FR2685777A1 - Process for prenatal determination of foetal abnormalities and process for prenatal sex determination - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention est relative à un procédé de dépistage prénatal d'anomalies foetales et notamment d'aberrations chromosomiques telles que la trisomie 21, la trisomie 18 ou la trisomie 13 ainsi que d'aberrations géniques telles que la drépanocytose, la thalassémie, la mucoviscidose, etc... The present invention relates to a method for prenatal screening for fetal anomalies and in particular chromosomal aberrations such as trisomy 21, trisomy 18 or trisomy 13 as well as gene aberrations such as sickle cell anemia, thalassemia, cystic fibrosis , etc ...
La présente invention est également relative à un procédé de dépistage prénatal du sexe. The present invention also relates to a method of prenatal sex screening.
Le problème majeur, pour de tels dépistages, est celui du prélèvement des cellules foetales
la plus ancienne des méthodes utilisées consiste à prélever, à travers la paroi abdominale maternelle, quelques millilitres de liquide amniotique ; les cellules foetales sont séparées, notamment par centrifugation et étudiées, directement ou après culture in vitro. En division, lesdites cellules peuvent être mises en milieu hypotonique pour les faire grossir et permettre une observation microscopique plus aisée du caryotype.The major problem for such screenings is that of the removal of fetal cells.
the oldest of the methods used consists in withdrawing, through the maternal abdominal wall, a few milliliters of amniotic fluid; the fetal cells are separated, in particular by centrifugation and studied, directly or after culture in vitro. In division, said cells can be placed in a hypotonic medium to make them enlarge and allow easier microscopic observation of the karyotype.
Cette méthode présente notamment un risque d'avortement et présente en outre l'inconvénient de ne pouvoir être réalisée simplement avant la 15-16ème semaine.This method presents in particular a risk of abortion and also has the disadvantage of not being able to be performed simply before the 15-16th week.
le prélèvement du sang foetal par ponction transabdominale directe dans la veine ombilicale, sous échographie ou rarement au cours d'une foetoscopie cette technique, qui nécessite l'hospitalisation de la femme, comporte également un risque élevé de mort foetale et ne peut être réalisée avant la 20ème semaine. the sampling of fetal blood by direct transabdominal puncture in the umbilical vein, under ultrasound or rarely during a fetoscopy this technique, which requires hospitalization of the woman, also involves a high risk of fetal death and cannot be carried out before the 20th week.
. la biopsie des villosités chorionales consiste à prélever, par voie vaginale ou transabdominale, un fragment des villosités du placenta qui contient le même matériel génétique que le foetus ; il est donc possible de réaliser un diagnostic prénatal à partir de ces cellules foetales. Cette technique est simple à mettre en oeuvre ; toutefois, elle entraîne 2 à 3 % de fausses couches. . the biopsy of the chorionic villi consists of taking, vaginally or transabdominally, a fragment of the villi from the placenta which contains the same genetic material as the fetus; it is therefore possible to carry out a prenatal diagnosis from these fetal cells. This technique is simple to implement; however, it causes 2-3% of miscarriages.
D'autres méthodes, qui ne nécessitent pas le prélèvement de cellules foetales, ont été proposées ; il s'agit notamment de méthodes indirectes, dans lesquelles le dosage de marqueurs sériques convenables est réalisé on peut citer notamment, dans le cas de la recherche des sujets présentant un risque d'apparition de trisomie 21 chez le foetus (femme de plus de 40 ans), le dosage de l'hCG à la 16ème semaine ; en effet, le taux en hCG passe par un pic entre la 12ème et la 13ème semaine ; si un taux élevé subsiste à la 16ème semaine, la femme chez laquelle ce dosage a été effectué peut être considérée comme un sujet à risque, i.e. le foetus peut présenter statistiquement un risque élevé de trisomie 21. Cette méthode, qui ne constitue pas un test de diagnostic, permet uniquement l'évaluation d'un risque et nécessite donc éventuellement, le recours à l'une des techniques précitées, en cas de doute ; de plus, dans la mesure où il n'existe pas de marqueur de ce type pour toutes les anomalies foetales, une telle méthode n'est applicable qu'à la trisomie 21. Other methods, which do not require the removal of fetal cells, have been proposed; these are in particular indirect methods, in which the determination of suitable serum markers is carried out, in particular in the case of research of subjects presenting a risk of developing trisomy 21 in the fetus (woman over 40 years), the dosage of hCG at the 16th week; indeed, the hCG level goes through a peak between the 12th and 13th week; if a high rate persists at the 16th week, the woman in whom this dosage was carried out can be considered as a subject at risk, ie the fetus may present a statistically high risk of Down's syndrome. This method, which is not a test diagnostic, only allows the assessment of a risk and therefore possibly requires the use of one of the above techniques, in case of doubt; moreover, since there is no such marker for all fetal anomalies, such a method is only applicable to trisomy 21.
Dans la mesure où, en France, le dépistage prénatal des anomalies foetales doit être proposé chez la femme enceinte de plus de 38 ans, il était toutefois important de disposer d'un test de dépistage fiable, sans risque et peu coûteux, surtout si l'on considère qu'il existe plus de 20 000 femmes enceintes par an, de plus de 38 ans. Insofar as, in France, prenatal screening for fetal anomalies must be offered in pregnant women over 38, it was nevertheless important to have a reliable screening test, safe and inexpensive, especially if the 'It is estimated that there are more than 20,000 pregnant women per year, over 38 years of age.
Pour ce faire, on a proposé le prélèvement de cellules foetales circulantes, mises en évidence dans la circulation sanguine maternelle. Bien que cette technique présente l'énorme avantage d'être sans danger, par rapport aux techniques précitées aussi bien pour la mère que pour le foetus, le faible nombre de cellules foetales circulantes ne permet pas la réalisation d'un test de dépistage prénatal fiable. To do this, we proposed the removal of circulating fetal cells, highlighted in the maternal blood circulation. Although this technique has the enormous advantage of being safe, compared to the aforementioned techniques for both the mother and the fetus, the low number of circulating fetal cells does not allow the realization of a reliable prenatal screening test .
C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de fournir un procédé de dépistage d'anomalies foetales qui répond mieux aux besoins de la pratique que les tests actuellement pratiqués. This is why the Applicant has set itself the goal of providing a method of screening for fetal anomalies which better meets the needs of the practice than the tests currently performed.
La présente invention a pour objet un procédé non intrusif de dépistage prénatal d'anomalies cellulaires foetales et notamment d'aberrations chromosomiques ou d'aberrations géniques, caractérisé en ce qu'à l'occasion d'un prélèvement d'un échantillon de sang maternel, on extrait dudit échantillon, une fraction enrichie en cellules foetales par mise en contact dudit échantillon avec des anticorps spécifiques de cellules foetales, puis en ce qu'on détecte lesdites cellules foetales par tout moyen approprié. The subject of the present invention is a non-intrusive method of prenatal screening for fetal cellular anomalies and in particular chromosomal aberrations or gene aberrations, characterized in that when a maternal blood sample is taken , a fraction enriched in fetal cells is extracted from said sample by bringing said sample into contact with antibodies specific for fetal cells, then in that said fetal cells are detected by any appropriate means.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit échantillon est mis en contact avec des anticorps monoclonaux antitrophoblaste humain. According to an advantageous embodiment of said method, said sample is brought into contact with monoclonal human antitrophoblast antibodies.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, lesdits anticorps sont couplés à un support chromatographique approprié, notamment une colonne d'affinité. According to an advantageous arrangement of this embodiment, said antibodies are coupled to an appropriate chromatographic support, in particular an affinity column.
Ces cellules foetales sont alors concentrées sur la colonne d'affinité puis éluées, avant de procéder à la détection. These fetal cells are then concentrated on the affinity column and then eluted, before carrying out the detection.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, lesdits anticorps sont couplés à des billes magnétiques convenables. According to another advantageous arrangement of this embodiment, said antibodies are coupled to suitable magnetic beads.
Dans ce cas, les complexes cellules foetalesanticorps/billes sont séparés de l'échantillon, avant de procéder à la détection. In this case, the fetal antibody / bead complexes are separated from the sample, before proceeding to detection.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, après l'enrichissement dudit échantillon en cellules foetales, on procède à la détection des anomalies chromosomiques par hybridation in situ des cellules foetales en interphase ou en métaphase, en pré sence d'une collection de sondes convenables complémentaires de la séquence à détecter. According to another advantageous embodiment of said method, after enriching said sample with fetal cells, chromosomal anomalies are detected by in situ hybridization of fetal cells in interphase or in metaphase, in the presence of a collection suitable probes complementary to the sequence to be detected.
On utilisera, en particulier, notamment pour la détection de la trisomie 21, des sondes YAC (Yeast
Artificial Chromosome), constituées de plusieurs centaines de kilobases et conjuguées à de la biotine, reconnaissant des séquences présentes sur le chromosome 21; l'hybride formé sera par exemple détecté après addition d'avidine ou de streptavidine couplées à un fluorochrome, pour détecter l'hybridation, par fluorescence.We will use, in particular, in particular for the detection of Down's syndrome, YAC probes (Yeast
Artificial Chromosome), made up of several hundred kilobases and conjugated to biotin, recognizing sequences present on chromosome 21; the hybrid formed will, for example, be detected after addition of avidin or streptavidin coupled to a fluorochrome, to detect hybridization, by fluorescence.
Ce mode de réalisation permet, de manière avantageuse, par la combinaison d'une étape d'extraction et de concentration en cellules foetales et d'une étape d'hybridation in situ, sur un tissu notamment, et sans extraction d'ADN, en dehors de toute mitose (chromatine interphasique) par exemple, de dénombrer les chromosomes. This embodiment makes it possible, advantageously, by the combination of an extraction step and of concentration in fetal cells and of an in situ hybridization step, on a tissue in particular, and without DNA extraction, by apart from any mitosis (interphasic chromatin) for example, to count the chromosomes.
Ce mode de réalisation est également applicable au diagnostic du sexe de l'embryon.This embodiment is also applicable to the diagnosis of the sex of the embryo.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, après l'enrichissement dudit échantillon en cellules foetales, on procède à la détection des anomalies géniques (mutation ponctuelle, par exemple) par hybridation des cellules foetales en métaphase avec des sondes spécifiques dans des conditions spécifiques de température et de pH ou bien on peut utiliser le procédé décrit dans la Demande de Brevet Européen 412 883, au nom de la Demanderesse. According to another advantageous embodiment of said method, after the enrichment of said sample in fetal cells, the gene abnormalities (point mutation, for example) are detected by hybridization of the fetal cells in metaphase with specific probes in specific conditions of temperature and pH or else the process described in European Patent Application 412 883, in the name of the Applicant, can be used.
Ce mode de réalisation permet, de manière avantageuse, par la combinaison d'une étape d'extraction et de concentration en cellules foetales et d'une étape d'hybridation, de localiser une mutation unique. This embodiment advantageously makes it possible, by the combination of a stage of extraction and concentration of fetal cells and a stage of hybridization, to locate a single mutation.
La présente invention a également pour objet un procédé non intrus if de dépistage prénatal du sexe, caractérisé en ce qu'à l'occasion d'un prélèvement d'un échantillon de sang maternel, on extrait dudit échantillon, une fraction enrichie en cellules foetales par mise en contact dudit échantillon avec des anticorps spécifiques de cellules foetales, puis en ce qu'on détecte les chromosomes sexuels dans lesdites cellules foetales par hybridation in situ desdites cellules foetales en interphase ou en métaphase, en présence d'une collection de sondes convenables, complémentaires des séquences à détecter. The present invention also relates to a non-intrusive method if prenatal sex screening, characterized in that when a sample of maternal blood is taken, a fraction enriched in fetal cells is extracted from said sample by bringing said sample into contact with antibodies specific to fetal cells, then by detecting the sex chromosomes in said fetal cells by in situ hybridization of said fetal cells in interphase or in metaphase, in the presence of a collection of suitable probes , complementary to the sequences to be detected.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. In addition to the foregoing arrangements, the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the process which is the subject of the present invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples are given only by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
EXEMPLE 1 : Dépistage de la trisomie 21.EXAMPLE 1: Screening for Down's syndrome
1. Précaration des anticorps monoclonaux antitrophoblastes. 1. Precaration of antitrophoblast monoclonal antibodies.
On prépare de tels anticorps conformément à la méthode de KOHLER et MILSTEIN, par immunisation de souris avec des cellules de rein embryonnaire humain en culture. Such antibodies are prepared according to the method of KOHLER and MILSTEIN, by immunization of mice with human embryonic kidney cells in culture.
La fusion est réalisée avec les cellules du myélome Sp2/0-AG 14, le promoteur de fusion étant le polyéthylène glycol
2. Couslaae de ces anticoros à une colonne d'affinité.The fusion is carried out with the cells of the myeloma Sp2 / 0-AG 14, the fusion promoter being polyethylene glycol
2. Couslaae of these anticoros to an affinity column.
- on utilise, comme colonne d'affinité, une colonne dont la matrice doit avoir une adsorption nonspécifique négligeable ; les plus courantes sont à base d'agarose ; on peut citer le Sépharose z 4B de PHARMACIA, par exemple. - one uses, as column of affinity, a column whose matrix must have a negligible nonspecific adsorption; the most common are based on agarose; mention may be made of Sepharose z 4B from PHARMACIA, for example.
- le couplage des anticorps est notamment réalisé par la méthode au bromure de cyanogène l'activation est obtenue en ajoutant 100 mg de bromure de cyanogène/g de gel (gépharose), dans un tampon 2 M
NaHCO3 - Na2CO3, pH 11 ; le couplage proprement dit est obtenu en mettant en contact 4 mg d'anticorps monoclonal par gramme de gel activé dans un tampon 0,1 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,5 à 4 C pendant 24 à 48 heures.- the coupling of the antibodies is notably carried out by the cyanogen bromide method the activation is obtained by adding 100 mg of cyanogen bromide / g of gel (gepharosis), in a 2 M buffer
NaHCO3 - Na2CO3, pH 11; the actual coupling is obtained by bringing 4 mg of monoclonal antibody per gram of activated gel into contact in a 0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl buffer, pH 8.5 at 4 ° C. for 24 to 48 hours.
3. Passaae de l'échantillon de sana maternel sur ladite colonne. 3. Passaae of the maternal health sample on said column.
- on ajoute sur une colonne contenant 1 ml de gel couplé à l'anticorps monoclonal anti-trophoblaste humain tel qu'obtenu ci-dessus, 20 ml de sang maternel mélangé à 1 ml d'héparine et dilué 10 fois dans un tampon 0,1 M Tris HCl, pH 8. - 20 ml of maternal blood mixed with 1 ml of heparin and diluted 10 times in buffer 0 are added to a column containing 1 ml of gel coupled to the anti-human trophoblast monoclonal antibody as obtained above 1 M Tris HCl, pH 8.
- on lave la colonne par 10 à 20 volumes de colonne avec le même tampon. - the column is washed with 10 to 20 column volumes with the same buffer.
4. Elution des cellules foetales retenues. 4. Elution of the retained fetal cells.
- on élue avec un tampon 4,5 M urée - 0,1 M
Tris HCl, pH 7,5.- eluted with a 4.5 M urea buffer - 0.1 M
Tris HCl, pH 7.5.
5. Hvbridation avec des sondes YAC. 5. Hybridization with YAC probes.
L'hybridation in situ est utilisée pour repérer une séquence donnée d'ADN, au sein des cellules foetales obtenues au cours de l'étape 4 ci-dessus. In situ hybridization is used to locate a given DNA sequence within the fetal cells obtained during step 4 above.
L'hybridation est réalisée directement sur les préparations cytogénétiques fixées sur lame, après traitement par la RNase (ARN messager), par la protéinase K (déprotéinisation) et dénaturation de l'ADN chromosomique. Hybridization is carried out directly on the cytogenetic preparations fixed on a slide, after treatment with RNase (messenger RNA), with proteinase K (deproteinization) and denaturation of chromosomal DNA.
L'hybridation se fait avec des sondes complémentaires d'une séquence à détecter sur le chromosome 21 ; les YAC (Yeast Artificial Chromosome) sont des sondes constituées de plusieurs centaines de kilobases et conjuguées à de la biotine, ce qui permet de détecter de longs fragments d'ADN, avec une grande spécificité. Hybridization is done with probes complementary to a sequence to be detected on chromosome 21; YACs (Yeast Artificial Chromosome) are probes made up of several hundred kilobases and conjugated with biotin, which makes it possible to detect long fragments of DNA, with great specificity.
6. Dénombrement du nombre de copies de chromosome 21 par détection de l'intensité du signal d'hybridation, par addition de streptavidine couplée à un fluorochrome. 6. Enumeration of the number of copies of chromosome 21 by detection of the intensity of the hybridization signal, by addition of streptavidin coupled to a fluorochrome.
Exemple 2 :Dépistage de la trisomie 21.Example 2: Trisomy 21 screening.
1. Précaration des anticorps monoclonaux anti troshoblastes. 1. Precaration of anti troshoblast monoclonal antibodies.
On procède comme dans l'exemple 1. The procedure is as in Example 1.
2. Couslaae de ces anticorps à des billes magnétiques. 2. Stitch these antibodies to magnetic beads.
Le couplage est réalisé comme à l'exemple 1, avec des billes magnétiques DYNABEADSQ M.450 (DYNAL). The coupling is carried out as in Example 1, with DYNABEADSQ M.450 (DYNAL) magnetic beads.
Les autres étapes sont réalisées comme dans l'exemple 1, après séparation des complexes cellules foetales-anticorps/billes. The other steps are carried out as in Example 1, after separation of the fetal cell-antibody / bead complexes.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is in no way limited to those of its modes of implementation, embodiment and application which have just been described more explicitly; on the contrary, it embraces all the variants which may come to the mind of the technician in the matter, without departing from the scope or the scope of the present invention.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9116407A FR2685777A1 (en) | 1991-12-31 | 1991-12-31 | Process for prenatal determination of foetal abnormalities and process for prenatal sex determination |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9116407A FR2685777A1 (en) | 1991-12-31 | 1991-12-31 | Process for prenatal determination of foetal abnormalities and process for prenatal sex determination |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2685777A1 true FR2685777A1 (en) | 1993-07-02 |
Family
ID=9420727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9116407A Withdrawn FR2685777A1 (en) | 1991-12-31 | 1991-12-31 | Process for prenatal determination of foetal abnormalities and process for prenatal sex determination |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2685777A1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990006509A1 (en) * | 1988-12-06 | 1990-06-14 | Flinders Technologies Pty. Ltd. | Isolation of fetal cells from maternal blood to enable prenatal diagnosis |
| EP0412700A1 (en) * | 1989-08-03 | 1991-02-13 | The Regents Of The University Of California | Method for isolating fetal cytotrophoblast cells |
| WO1991007660A1 (en) * | 1989-11-13 | 1991-05-30 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive method for isolation and detection of fetal dna |
-
1991
- 1991-12-31 FR FR9116407A patent/FR2685777A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990006509A1 (en) * | 1988-12-06 | 1990-06-14 | Flinders Technologies Pty. Ltd. | Isolation of fetal cells from maternal blood to enable prenatal diagnosis |
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| WO1991007660A1 (en) * | 1989-11-13 | 1991-05-30 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive method for isolation and detection of fetal dna |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LANCET THE. vol. 336, 28 Juillet 1990, LONDON GB pages 197 - 200; U.W.MUELLER ET AL.: 'Isolation of fetal trophoblast cells from peripheral blood of pregnant women' * |
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