FR2664287A1 - New polypeptide exhibiting enzymatic activity, and gene encoding this polypeptide - Google Patents

Abstract

The invention relates to a polypeptide having enzymatic activity, containing: . the sequence of 255 amino acids of Figure 1, . or a variant of this sequence, this variant being such that it results from the addition, suppression or replacement of one or more amino acids, with the proviso that the variant is a metallopeptidase having the same specificity as the said sequence with respect to substrates and inhibitors.

Description

NOUVEAU POLYPEPTIDE PRESENTANT UNE ACTIVITE
ENZYMATIQUE, ET GENE CODANT POUR CE POLYPEPTIDE
L'invention a pour objet de nouveaux polypeptides ayant une activité enzymatique et les gènes codant pour ces polypeptides.NEW POLYPEPTIDE HAVING ACTIVITY
ENZYMATIC, AND GENE ENCODING THE POLYPEPTIDE
The subject of the invention is new polypeptides having enzymatic activity and the genes coding for these polypeptides.

L'enzyme enképhalinase (membrane métalloendopeptidase, EC 3.4.24.11 nom recommandé par la Commission des Enzymes) est responsable de l'inactivation de certains neuropeptides, tels que les enképhalines, et neurohormones, telles que le facteur natriurétique auriculaire (Schwartz, 1989, In : "Design of Enzym inhibitors as drugs", Ed. by M. Sandler and
H.J. Smith, Oxford University Press New York, p.The enzyme enkephalinase (metalloendopeptidase membrane, EC 3.4.24.11 name recommended by the Enzyme Commission) is responsible for the inactivation of certain neuropeptides, such as enkephalins, and neurohormones, such as atrial natriuretic factor (Schwartz, 1989, In : "Design of Enzym inhibitors as drugs", Ed. By M. Sandler and
HJ Smith, Oxford University Press New York, p.

206-220).206-220).

De ce fait, des inhibiteurs de cette enzyme ont reçu des applications thérapeutiques en gastroentérologie ou, encore, dans le domaine cardiovasculaire. As a result, inhibitors of this enzyme have received therapeutic applications in gastroenterology or, again, in the cardiovascular field.

Un ADNc de cette enzyme a été cloné et sa séquence, ainsi que partiellement celle de son gène, ont été établis (Malfroy et al., Biochem. Biophys. Res. A cDNA of this enzyme has been cloned and its sequence, as well as that of its gene, has been established (Malfroy et al., Biochem. Biophys. Res.

Commun., 1987, 144, 59; Devault et al., EMBO J., 1987, 6, 1317; Shipp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 1317).Commun., 1987, 144, 59; Devault et al., EMBO J., 1987, 6, 1317; Shipp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 1317).

La séquence de cette enzyme est constituée de 742 acides aminés. The sequence of this enzyme consists of 742 amino acids.

la protéine enzymatique elle-même ou une séquence de celle-ci, privée de son segment cytoplasmique mais conservant une activité enzymatique non modifiée (attribuable au fragment extracellulaire) ont été proposés comme agents thérapeutiques (demande de brevet européen n" 272928). the enzymatic protein itself or a sequence thereof, deprived of its cytoplasmic segment but retaining an unmodified enzymatic activity (attributable to the extracellular fragment) have been proposed as therapeutic agents (European patent application No. 272928).

L'enképhalinase qui fait notamment l'objet de la référence demande de brevet EP n" 272928 sera désignée dans la suite par "enképhalinase forme longue".  The enkephalinase which is the subject in particular of the reference patent application EP n “272928 will be designated hereinafter by“ enkephalinase long form ”.

Or, l'invention repose sur le fait inattendu que partant de la séquence de l'enképhalinase de rat et utilisant par exemple les méthodes de Reverse
Transcriptase - Polymerase Chain Reaction, il a été mis en évidence l'existence, insoupçonnée jusqu'alors, d'isoformes de cette enzyme.However, the invention is based on the unexpected fact that starting from the sequence of rat enkephalinase and using for example the methods of Reverse
Transcriptase - Polymerase Chain Reaction, it was highlighted the existence, hitherto unsuspected, of isoforms of this enzyme.

La présente invention a également pour objet - des vecteurs contenant les gènes codant pour des polypeptides ayant une activité enzymatique correspondant aux isoformes de I'enképhalinase mentionnés ci-dessus, - des cellules transformées pour exprimer les gènes susdits sur lesquelles il est possible d'évaluer l'activité enzymatique des susdits polypeptides, - des sondes nucléotidiques susceptibles de s'hybrider avec les gènes codant pour les susdits polypeptides, lesquelles sondes seraient susceptibles d'être utilisées pour le diagnostic in vitro d'affections mettant en jeu un épissage alternatif anormal, - des anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre les susdits polypeptides et utilisables dans un but analytique pour purifier lesdits polypeptides, dans un but de diagnostic in vitro, ou dans un but thérapeutique, - des médicaments contenant comme substance active des inhibiteurs puissants de l'activité enzymatique des susdits polypeptides, - un procédé d'identification de tissus où les susdits polypeptides sont exprimés de façon exclusive ou prédominante, pour la détermination ou la mise au point d'inhibiteurs de l'activité enzymatique des susdits polypeptides. The present invention also relates to - vectors containing the genes coding for polypeptides having an enzymatic activity corresponding to the isoforms of enkephalinase mentioned above, - cells transformed to express the aforementioned genes on which it is possible to evaluate the enzymatic activity of the above polypeptides, - nucleotide probes capable of hybridizing with the genes coding for the above polypeptides, which probes would be capable of being used for the in vitro diagnosis of conditions involving abnormal alternative splicing, - polyclonal and monoclonal antibodies directed against the above-mentioned polypeptides and usable for an analytical purpose to purify said polypeptides, for an in vitro diagnostic purpose, or for a therapeutic purpose, - drugs containing as active substance powerful activity inhibitors of the above polypeptides, - a method of identification of tissues where the above polypeptides are expressed exclusively or predominantly, for the determination or development of inhibitors of the enzymatic activity of the above polypeptides.

En particulier, le nouveau polypeptide de l'invention ayant une activité enzymatique - contient la séquence de 255 acides aminés de la
Figure 1, - ou contient des variants de cette séquence, qui résulte de l'addition, de la suppression ou du remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que le variant soit une métallopeptidase présentant la même spécificité que ladite séquence vis-à-vis de substrats et inhibiteurs.In particular, the new polypeptide of the invention having enzymatic activity - contains the sequence of 255 amino acids of the
Figure 1, - or contains variants of this sequence, which results from the addition, deletion or replacement of one or more amino acids, provided that the variant is a metallopeptidase having the same specificity as said sequence vis- against substrates and inhibitors.

Des variants avantageux de l'invention sont ceux qui hydrolysent des peptides naturels tels que la (Met)5 enképhaline ou des substrats modèles tels que le succinyl-Ala-Ala-Phe-amidométhylcoumarine et dont l'activité peptidasique est inhibée par le thiorphan à O,lmM sans être affecté par le thiorphan à 0,1ssM.  Advantageous variants of the invention are those which hydrolyze natural peptides such as (Met) enkephalin or model substrates such as succinyl-Ala-Ala-Phe-amidomethylcoumarin and whose peptidasic activity is inhibited by thiorphan to O, lmM without being affected by 0.1ssM thiorphan.

Un polypeptide avantageux de l'invention est constitué par celui défini par la séquence d'acides aminés de la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par l'acide aminé en position 1 à celle constituée par l'acide aminé en position 255. An advantageous polypeptide of the invention consists of that defined by the amino acid sequence of FIG. 1, extending from the end constituted by the amino acid in position 1 to that constituted by the amino acid in position 255.

Ce polypeptide contient une séquence consensus de 8 acides aminés (86-93) qui est la caractéristique des peptido-hydrolases utilisant comme co-facteur un atome de Zn++ (il contient un atome de zinc coordonné notamment par les restes histidine de cette séquence consensus). Ce polypeptide appartient donc à la classe des métallopeptidases (EC 3.4.). De plus, il possède un fragment d'acides aminés hydrophobes (22-44) permettant un ancrage dans les membranes plasmiques, ce qui indique qu'il s'agit vraisemblablement d'une enzyme membranaire. This polypeptide contains a consensus sequence of 8 amino acids (86-93) which is characteristic of peptido hydrolases using as a co-factor a Zn ++ atom (it contains a zinc atom coordinated in particular by the histidine residues of this consensus sequence) . This polypeptide therefore belongs to the class of metallopeptidases (EC 3.4.). In addition, it has a hydrophobic amino acid fragment (22-44) allowing anchoring in plasma membranes, which indicates that it is probably a membrane enzyme.

Ce polypeptide possède un poids moleculaire d'environ 30000. This polypeptide has a molecular weight of approximately 30,000.

Ce polypeptide est obtenu à partir d'un ARN messager transcrit à partir d'un gène déjà caractérisé comme étant celui de l'enképhalinase (EC 3.4.24.11) qui comporte 742 acides aminés. Mais, il s'agit là d'un ARN messager obtenu par un mécanisme d'epissage alternatif qui supprime les exons 5 à 18 du gène déjà caractérisé (nomenclature selon Shipp et al., 1988 pour l'enzyme humaine), ce qui correspond à la délétion de la séquence d'acides aminés dont l'extrémité est constituée par l'acide aminé en position 59 de l'enképhalinase forme longue à celle constituée par l'acide aminé en position 545 de I'enképhalinase forme longue. I1 s'agit donc d'un polypeptide nouveau et jusqu'alors inconnu. This polypeptide is obtained from a messenger RNA transcribed from a gene already characterized as that of the enkephalinase (EC 3.4.24.11) which contains 742 amino acids. However, this is a messenger RNA obtained by an alternative splicing mechanism which removes exons 5 to 18 from the already characterized gene (nomenclature according to Shipp et al., 1988 for the human enzyme), which corresponds to the deletion of the amino acid sequence the end of which is constituted by the amino acid in position 59 of the long-form enkephalinase to that of the amino acid in position 545 of the long-form enkephalinase. It is therefore a new and hitherto unknown polypeptide.

En d'autres termes, les séquences d'acides aminés respectives 1 à 58 et 59 à 255 des polypeptides de l'invention se retrouvent sur l'enképhalinase forme longue, mais sont contiguës dans les polypeptides de l'invention, alors qu'elles sont séparées dans l'enképhalinase forme longue. In other words, the respective amino acid sequences 1 to 58 and 59 to 255 of the polypeptides of the invention are found on the long-form enkephalinase, but are contiguous in the polypeptides of the invention, whereas they are separated into long form enkephalinase.

Ces polypeptides de l'invention seront dans la suite désignés par "enképhalinase forme courte" ou isoforme courte de ltenképhalinase.  These polypeptides of the invention will hereinafter be referred to as "short form enkephalinase" or short isoform of ltenkephalinase.

Selon un autre mode de caractérisation, le polypeptide de l'invention comprend dans son ossature peptidique l'enchaînement d'acides aminés codé par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 1 et s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 45, à celle constituée par le nucléotide en position 809. According to another characterization mode, the polypeptide of the invention comprises in its peptide framework the chain of amino acids coded by the nucleic acid sequence represented in FIG. 1 and extending from the end constituted by the nucleotide at position 45, to that constituted by the nucleotide at position 809.

L'invention concerne également des protéines chimères dans lesquelles le polypeptide tel que défini plus haut ou des fragments de celui-ci sont réunis à un enchaînement d'acides aminés hétérologue par rapport à ce polypeptide. The invention also relates to chimeric proteins in which the polypeptide as defined above or fragments thereof are joined to a sequence of amino acids heterologous with respect to this polypeptide.

Les polypeptides et protéines chimères de l'invention peuvent être glycosylés et peuvent comporter ou non des ponts disulfure. The polypeptides and chimeric proteins of the invention may be glycosylated and may or may not contain disulfide bridges.

Un procédé pour la production des polypeptides de l'invention comprend - la culture d'un hôte cellulaire compétent, auparavant transformé avec un acide nucléique contenant une séquence de nucléotides codant pour le susdit polypeptide immunogène et dans laquelle cette séquence de nucléotides se trouve placée sous le contrôle d'éléments de régulation, dont notamment un promoteur reconnu par les polymérases de cet hôte cellulaire compétent, les éléments d'initiation et de terminaison de la traduction, et - la récupération du polypeptide immunogène produit à partir des produits d'expression de cet hôte cellulaire. A process for the production of the polypeptides of the invention comprises - the culture of a competent cellular host, previously transformed with a nucleic acid containing a nucleotide sequence coding for the above-mentioned immunogenic polypeptide and in which this nucleotide sequence is placed under the control of regulatory elements, including in particular a promoter recognized by the polymerases of this competent cellular host, the elements of initiation and termination of translation, and - the recovery of the immunogenic polypeptide produced from the expression products of this cell host.

Un autre procédé de préparation des polypeptides de l'invention est caractérisé en ce que, partant de préférence de l'amine acide C-terminal, l'on condense successivement deux à deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs résidus aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyle de l'autre ou vice versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment apres activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes connues dans la synthèse des peptides et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé Nterminal. Another process for the preparation of the polypeptides of the invention is characterized in that, preferably starting from the C-terminal acid amine, the successive aminoacyls are successively condensed two by two in the required order, or aminoacyles and fragments previously formed and already containing several aminoacyl residues in the appropriate order, or several fragments previously thus prepared, it being understood that care has been taken beforehand to protect all the reactive functions carried by these aminoacyles or fragments to the exception of the amine functions of one and the carboxyl of the other or vice versa, which should normally intervene in the formation of peptide bonds, in particular after activation of the carboxyl function, according to the methods known in the synthesis of peptides and so on , step by step, up to the amino acid Nterminal.

Des variantes préférées du procédé du génie génétique qui vient d'être brièvement défini et dont l'originalité réside essentiellement dans la nature de la séquence de nucléotides, dont l'expression est recherchee peuvent être envisagées. Preferred variants of the process of genetic engineering which has just been briefly defined and whose originality lies essentially in the nature of the nucleotide sequence, the expression of which is sought after, can be envisaged.

Il permet la production des polypeptides de l'invention par voie recombinante. It allows the production of the polypeptides of the invention by the recombinant route.

L'invention concerne également les acides nucléiques (acides désoxyribonucléiques ou acides ribonucléiques), susceptibles de s'hybrider avec la séquence complémentaire de l'un des acides nucléiques codant pour l'un quelconque des polypeptides précédemment définis, dans les conditions d'hybridation décrites par Maniatis et al., "Molecular cloning", Cold
Spring Harbor Laboratory (1982).The invention also relates to nucleic acids (deoxyribonucleic acids or ribonucleic acids), capable of hybridizing with the complementary sequence of one of the nucleic acids encoding any of the previously defined polypeptides, under the hybridization conditions described. by Maniatis et al., "Molecular cloning", Cold
Spring Harbor Laboratory (1982).

L'invention concerne également des acides nucléiques qui comprennent ou qui sont constitués par un enchaînement de nucléotides codant pour l'un quelconque des polypeptides précédemment définis. The invention also relates to nucleic acids which comprise or consist of a sequence of nucleotides encoding any of the previously defined polypeptides.

L'invention concerne en particulier les acides nucléiques contenant la séquence représentée sur la
Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 45 à celle constituée par le nucléotide en position 809.The invention relates in particular to nucleic acids containing the sequence shown in the
Figure 1, extending from the end formed by the nucleotide in position 45 to that formed by the nucleotide in position 809.

L'invention concerne également les acides nucléiques contenant la séquence definie par l'enchaînement représente sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1 à celle constituée par le nucléotide en position 822. The invention also relates to the nucleic acids containing the sequence defined by the sequence represented in FIG. 1, extending from the end constituted by the nucleotide in position 1 to that constituted by the nucleotide in position 822.

Des acides nucléiques avantageux de l'invention sont constitues par - l'enchaînement représente sur la Figure 1 s'étendant de l'extrémité constituee par le nucléotide en position 1 à celle constituée par le nucléotide en position 822, - l'enchaînement représente sur la Figure 1 s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 45 à celle constituée par le nucléotide en position 809. Advantageous nucleic acids of the invention are constituted by - the sequence represented in FIG. 1 extending from the end constituted by the nucleotide in position 1 to that constituted by the nucleotide in position 822, - the sequence represented in Figure 1 extending from the end formed by the nucleotide in position 45 to that formed by the nucleotide in position 809.

Font egalement partie de l'invention les acides nucléiques variants par rapport à ceux sus-définis et qui comportent certaines mutations localisées dans la mesure ou ces acides nucléiques variants s'hybrident avec les acides nucléiques précédemment définis ou avec les sondes nucléiques définies ci-après dans les conditions d'hybridation définies ci-après dans la description.  Also forming part of the invention are the nucleic acids which vary from those defined above and which contain certain localized mutations insofar as these variant nucleic acids hybridize with the nucleic acids previously defined or with the nucleic probes defined below. under the hybridization conditions defined below in the description.

Font également partie de l'invention les acides nucléiques complémentaires des acides nucléiques précédemment définis. The nucleic acids complementary to the nucleic acids previously defined also form part of the invention.

Les acides nucléiques de l'invention peuvent être prépares soit par un procedé chimique, soit par d'autres procédés. The nucleic acids of the invention can be prepared either by a chemical process or by other processes.

Un mode de préparation approprie des acides nucléiques (comportant au maximum 200 nucléotides - ou pb, lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicatenaires) de l'invention par voie chimique comprend les étapes suivantes - la synthèse d'ADN en utilisant la méthode automatisee de p-cyanéthyl phosphoramidite décrite dans Bioorganic
Chemistry 4; 274-325, 1986, - le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur plasmidien approprié et la récupération des ADN par hybridation avec une sonde appropriée.An appropriate mode of preparation of the nucleic acids (comprising a maximum of 200 nucleotides - or bp, in the case of double-stranded nucleic acids) of the invention by chemical route comprises the following stages - the synthesis of DNA using the automated p-cyanethyl phosphoramidite method described in Bioorganic
Chemistry 4; 274-325, 1986, - the cloning of the DNAs thus obtained in an appropriate plasmid vector and the recovery of the DNAs by hybridization with an appropriate probe.

Un mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques de longueur superieure à 200 nucléotides - ou pb (lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes: - l'assemblage d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leurs extrémités de sites de restriction différents, dont les séquences sont compatibles avec l'enchainement en acides amines du polypeptide naturel selon le principe décrit dans Proc. A method of preparation, by chemical route, of nucleic acids of length greater than 200 nucleotides - or bp (in the case of double-stranded nucleic acids) comprises the following stages: - the assembly of chemically synthesized oligonucleotides, provided at their ends with different restriction sites, the sequences of which are compatible with the amino acid chain of the natural polypeptide according to the principle described in Proc.

Nat. Acad. Sci. USA 80; 7461-7465, 1983, - le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur plasmidien approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché par hybridation avec une sonde appropriée.Nat. Acad. Sci. USA 80; 7461-7465, 1983, - the cloning of the DNAs thus obtained in an appropriate plasmid vector and the recovery of the desired nucleic acid by hybridization with an appropriate probe.

Un autre procédé de preparation des acides nucléiques de l'invention à partir d'ARNm comprend les étapes suivantes - préparation d'ARN cellulaire à partir de tout tissu exprimant l'isoforme courte de l'enképhalinase selon les techniques decrites par Maniatis et al., "Molecular cloning", Cold Spring Harbor Laboratory (1982), et
Ausubel F.M. et al.Current Protocols in Molecular
Biology, chapitre 4, Green Publishing Associates et
Wiley-Interscience, New York (1989), - récupération et purification des ARNm par passage des
ARN cellulaires totaux par chromatographie avec un oligodT immobilisé, - synthèse d'un brin d'ADNc à partir des ARNm purifiés d'après la technique décrite dans Gene 25:263, 1983, - clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur plasmidien approprie et récupération de la séquence nucléotidique recherchée en utilisant une sonde d'hybridation appropriee. Another method for preparing the nucleic acids of the invention from mRNA comprises the following stages - preparation of cellular RNA from any tissue expressing the short isoform of enkephalinase according to the techniques described by Maniatis et al. , "Molecular cloning", Cold Spring Harbor Laboratory (1982), and
Ausubel FM et al. Current Protocols in Molecular
Biology, Chapter 4, Green Publishing Associates and
Wiley-Interscience, New York (1989), - recovery and purification of mRNA by passage of
Total cellular RNA by chromatography with an immobilized oligodT, - synthesis of a strand of cDNA from mRNAs purified according to the technique described in Gene 25: 263, 1983, - cloning of the nucleic acids thus obtained into an appropriate plasmid vector and recovering the desired nucleotide sequence using an appropriate hybridization probe.

Pour preparer les acides nucléiques de l'invention, les sondes d'hybridation oligonucléotidiques synthétisées chimiquement sont celles qui sont constituées de deux enchaînements l'un à la suite de l'autre, non séparés par d'autres acides aminés, c'est-à-dire - un premier enchaînement contenu dans la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 204 à celle constituée par le nucléotide en position 219, - et un deuxième enchaînement contenu dans la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 220 à celle constituée par le nucleotide en position 230. To prepare the nucleic acids of the invention, the chemically synthesized oligonucleotide hybridization probes are those which consist of two sequences one after the other, not separated by other amino acids, that is to say i.e. - a first sequence contained in the nucleic acid sequence represented in FIG. 1, extending from the end constituted by the nucleotide in position 204 to that formed by the nucleotide in position 219, - and a second sequence contained in the amino acid sequence shown in Figure 1, extending from the end formed by the nucleotide at position 220 to that formed by the nucleotide at position 230.

Ce sont des séquences qui ont eté dérivées de celles de la Figure 1 et elles peuvent être utilisées dans les conditions d'hybridation décrites par Maniatis et al. (1982) dejà cité. These are sequences which have been derived from those of FIG. 1 and they can be used under the hybridization conditions described by Maniatis et al. (1982) already cited.

La synthèse du brin d'ADNc et son amplification subséquente in vitro peut également être effectuée en utilisant la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction), comme décrit par exemple par Goblet et al. Nucleic Acid
Research, 17, 2144, 1989 "One step amplification of transcripts in total RNA using Polymerase Chain
Reaction", en utilisant deux amplimères chimiquement synthétisés definis à partir de la séquence de la
Figure 1.Des amplimères appropriés sont par exemple - celui défini sur la Figure 1, du nucléotide en position 1 au nucléotide en position 33 (amorce 2), et celui défini sur la Figure 1, du nucléotide en position 799 au nucléotide en position 822 (amorce 1), - celui défini sur la Figure 1, du nucléotide en position 299 au nucléotide en position 322 et l'amorce 2 ci-dessus definie, - celui défini sur la Figure 1, du nucléotide en position 204 au nucléotide en position 230 et l'amorce 1 ci-dessus définie.The synthesis of the cDNA strand and its subsequent amplification in vitro can also be carried out using the PCR (Polymerase Chain Reaction) method, as described for example by Goblet et al. Nucleic Acid
Research, 17, 2144, 1989 "One step amplification of transcripts in total RNA using Polymerase Chain
Reaction ", using two chemically synthesized amplimers defined from the sequence of
Figure 1: Suitable amplimers are for example - that defined in Figure 1, from the nucleotide in position 1 to the nucleotide in position 33 (primer 2), and that defined in Figure 1, from the nucleotide in position 799 to the nucleotide in position 822 (primer 1), - that defined in Figure 1, from the nucleotide in position 299 to the nucleotide in position 322 and primer 2 above defined, - that defined in Figure 1, from the nucleotide in position 204 to the nucleotide in position 230 and the primer 1 defined above.

Le fragment d'acides nucléiques amplifié peut être ensuite cloné selon les techniques décrites dans
Ausubel F.M. et al. (1989) déjà cité.The amplified nucleic acid fragment can then be cloned according to the techniques described in
Ausubel FM et al. (1989) already cited.

L'invention concerne également les vecteurs recombinants, en particulier pour le clonage et/ou l'expression, notamment du type plasmide, cosmide, phage, ou virus, contenant un acide nucléique de l'invention en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication. The invention also relates to the recombinant vectors, in particular for cloning and / or expression, in particular of the plasmid, cosmid, phage, or virus type, containing a nucleic acid of the invention in one of its nonessential sites. for its replication.

Un vecteur approprié de l'invention, contient en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'un polypeptide selon l'invention, dans un hôte cellulaire et éventuellement un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible et éventuellement une séquence signal et une séquence d'ancrage. A suitable vector of the invention contains, at one of its sites which are not essential for its replication, the elements necessary to promote the expression of a polypeptide according to the invention, in a cellular host and possibly a promoter recognized by the polymerases of the cell host, in particular an inducible promoter and optionally a signal sequence and an anchoring sequence.

L'invention concerne également un hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant défini précédemment comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence nucléotidique codant pour l'un des polypeptides selon l'invention dans cet hôte. The invention also relates to a cellular host transformed by a recombinant vector defined above comprising the regulatory elements allowing the expression of the nucleotide sequence coding for one of the polypeptides according to the invention in this host.

Par hôte cellulaire on entend tout organisme susceptible d'être maintenu en culture. By cellular host is meant any organism capable of being maintained in culture.

L'un des microorganismes utilisés peut être constitué par une bactérie, notamment E. coli. One of the microorganisms used can consist of a bacterium, in particular E. coli.

Un organisme de choix est constitué par la cellule
CHO.A body of choice is formed by the cell
CHO.

Mais d'autres organismes peuvent être utilisés tout aussi aisément, naturellement sous réserve que l'on dispose pour chacun d'entre eux des vecteurs, notamment plasmidiques ou viraux, susceptibles de s'y répliquer et des séquences de nucléotides insérables dans ces vecteurs et capables, lorsqu'elles sont suivies dans ces vecteurs par un insérat codant pour un polypeptide de l'invention, d'assurer l'expression de cet insérat dans les organismes choisis et leur transport dans les membranes de ces hôtes cellulaires. However, other organisms can be used just as easily, naturally provided that each of them has vectors, in particular plasmid or viral, capable of replicating therein and nucleotide sequences insertable into these vectors and capable, when followed in these vectors by an insert coding for a polypeptide of the invention, to ensure the expression of this insert in the chosen organisms and their transport in the membranes of these cellular hosts.

L'invention concerne également les anticorps, notamment monoclonaux, dirigés de façon spécifique contre l'un des polypeptides de l'invention, et qui ne reconnaissent pas l'enképhalinase décrite dans la demande de brevet EP n" 272928. En particulier, ces anticorps reconnaissent la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1, s'étendant de l'acide aminé en position 54 à l'acide amine en position 64. The invention also relates to the antibodies, in particular monoclonal antibodies, directed specifically against one of the polypeptides of the invention, and which do not recognize the enkephalinase described in patent application EP No. 272928. In particular, these antibodies recognize the amino acid sequence shown in Figure 1, extending from the amino acid at position 54 to the amino acid at position 64.

Pour obtenir les anticorps, on peut injecter chez l'animal l'un des susdits polypeptides. To obtain the antibodies, one of the above-mentioned polypeptides can be injected into animals.

On prépare des anticorps monoclonaux par fusion cellulaire entre des cellules de myélome et des cellules spléniques de souris immunisées, selon les procédés classiques. Monoclonal antibodies are prepared by cell fusion between myeloma cells and spleen cells of immunized mice, according to conventional methods.

Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés pour purifier l'isoforme courte de l'enkêphalinase à partir de tissus ou de cellules où elle est exprimee ou bien encore dans un but diagnostic.  The antibodies of the invention can be used to purify the short isoform of enkephalinase from tissues or cells where it is expressed or even for diagnostic purposes.

L'invention concerne également les sondes nucléotidiques synthétiques ou non, s'hybridant avec l'un des acides nucléiques définis ci-dessus ou leurs séquences complémentaires ou leur ARN correspondant, et qui ne s'hybride pas avec les gènes ou 1tARN messager codant pour l'enkephalinase decrite dans la demande de brevet EP n" 272928. The invention also relates to the nucleotide probes, synthetic or not, hybridizing with one of the nucleic acids defined above or their complementary sequences or their corresponding RNA, and which does not hybridize with the genes or 1tRNA messenger encoding the enkephalinase described in patent application EP No. 272928.

Les sondes de l'invention comportent au minimum 10, avantageusement 15 acides nucléiques et peuvent comporter au maximum la totalité de la séquence nucléotidique représentée sur la Figure 1. The probes of the invention comprise at least 10, advantageously 15 nucleic acids and can comprise at most the entire nucleotide sequence shown in FIG. 1.

Pour les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 100 nucléotides, des conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes: 900mM de NaCl, 90mM de tri-sodium citrate pH 7,0, 100pg/ml d'ADN de sperme de saumon, 0,05% de pyrophosphate de sodium, 10 à 25% de formamide déionisee, 0,02% de Ficoll (Pm de 400.000), 0,02% d'albumine de serum bovine, 0,02% de polyvinylpyrrolidone, pendant 14 à 16 heures à 42 C.  For the shortest probes, that is to say about 10 to about 100 nucleotides, suitable hybridization conditions are as follows: 900 mM NaCl, 90 mM tri-sodium citrate pH 7.0, 100pg / ml of salmon sperm DNA, 0.05% sodium pyrophosphate, 10 to 25% deionized formamide, 0.02% Ficoll (Pm 400,000), 0.02% bovine serum albumin, 0 , 02% polyvinylpyrrolidone, for 14 to 16 hours at 42 C.

Pour les sondes les plus longues, c'est-à-dire présentant plus d'environ 100 nucléotides, des conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes: 600mM de NaC1, 60mM de tri-sodium citrate, 20pg/ml d'ADN de sperme de saumon, 20ssg/ml d'ARNt de levure, 8mM de Tris-HCl pH 7,4, 40 à 60% de formamide deionisée, 0,02% de Ficoll, 0,02% d'albumine de sérum bovine, 0,02% de polyvinylpyrrolidone, 0,2% de sodium dodécyl sulfate, 10% de sulfate de dextrane. For the longest probes, that is to say having more than about 100 nucleotides, suitable hybridization conditions are as follows: 600 mM NaCl, 60 mM tri-sodium citrate, 20 μg / ml of DNA salmon sperm, 20ssg / ml yeast tRNA, 8mM Tris-HCl pH 7.4, 40 to 60% deionized formamide, 0.02% Ficoll, 0.02% bovine serum albumin, 0 , 02% polyvinylpyrrolidone, 0.2% sodium dodecyl sulfate, 10% dextran sulfate.

L'invention concerne en particulier les sondes constituées de deux enchaînements l'un à la suite de l'autre, non séparés par d'autres acides nucléiques, c'est-à-dire - un premier enchaînement contenu dans la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 1, s'etendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 204 à celle constituée par le nucléotide en position 219, - et un deuxième enchaînement contenu dans la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 220 à celle constituée par le nucléotide en position 230. The invention relates in particular to probes consisting of two sequences one after the other, not separated by other nucleic acids, that is to say - a first sequence contained in the acid sequence nucleic acids represented in FIG. 1, extending from the end constituted by the nucleotide in position 204 to that constituted by the nucleotide in position 219, - and a second sequence contained in the amino acid sequence represented in FIG. 1, extending from the end formed by the nucleotide in position 220 to that formed by the nucleotide in position 230.

L'invention concerne en particulier la sonde nucléotidique suivante
GAC TGC ATA AAA TCA GTC TTC CCC GCC
Les sondes de l'invention peuvent être utilisées comme outils de diagnostic in vitro d'affections mettant en jeu un épissage alternatif anormal.The invention relates in particular to the following nucleotide probe
GAC TGC ATA AAA TCA GTC TTC CCC GCC
The probes of the invention can be used as tools for in vitro diagnosis of conditions involving abnormal alternative splicing.

L'invention concerne également un procédé de diagnostic in vitro d'affections mettant en jeu un épissage alternatif anormal, dans lequel on utilise l'une ou plusieurs quelconques des sondes définies selon l'invention, comprenant les étapes suivantes - l'amplification préalable possible des quantités de séquence nucléotidique selon l'invention susceptible d'être contenue dans un échantillon biologique prélevé sur un patient, au moyen d'amorces d'ADN, - la mise en contact de l'échantillon biologique indique ci-dessus avec une sonde nucléotidique constituée de deux enchaînements dans le prolongement l'un de l'autre, c'est-à-dire - un premier enchaînement contenu dans la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 204 à celle constituée par le nucléotide en position 219, - et un deuxième enchaînement contenu dans la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 220 à celle constituée par le nucléotide en position 230, et en particulier la sonde nucléotidique suivante
GAC TGC ATA AAA TCA GTC TTC CCC GCC ou leur séquence nucléotidique complementaire, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation forme de ladite sonde et ladite séquence nucléotidique, - la détection du complexe d'hybridation ci-dessus qui a pu se former.The invention also relates to a method for in vitro diagnosis of disorders involving abnormal alternative splicing, in which one or more of any of the probes defined according to the invention is used, comprising the following steps - possible prior amplification quantities of nucleotide sequence according to the invention capable of being contained in a biological sample taken from a patient, by means of DNA primers, - the contacting of the biological sample indicated above with a nucleotide probe consisting of two sequences in the extension of one another, that is to say - a first sequence contained in the nucleic acid sequence shown in Figure 1, extending from the end formed by the nucleotide at position 204 to that constituted by the nucleotide at position 219, - and a second sequence contained in the amino acid sequence shown in Figure 1, s' tending from the extremity constituted by the nucleotide at position 220 to that constituted by the nucleotide at position 230, and in particular the following nucleotide probe
GAC TGC ATA AAA TCA GTC TTC CCC GCC or their complementary nucleotide sequence, under conditions allowing the production of a hybridization complex in the form of said probe and said nucleotide sequence, - the detection of the above hybridization complex which has could train.

L'invention concerne également un procédé d'identification de tissus où les susdits polypeptides sont exprimés de façon exclusive ou prédominante, pour l'identification ou la mise au point d'inhibiteurs de l'activité enzymatique des susdits polypeptides. The invention also relates to a method for identifying tissues in which the above polypeptides are expressed exclusively or predominantly, for the identification or development of inhibitors of the enzymatic activity of the above polypeptides.

Par "inhibiteur de l'activité enzymatique d'un polypeptide de l'invention", on désigne un compose chimique comprenant notamment un groupe chélateur du zinc, et susceptible en concentration modérée d'inhiber l'activité peptidasique desdits polypeptides principalement celui désigné par enképhalinase forme courte. By "inhibitor of the enzymatic activity of a polypeptide of the invention", is meant a chemical compound comprising in particular a chelating group of zinc, and capable in moderate concentration of inhibiting the peptidasic activity of said polypeptides mainly that designated by enkephalinase short form.

L'expression "exprimé de façon prédominante" signifie que l'enképhalinase est exprimée à la fois sous la forme longue et à la fois sous la forme courte, l'activité de 1 ltenképhalinase "forme courte" de l'invention représentant au moins environ 50% par rapport à l'activité de l'enképhalinase totale exprimée. The expression "predominantly expressed" means that the enkephalinase is expressed both in the long form and in both the short form, the activity of the ltenkephalinase "short form" of the invention representing at least approximately 50% relative to the activity of total enkephalinase expressed.

Ce procédé d'identification de tissus tels que ceux du lobe intermédiaire de l'hypophyse, où le polypeptide de l'invention est exprimé de façon exclusive ou prépondérante, pour la mise au point d'inhibiteurs de l'activité enzymatique des polypeptides de l'invention peut impliquer l'utilisation d'une ou plusieurs sondes selon l'invention, et il comprend alors les étapes suivantes:: - l'amplification préalable possible des quantités de séquence nucléotidique selon l'invention susceptible d'être contenue dans un échantillon biologique au moyen d'amorces d'ADN, - la mise en contact de l'échantillon biologique indiqué ci-dessus avec une sonde nucleotidique constituée de deux enchaînements dans le prolongement l'un de l'autre, c'est-à-dire - un premier enchaînement contenu dans la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucleotide en position 204 à celle constituée par le nucléotide en position 219, - et un deuxième enchaînement contenu dans la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 220 à celle constituée par le nucléotide en position 230, et en particulier la sonde nucléotidique suivante
GAC TGC ATA AAA TCA GTC TTC CCC GCC ou leur séquence nucléotidique complémentaire, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation forme de ladite sonde et ladite séquence nucléotidique, - la detection du complexe d'hybridation ci-dessus qui a pu se former.This method of identifying tissues such as those of the intermediate pituitary lobe, where the polypeptide of the invention is expressed exclusively or predominantly, for the development of inhibitors of the enzymatic activity of the polypeptides of l invention may involve the use of one or more probes according to the invention, and it then comprises the following steps: - the possible prior amplification of the quantities of nucleotide sequence according to the invention capable of being contained in a sample biological by means of DNA primers, - bringing the biological sample indicated above into contact with a nucleotide probe consisting of two sequences in the extension of one another, that is to say a first sequence contained in the nucleic acid sequence represented in FIG. 1, extending from the end constituted by the nucleotide in position 204 to that constituted by the nucleotide in position 219 , - and a second sequence contained in the amino acid sequence represented in FIG. 1, extending from the end constituted by the nucleotide in position 220 to that constituted by the nucleotide in position 230, and in particular the nucleotide probe next
GAC TGC ATA AAA TCA GTC TTC CCC GCC or their complementary nucleotide sequence, under conditions allowing the production of a hybridization complex in the form of said probe and said nucleotide sequence, - the detection of the hybridization complex above which has could train.

Ce procédé d'identification de tissus tels que le lobe intermédiaire de l'hypophyse, où le polypeptide de l'invention est exprimé de façon exclusive ou prépondérante, pour la mise au point d'inhibiteurs de l'activité enzymatique des polypeptides de l'invention peut également impliquer l'utilisation d'un ou plusieurs anticorps selon l'invention, et il comprend alors les étapes suivantes - la mise en contact d'un anticorps selon l'invention avec un prelèvement biologique dans des conditions permettant la production éventuelle d'un complexe immunologique formé entre le polypeptide de l'invention ou produit qui en a dérivé et l'anticorps de l'invention, - la détection du susdit complexe immunologique formé. This method of identifying tissues such as the intermediate pituitary lobe, where the polypeptide of the invention is expressed exclusively or predominantly, for the development of inhibitors of the enzymatic activity of the polypeptides of the invention can also involve the use of one or more antibodies according to the invention, and it then comprises the following stages - bringing an antibody according to the invention into contact with a biological sample under conditions allowing the possible production of an immunological complex formed between the polypeptide of the invention or product which is derived therefrom and the antibody of the invention, - the detection of the above-mentioned immunological complex formed.

L'invention a également pour objet des médicaments contenant à titre de substance active des inhibiteurs des susdits polypeptides. A subject of the invention is also medicaments containing, as active substance, inhibitors of the above-mentioned polypeptides.

L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples suivants, qui n'ont qu'un caractère illustratif et nullement limitatif de l'invention. The invention will be better understood on reading the following examples, which are only illustrative and in no way limit the invention.

EXEMPLE 1 : Séquençage d'un polypeptide de 255 acides aminés (enkephalinase forme courte)
On peut mettre en evidence 1'ARN messager du polypeptide de 255 acides aminés représenté sur la
Figure 1 en synthétisant un ADNc simple brin à partir d'une amorce spécifique et d'ARN messagers tissulaires, et en amplifiant par PCR le fragment ainsi obtenu entre deux amorces définies, par exemple : on synthétise deux amorces dérivées de la séquence de l'enképhalinase (neutral endopeptidase 3.4.24.11) situees aux extrémités 5' et 3' du gène (synthétiseur d'ADN PCRmate 391 A, Applied Biosystems) : position 1-33 (Figure 1), 5'-G CTG AGG CGA GGG ATT TTA CGT GAT, amorce 2 et position 799-822 (Figure 1) 5'-CCT GTG AAG ATC ACC AAA
CCC GAC, amorce 1 utilisées à la concentration de 384nM.EXAMPLE 1 Sequencing of a 255 amino acid polypeptide (short form enkephalinase)
We can highlight the messenger RNA of the 255 amino acid polypeptide represented on the
Figure 1 by synthesizing a single-stranded cDNA from a specific primer and tissue messenger RNA, and by amplifying by PCR the fragment thus obtained between two defined primers, for example: two primers derived from the sequence of the enkephalinase (neutral endopeptidase 3.4.24.11) located at the 5 'and 3' ends of the gene (DNA synthesizer PCRmate 391 A, Applied Biosystems): position 1-33 (Figure 1), 5'-G CTG AGG CGA GGG ATT TTA CGT GAT, primer 2 and position 799-822 (Figure 1) 5'-CCT GTG AAG ATC ACC AAA
CCC GAC, primer 1 used at the concentration of 384nM.

On synthétise un ADNc monobrin en utilisant de la réverse transcriptase AMV (20U, Boerhinger) et de 1'ARN total (5pu) d'intestin de rat en presence de l'amorce 1 à 384nM. Cette matrice est ensuite amplifiée en utilisant les amorces 1 et 2 à 75nM pendant 35 cycles (92"C, 54"C, 72"C pendant lmn, lmn et 4mn respectivement) avec 2.5U d'ADN Polymerase Taq (Perkin
Elmer Cetus).Single strand cDNA is synthesized using reverse transcriptase AMV (20U, Boerhinger) and total RNA (5pu) from rat intestine in the presence of primer 1 at 384nM. This matrix is then amplified using primers 1 and 2 at 75nM for 35 cycles (92 "C, 54" C, 72 "C for lmn, lmn and 4mn respectively) with 2.5U of DNA Polymerase Taq (Perkin
Elmer Cetus).

Après résolution des produits qui ont été obtenus par la technique PCR par électrophorèse sur gel d'agarose, transfert et hybridation avec la sonde enkephalinase de rat dirigée contre la partie allant du site à zinc (300) jusqu'à l'extrémité 3' de la partie codante (822), une bande réactive est excisée à 800b, et on extrait 1'ADN. Cet ADN est amplifié à nouveau par technique PCR avec une amorce située au niveau du site à zinc (position 299-322, Figure 1) 5'-G GTC ATC GGA
CAT GAA ATC ACA CA) et l'amorce 2. Une bande de 300 bases est détectée après coloration au bromure d'éthidium, découpée, 1'ADN est extrait. On obtient un
ADN à bouts francs après action de l'ADN polymérase de
E. coli en présence de nucléotides et dotions Mg++.Puis cet ADN est phosphorylé par la T4 Poly nucléotide kinase, puis introduit dans le plasmide pGEM 4Z (Promega) afin d'être séquence (Sanger et al., Proc.After resolution of the products which have been obtained by the PCR technique by agarose gel electrophoresis, transfer and hybridization with the rat enkephalinase probe directed against the part going from the zinc site (300) to the 3 'end of the coding part (822), a reactive band is excised at 800b, and the DNA is extracted. This DNA is again amplified by PCR technique with a primer located at the zinc site (position 299-322, Figure 1) 5'-G GTC ATC GGA
CAT GAA ATC ACA CA) and primer 2. A band of 300 bases is detected after staining with ethidium bromide, cut out, the DNA is extracted. We get a
Blunt-ended DNA after action of DNA polymerase
E. coli in the presence of nucleotides and Mg ++ endowments. Then this DNA is phosphorylated by T4 Poly nucleotide kinase, then introduced into the plasmid pGEM 4Z (Promega) in order to be sequenced (Sanger et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463).Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463).

La séquence obtenue révèle notamment l'existence de deux enchaînements d'acides nucléiques correspondant respectivement à l'exon 4 et à l'exon 19 de l'enképhalinase forme longue, ces deux enchaînements d'acides nucléiques étant raccordés directement entre eux dans la séquence ci-dessus obtenue, c'est-à-dire étant l'un côte à côte de l'autre, sans qu'il y ait d'autres acides nucléiques les séparant. Une amorce 4 (position 204-230, Figure 1) 5'-GA CTG CAT AAA ATC AGT
CTT CCC CGCC) correspondant à ce raccordement, c'està-dire constituée d'une partie de l'enchaînement de nucléotides appartenant à l'exon 4 et d'une partie de l'enchaînement de nucléotides appartenant à l'exon 19, est synthétisée. Les amorces 1 et 4 (correspondant à la partie 3' et contenant le codon stop TGA) sont ensuite utilisées dans la technique RT-PCR comme décrit cidessus, utilisant 1'ARN total d'intestin comme source d'ARN.The sequence obtained reveals in particular the existence of two sequences of nucleic acids corresponding respectively to exon 4 and to exon 19 of the long-form enkephalinase, these two sequences of nucleic acids being directly connected to each other in the sequence above obtained, that is to say being one side by side of the other, without there being other nucleic acids separating them. A primer 4 (position 204-230, Figure 1) 5'-GA CTG CAT AAA ATC AGT
CTT CCC CGCC) corresponding to this connection, i.e. made up of part of the nucleotide sequence belonging to exon 4 and part of the nucleotide chain belonging to exon 19, is synthesized. Primers 1 and 4 (corresponding to the 3 'part and containing the stop codon TGA) are then used in the RT-PCR technique as described above, using total intestinal RNA as a source of RNA.

Une bande de taille prévue (618b) est extraite après électrophorèse sur gel d'agarose puis traitée comme décrit ci-dessus avant d'être sous clonée dans pGEM 4Z pour être séquence.  A band of expected size (618b) is extracted after electrophoresis on agarose gel and then treated as described above before being subcloned in pGEM 4Z to be sequenced.

La séquence de cet ADN correspond à celle de 1'ADN de l'enképhaîinase forme longue, dans laquelle les enchaînements d'acides aminés correspondant aux exons 5 à 18 ont été éliminés. The sequence of this DNA corresponds to that of the long form enkephainase DNA, in which the amino acid chains corresponding to exons 5 to 18 have been eliminated.

EXEMPLE 2
Afin de caractériser cette nouvelle activité enzymatique, on a exprimé 1'ADNc dans des cellules de mammifères à l'aide d'un vecteur d'expression.EXAMPLE 2
In order to characterize this new enzymatic activity, the cDNA was expressed in mammalian cells using an expression vector.

Cette expression permet d'obtenir de grandes quantités d'enzyme et ainsi de mesurer son activité, de caractériser sa spécificité de substrat et de définir l'action d'inhibiteurs. This expression makes it possible to obtain large quantities of enzyme and thus to measure its activity, to characterize its specificity of substrate and to define the action of inhibitors.

Méthode
Les vecteurs d'expression dérivent du plasmide pSV p2-MDH (Emorine, L., Marullo, S., Delavier-Klutchko,
C., Kaveri, S.V., Durieu-Trautmann, O. et Strosberg,
A.D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6995-6999 (1987).Method
The expression vectors are derived from the plasmid pSV p2-MDH (Emorine, L., Marullo, S., Delavier-Klutchko,
C., Kaveri, SV, Durieu-Trautmann, O. and Strosberg,
AD Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6995-6999 (1987).

Le récepteur adrénergique p2 est excisé de pSV p2-MDH par digestion avec Hind III, EcoRI et remplacé par un fragment de restriction SmaI-EcoRI du clone du récepteur D-2A (Giros, B., Sokoloff, P., Martres, M.P.,
Riou, J.F., Emorine, L.J. et Schwartz, J.C. Nature 342.The p2 adrenergic receptor is excised from pSV p2-MDH by digestion with Hind III, EcoRI and replaced by a SmaI-EcoRI restriction fragment of the clone of the D-2A receptor (Giros, B., Sokoloff, P., Martres, MP,
Riou, JF, Emorine, LJ and Schwartz, JC Nature 342.

923-926 (1989) en utilisant un adaptateur de nucléotide franc-Hind III conduisant au plasmide pSVD2.923-926 (1989) using a franc-Hind III nucleotide adapter leading to the plasmid pSVD2.

Le vecteur pour exprimer la forme courte de l'enképhalinase est obtenu en remplaçant le fragment de restriction Hind III-BglII pSV D2 par la construction suivante : les deux fragments obtenus après PCR décrit précédemment sont coupés par l'enzyme de restriction
NaeI et ligués entre eux pour générer l'ADNc codant entier.The vector for expressing the short form of enkephalinase is obtained by replacing the restriction fragment Hind III-BglII pSV D2 with the following construction: the two fragments obtained after PCR described above are cut with the restriction enzyme
NaeI and ligated together to generate the entire coding cDNA.

Cette construction est montée dans le site SmaI de pGEM 42 puis excise par EcoRV et Pst I puis liguee à des adaptateurs francs Hind III et PstI-BamHI respectivement. Le morceau généré Hind III-BamHI est ensuite introduit dans le pSV D2 Hind III-BglII.  This construction is mounted in the SmaI site of pGEM 42 then excised by EcoRV and Pst I then ligated to straightforward Hind III and PstI-BamHI adapters respectively. The Hind III-BamHI generated piece is then introduced into pSV D2 Hind III-BglII.

Ces constructions sont cultivees et purifiées sur gradient de chlorure de cesium (Sambrook J. et al.,
Molecular cloning - a laboratory manual. C. Nolan, ed., Coîd Spring Harbor Laboratory Press, 1989) et transfectées (45) à des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO-K1) anormales en dihydrofolate réductase.These constructions are cultivated and purified on a cesium chloride gradient (Sambrook J. et al.,
Molecular cloning - a laboratory manual. C. Nolan, ed., Coïd Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and transfected (45) to abnormal Chinese hamster ovary (CHO-K1) cells in dihydrofolate reductase.

Les transfectants stables sont sélectionnés dans un milieu de culture (Dubelcco's Modified Eagle medium) sans hypoxanthine et sans thymidine.The stable transfectants are selected in a culture medium (Dubelcco's Modified Eagle medium) without hypoxanthine and without thymidine.

Sur les cellules transfectées on met en évidence une activité peptidasique nouvelle, absente des cellules moins. On utilise pour ce faire divers substrats tels que la (Met5)enképhaline ou la (D-Ala2,
Leu5) enképhaline, radioactive selon Vogel et Altstein (FEBS Lett. 1979, 98, 44). On peut aussi utiliser des substrats modèles tels que Suc-Ala-Ala-Phe amidométhylcoumarine selon Gros et al. (Proc. Natl.On the transfected cells a new peptidasic activity is highlighted, absent from the less cells. Various substrates such as (Met5) enkephalin or (D-Ala2,
Leu5) enkephalin, radioactive according to Vogel and Altstein (FEBS Lett. 1979, 98, 44). One can also use model substrates such as Suc-Ala-Ala-Phe amidomethylcoumarin according to Gros et al. (Proc. Natl.

Acad. Sci., 1989, 86, 7580). Cette activité peptidasique est entièrement inhibée par des agents chélateurs tels que 1'EDTA ou des inhibiteurs de métallopeptidases tels que le thiorphan à une concentration élevée (0,lmM). Toutefois, le thiorphan à une concentration de 0,1pM, suffisante pour inhiber complètement la forme longue de l'enképhalinase, n'affecte pas significativement l'activité de la forme courte.Acad. Sci., 1989, 86, 7580). This peptidasic activity is completely inhibited by chelating agents such as EDTA or metallopeptidase inhibitors such as thiorphan at a high concentration (0.1 μm). However, thiorphan at a concentration of 0.1 µM, sufficient to completely inhibit the long form of enkephalinase, does not significantly affect the activity of the short form.

On peut en déduire que la spécificité enzymatique de la forme courte est fortement modifiee par rapport à celle de la forme longue, notamment en ce qui concerne 1 'affinité d'inhibiteurs caractéristiques. It can be deduced therefrom that the enzymatic specificity of the short form is greatly modified compared to that of the long form, in particular as regards the affinity of characteristic inhibitors.

Ainsi, les cellules transfectées par cette forme courte représentent (de même que les tissus dans lesquels celle-ci est exprimée de manière exclusive ou prédominante) des matériels utiles pour la mise au point d'une nouvelle classe d'inhibiteurs de métallopeptidase.  Thus, the cells transfected with this short form represent (as do the tissues in which it is expressed exclusively or predominantly) useful materials for the development of a new class of metallopeptidase inhibitors.

EXEMPLE 3 : localisation de l'enkephalinase forme courte
La localisation de 1'ARNm de 1'isoforme courte de l'enképhalinase dans différents tissus peut être réalisée selon une méthode d'hybridation in situ à l'aide d'une sonde oligonucléotidique très spécifique, qui, dans des conditions données, ne va s'hybrider qu'avec la forme courte.EXAMPLE 3: localization of the short-form enkephalinase
The localization of the mRNA of the short isoform of enkephalinase in different tissues can be carried out according to an in situ hybridization method using a very specific oligonucleotide probe, which, under given conditions, will not hybridize only with the short form.

Par exemple, l'oligonucléotide GAC TGC ATA AAA TCA
GTC TTC CCC GCC est marqué, en sa partie 3'-terminale, à l'aide de la terminale-transférase et d'ATP 35S (1000 Ci/mmol) avec une activite spécifique de 3108cpm/pg. For example, the oligonucleotide GAC TGC ATA AAA TCA
GTC TTC CCC GCC is labeled, in its 3'-terminal part, using the terminal transferase and ATP 35S (1000 Ci / mmol) with a specific activity of 3108cpm / pg.

Différents organes (cerveau, intestin, rein, surrénales, pancréas, etc....) sont prélevés et immédiatement congelés par immersion pendant 30mn dans du monochlorodifluorométhane (Prestogaz R22). Different organs (brain, intestine, kidney, adrenals, pancreas, etc.) are removed and immediately frozen by immersion for 30 minutes in monochlorodifluoromethane (Prestogaz R22).

Ils sont ensuite conservés, pendant une durée de 1 jour minimum à quelques semaines maximum à -80 C avant d'être coupés. They are then kept, for a period of 1 day minimum to a few weeks maximum at -80 C before being cut.

Des coupes de l0tm sont réalises à l'aide d'un cryostat (Bright Instrument Company Ltd) montées sur des lames gélatinées (gélatine 0,1%) puis conserves à -80 C, en présence de desséchant jusqu'à l'utilisation. 10tm sections are made using a cryostat (Bright Instrument Company Ltd) mounted on gelatin slides (gelatin 0.1%) and then stored at -80 C, in the presence of desiccant until use.

Au moment de l'expérience, les coupes, encore congelées, sont immergées dans du paraformaldehyde (4%) pendant 15mn à température ambiante puis rincées par trempage rapide dans 2 bains successifs de PBS 0,1M et séchées sous un courant d'air comprimé. At the time of the experiment, the sections, still frozen, are immersed in paraformaldehyde (4%) for 15 min at room temperature then rinsed by rapid soaking in 2 successive baths of 0.1 M PBS and dried under a stream of compressed air .

50p1 de milieu d'hybridation (50% formamide, 0,6M
NaCl, 1 x Dehnardt, lOmM Tris-HC1 pH 7.5, lmM EDTA
O,5mg/ml ARNt de levure, 10mM dithiothreitol) contenant l'oligonucléotide radioactif (200.000 cpm/50Z1) sont déposés sur les coupes sèches et recouverts d'une pellicule. L'hybridation est realisée pendant 24h à 42 C dans une enceinte humidifiée par du formamide/50%). 50p1 of hybridization medium (50% formamide, 0.6M
NaCl, 1 x Dehnardt, lOmM Tris-HC1 pH 7.5, lmM EDTA
0.5 mg / ml yeast tRNA, 10 mM dithiothreitol) containing the radioactive oligonucleotide (200,000 cpm / 50Z1) are deposited on the dry sections and covered with a film. Hybridization is carried out for 24 hours at 42 ° C. in an enclosure moistened with formamide / 50%).

Pour le lavage, on enlève la pellicule par trempage (2 x SSC, lmM dithiothreitol) puis 4 fois 15mn (2 x SSC/formamide 50%/lmM dithiothreitol) à 42"C, 4 fois 15mn (0.2 x SSC/lmM dithiothreitol) à 55"C et 2 fois 30mn (0.1 x SSC/lmM dithiothreitol) à température ambiante. For washing, the film is removed by soaking (2 x SSC, lmM dithiothreitol) then 4 times 15mn (2 x SSC / formamide 50% / lmM dithiothreitol) at 42 "C, 4 times 15mn (0.2 x SSC / lmM dithiothreitol) at 55 "C and twice 30 min (0.1 x SSC / lmM dithiothreitol) at room temperature.

Les coupes sont ensuite déshydratées 2 fois 2mn à l'aide d' éthanol 30%/O. 3M acetate d' ammonium/1mM dithiothreitol, 2 fois 2mn à l'aide de l'ethanol 60%, acétate d'ammonium 0.3M, lmM dithiothreitol, 2 fois 2mn à l'aide d'éthanol 95%, acétate d'ammonium 0.3M, lmM dithiothreitol et enfin 2 fois 2mn à l'aide d'éthanol absolu. The sections are then dehydrated 2 times 2 min using 30% / O ethanol. 3M ammonium acetate / 1mM dithiothreitol, 2 times 2 mins using 60% ethanol, 0.3M ammonium acetate, lmM dithiothreitol, 2 times 2 mins using 95% ethanol, ammonium acetate 0.3M, lmM dithiothreitol and finally 2 times 2mn using absolute ethanol.

Les coupes sont ensuite séchées sous un courant d'air comprimé. The sections are then dried under a stream of compressed air.

Pour la révélation, les coupes sont apposées sur des films (commercialisés sous le nom d'hyperfilms p- max, Amersham) dans des cassettes d'autoradiographie munies d'écrans amplificateurs, maintenues à -80 C pendant le temps necessaire.  For the revelation, the sections are affixed to films (marketed under the name of hyperfilms p-max, Amersham) in autoradiography cassettes fitted with amplifying screens, maintained at -80 ° C. for the necessary time.

Le marquage peut aussi être mis en évidence par microautoradiographie. The labeling can also be demonstrated by micro-autoradiography.

Les lames sont alors trempées dans une émulsion photographique liquide (Il ford K5 ou Amersham EM1), maintenue à 43"C, puis conservées le temps nécessaire à 4 C en présence de desséchant, à l'abri de la lumière. The slides are then dipped in a liquid photographic emulsion (Il ford K5 or Amersham EM1), maintained at 43 "C, then stored for the time necessary at 4 C in the presence of desiccant, protected from light.

Les lames sont ensuite révélées pendant 90 secondes dans un révélateur commercialisé sous le nom Dektol (Kodak) dilué au 1/3 à 17"C, rinces dans de l'eau distillée glace puis fixées pendant 10mn dans du fixateur rapide (Kodak) diluee au 1/4 et maintenu à 4 C.  The slides are then revealed for 90 seconds in a developer sold under the name Dektol (Kodak) diluted 1/3 to 17 "C, rinsed in distilled ice water and then fixed for 10 minutes in quick fixator (Kodak) diluted in 1/4 and maintained at 4 C.

Les lames sont ensuite lavées à l'eau courante pendant 1 heure et séchées 24 heures à température ambiante à l'abri de la poussière. Une coloration appropriee pour le tissu étudie peut alors être réalisée.  The slides are then washed under running water for 1 hour and dried for 24 hours at room temperature, protected from dust. An appropriate staining for the tissue being studied can then be carried out.

A l'aide de cette sonde, la présence d'ARNm de l'isoforme courte de l'enképhalinase a pu être observée dans différents organes chez le rat. Using this probe, the presence of mRNA of the short isoform of enkephalinase could be observed in different organs in the rat.

Au niveau du cerveau, le lobe intermédiaire de l'hypophyse est fortement réactif alors que le striatum, riche en ARNm, de 1'isoforme longue de l'enkephalinase, semble vide. De plus, l'analyse microautoradiographique du lobe intermédiaire de l'hypophyse indique que toutes les cellules endocrines expriment l'ARNm de l'isoforme courte. In the brain, the intermediate lobe of the pituitary gland is highly reactive while the striatum, rich in mRNA, of the long isoform of enkephalinase, appears empty. In addition, microautoradiographic analysis of the intermediate lobe of the pituitary gland indicates that all endocrine cells express the mRNA of the short isoform.

Le tractus gastrointestinal est la région où les plus fortes concentrations d'ARNm de l'isoforme courte ont pu être observées. Au niveau du duodenum et du jejunum tout particulièrement, on observe un nombre discret de cellules épithéliales positives localisées dans les villosités intestinales et à la base des cryptes. Les couches plus profondes, musculaire muqueuse, sous muqueuses et muscles paraissent dénuées de réactivité. The gastrointestinal tract is the region where the highest concentrations of short isoform mRNA have been observed. In the duodenum and jejunum in particular, there is a discreet number of positive epithelial cells located in the intestinal villi and at the base of the crypts. The deeper layers, mucosal muscle, submucosa and muscles seem devoid of reactivity.

Par ailleurs, la distribution tissulaire de l'isoforme courte de l'enképhalinase a été etablie par
RT-PCR en utilisant les amorces n 1 et 4 définies cidessus.In addition, the tissue distribution of the short isoform of enkephalinase was established by
RT-PCR using primers # 1 and # 4 defined above.

L'ARN messager de l'isoforme courte de l'enkephalinase est ainsi mis en evidence dans divers tissus où celui de l'isoforme longue de l'enkephalinase est présent : il s'agit de l'intestin, du rein, poumon, coeur, cerveau, etc Cependant, au niveau du lobe intermédiaire de l'hypophyse, seul le messager de l'isoforme courte est mis en évidence indiquant que les cellules produisant de l'hormone a-MSH à partir de la proopiomélanocortine expriment sélectivement la forme courte de l'enkephalinase. Ces cellules sont marquées à l'aide d'un anticorps monoclonal mAb85 A2 (Pollard et al., Neuroscience, 1989, 30, 339) dirigé contre 1' enképhalinase . Cet anticorps peut être dès lors utilisé pour immunoprécipiter sélectivement la protéine correspondant à l'isoforme courte à partir de membranes solubilisées selon une technique décrite par Pollard et al. (Eur. J. Pharmacol. 1987, 133, 155) et la caractériser. En outre, les membranes brutes du lobe neurointermediaire de l'hypophyse constituent une source d'activité peptidasique correspondant sélectivement à l'isoforme courte de l'enképhalinase.  The messenger RNA of the short isoform of enkephalinase is thus demonstrated in various tissues where that of the long isoform of enkephalinase is present: it is the intestine, the kidney, lung, heart , brain, etc. However, at the level of the intermediate lobe of the pituitary gland, only the short isoform messenger is highlighted indicating that the cells producing the hormone a-MSH from proopiomelanocortin selectively express the short form of enkephalinase. These cells are labeled using a mAb85 A2 monoclonal antibody (Pollard et al., Neuroscience, 1989, 30, 339) directed against enkephalinase. This antibody can therefore be used to selectively immunoprecipitate the protein corresponding to the short isoform from membranes solubilized according to a technique described by Pollard et al. (Eur. J. Pharmacol. 1987, 133, 155) and characterize it. In addition, the raw membranes of the neurointermediate lobe of the pituitary gland constitute a source of peptidasic activity corresponding selectively to the short isoform of enkephalinase.

Claims (15)

REVENDICATION8CLAIM8 1. Polypeptide ayant une activité enzymatique contenant 1. Polypeptide having an enzymatic activity containing la séquence de 255 acides aminés de la Figure 1, the sequence of 255 amino acids of Figure 1, ou un variant de cette séquence, ce variant étant tel qu'il résulte de l'addition, de la suppression ou du remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que le variant soit une métallopeptidase présentant la même spécificité que ladite séquence vis-à-vis de substrats et inhibiteurs. or a variant of this sequence, this variant being such that it results from the addition, deletion or replacement of one or more amino acids, provided that the variant is a metallopeptidase having the same specificity as said vis sequence -to substrates and inhibitors. 2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par la séquence, représentée sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituee par l'acide aminé en position 1 à celle constituee par l'extrémité en position 255. 2. Polypeptide according to claim 1, characterized in that it is constituted by the sequence, represented in FIG. 1, extending from the end constituted by the amino acid in position 1 to that constituted by the end in position 255. 3. Acide nucleique caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par un enchaînement de nucléotides codant pour les polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 et 2. 3. Nucleic acid characterized in that it comprises or consists of a sequence of nucleotides coding for the polypeptides according to any one of claims 1 and 2. 4. Acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par l'enchaînement de nucléotides representé sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituee par le nucléotide en position 1 à celle constituée par le nucleotide en position 822, ou est constitué par l'enchaînement de nucléotides représenté sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 45 à celle constituée par le nucléotide en position 809. 4. Nucleic acid according to claim 3, characterized in that it comprises or is constituted by the sequence of nucleotides represented in FIG. 1, extending from the end constituted by the nucleotide in position 1 to that constituted by the nucleotide at position 822, or is constituted by the sequence of nucleotides represented in FIG. 1, extending from the end constituted by the nucleotide at position 45 to that formed by the nucleotide at position 809. 5. Vecteur recombinant, en particulier pour le clonage et/ou l'expression, notamment du type plasmide, cosmide, phage ou virus, caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique selon l'une des revendications 3 ou 4 en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication.  5. Recombinant vector, in particular for cloning and / or expression, in particular of the plasmid, cosmid, phage or virus type, characterized in that it contains a nucleic acid according to one of claims 3 or 4 in one of its sites not essential for its replication. 6. Vecteur recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il contient en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'une séquences d'acides aminés selon les revendications 1 ou 2, dans un hôte cellulaire et éventuellement un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible et éventuellement une séquence signal et une séquence d'ancrage. 6. Recombinant vector according to claim 5, characterized in that it contains, in one of its non-essential sites for its replication, elements necessary to promote the expression of an amino acid sequence according to claims 1 or 2 , in a cellular host and possibly a promoter recognized by the polymerases of the cellular host, in particular an inducible promoter and optionally a signal sequence and an anchoring sequence. 7. Hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6 et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence nucleotidique codant pour le polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2 dans cet hâte. 7. A cellular host transformed by a recombinant vector according to any one of claims 5 or 6 and comprising the regulatory elements allowing the expression of the nucleotide sequence coding for the polypeptide according to one of claims 1 or 2 in this haste. 8. Hôte cellulaire transformé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les bactéries, notamment E. coli. 8. A transformed cell host according to claim 7, characterized in that it is chosen from bacteria, in particular E. coli. 9. Hôte cellulaire transformé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit de cellules CHO. 9. A transformed cell host according to claim 7, characterized in that they are CHO cells. 10. Anticorps caractérisé(s) en ce qu'il(s) est (ou sont) dirigé(s) de façon specifique contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, et en ce qu'il(s) ne reconnaît (ou reconnaissent) pas l'enképhalinase décrite dans la demande de brevet 10. Antibody characterized (s) in that it (s) is (or are) directed (s) specifically against a polypeptide according to any one of claims 1 or 2, and in that it (s) does not recognize (or does not recognize) the enkephalinase described in the patent application EP n" 272928, et en particulier celui ou ceux reconnaissant les sequences d'acides aminés suivantes: - celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1 s'étendant de l'extrémité constituée par l'acide amine en position 54 à celle constituée par l'acide aminé en position 64.EP n "272928, and in particular that or those recognizing the following amino acid sequences: - that defined by the amino acid sequence represented in FIG. 1 extending from the end constituted by the amino acid in position 54 to that constituted by the amino acid in position 64. 11. Sonde nucléotidique caractérisée en ce qu'elle s'hybride avec l'un des acides nucléiques selon les revendications 3 ou 4 ou leur séquence complémentaire dans les conditions d'hybridation telles qu'elle ne s'hybride pas avec les gènes ou ARN messager de l'enkephalinase décrite dans la demande EP n" 272928, en ce qu'elles sont constituées de deux enchaînements dans le prolongement l'un de l'autre, c'est-à-dire - un premier enchaînement contenu dans la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 204 à celle constituée par le nucléotide en position 219, - et un deuxième enchaînement contenu dans la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 220 à celle constituée par le nucléotide en position 230, et en particulier la sonde nucléotidique suivante 11. Nucleotide probe characterized in that it hybridizes with one of the nucleic acids according to claims 3 or 4 or their complementary sequence under hybridization conditions such that it does not hybridize with genes or RNA messenger of the enkephalinase described in application EP n ° 272928, in that they consist of two sequences in the extension of one another, that is to say - a first sequence contained in the sequence of nucleic acids represented in FIG. 1, extending from the end constituted by the nucleotide in position 204 to that constituted by the nucleotide in position 219, - and a second sequence contained in the amino acid sequence represented in the Figure 1, extending from the end formed by the nucleotide in position 220 to that formed by the nucleotide in position 230, and in particular the following nucleotide probe GAC TGC ATA AAA TCA GTC TTC CCC GCC ou leur séquence nucléotidique complementaire.GAC TGC ATA AAA TCA GTC TTC CCC GCC or their complementary nucleotide sequence. 12. Procéde de diagnostic in vitro d'affections mettant en jeu un épissage alternatif anormal, dans lequel on utilise l'une ou plusieurs quelconques des sondes définies selon la revendication 11, comprenant les étapes suivantes - l'amplification prealable possible des quantités de séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4 susceptible d'être contenue dans un échantillon biologique prélevé sur un patient, au moyen d'amorces d'ADN, - la mise en contact de l'échantillon biologique indiqué ci-dessus avec une sonde nucléotidique selon la revendication 11, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé de ladite sonde et ladite séquence nucléotidique, - la détection du complexe d'hybridation ci-dessus qui a pu se former.  12. Method for in vitro diagnosis of disorders involving abnormal alternative splicing, in which one or more of any of the probes defined according to claim 11 is used, comprising the following steps - the possible prior amplification of the quantities of sequence nucleotide according to any one of claims 3 or 4 capable of being contained in a biological sample taken from a patient, by means of DNA primers, - bringing the biological sample indicated above into contact with a nucleotide probe according to claim 11, under conditions allowing the production of a hybridization complex formed from said probe and said nucleotide sequence, - the detection of the above hybridization complex which may have formed. 13. Procédé d'identification de tissus tels que le lobe intermediaire de l'hypophyse, où le polypeptide selon les revendications 1 ou 2 est exprimé de façon exclusive ou prépondérante, pour la mise au point d'inhibiteurs de l'activité enzymatique des polypeptides selon les revendications 1 ou 2 dans lequel on utilise une ou plusieurs sondes selon la revendication 11 comprenant les étapes suivantes - l'amplification préalable possible des quantités de séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4 susceptible d'être contenue dans un echantillon biologique, au moyen d'amorces d'ADN, - la mise en contact de l'échantillon biologique indiqué ci-dessus avec une sonde nucléotidique selon la revendication 11, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé de ladite sonde et ladite séquence nucléotidique, - la détection du complexe d'hybridation ci-dessus qui a pu se former. 13. A method of identifying tissues such as the intermediate pituitary lobe, where the polypeptide according to claims 1 or 2 is expressed exclusively or preponderantly, for the development of inhibitors of the enzymatic activity of the polypeptides according to claims 1 or 2 in which one or more probes according to claim 11 are used comprising the following steps - the possible prior amplification of the quantities of nucleotide sequence according to any one of claims 3 or 4 capable of being contained in a biological sample, by means of DNA primers, - bringing the biological sample indicated above into contact with a nucleotide probe according to claim 11, under conditions allowing the production of a hybridization complex formed from said probe and said nucleotide sequence, - detection of the above hybridization complex which may have formed. 14. Procédé d'identification de tissus tels que le lobe intermédiaire de l'hypophyse, où le polypeptide selon les revendications 1 ou 2 est exprimé de façon exclusive ou prépondérante, pour la mise au point d'inhibiteurs de l'activité enzymatique des polypeptides selon les revendications 1 ou 2 dans lequel on utilise un ou plusieurs anticorps selon la revendication 10 comprenant les etapes suivantes - la mise en contact d'un anticorps selon la revendication 10 avec un prélèvement biologique dans des conditions permettant la production éventuelle d'un complexe immunologique formé entre le polypeptide selon les revendications 1 ou 2 ou produit qui en a dérivé et l'anticorps selon la revendication 10, - la detection du susdit complexe immunologique formé.  14. A method of identifying tissues such as the intermediate pituitary lobe, where the polypeptide according to claims 1 or 2 is expressed exclusively or preponderantly, for the development of inhibitors of the enzymatic activity of the polypeptides according to claims 1 or 2 in which one or more antibodies according to claim 10 are used comprising the following steps - bringing an antibody according to claim 10 into contact with a biological sample under conditions allowing the possible production of a complex immunological formed between the polypeptide according to claims 1 or 2 or product derived therefrom and the antibody according to claim 10, - the detection of the above-mentioned immunological complex formed. 15. Médicament contenant comme substance active un inhibiteur de l'un au moins des polypeptides selon l'une des revendications 1 ou 2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.  15. Medicament containing as active substance an inhibitor of at least one of the polypeptides according to one of claims 1 or 2, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.