JP7203128B2 - Digital analysis of circulating tumor cells in blood samples - Google Patents

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Description

本発明は、血液サンプリング技法に関し、より詳しくは、血液試料中の細胞の検出および分析のための方法およびシステムに関する。 The present invention relates to blood sampling techniques and, more particularly, to methods and systems for the detection and analysis of cells in blood samples.

単純な血液試験または「液体生検」を用いて希少な循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の存在を検出する能力は、上皮癌のモニタリングを大いに向上させる潜在性を有し、侵襲的な腫瘍生検を必要とせずに腫瘍細胞数、遺伝子組成および薬物応答パラメータの瞬時サンプリングを提供する。したがって、早期癌検出のためのＣＴＣの検出は、癌の処置に革命を起こす潜在性を有し、治療処置を期待できる場合にはそれが転移する前の段階で浸潤癌を診断することを可能にする。 The ability to detect the presence of rare circulating tumor cells (CTCs) using a simple blood test or a "liquid biopsy" has the potential to greatly improve the monitoring of epithelial cancers, replacing invasive tumor biopsies. It provides instantaneous sampling of tumor cell numbers, genetic composition and drug response parameters without the need. Therefore, the detection of CTCs for early cancer detection has the potential to revolutionize the treatment of cancer, making it possible to diagnose invasive cancer at a stage before it metastasizes when curative treatment is expected. to

しかし、ＣＴＣは非常に希少であり、正常な血液成分と混ざり合ったこれらの腫瘍細胞を同定、可視化および採点することは、既知のマイクロ流体装置または同様の技術を用いて部分的に精製した後でさえ、著しい難題であり続けている。例えば、全血１ミリリットル当たり、５０億個超の赤血球（ＲＢＣ）および５００万個超の白血球（ＷＢＣ）の中にＣＴＣは１～１０個しか存在しない（Ｐｌａｋｓら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４１：１１８６；２０１３）。その上、癌細胞の中での異種性が患者個人においてさえ高いことおよび、血流中を循環する多くの腫瘍細胞が物理的に弱い状態にあり、それらの多くがプログラム細胞死またはアノイキスを始めていることゆえに、腫瘍細胞の抗体染色は変動性が高い。さらに、抗体染色された腫瘍細胞の正確な採点は、抗体試薬に非特異的に結合するものがいくつかあり大量に混入している白血球と区別することを必要とする。そういったことから、抗体染色では候補となる腫瘍細胞のサブセットしか堅牢に同定することができず、試験された患者の半数もが、広く転移した癌を有するにも拘らず検出可能な細胞を有さない。 However, CTCs are extremely rare, and identifying, visualizing and scoring these tumor cells mixed with normal blood components is difficult after partial purification using known microfluidic devices or similar techniques. Even so, it remains a significant challenge. For example, there are only 1-10 CTCs in more than 5 billion red blood cells (RBCs) and more than 5 million white blood cells (WBCs) per milliliter of whole blood (Plaks et al., "Cancer Circulating Tumor Cells," Science, 341:1186; 2013). Moreover, heterogeneity among cancer cells is high even in individual patients and many tumor cells circulating in the bloodstream are in a physically weakened state, many of which undergo programmed cell death or anoikis. Therefore, antibody staining of tumor cells is highly variable. In addition, accurate scoring of antibody-stained tumor cells requires differentiation from large contaminating leukocytes, some of which bind non-specifically to antibody reagents. As such, antibody staining can only robustly identify a subset of candidate tumor cells, and as many as half of the patients tested have detectable cells despite having widely metastatic cancer. Absent.

それゆえ、ＣＴＣを画像化する現在のプロトコルは、ＣＴＣを特に他の有核血球、例えば白血球（ＷＢＣ）などから単離するときによりいっそう高いレベルの純度を必要としている。 Therefore, current protocols for imaging CTCs require even higher levels of purity when isolating CTCs, particularly from other nucleated blood cells such as white blood cells (WBCs).

本開示は、ＣＴＣの極めて高いレベルの純度の必要性を回避しながら標準的な血液試料中の希少なＣＴＣに関する可能な最高感度のデータを得るための方法、用途およびシステムに関する。特に、当該新規方法は、混入しているＷＢＣからＣＴＣを完全に隔離する必要がなく、その代わりに、例えば多くて１０，０００個以上のＷＢＣを含有する産物中のたった１個のＣＴＣを確実に検出することができる。新規検査方法およびシステムは、血液から、（１）ＣＴＣを（質の高いリボ核酸（ＲＮＡ）を有する）無傷な全細胞として堅実に得ることのできる単離システムと、（２）健常な患者の血液中には存在しない各腫瘍タイプに特異的な癌系統のリボ核酸ＲＮＡマーカーに的を絞った、液滴に基づくデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検査とを組み合わせる。 The present disclosure relates to methods, applications and systems for obtaining the highest possible sensitivity data on rare CTCs in standard blood samples while avoiding the need for extremely high levels of purity of CTCs. In particular, the new method does not require complete segregation of CTCs from contaminating WBCs, but instead ensures only one CTC in a product containing, for example, up to 10,000 or more WBCs. can be detected. The novel test method and system provide (1) an isolation system that can consistently obtain CTCs as intact whole cells (with high quality ribonucleic acid (RNA)) from blood and (2) It is combined with a droplet-based digital polymerase chain reaction (PCR) test that targets cancer lineage-specific ribonucleic acid RNA markers that are not present in blood.

本明細書において記載されるとおりに組み合わせた場合、これらの２つの概念は、ＣＴＣデジタル液滴ＰＣＲ検査法（「ＣＴＣ ｄｄＰＣＲ」）、または簡単に書けば「デジタルＣＴＣ」検査（「ｄ－ＣＴＣ」）を提供する。いくつかの実施形態において、単離システムは、マイクロ流体システム、例えば、負枯渇マイクロ流体システム（例えば、赤血球
（ＲＢＣ）、ＷＢＣおよび血小板などの造血細胞の負枯渇を用いて血液試料中のＣＴＣなどの無標識の非造血細胞を露顕させるいわゆる「ＣＴＣチップ」）である。 When combined as described herein, these two concepts are the CTC digital droplet PCR test (“CTC ddPCR”), or simply “digital CTC” test (“d-CTC”). )I will provide a. In some embodiments, the isolation system is a microfluidic system, such as CTCs, in a blood sample using negative depletion of hematopoietic cells such as red blood cells (RBCs), WBCs, and platelets. A so-called "CTC chip" that exposes unlabeled non-hematopoietic cells of the cell line).

総じて本発明は、極めて高い感度および特異性で癌を早期検出する方法であって、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のマイクロ流体単離およびＣＴＣ由来ＲＮＡのデジタル検出を用いることを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、ＣＴＣ由来ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＣＴＣ由来のｃＤＮＡには特異的に結合するが他の細胞ｃＤＮＡには結合しない構成のレポーター基の存在下で増幅させるための個々の液滴中にカプセル化することができる。レポーター基について陽性である液滴の数を数えて、疾患、例えば、様々なタイプの癌の存在を評価することができる。 SUMMARY OF THE INVENTION In general, the present invention relates to a method of early detection of cancer with extremely high sensitivity and specificity, comprising using microfluidic isolation of circulating tumor cells (CTCs) and digital detection of CTC-derived RNA. In some embodiments, CTC-derived RNA is converted to cDNA for individual amplification in the presence of a constitutive reporter group that specifically binds to CTC-derived cDNA but not to other cellular cDNA. can be encapsulated in droplets of The number of droplets that are positive for the reporter group can be counted to assess the presence of disease, eg various types of cancer.

別の態様において、本発明は、血液試料中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分析する方法に関する。方法は、血液試料から、血中に存在するＣＴＣおよび他の細胞を含む産物を単離すること；産物からリボ核酸（ＲＮＡ）分子を単離すること；溶液中で単離ＲＮＡからｃＤＮＡ分子を生成させること；ｃＤＮＡ分子を個々の液滴中にカプセル化すること；ＣＴＣ由来ｃＤＮＡには特異的に結合するが他の細胞由来ｃＤＮＡには結合しない構成のレポーター基の存在下、各液滴内でｃＤＮＡ分子を増幅させること；液滴中のＣＴＣ由来ｃＤＮＡ分子の存在の指標としてレポーター基を含有する液滴を検出すること；および検出された液滴中のＣＴＣを分析することを含むかまたはそれらから構成される。 In another aspect, the invention relates to a method of analyzing circulating tumor cells (CTCs) in a blood sample. The method comprises isolating from a blood sample a product containing CTCs and other cells present in the blood; isolating a ribonucleic acid (RNA) molecule from the product; isolating a cDNA molecule from the isolated RNA in solution. encapsulating the cDNA molecules into individual droplets; within each droplet in the presence of a reporter group configured to bind specifically to CTC-derived cDNAs but not to other cell-derived cDNAs. detecting droplets containing reporter groups as an indication of the presence of CTC-derived cDNA molecules in the droplets; and analyzing CTCs in the detected droplets; or composed of them.

本明細書に記載の方法はさらに、ＲＮＡを単離する前に産物の体積を減らすこと、および／またはｃＤＮＡ分子をカプセル化する前にｃＤＮＡ含有溶液から混入物を除去することを含むことができる。 The methods described herein can further include reducing the volume of the product prior to isolating RNA and/or removing contaminants from the cDNA-containing solution prior to encapsulating the cDNA molecules. .

新規方法の様々な具現化において、単離ＲＮＡからｃＤＮＡ分子を生成させることは、単離ＲＮＡ分子の逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことを含むことができ、および／または各液滴内でｃＤＮＡ分子を増幅させることは、各液滴の中でＰＣＲを行うことを含むことができる。新規方法において、個々のｃＤＮＡ分子およびＰＣＲ試薬を個々の液滴中にカプセル化することは、非水性液体、例えば１以上のフッ化炭素、フッ化炭化水素、鉱油、シリコーンオイルおよび炭化水素油、ならびに／または１以上の界面活性剤の少なくとも１０００個の液滴を形成することを含むことができる。各液滴は、ＣＴＣから得られた標的ｃＤＮＡ分子を概して１つ含有することができる。いくつかの実施形態において、レポーター基は蛍光標識であるかまたはそれを含むことができる。 In various implementations of the novel method, generating a cDNA molecule from the isolated RNA can include performing reverse transcription (RT) polymerase chain reaction (PCR) of the isolated RNA molecule and/or each Amplifying the cDNA molecules within the droplets can include performing PCR within each droplet. In the novel method, the encapsulation of individual cDNA molecules and PCR reagents in individual droplets is performed using non-aqueous liquids such as one or more fluorocarbons, fluorohydrocarbons, mineral oils, silicone oils and hydrocarbon oils, and/or forming at least 1000 droplets of one or more surfactants. Each droplet can generally contain one target cDNA molecule obtained from CTCs. In some embodiments, the reporter group can be or include a fluorescent label.

新規方法は、固相可逆固定（ＳＰＲＩ）を用いることによってｃＤＮＡ含有溶液から混入物を除去すること、例えば、溶液中のｃＤＮＡを例えばｃＤＮＡに特異的に結合するように構成された磁気ビーズで固定すること；溶液から混入物を除去すること；および精製ｃＤＮＡを溶離させることを含むことができる。 A novel method involves removing contaminants from cDNA-containing solutions by using solid-phase reversible immobilization (SPRI), e.g., immobilizing cDNA in solution with magnetic beads configured to specifically bind to cDNA. removing contaminants from the solution; and eluting the purified cDNA.

様々な具現化において、本明細書に記載の方法は、本明細書中の表１中の癌選択的遺伝子の一覧から選択される１以上の遺伝子に対応するプローブおよびプライマーを、各液滴内でｃＤＮＡ分子を増幅させる際に使用することを含む。例えば、選択された遺伝子は、前立腺癌選択的遺伝子、例えば、（表１から容易に決定できるように）ＡＧＲ２、ＦＯＬＨ１、ＨＯＸＤＢ１３、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ４、ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ５、ＡＭＡＣＲ、ＡＲ変異形、ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ１、ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ５およびＳＴＥＡＰ２のうちの任意の１つ以上を含むことができる。別の例では、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＣＤＨ１１、ＥＧＦＲ、ＦＡＴ１、ＭＥＴ、ＰＫＰ３、ＲＮＤ３、Ｓ１００Ａ２およびＳＴＥＡＰ２は膵臓癌に対して選択的である。表１に列挙するその他のタイプの癌について同様の一覧を生成することができる。 In various implementations, the methods described herein include, within each droplet, probes and primers corresponding to one or more genes selected from the list of cancer selective genes in Table 1 herein. including use in amplifying a cDNA molecule in a. For example, selected genes are prostate cancer selective genes such as AGR2, FOLH1, HOXDB13, KLK2, KLK3, SCHLAP1/SET4, SCHLAP1/SET5, AMACR, AR variants , UGT2B15/SET1, UGT2B15/SET5 and STEAP2. In another example, ALDH1A3, CDH11, EGFR, FAT1, MET, PKP3, RND3, S100A2 and STEAP2 are selective for pancreatic cancer. A similar list can be generated for the other types of cancer listed in Table 1.

他の例では、選択された遺伝子は、表１に列挙する乳癌選択的遺伝子のうちの任意の１つ以上を含む。他の例では、選択された遺伝子は、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、膵臓癌およびメラノーマ癌のうちの１以上に対して選択的な遺伝子を含む。例えば、多重検査は、特定のタイプの癌、例えば、乳癌、肺癌前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌およびメラノーマに対して選択的であるとして表１中に列挙された選択された遺伝子のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または全てを含むことができる。典型的には、表１からの５～１２個の癌選択的遺伝子に対するプライマーおよびプローブの群を特定のタイプの癌に対して使用する。選択された遺伝子のその他の固有の組み合わせ（それらの遺伝子に対するマーカー）を以下の実施例において記載する。 In other examples, the selected genes include any one or more of the breast cancer selective genes listed in Table 1. In other examples, the selected genes include genes selective for one or more of lung cancer, liver cancer, prostate cancer, pancreatic cancer and melanoma cancer. For example, the multiplex test tested two of the selected genes listed in Table 1 as being selective for particular types of cancer, e.g., breast cancer, lung cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, liver cancer and melanoma. 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, or all. Typically, groups of primers and probes to 5-12 cancer selective genes from Table 1 are used for a particular type of cancer. Other unique combinations of selected genes (markers for those genes) are described in the examples below.

方法はまた、異なる２以上、３以上、４以上または５以上のタイプの癌に対して選択的な１以上の遺伝子を使用することを含むことができる。例えば、遺伝子は、乳癌および肺癌；乳癌、肺癌および肝臓癌；乳癌、肺癌および膵臓癌；乳癌、肺癌および前立腺癌；乳癌、肝臓癌およびメラノーマ；乳癌、肺癌およびメラノーマ；乳癌、肺癌、肝臓癌および前立腺癌；乳癌、肺癌、肝臓癌およびメラノーマ；乳癌、肺癌、肝臓癌および膵臓癌；乳癌、肺癌、前立腺癌および膵臓癌；乳癌、肺癌、肝臓癌、メラノーマおよび膵臓癌；または、乳癌、肺癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌および前立腺癌に対して選択的であることができる。 The method can also include using one or more genes selective for two or more, three or more, four or more, or five or more different types of cancer. breast cancer, lung cancer and liver cancer; breast cancer, lung cancer and pancreatic cancer; breast cancer, lung cancer and prostate cancer; breast cancer, liver cancer and melanoma; breast cancer, lung cancer and melanoma; breast cancer, lung cancer, liver cancer and breast cancer, lung cancer, liver cancer and melanoma; breast cancer, lung cancer, liver cancer and pancreatic cancer; breast cancer, lung cancer, prostate cancer and pancreatic cancer; breast cancer, lung cancer, liver cancer, melanoma and pancreatic cancer; It can be selective against liver cancer, melanoma, pancreatic cancer and prostate cancer.

本明細書に記載の方法において、ＣＴＣは、転移癌または原発性／限局性の癌から生じるものであることができる。新規方法において、検出された液滴中のＣＴＣを分析するステップは、例えば既知の癌を有する患者の血液試料からのＣＴＣを例えば経時的にモニタリングすることと、ＣＴＣを（例えば標準的技法を用いて）試験および／または画像化して患者の予後予測を提供することとを含むことができる。他の実施形態では、検出された液滴中のＣＴＣを分析するステップは、患者の血液試料からのＣＴＣを（例えば標準的技法を用いて）試験および／または画像化して治療介入へのＣＴＣの応答の指標を提供することを含むことができる。 In the methods described herein, the CTCs can arise from metastatic cancer or primary/localized cancer. In the novel method, analyzing the CTCs in the detected droplets includes, for example, monitoring the CTCs over time from a blood sample of a patient with a known cancer, and measuring the CTCs (e.g., using standard techniques). and) testing and/or imaging to provide a patient prognosis. In other embodiments, analyzing the CTCs in the detected droplets includes testing and/or imaging (e.g., using standard techniques) CTCs from the patient's blood sample to assess CTCs for therapeutic intervention. It can include providing an indication of the response.

他の実施形態において、検出液滴中のＣＴＣを分析するステップは、患者の血液試料の単位体積当たりのＣＴＣの数または濃度を決定して、患者における腫瘍負荷の度合いを提供することを含む。方法はその後にさらに、患者における腫瘍負荷の度合いを用いて療法を選択することを含むことができ、または第２時点において患者における腫瘍負荷の度合いを決定して、腫瘍負荷を経時的に、例えば治療介入に応じて、例えば腫瘍負荷の動的モニタリングのためにモニタリングすることをさらに含むことができる。 In other embodiments, analyzing the CTCs in the detection droplets includes determining the number or concentration of CTCs per unit volume of the patient's blood sample to provide a measure of tumor burden in the patient. The method can then further comprise using the degree of tumor burden in the patient to select therapy, or determining the degree of tumor burden in the patient at a second time point and measuring tumor burden over time, e.g. Depending on the therapeutic intervention, further monitoring can be included, eg, for dynamic monitoring of tumor burden.

本明細書に記載の方法および検査は、多様な診断方法、予後予測方法およびセラノスティクス方法においてＣＴＣを増幅させかつ検出するために用いることができる。 The methods and tests described herein can be used to amplify and detect CTCs in a variety of diagnostic, prognostic and theranostic methods.

本明細書中で使用する場合、語句「循環腫瘍細胞」（ＣＴＣ）は、患者の血流内に非常に希少な数（例えば、全血中で約１０，０００，０００個のＷＢＣの中に約１個のＣＴＣ）で存在する固形腫瘍（非血行性の癌）に由来する癌細胞を指す。ＣＴＣは、転移癌および原発性／限局性の癌のどちらから生じるものでもあることができる。 As used herein, the phrase “circulating tumor cells” (CTCs) refers to very rare numbers within the bloodstream of a patient (e.g., among about 10,000,000 WBCs in whole blood). Refers to cancer cells derived from solid tumors (non-hematogenous cancers) present in about 1 CTC). CTCs can arise from both metastatic and primary/localized cancers.

本明細書中で使用する場合、「産物」は、例えば本明細書に記載のシステムを使用して本明細書に記載の方法で処理することから生じる、例えば何らかの液体、例えば緩衝液、例えばプルロニック緩衝液の中の単離された希少細胞およびその他の混入している血球、例えば赤血球、白血球〔例えば白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）〕の群を意味する。典型的な産物は、５００～２，５００個以上のＷＢＣと混ざり合ったほんの約１～１０個のＣＴＣ、例えば、１０００～２０００個のＷＢＣと混ざり合った１～１０個のＣＴＣを含有し得る。しかしながら、本発明の方法の検出限界は、１０，０００個のＷＢＣ中で約１個の
ＣＴＣであることができる。このように、本発明の方法は５００個のＷＢＣ中で約１個のＣＴＣの純度のレベルを達成することができる一方で、本発明の方法は、いくつかの既知のＣＴＣ分析方法で必要とされるような高度に精製されたＣＴＣを必要としない。 As used herein, a "product" is any liquid, e.g., a buffer, e.g., a Pluronic It means a group of isolated rare cells and other contaminating blood cells such as red blood cells, white blood cells (eg leukocytes) in buffer. A typical product may contain only about 1-10 CTCs intermingled with 500-2,500 or more WBCs, such as 1-10 CTCs intermingled with 1000-2000 WBCs. . However, the detection limit of the method of the present invention can be about 1 CTC in 10,000 WBCs. Thus, while the method of the present invention is capable of achieving a purity level of about 1 CTC in 500 WBCs, the method of the present invention is less demanding than some known CTC analysis methods. It does not require highly purified CTCs as is done in

本明細書において用いる場合、固相可逆固定（ＳＰＲＩ）による浄化は、産物の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲから作り出されたｃＤＮＡに対して、被覆磁気ビーズを使用して大きさの選択を実施する技法である。本明細書に記載の新規検査方法において、これは、（ａ）正しい大きさのｃＤＮＡのみを選択することと、（ｂ）液滴の安定性に適合しない強すぎる溶解洗剤を除去することとの二重の目的を達成する。 As used herein, solid phase reversible immobilization (SPRI) purification performs size selection on cDNA generated from reverse transcription (RT)-PCR of products using coated magnetic beads. Technique. In the novel testing method described herein, this is a combination of (a) selecting only cDNAs of the correct size and (b) removing too strong dissolved detergents that do not match the droplet stability. Accomplish a dual purpose.

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、小さいオリゴヌクレオチドプライマーの連続アニーリングおよび再アニーリングによって既知のＤＮＡ断片を増幅させて結果として検出可能な分子信号を得るプロセスである。 Polymerase chain reaction (PCR) is the process of amplifying known DNA fragments by sequential annealing and re-annealing of small oligonucleotide primers, resulting in a detectable molecular signal.

逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲは、逆転写を用いて相補的ｃ－ＤＮＡ分子をＲＮＡ鋳型から精製し、それによってＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応がＲＮＡに対して作用するのを可能にすることを指す。本明細書中に開示される新規方法の重要な態様は、ＲＮＡを破壊または分解しかねないような方法で溶解または処理されていない全細胞ＣＴＣからの質の高いＲＮＡの入手可能性である。 Reverse transcription (RT)-PCR refers to the use of reverse transcription to purify complementary c-DNA molecules from an RNA template, thereby allowing the DNA polymerase chain reaction to act on the RNA. An important aspect of the novel methods disclosed herein is the availability of high quality RNA from whole cell CTCs that have not been lysed or treated in a manner that could destroy or degrade the RNA.

本明細書中で使用する場合、「陽性液滴」は、タグ付きプライマーを使用して行われるＰＣＲ反応によってＰＣＲ増幅産物の可視化が可能になる脂質カプセル化分子である。したがって、特定の標識遺伝子の一本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を含有していた液滴は、蛍光顕微鏡法を用いて可視化可能になることができ、他方、「空」または「陰性」の液滴は、非標識ｃＤＮＡを含有する液滴である。 As used herein, a "positive droplet" is a lipid-encapsulated molecule that allows visualization of PCR amplification products by PCR reactions performed using tagged primers. Thus, droplets that contained single-stranded template cDNA molecules for a particular labeled gene can become visible using fluorescence microscopy, while 'empty' or 'negative' droplets Droplet containing unlabeled cDNA.

新規方法およびシステムは、数多くの利点および利益を提供する。例えば、現在の方法およびシステムは、単独で用いられるいずれかの従来の既知のシステムに比べてはるかにより正確かつ堅牢な結果を提供する。単一のＣＴＣからの信号を明るい蛍光を放つ数百個または数千個の液滴（各々は単一のｃＤＮＡ分子に由来する）に作り替えることにより、新規デジタルＣＴＣ検査は劇的な信号増幅を可能にする。本明細書に記載のバイオマーカー遺伝子を選択および最適化する厳密な判断基準を考慮すれば、正常な血球からのバックグラウンド信号はｄ－ＣＴＣでは無視できる。したがって、ｄ－ＣＴＣは、進行癌を有する患者（前立腺癌、肺癌、乳癌および肝臓癌を有する患者のうちのほぼ１００％）からの信号を著しく増幅させることを可能にする。陽性点数を有する患者の割合が著しく増すだけでなく、高レベルの信号は、癌治療に続いて腫瘍負荷が低下するときの動的測定を可能にする。さらに、信号増幅は、非常に低い腫瘍負荷を有する患者においてさえ、ＣＴＣ由来の識別特徴の検出（ＣＴＣ細胞画像化では容易に達成されないもの）を可能にし、それゆえ著しく早い時期での癌の検出を可能にする。 The new method and system offer numerous advantages and benefits. For example, current methods and systems provide far more accurate and robust results than any previously known system used alone. By reshaping the signal from a single CTC into hundreds or thousands of brightly fluorescent droplets, each derived from a single cDNA molecule, the novel digital CTC test achieves dramatic signal amplification. to enable. Given the stringent criteria for selecting and optimizing the biomarker genes described herein, background signal from normal blood cells is negligible in d-CTC. Thus, d-CTC makes it possible to significantly amplify the signal from patients with advanced cancer (almost 100% of patients with prostate, lung, breast and liver cancer). Not only is the proportion of patients with positive scores significantly increased, the high level of signal allows for dynamic measurements as tumor burden declines following cancer therapy. Furthermore, signal amplification allows the detection of CTC-derived distinguishing features, which is not easily achieved with CTC cell imaging, even in patients with very low tumor burden, thus significantly earlier cancer detection. enable

要約すれば、この新規マイクロ流体学方策は、患者の血液試料中のＣＴＣを濃縮、検出および分析する、能率的で処理能が極めて高く、高速で（例えば１試行当たり３時間）、感度の極めて高い方法を提供する。当該方策は、豊富で臨床上実用的な情報を提供し、さらなる最適化によって癌の早期検出を可能にし得る。 In summary, this novel microfluidics strategy provides an efficient, highly throughput, fast (e.g., 3 hours per trial), and highly sensitive method for concentrating, detecting and analyzing CTCs in patient blood samples. provide high way. The strategy provides a wealth of clinically actionable information and may allow early detection of cancer with further optimization.

別段の定義がなされない限り、本明細書において使用するあらゆる科学技術用語は、本発明が属する技術分野において当業者にとって普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で記載されているのと同様または等価な方法および材料を本発明の実施または試験で用いることはできるが、適する方法および材料を以下に記載する。全ての刊行物、特許出願、特許、および本明細書において言及されるその他の参考文献は、参照によって
それらの全体が組み込まれる。係争の場合には、定義を含めた本明細書によって立証されることになる。さらに、材料、方法および実施例は、例示的なものに過ぎず、限定を意図したものではない。 Unless otherwise defined, all scientific and technical terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below. All publications, patent applications, patents, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of dispute, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting.

本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかとなる。 Other features and advantages of the invention will become apparent from the following detailed description and the claims.

図１Ａは、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の全ＲＮＡから調製され、白血球と混合され、２つの異なる前立腺プライマー組を使用して液滴ＰＣＲによって分析された、ｃＤＮＡの希釈液を示すグラフである。結果はいくつかの純度を表し、この範囲に亘って陽性液滴数の良好な応答を示す。FIG. 1A is a graph showing dilutions of cDNA prepared from LNCaP prostate cancer cell total RNA, mixed with leukocytes, and analyzed by droplet PCR using two different prostate primer sets. The results represent several purities and show a good response of positive drop counts over this range. 図１Ｂは、健常提供者（ＨＤ）の血液試料の中へスパイクされ、ＣＴＣ－ｉチップの中に流され、液滴ＲＴ－ＰＣＲ（ＫＬＫ３プライマー組）に供された、手作業で単離されたＬＮＣａＰ細胞のグラフである。結果は、少数の標的細胞にまで至る優れた感度を示す。FIG. 1B. Manually isolated blood samples spiked into a healthy donor (HD) blood sample, flowed into a CTC-i chip, and subjected to droplet RT-PCR (KLK3 primer set). FIG. 2 is a graph of LNCaP cells. The results show excellent sensitivity down to low numbers of target cells. 図１Ｃは、ＣＴＣ－ｉチップの中を通って処理され、３つの前立腺特異的なバイオマーカーおよび１つの上皮特異的なバイオマーカー（ＫＬＫ３、ＡＭＡＣＲ、ＦＯＬＨ１、ＥｐＣＡＭ）を使用するＲＴ－ＰＣＲおよび液滴分析に供された、健常対照、限局性の（切除可能な）前立腺癌および転移性の前立腺癌を有する患者からの血液試料の分析を示すグラフである。４つマーカー全てを合わせたときの液滴の総数／ｍｌの結果を示す。FIG. 1C shows RT-PCR and solution processed through the CTC-i chip, using three prostate-specific biomarkers and one epithelial-specific biomarker (KLK3, AMACR, FOLH1, EpCAM). FIG. 2 is a graph showing analysis of blood samples from healthy controls, patients with localized (resectable) prostate cancer and metastatic prostate cancer subjected to titration analysis. Results are shown for total droplets/ml for all four markers combined. 図２は、血液中にスパイクされ、ＣＴＣ－ｉチップを使用して回収された、ＬＮＣＡＰ前立腺癌細胞に由来するＫＬＫ３陽性液滴を示す信号強度プロットである。FIG. 2 is a signal intensity plot showing KLK3-positive droplets derived from LNCAP prostate cancer cells spiked into blood and collected using a CTC-i chip. 図３は、反復実験間での最小限の変動、およびＣＴＣ－ｉチップによる試料処理の後の信号保持力を示すとともに本明細書に記載の新規検査を用いて増加した検出感度を示す、棒グラフである。FIG. 3 is a bar graph showing minimal variability between replicates and signal retention after sample processing with the CTC-i chip, as well as increased detection sensitivity using the novel test described herein. is. 図４は、本明細書に記載の新規ＣＴＣデジタル液滴ＰＣＲ検査法（「ＣＴＣ ｄｄＰＣＲ」検査または単に「ｄ－ＣＴＣ」検査）を用いて、健常提供者では４つの異なる癌特異的マーカーに陽性な液滴が存在していないことを示す、信号強度プロットである。FIG. 4 shows positivity for four different cancer-specific markers in healthy donors using the novel CTC digital droplet PCR test described herein (“CTC ddPCR” test or simply “d-CTC” test). Fig. 10 is a signal intensity plot showing the absence of any significant droplets; 図５は、血液中へスパイクした前立腺癌細胞株を検出するために４つの異なる系統特異的転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 5 is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for four different lineage-specific transcripts to detect prostate cancer cell lines spiked into blood. 図６Ａは、１反応当たり４つの異なる前立腺癌特異的転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 6A is a signal intensity plot showing multiplexed d-CTC testing for four different prostate cancer-specific transcripts per reaction. 図６Ｂは、１反応当たり４つの異なる前立腺癌特異的転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 6B is a signal intensity plot showing multiplexed d-CTC testing for four different prostate cancer-specific transcripts per reaction. 図７Ａは、１反応当たり４つの異なる前立腺癌特異的転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 7A is a signal intensity plot showing multiplexed d-CTC testing for four different prostate cancer-specific transcripts per reaction. 図７Ｂは、１反応当たり４つの異なる前立腺癌特異的転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。２つのそのような反応つまり反応１および２について示される理論モデル（図６Ａおよび７Ａ）および癌細胞株データ（図６Ｂおよび７Ｂ）は両方とも、理論モデルから実験データが正確に予測されることを実証している。FIG. 7B is a signal intensity plot showing multiplexed d-CTC testing for four different prostate cancer-specific transcripts per reaction. Both the theoretical model (FIGS. 6A and 7A) and cancer cell line data (FIGS. 6B and 7B) presented for two such reactions, reactions 1 and 2, demonstrate that the theoretical model accurately predicts the experimental data. Proving. 図８Ａは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 8A is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for four different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. 図８Ｂは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 8B is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for four different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. 図９Ａは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 9A is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for four different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. 図９Ｂは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 9B is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for four different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. 図１０Ａは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 10A is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for 4 different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. 図１０Ｂは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 10B is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for 4 different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. 図１１Ａは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 11A is a signal intensity plot showing multiplexed d-CTC testing for four different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. 図１１Ｂは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 11B is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for 4 different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. 図１２Ａは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 12A is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for 4 different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. 図１２Ｂは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 12B is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for 4 different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. 図１３Ａは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。FIG. 13A is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for 4 different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. 図１３Ｂは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。６つのそのような反応、反応１～６について示される理論モデル（図８Ａ、９Ａ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ａおよび１３Ａ）および癌細胞株データ（図８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂ、１１Ｂ、１２Ｂおよび１３Ｂ）は、マーカーの種々の組み合わせの各々に関して、理論モデルから実験データが正確に予測されることを実証している。FIG. 13B is a signal intensity plot showing d-CTC testing multiplexed for 4 different breast cancer-specific and lung cancer-specific transcripts per reaction. The theoretical model (FIGS. 8A, 9A, 10A, 11A, 12A and 13A) and cancer cell line data (FIGS. 8B, 9B, 10B, 11B, 12B and 13B) presented for six such reactions, reactions 1-6, are , demonstrate that theoretical models accurately predict experimental data for each of the various combinations of markers. 図１４は、１ｎｇの非増幅細胞株ｃＤＮＡ、ならびに１０、１４および１８サイクルの特異的標的増幅（ＳＴＡ）前増幅の後での１μｌの前増幅産物から得られた、７つの異なるバイオマーカー（ＰＩＰ、ＰＲＡＭＥ、ＲＮＤ３、ＰＫＰ３、ＦＡＴ１、Ｓ１００Ａ２およびＡＧＲ２）についての液滴ＰＣＲ信号を示す棒グラフであり、ＳＴＡ前増幅により液滴ＰＣＲ信号が著しく増強されることを実証している。Figure 14 shows seven different biomarkers (PIP , PRAME, RND3, PKP3, FAT1, S100A2 and AGR2), demonstrating that STA pre-amplification significantly enhances the droplet PCR signal. 図１５Ａは、肺癌を有する異なる３組の患者について新規ｄ－ＣＴＣ検査法を用いる患者のＣＴＣ検出を行った結果を示すグラフである。健常な患者はＣＴＣを有していなかった。FIG. 15A is a graph showing the results of patient CTC detection using the novel d-CTC test for three different sets of patients with lung cancer. No healthy patient had CTCs. 図１５Ｂは、乳癌を有する異なる３組の患者について新規ｄ－ＣＴＣ検査法を用いる患者のＣＴＣ検出を行った結果を示すグラフである。健常な患者はＣＴＣを有していなかった。FIG. 15B is a graph showing the results of patient CTC detection using the novel d-CTC test for three different sets of patients with breast cancer. No healthy patient had CTCs. 図１５Ｃは、前立腺癌を有する異なる３組の患者について新規ｄ－ＣＴＣ検査法を用いる患者のＣＴＣ検出を行った結果を示すグラフである。健常な患者はＣＴＣを有していなかった。FIG. 15C is a graph showing the results of patient CTC detection using the novel d-CTC test for three different sets of patients with prostate cancer. No healthy patient had CTCs. 図１６は、図中に列挙する９つのバイオマーカー（ＡＧＲ２、Ｄｕａｌ、ＦＡＴ１、ＦＯＬＨ１、ＨＯＸＢ１３、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＳＴＥＡＰ２およびＴＭＰＲＳＳ２）について本明細書に記載の多重化ｄ－ＣＴＣ検査法を用いて試験した患者の前立腺癌のデータの結果を示す横棒グラフである。９１パーセントの癌患者（１１人中１０人の患者）が、検出可能なＣＴＣを有しており、２８個のうち２４個（８６％）の試料が、検出可能なＣＴＣを含有しており、１２個のうち０個（０％）の健常提供者（ＨＤ）の血液試料がＣＴＣを含有していた。FIG. 16 shows the nine biomarkers listed in the figure (AGR2, Dual, FAT1, FOLH1, HOXB13, KLK2, KLK3, STEAP2 and TMPRSS2) tested using the multiplexed d-CTC assay described herein. 2 is a bar graph showing the results of prostate cancer data for patients who underwent a study. 91 percent of cancer patients (10 of 11 patients) had detectable CTCs, and 24 of 28 (86%) samples contained detectable CTCs; 0 out of 12 (0%) healthy donor (HD) blood samples contained CTCs. 図１７は、転移性前立腺癌患者（上行）、限局性前立腺癌患者（中央行）および健常提供者の対照試料（下列）から得た血液試料について２つの異なる反応（反応１（ＴＭＰＲＳＳ２、ＦＡＴ１、ＫＬＫ２およびＳＴＥＡＰ２）、左列）および反応２（ＫＬＫ３、ＨＯＸＢ１３、ＡＧＲ２およびＦＯＬＨ１）、右列）を多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す一連の信号強度プロットである。各場合において、健常提供者（ＨＤ）の試料中にはＣＴＣは存在しなかったが、癌の試料中にはＣＴＣの明確な証拠が存在していた。FIG. 17 shows two different reactions (Reaction 1 (TMPRSS2, FAT1, 10 is a series of signal intensity plots showing d-CTC studies multiplexed with KLK2 and STEAP2), left columns) and reaction 2 (KLK3, HOXB13, AGR2 and FOLH1), right columns). In each case, no CTCs were present in the healthy donor (HD) samples, but clear evidence of CTCs was present in the cancer samples. 図１８は、アビラテロン（登録商標）で処置した前立腺癌患者における薬物応答の読み出しを提供する経時的に測定されたＣＴＣでの、アンドロゲン受容体シグナル伝達遺伝子の相対的割合を示す多重棒グラフである。FIG. 18 is a multiple bar graph showing the relative proportion of androgen receptor signaling genes in CTCs measured over time providing a readout of drug response in prostate cancer patients treated with Abiraterone®. 図１９Ａは、非増幅対１８サイクルのＳＭＡＲＴｅｒ前増幅を示すグラフである。図１９Ａは、３回の反復（ＷＴＡ１、ＷＴＡ２、ＷＴＡ３）において一致した、種々の標的領域のアンプリコン増幅効率のレベルを示す棒グラフである。FIG. 19A is a graph showing no amplification versus 18 cycles of SMARTer pre-amplification. FIG. 19A is a bar graph showing the level of amplicon amplification efficiency of different target regions, consistent across three repeats (WTA1, WTA2, WTA3). 図１９Ｂは、非増幅対１８サイクルのＳＭＡＲＴｅｒ前増幅を示すグラフである。図１９Ｂは、１８サイクルのＳＭＡＲＴｅｒ前増幅を用いることによって信号が非前増幅試料に比べておおよそ４桁（１０８対１０４）増大することを示す。FIG. 19B is a graph showing no amplification versus 18 cycles of SMARTer pre-amplification. FIG. 19B shows that using 18 cycles of SMARTer preamplification increases the signal by approximately four orders of magnitude (10 8 vs. 10 4 ) compared to non-preamplified samples. 図２０Ａは、１１個のマーカーを多重肝臓癌検査において試験した結果を示す。図２０Ａは、２１人の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）患者における液滴総数を示す。FIG. 20A shows the results of testing 11 markers in a multiplex liver cancer test. FIG. 20A shows total droplet counts in 21 hepatocellular carcinoma (HCC) patients. 図２０Ｂは、１１個のマーカーを多重肝臓癌検査において試験した結果を示す。図２０Ｂは、１３人の慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）患者における液滴総数を示す（顕著な検出可能な液滴は全くない）。FIG. 20B shows the results of testing 11 markers in a multiplex liver cancer test. FIG. 20B shows total droplet counts (no significant detectable droplets) in 13 chronic liver disease (CLD) patients. 図２０Ｃは、１１個のマーカーを多重肝臓癌検査において試験した結果を示す。図２０Ｃは、１５人の健常提供者（ＨＤ）における液滴総数を示す（顕著な検出可能な液滴は全くない）。FIG. 20C shows the results of testing 11 markers in a multiplex liver cancer test. FIG. 20C shows total droplet counts (no significant detectable droplets) in 15 healthy donors (HD). 図２１Ａは、１４個のマーカーを多重化した肺癌検査の結果を示すグラフである。図２１Ａは、８人の転移性肺癌患者および８人の健常提供者（全員陰性）についての検査結果を示す。FIG. 21A is a graph showing the results of a 14-marker multiplexed lung cancer test. FIG. 21A shows test results for 8 metastatic lung cancer patients and 8 healthy donors (all negative). 図２１Ｂは、１４個のマーカーを多重化した肺癌検査の結果を示すグラフである。図２１Ｂは、癌患者の血液１ｍｌ当たりの液滴計数が全て（８人中８人）、全ての健常提供者よりも高くなり、この検査での検出率が１００％となったことを示す。FIG. 21B is a graph showing the results of a 14-marker multiplexed lung cancer test. FIG. 21B shows that all cancer patients (8 out of 8) had higher droplet counts per ml of blood than all healthy donors, giving 100% detection rate for this test. 図２２は、９人の転移性乳癌患者、５人の限局性乳癌患者、および１５人の健常提供者の範囲で用いた１１個のマーカーの多重検査のための乳癌検査の結果を示すグラフである。結果は、検査が９人中７人の転移性乳癌患者、５人中２人の限局性乳癌患者、および０人の健常提供者試料において癌を検出することを示す。Figure 22 is a graph showing breast cancer test results for 11 marker multiplex tests used in a range of 9 metastatic breast cancer patients, 5 localized breast cancer patients, and 15 healthy donors. be. Results show that the test detects cancer in 7 of 9 metastatic breast cancer patients, 2 of 5 localized breast cancer patients, and 0 healthy donor samples. 図２３Ａは、転移性乳癌患者におけるＡＲｖ７検出の結果を示すグラフである。図２３Ａは、１０人の転移性乳癌患者および７人の健常提供者から得た試料を本明細書に記載のＣＴＣチップによって処理した結果を示す棒グラフである。FIG. 23A is a graph showing the results of ARv7 detection in metastatic breast cancer patients. FIG. 23A is a bar graph showing the results of processing samples from 10 metastatic breast cancer patients and 7 healthy donors with the CTC chips described herein. 図２３Ｂは、転移性乳癌患者におけるＡＲｖ７検出の結果を示すグラフである。図２３Ｂは、１０個のうち５個の癌患者試料が健常提供者のバックグラウンドレベルを超え、１０中５、すなわち５０％の検出率が得られたことを示す。FIG. 23B is a graph showing the results of ARv7 detection in metastatic breast cancer patients. FIG. 23B shows that 5 out of 10 cancer patient samples exceeded background levels in healthy donors, yielding a detection rate of 5 out of 10, or 50%. 図２４Ａは、３４人のメラノーマ患者における個々のマーカー（ＰＭＥＬ、ＭＬＡＮＡ、ＭＡＧＥＡ６、ＰＲＡＭＥ、ＴＦＡＰ２ＣおよびＳＯＸ１０）および組合わせたマーカー混合物（ＳＵＭ）の検出率を示す棒グラフである。FIG. 24A is a bar graph showing detection rates of individual markers (PMEL, MLANA, MAGEA6, PRAME, TFAP2C and SOX10) and combined marker mixtures (SUM) in 34 melanoma patients. 図２４Ｂは、１５人の健常提供者と比較した場合の３４人のメラノーマ患者において検出された液滴信号の１８２個の描点についてのドットプロット分布図であり、健常提供者のバックグラウンド信号を超える総検出感度が（描点に基づいて）８１％であり特異性が（描点により）１００％であることを実証している。FIG. 24B is a dot plot distribution of the 182 dabs of droplet signals detected in 34 melanoma patients when compared to 15 healthy donors, exceeding the background signal of healthy donors. It demonstrates an overall detection sensitivity of 81% (based on dabs) and a specificity of 100% (by dabs).

本開示は、血液試料中の希少な癌細胞から情報を得る方法およびシステムに関する。これらの方法およびシステムは、血液試料中の非標識ＣＴＣを単離するための単離技法、例えば、超高処理能マイクロ流体技法、例えば、負枯渇技法、例えば、造血細胞の負枯渇を用いるものの力と、固有癌系統のリボ核酸（ＲＮＡ）マーカーに的を絞った分析技法、例えば、液滴に基づくデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検査とを組み合わせる。この方略は、細胞の精製（例えば、濾過、陽性腫瘍細胞選択）を部分的に提供するその他のＣＴＣ単離技術に適用することもできるが、ＲＮＡの質、したがって検査の感度はマイクロ流体技術には劣るであろう。同様に、ＲＮＡに適用されるその他のデジタルＰＣＲ技術は、系統に固有のプライマーを検出することができるが、液滴に基づく検査の感度が最も
高い可能性がある。 The present disclosure relates to methods and systems for obtaining information from rare cancer cells in blood samples. Although these methods and systems use isolation techniques for isolating unlabeled CTCs in blood samples, such as ultra-high-throughput microfluidic techniques, such as negative depletion techniques, such as negative depletion of hematopoietic cells. It combines ribonucleic acid (RNA) marker-targeted analytical techniques, such as droplet-based digital polymerase chain reaction (PCR) tests, for indigenous cancer lineages. Although this strategy can also be applied to other CTC isolation techniques that partially provide cell purification (e.g., filtration, positive tumor cell selection), the quality of RNA, and thus the sensitivity of the test, is limited to microfluidic technology. would be inferior. Similarly, other digital PCR techniques applied to RNA can detect lineage-specific primers, but droplet-based testing is likely to be the most sensitive.

本明細書に記載の新規方法は、血中のＣＴＣの存在に基づく癌の早期検出のためだけでなく腫瘍負荷定量のためにも用いることができ、また、特定の腫瘍からのＣＴＣを経時的にモニタリングして例えば臨床試行または特定の療法との関連において例えばＣＴＣの中に存在する固有の腫瘍マーカー遺伝子のあらゆる潜在的変化および特異的療法の結果としての腫瘍における変化を測定するために用いることができる。 The novel methods described herein can be used not only for early detection of cancer based on the presence of CTCs in blood, but also for tumor burden quantification, and also for the quantification of CTCs from specific tumors over time. to measure any potential changes in specific tumor marker genes present, e.g. in CTCs, e.g. in the context of clinical trials or specific therapies and changes in tumors as a result of specific therapies. can be done.

検査方法の一般概念
単離技法は、例えば国際ＰＣＴ出願第２０１５／０５８２０６号パンフレットおよびＯｚｋｕｍｕｒら、「Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、５：１７９ｒａ４７（２０１３）の中で記載されているいわゆる「ＣＴＣ－ｉチップ」などの超高処理能マイクロ流体学を用いて血液試料からＣＴＣを濃縮するために用いられる。ＣＴＣ－ｉチップは、血液試料中のＷＢＣを磁気ビーズで標識してその後に試料を２つの濃縮段階を通じて処理するというＣＴＣ抗原非依存的な手法を用いる。第１段階では、決定論的横置換法を用いて小さく柔軟な細胞（粒子）（ＲＢＣ、血小板、未結合磁気ビーズおよび血漿）を除去し、その一方でより大きい細胞（ＣＴＣおよびＷＢＣ）が保持される。第２段階では、慣性集束を用いて全ての細胞を狭い流体流の中で移動させ、その後、磁場を用いてビーズ標識されたＷＢＣを集束流から引き出し、高度に濃縮されたＣＴＣが残る。１０ｍｌの全血からのＣＴＣ－ｉチップ産物は、通常は＜５００，０００個のＲＢＣ、＜５，０００個のＷＢＣおよび変動する数のＣＴＣを含有する。 General Concepts of Testing Methods Isolation techniques are described, for example, in International PCT Application No. 2015/058206 and Ozkumur et al., "Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells," Sci. Transl. Med. , 5:179ra47 (2013) are used to concentrate CTCs from blood samples using ultra-high-throughput microfluidics, such as the so-called "CTC-i chip". The CTC-i chip uses a CTC antigen-independent approach to label WBCs in a blood sample with magnetic beads and then process the sample through two enrichment steps. In the first stage, a deterministic lateral displacement method is used to remove small, flexible cells (particles) (RBCs, platelets, unbound magnetic beads and plasma) while retaining larger cells (CTCs and WBCs). be done. In the second stage, inertial focusing is used to displace all cells in a narrow fluid stream, after which a magnetic field is used to pull the bead-labeled WBCs out of the focused stream, leaving highly enriched CTCs. A CTC-i chip product from 10 ml of whole blood typically contains <500,000 RBCs, <5,000 WBCs and varying numbers of CTCs.

いくつかの分析技法は、例えば液滴マイクロ流体学を用いて、例えばＣＴＣ－ｉチップから得られた単離ＣＴＣをさらに濃縮および分析する。液滴マイクロ流体学についてのいくつかの基礎的な情報は、Ｊｅｒｅｍｙら、「Ｕｌｔｒａｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｏｐ－Ｂａｓｅｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、１０７：４００４（２０１０）に全体的に記載されている。 Some analytical techniques use, for example, droplet microfluidics to further concentrate and analyze isolated CTCs obtained, for example, from the CTC-i chip. Some background information about droplet microfluidics can be found in Jeremy et al., "Ultrahigh-Throughput Screening in Drop-Based Microfluidics for Directed Evolution," Proc. Natl. Acad. Sci. US, 107:4004 (2010).

本明細書において用いる場合、液滴マイクロ流体技法は、特定の具現化において、典型的には非水溶性液体（例えば、フッ化炭素、フッ化炭化水素、鉱油、シリコーンオイルおよび炭化水素油；また、非水性液体中に界面活性剤、例えば、Ｓｐａｎ８０、モノオレイン／オレイン酸、Ｔｗｅｅｎ２０／８０、ＳＤＳ、ｎ－ブタノール、ＡＢＩＬ ＥＭ９０およびリン脂質を含むこともできる）であり体積での大きさが例えば約０．５ｐＬ～１５ｎＬ、直径が例えば１０～３００μｍ、例えば２０～１００μｍ、例えば３０～５０μｍ、例えば３５μｍである液滴の中に単一の細胞、ＲＴ－ＰＣＲ試薬、および溶解用緩衝剤をカプセル化することを含むことができる。本開示において記載の新規方法において使用する場合、これらの技法はさらに、癌特異的転写物を液滴内で増幅させて蛍光信号を生成すること、および増幅陽性液滴を選別することを含む。この手法によって、診断および個人別薬物療法を目的とした配列決定および分析を行うことのできる純粋なＣＴＣが単離される。ＣＴＣの異種性が高いため、多重化した増幅を用いて可能な限り多くのＣＴＣを検出することが有用である。したがって、１対のプライマーをＰＣＲ混合物中で使用する代わりに、腫瘍特異的なプライマーの組み合わせを用いてＣＴＣの検出および選別の可能性を高めることができる。癌細胞を選別するためにＰＣＲを使用する際のさらなる情報については、例えば、Ｅａｓｔｂｕｒｎら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＰＣＲ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１４、第４２巻、Ｎｏ．１６ｅ１２８を参照されたい。 As used herein, droplet microfluidic techniques, in certain implementations, are typically water-insoluble liquids such as fluorocarbons, fluorohydrocarbons, mineral oils, silicone oils and hydrocarbon oils; , surfactants such as Span 80, monoolein/oleic acid, Tween 20/80, SDS, n-butanol, ABIL EM90 and phospholipids in non-aqueous liquids) and have a size in volume such as Encapsulating a single cell, RT-PCR reagents, and lysis buffer in a droplet of about 0.5 pL to 15 nL, such as 10-300 μm, such as 20-100 μm, such as 30-50 μm, such as 35 μm in diameter. can include transforming When used in the novel methods described in this disclosure, these techniques further include amplifying cancer-specific transcripts within droplets to produce fluorescent signals and sorting amplification-positive droplets. This approach isolates pure CTCs that can be sequenced and analyzed for diagnostic and personalized drug therapy. Due to the high heterogeneity of CTCs, it is useful to use multiplexed amplification to detect as many CTCs as possible. Therefore, instead of using a single pair of primers in the PCR mixture, tumor-specific primer combinations can be used to increase the likelihood of detection and sorting of CTCs. For further information on using PCR to sort cancer cells, see, for example, Eastburn et al., "Identification and genetic analysis of cancer cells with PCR-activated cell sorting," Nucleic Acids Research, 2014, vol. . 16e128.

新規検査方法では、ＣＴＣを溶解して、癌細胞で発現される遺伝子を代表するものであるＲＮＡ分子を放出する。大半のものが、癌特異的というよりはむしろ「系統」特異的であり、例えばいかなる前立腺細胞も（癌性であろうとなかろうと）これらのマーカーを発現する。しかし正常な血液細胞はその発現がなく、信号が、血流中を循環する細胞に由来する、という事実はそれを異常な信号として決定する。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することによって、今やこの系統信号をＰＣＲ増幅させることができる。本発明者らは、極めて高感度である液滴デジタルＰＣＲを用いて、単一の癌細胞からの信号（例えば、画像化検査での１つの信号）を何千もの陽性免疫蛍光液滴に変換することを可能にする。多重に高度に集団化した転写物のこれらの組み合わせは、癌に対する高い感度および特異性を保証し、（前立腺癌および乳癌におけるホルモン応答性経路の状態などでの）機能的洞察をも可能にする。 The new test method lyses CTCs to release RNA molecules that are representative of genes expressed in cancer cells. Most are "lineage" specific rather than cancer specific, eg, any prostate cell (whether cancerous or not) expresses these markers. However, normal blood cells lack its expression and the fact that the signal originates from cells circulating in the bloodstream defines it as an abnormal signal. By converting RNA to cDNA, this lineage signal can now be PCR amplified. We used droplet digital PCR, which is extremely sensitive, to convert the signal from a single cancer cell (e.g., one signal in an imaging test) into thousands of positive immunofluorescent droplets. make it possible to These combinations of multiple, highly clustered transcripts ensure high sensitivity and specificity for cancer, and also enable functional insights (such as the status of hormone-responsive pathways in prostate and breast cancer). .

記している通り、新規検査方法は、ＤＮＡではなく質の高いＲＮＡの検出および分析に的を絞る。これらは、血漿およびＣＴＣでのＤＮＡ突然変異に対してかなりの作業となってきたが、本発明の方法は、以下の理由からＲＮＡマーカーに依拠している：
１．ＤＮＡ突然変異は腫瘍特異的ではなく、また、健常個体がいくつかの未確認の癌細胞を血中に有するという発見は、臨床上非常に困難な状況である。これとは対照的に、腫瘍特異的なＲＮＡ（例えば、肺に対して前立腺）を選択することによって、新規方法は血中の癌細胞の根源を特定することができる。 As noted, the new test method focuses on the detection and analysis of high quality RNA rather than DNA. Although there has been considerable work on DNA mutations in plasma and CTCs, the method of the present invention relies on RNA markers for the following reasons:
1. DNA mutations are not tumor-specific, and the discovery that healthy individuals have some unidentified cancer cells in their blood is a clinically challenging situation. In contrast, by selecting tumor-specific RNA (eg prostate versus lung), the novel method can identify the source of cancer cells in the blood.

２．ＤＮＡ突然変異は、非常に異種性が高く、そのうえ、多くの癌が共有する再発性突然変異は少なく、大半の血液に基づく突然変異の検出には、一次腫瘍の中に存在する突然変異についての既存の知識が必要である（すなわち、未知の癌のスクリーニングには適さない）。これとは対照的に、特異的な器官に由来する全ての腫瘍細胞は、共通する系統のマーカーをＲＮＡレベルで発現する。それゆえ、新規方法では、個々の癌タイプのそれぞれに対して単一のマーカー混合物を使用する。 2. DNA mutations are highly heterogeneous and, moreover, many cancers share few recurrent mutations, and detection of most blood-based mutations requires extensive knowledge of mutations present in primary tumors. Requires existing knowledge (ie not suitable for screening unknown cancers). In contrast, all tumor cells derived from specific organs express common lineage markers at the RNA level. Therefore, the new method uses a single marker mixture for each individual cancer type.

３．転移が確立される前に浸潤癌は低レベルのＣＴＣを流す（つまりそれは、血液に基づく検出には遅すぎではない）が、血中での腫瘍細胞の存在は血管浸潤を暗に意味する（つまり、緩慢性ではなく侵襲性の癌）。それは、一次腫瘍の中の死滅しかけている細胞から漏れるものである血漿ＤＮＡまたは血漿タンパク質マーカーの場合には当てはまらず、必ずしも血管浸潤を指し示している必要はない。例えば、血中の血清ＰＳＡタンパク質は、良性の前立腺細胞からも一次前立腺癌からも流れる。他方、ＰＳＡを発現しているＣＴＣは、浸潤性の前立腺癌のみから流れる。 3. Although invasive cancers shed low levels of CTCs before metastases are established (that is, it is not too late for blood-based detection), the presence of tumor cells in the blood implies vascular invasion ( ie, aggressive rather than indolent cancer). That is not the case for plasma DNA or plasma protein markers that leak from dying cells within the primary tumor and are not necessarily indicative of vascular invasion. For example, serum PSA protein in the blood is shed from both benign prostate cells and primary prostate cancer. On the other hand, PSA-expressing CTCs shed only from invasive prostate cancer.

４．本明細書に記載の新規デジタル採点技術を用いるＲＮＡの分析は、極めて高感度である。しかしながら、遊離ＲＮＡは血流中で分解されるものであり、本明細書に記載の単離システム、例えばマイクロ流体負枯渇システム（例えばＣＴＣチップシステム）の使用は、非標識の腫瘍細胞が抽出可能な質の高いＲＮＡを有するという点で独特である。 4. Analysis of RNA using the novel digital scoring technology described herein is extremely sensitive. However, free RNA is degraded in the bloodstream, and the use of the isolation systems described herein, such as the microfluidic negative depletion system (e.g., the CTC chip system), allows extraction of unlabeled tumor cells. It is unique in that it has the highest quality RNA.

ＤＮＡよりもｃＤＮＡを標的分子として選択することは、各腫瘍細胞を起源とする信号を増大させるためだけでなく、白血球（ＷＢＣ）転写物の排除に向けて腫瘍細胞転写物のみを特異的に標的化するためにも行われた。信号の増大は重要な利点である、というのも、それによって、ＣＴＣを非常に高いレベルの純度で単離する必要がなくなるからである。つまりそれは、同じ産物中で混入している何百または何千ものＷＢＣ、例えば白血球によって未だに取り囲まれた１つ以上の「単離」ＣＴＣを含有する産物に関して、堅牢で反復可能な結果を可能にする。それにも拘らず、新規方法において使用されるようなＲＮＡから作られたｃＤＮＡを標的とする方略は、従来の手法に比べて最低レベルのＣＴＣ純度で最大限の特異性を精巧にあつらえることを可能にする。 Choosing cDNA over DNA as a target molecule not only increases the signal originating from each tumor cell, but also specifically targets only tumor cell transcripts for elimination of white blood cell (WBC) transcripts. It was also done to make Increased signal is an important advantage, as it eliminates the need to isolate CTCs to very high levels of purity. Thus, it enables robust and repeatable results for hundreds or thousands of WBCs contaminating in the same product, e.g., products containing one or more "isolated" CTCs still surrounded by leukocytes. do. Nonetheless, the strategy of targeting cDNA made from RNA, as used in the novel method, offers the potential to tailor maximum specificity at the lowest level of CTC purity compared to conventional approaches. to enable.

ＣＴＣ－ｉチップ技術は、抗体でタグ付けされた白血球のマイクロ流体枯渇によって、非造血性細胞を単離する効率が高い。ＣＴＣ－ｉチップのこの特徴は、無傷な腫瘍由来ＲＮＡを（その他の技術を用いて得られるレベルよりもはるかに高いレベルで）提供し、またそれは、（個人の癌の中で癌同士および上皮細胞対間葉系細胞サブタイプ同士で異形成が高い）腫瘍細胞表面エピトープとは無関係である。さらに、画像化分析のための抗体染色および選択が最適未満であるアポトーシス前の癌細胞さえも、本明細書に記載の方法を用いて採点されることのできる腫瘍特異的ＲＮＡの供給源を提供することができる。これら全ての理由から、希少なＣＴＣと共に試料中に見受けられるＷＢＣを少なくともいくらか低減しつつ、質の高いＲＮＡを無傷のＣＴＣから提供する単離技術またはシステム、例えばマイクロ流体負枯渇システム、例えばＣＴＣ－ｉチップは、腫瘍特異的なデジタル読み出しを産物に適用する前の重要な第１ステップの単離である。 The CTC-i chip technology is highly efficient in isolating non-hematopoietic cells by microfluidic depletion of antibody-tagged leukocytes. This feature of the CTC-i chip provides intact tumor-derived RNA (at levels much higher than those obtained using other techniques), and it is also useful for cancer-to-cancer and epithelial cancers within an individual. high dysplasia between cells versus mesenchymal cell subtypes) independent of tumor cell surface epitopes. Furthermore, even pre-apoptotic cancer cells with suboptimal antibody staining and selection for imaging analysis provide a source of tumor-specific RNA that can be scored using the methods described herein. can do. For all these reasons, isolation techniques or systems, such as microfluidic negative depletion systems, such as CTC-, provide high-quality RNA from intact CTCs while at least somewhat reducing the WBCs found in samples with rare CTCs. The ichip is the critical first step isolation before applying a tumor-specific digital readout to the product.

異種混交の混合物中での極めて希少な分子の液滴に基づくデジタル検出は元々、異種混交の混合物中に存在する場合には検出レベル未満であるがＰＣＲに供される前に液滴中に隔離されている場合には容易に識別される、個々のＤＮＡ分子をＰＣＲ増幅させるために開発された。液滴に基づくデジタルＰＣＲ（「液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）」）の基本的技術は、ＲａｉｎＤａｎｃｅおよびＢｉｏ―Ｒａｄにより市販されており、それによって、標的分子の脂質カプセル化およびそれに続くＰＣＲ分析のための装備が提供される。これを可能にした重要な科学的進歩には、ハーバードのＤａｖｉｄ Ｗｅｉｔｚおよびジョンズ・ホプキンズのＢｅｒｔ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎの研究所での研究が含まれる。例えば、米国特許第６，７６７，５１２号；第７，０７４，３６７号；第８，５３５，８８９号；第８，８４１，０７１号；第９，０７４，２４２号；および米国特許第２０１４／０３０３００５号公報を参照されたい。また、米国特許第９，０６８，１８１号も参照されたい。 Droplet-based digital detection of extremely rare molecules in heterogeneous mixtures originally below detection levels when present in heterogeneous mixtures but sequestered in droplets before being subjected to PCR It was developed for PCR amplification of individual DNA molecules that are easily identifiable when used. The basic technology of droplet-based digital PCR (“droplet digital PCR (ddPCR)”) is marketed by RainDance and Bio-Rad, whereby it allows for lipid encapsulation of target molecules and subsequent PCR analysis. equipment is provided. Important scientific advances that have made this possible include work in the laboratories of David Weitz at Harvard and Bert Vogelstein at Johns Hopkins. For example, U.S. Patent Nos. 6,767,512; 7,074,367; 8,535,889; 8,841,071; 9,074,242; See Japanese Patent No. 0303005. See also US Pat. No. 9,068,181.

しかしながら、液滴デジタルＰＣＲ自体は、本明細書に記載の新規方法の肝要部分である生物起源の材料と結合されない限り、生物学的に重要ではない。例えば、系統特異的なＲＮＡの検出（本発明の検出方略の中心的焦点）は、正常な前立腺上皮細胞と癌性の前立腺細胞とを区別しない。そういったことから、前立腺由来の転写物の血中での検出は意味深いものではない：それらは、正常な前立腺細胞またはエキソソームからの破片の中に存在する。完全ＣＴＣ（すなわち、血中の無傷のＣＴＣ）の単離と結合させたときに初めて、ｄｄＰＣＲ検査は極めて高い感度と特異性との両方を達成する。それゆえ、これらの２つの技術は理想的には互いに適合したものである、というのも、新規方法において、単離システムは質の高いＲＮＡを提供し、液滴に基づくデジタルＰＣＲ検査はＲＮＡマーカーに的を絞っているからである。 However, droplet digital PCR itself is not biologically significant unless combined with biogenic materials that are an integral part of the novel methods described herein. For example, detection of lineage-specific RNA (the central focus of the detection strategy of the present invention) does not distinguish between normal and cancerous prostate epithelial cells. As such, detection of prostate-derived transcripts in blood is not meaningful: they are present in debris from normal prostate cells or exosomes. Only when coupled with the isolation of complete CTCs (ie, intact CTCs in blood) does the ddPCR test achieve both extremely high sensitivity and specificity. These two techniques are therefore ideally compatible with each other, because in the novel method the isolation system provides high-quality RNA and the droplet-based digital PCR test provides RNA markers. because it is focused on

１つの付加的な態様は、新規検査方法の全体的な成功にとって重要である。記されているように、本明細書に記載の新規検査方法は、完全ＲＮＡから作られたｃＤＮＡを使用するが、この使用にとって肝要なのは、各癌タイプについて主要系統に特異的であり、しかも正常な血球の中には（ｄｄＰＣＲ感度によってさえ）全く存在しない程に非常に独特である、適切なバイオマーカーを特定することである。本明細書において記載される、各癌タイプについての多数の標的ＲＮＡバイオマーカーの選択、試験および検証は、新規検査方法の成功を可能にする。 One additional aspect is important to the overall success of the new testing method. As noted, the novel test method described herein uses cDNA made from complete RNA, but critical to its use is major lineage-specific and normal tumors for each cancer type. The challenge is to identify suitable biomarkers that are so unique that they are completely absent (even by ddPCR sensitivity) among different blood cells. The selection, testing and validation of multiple target RNA biomarkers for each cancer type described herein will enable successful novel testing methods.

検査方法のステップ
新規検査方法は、液滴デジタルＰＣＲ機器からのデータの解析に至るまで、またはそれを含めて、単離システム、例えばマイクロ流体負枯渇システムを用いて部分的に純粋なＣＴＣを単離することから始まる。主に８つの検査ステップがあり、そのいくつかは、任意で選択されるが概してより良好な結果を与えるものである。 Test Method Steps The novel test method ranges from or includes analysis of data from a droplet digital PCR instrument, using an isolation system such as a microfluidic negative depletion system to isolate partially pure CTCs. Start by letting go. There are eight main inspection steps, some of which are arbitrary but generally give better results.

１．血液試料から；例えば患者または被験体から、血中に存在するＣＴＣおよびその他の細胞を含む産物を単離すること；
２．希少細胞含有産物の体積を減らすこと（任意）；
３．例えば細胞溶解によって、産物からリボ核酸（ＲＮＡ）分子を単離し、単離ＲＮＡから；例えば産物中に含まれている細胞から放出したＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲによって、ｃＤＮＡを生成させること；
４．ＲＴ－ＰＣＲステップ中に合成されたｃＤＮＡの浄化（任意）；
５．遺伝子特異的な標的化前増幅プローブを使用して、例えばＦｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）入れ子式ＰＣＲ手法、または非特異的完全トランスクリプトーム増幅を用いて、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）を使用して、ｃＤＮＡを前増幅すること（任意）；
６．ｃＤＮＡ分子を個々の液滴中に、例えばＰＣＲ試薬と共に、カプセル化すること；
７．ＣＴＣ由来ｃＤＮＡには特異的に結合するが他の細胞由来ｃＤＮＡには結合しない構成のレポーター基の存在下、各液滴内で、例えばＰＣＲを用いて、ｃＤＮＡ分子を増幅させること；
８．レポーター基を含有する液滴（例えば「陽性」液滴）を液滴中のＣＴＣ由来ｃＤＮＡ分子の存在の指標として検出すること；ならびに
９．検出された液滴中のＣＴＣを分析して、例えば、患者または被験体における特定疾患の存在を判定すること。 1. isolating a product containing CTCs and other cells present in the blood from a blood sample; e.g., from a patient or subject;
2. reducing the volume of the rare cell-containing product (optional);
3. Isolating ribonucleic acid (RNA) molecules from the product, for example by cell lysis, and generating cDNA from the isolated RNA; for example by RT-PCR of RNA released from cells contained in the product;
4. Purification of cDNA synthesized during the RT-PCR step (optional);
5. cDNA using gene-specific pre-targeted amplification probes, such as the Fluidigm BioMark™ nested PCR approach, or non-specific full transcriptome amplification, such as using the Clontech SMARTer™ pre-amplifying (optional);
6. encapsulating cDNA molecules into individual droplets, e.g., together with PCR reagents;
7. amplifying the cDNA molecules within each droplet, for example using PCR, in the presence of a reporter group configured to bind specifically to CTC-derived cDNAs but not to other cell-derived cDNAs;
8. 8. Detecting droplets containing reporter groups (eg, "positive" droplets) as an indication of the presence of CTC-derived cDNA molecules in the droplets; Analyzing the CTCs in the detected droplets to determine, for example, the presence of a particular disease in a patient or subject.

以下にさらに詳しく記載しているように、新規ｄ－ＣＴＣ検査法の重要な特徴の１つは、優れた感度を送達する数々の標的バイオマーカー（および対応するプライマー）が慎重に選択される一方で同時にほぼ完璧な特異性が維持されることである。本明細書に記載の独特の標的遺伝子バイオマーカーの一覧（表１、下記）は、公的に入手可能なデータベースと専売のＲＮＡｓｅｑ ＣＴＣデータとのバイオインフォマティクス解析を用いて決定した。白血球のいかなる亜集団でも発現されないがＣＴＣでは十分に高い頻度および強度で発現されるマーカーを十分に慎重に選択して、種々様々な患者の合理的な広さのアレイにおいて信頼性のある信号を提供した。各癌タイプ（例えば特に、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、肺癌、膵臓癌）について特異的な組のマーカーを選択した。 As described in more detail below, one of the key features of the novel d-CTC test method is that while a number of target biomarkers (and corresponding primers) are carefully selected to deliver superior sensitivity, At the same time, almost perfect specificity is maintained. The list of unique target gene biomarkers described herein (Table 1, below) was determined using bioinformatics analysis of publicly available databases and proprietary RNAseq CTC data. Markers that are not expressed in any subpopulation of leukocytes but are expressed at sufficiently high frequency and intensity in CTCs are carefully selected to produce reliable signals in a reasonably wide array of a wide variety of patients. provided. A specific set of markers was selected for each cancer type (eg prostate cancer, breast cancer, melanoma, lung cancer, pancreatic cancer among others).

これより、検査方法の個別のステップについてより詳しく記載することにする。
１．ＣＴＣの単離
患者の血液をＣＴＣ－ｉチップ、例えば、バージョン１．３Ｍまたは１．４．５Ｔの中に流し、試料を氷上の１５ｍＬ円錐形チューブ内に回収した。ＣＴＣ－ｉチップは、以前に記載されているとおりに設計および作製された（Ｏｚｋｕｍｕｒら、「Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５（１７９）：１７９ｒａ４７（ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００５６１６）（２０１３））。 The individual steps of the inspection method will now be described in more detail.
1. Isolation of CTCs Patient's blood was run through a CTC-i chip, eg, version 1.3M or 1.4.5T, and samples were collected in 15 mL conical tubes on ice. The CTC-i chip was designed and fabricated as previously described (Ozkumur et al., "Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells", Science Translational 5 Medical 19). : 179ra47 (DOI: 10.1126/scitranslmed.3005616) (2013)).

血液試料（癌患者１人当たり約２０ｍｌ）を、認可済のプロトコルを用いてＥＤＴＡチューブ内に採取する。その後にこれらの試料をＣＤ４５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣＤ６６ｂ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、自社でビオチン化した）に対するビオチン化抗体と共に保温し、続いてＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（登録商標）ストレプトアビジンＴ１（インビトロジェン）と共に保温して、白血球の磁気標識化を達成する（Ｏｚｋｕｍｕｒら、２０１３）。 Blood samples (approximately 20 ml per cancer patient) are collected in EDTA tubes using an approved protocol. These samples were then incubated with biotinylated antibodies against CD45 (R&D Systems) and CD66b (AbD Serotec, biotinylated in-house) followed by Dynabeads® MyOne® Streptavidin T1 (Invitrogen). Incubation is used to achieve magnetic labeling of leukocytes (Ozkumur et al., 2013).

その後に試料をＣＴＣ－ｉチップの中に通して処理し、それによって血液成分（赤血球
および白血球および血小板）および未結合ビーズをＣＴＣから分離する。ＣＴＣを溶液中に回収する一方で、赤血球、血小板、未結合ビーズおよびタグ付き白血球を廃液チャンバ内に回収する。プロセスは自動化されており、１０ｍｌの血液が１時間で処理される。 The sample is then processed through the CTC-i chip, thereby separating blood components (red and white blood cells and platelets) and unbound beads from the CTC. Red blood cells, platelets, unbound beads and tagged white blood cells are collected in the waste chamber while CTCs are collected in solution. The process is automated and 10 ml of blood is processed in 1 hour.

２．希少細胞含有産物の体積低減および貯蔵
産物中に単離された全ての細胞を完全に溶解させるためには、典型的な出発点である数ミリリットから最終体積の約１００μｌに産物体積を低減することが好ましい。これは、例えば、産物を遠心分離し、細胞溶解およびｃＤＮＡの生成に備えてプルロニック緩衝液中に再懸濁させることによって、成し遂げることができる。この時点で、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の添加およびそれに続く液体窒素中での瞬間凍結および－８０℃での保存により、試料を長期保存のために処理することができる。 2. Volume Reduction and Storage of Rare Cell-Containing Products To completely lyse all cells isolated in the product, reduce the product volume from a typical starting point of a few milliliters to a final volume of approximately 100 μl. is preferred. This can be accomplished, for example, by centrifuging the product and resuspending it in Pluronic buffer in preparation for cell lysis and cDNA production. At this point, samples can be processed for long-term storage by the addition of RNAlater™ (ThermoFisher) followed by flash freezing in liquid nitrogen and storage at -80°C.

３．産物中の細胞からのＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの生成
ＲＮＡ単離ステップは、ＲＴ－ＰＣＲに備えて細胞から全てのＲＮＡ分子を完全に放出させるためにプロセスにとって重要である。ワンステップでのチューブ内反応を用いて、標準的な移送ステップの間に招く可能性のある細胞およびＲＮＡの損失の危険性を最小限に抑えることができる。例えば、ペレット状産物にＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを直接添加し、ピペット操作で完全に溶解させ、１：１のＲＮＡ：ｃＤＮＡ比を目標とするキットプロトコルに従って反応を実施することにより、ｑＲＴ－ＰＣＲキット用のインビトロジェンＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（登録商標）第一鎖合成Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（登録商標）を使用することができる。一旦ｃＤＮＡが合成されたならばＲＮアーゼＨを反応に適用して、残存しているあらゆるＲＮＡを除去する。あるいは、後のステップにおいて試料の完全トランスクリプトーム前増幅を実施したいのであれば、専売オリゴヌクレオチドおよび逆転写酵素を使用するものであるＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡキットプロトコルを使用して、ｃＤＮＡを合成することができる。 3. Isolation of RNA from Cells in Product and Generation of cDNA The RNA isolation step is critical to the process to completely release all RNA molecules from the cells in preparation for RT-PCR. A one-step in-tube reaction can be used to minimize the risk of cell and RNA loss that can be incurred during standard transfer steps. qRT-PCR kit, for example, by adding the RT-PCR master mix directly to the pelleted product, dissolving completely by pipetting, and performing the reaction according to the kit protocol targeting a 1:1 RNA:cDNA ratio. Invitrogen SuperScript III® First Strand Synthesis Supermix® can be used. Once the cDNA is synthesized, RNase H is applied to the reaction to remove any remaining RNA. Alternatively, if one wishes to perform full transcriptome pre-amplification of the sample in a later step, the SMARTer™ Ultra Low Input RNA kit protocol, which uses proprietary oligonucleotides and reverse transcriptase, can be used to generate cDNA can be synthesized.

４．ＲＴ－ＰＣＲ中に合成されたｃＤＮＡの浄化
プロセスの別の有用なステップは、任意ステップではあるが、溶解試薬をｃＤＮＡ含有溶液から除去することを含む。強すぎる洗剤の存在は、ｃＤＮＡ含有溶液がｄｄＰＣＲ機器へ移されるとすぐに、ｄｄＰＣＲ法で使用する液滴の不安定化を招く可能性がある。洗剤の除去は、例えば、固相可逆固定（ＳＰＲＩ）を用いることによって成し遂げることができる。この技法では、被覆磁気ビーズを使用して最初に特定の大きさ範囲のｃＤＮＡを結合させ、その後に洗剤含有上清を除去し、最後に純粋なｃＤＮＡをｄｄＰＣＲ機器への投入のために溶離させる。ＲＴ－ＰＣＲの浄化に加えて、ＳＰＲＩプロセスもまた、ｃＤＮＡの大きさの選択を達成し、それは、プロセスのｄｄＰＣＲ段階に入る非標的ｃＤＮＡ分子の数を低減し、次いでそれはバックグラウンドおよびノイズを低減する。 4. Purification of cDNA Synthesized During RT-PCR Another useful step in the process, although an optional step, involves removing the lysis reagent from the cDNA-containing solution. The presence of too strong a detergent can lead to destabilization of the droplets used in the ddPCR method once the cDNA-containing solution is transferred to the ddPCR instrument. Detergent removal can be accomplished, for example, by using solid phase reversible immobilization (SPRI). In this technique, coated magnetic beads are used to first bind cDNAs of a particular size range, after which the detergent-containing supernatant is removed, and finally the pure cDNAs are eluted for input into the ddPCR machine. . In addition to RT-PCR purification, the SPRI process also achieves cDNA size selection, which reduces the number of non-target cDNA molecules entering the ddPCR stage of the process, which in turn reduces background and noise. do.

５．前増幅
ｃＤＮＡの前増幅は、液滴ＰＣＲステップで検出できる鋳型分子の数を増加させる、したがってシグナル対ノイズ比を向上させ陽性読み値の信頼性を高める、任意ステップである。それは、ＣＴＣにおいて低レベルで発現されるマーカーの検出のためおよび、例えば転移前の疾患の早期検出との関連において、アポトーシス性である可能性のある非常に少ない数のＣＴＣを含有する試料を分析するための、非常に強力な手法である。これらの２つの手法は、ｄ－ＣＴＣ検査の作業流れにおいて適用されるために改変されている。特異的標的増幅（ＳＴＡ）は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）入れ子式ＰＣＲプロトコルに基づいて、液滴ＰＣＲステップで使用されるプローブによって標的化される領域を増幅するように特異的に設計されたプライマーを使用することに依拠している（表２参照）。これらのプライマーは、健常対照におけるノイズの増加なしに効率的で特異的な増幅を確保するために、それらの各々の蛍光プローブと組み合わせて慎重に設計および試験された。その代わりに、完全トランスクリプトーム増幅は、ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｕ
ｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡキットプロトコルに基づき、ＷＢＣにおいて見受けられる転写物とＣＴＣにおいて見受けられる転写物との両方を含めた産物中の全ての転写物の増幅に依拠している。 5. Pre-amplification Pre-amplification of cDNA is an optional step that increases the number of template molecules that can be detected in the droplet PCR step, thus improving the signal-to-noise ratio and increasing the confidence of positive readings. It analyzes samples containing very low numbers of potentially apoptotic CTCs for the detection of markers expressed at low levels in CTCs and in the context of early detection of disease, e.g., before metastasis. It is a very powerful method for doing These two techniques have been modified to be applied in the d-CTC examination workflow. Specific Target Amplification (STA) is based on the Fluidigm BioMark™ nested PCR protocol using primers specifically designed to amplify the region targeted by the probes used in the droplet PCR step. (see Table 2). These primers were carefully designed and tested in combination with their respective fluorescent probes to ensure efficient and specific amplification without increased noise in healthy controls. Alternatively, full transcriptome amplification can be performed with SMARTer™ U
Based on the ltra Low Input RNA kit protocol, it relies on the amplification of all transcripts in the product, including both those found in WBCs and those found in CTCs.

６．液滴中でのｃＤＮＡおよびＰＣＲ試薬のカプセル化
一旦ｃＤＮＡが合成され、混入している洗剤を除去して精製されたならば、溶液中のｃＤＮＡ分子の全ての凝集物とｑＰＣＲ試薬とを、例えば液滴製造機器、例えば液滴生成器、例えば１試料あたり２０，０００個の液滴を精製するＢｉｏｒａｄ自動液滴生成器によって、多くの小区画化された反応に分割する。各反応は、非水性液体、例えば油（ＰＣＲ適合性、例えば販売者からの専売製剤）の極めて小さい液滴から構成され、それは、Ｔａｑｍａｎ型ＰＣＲ試薬を遺伝子特異的プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに少量の試料を含有している。液滴生成が完了した時点で、試料は、多大な数の個々のＰＣＲ対応型反応を含有しているエマルジョンから構成される。 6. Encapsulation of cDNA and PCR Reagents in Droplets Once the cDNA has been synthesized and purified by removing contaminating detergents, all aggregates of cDNA molecules in solution and the qPCR reagents can be removed, e.g. A droplet making instrument, eg, a droplet generator, eg, a Biorad automatic droplet generator that purifies 20,000 droplets per sample, divides into many subcompartmentalized reactions. Each reaction consists of a very small droplet of a non-aqueous liquid, such as an oil (PCR compatible, such as a proprietary formulation from a vendor), which combines Taqman-type PCR reagents with gene-specific primers and oligonucleotide probes, as well as small amounts of contains samples of When droplet generation is complete, the sample consists of an emulsion containing a large number of individual PCR-ready reactions.

このステップでは、１つ、または多数の反応において腫瘍負荷の総合的な判定のため、例えば、主要の進展または療法への応答を判定するために、以下の表１に挙げる１つ以上の異なる標的遺伝子に対するＰＣＲプローブおよび関連するプライマーを使用することができる。このように、いくつかの事例では表１の特定の遺伝子に対する単一の組のＰＣＲプライマーおよびプローブを各液滴中に含むことができるが、ＣＴＣにおける遺伝子発現の異種性を考慮すれば、腫瘍細胞の検出を最大限に高めるために、それぞれのプライマー／プローブの組について種々の蛍光プローブを使用して各液滴中に２つ以上の異なる遺伝子に対してＰＣＲプライマーおよびプローブを多重化することも可能である。また、各液滴中で様々な癌タイプを標的とする多数の遺伝子のためにＰＣＲプライマーおよびプローブを多重化して、それゆえに単回の検査において多数の腫瘍タイプの広範でしかも特異的な検出を可能にすることも、可能である。 In this step, one or more different targets listed in Table 1 below are used for an overall determination of tumor burden in one or multiple responses, e.g., to determine major progression or response to therapy. PCR probes for genes and related primers can be used. Thus, although in some cases a single set of PCR primers and probes for a particular gene in Table 1 can be included in each droplet, given the heterogeneity of gene expression in CTCs, tumors Multiplexing PCR primers and probes for two or more different genes in each droplet using different fluorescent probes for each primer/probe set to maximize cell detection is also possible. Also, PCR primers and probes are multiplexed for multiple genes targeting different cancer types in each droplet, thus allowing broad and specific detection of multiple tumor types in a single test. It is also possible to make it possible.

７．液滴にカプセル化されたｃＤＮＡ分子のＰＣＲ
ｑＰＣＲサイクル条件を用いて、エマルジョン試料全体に対して標準的なＰＣＲサイクルを実施する。反応は、個々の液滴ＰＣＲ体積の大部分が終点へともたらされることを確かにするために、４５サイクルまで行う。このことは重要であるが、反応はＴａｑｍａｎ型ｑＰＣＲ試薬を使用して実施され、ｑＰＣＲ条件下で繰り返されるが、試料の蛍光強度はＰＣＲサイクル中には測定されずに次のステップで測定されることになるからである。 7. PCR of cDNA molecules encapsulated in droplets
A standard PCR cycle is performed on the entire emulsion sample using qPCR cycling conditions. Reactions are run for up to 45 cycles to ensure that most of the individual droplet PCR volumes are brought to the endpoint. Importantly, although the reaction is performed using Taqman-type qPCR reagents and repeated under qPCR conditions, the fluorescence intensity of the sample is not measured during the PCR cycle but in the next step. This is because

８．陽性液滴の検出
個々に区画されたＰＣＲの各々は、いかなる蛍光測定も実施する前に完全に終点へともたらされるため、個々の液滴はそれぞれ、十分に蛍光を発する液滴となるか、または蛍光を実質的に全く含まないことになる。これにより、陽性（蛍光を発する）および陰性（蛍光を発しない）の液滴を簡単に数え上げることが可能になる。 8. Detection of positive droplets Since each individual compartmented PCR is brought to a complete endpoint before any fluorescence measurements are taken, each individual droplet either results in a fully fluorescent droplet, or or contain substantially no fluorescence. This allows easy enumeration of positive (fluoresce) and negative (does not fluoresce) droplets.

９．分析
上流でのＲＴ－ＰＣＲは１：１のＲＮＡ：ｃＤＮＡ比を目標としたため、各陽性液滴は、生じる単一のＲＮＡ転写物を表すはずである。この解釈は、標的ｃＤＮＡ分子の数をはるかに上回る個々の液滴の数に依拠している。新規プロセスでは、一極において本発明者らは、単一のＣＴＣを単離および溶解させて、数個のＲＮＡ転写物を遊離させ、次いでそれを１：１でｃＤＮＡへと逆転写し、分画し、ＰＣＲ増幅させ、数え上げる、ということの可能性を検討する。 9. Analysis Since the upstream RT-PCR was targeted for a 1:1 RNA:cDNA ratio, each positive droplet should represent a single RNA transcript resulting. This interpretation relies on the number of individual droplets far exceeding the number of target cDNA molecules. In the novel process, at one pole we isolated and lysed a single CTC to liberate several RNA transcripts, which were then reverse transcribed 1:1 into cDNA and fractionated. , PCR amplified and enumerated.

本発明者らは、適度に発現された遺伝子、例えば前立腺癌細胞中のＫＬＫ３遺伝子の場合、各細胞がおおよそ８０～１２０個のＫＬＫ３ ｍＲＮＡの複製物を含有している、と推定する。Ｂｉｏｒａｄ ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステムは、２０，０００個の液滴を
生成し、それは、少数の単離ＣＴＣおよび適度に発現された標的遺伝子について液滴１個当たり２つ以上の標的ｃＤＮＡ分子が決して存在しないことを確かなものにする。他方、ＣＴＣの数が数ダースまたは数百に達する場合、適度に発現する遺伝子について液滴１個当たり多数の標的ｃＤＮＡ複製物が存在する可能性がある。そのような場合、生じる転写物のおおよその数はポアソン統計学を用いて推定することができる。 We estimate that for moderately expressed genes such as the KLK3 gene in prostate cancer cells, each cell contains approximately 80-120 copies of KLK3 mRNA. The Biorad QX200 ddPCR system generated 20,000 droplets, which for a small number of isolated CTCs and moderately expressed target genes never had more than 2 target cDNA molecules per droplet. to ensure On the other hand, when the number of CTCs reaches dozens or hundreds, there may be many target cDNA copies per droplet for moderately expressed genes. In such cases, the approximate number of transcripts produced can be estimated using Poisson statistics.

ＣＴＣの系統特異的同定を可能にする新規遺伝子パネル
上に述べたように、周囲を取り巻く正常な血球との関連において癌細胞に対して高度に特異的である遺伝子転写物の同定は、新規方法の中心部分である。癌細胞においてより高度に発現される遺伝子は多く知られているが、これらの遺伝子の大多数もまた、血液を含めた正常な組織において通常は少なくとも限られた発現を有する。この検査に必要とされる並外れた感度を考慮すれば、正常な血球における信号の欠如は、血流中の腫瘍細胞の信頼性の高い同定にとって必須である。 A Novel Gene Panel Enabling Lineage-Specific Identification of CTCs As noted above, the identification of gene transcripts that are highly specific for cancer cells in the context of surrounding normal blood cells is a novel method. is the central part of Many genes are known to be more highly expressed in cancer cells, but the majority of these genes also usually have at least limited expression in normal tissues, including blood. Given the extraordinary sensitivity required for this test, the lack of signal in normal blood cells is essential for reliable identification of tumor cells in the bloodstream.

血中のＣＴＣを検出するために使用される候補の腫瘍特異的転写物は、最初に、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌および肝臓癌ならびにメラノーマに由来する、公的に入手可能な遺伝子発現データセットならびに、本発明者らの研究所で生成させた、乳癌、前立腺癌および膵臓癌の患者およびこれらの癌のマウスモデルから単離されたＣＴＣからの単一細胞ＲＮＡＳｅｑデータを解析することによって選択される。発現が腫瘍に制限されており血液成分中には存在しないかまたは検出不可能である転写物は、さらに下流での分析のために選択される。正常な血球における発現の完全な欠如を（最も高いレベルの感度で、つまりデジタルＰＣＲ検査によって）実証および検証することは重要である。全体として本発明者らは、コンピュータモデルまたはＲＮＡ Ｓｅｑデータに基づいて予言された候補遺伝子のうちのたった約１０％のみがヒト血液試料において真に陰性であることを見出した。 Candidate tumor-specific transcripts used to detect CTCs in the blood were initially selected from publicly available gene expressions derived from breast, prostate, lung, pancreatic and liver cancers and melanoma. By analyzing the dataset and single-cell RNASeq data from CTCs isolated from breast, prostate and pancreatic cancer patients and mouse models of these cancers generated in our laboratory. selected. Transcripts whose expression is restricted to the tumor and absent or undetectable in blood components are selected for further downstream analysis. It is important to demonstrate and verify the complete lack of expression in normal blood cells (at the highest level of sensitivity, ie by digital PCR testing). Overall, we found that only about 10% of candidate genes predicted based on computer models or RNA Seq data were truly negative in human blood samples.

特に、ＣＴＣを検出するための候補の腫瘍特異的ｍＲＮＡ転写物は最初に、ヒトの乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、肝細胞癌およびメラノーマ癌について以前に導き出された遺伝子発現データセット（マイクロアレイおよびＲＮＡ－Ｓｅｑ）の解析によって特定した。この解析に用いる公的に入手可能なデータセットの具体的な例としては、癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）（癌ゲノムアトラス、ｔｃｇａ－ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｂ／ｔｃｇａ／ｔｃｇａＨｏｍｅ２．ｊｓｐにてオンライン利用可能）および癌細胞株百科辞典（ＣＣＬＥ）（ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ／ｈｏｍｅにてオンライン利用可能；また、Ｂａｒｒｅｔｉｎａら、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｅｎａｂｌｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、Ｎａｔｕｒｅ ４８３：６０３－６０７（２０１２）も参照されたい）が挙げられる。加えて、乳癌、前立腺癌および膵臓癌を有するヒト患者から単離されたＣＴＣからの単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ遺伝子発現データを解析した（ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ５１８２７、ＧＳＥ６０４０７およびＧＳＥ６７９８０）（Ａｃｅｔｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｒｅ ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ
ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、Ｃｅｌｌ、１５８：１１１０－１１２２（２０１４）；Ｔｉｎｇら、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ
Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ、８：１９０５－１９１８（２０１４）；およびＭｉｙａｍｏｔｏら、ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ＣＴＣｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４９：１３５１－１３５６（２０１５）。次に、これらのデータベースによって特定された
腫瘍特異的転写物をヒト白血球ＲＮＡ－Ｓｅｑ遺伝子発現データ（ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ３０８１１、ＧＳＥ２４７５９、ＧＳＥ５１８０８、ＧＳＥ４８０６０、ＧＳＥ５４５１４およびＧＳＥ６７９８０）と比較した。次に、さらに下流での分析のために、腫瘍における発現が高く白血球における発現が低いかまたは検出不可能である、差異の著しい発現を呈した転写物を選択した。さらに、文献検索を実施して追加候補の腫瘍特異的転写物を選択した。ヒトの各タイプの癌について５０～１００個の候補遺伝子が選択された。 In particular, candidate tumor-specific mRNA transcripts for detecting CTCs were initially derived from previously derived gene expression datasets (microarrays) for human breast, prostate, lung, pancreatic, hepatocellular and melanoma cancers. and RNA-Seq) analysis. Specific examples of publicly available datasets used for this analysis include the Cancer Genome Atlas (TCGA) (Cancer Genome Atlas, available online at tcga-data.nci.nih.gob/tcga/tcgaHome2.jsp). available) and the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) (available online at broadinstitute.org/ccle/home; also Barretina et al., The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modeling of anticancer drug sensitivity 6: 360, 8: 3-8). 2012)). In addition, we analyzed single-cell RNA-seq gene expression data from CTCs isolated from human patients with breast, prostate and pancreatic cancer (GEO accession numbers GSE51827, GSE60407 and GSE67980) (Aceto et al., Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors
of breast cancer metastasis, Cell, 158:1110-1122 (2014); Ting et al., Single-Cell RNA Sequencing Identities Extracellular Matrix Gene Expression by Pancreatic Circulating
Tumor Cells, Cell Rep, 8:1905-1918 (2014); and Miyamoto et al., RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance, Science 5113-3215, 349. Tumor-specific transcripts identified by these databases were then compared to human leukocyte RNA-Seq gene expression data (GEO accession numbers GSE30811, GSE24759, GSE51808, GSE48060, GSE54514 and GSE67980). Transcripts that exhibited highly differential expression, with high expression in tumors and low or undetectable expression in leukocytes, were then selected for further downstream analysis. In addition, a literature search was performed to select additional candidate tumor-specific transcripts. 50-100 candidate genes were selected for each type of human cancer.

各特異的癌タイプにおける各候補遺伝子について、標的転写物の領域にまたがる２～４組のＰＣＲプライマーを設計した。プライマーはＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成し、プローブをＦＡＭまたはＨＥＸ、ＺＥＮおよびＩＡＢｋＦＱで標識して、アンプリコンの中間部を標的とするプローブを作出する。ヒトＣＴＣにおいてデジタル式のＰＣＲに基づくｍＲＮＡ転写検出を好結果に適用するために必要とされる本発明者らのＰＣＲプライマー設計方式の独特の特徴としては、例えば下記が挙げられる：１）細胞ｍＲＮＡ転写物は、固定されていない脆弱な細胞、例えばＣＴＣにおいて特に、５’末端から分解する傾向にある、ということを考慮した、各ｍＲＮＡ転写物の３’末端の特異的標的化；２）例えば富化ＣＴＣ混合物中に過剰に混入している白血球に由来する、混入しているゲノムＤＮＡの意図しない増幅を排除するための、イントロンにまたがるアンプリコンを生成させるプライマーの設計；および３）特異的スプライス変異形の臨床的妥当性に関するいくつかの事例における不確定性を考慮した、所与の遺伝子の多数のスプライス変異形を包括的に増幅させるプライマーの設計。 For each candidate gene in each specific cancer type, 2-4 sets of PCR primers were designed spanning the region of the target transcript. Primers are IDT (Integrated DNA
Technologies) and labeled probes with FAM or HEX, ZEN and IABkFQ to create probes that target the middle of the amplicon. Unique features of our PCR primer design strategy required for the successful application of digital PCR-based mRNA transcript detection in human CTCs include, for example: 1) cellular mRNA; Specific targeting of the 3' end of each mRNA transcript, taking into account that transcripts are particularly prone to degradation from the 5' end in unfixed fragile cells such as CTCs; 2) e.g. 3) the design of primers that generate intron-spanning amplicons to eliminate unintended amplification of contaminating genomic DNA from leukocytes that overcontaminate the enriched CTC mixture; Designing primers to globally amplify multiple splice variants of a given gene, taking into account the uncertainty in some cases regarding the clinical relevance of splice variants.

癌細胞株（乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌および肝臓癌ならびにメラノーマを代表する）に由来するｃＤＮＡを使用してプライマーの特異性を最初にｑＲＴ－ＰＣＲによって試験した。ヒトの各タイプの癌について、２～５個の立証された癌細胞株を培養し、初期試験に使用してＰＣＲプライマー性能を見積もり、指定された癌における標的転写物の発現を評価した。特異性の初期試験を提供するために同じプライマーを使用して、癌の診断を有さない健常個体の白血球における標的転写物の発現を見積もった。最低５人の異なる健常個体の白血球をこの段階の試験において試験した（男性個体および女性個体の混合－これは、癌のタイプに依存する；つまり、候補の前立腺癌遺伝子および乳癌遺伝子はそれぞれ、男性提供者のみ、または女性提供者のみを用いる必要があった）。 The specificity of the primers was first tested by qRT-PCR using cDNAs derived from cancer cell lines (representing breast, prostate, lung, pancreatic and liver cancers and melanoma). For each type of human cancer, 2-5 validated cancer cell lines were cultured and used in initial studies to estimate PCR primer performance and assess target transcript expression in a given cancer. The same primers were used to estimate target transcript expression in leukocytes of healthy individuals without a cancer diagnosis to provide an initial test of specificity. Leukocytes from a minimum of 5 different healthy individuals were tested in this phase of the study (a mix of male and female individuals—this depends on the type of cancer; only donors or only female donors had to be used).

ヘパリンナトリウムを含む細胞調製チューブ（ＣＰＴ）（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー、ニュージャージー州）を製品に折り込まれた説明書に従って使用して全血から健常個体の白血球を単離した。ＲＮＡ抽出および第一鎖ｃＤＮＡ合成を癌細胞株に対して実施し、標準的方法を用いて白血球を単離した。（各遺伝子に対して別個の２～４組のプライマーを使用して）各遺伝子の発現の特異性を、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて（細胞株ｃＤＮＡを陽性対照とし、健常提供者からの白血球ｃＤＮＡを陰性対照とし、水を追加の陰性対照として）試験した。その後、ｑＲＴ－ＰＣＲ試験に基づいて癌細胞株の中には存在するが白血球の中には存在しない転写物を、液滴デジタルＰＣＲによるさらなる検証のために選択した。この段階の試験を通過する選択基準は非常に厳密であり、ｑＲＴ－ＰＣＲ信号が少なくとも１つの癌細胞株の中に存在し、かつ試験された健常提供者のいずれの白血球試料の中にも存在しない、ということを要求した。 Healthy individual leukocytes were isolated from whole blood using cell preparation tubes (CPT) containing sodium heparin (Becton, Dickinson and Company, NJ) according to the manufacturer's instructions. RNA extraction and first strand cDNA synthesis were performed on cancer cell lines and leukocytes were isolated using standard methods. The specificity of expression of each gene (using 2-4 sets of separate primers for each gene) was determined using qRT-PCR (with cell line cDNA as positive control and leukocyte cDNA from healthy donors). was tested as a negative control and water as an additional negative control). Transcripts present in cancer cell lines but not in leukocytes based on qRT-PCR studies were then selected for further validation by droplet digital PCR. The selection criteria for passing this stage of testing are very stringent, qRT-PCR signal is present in at least one cancer cell line and present in any leukocyte sample from healthy donors tested. I requested not to.

ｑＲＴ－ＰＣＲ段階の試験を通過した標的転写物および特異的プライマー対を、液滴デジタルＰＣＲを用いてさらに検証した。この段階の試験では、ＣＴＣ－ｉチップ（例えば、Ｏｚｋｕｍｕｒら、「Ｉｎｅｒｔｉａｌ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｒａｒｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、５、１７９ｒａ１４７（２０１３）を参照されたい）を使用して、健常個体から提供された全血試料を処理した。ＣＴＣ－ｉチップは全血からの赤血球、
血小板および白血球の負枯渇を実施するものであり、（健常個体に存在するはずのない）ＣＴＣを含めた、白血球マーカーを発現しない血中の細胞が富化された試料産物を生成する。各血液試料について、ＣＴＣ－ｉチップからの産物にＲＮＡ安定化溶液（ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補給し、標準的方法を用いるＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のための処理を行った。その後、液滴デジタルＰＣＲ（Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州）を用いて、試験されている特異的プライマー対に基づいて各試料中に存在する転写物の数を定量した。この段階中に液滴デジタルＰＣＲによって評価した試料は、癌細胞株からのｃＤＮＡ、ＣＴＣ－ｉチップを通じて処理された健常提供者からの白血球ｃＤＮＡ（試験されているプライマー対１つ当たり少なくとも４人の健常個体）、および陰性対照としての水を含んでいた。 Target transcripts and specific primer pairs that passed qRT-PCR step testing were further validated using droplet digital PCR. At this stage of testing, the CTC-i chip (see, for example, Ozkumur et al., "Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells", Sci. Transl. Med., 5, 179ra147 (2013) ) was used to process whole blood samples provided by healthy individuals. CTC-i chip red blood cells from whole blood,
Negative depletion of platelets and leukocytes is performed to produce a sample product enriched for cells in the blood that do not express leukocyte markers, including CTCs (which should not be present in healthy individuals). For each blood sample, the product from the CTC-i chip was supplemented with RNA stabilization solution (RNAlater®, Life Technologies) and processed for RNA extraction and cDNA synthesis using standard methods. Droplet digital PCR (Biorad, Calif.) was then used to quantify the number of transcripts present in each sample based on the specific primer pair being tested. Samples evaluated by droplet digital PCR during this stage included cDNA from cancer cell lines, leukocyte cDNA from healthy donors processed through the CTC-i chip (at least 4 healthy individuals), and water as a negative control.

液滴デジタルＰＣＲ試験を通過するための基準は厳密であり、下記：１）癌細胞株における転写信号の存在（＞１０個の陽性液滴を有する少なくとも１つの細胞株）；２）陽性液滴と陰性（空の）液滴との間での信号の隔たりによって表される優れたシグナル対ノイズ比；３）健常提供者（健常提供者１人当たり＜３個の液滴）において液滴信号が最小限であるかまたは欠如していること；ならびに４）水における液滴信号の欠如（０個の陽性液体）を含んでいた。 The criteria for passing the droplet digital PCR test are stringent and include: 1) presence of transcriptional signal in cancer cell lines (at least 1 cell line with >10 positive droplets); 2) positive droplets. 3) excellent signal-to-noise ratio, represented by the signal separation between negative (empty) droplets; 3) drop signal in healthy donors (<3 droplets per healthy donor) and 4) lack of droplet signal in water (0 positive liquids).

上記の液滴デジタルＰＣＲ試験において、転写物を細胞株では特異的に増幅させたが白血球では増幅させなかったプライマーをその後にシグナルの感度についての詳細な試験に供した。単一細胞の顕微操作を用いて正確な数（１個、５個、１０個、２５個および５０個の細胞）の癌細胞を、健常個体から提供された全血の中にスパイクし、その後、ＣＴＣ－ｉチップに通して処理した。その後、各試料を、液滴デジタルＰＣＲを用いる試験のために上記のとおりに処理し、信号が所望の臨床用途のために十分となることを確かにする感度を見積もった。 In the droplet digital PCR test described above, primers that specifically amplified transcripts in cell lines but not in leukocytes were subsequently subjected to further testing for signal sensitivity. Precise numbers (1, 5, 10, 25 and 50 cells) of cancer cells were spiked into whole blood provided by healthy individuals using single cell micromanipulation and then , were processed through a CTC-i chip. Each sample was then processed as described above for testing using droplet digital PCR and sensitivity was estimated to ensure that the signal was sufficient for the desired clinical use.

ｑＲＴ－ＰＣＲおよび液滴デジタルＰＣＲを用いて候補の遺伝子およびプライマーを見積もる上記の厳密な手順によって、各タイプの癌について５０～１００個の候補遺伝子の初期一覧（合計でおおよそ４００個の初期候補遺伝子）のうちのおおよそ１０％から構成される最終プライマー一覧が得られた。次いで、ＭＧＨ癌センターで癌処置を受けている癌患者から提供された、ＩＲＢ承認済の臨床プロトコルの下で採集した血液試料を使用して、患者のＣＴＣにおける信号についてこれらのプライマーをさらに見積もった。この部分の見積もりにおいて肝要となるのは、癌の診断を有さない健常個体から採取した血液との比較である。以下の表１は、液滴デジタルＰＣＲを用いる前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、膵臓癌、肺癌およびメラノーマ癌を有する患者からのＣＴＣの特異的検出のためのこれらの方法を用いてこれまで開発されたプライマーおよびプローブを一覧で示す。 The above rigorous procedure of estimating candidate genes and primers using qRT-PCR and droplet digital PCR yielded an initial list of 50-100 candidate genes for each type of cancer (approximately 400 initial candidate genes in total). ), resulting in a final primer list composed of approximately 10% of the These primers were then further estimated for signal in patient CTCs using blood samples collected under an IRB-approved clinical protocol provided by cancer patients undergoing cancer treatment at MGH Cancer Center. . Critical to this part of the estimate is the comparison to blood drawn from healthy individuals with no cancer diagnosis. Table 1 below lists the methods developed to date with these methods for the specific detection of CTCs from patients with prostate, breast, hepatocellular, pancreatic, lung and melanoma cancers using droplet digital PCR. The primers and probes used are listed.

各癌タイプに対して単一遺伝子を使用することはできるが、各パネルにおける多数の遺伝子の存在は、感度（ＣＴＣは、発現様式において患者個人の中でさえ異種性を有する）と特異性（多数の遺伝子信号を検出は、これが真の癌細胞識別特徴を表すということのさらなる信頼性を付与する）との両方のために有用である。 Although a single gene can be used for each cancer type, the presence of multiple genes in each panel reduces sensitivity (CTCs are heterogeneous even among individual patients in their expression patterns) and specificity ( Detecting multiple gene signals is useful for both (giving additional confidence that this represents a true cancer cell distinguishing feature).

以下の表１中に提供される遺伝子一覧は、特定タイプの癌に独特である転写物（例えば、前立腺癌または乳癌または肝臓癌の特異性の高いマーカー）および、いくつかの癌タイプ、例えば全ての上皮癌タイプによって共有される（したがって全癌マーカーとして役立ち得る）遺伝子、および特定条件（例えば、前立腺癌における活発なアンドロゲンシグナル伝達または乳癌における活発なエストロゲンシグナル伝達）の下で誘導される遺伝子を含む。このように、各タイプの癌に対して、最適な感度、特異性、および所与の癌タイプについての臨床上実用的な情報のために設計された遺伝子の特異的パネルが割当てられる。 The list of genes provided in Table 1 below includes transcripts that are unique to certain types of cancer (e.g. highly specific markers for prostate or breast or liver cancer) and some cancer types, e.g. genes shared by epithelial cancer types (and thus can serve as pan-cancer markers), and genes induced under specific conditions (e.g., active androgen signaling in prostate cancer or active estrogen signaling in breast cancer). include. Thus, each type of cancer is assigned a specific panel of genes designed for optimal sensitivity, specificity, and clinically actionable information about a given cancer type.

さらに、表２に記載されているプライマーは、それらの特異性を維持しながら表１に列挙する遺伝子のうちのいくつかを前増幅するように設計される。ＳＴＡを方法に選択する場合、これらの入れ子型プライマーは各癌パネルの追加成分となる。 Additionally, the primers listed in Table 2 are designed to pre-amplify some of the genes listed in Table 1 while maintaining their specificity. These nested primers will be additional components of each cancer panel if STA is chosen for the method.

様々なタイプの癌についての遺伝子一覧
以下の表１は、（（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ）および配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）による）遺伝子の名前の一覧を、それらの選択対象である癌タイプ（Ｂｒ：***、Ｌｕ：肺、Ｌｉ：肝、Ｐｒ：前立腺、Ｐａｎｃ：膵臓、Ｍｅｌ：メラノーマ）と共に提供する。加えて、各遺伝子について最適化されたプライマーの組（プライマー１および２）を、デジタルＰＣＲ産物を最適に可視化するための蛍光プライマープローブの構成（例えば、タグ付きプローブ用の６－ＦＡＭ（商標）（青色蛍光標識）またはＨＥＸ（商標）（緑色蛍光標識）、およびＺＥＮ－３１ＡＢｋＦＱ消光剤）と共に列挙する。 Gene listings for various types of cancer Table 1 below lists the names of genes (by (Genbank ID) and sequence identification number (SEQ ID NO)) and their selected cancer types (Br: Breast , Lu: lung, Li: liver, Pr: prostate, Panc: pancreas, Mel: melanoma). In addition, an optimized primer set (primers 1 and 2) for each gene was used in the construction of fluorescent primer probes (e.g., 6-FAM™ for tagged probes) for optimal visualization of digital PCR products. (blue fluorescent label) or HEX™ (green fluorescent label), and ZEN-31ABkFQ quencher).

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ＰＲＡＭＥはＭＡＰＥ（腫瘍に好発現するメラノーマ抗原）、ＯＩＰ４（Ｏｐａ相互作用タンパク質ＯＩＰ４）、およびＣＴ１３０（癌／精巣抗原１３０）とも呼ばれることに留意されたい。 Note that PRAME is also called MAPE (tumor-well expressed melanoma antigen), OIP4 (Opa-interacting protein OIP4), and CT130 (cancer/testis antigen 130).

以下の表２は、表１に列挙するプライマーによって標的化される領域を特異的に前増幅させるように設計された入れ子型プライマーを一覧にしたものである。 Table 2 below lists nested primers designed to specifically pre-amplify the region targeted by the primers listed in Table 1.

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ＣＴＣチップ産物からの遺伝子転写物の多重デジタル分析
ＣＴＣに由来する最小量のＲＮＡからの腫瘍特異的ｍＲＮＡの検出を向上させるために、本発明者らは、微少量のＣＴＣチップ産物からの多様な遺伝子転写産物を試験することのできる多重検査を確立した。これは、独立した多数の遺伝子を使用することのより高い感度／特異性を、投入される鋳型の量が限られている（したがって多数の反応へと希釈されるべきでない）という事実と組み合わせるものである。本発明者らの検査は、１反応当たり４つの遺伝子を含み、各遺伝子は、様々な比率で蛍光結合プライマーを選択すること
によって独特に二次元空間に分解される。それゆえ、鋳型を希釈する必要なく、１回の反応で４つの遺伝子転写物を独立に測定することができる。種々の癌について本発明者らは最大で４つもの異なる反応（つまり、最大２０個の異なる遺伝子転写物）を行っており、入れ子式ＲＴ－ＰＣＲデジタル検査を適用すれば、実施できる反応の数に制限はない。 Multiplexed Digital Analysis of Gene Transcripts from CTC Chip Products To improve the detection of tumor-specific mRNAs from minimal amounts of RNA derived from CTCs, we used diverse A multiplex test was established that could test gene transcripts. This combines the higher sensitivity/specificity of using multiple independent genes with the fact that the amount of template input is limited (and therefore should not be diluted into multiple reactions). is. Our assay included four genes per reaction, each gene uniquely resolved into two-dimensional space by choosing fluorescent-conjugated primers in various ratios. Therefore, four gene transcripts can be measured independently in one reaction without the need to dilute the template. For various cancers we have performed up to 4 different reactions (i.e. up to 20 different gene transcripts) and applying the nested RT-PCR digital test, the number of reactions that can be performed There is no limit to

この多重式の方略は、多数の転写物の分析同士での理想的な均衡を達成する（したがって、癌細胞発現様式の異種変動から守る）ものであるが、独立した多数のＰＣＲ反応の実施によって投入材料が希釈されない。腫瘍タイプおよび、最適な信号に必要な遺伝子の数に応じて、本発明者らは、２～４重反応に及ぶ検査（４つの遺伝子に対して各々の多重反応）を開発した。それゆえ、投入される鋳型の不適切な希釈を行うことなく単一のＣＴＣの産物を、８～１６個のうちの任意個数の異なる遺伝子の発現について調べることができる。これらの遺伝子全てからの信号（すなわち累加信号）を加えることができる一方で、個々の遺伝子の結果を有する（そして、個々の遺伝子レベルでシグナル／ノイズを最適化し、また各遺伝子によって引き出される特異的なシグナル伝達経路からの情報（例えば、前立腺ＣＴＣでのアンドロゲンシグナル伝達）を集める）ことができることは、検査にとって重要なことである。 This multiplex strategy achieves an ideal balance between analyzes of multiple transcripts (thus protecting against heterogeneous variations in cancer cell expression patterns), but by performing multiple independent PCR reactions. Input material is not diluted. Depending on the tumor type and the number of genes required for optimal signal, we developed tests ranging from 2 to 4 multiplex reactions (each multiplex reaction for 4 genes). Therefore, the product of a single CTC can be examined for expression of any number of 8-16 different genes without undue dilution of the input template. Signals from all of these genes (i.e. cumulative signal) can be added while having the results of individual genes (and optimizing the signal/noise at the individual gene level and also the specific signal elicited by each gene). The ability to gather information from multiple signaling pathways (eg, androgen signaling in prostate CTCs) is important for testing.

多重反応の結果を単一の図で提示する（それゆえ各遺伝子の増幅を分離して区別する）ために、本発明者らは、２つの蛍光プローブ（ＦＡＭ（青色）およびＨＥＸ（緑色））の濃度を変化させた。こうすることによって、個々の遺伝子増幅反応のそれぞれが、遺伝子特異的プライマーの組成を反映する、したがって遺伝し特異的ＰＣＲ産物を識別する、ＦＡＭ／ＨＥＸ識別特徴の独特の組み合わせを有する。二次元空間に、単一の多重反応から生じた４つの異なる遺伝子増幅産物の信号位置を示すことができる。各ＰＣＲ反応をカプセル化する液滴を使用するデジタルＰＣＲに適用されるように、この方法は、定量的に示されるものである陽性液滴の二元信号振幅を改変することによって、標的を個々の集合体に分離する。予測されるとおり、この方法は、多数の遺伝子（例えば、合計４つの反応において１６個のマーカー）についての全信号の累加的採点だけでなく、個々の遺伝子標的のそれぞれからの信号を定量する能力の維持も可能にする。 To present the results of the multiplex reactions in a single figure (thus separating and distinguishing the amplification of each gene), we used two fluorescent probes (FAM (blue) and HEX (green)) was varied. By doing this, each individual gene amplification reaction has a unique combination of FAM/HEX distinguishing features that reflect the composition of the gene-specific primers and thus distinguish the inherited specific PCR products. In two-dimensional space, the signal locations of four different gene amplification products resulting from a single multiplex reaction can be shown. As applied to digital PCR, which uses droplets that encapsulate each PCR reaction, this method targets individually by modifying the binary signal amplitude of positive droplets, which is quantitatively indicated. separate into aggregates of As expected, this method provides the ability to quantify the signal from each of the individual gene targets, as well as the cumulative scoring of the total signal for a large number of genes (e.g., 16 markers in a total of 4 reactions). also allows the maintenance of

試験の具体的な結果は以下の実施例で詳述する。
ｄ－ＣＴＣ検査法の応用
外科的に切除または根絶することのできる時点での上皮癌の早期検出は、治癒の絶好の機会を提供し、最小限の癌播種の開始時における補助化学療法の投与は、確立された転移性疾患の処置に比べて治癒を得るのにはるかにより効果的である。しかしながら、早期癌検出の現在の取り組みは、特異性の欠如に悩まされている。例えば、血清ＰＳＡ測定を使用した男性の前立腺癌についての広範なスクリーニングは初期癌を発見するのに有効ではあるが、それは、はるかに数多くの非悪性前立腺症状（例えば、腺の良性の肥大）、さらには浸潤性になることが決してない緩慢性の癌さえも識別する。こういった事情から、広範なＰＳＡスクリーニングは公的医療機関によって推奨されていない、というのも、過剰診断による（死を含めた）合併症は早期癌検出の計算上の利点と競合的であるかまたはそれを上回るからである。 Specific results of the tests are detailed in the examples below.
Application of the d-CTC test Early detection of epithelial cancer at the time it can be surgically resected or eradicated provides the best chance of cure and administration of adjuvant chemotherapy at the onset of minimal cancer dissemination. are far more effective in obtaining cures than treatments for established metastatic disease. However, current efforts for early cancer detection suffer from a lack of specificity. For example, although extensive screening of men for prostate cancer using serum PSA measurements is effective in detecting early cancer, it is associated with a much larger number of non-malignant prostate conditions (e.g., benign enlargement of the glands), It even identifies indolent cancers that never become invasive. For these reasons, extensive PSA screening is not recommended by public health authorities because the complications (including death) from overdiagnosis compete with the computational advantage of early cancer detection. or more.

その他の癌、例えば乳癌の場合、マンモグラフィーが有効であると考えられているが、その場合でさえ、各々の真の悪性度を診断するために***生検が多数実施される。肺癌の場合、近年推奨されている、重度の喫煙履歴を有する個体の低線量ＣＴスキャンもまた、各々の真の悪性度について数百もの無害の放射線画像異常を検出する可能性がある。 For other cancers, such as breast cancer, mammography is considered effective, but even then, multiple breast biopsies are performed to diagnose the true grade of each. In the case of lung cancer, recently recommended low-dose CT scans of individuals with heavy smoking histories may also detect hundreds of harmless radiographic abnormalities for each true malignancy.

この文脈上、癌細胞由来の識別特徴の存在に関して血液に基づく極めて高感度な読み出しを追加することは、所要の特異性を提供することになるであろう。本明細書に記載のｄ－ＣＴＣ検査は、初期スクリーニングのためだけでなく、早期スクリーニングの事後確認
としても用いることができる。例えば、ある場合には、高感度であるが非特異的なスクリーニング試験（例えば前立腺癌におけるＰＳＡ）を検証する第二次試験として検査を用いることができる。癌が非常に致命的であるがスクリーニング手法が現在存在していないその他の状況（例えば膵臓癌）では、本明細書に記載の検査を用いる慣例的な周期的血液スクリーニングは、患者の経時的な状態または容態をモニタリングする規範となり得る。 In this context, the addition of a highly sensitive blood-based readout for the presence of distinguishing features derived from cancer cells would provide the required specificity. The d-CTC test described herein can be used not only for initial screening, but also as a follow-up to early screening. For example, in some cases the test can be used as a secondary test to validate a sensitive but non-specific screening test (eg PSA in prostate cancer). In other situations where cancer is highly lethal but where no screening approach currently exists (e.g. pancreatic cancer), routine periodic blood screening using the tests described herein may help patients over time. It can be the norm for monitoring a condition or condition.

新規ｄ－ＣＴＣ読み出しはまた、患者、例えば、特定タイプの癌の家族履歴および／または遺伝子マーカーを有する健常であると思われる患者の連続モニタリングにとって大いに妥当である。ＣＴＣの画像化は、必要な全てのマーカーについて適切に染色する無傷の細胞が単一の信号を生成するという点で、高い費用が掛かり、比較的感度が低い。（どれほど無傷であるかまたはアポトーシス前であるかに拘らず）各ＣＴＣが何百もの分子信号を生じることができる、本明細書に記載の新規ｄ－ＣＴＣ検査を用いることにより、既知の癌を有する患者のＣＴＣを検出およびモニタリングする能力および、治療介入に対するそれらの応答を定量的にモニタリングおよび分析する能力を劇的に向上させる。分子マーカーによる細胞数の採点の他に、かなりの感度で突然変異または癌関連の再編成（例えば、肺癌でのＥＭＬ４－ＡＬＫ）の特異的調査を達成することができる。 The novel d-CTC readout is also of great relevance for serial monitoring of patients, eg, presumably healthy patients with family history and/or genetic markers of certain types of cancer. Imaging of CTCs is expensive and relatively insensitive in that an intact cell that stains appropriately for all the markers of interest produces a single signal. By using the novel d-CTC test described herein, where each CTC (regardless of how intact or pre-apoptotic) can generate hundreds of molecular signals, known cancers can be detected. It dramatically improves the ability to detect and monitor CTCs in patients with cancer and to quantitatively monitor and analyze their response to therapeutic intervention. Besides scoring cell number by molecular markers, specific investigation of mutations or cancer-associated rearrangements (eg EML4-ALK in lung cancer) can be achieved with great sensitivity.

血液試料中に存在するＣＴＣのデジタル式（定量的）手段を提供することに加えて、新規ｄ－ＣＴＣ検査は、血中の腫瘍細胞に独特である特異的シグナル伝達経路の分析も可能にする。例えば、前立腺系統特異的遺伝子のサブセットはアンドロゲンシグナル伝達（例えばＰＳＡ）が動因となるが、別のサブセットはアンドロゲンシグナル伝達（例えばＰＳＭＡ）によって抑制される。これらの遺伝子を一緒に分析することにより、ＣＴＣ内でのアンドロゲンシグナル伝達の状態を確認することができる。同様に、乳癌では、エストロゲン応答性遺伝子（例えばプロゲステロン受容体）の発現は、ＣＴＣ内でのエストロゲン応答経路の状態についての度合いを提供する。これらの測定は、前立腺癌および乳癌での治療介入がいずれもそれぞれアンドロゲン受容体およびエストロゲン受容体を標的とするために引き出されるものであるという点において、特に重要である。このように、臨床的経路の標的化および遮断における治療剤の有効性についての情報を同時に用いて血中のＣＴＣ信号の総数を定義することは治療モニタリングのために重要である。 In addition to providing a digital (quantitative) means of CTCs present in blood samples, the novel d-CTC test also allows analysis of specific signaling pathways that are unique to tumor cells in blood. . For example, a subset of prostate lineage-specific genes are driven by androgen signaling (eg, PSA), while another subset is repressed by androgen signaling (eg, PSMA). By analyzing these genes together, the status of androgen signaling within CTCs can be confirmed. Similarly, in breast cancer, expression of estrogen-responsive genes (eg, progesterone receptors) provides a measure of the status of estrogen-responsive pathways within CTCs. These measurements are of particular importance in that therapeutic interventions in prostate cancer and breast cancer are both drawn to target androgen and estrogen receptors, respectively. Thus, it is important for therapy monitoring to define the total number of CTC signals in the blood with information about the effectiveness of therapeutic agents in targeting and blocking clinical pathways simultaneously.

以下の実施例で述べるように、癌の進行を抑制するために抗アンドロゲン剤であるアビラトロン（例えば、ザイティガ（登録商標））が有効である前立腺癌、特に、アンドロゲン経路に未だ依存性である腫瘍において、本明細書に記載の新規方法を示す。 As described in the examples below, prostate cancers in which the anti-androgen abiratron (e.g., Zytiga®) is effective in inhibiting cancer progression, particularly tumors that are still dependent on the androgen pathway. shows the novel method described herein.

以下の実施例において本発明をさらに説明するが、それは請求項の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。 The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

実施例１－デジタルＣＴＣ検査の予備的試験および検証
ＣＴＣチップ－液滴検査の実行可能性を試験するために、本発明者らはまず、前立腺腫瘍細胞では特異的に発現されるが混入している白血球には存在しないいくつかの転写物を選択した。これらは、前立腺系統特異的マーカーであるＫＬＫ３（カリクレイン関連ペプチダーゼ；または前立腺特異的抗原すなわちＰＳＭＡ）、ＦＯＬＨ１（葉酸加水分解酵素；または前立腺特異的膜抗原すなわちＰＳＭＡ）およびＡＭＡＣＲ（アルファメチルアシルＣｏＡラセミ化酵素）ならびにＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）であった。ＰＣＲ条件は、イントロンにまたがるプライマーとＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルヴィル、アイオワ州）のＺＥＮ二重消光ＦＡＭ標識プローブとを使用して標準的なｑＰＣＲプロトコルに従って最適化した。系の動的範囲を調査するために、これらの条件をまず、癌細胞と白血球との混合物からカプセル化されたｃＤＮＡを使用して試験した。次に、個々の細胞を選択する手作業での単離技法を用いて、０個、３個、
６個、１２個、２５個および１２５個の前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞を、ＨＤ血液の個々の５ｍｌ分取の中にスパイクし、続いてＣＴＣ－ｉチップ処理、ＲＴ－ＰＣＲおよび、ＲａｉｎＤｒｏｐシステムを使用した液滴カプセル化を行った。本発明者らは、ＫＬＫ３をこの実験の標的転写物として選択した、というのもそれは程よく豊富に存在することが予測されるからである。５，０００の強度閾値を用いて、本発明者らは、おおよそ２５０個の液滴でたった３個の細胞に値するＫＬＫ３転写物が容易に検出されることを見出した。 Example 1 - Preliminary Testing and Validation of Digital CTC Testing To test the feasibility of the CTC chip-droplet testing, we first investigated the contaminating but specifically expressed in prostate tumor cells. Several transcripts were selected that are not present in the leukocytes that have been identified. These include the prostate lineage-specific markers KLK3 (kallikrein-related peptidase; or prostate-specific antigen or PSMA), FOLH1 (folate hydrolase; or prostate-specific membrane antigen or PSMA) and AMACR (alpha-methylacyl-CoA racemization). enzyme) and EpCAM (epithelial cell adhesion molecule). PCR conditions were optimized according to standard qPCR protocols using intron-spanning primers and ZEN double-quenching FAM-labeled probes from Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). To investigate the dynamic range of the system, these conditions were first tested using cDNA encapsulated from a mixture of cancer cells and leukocytes. Then, using a manual isolation technique that selects individual cells, 0, 3,
6, 12, 25 and 125 prostate cancer LNCaP cells were spiked into individual 5 ml aliquots of HD blood followed by CTC-i chip processing, RT-PCR and using the RainDrop system. Droplet encapsulation was performed. We chose KLK3 as the target transcript for this experiment because it is expected to be reasonably abundant. Using an intensity threshold of 5,000, we found that approximately 250 droplets readily detected KLK3 transcripts worth only 3 cells.

これらの予備データに基づき、本発明者らは、転移性および限局性の前立腺癌を有する患者において健常対照と比較してＣＴＣチップ液滴検査を試験した。各試料をｉチップの中に流し、その後、上記４つの前立腺マーカー：ＫＬＫ３、ＡＭＡＣＲ、ＦＯＬＨ１およびＥｐＣＡＭを使用してＣＴＣ含有産物を液滴ＲＴ－ＰＣＲの中に流した。局所性または転移性のいずれかの前立腺癌を有する患者は、ＨＤ対照と比較してより著しく高い陽性液滴計数を生じた。 Based on these preliminary data, we tested the CTC chip drop test in patients with metastatic and localized prostate cancer compared to healthy controls. Each sample was run into an i-chip and then CTC-containing products were run into droplet RT-PCR using the four prostate markers described above: KLK3, AMACR, FOLH1 and EpCAM. Patients with either localized or metastatic prostate cancer produced significantly higher positive droplet counts compared to HD controls.

図１Ａは、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の全ＲＮＡから調製され、白血球と混和され、２つの異なる前立腺プライマー組を使用して液滴ＰＣＲによって分析された、ｃＤＮＡの希釈液を示す。結果はいくつかの純度を表し、この範囲に亘って陽性液滴数の良好な応答を示す。 FIG. 1A shows dilutions of cDNA prepared from total RNA of LNCaP prostate cancer cells, mixed with leukocytes and analyzed by droplet PCR using two different prostate primer sets. The results represent several purities and show a good response of positive drop counts over this range.

図１Ｂは、ＨＤ血液試料の中へスパイクされ、ＣＴＣｉチップの中に流され、液滴ＲＴ－ＰＣＲ（ＫＬＫ３プライマー組）に供された、手作業で単離されたＬＮＣａＰ細胞を示す。結果は、少数の標的細胞にまで至る優れた感度を示す。 FIG. 1B shows manually isolated LNCaP cells spiked into an HD blood sample, flowed into a CTCi chip and subjected to droplet RT-PCR (KLK3 primer set). The results show excellent sensitivity down to low numbers of target cells.

図１Ｃは、ＣＴＣ－ｉチップの中を通って処理され、３つの前立腺特異的なバイオマーカーおよび１つの上皮特異的なバイオマーカー（ＫＬＫ３、ＡＭＡＣＲ、ＦＯＬＨ１、ＥｐＣＡＭ）を使用するＲＴ－ＰＣＲおよび液滴分析に供された、健常対照、限局性の（切除可能な）前立腺癌および転移性の前立腺癌を有する患者からの血液試料の分析を示す。４つマーカー全てを合わせたときの液滴の総数／ｍｌの結果を示す。 FIG. 1C shows RT-PCR and solution processed through the CTC-i chip, using three prostate-specific biomarkers and one epithelial-specific biomarker (KLK3, AMACR, FOLH1, EpCAM). Analysis of blood samples from healthy controls, patients with localized (resectable) prostate cancer and metastatic prostate cancer that were subjected to titration analysis are shown. Results are shown for total droplets/ml for all four markers combined.

これらの結果は、ＣＴＣ－ｉチップに液滴に基づくＰＣＲ読み出しを適用することによって、生物学的検体中に存在する実質的に全てのＣＴＣを検出するその感度が著しく向上することを示唆している。まとめると、ＣＴＣ－ｉチップおよび液滴ＰＣＲは、互いに適合性が高く直列で一体化させて新規かつ高感度で正確な生体検査を作り出すことができる、２つの強力なマイクロ流体技術を表す。 These results suggest that applying a droplet-based PCR readout to the CTC-i chip significantly improves its sensitivity to detect virtually all CTCs present in a biological specimen. there is Taken together, CTC-i chip and droplet PCR represent two powerful microfluidic technologies that are highly compatible with each other and can be integrated in series to create novel, sensitive and accurate biotests.

実施例２－デジタルＣＴＣ検査プロトコル
この実施例は、本明細書に記載の方法に使用できる一般的デジタルＣＴＣ検査プロトコルを提供する。本明細書中に記載されるいくつかの実施例では、この一般的プロトコルの様々な態様を用いた。例えば、以下に記載する（ＲＮＡ精製からｃＤＮＡ合成までに関する）プロトコルのステップ３の手法１を用いて、図１５Ａ～１５Ｃのデータが生成された。ステップ３の手法２を用いて図１９Ａ～２４Ｂのデータが生成された。 Example 2 - Digital CTC Inspection Protocol This example provides a general digital CTC inspection protocol that can be used in the methods described herein. Various aspects of this general protocol were used in several of the examples described herein. For example, the data of Figures 15A-15C were generated using Procedure 1 of Step 3 of the protocol (regarding RNA purification to cDNA synthesis) described below. Method 2 in Step 3 was used to generate the data for FIGS. 19A-24B.

１．患者の血液をＩ－チップ、バージョン１．３Ｍまたは１．４．５Ｔの中に流す。試料を氷上の１５ｍＬ円錐形チューブ内に回収する。 1. The patient's blood is run through the I-tip, version 1.3M or 1.4.5T. Samples are collected in 15 mL conical tubes on ice.

２．４Ｃで試料の遠心沈殿を行う。上清を静かに移し、ペレットにＳＵＰＥＲａｓｅ（商標）Ｉｎ（ＤＴＴ非依存性ＲＮアーゼ阻害剤）＋ＲＮＡＬａｔｅｒ（登録商標）安定化溶液（ＲＮアーゼを阻害することによってＲＮＡ分解を防止するもの）を添加する。試料を瞬間凍結させ、さらなる処理を行うまで－８０のところに置く。試料は－８０で安定である。 2. Centrifuge the sample at 4C. Decant supernatant and add to pellet SUPERase™ In (DTT independent RNase inhibitor) + RNALater® Stabilizing Solution (prevents RNA degradation by inhibiting RNase) . Samples are flash frozen and placed at -80 until further processing. The sample is stable at -80.

３．ＲＮＡ精製からｃＤＮＡ合成までは、以下に記載の実施例で用いた２つの異なる処理プロトコルが存在する。 3. From RNA purification to cDNA synthesis, there are two different processing protocols used in the examples described below.

手法１
ａ．試料を氷上で解凍した。 Method 1
a. Samples were thawed on ice.

ｂ．洗剤（ＮＰ４０、Ｔｗｅｅｎ２０）を使用した試料の直接溶解。
ｃ．溶解した試料をそのままｃＤＮＡ合成（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ）に使用した。 b. Direct lysis of samples using detergents (NP40, Tween20).
c. The lysed samples were directly used for cDNA synthesis (Superscript III).

ｄ．ｃＤＮＡ合成試料をＳＰＲＩ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズ）による浄化によって精製して洗剤およびあらゆる＜１００ｂｐのヌクレオチドを除去した。 d. cDNA synthesis samples were purified by SPRI (Agencourt AMPure® XP beads) cleanup to remove detergent and any <100 bp nucleotides.

手法２
ａ．試料を氷上で解凍した。 Method 2
a. Samples were thawed on ice.

ｂ．試料をＲＮｅａｓｙＱｉａｇｅｎＭｉｃｒｏＫｉｔで処理した。プロトコルは、従前のＱｉａｇｅｎの推奨と比較してわずかな変化を有する。より多い体積の緩衝剤ＲＬＴ（溶解用緩衝剤）を使用すると同時に、より高いＥＴＯＨ濃度を用いた。これらの改変は、試料にＲＮＡＬａｔｅｒ（登録商標）を添加するがゆえに行った。 b. Samples were processed with the RNeasyQiagenMicroKit. The protocol has minor changes compared to previous Qiagen recommendations. A higher ETOH concentration was used at the same time that a higher volume of buffer RLT (lysis buffer) was used. These modifications were made due to the addition of RNALater® to the samples.

ｃ．ｃＤＮＡ合成後－試料をＳＰＲＩ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ）による浄化によって精製して洗剤およびあらゆる＜１００ｂｐのヌクレオチドを除去した。 c. After cDNA synthesis—Samples were purified by SPRI (Agencourt AMPure XP beads) cleanup to remove detergent and any <100 bp nucleotides.

４．ｃＤＮＡ（アプローチ１または２により合成）は、２つの異なる方法で処理することができる：
ａ．ｃＤＮＡを直接、ｄｄＰＣＲに使用した；または
ｂ．Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）入れ子式ＰＣＲ手法を用いてｃＤＮＡを増幅させた（入れ子式ＰＣＲに使用した遺伝子からのプライマーは事前に検証した）。増幅させたｃＤＮＡを希釈した。 4. cDNA (synthesized by approaches 1 or 2) can be treated in two different ways:
a. cDNA was used directly for ddPCR; or b. The cDNA was amplified using the Fluidigm BioMark™ nested PCR technique (primers from genes used for nested PCR were previously verified). Amplified cDNA was diluted.

５．ｃＤＮＡ（ステップ４ａまたは４ｂから）、プローブとしてのＢｉｏｒａｄ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（商標）、（対象遺伝子のための）１つ以上のプライマー（４つ以下の異なるプライマー（ＦＡＭおよびＨＥＸ）を多重化することができる）を合計２２μｌの体積に添加した。 5. cDNA (from step 4a or 4b), Biorad Supermix™ as probe, one or more primers (for gene of interest) (up to 4 different primers (FAM and HEX) can be multiplexed) was added to a total volume of 22 μl.

６．液滴を生成させた（１ウェルあたり約１５，０００～１８，０００個の液滴）。
７．液滴試料をＰＣＲ機の中に入れた。ＰＣＲ条件はＢｉｏｒａｄの推奨とは異なっていた。本発明者らは、全ての液滴を確実に同じ温度にするために、緩やかな傾斜ではなく段階的降下を用いた。これは、ＲａｉｎＤａｎｃｅが用いるものともＢｉｏｒａｄが用いるものとも異なっている。勾配ではなく段階的降下を用いることによって、よりよい結果（すなわち、より大きな信号および、陽性液滴と陰性液滴との間でのより大きな分離）を得ることができる。 6. Droplets were generated (approximately 15,000-18,000 droplets per well).
7. A droplet sample was placed into the PCR machine. PCR conditions differed from those recommended by Biorad. We used a stepped descent rather than a gradual ramp to ensure all drops were at the same temperature. This is different from what RainDance uses and what Biorad uses. Better results (ie, greater signal and greater separation between positive and negative droplets) can be obtained by using a stepped descent rather than a gradient.

８．ＰＣＲの後、陽性液体の数をｄｄＰＣＲ機で数えた。
９．データを収集し、ＴＩＢＣＯ（登録商標）Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（登録商標）解析ソフトウェアを使用して解析した。 8. After PCR, the number of positive liquids was counted with a ddPCR machine.
9. Data were collected and analyzed using TIBCO® Spotfire® analysis software.

試薬、試薬濃度および反応体積を以下に示す：
試薬：
・プローブとしてのＢｉｏｒａｄ ｄｄＰＣＲ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ｄＵＴＰなし）
・ＩＤＴプライマー／プローブ（２０倍濃縮または４０倍濃縮）
・ｃＤＮＡ（細胞株で１ｎｇ／ｕｌ）
・ヌクレアーゼ不含水
・エッペンドルフ セミスカート９６ウェルプレート（これらのプレートのみが機械で正常に機能する）

試験関連の細胞株
単一反応当たり：
ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １１．０μｌ
プライマー（２０倍濃縮） １．１０μｌ
ｃＤＮＡ（１ｎｇ／μｌ） １．１０μｌ
水 ８．８０μｌ
合計 １ウェル当たり２２．０μｌ
ｄｄＰＣＲ ｓｕｐｅｒｍｉｘ、ｃＤＮＡおよび水を含有するマスターミックスをウェル内へ分取し、各々１．１μｌのプライマーを各ウェルに加え、十分に混合した。 Reagents, reagent concentrations and reaction volumes are shown below:
reagent:
- Biorad ddPCR™ Supermix (no dUTP) as probe
- IDT primers/probes (20x enriched or 40x enriched)
-cDNA (1 ng/ul in cell line)
Nuclease-free water Eppendorf semi-skirt 96-well plates (only these plates work properly on the machine)

Test-relevant cell lines Per single reaction:
ddPCR Supermix 11.0 μl
Primer (20x concentrated) 1.10 μl
cDNA (1 ng/μl) 1.10 μl
8.80 µl of water
Total 22.0 μl per well
A master mix containing ddPCR supermix, cDNA and water was aliquoted into wells and 1.1 μl of each primer was added to each well and mixed well.


患者試料
個々の遺伝子について単一反応当たり
ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １１．０μｌ
プライマー（２０倍濃縮） １．１μｌ
ｃＤＮＡ（患者） ９．９μｌまで（満たない場合は水で釣り合わせる）
合計 １ウェル当たり２２．０μｌ
多数の遺伝子についての単一多重化反応当たり
ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １１．０μｌ
プライマー１（４０倍濃縮） ．５５μｌ
プライマー２（４０倍濃縮） ．５５μｌ
プライマー３（４０倍濃縮） ．５５μｌ
プライマー４（４０倍濃縮） ．５５μｌ
ｃＤＮＡ（患者） ８．８μｌ
合計 １ウェル当たり２２．０μｌ

遺伝子特異的プライマーに対して多数の患者を試験する場合、または多数の遺伝子に対して多重化するプライマーを試験する場合、ｄｄＰＣＲ ｓｕｐｅｒｍｉｘとプライマーとを含むものであるマスターミックスをウェル内へ分取し、続いて各ウェルに患者ｃＤＮＡを加え、十分に混合した。
Patient sample ddPCR Supermix 11.0 μl per single reaction for each gene
Primer (20x concentrated) 1.1 μl
cDNA (patient) up to 9.9 μl (balance with water if less)
Total 22.0 μl per well
11.0 μl ddPCR Supermix per single multiplex reaction for multiple genes
Primer 1 (40-fold concentrated) . 55 μl
Primer 2 (40-fold concentrated) . 55 μl
Primer 3 (40-fold concentrated) . 55 μl
Primer 4 (40-fold concentrated) . 55 μl
cDNA (patient) 8.8 μl
Total 22.0 μl per well

When testing multiple patients against gene-specific primers, or multiplexing primers against multiple genes, a master mix containing ddPCR supermix and primers is aliquoted into wells followed by Patient cDNA was added to each well by using a sieve and mixed well.

実施例３－遺伝子検証のためのプロトコル
表１に列挙する特異的マーカー遺伝子を選択するために下記のプロトコルを用いた。 Example 3 - Protocol for Gene Validation The following protocol was used to select the specific marker genes listed in Table 1.

１．ＣＴＣに対しては独特であるが白血球（ＷＢＣ）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）などをバイオインフォマティクス的に徹底調査した。一次腫瘍およびＣＴＣの遺伝子発現データをＷＢＣ遺伝子発現データセットと比較して、一次腫瘍および／またはＣＴＣにのみ存在する転写物を探し出した。 1. Unique to CTCs, white blood cells (WBC), leukocytes, etc. were bioinformatically probed. Gene expression data of primary tumors and CTCs were compared to the WBC gene expression dataset to look for transcripts present only in primary tumors and/or CTCs.

２．閾値カットオフを通過した転写物をｑＰＣＲによって検証した。
３．プライマーをＩＤＴによって合成した。プローブをＦＡＭ／ＺＥＮ／ＩＢＦＱで標識した。 2. Transcripts passing the threshold cutoff were verified by qPCR.
3. Primers were synthesized by IDT. Probes were labeled with FAM/ZEN/IBFQ.

４．ｑＰＣＲ検証には、２つの異なる細胞株、（ＣＰＴカラムにより単離された）５つの健常提供者ＷＢＣ、および陰性対照としての水に対して各転写物を少なくとも２つの独立したプライマー組によって検証することを要した。５０サイクルのｑＰＣＲを用いて、転写物の発現が細胞株にのみ存在し健常提供者に存在しないことを確認した。 4. For qPCR validation, each transcript is validated by at least two independent primer sets against two different cell lines, five healthy donor WBCs (isolated by CPT columns), and water as a negative control. required. A 50-cycle qPCR was used to confirm that transcript expression was present only in the cell lines and not in healthy donors.

５．ｑＰＣＲ検証を通過した転写物を、ＣＴＣ－ｉチップを通過させる細胞株および健常提供者を用いたｄｄＰＣＲで（細胞のスパイクの有り無しで）検証した。 5. Transcripts that passed qPCR validation were validated (with and without cell spikes) by ddPCR using cell lines and healthy donors passing the CTC-i chip.

６．対照の疾患に応じて転写物のパネルを（１反応当たり４つまでの遺伝子）多重化した。 6. A panel of transcripts was multiplexed (up to 4 genes per reaction) according to control disease.

この方略の効力はスパイク細胞実験で以下に示されるが、スパイク細胞実験は、慎重に数を測定した（ＬＮＣＡＰ前立腺癌細胞株からの）腫瘍細胞を個々に顕微操作し、対照血液検体を添加し、ＣＴＣ－ｉチップに通してその後に上記のｄ－ＣＴＣ検査で分析するものであった。スパイクする細胞の数が増えると、図２に示すようにデジタル信号の数が増加を示し、それはこのプロトコルの能力を例証している。図２は、プローブとしての単一の遺伝子転写物（前立腺癌のＰＳＡとしても知られるＫＬＫ３）の使用を実証する（検査において本発明者らは８～２４個の遺伝子転写物を使用し、それによって感度をさらに向上させている）。ここで、本発明者らは、計算した数の癌細胞をスパイクする（各セルを顕微操作して選び、１０ｍｌの対照血液検体中に導入する）。その後、血液をＣＴＣチップに通して処理し、上記のデジタル読み出しに供する。単一の癌細胞でスパイクされた場合に血中に観察される信号は全くない。２細胞／血液１０ｍｌの投入は明確な信号（６５個の陽性液滴）を生成する。この場合、１０個のＣＴＣ産物を４つに分割して４重に流したため、６４個の液滴は実際には腫瘍細胞の１／４に由来するデジタル信号を表す。 The efficacy of this strategy is demonstrated below in spike cell experiments, in which carefully enumerated tumor cells (from the LNCAP prostate cancer cell line) were individually micromanipulated and a control blood sample was added. , through a CTC-i chip and subsequently analyzed with the d-CTC test described above. As the number of spiking cells increased, the number of digital signals showed an increase as shown in Figure 2, which illustrates the power of this protocol. Figure 2 demonstrates the use of a single gene transcript (KLK3, also known as PSA for prostate cancer) as a probe (in testing we used 8-24 gene transcripts, to further improve sensitivity). Here we spike a calculated number of cancer cells (each cell is micromanipulated and introduced into a 10 ml control blood sample). The blood is then processed through a CTC chip and subjected to the digital readout described above. No signal is observed in the blood when spiked with single cancer cells. An input of 2 cells/10 ml of blood produces a clear signal (65 positive droplets). In this case, the 64 droplets actually represent digital signals from 1/4 of the tumor cells, since the 10 CTC products were split into 4 and run in quadruplicates.

この検査は高感度だけでなく再現性も有する。図３に示すように、これらのスパイク細胞実験でのデジタル信号は、高い再現性を示し（ここでは２つの独立な反復を示している）、細胞を（血液でなく）緩衝液の中にスパイクして直接（ＣＴＣチップ処理なしで）分析した場合に同じ量の信号が見られる。したがって、腫瘍細胞を数十億個もの正常血液細胞の中に希釈し、その後にデジタル読み出しに先立ってＣＴＣチップを使用して「再単離」した場合、信号の損失は実質的に存在しない。 This test has not only high sensitivity but also reproducibility. As shown in Figure 3, the digital signals in these spiked cell experiments are highly reproducible (here showing two independent replicates), spiking cells into buffer (rather than blood). The same amount of signal is seen when analyzed directly (without CTC chip processing) with Therefore, there is virtually no loss of signal when tumor cells are diluted into billions of normal blood cells and then "re-isolated" using a CTC chip prior to digital readout.

実施例４－ＣＴＣチップ産物からの遺伝子転写物の多重デジタル分析
本発明者らは、微少量のＣＴＣチップ産物から多くの異なる遺伝子転写物を試験することのできる多重検査を確立した。 Example 4 - Multiplex Digital Analysis of Gene Transcripts from CTC Chip Products We have established a multiplex test that can test many different gene transcripts from minute amounts of CTC chip products.

これは、独立した多数の遺伝子を使用することのより高い感度および特異性を、投入される鋳型の量が限られている（したがって多数の反応へと希釈されるべきでない）という事実と組み合わせたものである。 This combines the greater sensitivity and specificity of using multiple independent genes with the fact that the amount of template input is limited (and therefore should not be diluted into multiple reactions). It is.

新規検査は、１反応当たり多数の遺伝子、例えば、２個、３個、４個、６個、８個、１０個またはそれより多い遺伝子を含み、各遺伝子は、様々な比率で蛍光結合プライマーを選択することによって独特に二次元空間に分解される。それゆえ、鋳型を希釈する必要なく、１回の反応で２つ、３つ、４つまたはそれより多い遺伝子転写物を独立に測定することができる。種々の癌について、多数の異なる反応（例えば、４回の反応において最大２０個の異なる遺伝子転写物）を実行および分析することができ、入れ子式ＲＴ－ＰＣＲデ
ジタル検査を適用すれば、実施できる反応の数に制限はない。 The novel test contains multiple genes per reaction, e.g., 2, 3, 4, 6, 8, 10 or more genes, each gene with fluorescent-conjugated primers in various ratios. The selection is uniquely decomposed into two-dimensional space. Therefore, 2, 3, 4 or more gene transcripts can be measured independently in a single reaction without the need to dilute the template. A large number of different reactions (e.g. up to 20 different gene transcripts in 4 reactions) can be run and analyzed for different cancers, which can be done if nested RT-PCR digital tests are applied. There is no limit to the number of

多重反応の結果を１つの図で提示する（それゆえ各遺伝子の増幅を分離して区別する）ために、本発明者らは、２つの蛍光プローブ（ＦＡＭおよびＨＥＸ）の濃度を変化させた。こうすることによって、個々の遺伝子増幅反応のそれぞれが、遺伝子特異的プライマーの組成を反映する、したがって遺伝し特異的ＰＣＲ産物を識別する、ＦＡＭ／ＨＥＸ識別特徴の独特の組み合わせを有する。二次元空間に、単一の多重反応から生じた４つの異なる遺伝子増幅産物の信号位置を示すことができる。各ＰＣＲ反応をカプセル化する液滴を使用するデジタルＰＣＲに適用されるように、この方法は、定量的に示されるものである陽性液滴の二元信号振幅を改変することによって、標的を個々の集合体に分離する。予測されるとおり、この方法は、多数の遺伝子（例えば、合計４つの反応において１６個のマーカー）についての全信号の累加的採点だけでなく、個々の遺伝子標的のそれぞれからの信号を定量する能力の維持も可能にする。 In order to present the results of the multiplex reaction in one figure (thus separating and distinguishing the amplification of each gene), we varied the concentrations of the two fluorescent probes (FAM and HEX). By doing this, each individual gene amplification reaction has a unique combination of FAM/HEX distinguishing features that reflect the composition of the gene-specific primers and thus distinguish the inherited specific PCR products. In two-dimensional space, the signal locations of four different gene amplification products resulting from a single multiplex reaction can be shown. As applied to digital PCR, which uses droplets that encapsulate each PCR reaction, this method targets individually by modifying the binary signal amplitude of positive droplets, which is quantitatively indicated. separate into aggregates of As expected, this method provides the ability to quantify the signal from each of the individual gene targets, as well as the cumulative scoring of the total signal for a large number of genes (e.g., 16 markers in a total of 4 reactions). also allows the maintenance of

プローブ１：１００％ ＦＡＭ
プローブ２：１００％ ＨＥＸ
プローブ３：ＦＡＭとＨＥＸとの混合物－合計１００％
プローブ４：ＦＡＭとＨＥＸとの混合物－合計１００％
表３～７に示すように、多重反応において下記のプローブ混合物を使用した： Probe 1: 100% FAM
Probe 2: 100% HEX
Probe 3: Mixture of FAM and HEX - 100% total
Probe 4: Mixture of FAM and HEX - 100% total
The following probe mixtures were used in multiplex reactions, as shown in Tables 3-7:

Figure 0007203128000010
Figure 0007203128000010

Figure 0007203128000011
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Figure 0007203128000012
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Figure 0007203128000013
Figure 0007203128000013

Figure 0007203128000014
Figure 0007203128000014

検証および試験
この多重方略の有効性を検証および実証するために、本発明者らは、（スパイク細胞実験を用いた）概念と患者由来の試料とを示した。図４は、健常提供者（ＨＤ）からの正常な対照血液試料をＣＴＣチップによって処理して４つの異なる遺伝子転写物（その全てが陰性（すなわちブランク液滴）である）についてｄーＣＴＣ検査に供した結果を示す。 Validation and Testing To validate and demonstrate the efficacy of this multiplex strategy, we demonstrated the concept (using spike cell experiments) and patient-derived samples. FIG. 4 shows that a normal control blood sample from a healthy donor (HD) was processed by the CTC chip to d-CTC testing for four different gene transcripts, all of which were negative (i.e., blank droplets). The results obtained are shown.

他方、図５は、スパイク細胞実験から得たデータを表すものであり、当該実験では、前立腺癌細胞株を血中に導入してＣＴＣチップにより処理し、続いてデジタル検査を行い、４系統の転写物の各々について陽性信号（蛍光液滴）が示された。これらは、二次元プロットの中で、（写真では色付けされている）２つのプローブの蛍光の区別に基づいて別個の場所に現れた。試料は使用細胞が過剰に投入されているため、いくつかの液滴は１つ以上の遺伝子転写物からの信号を含んでいた（液滴１個あたり多数個ある遺伝子は灰色で示されている）。 On the other hand, FIG. 5 represents data obtained from a spike cell experiment, in which a prostate cancer cell line was introduced into blood and processed with a CTC chip, followed by digital examination, and four lines of A positive signal (fluorescent droplet) was shown for each of the transcripts. These appeared at distinct locations in the two-dimensional plot based on the distinction of the fluorescence of the two probes (colored in the picture). Samples were overloaded with working cells, so some droplets contained signal from more than one gene transcript (genes with multiple per droplet are shown in gray). ).

各反応において４つの異なる遺伝子を表す方略は、各腫瘍タイプの代わりに特異的系統マーカーを使用して多様な癌に適用可能であった。例えば、前立腺癌では、本発明者らは、２つの反応のそれぞれについて４つの四つ組（１つの四つ組当たり１つの遺伝子）を使用する多重反応の予測（理論モデル）をした（合計８つの遺伝子マーカー）。スパイク細胞実験（対照血液中に導入されＣＴＣ－ｉチップにより処理される前立腺癌細胞）は、予測された結果を正確に再現した。 The strategy of representing four different genes in each reaction was applicable to a variety of cancers using specific lineage markers in place of each tumor type. For example, in prostate cancer, we made multiple response predictions (theoretical model) using four quadruplets (one gene per quadruplet) for each of the two responses (a total of 8 two genetic markers). Spike cell experiments (prostate cancer cells introduced into control blood and treated with CTC-i chips) exactly reproduced the expected results.

さらに、図６Ａ～６Ｂおよび図７Ａ～７Ｂは、まとめ合わせると、本発明の解析プログラムが全ての陽性信号をまさにモデリングから予測されるとおりに四半部内に統合し、特異的遺伝子信号の採点方法を本発明者らが開発するのを可能にした、ということを示している。信号の多次元空間解析は、高い精度レベルでの自動化された分析および採点を可能にした。図６Ａおよび６Ｂはそれぞれ反応１の前立腺癌細胞株についての理論モデルおよび実際の結果を示し、図７Ａおよび７Ｂはそれぞれ、反応２の同じ前立腺癌細胞株についての理論モデルおよび実際の結果を示す。 Moreover, Figures 6A-6B and Figures 7A-7B, taken together, demonstrate that the analysis program of the present invention integrates all positive signals into quadrants exactly as predicted from modeling, and the specific gene signal scoring method. It shows that the inventors made it possible to develop. Multidimensional spatial analysis of the signals allowed for automated analysis and scoring with a high level of accuracy. Figures 6A and 6B show the theoretical model and actual results, respectively, for the prostate cancer cell line of Reaction 1, and Figures 7A and 7B show the theoretical model and the actual results, respectively, for the same prostate cancer cell line of Reaction 2.

図８Ａ～８Ｂ（乳癌および肺癌の理論および実際の結果、反応１）および図９Ａ～９Ｂ（乳癌および肺癌の理論および実際の結果、反応２）、図１０Ａ～１０Ｂ（同じ、反応３）、図１１Ａ～１１Ｂ（同じ、反応４）、図１２Ａ～１２Ｂ（同じ、反応５）、図１３Ａ～１３Ｂ（同じ、反応６）は、乳癌および肺癌に関して同じ手法を用いた場合の結果を示す。本発明者らは、以下（乳癌細胞と肺癌細胞との両方に関するスパイク細胞実験を用いる理論対検証）に示すように、殆どの腺癌で共有されている（つまり、乳癌と肺癌とをまとめ合わせる）マーカーを識別するのに有効な多重癌パネルを６つの反応（合計２４個のマーカーでは各反応に４つの遺伝子マーカー）として確立することができる。 Figures 8A-8B (breast and lung cancer theoretical and practical results, reaction 1) and Figures 9A-9B (breast and lung cancer theoretical and practical results, reaction 2), Figures 10A-10B (same, reaction 3), Figs. 11A-11B (same, reaction 4), FIGS. 12A-12B (same, reaction 5), FIGS. 13A-13B (same, reaction 6) show the results of using the same procedure for breast cancer and lung cancer. We show below (theory vs. validation using spike cell experiments on both breast and lung cancer cells) shared by most adenocarcinomas (i.e., breast and lung cancer together) ) A multiplex cancer panel effective in distinguishing markers can be established as 6 reactions (4 gene markers in each reaction for a total of 24 markers).

これらの図は、多数の遺伝子転写物を多重様式（１反応当たり４つの遺伝子）で試験する同じ手法を乳癌に適応した場合の結果を示す。（合計２４個の遺伝子転写物を独立に試験することを可能にする）６つの異なる反応を同じＣＴＣチップ産物に実施し、その各々を指定の（上のパネルで予測された）信号位置を有し、スパイク細胞検証実験で観察された（下のパネルで観察された）。 These figures show the results of applying the same approach to testing multiple gene transcripts in a multiplexed fashion (4 genes per reaction) to breast cancer. Six different reactions (allowing a total of 24 gene transcripts to be tested independently) were performed on the same CTC chip product, each with a designated (predicted in upper panel) signal position. and observed in the spike cell validation experiment (observed in lower panel).

実施例５－腫瘍特異的ｍＲＮＡの検出を改善する標的特異的な前増幅
腫瘍特異的ＲＮＡの検出を改善するために、遺伝子特異的増幅の各々について入れ子式ＰＣＲ方略を最適化した。これを成し遂げるために、ＣＴＣに由来するｃＤＮＡをまず、ｄ－ＣＴＣ検査に使用する遺伝子特異的プライマーの数塩基対外側に配置される遺伝子特異的プライマーで増幅した。各遺伝子について、２～３個のプライマー組を試験し、遺伝子特異的ｄ－ＣＴＣ検査プライマーに適合しておりかつＨＤ血液において試験結果が陰性であるプライマー組を患者試料の分析のために選択した。 Example 5 Target-Specific Pre-Amplification to Improve Detection of Tumor-Specific mRNA To improve detection of tumor-specific RNA, a nested PCR strategy was optimized for each of the gene-specific amplifications. To accomplish this, cDNAs derived from CTCs were first amplified with gene-specific primers positioned a few base pairs outside of the gene-specific primers used for d-CTC testing. For each gene, 2-3 primer sets were tested, and primer sets that matched the gene-specific d-CTC test primers and tested negative in HD blood were selected for analysis of patient samples. .

上記のとおり、標的特異的増幅プロトコルをまず、種々の癌に由来する細胞株で試験した。その後、血液と混ぜてＣＴＣ－ｉチップによって濃縮した癌細胞株の混合物を使用して腫瘍細胞に特異的な（かつ白血球には存在しない）プライマーの組み合わせを試験した。ＣＴＣ－ｉチップによって処理したＨＤ血液を対照として使用した。この方略にとって肝要なのは、正常血液細胞からのベースライン信号を増加させることなく微少量のＣＴＣ由来ｃＤＮＡからの信号を増強する入れ子式ＰＣＲ条件の考案である。この感度は、ＰＣＲプライマー配列および検査条件を慎重に最適化することならびに外部ＰＣＲと内部ＰＣＲとでサイクル数の釣り合いをとることによって達成された。全ての条件は、最初に生成核酸を使用して検証し、次に、対照血液試料中へスパイクされかつＣＴＣ－ｉチップによって処理された個々の腫瘍細胞を使用して検証し、次に、種々の健常血液提供者の広い（＞１０）パネルを使用して検証し、最終的に、転移性または限局性のいずれかである前立腺、***、メラノーマ、肝臓、肺または膵臓の癌を有する患者からの患者由来血液試料を
使用して検証する。 As described above, the target-specific amplification protocol was first tested on cell lines derived from various cancers. Tumor cell-specific (and leukocyte-absent) primer combinations were then tested using a mixture of cancer cell lines mixed with blood and enriched by the CTC-i chip. HD blood processed by CTC-i chips was used as a control. Critical to this strategy is the devising of nested PCR conditions that enhance the signal from minute amounts of CTC-derived cDNA without increasing the baseline signal from normal blood cells. This sensitivity was achieved by careful optimization of PCR primer sequences and test conditions and by balancing the number of cycles between external and internal PCR. All conditions were first validated using generated nucleic acids, then using individual tumor cells spiked into a control blood sample and processed by the CTC-i chip, followed by various from patients with prostate, breast, melanoma, liver, lung or pancreatic cancer, either metastatic or localized patient-derived blood samples.

試薬
・ＤＮＡ懸濁用緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）（ＴＥＫｎｏｖａ、ＰＮＴ０２２１）
・０．５ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（インビトロジェン、ＰＮ Ａｍ９２６０Ｇ）
・ＴａｑＭａｎ前増幅マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ４３９１１２８）
・ヌクレアーゼ不含水（ＴＥＫｎｏｖａ、ＰＮ Ｗ３３０）
１０倍濃縮の特異的標的増幅（ＳＴＡ）プライマー混合物の調製
１．）ＤＮＡ非存在フード内で、０．５μＬの２００μＭのプライマーの対の各々（０．５μＬの順方向プライマーおよび０．５μＬの逆方向プライマー）を混合した。 Reagents DNA suspension buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) (TEKnova, PNT0221)
- 0.5 EDTA, pH 8.0 (Invitrogen, PN Am9260G)
- TaqMan preamplification master mix (Applied Biosystems, PN 4391128)
・Nuclease free water (TEKnova, PN W330)
Preparation of 10-fold concentrated specific target amplification (STA) primer mix. ) In a DNA-free hood, 0.5 μL of 200 μM of each primer pair (0.5 μL forward primer and 0.5 μL reverse primer) were mixed.

２．）各プライマーを１倍濃度のＤＮＡ懸濁用緩衝液中に希釈して終濃度を５００ｎＭとした。（例：プールされたプライマーの体積が８ｍＬに等しい場合には１９２ｍＬのＤＮＡ懸濁用緩衝液を添加する）
３．）混合物の渦流撹拌を２０秒間行い、遠心沈殿を３０秒間行った。 2. ) Each primer was diluted in 1× DNA suspension buffer to a final concentration of 500 nM. (Example: if the volume of pooled primers equals 8 mL, add 192 mL of DNA suspension buffer)
3. ) The mixture was vortexed for 20 seconds and spun down for 30 seconds.

４．）１０倍濃縮のＳＴＡプライマー混合物は繰り返し使用するために４℃で６ヶ月まで貯蔵することができ、または長期使用のために－２０℃で凍結貯蔵することができる。 4. ) The 10-fold concentrated STA primer mix can be stored at 4°C for up to 6 months for repeated use, or can be stored frozen at -20°C for long-term use.

ＳＴＡ反応混合物の調製
１．）９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに下記の混合物を調製する。 Preparation of STA reaction mixture 1 . ) Prepare the following mixtures in each well of a 96-well PCR plate.

Figure 0007203128000015
Figure 0007203128000015

２．）６μＬのｃＤＮＡを９μＬのＳＴＡ反応混合物に添加する
３．）２０サイクルではなく１８サイクルの変性およびアニーリング／伸長ステップを用いて下記に一覧で示す熱サイクル条件を用いた（注：１８サイクルは、ＴＳＡ前増幅プロトコルを全トランスクリプトーム増幅と比較するために用いた）。 2. 3.) Add 6 μL cDNA to 9 μL STA reaction mix. ) The thermal cycling conditions listed below were used with 18 cycles of denaturation and annealing/extension steps rather than 20 cycles (Note: 18 cycles were used to compare the TSA preamplification protocol to whole transcriptome amplification). Using).

Figure 0007203128000016
Figure 0007203128000016

各液滴ＰＣＲ反応に１μｌの前増幅産物を投入する。
図１４は、１ｎｇの非増幅細胞株ｃＤＮＡならびに、１０、１４および１８サイクルの前増幅後の１μｌの前増幅産物から得られた、７つのマーカー（ＰＩＰ、ＰＲＡＭＥ、ＲＮＤ３、ＰＫＰ３、ＦＡＴ１、Ｓ１００Ａ２およびＡＧＲ２）の液滴ＰＣＲ信号を示す。さらなるサイクルの前増幅は信号の増加をもたらす。注目すべきことに、この細胞株において非常に低レベルで発現されるマーカーであるＰＲＡＭＥは、１８サイクルの前増幅の後にのみ検出され、当該技法の有用性を実証している。 Inject 1 μl of preamplification product into each droplet PCR reaction.
Figure 14 shows seven markers (PIP, PRAME, RND3, PKP3, FAT1, S100A2 and AGR2) droplet PCR signal. Additional cycles of pre-amplification result in an increase in signal. Of note, PRAME, a marker expressed at very low levels in this cell line, was detected only after 18 cycles of pre-amplification, demonstrating the utility of the technique.

実施例６－臨床データおよび検査検証
臨床研究からの実際の患者試料を使用して本明細書に記載の検査を検証した。これらは、転移癌（肺、***、前立腺およびメラノーマ）を有する患者および限局癌（前立腺）を有する患者を含む。検査は実施例２～５に記載されているとおりに行った。 Example 6 - Clinical Data and Laboratory Validation Actual patient samples from clinical studies were used to validate the assay described herein. These include patients with metastatic cancer (lung, breast, prostate and melanoma) and patients with localized cancer (prostate). Testing was performed as described in Examples 2-5.

図１５Ａ、ＢおよびＣは、肺（６人の患者；図１５Ａ）、***（６人の患者；図１５Ｂ）および前立腺（１０人の患者；図１５Ｃ）の転移癌を有する患者からの臨床検査の概要により、実質的に全ての患者は陽性信号を有するがその一方で健常対照はそれを全く有しないことが示されたことを示す。この検査では、全ての陽性点数を足し合わせた（累加点数）。しかしながら、以下に記載するように、点数を個々の遺伝子によって図１６に示すように分解することもできる。 Figures 15A, B and C are laboratory studies from patients with metastatic cancer of the lung (6 patients; Figure 15A), breast (6 patients; Figure 15B) and prostate (10 patients; Figure 15C). showed that virtually all patients had a positive signal, while healthy controls had none. In this test, all positive scores were summed (cumulative score). However, as described below, the scores can also be broken down by individual genes as shown in FIG.

図１６は、多数のプローブからのデータの累加的な解析を例示するものであり、１０／１１の転移性前立腺癌患者（患者１人当たりの基準では９１％）および０／１２（０％）の健常対照での陽性信号を示す。試料１つ当たりの基準では２８個のうち２４個の試料が陽性信号を有し、８６％の検出率を示していた。さらに、いくつかの個々のマーカーはかなり効果的であり、例えば、ＡＧＲ２（転移癌については９／１０の検出、および限局癌については０／３の検出）、ＴＭＰＲＳＳ２（５／１０および１／３）、ＫＬＫ２（６／１０および０／３）、ＳＴＥＡＰ２（１／１０および１／３）、ＦＡＴ１（２／１０および１／３）およびＦＯＬＨ１（３／１０および１／３）となった。 FIG. 16 illustrates the cumulative analysis of data from multiple probes, showing that 10/11 patients with metastatic prostate cancer (91% on a per patient basis) and 0/12 (0%) A positive signal in healthy controls is shown. On a per sample basis, 24 out of 28 samples had a positive signal, indicating a detection rate of 86%. In addition, some individual markers are quite effective, e.g. AGR2 (9/10 detection for metastatic cancer and 0/3 detection for localized cancer), TMPRSS2 (5/10 and 1/3 ), KLK2 (6/10 and 0/3), STEAP2 (1/10 and 1/3), FAT1 (2/10 and 1/3) and FOLH1 (3/10 and 1/3).

上に示したように、上記の多重蛍光色体系を用いて、独立した検証および定量のために個々の遺伝子マーカーを分解することもできる。以下のこの実施例では、転移性前立腺癌を有する患者は多数の陽性マーカーを有し、限局性前立腺癌を有する患者はより少ないマーカーのより少ない数の陽性点数を有し、健常対照は全てのマーカーについて陰性である。 As indicated above, the multiple fluorochrome scheme described above can also be used to resolve individual genetic markers for independent validation and quantification. In this example below, patients with metastatic prostate cancer had a large number of positive markers, patients with localized prostate cancer had a lower number of positive scores with fewer markers, and healthy controls had all Negative for markers.

図１７は、３つの代表的な患者試料からの臨床データを示す。各々４つの遺伝子転写物（合計８つのプローブ）を使用する２つの個別の反応において転移性前立腺癌を有する患者の血液試料は、多数の信号を示した（全てのプローブは様々な程度で陽性である）。対照的に、限局性（治癒可能な）前立腺癌を有する患者の血液試料はより弱い（しかし明確に検出できる）信号を示した。プローブ１（ＴＭＰＲＳＳ２）、５（ＫＬＫ３）、６（Ｈ
ＯＸＢ１３）、７（ＡＧＲ２）は、転移癌患者において最も強い信号を有しており、プローブ２（ＦＡＴ１）および４（ＳＴＥＡＰ２）は、限局癌患者において最も陽性であった。この結果は、血中の癌細胞における信号の異種性、および検査の中で差異のある信号を詳細に分析することの重要性を明確に例証している。（癌患者試料と等しく処理された）ＨＤ対照からの血液は、信号が全く存在していなかった。 Figure 17 shows clinical data from three representative patient samples. Blood samples from patients with metastatic prostate cancer in two separate reactions each using four gene transcripts (eight probes total) showed multiple signals (all probes were positive to varying degrees). be). In contrast, blood samples from patients with localized (curable) prostate cancer showed a weaker (but clearly detectable) signal. Probes 1 (TMPRSS2), 5 (KLK3), 6 (H
OXB13), 7 (AGR2) had the strongest signals in patients with metastatic cancer, and probes 2 (FAT1) and 4 (STEAP2) were the most positive in patients with localized cancer. This result clearly illustrates the heterogeneity of signals in cancer cells in blood and the importance of detailed analysis of differential signals in a test. Blood from HD controls (treated identically to cancer patient samples) had no signal present.

実施例７－ＣＴＣ内でのシグナル伝達経路の測定
血液試料中に存在するＣＴＣのデジタル式（定量的）手段を提供することに加えて、本発明者らのｄ－ＣＴＣ検査は、血中の腫瘍細胞に独特である特異的シグナル伝達経路の分析も可能にする。例えば、前立腺系統特異的遺伝子のサブセットはアンドロゲンシグナル伝達（例えばＰＳＡ）が動因となったが、別のサブセットはアンドロゲンシグナル伝達（例えばＰＳＭＡ）によって抑制された。これらの遺伝子を一緒に分析することにより、ＣＴＣ内でのアンドロゲンシグナル伝達の状態を確認することができる。必須経路の標的化および遮断における治療剤の有効性についての情報を同時に用いて血中のＣＴＣ信号の総数を定義することは治療モニタリングのために重要である。 Example 7 Measurement of Signaling Pathways in CTCs In addition to providing a digital (quantitative) means of CTCs present in blood samples, our d-CTC test It also allows analysis of specific signaling pathways that are unique to tumor cells. For example, a subset of prostate lineage-specific genes were driven by androgen signaling (eg, PSA), whereas another subset was repressed by androgen signaling (eg, PSMA). By analyzing these genes together, the status of androgen signaling within CTCs can be confirmed. Defining the total number of CTC signals in blood simultaneously with information about the effectiveness of therapeutic agents in targeting and blocking essential pathways is important for therapy monitoring.

本発明者らはこの概念を、抗アンドロゲン剤であるアビラトロンが癌進行の抑制に有効である前立腺癌、特に、アンドロゲン経路に未だ依存性である腫瘍において例証してきた。以下に、第一線のリュープロリドに対してもはや応答性でない「去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）」を有しアビラテロンで処置された患者の結果を示した。アンドロゲン応答マーカー（緑色）は、初期の有効性を示す療法によって最初に抑制されたが、後に腫瘍が抵抗性になるにつれて回復し、患者はこの薬剤で疾患が進行する。 We have demonstrated this concept in prostate cancer, in which the anti-androgen drug abiratron is effective in inhibiting cancer progression, particularly in tumors that are still dependent on the androgen pathway. Shown below are the results of a patient treated with abiraterone who has "castration-resistant prostate cancer (CRPC)" that is no longer responsive to first-line leuprolide. The androgen response marker (green) was initially suppressed by the therapy showing early efficacy, but later recovered as the tumor became resistant and the patient progressed on the drug.

図１８は、転移性前立腺癌を有する患者の臨床研究の結果を提供する。「アンドロゲン受容体に起因する遺伝子（ＡＲオン）」からの信号のサブセットはこの棒グラフのバーの上部に緑色で示され、その一方で「アンドロゲンで抑制される遺伝子（ＡＲオフ）」は各バーの下部に赤色で示される。患者はアンドロゲン経路阻害剤であるアビラトロン（例えばザイティガ（登録商標）（酢酸アビラテロン）で処置されているため、ＡＲオン信号は大きく低減され、血中の癌細胞内でアンドロゲン経路が効果的に抑制されることを示している。しかし、薬物処置の第４サイクルまでにアンドロゲン経路は癌細胞において再活性化されると見受けられ（増加している緑色信号）、薬物抵抗性を指し示している。これらの時点において行われた血清ＰＳＡ測定結果は、薬物処置の失敗と一致する。 Figure 18 provides the results of a clinical study of patients with metastatic prostate cancer. The subset of signals from 'androgen receptor driven genes (AR on)' is shown in green at the top of the bars in this bar graph, while 'androgen repressed genes (AR off)' are shown in green at the top of each bar. Shown in red at the bottom. Because the patient has been treated with an androgen pathway inhibitor, abiraterone, such as Zytiga (abiraterone acetate), the AR-on signal is greatly reduced, effectively suppressing the androgen pathway in cancer cells in the blood. However, by the fourth cycle of drug treatment, the androgen pathway appears to be reactivated in cancer cells (increasing green signal), indicating drug resistance. Serum PSA measurements taken at time points are consistent with drug treatment failure.

実施例８－腫瘍特異的ｍＲＮＡの検出を改善する非特異的前増幅
実施例５と同様に、非特異的全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）を用いてＣＴＣ特異的転写物の検出率を向上させることができる。この方法は、対象標的だけでなく産物中に見つかるあらゆる伝達を増幅させるランダムなプライマーの使用に依拠する。この実施例では、下記のとおりＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＲＮＡキットプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。 Example 8 - Non-Specific Pre-Amplification Improves Detection of Tumor-Specific mRNAs Similar to Example 5, non-specific whole-transcriptome amplification (WTA) is used to improve detection of CTC-specific transcripts. be able to. This method relies on the use of random primers that amplify not only the target of interest but also any transfer found in the product. In this example, the SMARTer™ Ultra Low RNA kit protocol (Clontech) was used as follows.

ＲＮＡをＰＣＲ用のチューブまたはプレートに移す
１）１：５０，０００に希釈された１ｕＬのＥＲＣＣ Ｓｐｉｋｅ－Ｉｎ Ｍｉｘ １を各試料に添加する
２）各試料の体積を１０ｕＬに増やす
３）１ｕＬの３’ＳＭＡＲＴ ＣＤＳプライマーＩＩＡを各試料に添加する
４）熱サイクル機の「７２Ｃ」プログラムを実行する：
７２℃ ３分
４°Ｃ 永遠
第一鎖ｃＤＮＡマスターミックス（ＦＳＭ）：
１倍濃度で４ｕＬ ５倍濃縮の第一鎖用緩衝液
０．５ｕＬ ＤＴＴ
１ｕＬ ｄＮＴＰ混合物
１ｕＬ ＳＭＡＲＴｅｒ ＩＩＡオリゴヌクレオチド
０．５ｕＬ ＲＮアーゼ阻害剤
２ｕＬ ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ ＲＴ
１試料当たり９ｕＬ
５）試料個数分のＦＳＭを１０％過剰に調製し、次いで９ｕＬのＦＳＭを各試料に添加し、ピペット操作で混合する
６）熱サイクル機の「ｃＤＮＡ」プログラムを実行する：
４２℃ ９０分
７０℃ １０分
４°Ｃ 永遠
第二鎖合成および増幅（ＳＳＭ）：
１倍濃度で２５ｕＬ ２倍濃縮のＳｅｑＡｍｐ ＰＣＲ用緩衝液
１μＬ プライマーＩＩＡ－ｖ３
１μＬ ＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ
３ｕＬ ヌクレアーゼ不含水 １試料当たり３０ｕＬ
７）試料個数分のＳＳＭを１０％過剰に調製し、次いで３０ｕＬのＳＳＭを各試料に添加し、ピペット操作で混合する
８）熱サイクル機の「ＰＣＲ」プログラムを実行する：
９５℃ １分
Ｘサイクル
９８℃ １０秒
６５℃ ３０秒
６８℃ ３分
７２℃ １０分
４℃ 永遠
サイクルの回数はＲＮＡ投入量に応じて調節することができる（例えば、単一の細胞には１８サイクル、または１０ｎｇのＲＮＡ投入量では９サイクル）。加えて、４℃の停止点は一晩である。 Transfer RNA to tubes or plates for PCR 1) Add 1 uL of ERCC Spike-In Mix 1 diluted 1:50,000 to each sample 2) Increase volume of each sample to 10 uL 3) 1 uL of 3 'Add SMART CDS Primer IIA to each sample 4) Run the '72C' program on the thermal cycler:
72°C 3 minutes 4°C forever First Strand cDNA Master Mix (FSM):
4uL at 1X concentration 5X Concentrated First Strand Buffer 0.5uL DTT
1 uL dNTP Mix 1 uL SMARTer IIA Oligonucleotide 0.5 uL RNase Inhibitor 2 uL SMARTScribe RT
9 uL per sample
5) Prepare a 10% excess of FSM for the number of samples, then add 9 uL of FSM to each sample and mix by pipetting 6) Run the "cDNA" program on the thermal cycler:
42°C 90 minutes 70°C 10 minutes 4°C forever Second Strand Synthesis and Amplification (SSM):
25 uL at 1× concentration 1 μL 2× concentrated SeqAmp PCR buffer Primer IIA-v3
1 μL SeqAmp DNA polymerase 3 uL Nuclease free water 30 uL per sample
7) Prepare a 10% excess of SSM for the number of samples, then add 30 uL of SSM to each sample and mix by pipetting 8) Run the "PCR" program on the thermal cycler:
95°C 1 minute X cycle 98°C 10 seconds 65°C 30 seconds 68°C 3 minutes 72°C 10 minutes 4°C forever The number of cycles can be adjusted depending on the RNA input (e.g., 18 for a single cell). cycles, or 9 cycles for a 10 ng RNA input). In addition, the 4° C. stop point is overnight.

固相可逆固定（ＳＰＲＩ）による精製：
ＰＣＲ産物をｌｏ－ｂｉｎｄ１．５ｍＬエッペンドルフに移し、第２組のチューブに試料ＩＤのラベルを付け；最終的に溶離させるときまで室温でＳＰＲＩプロトコルを行う
９）ＡＭＰｕｒｅ（商標）ＸＰビーズ［４度］を室温で少なくとも３０分間保温する
１０）十分な量の溶離用緩衝液が解凍されて室温であることを確認する
１１）８０％エタノールを作る（１試料当たり少なくとも４００ｕＬ）
１２）５０ｕＬのビーズを各試料に添加する前に、十分に混合すべくピペット操作を上下に５～１０回行ってビーズの十分な渦流撹拌を行う。注：ビーズをピペットで採取するときには、体積のよりよい制御および先端でのより少ないビーズの付着のためにＲＰＴ先端具を使用することが賢明である
１３）試料を室温で５分間保温する
１４）試料を磁石の上に置き、５分間静置する
１５）ビーズを乱さずに上清（約９５ｕＬ）をピペットで吸い出す（ピペット先端が褐色になっているか確認し、相当な量のビーズの損失があればチューブに戻す）
１６）２００ｕＬの８０％エタノールで２回洗浄する－ビーズペレットを混合または撹乱しないこと。 Purification by solid phase reversible immobilization (SPRI):
Transfer PCR product to lo-bind 1.5 mL Eppendorf, label second set of tubes with sample ID; perform SPRI protocol at room temperature until final elution 9) AMPure™ XP beads [4 degrees] Incubate at room temperature for at least 30 minutes 10) Ensure sufficient volume of elution buffer is thawed and at room temperature 11) Make 80% ethanol (at least 400 uL per sample)
12) Before adding 50 uL of beads to each sample, vortex the beads thoroughly by pipetting up and down 5-10 times to mix well. Note: When pipetting beads, it is advisable to use an RPT tip for better control of volume and less adherence of beads at the tip 13) Incubate sample at room temperature for 5 minutes 14) Place the sample on the magnet and let it sit for 5 minutes 15) Pipette off the supernatant (approximately 95uL) without disturbing the beads (check if the pipette tip is brown; return to tube if present)
16) Wash twice with 200uL 80% ethanol - do not mix or disturb the bead pellet.

単純にビーズペレットをエタノールに３０秒間浸し、その後にエタノールを除去する。
エタノール洗浄の合間にビーズペレットが乾燥しないようにすること。 Simply soak the bead pellet in ethanol for 30 seconds, then remove the ethanol.
Do not let the bead pellet dry between ethanol washes.

１７）ビーズペレットの光沢がもはやなくなるまで（但しそれらが割れる前に）磁気ラック上で試料を風乾する。乾燥中、底に溜まる残留エタノールをピペットで取り除く（注：乾燥時間は増幅後のＤＮＡ濃度に大いに依存する可能性がある）。単一細胞レベルのＲＮＡ投入量では乾燥に通常３～５分間掛かる一方、その他のＩＦＤ産物試料は１時間まで掛かった。 17) Air dry the samples on the magnetic rack until the bead pellets are no longer shiny (but before they crack). During drying, pipette off residual ethanol that collects at the bottom (note: drying time can be highly dependent on DNA concentration after amplification). Drying typically took 3-5 minutes for single cell level RNA inputs, while other IFD product samples took up to 1 hour.

１８）ペレットを、それらが割れ始める時に１７ｕＬの溶離用緩衝液中で溶離させる。試料を磁石から取り外し、全てのビーズが溶液中に入るまでペレットの上に緩衝液をピペットで加え；その後、ピペット操作で混合してビーズを完全に再懸濁させる（これは効果の程度が各試料で異なるであろう）。激しく混合し過ぎないようにすること、というのも、これは、達成可能な溶離体積を低下させる傾向にある気泡を多く作り出すからである。 18) Elute the pellets in 17 uL of elution buffer when they start to crack. Remove the sample from the magnet and pipet buffer over the pellet until all the beads are in solution; sample will vary). Avoid mixing too vigorously, as this creates a lot of air bubbles which tends to reduce the achievable elution volume.

１９）再懸濁させた試料を室温で少なくとも２分間保温し、その後、全ての試料を高速旋回させる。 19) Incubate the resuspended samples at room temperature for at least 2 minutes, then vortex all samples at high speed.

２０）試料を磁気ラック上に戻して５分間置く。
２１）約１５ｕＬの溶離した増幅ｃＤＮＡをピペットで吸い取り、ピペット先端にビーズがあるか確認する。ビーズが存在しているならば、ピペットで溶液をビーズペレットの上に戻し、溶離をもう１回試みる前に約１分間静置する。そうでなければ、新しいｌｏ－ｂｉｎｄ１．５ｍＬエッペンドルフ、ＰＣＲチューブまたは９６ウェルＰＣＲプレートの中に保存する。注：溶離産物中に繰り返しビーズが入るようであれば、吸入体積を１４ｕＬ以下にすることが唯一の解決策となり得る。 20) Place the sample back on the magnetic rack for 5 minutes.
21) Pipette approximately 15 uL of eluted amplified cDNA and check for beads at the pipette tip. If beads are present, pipette the solution back over the bead pellet and let stand for about 1 minute before attempting another elution. Otherwise, store in new lo-bind 1.5 mL Eppendorf, PCR tubes or 96-well PCR plates. Note: Reducing the draw volume to 14 uL or less may be the only solution if repeated beads appear in the eluate.

この全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）手法は最初に、種々の癌に由来する細胞株で試験した。図１９Ａおよび１９Ｂは、３回の異なる反復のＳＭＡＲＴｅｒで前増幅した、肝臓癌細胞株（ＨＥＰＧ２）由来のｃＤＮＡ（１８サイクル）を、肝臓癌パネルからの１２個のプローブで分析したものを示す。図１９Ａに示すように、各標的領域の増幅効率は異なるがそれは３回の反復（ＷＴＡ１、ＷＴＡ２、ＷＴＡ３）の間で一致しており、この手法の再現性を実証している。図１９Ｂに示すように、１８サイクルのＳＭＡＲＴｅｒ前増幅を用いるこれらの方法は、おおよそ４桁（１０８対１０４）の信号の増大をもたらし、検出の著しい強化をもたらす。 This whole transcriptome amplification (WTA) approach was first tested in cell lines derived from various cancers. Figures 19A and 19B show cDNA (18 cycles) from a liver cancer cell line (HEPG2) pre-amplified with three different iterations of SMARTer analyzed with 12 probes from the liver cancer panel. As shown in Figure 19A, the amplification efficiencies of each target region differed but were consistent among the three replicates (WTA1, WTA2, WTA3), demonstrating the reproducibility of this approach. As shown in Figure 19B, these methods with 18 cycles of SMARTer pre-amplification result in a signal increase of roughly four orders of magnitude ( 108 vs 104), resulting in a significant enhancement of detection.

実施例９－肝臓癌の多重対個別マーカー検査
各試料のために各患者から１０～２０ｍＬの血液を採取した。血液を到着から３時間以内に、負枯渇モードで流しているＣＴＣ－ｉチップで処理した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（商標）ｐｌｕｓマイクロキットを使用して産物からＲＮＡを抽出し、取得可能な１７ｕＬのうちの５ｕＬを、ＣｌｏｎＴｅｃｈのｖ３ ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）方略を用いて増幅させた。その後、ＷＴＡ産物の１％をデジタルＰＣＲプレートの各ウェルの中に投入し、５００ｎＭのＴａｑｍａｎ（商標）プライマー／プローブ合剤を使用して対象の各遺伝子について転写物濃度を決定した。転写物計数を血液体積に規格化してＨＣＣ、ＨＤおよびＣＬＤの患者同士で比較した。ＨＣＣ患者は、生検確認済の未切除肝細胞癌腫として定義され、ＣＬＤ患者は、超音波／ＭＲＩが陰性である、様々な病因（アルコール媒介性、ＨＢＶ、ＨＣＶ）の肝臓疾患を有する患者である。ＨＤは、１０～２０ｍＬの血液を提供する、研究所外の健常提供者である。 Example 9 - Multiple Versus Individual Marker Test for Liver Cancer 10-20 mL of blood was drawn from each patient for each sample. Blood was processed within 3 hours of arrival with a CTC-i chip running in negative depletion mode. RNA was extracted from the product using the Qiagen RNeasy™ plus micro kit and 5 uL of the 17 uL available was amplified using ClonTech's v3 SMARTer™ Whole Transcriptome Amplification (WTA) strategy. rice field. 1% of the WTA product was then loaded into each well of a digital PCR plate, and 500 nM Taqman™ primer/probe mix was used to determine transcript concentration for each gene of interest. Transcript counts were normalized to blood volume and compared between HCC, HD and CLD patients. HCC patients were defined as biopsy-confirmed unresected hepatocellular carcinoma, and CLD patients were patients with liver disease of various etiologies (alcohol-mediated, HBV, HCV) with negative ultrasound/MRI. be. HD is a non-laboratory healthy donor donating 10-20 mL of blood.

図２０Ａ～２０Ｃは、２１人の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）患者（図２０Ａ）、１３人の慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）患者（図２０Ｂ）および１５人の健常提供者（ＨＤ）（図２０Ｃ）に
おける液滴総数を示す。ＨＣＣ患者はＣＬＤおよびＨＤのどちらと比べてもより多い数の液滴を示し、パネルから高リスクＣＬＤ群がかなり取り除かれていることおよび、パネルを用いてそれらの患者を肝臓癌の発症に関してスクリーニングできることを示唆している。これは、現在診療所で利用可能な肝臓癌のためのスクリーニング方法ｃの特異性が低いことを考慮すれば重要な結果である。ＣＬＤ患者についてアメリカ肝臓病協会は、６ヶ月毎の超音波（ＵＳ）（詳細なアルゴリズムは、検出される肝臓病巣の大きさに依存する）を推奨している。中国において、ＡＦＰ遺伝子マーカーと超音波スクリーニングとの有望な組み合わせは、スクリーニングされた母集団がたった６０％の遵守率を維持した場合でさえ、スクリーニングされた人が、スクリーニングされなかった人に比べて死亡率の３７％の得をする、ということを実証した。 20A-20C in 21 hepatocellular carcinoma (HCC) patients (FIG. 20A), 13 chronic liver disease (CLD) patients (FIG. 20B) and 15 healthy donors (HD) (FIG. 20C). Total number of droplets is indicated. HCC patients showed a higher number of droplets compared to both CLD and HD, significantly removing the high-risk CLD group from the panel and using the panel to screen those patients for the development of liver cancer. suggesting that it can be done. This is an important result considering the low specificity of screening methods c for liver cancer currently available in the clinic. For CLD patients, the American Liver Association recommends ultrasound (US) every 6 months (the detailed algorithm depends on the size of the liver lesions detected). In China, a promising combination of AFP genetic markers and ultrasound screening showed that screened compared to unscreened, even though the screened population maintained a compliance rate of only 60%. It has been demonstrated to have a 37% mortality benefit.

各検査の感度および特異性は、「罹患」対「非罹患」を定義するために選択される閾値に依存するが、２０ｕｇ／Ｌを用いて、ＡＦＰ遺伝子マーカーは５０～８０％の感度および８０～９０％の特異性を有する。２０ｎｇ／ｍｌをカットオフ点として用いる研究では、感度は７８．９％に上昇するが、特異性は７８．１％に落ち込む（Ｔａｋｅｔａ、Ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１９８９；３３：１３８０）。他方、本発明の検査は、患者の臨床履歴を考慮に入れ、かつ根治的切除または肝臓移植を受けた者について補正した場合、全体的な検出率が７６％であり、特異性が１００％であった。 The sensitivity and specificity of each test depends on the threshold chosen to define "affected" versus "unaffected", but using 20 ug/L, the AFP gene marker has a sensitivity of 50-80% and a sensitivity of 80%. It has a specificity of ~90%. A study using 20 ng/ml as a cut-off point raises the sensitivity to 78.9% but the specificity drops to 78.1% (Taketa, Alpha-fetoprotein, J. Med. Technol., 1989; 33: 1380). On the other hand, the test of the present invention has an overall detection rate of 76% and a specificity of 100% when taking into account the patient's clinical history and correcting for those who have undergone radical resection or liver transplantation. there were.

さらに、本明細書において用いられる肝臓癌検査の１１個のマーカーは全て、７６％の感度に寄与したが、上位５つのマーカー（ＡＨＳＧ、ＡＬＢ、ＡＰＯＨ、ＦＧＢおよびＦＧＧ）はそれら自体で７０％の感度を有し、その一方で上位３つのマーカーのみ（ＡＬＢ、ＦＧＢ、ＦＧＧ）では６７％の感度を生じる。ＡＬＢ単独では症例の５６％を検出した。 Furthermore, all 11 markers of liver cancer testing used herein contributed to a sensitivity of 76%, whereas the top five markers (AHSG, ALB, APOH, FGB and FGG) by themselves contributed 70% of the sensitivity. sensitivity, while only the top three markers (ALB, FGB, FGG) yield a sensitivity of 67%. ALB alone detected 56% of cases.

実施例１０－肺癌についての多重対個別マーカー検査
８人の転移性肺患者および８人の健常提供者の血液試料を、先に記載したようにＣＴＣチップに通して処理した。試料に遠心沈殿を行い、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで保存した。ＲＮＡを精製し、記載したようにｃＤＮＡを合成した。６μｌのｃＤＮＡおよび図中に列挙されるプローブに対応する入れ子型プライマーを使用して各試料に対してＳＴＡを実施した。各液滴ＰＣＲ反応につき１μｌのＳＴＡ産物を投入した。 Example 10 - Multiplexed vs Individual Marker Test for Lung Cancer Blood samples from 8 metastatic lung patients and 8 healthy donors were processed through a CTC chip as previously described. Samples were spun down, treated with RNAlater™, and stored at -80C. RNA was purified and cDNA was synthesized as described. STA was performed on each sample using 6 μl of cDNA and nested primers corresponding to the probes listed in the figure. 1 μl of STA product was input for each droplet PCR reaction.

液滴数を血液体積に正規化した。図２１Ａおよび２１Ｂに示すように、多重化した肺遺伝子マーカーのパネルは、８人の健常提供者のバックグラウンドを上回る転移性肺癌患者試料を１００％（８／８）検出することができた。肺パネルの各マーカーの感度もまた決定したところ、結果は、ＳＦＲＰの検出率が８／８であり、ＦＡＴ１プローブ２の検出率が７／８であり、ＴＭＰＲＳＳ４の検出率が６／８であり、ＦＯＸＦ１およびＡＲＧ２、プローブ２の検出率が５／８であり、ＦＡＴ１の検出率が４／８であり、ＦＡＴ２およびＡＧＲ２の検出率が３／８であり、ＦＡＴ２、プローブ２の検出率が２／８であったことを示している。 Drop counts were normalized to blood volume. As shown in Figures 21A and 21B, the panel of multiplexed lung genetic markers was able to detect 100% (8/8) of the metastatic lung cancer patient samples above the background of 8 healthy donors. The sensitivity of each marker in the lung panel was also determined and the results were 8/8 detection rate for SFRP, 7/8 detection rate for FAT1 probe 2, and 6/8 detection rate for TMPRSS4. , FOXF1 and ARG2 with a detection rate of 5/8 for probe 2, a detection rate of 4/8 for FAT1, a detection rate of 3/8 for FAT2 and AGR2, and a detection rate of 2 for FAT2 and probe 2. /8.

ＳＥＲＰＩＮＡ３およびＳＦＲＰ２の検査は、ＳＦＲＰ２が肺癌および乳癌のどちらの検出にも有効であることを指し示したが、他方で前者は、乳癌検出に対してより特異的であるがいくつかの肺癌試料も検出すると見受けられる。 Examination of SERPINA3 and SFRP2 indicated that SFRP2 was effective in detecting both lung and breast cancer, whereas the former was more specific for breast cancer detection but also detected some lung cancer samples. Then you can see it.

実施例１１－乳癌についての多重対個別マーカー検査
９人の転移性乳癌患者、５人の限局性乳癌患者および１５人の健常提供者からの血液試料をＣＴＣチップに通して処理した。産物をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで保存した。先に記載したように各試料からＲＮＡおよびｃＤＮＡを調
製した。図２２中に列挙されるプローブに対応する入れ子型プライマー（ＦＡＴ２、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＰＧＲ、ＰＲＡＭＥ、ＴＦＡＰ２Ｃ、Ｓ１００Ａ２、ＦＡＴ１、ＡＧＲ２、ＰＫＰ３、ＲＮＤ３およびＰＩＰ）を使用して各試料から６μｌのｃＤＮＡをＳＴＡ増幅した。液滴数を血液体積に正規化し、各マーカーについて、最も高い健常提供者の値を患者試料の値から差し引いた。 Example 11 Multiplexed Paired Individual Marker Test for Breast Cancer Blood samples from 9 patients with metastatic breast cancer, 5 patients with localized breast cancer and 15 healthy donors were processed through a CTC chip. Products were pelleted, treated with RNAlater™ and stored at -80C. RNA and cDNA were prepared from each sample as previously described. STA amplify 6 μl of cDNA from each sample using nested primers (FAT2, SCGB2A1, PGR, PRAME, TFAP2C, S100A2, FAT1, AGR2, PKP3, RND3 and PIP) corresponding to the probes listed in FIG. bottom. Drop counts were normalized to blood volume and the highest healthy donor value was subtracted from the patient sample value for each marker.

図２２は、各患者についてのバックグラウンドより上の信号を示す。これらの方法は、７／９（７８％）の転移性試料および２／５（４０％）の限局性試料を検出した。各マーカー単独での感度は１／１４～６／１４で変動し、最も関連のある２つのマーカーはＡＧＲ２（６／１４）およびＦＡＴ１（５／１４）であり、その次に最も関連のある４つのマーカーはＲＮＤ３、ＰＫＰ３、ＰＲＡＭＥおよびＳＣＧＢ２Ａ１（それぞれ３／１４）であった。 FIG. 22 shows the signal above background for each patient. These methods detected 7/9 (78%) metastatic and 2/5 (40%) localized samples. The sensitivity for each marker alone varied from 1/14 to 6/14, with the two most relevant markers being AGR2 (6/14) and FAT1 (5/14), followed by 4 The two markers were RND3, PKP3, PRAME and SCGB2A1 (3/14 each).

実施例１２－転移性乳癌におけるＡＶＲ７検出
１０人の転移性乳癌患者、７人の健常提供者からの血液試料をＣＴＣチップに通して処理した。産物をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで保存した。先に記載したように各試料からＲＮＡおよびｃＤＮＡを調製した。６μｌの未増幅ｃＤＮＡを各液滴ＰＣＲ反応に投入した。試料は、アンドロゲン受容体のｖ７アイソフォーム（ＡＲｖ７、配列は表１中）に対するプローブを使用して分析した。液滴数を血液体積に正規化した。 Example 12 - AVR7 detection in metastatic breast cancer Blood samples from 10 metastatic breast cancer patients, 7 healthy donors were processed through a CTC chip. Products were pelleted, treated with RNAlater™ and stored at -80C. RNA and cDNA were prepared from each sample as previously described. 6 μl of unamplified cDNA was added to each droplet PCR reaction. Samples were analyzed using a probe against the v7 isoform of the androgen receptor (ARv7, sequence in Table 1). Drop counts were normalized to blood volume.

図２３Ａに示すように、ＡＲｖ７は５／１０の患者（５０％）においてバックグラウンド（ＨＤ）レベルを超えて検出され、検査が好結果にＡＲｖ７を液体生検から検出することを実証した。患者のうちの１人は三重陰性乳癌を有しており、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）との関連（例えば、３つの最も一般的な乳癌マーカーであるエストロゲン受容体（ＥＲ）マーカー、ＨＥＲ２／ｎｅｕマーカーおよびプロゲステロン受容体（ＰＲ）マーカーのいずれかの遺伝子を発現しない患者）においてさえＡＲｖ７がマーカーとして有用であることが示唆された。 As shown in Figure 23A, ARv7 was detected above background (HD) levels in 5/10 patients (50%), demonstrating that the test successfully detects ARv7 from liquid biopsies. One of the patients had triple-negative breast cancer and had no association with triple-negative breast cancer (TNBC) (e.g. estrogen receptor (ER) marker, HER2/neu marker, the three most common breast cancer markers). It was suggested that ARv7 is useful as a marker even in patients who do not express genes for any of the progesterone receptor (PR) markers.

実施例１３－メラノーマについての多重対個別マーカー検査
（各々多数の描点（合計描点：１８２）を有する）３４人の転移性または切除不可能なメラノーマ患者および１５人の健常提供者からの血液試料をＣＴＣチップに通して処理した。産物をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで瞬間凍結した。先に記載したように各試料からＲＮＡおよびｃＤＮＡを調製した。図２４Ａ中のグラフの下部に沿って列挙されているプローブに対応する入れ子型プライマー（個々のマーカーはＰＭＥＬ、ＭＬＡＮＡ、ＭＡＧＥＡ６、ＰＲＡＭＥ、ＴＦＡＰ２ＣおよびＳＯＸ１０））を使用して、各試料から１２μｌのｃＤＮＡを特異的標的増幅（１０サイクル）によって増幅させた。液滴数を血液体積に正規化した。図２４Ｂは、健常提供者と比較した場合のメラノーマ患者において検出された液滴信号のドットプロット分布図を示す。全患者の描点について検出感度は８１％であった（患者の描点は、６つのマーカーのうち任意の１つが、その特定マーカーについてのＨＤでの最も高いバックグラウンド信号を上回る液滴信号を示す場合に、陽性に採点される）。個々のマーカーのうち、ＰＭＥＬおよびＭＬＡＮＡは最も高い検出率を示した。 Example 13 - Multiple Paired Individual Marker Test for Melanoma Blood samples from 34 patients with metastatic or unresectable melanoma (each with multiple dabs (total dabs: 182)) and 15 healthy donors were Processed through a CTC chip. Products were pelleted, treated with RNAlater™, and flash frozen at -80C. RNA and cDNA were prepared from each sample as previously described. 12 μl of cDNA from each sample were analyzed using nested primers corresponding to the probes listed along the bottom of the graph in FIG. was amplified by specific target amplification (10 cycles). Drop counts were normalized to blood volume. FIG. 24B shows a dot plot distribution of droplet signals detected in melanoma patients as compared to healthy donors. Sensitivity of detection was 81% for all patient dabs (patient dab if any one of the 6 markers showed a drop signal above the highest background signal in HD for that particular marker). (to be scored positively). Among the individual markers, PMEL and MLANA showed the highest detection rate.

その他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上記の記載が例示を意図したものであり、別記の特許請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではない、ということは理解されるべきである。その他の態様、利点および変化形態は添付の特許請求の範囲に含まれる。 OTHER EMBODIMENTS While the present invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to be illustrative and not limit the scope of the invention as defined by the appended claims. It should be understood that it is not. Other aspects, advantages and modifications are within the scope of the appended claims.

Claims (17)

血液試料中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分析する方法であって、
前記血液試料から、ＣＴＣを単離することと、
前記ＣＴＣからリボ核酸（ＲＮＡ）分子を単離することと、
溶液中で単離ＲＮＡからｃＤＮＡ分子を生成させることと、
ｃＤＮＡ分子を個々の液滴中にカプセル化することと、
ＣＴＣ由来のｃＤＮＡには特異的に結合するがその他の細胞に由来するｃＤＮＡには結合しないように構成された１つ以上のレポーター基の存在下、各液滴内でｃＤＮＡ分子を増幅させることと、
前記レポーター基を含有する液滴を液滴中のＣＴＣ由来のｃＤＮＡ分子の存在の指標として検出することと、
検出された液滴中のＣＴＣを分析することと
を含み、
各液滴内でｃＤＮＡ分子を増幅させることが、各液滴の中でＰＣＲを行うことを含み、
プライマーの組を各液滴内で前記ｃＤＮＡ分子を増幅させるために使用し、各プライマーの組は、選択された癌遺伝子に対応し、
前記選択された癌遺伝子は、前立腺癌、乳癌、肺癌、肝臓癌およびメラノーマの１以上に対して選択的な遺伝子を含み、
前記前立腺癌選択的遺伝子は、ＦＡＴ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＡＧＲ２、ＦＯＬＨ１、ＨＯＸＢ１３、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、およびＳＴＥＡＰ２を含み、前記前立腺癌選択的遺伝子に対応する前記プライマーの組は、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＴＭＰＲＳＳ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＦＯＬＨ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、
ＨＯＸＢ１３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＫＬＫ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、
ＫＬＫ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、および
ＳＴＥＡＰ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）
であり、
前記乳癌選択的遺伝子は、ＴＦＡＰ２Ｃ、Ｓ１００Ａ２、ＰＧＲ、ＰＩＰ、ＦＡＴ２、ＡＧＲ２、ＦＡＴ１、ＲＮＤ３、ＰＫＰ３、ＰＲＡＭＥ、およびＳＣＧＢ２Ａ１を含み、前記乳癌選択的遺伝子に対応する前記プライマーの組は、
ＴＦＡＰ２Ｃ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）、
Ｓ１００Ａ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０， プライマー７９ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）、
ＰＧＲ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、
ＰＩＰ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３）、
ＦＡＴ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＲＮＤ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、
ＰＫＰ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、
ＰＲＡＭＥ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）、および
ＳＣＧＢ２Ａ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）
であり、
前記肺癌選択的遺伝子は、ＡＱＰ４、ＧＲＥＭ１、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＰＲＡＭＥ、ＳＦＲＰ２、ＦＡＴ１、ＴＭＰＲＳＳ４、ＦＯＸＦ１、ＡＲＧ２、およびＦＡＴ２を含み、前記肺癌選択的遺伝子に対応する前記プライマーの組は、
ＡＱＰ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２００， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９９）、
ＧＲＥＭ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５）、
ＴＦＡＰ２Ｃ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）、
ＰＲＡＭＥ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）、
ＳＦＲＰ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＴＭＰＲＳＳ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２）、
ＦＯＸＦ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、および
ＦＡＴ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
であり、
前記肝臓癌選択的遺伝子は、ＴＦ、ＲＢＰ４、ＧＰＣ３、ＡＦＰ、ＡＨＳＧ、ＡＬＢ、ＦＡＢＰ１、ＡＰＯＨ、ＦＧＢ、およびＦＧＧを含み、前記肝臓癌選択的遺伝子に対応する前記プライマーの組は、
ＴＦ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０）、
ＲＢＰ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７）、
ＧＰＣ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６）、
ＡＦＰ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）、
ＦＡＢＰ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５）、
ＡＨＳＧ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１）、
ＡＬＢ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）、
ＡＰＯＨ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２）、
ＦＧＢ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８）、および
ＦＧＧ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１）
であり、および
前記メラノーマ選択的遺伝子は、ＰＭＥＬ、ＭＬＡＮＡ、ＭＡＧＥＡ６、ＰＲＡＭＥ、ＴＦＡＰ２Ｃ、およびＳＯＸ１０を含み、前記メラノーマ選択的遺伝子に対応する前記プライマーの組は、
ＰＭＥＬ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）、
ＭＬＡＮＡ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、
ＭＡＧＥＡ６ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、
ＰＲＡＭＥ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）、
ＴＦＡＰ２Ｃ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）、および
ＳＯＸ１０ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）
である、方法。 A method of analyzing circulating tumor cells (CTCs) in a blood sample, comprising:
isolating CTC from the blood sample ;
isolating ribonucleic acid (RNA) molecules from said CTCs ;
generating a cDNA molecule from the isolated RNA in solution;
encapsulating cDNA molecules in individual droplets;
amplifying the cDNA molecules within each droplet in the presence of one or more reporter groups configured to specifically bind to CTC-derived cDNAs but not to cDNAs derived from other cells; ,
detecting the droplet containing the reporter group as an indication of the presence of a CTC-derived cDNA molecule in the droplet;
analyzing CTCs in the detected droplets;
amplifying the cDNA molecules within each droplet comprises performing PCR within each droplet;
using a set of primers to amplify said cDNA molecule within each droplet, each primer set corresponding to a selected oncogene;
said selected oncogenes comprise genes selective for one or more of prostate cancer, breast cancer, lung cancer, liver cancer and melanoma;
The prostate cancer selective genes include FAT1, TMPRSS2, AGR2, FOLH1, HO XB 13, KLK2, KLK3, and STEAP2, and the set of primers corresponding to the prostate cancer selective genes are:
FAT1 (Primer 1 SEQ ID NO: 23, Primer 2 SEQ ID NO: 22),
TMPRSS2 (Primer 1 SEQ ID NO: 134, Primer 2 SEQ ID NO: 133),
AGR2 (Primer 1 SEQ ID NO: 2, Primer 2 SEQ ID NO: 1),
FOLH1 (Primer 1 SEQ ID NO: 29, Primer 2 SEQ ID NO: 28),
HO XB 13 (Primer 1 SEQ ID NO: 32, Primer 2 SEQ ID NO: 31),
KLK2 (Primer 1 SEQ ID NO: 35, Primer 2 SEQ ID NO: 34),
KLK3 (Primer 1 SEQ ID NO: 38, Primer 2 SEQ ID NO: 37), and STEAP2 (Primer 1 SEQ ID NO: 125, Primer 2 SEQ ID NO: 124)
and
The breast cancer selective genes include TFAP2C, S100A2, PGR, PIP, FAT2, AGR2, FAT1, RND3, PKP3, PRAME, and SCGB2A1, and the set of primers corresponding to the breast cancer selective genes are
TFAP2C (Primer 1 SEQ ID NO: 131, Primer 2 SEQ ID NO: 130),
S100A2 (primer 1 SEQ ID NO: 80, primer 79 SEQ ID NO: 103),
PGR (Primer 1 SEQ ID NO: 62, Primer 2 SEQ ID NO: 61),
PIP (Primer 1 SEQ ID NO: 164, Primer 2 SEQ ID NO: 163),
FAT2 (primer 1 SEQ ID NO: 26, primer 2 SEQ ID NO: 25),
AGR2 (Primer 1 SEQ ID NO: 2, Primer 2 SEQ ID NO: 1),
FAT1 (Primer 1 SEQ ID NO: 23, Primer 2 SEQ ID NO: 22),
RND3 (Primer 1 SEQ ID NO: 77, Primer 2 SEQ ID NO: 76),
PKP3 (Primer 1 SEQ ID NO: 65, Primer 2 SEQ ID NO: 64),
PRAME (Primer 1 SEQ ID NO: 149, Primer 2 SEQ ID NO: 148), and
SCGB2A1 (Primer 1 SEQ ID NO: 83, Primer 2 SEQ ID NO: 82)
and
The lung cancer selective genes include AQP4, GREM1, TFAP2C, PRAME, SFRP2, FAT1, TMPRSS4, FOXF1, ARG2, and FAT2, and the set of primers corresponding to the lung cancer selective genes are
AQP4 (Primer 1 SEQ ID NO: 200, Primer 2 SEQ ID NO: 199),
GREM1 (primer 1 SEQ ID NO: 206, primer 2 SEQ ID NO: 205),
TFAP2C (Primer 1 SEQ ID NO: 131, Primer 2 SEQ ID NO: 130),
PRAME (Primer 1 SEQ ID NO: 149, Primer 2 SEQ ID NO: 148),
SFRP2 (Primer 1 SEQ ID NO: 194, Primer 2 SEQ ID NO: 193),
FAT1 (Primer 1 SEQ ID NO: 23, Primer 2 SEQ ID NO: 22),
TMPRSS4 (primer 1 SEQ ID NO: 203, primer 2 SEQ ID NO: 202),
FOXF1 (Primer 1 SEQ ID NO: 209, Primer 2 SEQ ID NO: 208),
AGR2 (Primer 1 SEQ ID NO: 2, Primer 2 SEQ ID NO: 1), and FAT2 (Primer 1 SEQ ID NO: 26, Primer 2 SEQ ID NO: 25)
and
The liver cancer selective genes include TF, RBP4, GPC3, AFP, AHSG, ALB, FABP1, APOH, FGB, and FGG, and the set of primers corresponding to the liver cancer selective genes are
TF (Primer 1 SEQ ID NO: 251, Primer 2 SEQ ID NO: 250),
RBP4 (Primer 1 SEQ ID NO: 248, Primer 2 SEQ ID NO: 247),
GPC3 (Primer 1 SEQ ID NO: 137, Primer 2 SEQ ID NO: 136),
AFP (Primer 1 SEQ ID NO: 122, Primer 2 SEQ ID NO: 121),
FABP1 (Primer 1 SEQ ID NO: 236, Primer 2 SEQ ID NO: 235),
AHSG (Primer 1 SEQ ID NO: 152, Primer 2 SEQ ID NO: 151),
ALB (Primer 1 SEQ ID NO: 140, Primer 2 SEQ ID NO: 139),
APOH (Primer 1 SEQ ID NO: 233, Primer 2 SEQ ID NO: 232),
FGB (Primer 1 SEQ ID NO: 239, Primer 2 SEQ ID NO: 238), and FGG (Primer 1 SEQ ID NO: 242, Primer 2 SEQ ID NO: 241)
and the melanoma-selective genes include PMEL, MLANA, MAGEA6, PRAME, TFAP2C, and SOX10, and the set of primers corresponding to the melanoma-selective genes are
PMEL (Primer 1 SEQ ID NO: 68, Primer 2 SEQ ID NO: 67),
MLANA (Primer 1 SEQ ID NO: 50, Primer 2 SEQ ID NO: 49),
MAGEA6 (primer 1 SEQ ID NO: 44, primer 2 SEQ ID NO: 43),
PRAME (Primer 1 SEQ ID NO: 149, Primer 2 SEQ ID NO: 148),
TFAP2C (Primer 1 SEQ ID NO: 131, Primer 2 SEQ ID NO: 130), and SOX10 (Primer 1 SEQ ID NO: 89, Primer 2 SEQ ID NO: 88)
is a method. 前記ｃＤＮＡ分子をカプセル化する前にｃＤＮＡ含有溶液から混入物を除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, further comprising removing contaminants from the cDNA-containing solution prior to encapsulating said cDNA molecule. 前記単離ＲＮＡからｃＤＮＡ分子を生成させることが、前記単離ＲＮＡ分子の逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことを含む、請求項１又は２に記載の方法。 3. The method of claim 1 or 2, wherein generating a cDNA molecule from said isolated RNA comprises performing reverse transcription (RT) polymerase chain reaction (PCR) of said isolated RNA molecule. 個々のｃＤＮＡ分子をカプセル化することがさらに、ｃＤＮＡ分子と共にＰＣＲ試薬を個々の液滴中にカプセル化することと、非水性液体の少なくとも１０００個の液滴を形成することとを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。 4. The claim wherein encapsulating individual cDNA molecules further comprises encapsulating PCR reagents in individual droplets with the cDNA molecules and forming at least 1000 droplets of the non-aqueous liquid. 4. The method according to any one of 1 to 3. 前記レポーター基が蛍光標識を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。 The method of any one of claims 1-4, wherein the reporter group comprises a fluorescent label. 前記ｃＤＮＡ含有溶液から混入物を除去することが、固相可逆固定法（ＳＰＲＩ）の使用を含む、請求項２に記載の方法。 3. The method of claim 2, wherein removing contaminants from said cDNA-containing solution comprises using solid phase reversible immobilization (SPRI). 前記ＳＰＲＩが、
前記溶液中のｃＤＮＡを、前記ｃＤＮＡに特異的に結合するように構成された磁気ビーズで固定することと、
前記溶液から混入物を除去することと、
精製ｃＤＮＡを溶出させることと
を含む、請求項６に記載の方法。 The SPRI is
immobilizing the cDNA in the solution with magnetic beads configured to specifically bind to the cDNA;
removing contaminants from the solution;
7. The method of claim 6, comprising eluting the purified cDNA. 前記非水性液体が、１つ以上のフッ化炭素、フッ化炭化水素、鉱油、シリコーンオイルおよび炭化水素油を含む、請求項４に記載の方法。 5. The method of claim 4, wherein the non-aqueous liquid comprises one or more of fluorocarbons, fluorohydrocarbons, mineral oils, silicone oils and hydrocarbon oils. 前記選択された癌選択的遺伝子が、前立腺癌選択的遺伝子を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。 The method of any one of claims 1-8, wherein the selected cancer selective gene comprises a prostate cancer selective gene. 前記選択された癌選択的遺伝子が、乳癌選択的遺伝子を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。 The method of any one of claims 1-8, wherein the selected cancer selective gene comprises a breast cancer selective gene. 前記選択された癌選択的遺伝子が、異なった２以上、３以上、４以上または５以上の型の癌に対して選択的な１以上の遺伝子を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。 11. Any one of claims 1-10, wherein said selected cancer selective gene comprises one or more genes selective for 2 or more, 3 or more, 4 or more or 5 or more different types of cancer. The method described in . 前記ＣＴＣが、転移癌または原発性／限局性の癌から生じるものである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。 The method of any one of claims 1-11, wherein said CTCs arise from metastatic cancer or primary/localized cancer. 前記ＣＴＣを検出液滴中において分析することが、既知の癌を有する患者から経時的に採取された血液試料からのＣＴＣをモニタリングすることと、前記ＣＴＣの試験、画像化、または試験および画像化の両方を行うこととを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。 analyzing said CTCs in detection droplets monitoring CTCs from blood samples taken over time from a patient with a known cancer; and testing, imaging, or testing and imaging said CTCs. A method according to any one of claims 1 to 12, comprising performing both 前記ＣＴＣを検出液滴中において分析することが、患者からの血液試料からの前記ＣＴＣの試験、画像化、または試験と画像化とを行うことを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。 13. Any one of claims 1-12, wherein analyzing the CTCs in detection droplets comprises testing, imaging, or testing and imaging the CTCs from a blood sample from a patient. The method described in section. 前記ＣＴＣを検出液滴中において分析することが、患者からの血液試料の単位体積当たりのＣＴＣの数または濃度を決定して、前記患者における腫瘍負荷の度合いを提供することを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。 2. Analyzing the CTCs in detection droplets comprises determining the number or concentration of CTCs per unit volume of a blood sample from a patient to provide a measure of tumor burden in the patient. 13. The method of any one of items 1 to 12. 前記患者における前記腫瘍負荷の度合いを用いて療法を選択することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。 16. The method of claim 15, further comprising using the degree of tumor burden in the patient to select therapy. 第２時点において前記患者における前記腫瘍負荷の度合いを決定して、経時的に、例えば治療介入に応じて、前記腫瘍負荷をモニタリングすることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。 17. The method of claim 16, further comprising determining the degree of tumor burden in the patient at a second time point and monitoring the tumor burden over time, eg, in response to therapeutic intervention.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4361609A3 (en) 2012-02-03 2024-07-17 California Institute of Technology Signal encoding and decoding in multiplexed biochemical assays
ES2954456T3 (en) 2015-03-25 2023-11-22 Massachusetts Gen Hospital Digital analysis of circulating tumor cells in blood samples
CN110050075B (en) * 2016-10-27 2024-04-02 通用医疗公司 Digital analysis of blood samples for determining efficacy of cancer therapies for specific cancers
US20180252722A1 (en) * 2017-03-05 2018-09-06 Yan Wang PCR-based Method for Counting Circulating Tumor Cells
US11597963B2 (en) * 2017-11-09 2023-03-07 Biomillenia Sas Microbial selection system
US20200399681A1 (en) * 2018-02-23 2020-12-24 Cornell University Assay for detection of androgen receptor variants
CN108535145A (en) * 2018-03-09 2018-09-14 深圳市瑞图生物技术有限公司 Quickly detect the method and device of granulophilocyte quantity in peripheral blood
CN110456034B (en) * 2018-05-07 2022-07-22 上海市第十人民医院 Detection method of circulating tumor cells
US20220033910A1 (en) * 2018-09-11 2022-02-03 The General Hospital Corporation Method for Detecting Liver Diseases
KR102380529B1 (en) * 2020-04-29 2022-03-31 인제대학교 산학협력단 Circulating tumor cell based biomarker composition for diagnosis and prognosis of metastatic prostate cancer
CN112662774A (en) * 2021-01-12 2021-04-16 南方医科大学南方医院 Liver cancer circulating tumor cell marker and application thereof
CN114395622A (en) * 2021-12-13 2022-04-26 深圳先进技术研究院 Method for detecting EGFR gene mutation of circulating tumor cells by using digital PCR and application thereof
DE102022211089A1 (en) * 2022-10-19 2024-04-25 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Combined cell-specific labeling and enrichment of biomarkers

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014532409A (en) 2011-10-24 2014-12-08 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション Cancer biomarkers

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8535A (en) 1851-11-18 Stove-geate
US889A (en) 1838-08-20 Mode of constructing metal bench-vises
DE29623597U1 (en) 1996-11-08 1999-01-07 Eppendorf - Netheler - Hinz Gmbh, 22339 Hamburg Temperature control block with temperature control devices
US20080050393A1 (en) 1998-12-03 2008-02-28 Tang Y Tom Novel nucleic acids and polypeptides
CA2311201A1 (en) * 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
CA2417866A1 (en) * 2000-08-03 2002-02-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
JP2004537261A (en) 2000-12-08 2004-12-16 イプソゲン Gene expression profiling of primary breast cancer using an array of candidate genes
BR0209646A (en) 2001-05-16 2006-10-10 Novartis Ag genes expressed in breast cancer as prognostic and therapeutic targets
US20030073623A1 (en) 2001-07-30 2003-04-17 Drmanac Radoje T. Novel nucleic acid sequences obtained from various cDNA libraries
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20060275794A1 (en) 2005-03-07 2006-12-07 Invitrogen Corporation Collections of matched biological reagents and methods for identifying matched reagents
US20070026417A1 (en) * 2005-07-29 2007-02-01 Martin Fuchs Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
US20090118175A1 (en) 2005-05-06 2009-05-07 Macina Roberto A Compositions and Methods for Detection, Prognosis and Treatment of Breast Cancer
WO2007136717A1 (en) * 2006-05-16 2007-11-29 Nugen Technologies, Inc. Nucleic acid separation and purification method based on reversible charge interactions
EP2589668A1 (en) * 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
WO2009051734A1 (en) 2007-10-17 2009-04-23 The General Hospital Corporation Microchip-based devices for capturing circulating tumor cells and methods of their use
US9068181B2 (en) 2008-05-23 2015-06-30 The General Hospital Corporation Microfluidic droplet encapsulation
US20120252015A1 (en) * 2011-02-18 2012-10-04 Bio-Rad Laboratories Methods and compositions for detecting genetic material
US9625454B2 (en) * 2009-09-04 2017-04-18 The Research Foundation For The State University Of New York Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices
US20110166030A1 (en) * 2009-09-30 2011-07-07 Yixin Wang Prediction of response to docetaxel therapy based on the presence of TMPRSSG2:ERG fusion in circulating tumor cells
EP3392349A1 (en) 2010-02-12 2018-10-24 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US20120329061A1 (en) * 2010-03-11 2012-12-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Quantitative rt-pcr detection for genes involved in epithelial mesenchymal transition in peripheral blood of cancer patients
BR112012024718A2 (en) 2010-03-31 2017-01-10 Sividon Diagnostics Gmbh method for predicting breast cancer recurrence under endocrine treatment
AU2015268617A1 (en) 2010-03-31 2016-01-07 Sividon Diagnostics Gmbh Method for breast cancer recurrence prediction under endocrine treatment
US9650629B2 (en) * 2010-07-07 2017-05-16 Roche Molecular Systems, Inc. Clonal pre-amplification in emulsion
WO2012024543A1 (en) 2010-08-18 2012-02-23 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings Circulating biomarkers for disease
US20140141986A1 (en) 2011-02-22 2014-05-22 David Spetzler Circulating biomarkers
WO2012135397A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Lisanti Michael P Lactate-and ketones-induced gene signatures and use the same for diagnosing disease and predicting clinical outcome
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
WO2014008155A1 (en) 2012-07-02 2014-01-09 The General Hospital Corporation Diagnosis and monitoring treatment of prostate cancer
EP2882872B1 (en) * 2012-08-13 2021-10-06 The Regents of The University of California Methods and systems for detecting biological components
US10113200B2 (en) 2012-09-14 2018-10-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Genes associated with dasatinib sensitivity
WO2014047285A1 (en) 2012-09-19 2014-03-27 Paraskevi Giannakakou Identifying taxane sensitivity in prostate cancer patients
WO2014075067A1 (en) 2012-11-12 2014-05-15 Nanostring Technologies, Inc. Methods to predict breast cancer outcome
US20140303005A1 (en) 2013-04-05 2014-10-09 Raindance Technologies, Inc. Rare cell analysis after negative selection
CN105636594A (en) 2013-08-12 2016-06-01 托凯药业股份有限公司 Biomarkers for treatment of neoplastic disorders using androgen-targeted therapies
US10202577B2 (en) 2013-10-18 2019-02-12 The General Hospital Corporation Microfluidic sorting using high gradient magnetic fields
BR112016020953A2 (en) 2014-03-13 2018-01-23 Hoffmann La Roche compound, kit, pharmaceutical composition, compound use, method of treatment and invention
RU2016148441A (en) 2014-05-21 2018-06-22 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг METHOD FOR TREATING A PR-POSITIVE LUMINARY A-TYPE OF BREAST CANCER WITH PI3K PIKTILISIB INHIBITOR
AU2015360260B2 (en) 2014-12-12 2021-10-28 Celcuity Inc. Methods of measuring ErbB signaling pathway activity to diagnose and treat cancer patients
ES2719206T3 (en) 2015-02-20 2019-07-09 Comelz Spa Procedure to cut natural skins
US20160304962A1 (en) 2015-03-12 2016-10-20 Janssen Pharmaceutica Nv WHOLE BLOOD BASED mRNA MARKERS FOR PREDICTING PROSTATE CANCER AND METHODS OF DETECTING THE SAME
ES2954456T3 (en) 2015-03-25 2023-11-22 Massachusetts Gen Hospital Digital analysis of circulating tumor cells in blood samples
CN110050075B (en) 2016-10-27 2024-04-02 通用医疗公司 Digital analysis of blood samples for determining efficacy of cancer therapies for specific cancers

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014532409A (en) 2011-10-24 2014-12-08 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション Cancer biomarkers

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cancer Res.，2005年，Vol. 65，pp. 4993-4997
Sci. Transl. Med.，2013年，Vol. 5, 179ra47
Trends Mol. Med.，2012年，Vol. 18，pp. 405-416

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