the above inhibition tests, it is clear that the enzyme of the present invention is a protease having a serine residue in the active site.
(8) Method for determining enzyme activity
As mentioned above.
(9) Molecular weight
The molecular weight of the enzyme of the present invention is approximately 22,000 as determined by gel filtration on Sephatex (registered trademark) G-75 at a pH of 10.
(10) Isoelectric point
The isoelectric point of the enzyme of the present invention is 7.4 as determined by an electrofocusing method.
(11) Absorption in the ultraviolet (UV)
The absorption peak is present at 275-282 µm in the UV absorption spectrum.
(12) Infrared (IR) absorption spectrum
As shown in figure 5.
(13) Elementary analysis
Has been omitted for the reason that the characteristic differences in this type of high molecular weight substances, such as the enzyme of the present invention, cannot be clearly demonstrated
<Desc / Clms Page number 21>
by comparing their content of elements, such as carbon, nitrogen or hydrogen.
(14) Amino acid composition
The amino acid composition of protease API-21 calculated on the basis of the results obtained by an acid hydrolysis of the enzyme with the exception of cysteine / cystine and tryptophan, by a decomposition of performic acid for the analysis concerning cysteine / cystine and by an alkaline decomposition for the analysis relate to tryptophan, according to the method described in the literature ("Methods in Enzymology" volume II, 1967, Academic Press, New York) is indicated in Table I, at the same as the compositions of other alkaline proteases,
EMI21.1
1, the results of which are cited in 2).
As indicated in Table I, there are large differences between the API-21 enzyme and the other enzymes mentioned in the amino acid compositions, such as serine, arginine, lysine, valine, alanine, tryptophan, proline, etc.
<Desc / Clms Page number 22>
TABLE I Comparison of amino acid compositions between API-21 and other alkaline proteases
EMI22.1
<tb>
<tb> Amino acid <SEP> API-21 <SEP> Subtilisin <SEP> Subtilisin
<tb> Novo <SEP> 1) <SEP> Carlsberg <SEP> 2)
<tb> Lysine <SEP> 4 <SEP> 11 <SEP> 9
<tb> Histidine <SEP> 8 <SEP> 6 <SEP> 5
<tb> Arginine <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 4
<tb> Tryptophan <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 1
<tb> Acid <SEP> aspartic / 2711 <SEP> 9
<tb> asparagine <SEP> 17 <SEP> 19
<tb> Threonine <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 19
<tb> Serine <SEP> 17 <SEP> 37 <SEP> 32
<tb> Acid <SEP> glutamic / 14 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP>
<tb> gultamine <SEP> 11 <SEP> 7
<tb> Proline <SEP> 7 <SEP> 14 <SEP> 9
<tb> Glycine <SEP> 30 <SEP> 33 <SEP> 35
<tb> Alanine <SEP> 26 <SEP> 37 <SEP> 41
<tb> Valine <SEP> 20 <SEP> 30 <SEP> 31
<tb> Isoleucine <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 10
<tb> Leucine <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16
<tb> Tyrosine <SEP> 12 <SEP>
10 <SEP> 13
<tb> Phenylalannine <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Cysteine / 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> cystine
<tb>
* 1) J. Biol. Chem., 243.5296 (1968) * 2) J. Biol. Chem., 243.2134 (1968)
As can be seen from the above results, the enzyme of the present invention, which has an optimum pH of 10 to 11, retains activity at a relatively low temperature, but is deactivated at
<Desc / Clms Page number 23>
a relatively high temperature (i.e. 500C or more). The enzyme of the present invention having these physicochemical properties will now be compared to the properties of known similar alkaline proteases.
Among the extracellular alkaline proteases originating from Gram positive bacteria, we know well, for example, the alkaline protease (Carlsberg subtilisin) originating from Bacillus licheniformis and the alkaline protease (subtilisin Novo) originating from Bacillus subtilis.
These enzymes are proteases having a serine residue in the active site, a molecular weight of about 27,000 to 30,000 and an isoelectric point of 9 to 11. Most of the other reported extracellular alkaline proteases derived from the genus Bacillus have a molecular weight of 25,000 to 30,000 and an isoelectric point from 9 to 11. Most of the above-mentioned enzymes are not deactivated by heating at 50 ° C. and at pH 10 for 10 minutes. The known alkaline proteases with a lower molecular weight from the genus Bacillus are the alkaline proteases E-1 and E-2 from Bacillus nO D-6, both having a molecular weight of 20,000, the activity of which does not decrease at all by
EMI23.1
heating to 50 ° C. and to a pH of 9.0 (see Japanese patent application examined No. 56-4236).
In addition, an alkaline protease derived from Bacillus alcalophilus NCIB 10436 and an alkaline protease derived from Bacillus alcalophilus NCIB 10438 are known in the art as an alkaline protease derived from the genus Bacillus.
<Desc / Clms Page number 24>
These enzymes however retain approximately 90% of the activity by heating at 500C and pH 10 for 10 minutes, as indicated in Table II. Likewise, also as indicated in Table II, the alkaline proteases originating from Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis retain 70 to 80% of the activity by heating at 500C and at pH 10 for 10 minutes. Thus, alkaline proteases from bacteria belonging to the genus Bacillus such as Bacillus subtilis are stable in a region of relatively high temperatures.
Unlike. eci, as mentioned above, the enzyme of the present invention loses most of its activity by heating at 500C and at pH 10 for 10 minutes, while being stable by heating at a temperature up to 40 C and at pH 10 for 10 minutes. In addition, deactivation of the enzyme of the present invention occurs by heating to
EMI24.1
around 500C and at pH 8 for 10 minutes and most of its activity is lost at 600C under the same conditions.
In view of the differences which are found in temperature stability, molecular weight and isoelectric point, the enzyme of the present invention is clearly distinguished from known alkaline proteases originating from bacteria belonging to the genus Bacillus and does not have has been reported in publications. Therefore, the enzyme of the present invention should be considered to be a new enzyme and is referred to as the "alkaline protease API-21".
<Desc / Clms Page number 25>
TABLE II
EMI25.1
<tb>
<tb> Protease <SEP> alkaline <SEP> Weight <SEP> mole-Point <SEP> iso-Activity <SEP> remaining <SEP> (%) <SEP> after
<tb> cular <SEP> electric <SEP> heating <SEP> to <SEP> pH <SEP> 10 <SEP> pen. <SEP> in <SEP>
<tb> 10 <SEP> minutes
<tb> 500C <SEP> 600C <SEP>
<tb> Protease <SEP> alkaline <SEP> from <SEP> * 3) <SEP> * 3)
<tb> of <SEP> Bacillus <SEP> licheniformis <SEP> 27.287 <SEP> 9.4 <SEP> 78 <SEP> <2
<tb> Protease <SEP> alkaline <SEP> from <SEP> * 4) <SEP> * 4)
<tb> of <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 27.537 **) <SEP> 9.1 **) <SEP> 70 <SEP> <2
<tb> Protease <SEP> alkaline <SEP> from
<tb> of <SEP> Bacillus <SEP> alcalophilus
<tb> NCIB <SEP> 10436--94 <SEP> 73
<tb> Protease <SEP> alkaline <SEP> from
<tb> of <SEP> Bacillus <SEP> alcalophilus
<tb> NCIB <SEP> 10438 <SEP> 25.
<SEP> 000-85 <SEP> 63
<tb> Protease <SEP> alkaline <SEP> from
<tb> of <SEP> Bacillus <SEP> NKS-21 <SEP> 22. <SEP> 000 <SEP> 7.4 <SEP> 6 <SEP> 1
<tb>
* 3) Fette Seiten Anstrichmittel. 75, p49 (1973) * 4) The Enzymes, vol III, p564 (1971)
<Desc / Clms Page number 26>
The enzyme "API-21" of the present invention can be used with a substance which promotes the cleaning action of detergents and can therefore be used as a detergent additive, since this enzyme is stable at a pH of 7 to 11 , 5 and that the maximum enzymatic activity is reached at a pH of 10 to 11, as mentioned above.
In particular, the enzyme of the present invention retains its high activity even at a relatively low temperature (for example 200C to 300C), compared to the usual enzymes used with detergents. Consequently, the enzyme of the present invention is a type of alkaline protease which is particularly advantageous as an additive for household detergents in countries where clothes are washed at room temperature such as Japan. In addition, the enzyme of the present invention can be used effectively in the treatment of residues and in the treatment of waste water for the purpose of rapid protein breakdown and reuse of nitrogen resources, as protein levels in household waste and domestic wastewater have recently increased.
In addition, the use of the protease of the present invention in the food industry, such as in the treatment of food materials, proves to be advantageous, since the enzyme can be easily deactivated after use by heating at a relatively low temperature, for example 50 to 60 C.
Thus, the use of the enzyme of the present invention is effective from the point of view of controlling
<Desc / Clms Page number 27>
the quality of the processed food material.
In the case where the enzyme "API-21" of the present invention is incorporated into a detergent composition, the enzyme "API-21" is generally used in an amount of 5 to 500 nKatals (or zo Katal ), preferably at a rate of 10 to 100 nKatals relative to 1 g of the detergent composition, although there is no limitation on the amount of enzyme used.
In addition to the enzyme "API-21", the detergent composition containing the enzyme may contain any of the usual detergent ingredients without changing its amount compared to ordinary detergent compositions. Typical examples of such detergent ingredients are surfactants in amounts of 10 to 50% by weight, substances promoting the cleaning action in amounts of 0 to 50% by weight, alkaline agents or inorganic electrolytes in the right amount. from 1% to 50% by weight, and anti-redeposition agents, enzymes, bleaching agents, optical dyes (or fluorescent), agents preventing cake formation and antioxidants. The incorporation of the enzyme "API-21" can be carried out in any conventional manner.
However, the enzyme is preferably combined in the detergent composition in the form of a solution or in a form such that any formation of dust, as far as environmental protection is concerned, is prevented.
The present invention will now be illustrated in more detail by the examples not
<Desc / Clms Page number 28>
following limits, in which all the percentages are expressed by weight, unless otherwise indicated.
Example 1
The new NKS-21 strain of the present invention is grown in a coated culture medium.
The cultured product is suspended in sterilized water and 0.5 ml of this suspension is used as an inoculation product.
An enzyme-producing culture medium containing 1% casein, 1% meat extract, 1% polypeptone and 1% sodium bicarbonate is adjusted to a pH of 9.5 or 7.2 by adding thereto. aqueous sodium hydroxide or hydrochloric acid.
In a shake culture process (A) using a rotary shaker, 100 ml, 200 ml or 300 ml of the medium prepared above having a pH of 9.5 is added to a 1 liter Erlenmeyer flask. After sterilization, 0.5 ml of the suspension of NKS-21 prepared above is inoculated into the culture medium and the culture is carried out at 20 ° C. and under stirring conditions of 200 revolutions per minute for 41.65 or 89 hours.
On the other hand, in a shaking culture with reciprocating motion (B), 100 ml of the culture medium prepared above having a pH of 9.5 or 7.2 are added to a 500 ml Sakaguchi container. After sterilization, 0.5 ml of the suspension of NKS-21 prepared above is inoculated into the culture medium and the process is carried out.
<Desc / Clms Page number 29>
culture shaking back and forth under shaking conditions of 110 strokes per minute at 300C for 66 or 90 hours.
After the culture process, the cultured product is centrifuged at 28,000 x g for 15 minutes and the resulting supernatant solution is collected. The alkaline protease activity of this solution is determined as described above.
The results are given in Tables III and IV.
TABLE III Results of the rotary shaking culture process (A) (20 C, initial pH of the medium = 9.5)
EMI29.1
<tb>
<tb> Quantity <SEP> from <SEP> Activity <SEP> enzymatic <SEP> (microkatal / liter)
<tb> middle <SEP> (ml) <SEP> 41 <SEP> hrs <SEP> 65 <SEP> hrs <SEP> 89 <SEP> hrs
<tb> 100 <SEP> 1.3 <SEP> 2.6 <SEP> 2.7
<tb> 200 <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> 4.3 <SEP> 4, <SEP> 0
<tb> 300 <SEP> 2.5 <SEP> 5.6 <SEP> 5.4
<tb>
TABLE IV Results of the reciprocating shaking culture process (B) (300C)
EMI29.2
<tb>
<tb> pH <SEP> initial <SEP> Activity <SEP> enzymatic <SEP> (microkatal / liter
<tb> of <SEP> middle <SEP> 66 <SEP> hrs <SEP> 90 <SEP> hrs
<tb> 9.6 <SEP> 4.5 <SEP> 3.0
<tb> 7.2 <SEP> 4.9 <SEP> 3,
4
<tb>
When the NKS-21 strain is subjected to a shaking-type culture back and forth at 30 ° C., the growth of the NKS-21 strain is good not only at an initial medium pH of 9.5
<Desc / Clms Page number 30>
but also at an initial medium pH of 7.2 and the desired alkaline protease API-21 is obtained at a high rate in each case. As in the case where an initial medium with a pH of 9.5 is used, similar results are obtained when the NKS-21 strain is cultivated in a shaker moving back and forth at 20 ° C. and at an initial medium pH of 7.2.
7 liters of the supernatant solution are cooled to 30C after the centrifugal separation of the cultured product (NKS-21) obtained above.
Then, twice by volume of ethyl alcohol previously cooled to 30 ° C. is added to the cooled supernatant solution to form precipitates. The resulting precipitates are separated by centrifugation at 11000 xg in a cooled centrifugal separation device and "then, the separated precipitates are immediately dried by vacuum freezing. Thus, 15.7 g of the powder are obtained. enzyme desired.
The specific activity of the alkaline protease thus obtained on the basis of 1 kg of protein is 0.71 u. Katal (0.71 pKatal / kg of protein) and the recovery yield is 33%, the protein being determined according to the Lowry method.
The freeze-dried enzyme sample thus obtained is dissolved in a potassium chloride-bEric acid-sodium carbonate 0.01 M buffer solution (pH 10.0) containing 0.2 M sodium chloride The enzymatic solution is filtered on gel on a column (diameter of 2 cm x
<Desc / Clms Page number 31>
74 cm) filled with Sephadex G-75 (registered trademark of Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden) previously equilibrated with the aforementioned buffer solution and eluate fractions of 3 ml are collected. The purified enzyme is obtained from the main fractions which have a high enzymatic activity.
The enzyme thus obtained has a molecular weight of approximately 22,000 as measured by gel filtration on Sephadex G-75 (registered trademark) at pH 10 and an isoelectric point of 7.4 as measured by an electrofocusing method. The specific activity of the enzyme thus obtained increased by about ten times compared to that without gel filtration and the specific activity obtained on the basis of 1 kg of protein is 7.0 pkatals. The recovery yield is 70%.
Example 2
The production of alkaline protease in a 500 liter fermentation tank and the subsequent production of the enzyme preparation are carried out using the NKS-21 strain producing alkaline protease.
An enzyme-producing culture medium containing 1% casein, 1% meat extract, 1% polypeptone and 1% sodium bicarbonate is adjusted to pH 9.5 by adding this aqueous sodium hydroxide . 300 ml of the medium prepared above are added to a 1 liter Erlenmeyer flask. After sterilization, 0.5 ml of the suspension of NKS-21 prepared in the same manner as in Example 1 is inoculated into the culture medium and
<Desc / Clms Page number 32>
culture at 200C for 3 days. 300 ml of the resulting cultured product are added to a sterilized 30 liter fermentation vessel containing 10 liters of the culture medium prepared above having a pH of 9.5.
Then, a culture is carried out with aerobic stirring at a temperature of 200C for 3 days under the conditions of a stirring speed of 400 revolutions per minute and an aeration rate of 12 liters / minute.
After culturing in the 30 liter fermenter for 3 days, 10 liters of the cultured product are transferred to a sterilized 500 liter fermentation tank containing 220 liters of the culture medium prepared above having a pH of 9.5. Then, a culture is carried out with aerobic stirring at 200C for 4 days under the conditions of a stirring speed of 400 revolutions per minute and an aeration rate of 200 liters / minute.
After the culture process, the cultured product is centrifuged at 11000 x g in a cooled continuous centrifugal separator, and 200 liters of a supernatant solution are obtained. This supernatant solution is cooled to 30C. Then, twice the volume of ethyl alcohol previously cooled to 30C is added to the cooled supernatant solution to precipitate the desired alkaline protease. The precipitated API-21 alkaline protease is centrifuged at about 11000 x g in a cooled continuous centrifugal separator and then the separated API-21 alkaline protease is dried immediately by vacuum.
This is how we get the preparation
<Desc / Clms Page number 33>
API-21 alkaline protease enzyme dried by the following freezing:
Weight of enzyme recovered (g) 1230
Specific activity (microkatal / kg of protein) 0,
Recovery efficiency (%) 70
The enzyme thus obtained is purified in the same manner as in Example 1, to obtain an alkaline protease having a molecular weight of approximately 22,000 and an isoelectric point of 7.4.
Example 3
The alkaline protease "API-21" obtained above and, by way of comparative example, a commercially available alkaline protease for detergent are examined by combining them in different detergent compositions. The test for laundering tissues soiled with blood is carried out as follows:
A. Preparation of cotton tissue soiled with whole blood
Tissue samples are soaked, under the following conditions, in a stream of fresh bovine whole blood and immediately after collection is added. one volume of sodium citrate solution for nine volumes of blood to prevent clotting. The soiled tissue samples are compressed to 70% using a wringer to obtain uniformly soiled tissue.
Then the fabric samples are air dried in a room without being exposed to direct sunlight and are then stored at 0 ° C to 50 ° C in a cool dark place.
After preparation, the tissue samples are
<Desc / Clms Page number 34>
cut to a dimension of 10 cm x 5 cm.
Fabric samples: 10 cm x 15 cm
Soiling liquid: 100 ml for ten tissue samples
Soiling temperature: 10 20C
Soiling time: 5 minutes (the direction of agitation is changed every 30 seconds)
B. Washing process
The tissue samples are washed and rinsed (three times) under the following conditions in a Terg-O-Tometer.
Washing conditions Soiled fabrics: 5 cm x 10 cm Detergent: 0.133% (0.7 nKat / ml of enzyme Bath ratio: 1/85 Agitation: 105 rpm Washing time: 10 min.
Rinsing conditions Soiled fabrics: 5 cm x 10 cm Bathing ratio: 1/85 Agitation: 105 rpm Rinsing time: 3 min.
After rinsing, the fabric samples are air-dried in a room without exposing them directly to sunlight.
C. Detergent and enzyme used
The following six phosphate and non-phosphate detergents are used as the detergent.
<Desc / Clms Page number 35>
Detergent compositions
EMI35.1
<tb>
<tb> Composition <SEP> Detergent <SEP> Detergent <SEP> no
<tb> phosphated <SEP> phosphated
<tb> Agent <SEP> surfactant <SEP> 15% <SEP> 15%
<tb> Tripolyphosphate <SEP> from <SEP> sodium <SEP> 17
<tb> Zeolite-17
<tb> Silicate <SEP> from <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> Carbonate <SEP> from <SEP> sodium <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Carboxymethylcellulose <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Water <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> Sulfate <SEP> from <SEP> sodium <SEP> on <SEP> remaining <SEP> on <SEP> remaining
<tb>
The pH of each detergent measured at a concentration of 0.133% at 250C is as follows:
detergent pH
EMI35.2
<tb>
<tb> Type Agent <SEP> <SEP> surfactant <SEP> Detergent <SEP> Detergent <SEP> no
<tb> phosphated <SEP> phosphated
<tb> Detergent <SEP> from <SEP> type <SEP> LAS <SEP> * 1 <SEP> 10.18 <SEP> 10.18
<tb> Detergent <SEP> from <SEP> type <SEP> SUDS <SEP> 2 <SEP> 9.76 <SEP> 9.86
<tb> Detergent <SEP> from <SEP> type <SEP> AOS <SEP> * 3 <SEP> 9.95 <SEP> 10, <SEP> 17
<tb>
EMI35.3
X 1 LAS: linear sodium alkylbenzene sulfonate 2 SDS: sodium dodecyl sulfate 3 AOS: alpha olefin sulfonate
The enzyme used is a commercially available alkaline protease for detergent composition or the "API-21" alkaline protease obtained above.
The results are given in Table V.
The effectiveness as a detergent of the protein-based compositions is determined in the following way:
<Desc / Clms Page number 36>
Liquid samples are obtained by thermally extracting soiled tissue before and after washing with 100 ml of a 0.1 N aqueous NaOH solution at a temperature of 90 +2 C for 120 minutes. The liquid sample is chemically colored with a copper-based Folin reagent and its absorption is measured at a wavelength of 750 nm. Efficacy as a detergent (D) is calculated according to the following equation:
EMI36.1
where De represents the absorption of the extract obtained from standard cotton fabrics (lg).
Ds represents the absorption of the extract obtained from soiled tissues (1 g) before washing.
Dw represents the absorption of the extract obtained from soiled tissues (1 g) after washing.
<Desc / Clms Page number 37>
arrayV
EMI37.1
<tb>
<tb> Presence <SEP> Temp. <SEP> Efficiency <SEP> in <SEP> so much <SEP> that <SEP> detergent <SEP> (%)
<tb> Detergent <SEP> from <SEP> from <SEP> Detergent <SEP> Incorporation <SEP> Protease <SEP> alkaline <SEP> from
<tb> phosphate <SEP> washing <SEP> water <SEP> only <SEP> from <SEP> API-21 <SEP> trade <SEP> for <SEP> detergent
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Yes <SEP> 68, <SEP> 6 <SEP> 85, <SEP> 7 <SEP> 78, <SEP> 6 <SEP>
<tb> No <SEP> 68.8 <SEP> 82.0 <SEP> 77.3
<tb> type <SEP> SDS <SEP> Yes <SEP> 100C <SEP> 35.0 <SEP> 68, <SEP> 0 <SEP> 85.6 <SEP> 77.7
<tb> No <SEP> 70.2 <SEP> 85.8 <SEP> 80, <SEP> 9 <SEP>
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Yes <SEP> 69, <SEP> 4 <SEP> 87, <SEP> 0 <SEP> 80.4
<tb> No <SEP> 68.0 <SEP> 86.9 <SEP> 80,
0
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Yes <SEP> 73.9 <SEP> 89, <SEP> 8 <SEP> 88.6
<tb> No <SEP> 72.0 <SEP> 90.0 <SEP> 88.5
<tb> type <SEP> SDS <SEP> yes <SEP> 250C <SEP> 40, <SEP> 9 <SEP> 74, <SEP> 0 <SEP> 91, <SEP> 0 <SEP> 89, <SEP> 1 <SEP>
<tb> No <SEP> 69.4 <SEP> 91.3 <SEP> 87.7
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Yes <SEP> 75.9 <SEP> 91.6 <SEP> 91.6
<tb> No <SEP> 74.5 <SEP> 90.0 <SEP> 91.6
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Yes <SEP> 73.8 <SEP> 91.7 <SEP> 90.0
<tb> No <SEP> 74.8 <SEP> 94.3 <SEP> 92.1
<tb> type <SEP> SDS <SEP> Yes <SEP> 400C <SEP> 45.9 <SEP> 73, <SEP> 2 <SEP> 92, <SEP> 4 <SEP> 90, <SEP> 0 <SEP>
<tb> No <SEP> 74.2 <SEP> 91.7 <SEP> 89.7
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Yes <SEP> 80, <SEP> 3 <SEP> 92.6 <SEP> 90, <SEP> 5 <SEP>
<tb> No <SEP> 79.0 <SEP> 91.2 <SEP> 91.0
<tb>
<Desc / Clms Page number 38>
Example 4
The washing test process of Example 3 is repeated,
with the exception that the activity of the protease in the washing solution and the washing temperature are modified in the case of the non-phosphatic detergent of the LAS type containing the alkaline protease "API-21".
The results are given in Table VI.
TABLE VI: effectiveness as a detergent (%)
EMI38.1
<tb>
<tb> Activity <SEP> from
<tb> the <SEP> protease
<tb> in <SEP> the <SEP> solu-Temperature <SEP> from <SEP> washing
<tb> tion <SEP> from <SEP> washing
<tb> (nKat / ml) <SEP> 10 C <SEP> 25 C <SEP> 40 C
<tb> 0 <SEP> 68.8 <SEP> 72.0 <SEP> 74.8
<tb> 0.7 <SEP> 78.2 <SEP> 87.8 <SEP> 89.4
<tb> 2.1 <SEP> 80.5 <SEP> 88.6 <SEP> 92.8
<tb> 3.5 <SEP> 80.8 <SEP> 89.4 <SEP> 92.8
<tb> 7 <SEP> 82.0 <SEP> 89.8 <SEP> 94.3
<tb>
Example 5
Tests for laundering soiled cotton cervical fabrics are carried out using different detergents containing the alkaline protease "API-21" obtained above or an alkaline protease commercially available for detergent composition as follows:
AT.
Preparation of soiled cervical tissue
200 pieces of soiled standard cotton collar fabrics are cut for detergency tests, with a dimension of 7 cm x 37 cm into small pieces with a dimension of 1 cm x 5 cm. Collar fabrics
<Desc / Clms Page number 39>
are used for 1 week according to the method described in Motoi Minagawa and Ikuko Okamoto "Seni Seihin Shohi Kagaku" 19, 106-115 (1978). The small pieces are sewn by ten so as to form test fabrics having a dimension of 5 cm × 10 cm and are stored at a temperature of OOC at 50 ° C. in a dark and cool place.
B. Washing process
The tissue samples are washed and rinsed (three times) under the following conditions in a Terg-O-Tometer device.
EMI39.1
<tb>
<tb>
Conditions <SEP> from <SEP> washing
<tb> Fabrics <SEP> soiled <SEP>: <SEP> 5 <SEP> cm <SEP> x <SEP> 10 <SEP> cm
<tb> Detergent <SEP>: <SEP> 0.133% <SEP> (0.7 <SEP> nKat / ml
<tb> enzyme)
<tb> Report <SEP> from <SEP> bath <SEP>: <SEP> 1/85
<tb> Agitation <SEP>: <SEP> 105 <SEP> rpm
<tb> Time <SEP> from <SEP> washing <SEP>: <SEP> 10 <SEP> minutes
<tb> Conditions <SEP> from <SEP> rinsing
<tb> Fabrics <SEP> soiled <SEP>: <SEP> 5 <SEP> cm <SEP> x <SEP> 10 <SEP> cm
<tb> Report <SEP> from <SEP> bath <SEP>: <SEP> 1/85
<tb> Agitation <SEP>: <SEP> 105 <SEP> rpm
<tb> Time <SEP> from <SEP> rinsing <SEP>: <SEP> 3 <SEP> min.
<tb>
After rinsing, the tissue samples are air-dried in a room without being exposed to direct sunlight.
C. Detergent and enzyme used
The following four phosphate and non-phosphate detergents are used as the detergent.
<Desc / Clms Page number 40>
Detergent composition
EMI40.1
<tb>
<tb> Composition <SEP> Detergent <SEP> Detergent <SEP> no
<tb> phosphated <SEP> phosphated
<tb> Agent <SEP> surfactant <SEP> 15% <SEP> 15%
<tb> Tripolyphosphate <SEP> from <SEP> sodium <SEP> 17Zeolite <SEP> (4A) -17
<tb> Silicate <SEP> from <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> Carbonate <SEP> from <SEP> sodium <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Carboxymethylcellulose <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Water <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> Sulfate <SEP> from <SEP> sodium <SEP> on <SEP> remaining <SEP> on <SEP> remaining
<tb>
The pH of each detergent measured at a concentration of 0.133% at 25 ° C. is as follows:
detergent pH
EMI40.2
<tb>
<tb> Type Agent <SEP> <SEP> surfactant <SEP> Detergent <SEP> Detergent <SEP> no
<tb> phosphated <SEP> phosphated
<tb> Detergent <SEP> from <SEP> type <SEP> LAS <SEP> xl <SEP> 10.18 <SEP> 10.18
<tb> Detergent <SEP> from <SEP> type <SEP> AOS <SEP> x2 <SEP> 9.95 <SEP> 10.17
<tb>
1 LAS: linear sodium alkylbenzene sulfonate 2 AOS: alpha-olefin sulfonate
The enzyme used is a commercially available alkaline protease for detergent composition or the "API-21" alkaline protease obtained above.
The results are given in Table VII below.
<Desc / Clms Page number 41>
Table VII
EMI41.1
<tb>
<tb> Efficiency <SEP> in <SEP> so much <SEP> that <SEP> detergent <SEP> (%) <SEP>
<tb> Presence <SEP> Temp.
<tb>
Detergent <SEP> from <SEP> from <SEP> Detergent <SEP> Incorporation <SEP> Protease <SEP> alkaline <SEP> from
<tb> Detergent <SEP> Phosphate <SEP> washing <SEP> Water <SEP> only <SEP> from <SEP> API-21 <SEP> trade <SEP> for <SEP> detergent
<tb> type <SEP> LAS <SEP> yes <SEP> 70, <SEP> 1 <SEP> 82, <SEP> 0 <SEP> 77, <SEP> 9 <SEP>
<tb> No <SEP> 100C <SEP> 49.3 <SEP> 66, <SEP> 7 <SEP> 82, <SEP> 1 <SEP> 73, <SEP> 6 <SEP>
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Yes <SEP> 80, <SEP> 4 <SEP> 87.4 <SEP> 86.4
<tb> No <SEP> 75.0 <SEP> 86.8 <SEP> 83.3
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Yes <SEP> 78, <SEP> 7 <SEP> 85, <SEP> 7 <SEP> 79.0
<tb> No <SEP> 250C <SEP> 52, <SEP> 1 <SEP> 78.0 <SEP> 80.1 <SEP> 74.2
<tb> Yes <SEP> 80.4 <SEP> 89.6 <SEP> 87.3
<tb> type <SEP> AOS <SEP> No <SEP> 80, <SEP> 2 <SEP> 91, <SEP> 2 <SEP> 88, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Yes <SEP> 80.3 <SEP> 86.8 <SEP> 86,
8
<tb> type <SEP> LAS <SEP> No <SEP> 40 C <SEP> 58.3 <SEP> 81.0 <SEP> 91.2 <SEP> 89.7
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Yes <SEP> 82.6 <SEP> 90, <SEP> 1 <SEP> 89.0
<tb> No <SEP> 86.1 <SEP> 89.1 <SEP> 90.4
<tb>
<Desc / Clms Page number 42>
It should be understood that the present invention is in no way limited to the above embodiments and that many modifications can be made thereto without departing from the scope of this patent.