FR2815964A1

FR2815964A1 - RENIN AND / OR PRORENIN RECEPTOR PROTEIN, NUCLEIC ACID ENCODING THE RECEPTOR AND THEIR APPLICATIONS

Info

Publication number: FR2815964A1
Application number: FR0013943A
Authority: FR
Inventors: Francoise Delarue; Jean Daniel Sraer; Genevieve Nguyen
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2000-10-30
Filing date: 2000-10-30
Publication date: 2002-05-03
Also published as: WO2002036630A2; WO2002036630A3

Abstract

The invention concerns an isolated protein with renin receptor activity, a nucleic acid coding for said protein and their uses, in particular for screening antagonists or agonists of the renin-receptor linkage, useful in particular for treating diseases involving the renin/angiotensin system, and affecting in particular the heart, the kidneys and the brain.

Description

La présente invention a trait à une protéine récepteur de la rénine et/ou de la prorénine, à un acide nucléique codant pour ce récepteur et à leurs applications, notamment pour le criblage de composés agonistes ou antagonistes de ce récepteur. The present invention relates to a renin and / or prorenin receptor protein, to a nucleic acid coding for this receptor and to their applications, in particular for the screening of compounds agonists or antagonists of this receptor.

La rénine est une enzyme de la famille des aspartyl-protéases, essentiellement synthétisée au niveau de l'appareil juxtaglomérulaire par les cellules myoépithélioïdes des artérioles glomérulaires afférentes, et à un moindre degré par les cellules mésangiales humaines (Chansel et al, 1987). La rénine se distingue par sa spécificité d'action sur un seul substrat, l'angiotensinogène, qu'elle active en angiotensine 1. Cette activation par protéolyse limitée de l'angiotensinogène constitue l'étape limitant de la génération d'angiotensine Il (Ang Il). Il existe des arguments en faveur d'une production tissulaire, locale, d'Ang Il. Cette production tissulaire d'Ang Il peut résulter d'une synthèse locale de rénine et d'angiotensinogène, soit d'une capture des protéines à partir du plasma. Renin is an enzyme from the aspartyl protease family, essentially synthesized in the juxtaglomerular apparatus by the myoepithelioid cells of the afferent glomerular arterioles, and to a lesser extent by human mesangial cells (Chansel et al, 1987). Renin is distinguished by its specificity of action on a single substrate, angiotensinogen, which it activates in angiotensin 1. This activation by limited proteolysis of angiotensinogen constitutes the limiting step of the generation of angiotensin II (Ang He). There are arguments in favor of local tissue production of Ang Il. This tissue production of Ang II can result from a local synthesis of renin and angiotensinogen, that is, from a capture of proteins from plasma.

Plusieurs sites de fixation de la rénine ont été rapportés à ce jour : la RnBp et le récepteur mannose-6-phosphate ont été bien caractérisés, tandis que d'autres sites de fixation tissulaires ont été simplement décrits, en particulier des protéines de masse moléculaire 70 et 40 kDa. La RnBp ou "renin-binding protein"a été purifiée à partir de rein de porc (Takahashi et al, 1983) puis clonée chez l'homme (Inoue et al, 1991). C'est une protéine de 417 acides aminés et de poids moléculaire 45 kDa, localisée dans le cytosol. Elle est caractérisée par un motif leucine zipper important pour la formation d'homodimères RnBp et d'hétérodimère RnBp-rénine. Très récemment, il a été montré que la RnBp était identique à la N-Acyl-D-glucosamine 2-épimerase (Maru et al, 1996). La fixation de la rénine au récepteur mannose-6-P a été montrée sur les cellules endothéliales humaines de veines de cordon ombilical et sur les cardiomyocytes de rat. La fixation de rénine et de pro-rénine entraîne une internalisation des ligands et une activation de la pro-rénine (van Kesteren

et al, 1997 ; Admiraal et al, 1999). Campbell et Valentijn ont également rapporté chez le rat l'existence de deux protéines capables de lier la rénine (1994). Ces protéines ont été décrites dans des préparations de membranes Several renin binding sites have been reported to date: RnBp and the mannose-6-phosphate receptor have been well characterized, while other tissue binding sites have been simply described, in particular molecular weight proteins 70 and 40 kDa. RnBp or "renin-binding protein" was purified from pig kidneys (Takahashi et al, 1983) and then cloned in humans (Inoue et al, 1991). It is a protein of 417 amino acids and molecular weight 45 kDa, located in the cytosol. It is characterized by an important leucine zipper motif for the formation of RnBp homodimers and of RnBp-renin heterodimer. Very recently, it has been shown that RnBp is identical to N-Acyl-D-glucosamine 2-epimerase (Maru et al, 1996). Binding of renin to the mannose-6-P receptor has been shown on human endothelial cells from umbilical cord veins and on rat cardiomyocytes. Binding of renin and pro-renin leads to internalization of ligands and activation of pro-renin (van Kesteren

et al, 1997; Admiraal et al, 1999). Campbell and Valentijn also reported in rats the existence of two proteins capable of binding renin (1994). These proteins have been described in membrane preparations

d'artères mésentériques et de cellules musculaires lisses d'aorte, mais elles n'ont pas été retrouvées dans les préparations membranaires de cortex rénal.

mesenteric arteries and smooth muscle cells of the aorta, but they were not found in the membrane preparations of the renal cortex.

La fixation de la rénine aux membranes d'artère mésentérique était de faible affinité (kD de l'ordre du uM) et était totalement inhibée en présence d'un inhibiteur de l'activité de la rénine. Enfin Sealer et coli. (1996) ont décrit des sites de fixation de haute affinité pour la rénine et la pro-rénine (900 et 200 pM, respectivement) dans de nombreux tissus de rat. Ces sites de fixation semblent être distincts du récepteur mannose-6-P. The binding of renin to the mesenteric artery membranes was of low affinity (kD of the order of uM) and was completely inhibited in the presence of an inhibitor of renin activity. Finally Sealer and coli. (1996) described high affinity binding sites for renin and pro-renin (900 and 200 pM, respectively) in many rat tissues. These binding sites appear to be distinct from the mannose-6-P receptor.

Puisque les cellules mésangiales sont des cellules dérivées des cellules musculaires lisses et sont capables de synthétiser de la rénine, et que le système rénine-angiotensine peut être activé localement, l'hypothèse d'un système autocrine/paracrine de la rénine au niveau des cellules mésangiales humaines a été testée (Nguyen et al, 1998). Dans le cadre de cette étude, une protéine de poids moléculaire de 57 kDa avait été partiellement purifiée, par chromatograpie d'affinité. Since mesangial cells are cells derived from smooth muscle cells and are capable of synthesizing renin, and the renin-angiotensin system can be activated locally, the hypothesis of an autocrine / paracrine system of renin at the cell level human mesangials has been tested (Nguyen et al, 1998). In the context of this study, a protein with a molecular weight of 57 kDa had been partially purified by affinity chromatography.

Toutefois, le protocole de purification mentionné dans l'article de Nguyen et al, de 1998 n'a jamais pu aboutir, faute de quantité suffisante de matériel biologique. However, the purification protocol mentioned in the 1998 article by Nguyen et al, was never successful due to the lack of sufficient biological material.

Adoptant une nouvelle stratégie, les auteurs de l'invention sont parvenus à cloner un ADNc de 2 040 paires de bases (pb), comportant un cadre de lecture ouvert d'environ 1 100 pb, qui code pour une protéine de 350 acides aminés à activité de récepteur humain de la rénine, d'un poids moléculaire d'environ 39 kDa. Adopting a new strategy, the authors of the invention succeeded in cloning a cDNA of 2040 base pairs (bp), comprising an open reading frame of approximately 1100 bp, which codes for a protein of 350 amino acids with human renin receptor activity, with a molecular weight of about 39 kDa.

La liste des séquences annexée présente cet ADNc (SEQ ID no 1), et la séquence polypeptidique correspondante (SEQ ID no 2). La séquence

SEQ ID no 7 représente la séquence d'ADNc du récepteur de la rénine chez la souris, la séquence SEQ ID na 8 étant la séquence d'acides aminés correspondante. The annexed list of sequences presents this cDNA (SEQ ID No. 1), and the corresponding polypeptide sequence (SEQ ID No. 2). The sequence

SEQ ID No. 7 represents the cDNA sequence of the renin receptor in mice, the sequence SEQ ID na 8 being the corresponding amino acid sequence.

La présente invention a donc pour objet un acide nucléique isolé, comprenant la séquence SEQ ID n 1 ou no 7. The present invention therefore relates to an isolated nucleic acid, comprising the sequence SEQ ID No. 1 or No. 7.

Il est entendu que sont également comprises les séquences homologues, définies comme : It is understood that the homologous sequences are also included, defined as:

i) des séquences similaires à au moins 70 % de la séquence SEQ ID no 1 ou no 7 ; ou ii) des séquences hybridant avec la séquence SEQ ID no 1 ou no 7, ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou iii) des séquences codant pour la protéine, à activité de récepteur de la rénine, telle que définie précédemment.

i) sequences similar to at least 70% of the sequence SEQ ID no 1 or no 7; or ii) sequences hybridizing with the sequence SEQ ID No. 1 or No. 7, or its complementary sequence, under stringent hybridization conditions, or iii) sequences coding for the protein, with renin receptor activity, such as previously defined.

De préférence, une séquence nucléotidique homologue selon l'invention est similaire à au moins 75 % des séquences SEQ ID n'l ou no 7, de préférence encore au moins 85 %, ou au moins 90 %. Preferably, a homologous nucleotide sequence according to the invention is similar to at least 75% of the sequences SEQ ID n'l or no 7, more preferably at least 85%, or at least 90%.

De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement aux séquences complémentaires de la séquence SEQ ID no 1 ou no 7, dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm). Preferably, such a homologous nucleotide sequence specifically hybridizes to the sequences complementary to the sequence SEQ ID No. 1 or No. 7, under stringent conditions. The parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm).

Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81,5+0, 41 (% G+C) +16,6Log (concentration en cations)- 0,63 (% formamide)- (600/nombre de bases) (Sambrook et al., 1989). For sequences comprising more than 30 bases, Tm is defined by the relationship: Tm = 81.5 + 0.41 (% G + C) + 16.6 Log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - ( 600 / number of bases) (Sambrook et al., 1989).

Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4 (G+C) + 2 (A+T). For sequences of length less than 30 bases, Tm is defined by the relation: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T).

Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation peut être de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple. Under appropriate stringency conditions, to which the aspecific sequences do not hybridize, the hybridization temperature can preferably be 5 to 10 ° C. below Tm, and the hybridization buffers used are preferably solutions of ionic strength. high such as a 6xSSC solution for example.

Le terme "séquences similaires" employé plus haut se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les nucléotides comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans les séquences nucléiques distingue par exemple les purines et les pyrimidines. The term "similar sequences" used above refers to the perfect resemblance or identity between the nucleotides compared but also to the non-perfect resemblance which is called similarity. This search for similarities in the nucleic sequences distinguishes, for example, purines and pyrimidines.

Une séquence nucléotidique homologue à l'ORF représentée à la SEQ ID n 1 ou no 7 inclut donc toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID no 1 ou no 7 par mutation, insertion, délétion ou substitution A nucleotide sequence homologous to the ORF represented in SEQ ID no 1 or no 7 therefore includes any nucleotide sequence which differs from the sequence SEQ ID no 1 or no 7 by mutation, insertion, deletion or substitution

d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique, pour autant qu'elle code pour une protéine présentant l'activité biologique du récepteur de la rénine.

of one or more bases, or by the degeneration of the genetic code, provided that it codes for a protein exhibiting the biological activity of the renin receptor.

Parmi de telles séquences homologues, sont comprises les séquences des gènes de vertébrés, de préférence de mammifères autres que l'homme, codant pour ce récepteur, de préférence d'un primate, d'un bovin, ovin ou porc, ou encore d'un rongeur, mais aussi des poissons tels que la truite (pour lesquels il est connu que le système rénine/angiotensine est impliqué dans l'adaptation eau de mer/eau de source) ainsi que les variants alléliques. Among such homologous sequences are included the sequences of the genes of vertebrates, preferably mammals other than man, coding for this receptor, preferably a primate, a bovine, ovine or pig, or alternatively a rodent, but also fish such as trout (for which it is known that the renin / angiotensin system is involved in the adaptation of seawater / spring water) as well as allelic variants.

La présente invention a également pour objet une protéine isolée, à activité de récepteur de la rénine, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID no 2 ou no 8. Il est entendu que sont également comprises les séquences homologues, définies comme i) les séquences similaires à au moins 70% de la séquence SEQ ID no 2 ou no 8 ; ou ii) les séquences codées par une séquence d'acide nucléique homologue telle que définie précédemment c'est-à-dire une séquence d'acide nucléique hybridant avec la séquence SEQ ID no 1 ou no 7 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation. The present invention also relates to an isolated protein, with renin receptor activity, comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 2 or No. 8. It is understood that the homologous sequences, defined as i) are also included. sequences similar to at least 70% of the sequence SEQ ID no 2 or no 8; or ii) the sequences coded by a homologous nucleic acid sequence as defined above, that is to say a nucleic acid sequence hybridizing with the sequence SEQ ID no 1 or no 7 or its complementary sequence, under conditions stringent hybridization.

Là encore, le terme"similaires"se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les acides aminés comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans une séquence polypeptidique prend en compte les substitutions conservatives qui sont des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamin, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux

chaînes latérales apolares (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine). Again, the term "similar" refers to the perfect resemblance or identity between the amino acids compared, but also to the non-perfect resemblance which is termed similarity. This search for similarities in a polypeptide sequence takes into account conservative substitutions which are amino acid substitutions of the same class, such as amino acid substitutions for the uncharged side chains (such as asparagine, glutamin, serine, threonine, and tyrosine), amino acids with basic side chains (such as lysine, arginine, and histidine), amino acids with acid side chains (such as aspartic acid and glutamic acid); amino acids

apolar side chains (such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan, and cysteine).

Plus généralement, par séquence d'acides aminés homologue , on entend donc toute séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence SEQ ID no 2 ou no 8 par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudoacides aminés à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité biologique du récepteur de la rénine. More generally, by homologous amino acid sequence is therefore meant any amino acid sequence which differs from the sequence SEQ ID no 2 or no 8 by substitution, deletion and / or insertion of an amino acid or a number reduced amino acids, in particular by substitution of natural amino acids with non-natural amino acids or pseudo-amino acids at positions such that these modifications do not significantly affect the biological activity of the renin receptor.

De préférence, une telle séquence d'acides aminés homologue est similaire à au moins 85 % de la séquence SEQ ID no 2 ou no 8, de préférence au moins 95 %. Preferably, such a homologous amino acid sequence is similar to at least 85% of the sequence SEQ ID no 2 or no 8, preferably at least 95%.

L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i. e. identité ou similitude, comme défini plus haut). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces ( gaps ) dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions. Homology is usually determined using sequence analysis software (for example, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Similar amino acid sequences are aligned to obtain the maximum degree of homology (ie identity or similarity, as defined above). To this end, it may be necessary to artificially introduce gaps in the sequence. Once the optimal alignment has been achieved, the degree of homology is established by recording all the positions for which the amino acids of the two sequences compared are identical, relative to the total number of positions.

L'activité biologique du récepteur de la rénine/prorénine se réfère à sa capacité de fixation de la rénine ou de la prorénine et d'induction de différents phénomènes mesurables, tels que : - une augmentation de l'incorporation de thymidine tritiée ; - une augmentation de la sécrétion de l'inhibiteur type-1 de l'activateur tissulaire du plasminogène (PAI1) associée à un clivage du PAI1 en une forme inactive. Le PAI1 est une anti-protéase essentielle dans le contrôle de la fibrinolyse intra-vasculaire et dans la régulation du remodelage de la matrice extra-cellulaire ; - une inhibition de la génération de GMP cyclique (second messager intracellulaire) induite par le peptide natriurétique de type C (CNP) ; The biological activity of the renin / prorenin receptor refers to its capacity to fix renin or prorenin and to induce various measurable phenomena, such as: - an increase in the incorporation of tritiated thymidine; - an increase in the secretion of the type-1 inhibitor of the tissue plasminogen activator (PAI1) associated with cleavage of the PAI1 into an inactive form. PAI1 is an essential anti-protease in the control of intravascular fibrinolysis and in the regulation of remodeling of the extra-cellular matrix; an inhibition of the generation of cyclic GMP (second intracellular messenger) induced by the natriuretic peptide type C (CNP);

une augmentation de la vitesse de catalyse de l'angiotensinogène en angiotensine 1.

an increase in the rate of catalysis of angiotensinogen to angiotensin 1.

Le récepteur de la rénine selon l'invention serait impliqué dans des pathologies cardio-vasculaires et rénales telles que les cardiopathies hypertrophiques et les insuffisances rénales. Le coeur et le rein sont en effet deux organes dans lesquels l'existence d'un système rénine-angiotensine (SRA) local est bien démontré. Il existe également un SRA dans le cerveau, l' il, le placenta, les testicules et cette liste est non exhaustive. De fait, le récepteur de la rénine pourrait jouer un rôle dans toutes les pathologies impliquant le SRA local. The renin receptor according to the invention is implicated in cardiovascular and renal pathologies such as hypertrophic heart diseases and renal failure. The heart and the kidney are indeed two organs in which the existence of a local renin-angiotensin system (RAS) is well demonstrated. There is also an RAS in the brain, eye, placenta, testes and this list is not exhaustive. In fact, the renin receptor could play a role in all pathologies involving local RAS.

La protéine récepteur de la rénine présente une partie extramembranaire (séquence d'acides aminés no 1 à no 308 de SEQ ID no 2, représentée SEQ ID nO 4), un domaine transmembranaire, et une queue

intracytoplasmique (séquence d'acides aminés no 331 à no 350, de SEQ ID no 2, représentée SEQ ID nO 6). The renin receptor protein has an extramembrane part (amino acid sequence no 1 to no 308 of SEQ ID no 2, represented SEQ ID no 4), a transmembrane domain, and a tail

intracytoplasmic (amino acid sequence no 331 to no 350, from SEQ ID no 2, shown SEQ ID no 6).

Le polypeptide extramembranaire comprenant la séquence SEQ ID no 4, ou le polypeptide intracytoptasmique comprenant la séquence SEQ ID no 6, et les acides nucléiques codant pour ces polypeptides, comprenant par exemple respectivement les séquences représentées SEQ ID no 3 ou no 5, font partie de l'invention. The extramembrane polypeptide comprising the sequence SEQ ID no 4, or the intracytoptasmic polypeptide comprising the sequence SEQ ID no 6, and the nucleic acids coding for these polypeptides, comprising for example the sequences represented SEQ ID no 3 or no 5, are part of the invention.

Les acides nucléiques et polypeptides homologues font également partie de l'invention, selon la définition de l'homologie mentionnée plus haut et considérée par analogie. Homologous nucleic acids and polypeptides also form part of the invention, according to the definition of homology mentioned above and considered by analogy.

Le polypeptide comprenant la séquence SEQ ID no 4 ou ses homologues présente la capacité de capter la rénine et/ou la prorénine. Il peut donc par exemple être utile dans des procédés de criblage des composés susceptibles d'être des ligands du récepteur de la rénine. The polypeptide comprising the sequence SEQ ID No. 4 or its counterparts has the capacity to capture renin and / or prorenin. It can therefore, for example, be useful in methods for screening for compounds capable of being ligands for the renin receptor.

Le polypeptide comprenant la séquence SEQ ID no 6 ou ses homologues contient des résidus sérine et tyrosine phosphorylables. Il peut être notamment utile dans des procédés de criblage de composés qui empêchent ou stimulent la phosphorylation de ces résidus. The polypeptide comprising the sequence SEQ ID No. 6 or its homologs contains phosphorylatable serine and tyrosine residues. It can be particularly useful in methods for screening for compounds which prevent or stimulate the phosphorylation of these residues.

Dans la description ci-après, on entend, sauf indication contraire, par"protéine de l'invention" indifféremment la protéine entière récepteur de la rénine et de la prorénine, ou les polypeptides correspondant au domaine extramembranaire et au domaine intracytoplasmique, ou encore les protéines ou polypeptides homologues. In the description below, the term "protein of the invention" is understood to mean, without reference to the contrary, the whole protein receptor of renin and of prorenin, or the polypeptides corresponding to the extramembrane domain and to the intracytoplasmic domain, or alternatively the homologous proteins or polypeptides.

La protéine de la présente invention peut être synthétisée par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier. La protéine de l'invention peut par exemple être synthétisée par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production. The protein of the present invention can be synthesized by any method well known to those skilled in the art. The protein of the invention can for example be synthesized by the techniques of synthetic chemistry, such as Merrifield-type synthesis which is advantageous for reasons of purity, antigenic specificity, absence of unwanted side products and for its ease of production.

Une protéine recombinante peut également être produite par un procédé, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID no 1, 5 ou 7 ou une séquence homologue est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression de la protéine correspondante. A recombinant protein can also be produced by a method in which a vector containing a nucleic acid comprising the sequence SEQ ID No. 1, 5 or 7 or a homologous sequence is transferred into a host cell which is cultured under conditions allowing expression of the corresponding protein.

La protéine produite peut ensuite être récupérée et purifiée. The protein produced can then be recovered and purified.

Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. La protéine recombinante obtenue peut être purifiée à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono-ou polyclonaux spécifiques, etc. The purification methods used are known to those skilled in the art. The recombinant protein obtained can be purified from lysates and cell extracts, from the supernatant of the culture medium, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using specific mono or polyclonal antibodies, etc.

La protéine obtenue peut donc être une protéine soluble ou une protéine qui s'intègre dans une membrane cellulaire. The protein obtained can therefore be a soluble protein or a protein which integrates into a cell membrane.

La séquence d'acide nucléique d'intérêt peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription. The nucleic acid sequence of interest can be inserted into an expression vector, in which it is operably linked to elements allowing the regulation of its expression, such as in particular promoters, activators and / or transcription terminators. .

Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon The signals controlling the expression of the nucleotide sequences (promoters, activators, termination sequences, etc.) are chosen according to the cell host used. To this end, the nucleotide sequences according to

l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium.

the invention can be inserted into autonomous replication vectors within the chosen host, or integrative vectors of the chosen host. Such vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as for example electroporation or precipitation with calcium phosphate.

Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits cidessus, contenant une séquence nucléotidique définie selon l'invention font également partie de la présente invention. The cloning and / or expression vectors as described above, containing a nucleotide sequence defined according to the invention also form part of the present invention.

L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. The invention further relates to host cells transfected, transiently or stable, with these expression vectors. These cells can be obtained by introducing into host cells, prokaryotic or eukaryotic, a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.

Des exemples de cellules hôtes incluent notamment des cellules de mammifères, telles que les lignées et les cellules rénales en culture primaire, ou encore les cellules CHO, COS-7,293, MDCK, des cellules d'insectes telles que les cellules SF9, des bactéries telles que E. coli et des souches de levures telles que L40 et Y90. Examples of host cells include in particular mammalian cells, such as lines and renal cells in primary culture, or alternatively CHO, COS-7,293, MDCK cells, insect cells such as SF9 cells, bacteria such as as E. coli and yeast strains such as L40 and Y90.

Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID no 1. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art. The nucleotide sequences of the invention can be of artificial origin or not. They can be DNA or RNA sequences, obtained by screening of sequence banks using probes prepared on the basis of the sequence SEQ ID No. 1. Such libraries can be prepared by conventional techniques of biology molecular, known to those skilled in the art.

La séquence nucléotidique selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques. The nucleotide sequence according to the invention can also be prepared by chemical synthesis, or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening libraries.

La séquence nucléotidique de l'invention permet la réalisation de sondes ou amorces, hybridant spécifiquement avec la séquence SEQ ID no 1 selon l'invention, ou son brin complémentaire. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence dans des conditions stringentes telles que définies précédemment. Ces sondes peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, notamment d'hybridation"in situ", de transcrits spécifiques de la protéine de l'invention dans des échantillons biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques résultant d'un polymorphisme, de mutations ou d'un mauvais épissage. The nucleotide sequence of the invention allows the production of probes or primers, specifically hybridizing with the sequence SEQ ID No. 1 according to the invention, or its complementary strand. The appropriate hybridization conditions correspond to the temperature and ionic strength conditions usually used by those skilled in the art, preferably under stringent conditions as defined above. These probes can be used as an in vitro diagnostic tool for the detection, by hybridization experiments, in particular of "in situ" hybridization, of specific transcripts of the protein of the invention in biological samples or for the implementation evidence of aberrant syntheses or genetic anomalies resulting from polymorphism, mutations or improper splicing.

Les acides nucléiques de l'invention utiles comme sondes comportent au minimum 15 nucléotides, préférentiellement au moins 20 nucléotides, préférentiellement encore au moins 100 nucléotides, mais de préférence inférieure à la taille de la séquence SEQ ID no 1 elle-même. The nucleic acids of the invention useful as probes comprise at least 15 nucleotides, preferably at least 20 nucleotides, preferably still at least 100 nucleotides, but preferably less than the size of the sequence SEQ ID No. 1 itself.

On peut par exemple utiliser comme sonde le fragment des nucléotides 90 à 1945 de SEQ ID no 1. One can for example use as probe the fragment of nucleotides 90 to 1945 of SEQ ID no 1.

Les acides nucléiques utiles comme amorces comportent au minimum 15 nucléotides, de préférence au moins 18 nucléotides, et préférentiellement moins de 40 nucléotides. The nucleic acids useful as primers comprise at least 15 nucleotides, preferably at least 18 nucleotides, and preferably less than 40 nucleotides.

On peut par exemple utiliser comme amorce, pour une amplification, les acides nucléiques constitués des séquences des nucléotides 128 à 151, 796 à 819,228 à 248 ou 454 à 474 de SEQ Il ne 1. One can for example use as primer, for an amplification, the nucleic acids made up of the sequences of nucleotides 128 to 151, 796 to 819,228 to 248 or 454 to 474 of SEQ II does not 1.

Plus précisément, la présente invention a pour objet un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides, qui hybride spécifiquement avec l'une des séquences d'acide nucléique SEQ ID no 1 ou son complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation. More specifically, the present invention relates to a nucleic acid having at least 15 nucleotides, which specifically hybridizes with one of the nucleic acid sequences SEQ ID No. 1 or its complement, under stringent hybridization conditions.

Préférentiellement, les sondes ou amorces de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique. Preferably, the probes or primers of the invention are marked, prior to their use. For this, several techniques are within the reach of those skilled in the art such as, for example, fluorescent, radioactive, chemiluminescent or enzymatic labeling.

Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces oligonucléotides sont mis en oeuvre pour la détection de mutations ou de The in vitro diagnostic methods in which these oligonucleotides are used for the detection of mutations or

remaniements génomiques, au niveau du gène du récepteur de la rénine, sont incluses dans la présente invention. Ces méthodes sont particulièrement utiles en diagnostic prénatal, au cours du développement de l'embryon et du foetus ainsi que plus généralement pour le diagnostic d'affections impliquant les systèmes rénine/angiotensine locaux.

Genomic changes, at the renin receptor gene level, are included in the present invention. These methods are particularly useful in prenatal diagnosis, during the development of the embryo and fetus as well as more generally for the diagnosis of conditions involving the local renin / angiotensin systems.

L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression du récepteur de la rénine tel que défini précédemment dans un échantillon cellulaire ou tissulaire, comprenant les étapes consistant à : - préparer l'ARN dudit échantillon ; - mettre en contact ledit ARN obtenu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique codant pour une protéine à activité de récepteur de la rénine, telle que définie précédemment ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression dudit récepteur. The subject of the invention is also a method for detecting the expression of the renin receptor as defined above in a cell or tissue sample, comprising the steps consisting in: - preparing the RNA of said sample; - contacting said RNA obtained with a probe having a nucleotide sequence capable of hybridizing specifically with a nucleic acid coding for a protein with renin receptor activity, as defined above; - detect the presence of mRNA hybridizing with this probe, indicative of the expression of said receptor.

L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression de ce récepteur dans des cellules ou un tissu par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact lesdites cellules ou ledit tissu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique codant pour une protéine à activité de récepteur de la rénine, telle que définie précédemment ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression dudit récepteur. The subject of the invention is also a method for detecting the expression of this receptor in cells or tissue by in situ hybridization, comprising the steps consisting in: - bringing said cells or said tissue into contact with a probe having a sequence nucleotide capable of hybridizing specifically with a nucleic acid coding for a protein with renin receptor activity, as defined above; - detect the presence of mRNA hybridizing with this probe, indicative of the expression of said receptor.

L'invention concerne également une méthode in vitro pour la détection ou la mesure du taux d'expression du récepteur de la rénine dans un prélèvement biologique, comprenant la mise en contact d'au moins un anticorps dirigé contre ce récepteur avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre ce récepteur et le ou lesdits anticorps et la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés. The invention also relates to an in vitro method for detecting or measuring the level of expression of the renin receptor in a biological sample, comprising contacting at least one antibody directed against this receptor with said biological sample in conditions allowing the possible formation of specific immunological complexes between this receptor and the said antibody or antibodies and the detection of specific immunological complexes possibly formed.

L'invention a également pour objet des anticorps dirigés contre la protéine récepteur de la rénine telle que définie précédemment, ou contre les fragments épitopiques de celle-ci, tels que les fragments définis entre les résidus 23 à 38 de SEQ ID no 2 (NH2-KSP GSV VFR NGN WPI P-CONH2) ; 221 à 235 de SEQ ID no 2 (NH2-EIG KRY GED SEQ FRD C-CONH2) ; 277 à 291 de SEQ ID no 2 (NH2-CTR TIL EAK QAK NPA S-CONH2) ; 338 à 350 de SEQ ID no 2 (NH2 - Cil YRM TNQ KIR MD-CONH2).

The subject of the invention is also antibodies directed against the renin receptor protein as defined above, or against the epitopic fragments thereof, such as the fragments defined between residues 23 to 38 of SEQ ID No. 2 (NH2 -KSP GSV VFR NGN WPI P-CONH2); 221 to 235 of SEQ ID No. 2 (NH2-EIG KRY GED SEQ FRD C-CONH2); 277-291 of SEQ ID No. 2 (NH2-CTR TIL EAK QAK NPA S-CONH2); 338 to 350 of SEQ ID no 2 (NH2 - Cil YRM TNQ KIR MD-CONH2).

Il peut s'agir d'anticorps poly-ou monoclonaux ou de leurs fragments, d'anticorps chimériques, notamment humanisés ou immunoconjugués. They may be poly- or monoclonal antibodies or their fragments, chimeric antibodies, in particular humanized or immunoconjugated.

Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre une protéine selon les modes opératoires usuels. Polyclonal antibodies can be obtained from the serum of an animal immunized against a protein according to the usual procedures.

Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser comme antigène un fragment peptidique approprié, tel que défini plus haut, pouvant être couplé par l'intermédiaire d'un résidu réactif à une protéine (telle que l'hémocyanine de patelle KLH) ou un autre peptide. Des lapins sont immunisés avec l'équivalent de 1 mg de l'antigène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et al. (1982). A des intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200 ug d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, l'anti-sérum est examiné pour déterminer sa capacité à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode chloramine-T et est ensuite purifié par une chromatographie sur colonne échangeuse d'ion carboxyméthyl cellulose (CMC). Les molécules d'anticorps sont ensuite recueillies dans les mammifères et isolées jusqu'à la concentration souhaitée par les méthodes bien connues de l'homme de l'art, par exemple, en utilisant DEAE Sephadex pour obtenir la fraction IgG. According to one embodiment of the invention, an appropriate peptide fragment, as defined above, can be used as antigen, which can be coupled via a reactive residue to a protein (such as keyhole limpet hemocyanin KLH ) or another peptide. Rabbits are immunized with the equivalent of 1 mg of the peptide antigen according to the procedure described by Benoit et al. (1982). At four-week intervals, the animals are treated with injections of 200 µg of antigen and bled 10-14 days later. After the third injection, the antiserum is examined to determine its capacity to bind to the antigen peptide radiolabelled with iodine, prepared by the chloramine-T method and is then purified by chromatography on an ion exchange column carboxymethyl cellulose (CMC). The antibody molecules are then collected in mammals and isolated to the desired concentration by methods well known to those skilled in the art, for example, using DEAE Sephadex to obtain the IgG fraction.

Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonal, les anticorps peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité en utilisant des polypeptides immunisants en phase solide. L'anticorps est mis en contact avec le polypeptide immunisant en phase solide pendant une durée suffisante de façon à faire immuno-réagir le polypeptide avec la molécule d'anticorps afin de former un complexe immunologique en phase solide. In order to increase the specificity of the polyclonal serum, the antibodies can be purified by immunoaffinity chromatography using solid phase immunizing polypeptides. The antibody is brought into contact with the immunizing polypeptide in solid phase for a sufficient time so as to make the polypeptide immunoreact with the antibody molecule in order to form an immunological complex in solid phase.

Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Köhler et Milstein (1975). The monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of culture of hybridomas described by Köhler and Milstein (1975).

Les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention peuvent être par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F (ab') 2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. The antibodies or antibody fragments of the invention can be, for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab and F (ab ') 2 fragments. They can also be in the form of immunoconjugates or labeled antibodies.

Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent notamment être utilisés pour l'analyse par immunohistochimie du récepteur de la rénine sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoperoxydase... The antibodies of the invention, in particular the monoclonal antibodies, can in particular be used for the analysis by immunohistochemistry of the renin receptor on sections of specific tissues, for example by immunofluorescence, gold labeling, immunoperoxidase, etc.

Les anticorps ainsi produits peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression du récepteur de la rénine doit être observée. The antibodies thus produced can advantageously be used in any situation where the expression of the renin receptor must be observed.

L'invention a plus généralement pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps ainsi produit pour la détection ou la purification d'une protéine telle que définie précédemment dans un échantillon biologique. A more general subject of the invention is the use of at least one antibody thus produced for the detection or the purification of a protein as defined above in a biological sample.

L'invention a également pour objet un kit pour la mise en oeuvre de cette méthode comprenant : - au moins un anticorps spécifique du récepteur de la rénine, éventuellement fixé sur un support ; - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre le récepteur de la rénine et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes. The invention also relates to a kit for the implementation of this method comprising: - at least one antibody specific for the renin receptor, optionally attached to a support; - Means for revealing the formation of specific antigen / antibody complexes between the renin receptor and said antibody and / or means for quantifying these complexes.

L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'animal non humain, de préférence une souris, dans lequel on invalide le gène du récepteur de la rénine. L'animal susceptible d'être obtenu par ce procédé fait également partie de l'invention. Un tel animal, désigné"knock-out"pour ce gène, est un modèle notamment utile pour étudier la susceptibilité à développer des lésions, notamment de type lésions vasculaires ou modifiant la composition The invention also relates to a process for obtaining a non-human animal, preferably a mouse, in which the gene for the renin receptor is disabled. The animal capable of being obtained by this process also forms part of the invention. Such an animal, designated "knockout" for this gene, is a model which is particularly useful for studying the susceptibility to developing lesions, in particular of the vascular lesion type or modifying the composition

de la matrice extracellulaire, ou par exemple pour évaluer la cytotoxicité ou l'activité thérapeutique de certaines molécules.

of the extracellular matrix, or for example to evaluate the cytotoxicity or the therapeutic activity of certain molecules.

L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'animal non humain transgénique, de préférence une souris, dans le génome duquel on intègre une séquence nucléotidique codante pour le récepteur de la rénine selon l'invention. Ladite séquence codante peut être une séquence homologue vis à vis de l'animal (par exemple une séquence murine intégrée dans le génome d'une souris) ou hétérologue (par exemple une séquence humaine intégrée dans le génome d'une souris). Un tel animal transgénique peut être un modèle utile pour étudier plus avant les fonctions du récepteur, mais aussi pour tester des molécules susceptibles d'agir sur celui-ci. The subject of the invention is also a process for obtaining a transgenic non-human animal, preferably a mouse, in the genome of which a nucleotide sequence coding for the renin receptor according to the invention is integrated. Said coding sequence can be a sequence homologous with respect to the animal (for example a murine sequence integrated into the genome of a mouse) or heterologous (for example a human sequence integrated into the genome of a mouse). Such a transgenic animal can be a useful model for further studying the functions of the receptor, but also for testing molecules capable of acting on it.

Les techniques classiquement utilisées pour obtenir des animaux transgéniques sont la technique de micro-injection d'ADN dans l'ovocyte, ou la technique d'injection dans le blastocyte et la technique d'agrégation (Hogan et al, 1994). The techniques conventionally used to obtain transgenic animals are the technique of micro-injection of DNA into the oocyte, or the technique of injection into the blastocyte and the technique of aggregation (Hogan et al, 1994).

La protéine de l'invention ou l'acide nucléique codant pour cette protéine sont utiles à titre de médicament, notamment pour le traitement d'affections, dans lesquelles on observe par exemple l'expression d'un récepteur de la rénine modifié, et pour le traitement desquelles on cherche à restaurer l'activité de ce récepteur sauvage. Ces médicaments seraient en particulier utiles pour le traitement de pathologies associées à une augmentation de PAI 1 eVou une accumulation de matrice extracellulaire (inflammation, fibrose). The protein of the invention or the nucleic acid encoding this protein are useful as a medicament, in particular for the treatment of conditions, in which, for example, the expression of a modified renin receptor is observed, and for the treatment of which it is sought to restore the activity of this wild receptor. These drugs would be particularly useful for the treatment of pathologies associated with an increase in PAI 1 and an accumulation of extracellular matrix (inflammation, fibrosis).

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant une protéine telle que définie précédemment ou un acide nucléique codant pour ladite protéine, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a protein as defined above or a nucleic acid encoding said protein, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.

Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention, contenant au moins une protéine, peuvent être déterminées de manière usuelle par l'homme du métier, notamment selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par The modes of administration, the dosages and the galenical forms of the pharmaceutical compositions according to the invention, containing at least one protein, can be determined in the usual way by a person skilled in the art, in particular according to the criteria generally taken into account for the establishment of a therapeutic treatment adapted to a patient, such as

exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc.

example the patient's age or body weight, the seriousness of his general condition, the tolerance to treatment, and the side effects observed, etc.

De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 0, 1 ug à environ 1 mg peut être administrée à des adultes humains. Generally, a therapeutically or prophylactically effective amount ranging from about 0.1 µg to about 1 mg can be administered to human adults.

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique tel que défini précédemment, codant pour le récepteur de la rénine et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ladite composition étant destinée à être utilisée en thérapie génique. L'acide nucléique de préférence inséré dans un vecteur généralement viral (tels que les adénovirus et les rétrovirus) peut être administré sous forme nue, exempt de tout véhicule favorisant le transfert à la cellule cible, ou au contraire en association avec un agent facilitant la transfection. The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid as defined above, coding for the renin receptor and a pharmaceutically acceptable vehicle, said composition being intended for use in gene therapy. The nucleic acid preferably inserted into a generally viral vector (such as adenoviruses and retroviruses) can be administered in naked form, free of any vehicle promoting transfer to the target cell, or on the contrary in combination with an agent facilitating the transfection.

Lorsque les constructions d'acide nucléique de l'invention recouvrent des microparticules, celles-ci peuvent être injectées par voie intradermique ou intraépidermique par la technique du canon à gènes, "gene gun" (WO 94/24263). When the nucleic acid constructs of the invention cover microparticles, these can be injected intradermally or intraepidermally by the gene gun technique, "gene gun" (WO 94/24263).

La quantité à utiliser comme médicament dépend notamment de la construction d'acide nucléique elle-même, de l'individu auquel cet acide nucléique est administré, du mode d'administration et du type de formulation, et de la pathologie. De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 0,1 ug à environ 1 mg, de préférence d'environ 1 ug à environ 800 ug et, de manière préférentielle d'environ 25 ug à environ 250 ug, peut être administrée à des adultes humains. The amount to be used as a drug depends in particular on the construction of nucleic acid itself, the individual to whom this nucleic acid is administered, the mode of administration and the type of formulation, and the pathology. Generally, a therapeutically or prophylactically effective amount ranging from about 0.1 µg to about 1 mg, preferably from about 1 µg to about 800 µg and, preferably from about 25 µg to about 250 µg, may be administered to human adults.

Les constructions d'acides nucléiques de l'invention peuvent être administrées par toute voie d'administration conventionnelle telle que notamment par voie parentérale. Le choix de la voie d'administration dépend en particulier de la formulation choisie. The nucleic acid constructs of the invention can be administered by any conventional route of administration, such as in particular parenterally. The choice of route of administration depends in particular on the formulation chosen.

L'invention a donc enfin pour objet une méthode de traitement thérapeutique, dans laquelle on administre à un patient nécessitant un tel traitement, une quantité efficace d'une protéine à activité de récepteur de la rénine tel que défini précédemment ou un acide nucléique codant pour cette protéine, dans le cadre d'une thérapie génique. The invention therefore finally relates to a therapeutic treatment method, in which a patient in need of such treatment is administered an effective amount of a protein with renin receptor activity as defined above or a nucleic acid coding for this protein, as part of gene therapy.

Le patient visé est généralement un être humain, mais l'application peut également être étendue à tout mammifère le cas échéant. The target patient is generally a human being, but the application can also be extended to any mammal if necessary.

A l'inverse, dans d'autres circonstances où l'on observe par exemple une surexpression du récepteur de la rénine, en corrélation avec un phénotype pathologique, on peut chercher à bloquer ou inhiber l'activité de ce récepteur. Conversely, in other circumstances where for example an overexpression of the renin receptor is observed, in correlation with a pathological phenotype, it is possible to seek to block or inhibit the activity of this receptor.

L'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un anticorps dirigé contre ledit récepteur, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. The invention therefore also relates to a pharmaceutical composition comprising an antibody directed against said receptor, in association with an acceptable pharmaceutical vehicle.

L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique comprenant une séquence anti-sens bloquant l'expression du gène codant pour le récepteur, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The invention further relates to a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid comprising an antisense sequence blocking the expression of the gene encoding the receptor, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.

La formulation de ces compositions pharmaceutiques et la posologie associée sont à la portée de l'homme du métier, au vu notamment des informations données précédemment, concernant les compositions pharmaceutiques à base de protéine récepteur ou d'acide nucléique codant pour le récepteur. The formulation of these pharmaceutical compositions and the associated dosage are within the reach of those skilled in the art, in view in particular of the information given above, concerning pharmaceutical compositions based on receptor protein or nucleic acid encoding the receptor.

L'invention a également pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles de se lier à la protéine à activité de récepteur de la rénine selon l'invention ou au polypeptide corespondant au domaine extramembranaire de celle-ci, dans lequel on met en contact lesdits composés avec ladite protéine récepteur ou ledit polypeptide et on évalue le taux de liaison entre lesdits composés et ladite protéine récepteur. The subject of the invention is also a method of screening for compounds capable of binding to the protein with renin receptor activity according to the invention or to the polypeptide corresponding to the extramembrane domain thereof, in which said contacts are brought into contact. compounds with said receptor protein or said polypeptide and the rate of binding between said compounds and said receptor protein is evaluated.

Les nouveaux ligands obtenus ou pouvant être obtenus par ce procédé, en particulier des ligands synthétiques, font également partie de l'invention. The new ligands obtained or obtainable by this process, in particular synthetic ligands, also form part of the invention.

Ces tests de liaison peuvent être également appliqués à la détermination de la présence ou de l'absence de rénine ou de ses analogues dans un échantillon biologique, ainsi qu'à l'isolement de nouveaux ligands endogènes. These binding tests can also be applied to determine the presence or absence of renin or its analogs in a biological sample, as well as to the isolation of new endogenous ligands.

L'invention a donc également pour objet un procédé d'identification de ligands du récepteur de la rénine comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon biologique susceptible de contenir des ligands du récepteur avec une protéine ou un polypeptide extramembranaire selon l'invention ou une cellule hôte exprimant ladite protéine, b) isoler les complexes ligand-récepteur formés, et c) identifier les ligands du récepteur de la rénine. A subject of the invention is therefore also a method for identifying ligands of the renin receptor comprising the steps consisting in: a) bringing a biological sample capable of containing ligands of the receptor into contact with an extramembrane protein or polypeptide according to invention or a host cell expressing said protein, b) isolating the ligand-receptor complexes formed, and c) identifying the ligands of the renin receptor.

Les tests de liaison utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être réalisés selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. On peut notamment marquer préalablement les composés susceptibles de se lier à la protéine récepteur, qui peuvent être utilisés seuls ou en compétition avec d'autres composés non marqués. The binding tests used in the context of the present invention can be carried out according to methods well known to those skilled in the art. In particular, the compounds capable of binding to the receptor protein can be marked beforehand, which can be used alone or in competition with other unlabeled compounds.

Plus particulièrement, on peut réaliser par exemple des tests de liaison compétitifs, des tests de type ELISA ou IRMA. More particularly, competitive binding tests, ELISA or IRMA type tests can be carried out, for example.

L'invention a également pour objet un procédé d'évaluation des propriétés pharmacologiques des composés capables de se lier à la protéine récepteur de la rénine, appelés ligands dudit récepteur, comprenant les étapes consistant à : a) cultiver des cellules exprimant ladite protéine récepteur, en présence d'au moins un ligand dudit récepteur ; et b) évaluer la capacité du ligand à moduler l'activité du récepteur. The subject of the invention is also a method for evaluating the pharmacological properties of the compounds capable of binding to the renin receptor protein, called ligands of said receptor, comprising the steps consisting in: a) culturing cells expressing said receptor protein, in the presence of at least one ligand of said receptor; and b) evaluate the capacity of the ligand to modulate the activity of the receptor.

Plus particulièrement, on peut évaluer la capacité d'un ligand à moduler l'activité du récepteur en évaluant la phosphorylation du récepteur. More particularly, the ability of a ligand to modulate the activity of the receptor can be evaluated by evaluating the phosphorylation of the receptor.

La protéine récepteur de la rénine présente en effet dans sa queue cytoplasmique des résidus sérine et tyrosine phosphorylables. The renin receptor protein has phosphorylatable serine and tyrosine residues in its cytoplasmic tail.

On peut également évaluer la modulation de l'activité du récepteur en mesurant par exemple une modification de l'incorporation de thymidine tritiée, de la sécrétion de PAI1, de la génération de GMPC induite par It is also possible to evaluate the modulation of the receptor activity by measuring for example a modification of the incorporation of tritiated thymidine, of the secretion of PAI1, of the generation of GMPC induced by

le peptide natriurétique de type C, ou encore une modification de la vitesse de catalyse de l'angiotensinogène en angiotensine 1.

natriuretic peptide type C, or a change in the rate of catalysis of angiotensinogen to angiotensin 1.

Selon une variante de ce mode de réalisation, on peut de manière avantageuse cultiver lesdites cellules en présence : - soit de concentrations accrues d'au moins un ligand du récepteur de la rénine dont le profil pharmacologique est recherché et d'une concentration déterminée d'au moins un agoniste connu de ce récepteur, tel que la rénine ou la prorénine ; - soit de concentrations accrues d'au moins un agoniste connu du récepteur de la rénine et d'une concentration déterminée d'au moins un ligand de ce récepteur dont le profil pharmacologique est recherché. According to a variant of this embodiment, it is advantageous to cultivate said cells in the presence of: - either increased concentrations of at least one ligand of the renin receptor whose pharmacological profile is sought and a determined concentration of at least one known agonist of this receptor, such as renin or prorenin; - Or increased concentrations of at least one known agonist of the renin receptor and a determined concentration of at least one ligand of this receptor whose pharmacological profile is sought.

Les tests biologiques selon l'invention tels que décrits ci-dessus permettent ainsi d'évaluer le profil pharmacologique des composés testés, notamment de déterminer si les composés testés sont capables d'agir comme agonistes ou antagonistes du récepteur de la rénine selon l'invention. The biological tests according to the invention as described above thus make it possible to evaluate the pharmacological profile of the compounds tested, in particular to determine whether the compounds tested are capable of acting as agonists or antagonists of the renin receptor according to the invention .

Les antagonistes ou agonistes de la liaison rénine/récepteur sont en particulier des candidats particulièrement avantageux pour prévenir et/ou traiter les affections mentionnées ci-dessus, telles que notamment des affections cardiaques, rénales ou cérébrales. Antagonists or agonists of the renin / receptor bond are in particular particularly advantageous candidates for preventing and / or treating the conditions mentioned above, such as in particular cardiac, renal or cerebral affections.

Selon un mode de réalisation préféré, ces antagonistes ou agonistes de la liaison rénine/récepteur peuvent être identifiés rapidement à l'aide d'une méthode de criblage, comprenant la mise en contact d'une molécule à tester avec : (i) un premier partenaire de liaison qui est le récepteur de la rénine ou un fragment de celui-ci qui se fixe à la rénine, et (ii) un deuxième partenaire de liaison qui est la rénine ou un fragment de celle-ci qui se fixe au récepteur, le (s) dit (s) premier et/ou deuxième partenaire (s) de liaison pouvant être marqué (s) de manière à être détectés, et l'évaluation de l'inhibition ou de la stimulation de l'interaction entre lesdits partenaires de liaison par la molécule à tester. According to a preferred embodiment, these antagonists or agonists of the renin / receptor bond can be rapidly identified using a screening method, comprising bringing a molecule to be tested into contact with: (i) a first binding partner which is the renin receptor or a fragment thereof which binds to renin, and (ii) a second binding partner which is renin or a fragment thereof which binds to the receptor, said first and / or second binding partner (s) can be marked so as to be detected, and the evaluation of the inhibition or stimulation of the interaction between said partners of binding by the molecule to be tested.

Pour mettre en oeuvre ces tests de liaison compétitifs, par exemple du type ELISA ou IRMA, on peut donc utiliser un fragment du récepteur qui se fixe à la rénine, à savoir tout ou partie du domaine extramembranaire du récepteur. To implement these competitive binding tests, for example of the ELISA or IRMA type, it is therefore possible to use a fragment of the receptor which binds to renin, namely all or part of the extramembrane domain of the receptor.

L'un ou l'autre de ces partenaires de liaison peut être marqué de manière détectable, les moyens de marquage des protéines étant bien connus de l'homme du métier. Il peut s'agir d'un agent de marquage fluorescent qui se lie chimiquement aux protéines sans dénaturation pour former un fluorochrome colorant qui est un indicateur immunofluorescent utile. L'agent de marquage peut aussi être une enzyme, telle que la peroxydase (HRP) ou la glucose oxydase. Des éléments radioactifs peuvent être également utilisés comme agents de marquage. Either of these binding partners can be detectably labeled, the means for labeling proteins being well known to those skilled in the art. It may be a fluorescent labeling agent which chemically binds to proteins without denaturing to form a coloring fluorochrome which is a useful immunofluorescent indicator. The labeling agent can also be an enzyme, such as peroxidase (HRP) or glucose oxidase. Radioactive elements can also be used as labeling agents.

De manière préférentielle, on utilise une protéine (de préférence, 1 la rénine) fusionnée ou couplée à une protéine de type biotine, glutathion-S- transferase, poly-histidine.... Preferably, a protein (preferably 1 renin) is used which is fused or coupled to a protein of biotin, glutathione-S-transferase, poly-histidine ... type.

L'un ou l'autre des partenaires de liaison (de préférence, le récepteur) peut être immobilisé de manière avantageuse sur une phase solide (membrane, billes, plastique...). Either of the binding partners (preferably the receptor) can be immobilized advantageously on a solid phase (membrane, beads, plastic, etc.).

L'interaction entre les partenaires de liaison est donc ainsi mise en évidence par un test enzymatique, de fluorescence, ou par autoradiographie,... The interaction between the binding partners is therefore demonstrated by an enzymatic, fluorescence test, or by autoradiography, ...

Pour mettre en oeuvre ces tests de liaison compétitifs, on peut également utiliser un BIACORE@ (Biospecific Interaction Analysis CORE de la société Pharmacia). Cet appareil permet de mesurer en temps réel et sans marquage, l'interaction entre lesdits partenaires de liaison ainsi que la modification éventuelle de l'interaction en présence de la molécule à tester, par le biais de la mesure des modifications de résonance induite par toute interaction moléculaire. To implement these competitive binding tests, it is also possible to use a BIACORE @ (Biospecific Interaction Analysis CORE from the company Pharmacia). This device makes it possible to measure in real time and without labeling, the interaction between said binding partners as well as the possible modification of the interaction in the presence of the molecule to be tested, by means of the measurement of the resonance modifications induced by any molecular interaction.

Les molécules sélectionnées par cette méthode peuvent ensuite être soumises à un test de précipitation du récepteur produit dans des cellules de mammifères. Le récepteur est précipité à partir d'un lysat cellulaire grâce à la rénine et révélé par Western Blot ou par toute autre méthode suffisamment sensible. The molecules selected by this method can then be subjected to a precipitation test of the receptor produced in mammalian cells. The receptor is precipitated from a cell lysate by means of renin and revealed by Western Blot or by any other sufficiently sensitive method.

Les molécules dont l'activité agoniste ou antagoniste de l'interaction rénine (ou prorénine) est confirmée sont retenues pour être testées sur des cellules, telles que des cellules rénales, afin d'évaluer leur capacité à stimuler ou inhiber la multiplication cellulaire ou à modifier la composition de la matrice extracellulaire par exemple. Molecules whose agonist or antagonist activity of the renin (or prorenin) interaction is confirmed are selected to be tested on cells, such as renal cells, in order to evaluate their capacity to stimulate or inhibit cell multiplication or to modify the composition of the extracellular matrix for example.

Alternativement, un test double-hybride ou triple-hybride de la levure peut être mis en oeuvre à cette fin (Zhang et al, 1996). Alternatively, a double-hybrid or triple-hybrid yeast test can be used for this purpose (Zhang et al, 1996).

Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. The following examples and figures illustrate the invention without limiting its scope.

LEGENDE DES FIGURES :
La figure 1 représente une analyse en Northern Blot de la distribution tissulaire de l'ARNm du clone N14F. LEGEND OF THE FIGURES:
FIG. 1 represents a Northern Blot analysis of the tissue distribution of the mRNA of the clone N14F.

La figure 2A montre l'expression des sites de liaison de la rénine dans des cellules mésangiales humaines (CMH) transformées avec N14F. La saturation de la liaison du clone 2 de CMH (CMH2, D totale o non spécifique) et sur CM H (x totale, + non spécifique). Figure 2A shows the expression of renin binding sites in human mesangial cells (MHC) transformed with N14F. The saturation of the binding of clone 2 of MHC (MHC2, total D or non-specific) and on MHC H (x total, + non-specific).

La figure 2B représente un graphique de Scatchard de la liaison de la rénine sur CMH2. FIG. 2B represents a Scatchard graph of the binding of renin to CMH2.

La figure 3A représente une analyse de la transcription/traduction in vitro de la protéine de fusion N14F/FLAG (système de lysat de réticulocytes couplé au TNT, Promega) marquée avec de la méthionine 35S (piste A) avec un vecteur vide de contrôle (piste B), par SDS-PAGE à 10 % et fluorographie. FIG. 3A represents an analysis of the in vitro transcription / translation of the fusion protein N14F / FLAG (reticulocyte lysate system coupled to TNT, Promega) labeled with methionine 35S (lane A) with an empty control vector ( lane B), by 10% SDS-PAGE and fluorography.

La figure 3B représente la coprécipitation de la rénine liée aux cellules CMH2. Les cellules sont incubées deux heures à 37 C avec 10 nM de rénine, Iysées et le lysat est immunoprécipité avec un anticorps anti-FLAG. Le produit d'élution est séparé sur SDS-PAGE à 10 %, transféré et mis en présence d'un anticorps polyclonal anti-rénine puis révélé avec un anticorps de chèvre anti-lapin marqué au moyen de phosphatase alcaline. Piste A : rénine humaine recombinante ; piste B : membrane CMH2. FIG. 3B represents the coprecipitation of renin linked to the MHC2 cells. The cells are incubated for two hours at 37 ° C. with 10 nM of renin, lysed and the lysate is immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody. The elution product is separated on 10% SDS-PAGE, transferred and placed in the presence of an anti-renin polyclonal antibody then revealed with an anti-rabbit goat antibody labeled with alkaline phosphatase. Lane A: recombinant human renin; lane B: CMH2 membrane.

La figure 4 représente un profil de phosphorylation du récepteur de la rénine après stimulation par la rénine. Les cellules CMH2 ont été FIG. 4 represents a profile of phosphorylation of the renin receptor after stimulation with renin. CMH2 cells were

incubées avec de la rénine à 50 nM pendant 0, 3 et 10 minutes. Les cellules Iysées sont immunoprécipitées avec un anticorps anti-FLAG couplé à de l'agarose (SIGMA). L'agarose est élué et le produit d'élution est séparé sur un gel SDS-polyacrylamide à 10 % et transféré sur une membrane PVDF. La membrane est mise en contact avec des anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines phosphotyrosine (Chemical International), à gauche, ou phosphosérine (Sigma), à droite, et les bandes sont visualisées par chimioluminescence (système ECL, Amersham Pharmacia Biotech). EXEMPLES :
Exemple 1 :
Clonage du récepteur humain de la rénine
Les auteurs de l'invention ont criblé un million de clones d'une banque commerciale d'expression de rein humain dans des phages lambda gt 11 (Clontech) avec de la rénine humaine recombinante marquée à)' iode.

incubated with renin at 50 nM for 0, 3 and 10 minutes. The lysed cells are immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody coupled to agarose (SIGMA). The agarose is eluted and the elution product is separated on a 10% SDS-polyacrylamide gel and transferred to a PVDF membrane. The membrane is brought into contact with monoclonal antibodies directed against phosphotyrosine proteins (Chemical International), on the left, or phosphoserine (Sigma), on the right, and the bands are visualized by chemiluminescence (ECL system, Amersham Pharmacia Biotech). EXAMPLES:
Example 1:
Cloning of the human renin receptor
The authors of the invention screened a million clones of a commercial library of expression of human kidney in phage lambda gt 11 (Clontech) with recombinant human renin labeled with iodine.

Le criblage de ces phages s'effectue comme suit : 1 x 106 pfu ont été déposés sur des E. coli dans du milieu Y1090 à une densité de 150 000 pfu pour une boîte de 245 x 245 mm. Les réplicats ont été transférés sur des membranes de PVDF pendant trois heures. Les filtres ont été lavés quatre fois dans du tampon phosphate 50 mM contenant 5 % de lait écrémé en poudre, 0,1 % de NP-40 et 0,05 % d'azoture de sodium et incubés dans le même tampon contenant de la rénine 1251 (1 x 106 cpm/ml) dans un sac scellé à chaud pendant 24 heures. Après lavage extensif, les filtres ont été séchés et exposés aux rayons X, à -70oC. La protéine de fusion lambda a été purifiée par dilution répétée et un stock de solution finale à titre élevé a été réalisé en Iysant la plaque avec 2 ml de Tris-HCI à 50 mM, pH 7,5 contenant 100 mM NaCI, 10 mM MgSO4, et 0,01 % de gélatine et deux gouttes de chloroforme. La PCR a été réalisée sur des lysats de phages, en utilisant des amorces spécifiques de lambda gt 11 et le système PCR à longue matrice Expand (Roche). Les produits de PCR ont été sous-clonés dans un vecteur pGEM T-easy (Promega) et amplifiés pour le séquençage. The screening of these phages is carried out as follows: 1 × 10 6 pfu were deposited on E. coli in Y1090 medium at a density of 150,000 pfu for a dish of 245 × 245 mm. The replicates were transferred to PVDF membranes for three hours. Filters were washed four times in 50 mM phosphate buffer containing 5% skimmed milk powder, 0.1% NP-40 and 0.05% sodium azide and incubated in the same buffer containing renin 1251 (1 x 106 cpm / ml) in a heat sealed bag for 24 hours. After extensive washing, the filters were dried and exposed to X-rays, at -70oC. The lambda fusion protein was purified by repeated dilution and a stock of high final solution was produced by lyzing the plate with 2 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 containing 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4. , and 0.01% gelatin and two drops of chloroform. PCR was performed on phage lysates, using specific primers of lambda gt 11 and the Expand long matrix PCR system (Roche). The PCR products were subcloned into a pGEM T-easy vector (Promega) and amplified for sequencing.

La séquence d'un clone (N14F) représentait une nouvelle protéine avec aucune homologie avec une famille quelconque de récepteurs membranaires connue. Le clone positif a été séquencé dans les deux directions en utilisant la méthode de terminaison de chaînes dideoxy. L'intégrité de l'extrémité 5'a été évaluée par amplification rapide de l'extrémité 5'de l'ADNc complémentaire par la réaction en chaîne par la polymérase (RACE) et par comparaison avec des séquences EST dans les bases de données. Le codon d'initiation est entouré de séquences consensus nucléotiques Kozak optimales et le cadre de lecture ouvert code pour une protéine de 350 acides aminés (poids moléculaire : 39,008). L'analyse de l'hydrophobicité de la séquence protéique traduite selon Kyte-Doolittle a montré deux régions hydrophobes. Une région est localisée dans la partie N-terminale (acides aminés 1-16) et est susceptible de représenter un peptide signal, l'autre séquence hydrophobe étant dans la partie C-terminale (acides aminés : 306- 326) et est susceptible de représenter une région transmembranaire. Les 24 acides aminés de la queue cytoplasmique Ser 337, Thr 343, Tyr 335 et Tyr 340 représentent des sites possibles pour la phosphorylation régularice, Tyr 335 apparaissant être le site phosphorylé potentiel le plus probable. The sequence of a clone (N14F) represented a new protein with no homology to any family of known membrane receptors. The positive clone was sequenced in both directions using the dideoxy chain termination method. The integrity of the 5 ′ end was evaluated by rapid amplification of the 5 ′ end of the complementary cDNA by the polymerase chain reaction (RACE) and by comparison with EST sequences in the databases. The initiation codon is surrounded by optimal Kozak nucleotic consensus sequences and the open reading frame codes for a protein of 350 amino acids (molecular weight: 39.008). Analysis of the hydrophobicity of the protein sequence translated according to Kyte-Doolittle showed two hydrophobic regions. One region is located in the N-terminal part (amino acids 1-16) and is capable of representing a signal peptide, the other hydrophobic sequence being in the C-terminal part (amino acids: 306-326) and is capable of represent a transmembrane region. The 24 amino acids of the cytoplasmic tail Ser 337, Thr 343, Tyr 335 and Tyr 340 represent possible sites for regular phosphorylation, Tyr 335 appearing to be the most probable potential phosphorylated site.

Exemple 2 : Expression tissulaire du récepteur de la rénine
Une membrane contenant l'ARNm poly-A+ isolée à partir de tissus humains a été obtenue auprès de Clontech. La quantité d'ARN a été ajustée de manière à ce que le signal d'hybridation de la-actinie soit d'intensité comparable dans chaque piste. Les membranes ont été hybridées et lavées en utilisant le système ExpressHyb (Clontech). Le fragment Not1-Xba1 (1,3 kb) contenant la région codante entière de l'ADNc de clone N14F a été radiomarqué avec le kit de marquage Priment (Strategene) en utilisant du 32p~ dCTP. Après hybridation, un fort signal correspondant à une bande d'ARNm de 2,4 kb a été détecté dans le coeur, le cerveau et le placenta, un signal plus Example 2 Tissue Expression of the Renin Receptor
A membrane containing poly-A + mRNA isolated from human tissue was obtained from Clontech. The amount of RNA was adjusted so that the actinia hybridization signal was of comparable intensity in each lane. The membranes were hybridized and washed using the ExpressHyb system (Clontech). The Not1-Xba1 fragment (1.3 kb) containing the entire coding region of the cDNA of clone N14F was radiolabeled with the Priment labeling kit (Strategene) using 32p ~ dCTP. After hybridization, a strong signal corresponding to a 2.4 kb mRNA band was detected in the heart, brain and placenta, a stronger signal

faible étant observé dans le foie, le pancréas et le rein tandis que l'ARNm était à peine détectable dans le poumon et le muscle squelettique (figure 1).

low being seen in the liver, pancreas and kidney while mRNA was barely detectable in the lung and skeletal muscle (Figure 1).

Chez la souris, l'analyse par Northern Blot avec une sonde de souris montre une forte expression du récepteur de la rénine dans le cerveau, dans l'oeil et dans le rein, et à un moindre degré dans le coeur et le foie. In mice, analysis by Northern Blot with a mouse probe shows a strong expression of the renin receptor in the brain, in the eye and in the kidney, and to a lesser degree in the heart and the liver.

Exemple 3 :
Analyse de la capacité de liaison à la rénine de cellules transfectées par l'ADNc cloné
L'identification de l'ADNc cloné à partir de la banque de rein humain a été réalisée par transfection stable de cellules mésangiales humaines immortalisées et analyse de la capacité de liaison à la rénine des cellules transfectées ainsi que des effets de la rénine sur le profil de phosphorylation du récepteur. Le fragment Not1-Xba1 dans pADNc 3.1 a été utilisé pour transfecter deux différentes lignées cellulaires mésangiales humaines (M12 : Sraer et ai, 1996 ; et CMH : Banas et al, 1999) en utilisant la méthode Fugen@ (Roche). On a observé sur les cellules M12 dérivées de cellules mésangiales humaines une liaison spécifique à la rénine marquée humaine avec une constante de dissociation (Kd) de 1 nM et 2 000 sites de liaison par cellules (Nguyen et al, 1996). Les cellules M12 ont été aussi détectées positives pour N14F par PCR utilisant des amorces dans la région codante. Example 3:
Analysis of the renin-binding capacity of cells transfected with cloned cDNA
The identification of the cloned cDNA from the human kidney bank was carried out by stable transfection of immortalized human mesangial cells and analysis of the renin binding capacity of the transfected cells as well as the effects of renin on the profile. of phosphorylation of the receptor. The Not1-Xba1 fragment in pDNA 3.1 was used to transfect two different human mesangial cell lines (M12: Sraer et ai, 1996; and MHC: Banas et al, 1999) using the Fugen @ method (Roche). Specific binding to human labeled renin has been observed in M12 cells derived from human mesangial cells with a dissociation constant (Kd) of 1 nM and 2,000 cell binding sites (Nguyen et al, 1996). M12 cells were also detected positive for N14F by PCR using primers in the coding region.

Huit clones de transformants stables M12 sélectionnés par résistance au G418 ont été testés. Ils ont tous montré une affinité similaire à celles des cellules parentes (de 1,9 à 3,0 nM), mais présentaient un nombre accru de sites de liaison allant de 7 000 à 36 000 sites par cellules. En revanche, les cellules CMH dérivées des cellules mésangiales foetales humaines ne liaient pas spécifiquement la rénine et n'exprimaient pas N14F ni par PCR avec des amorces spécifiques de N14F ni par analyse en Northern Blot. Eight clones of stable M12 transformants selected by resistance to G418 were tested. They all showed similar affinity to that of the parent cells (1.9 to 3.0 nM), but had an increased number of binding sites ranging from 7,000 to 36,000 sites per cell. In contrast, MHC cells derived from human fetal mesangial cells did not specifically bind renin and expressed N14F neither by PCR with primers specific for N14F nor by Northern Blot analysis.

Des cellules CMH, immortalisées avec un plasmide contenant un gène de résistance à la néomycine ont été transfectées avec le fragment Not1Xba1 de N14F sous-cloné dans pADNc 3.1 avec un gène de résistance à la MHC cells, immortalized with a plasmid containing a neomycin resistance gene, were transfected with the Not1Xba1 fragment of N14F subcloned into pDNA 3.1 with a resistance gene.

zéocine et marqué ("tagué") sur l'extrémité 3'avec un peptide FLAG (Asp-TyrLys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), par introduction en PCR de la séquence (GAC- TAC-MG-GAC-GAC-GAT-GAC-MG) avant le codon stop. Deux clones des transformants stables de CMH (CMH2 et CMH4) ont été analysés pour l'expression d'un récepteur par des tests de liaison.

zeocin and labeled (“tagged”) on the 3 ′ end with a FLAG peptide (Asp-TyrLys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), by PCR introduction of the sequence (GAC- TAC-MG-GAC- GAC-GAT-GAC-MG) before the stop codon. Two clones of the stable transformants of MHC (MHC2 and MHC4) were analyzed for the expression of a receptor by binding tests.

Les résultats montrent que ces cellules lient spécifiquement la rénine. La liaison à la rénine est réversible (100 % de rénine liée marquée aux cellules était dissociée après 1,5 à 2 heures). La liaison spécifique était inhibée par la prorénine 100 nM et la rénine préincubée avec un inhibiteur du site actif (Fischli et al, 1991). La liaison de la rénine sur les cellules transformantes est saturable avec un Kd de 5,0 nM et un Bmax de 2,8 fmole pour 100 000 cellules correspondant à approximativement 17 000 sites par cellules pour CMH2, et un Kd de 0,8 nM et un Bmax de 1,8 fmoles pour 100 000 cellules approximativement 11 000 sites par cellules pour CMH4, tandis que les cellules CMH contrôles ne présentaient aucune liaison rénine spécifique (figure 2). The results show that these cells specifically bind renin. Binding to renin is reversible (100% of bound renin labeled with cells was dissociated after 1.5 to 2 hours). Specific binding was inhibited by 100 nM prorenin and preincubated renin with an active site inhibitor (Fischli et al, 1991). The binding of renin to transforming cells is saturable with a Kd of 5.0 nM and a Bmax of 2.8 fmole per 100,000 cells corresponding to approximately 17,000 sites per cell for MHC2, and a Kd of 0.8 nM and a Bmax of 1.8 fmoles per 100,000 cells approximately 11,000 sites per cell for MHC4, while the MHC control cells showed no specific renin binding (Figure 2).

La spécificité de la liaison a été en outre évaluée par des expériences de compétition avec d'autres aspartyl-protéases, la pepsine et la cathepsine D. The specificity of the binding was further evaluated by competitive experiments with other aspartyl proteases, pepsin and cathepsin D.

Exemple 4 :
Confirmation de la capacité du récepteur à lier la rénine
Pour confirmer la capacité du récepteur tagué avec le peptide FLAG à lier la rénine, les auteurs de la présente invention ont réalisé des expériences de coprécipitation des cellules incubées avec la rénine, imunoprécipitées avec un anticorps ANTI-FLAG et révélées par un anticorps anti-rénine. Example 4:
Confirmation of the receptor's ability to bind renin
To confirm the capacity of the receptor tagged with the FLAG peptide to bind renin, the authors of the present invention carried out experiments of coprecipitation of cells incubated with renin, imunoprecipitated with an ANTI-FLAG antibody and revealed by an anti-renin antibody .

Plus précisément, les cellules ont été incubées deux heures à 37 C avec 10 nM de rénine Iysée et le lysat immunoprécipité avec un anticorps anti-FLAG. Le produit d'élution a été séparé sur SDS-PAGE à 10 %, mis en contact avec un anticorps polyclonal anti-rénine et révélé par un anticorps de chèvre anti-lapin marqué à la phosphatase alcaline (figure 3). More specifically, the cells were incubated for two hours at 37 ° C. with 10 nM of lysed renin and the lysate immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody. The elution product was separated on 10% SDS-PAGE, contacted with an anti-renin polyclonal antibody and revealed by an anti-rabbit goat antibody labeled with alkaline phosphatase (FIG. 3).

Pour évaluer le profil de phosphorylation du récepteur de la rénine après stimulation par la rénine, les cellules CMH2 ont été incubées avec de la rénine 50 nM pendant 0,3 et 10 minutes. Les cellules ont été Iysées dans du Tris 10 mM pH 7,4, NaCI 150 mM contenant 1 % de Triton X100, PMSF 1 mM, Trasylol 100 U/m !, EDTA 5 mM, fluorure de sodium 50 mM, et vanadate de sodium 0,2 mM. Le lysat a été immunoprécipité avec un anticorps antiFLAG couplé à de l'agarose (Sigma). L'agarose a été éluée avec de la glycine 50 mM, pH 3,5 et le produit d'elution a été séparé sur un gel SDSpolyacrylamide à 10 % et transféré sur une membrane PVDF. La membrane a été mise en contact avec des anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines-phosphotyrosine (Chemicon International) ou-phosphosérine (Sigma) et les bandes ont été visualisées par chimioluminescence. To assess the phosphorylation profile of the renin receptor after stimulation with renin, MHC2 cells were incubated with 50 nM renin for 0.3 and 10 minutes. The cells were lyzed in 10 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl containing 1% Triton X100, 1 mM PMSF, 100 U / m Trasylol, 5 mM EDTA, 50 mM sodium fluoride, and sodium vanadate 0.2 mM. The lysate was immunoprecipitated with an antiFLAG antibody coupled to agarose (Sigma). The agarose was eluted with 50 mM glycine, pH 3.5 and the elution product was separated on a 10% SDSpolyacrylamide gel and transferred to a PVDF membrane. The membrane was brought into contact with monoclonal antibodies directed against proteins-phosphotyrosine (Chemicon International) or -phosphoserine (Sigma) and the bands were visualized by chemiluminescence.

L'analyse du profil de phosphorylation du récepteur après stimulation par la rénine a montré que le récepteur était phosphorylé sur les résidus sérines et tyrosines (figure 4). La phosphorylation des résidus sérines intervient plus rapidement que celle des tyrosines, et était déjà détectable après trois minutes d'un contact avec la rénine, tandis que la phosphorylation des résidus tyrosines apparaissait après 10 minutes. La protéine immunoprécipitée avait un poids moléculaire apparent de 44-47 kD, qui est donc plus élevé que le produit de traduction in vitro (39 kD), cette observation indiquant que des modifications post-traductionnelles étaient intervenues dans la cellule eucaryote. Les caractéristiques de liaison à la rénine des cellules transfectées de manière stable par l'ADNc N14F et la phosphorylation du récepteur induite par la rénine indiquent l'expression d'un récepteur de la rénine fonctionnelle. Analysis of the phosphorylation profile of the receptor after stimulation with renin showed that the receptor was phosphorylated on the serine and tyrosine residues (FIG. 4). Phosphorylation of serine residues occurs more rapidly than that of tyrosines, and was already detectable after three minutes of contact with renin, while phosphorylation of tyrosine residues appeared after 10 minutes. The immunoprecipitated protein had an apparent molecular weight of 44-47 kD, which is therefore higher than the in vitro translation product (39 kD), this observation indicating that post-translational modifications had occurred in the eukaryotic cell. The renin-binding characteristics of cells stably transfected with N14F cDNA and renin-induced receptor phosphorylation indicate the expression of a functional renin receptor.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Admiraal et al, (1999), J. Hypertens. 17 (5) : 621-629 - et al, (1982) PNAS USA, 79, 917-921 (1982).

BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES

Admiraal et al, (1999), J. Hypertens. 17 (5): 621-629 - et al, (1982) PNAS USA, 79, 917-921 (1982).

Campbell et Valentijn (1994) Identification of vascular reninbinding proteins by chemical cross-linking : inhibition of binding of renin by renin inhibitors. J. Hypertens., 12 : 879-890. Campbell and Valentijn (1994) Identification of vascular reninbinding proteins by chemical cross-linking: inhibition of binding of renin by renin inhibitors. J. Hypertens., 12: 879-890.

- Chansel et al, (1987) Am. J. Physiol., 252 (1) : 32-8 - Fischli et al, (1991) Hypertension, 8 : 22-31 - Hogan et al, (1994) Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press - Inoue et al, (1991), J. Biol. Chem., 266 : 11896-900 - Koeh) er et Milstein, (1975) Nature, 256,495-497

- Maru et ai, (1996), J. Biol. Chem., 271 : 16294-9 - Nguyen et ai, (1996) Specific receptor binding of renin on human mesangial cells in culture increases plasminogen activator inhibitor-1 antigen, Kidney Int., 50 : 1897-1903 - Nguyen et al, (1998), Mise en évidence d'un récepteur de la

rénine sur les cellules mésangiales humaines : effets sur le PAI1 et sur le GMPc, Néphrologie, 19 : 411-416. - Chansel et al, (1987) Am. J. Physiol., 252 (1): 32-8 - Fischli et al, (1991) Hypertension, 8: 22-31 - Hogan et al, (1994) Manipulating the Mouse Embryo , Cold Spring Harbor Laboratory Press - Inoue et al, (1991), J. Biol. Chem., 266: 11896-900 - Koeh) er and Milstein, (1975) Nature, 256,495-497

- Maru et ai, (1996), J. Biol. Chem., 271: 16294-9 - Nguyen et ai, (1996) Specific receptor binding of renin on human mesangial cells in culture increases plasminogen activator inhibitor-1 antigen, Kidney Int., 50: 1897-1903 - Nguyen et al, ( 1998), Demonstration of a receptor for the

renin on human mesangial cells: effects on PAI1 and on cGMP, Nephrology, 19: 411-416.

- Sealey et al (1996) : Specific Prorenin/Renin binding (ProBP) Identification and Characterization of a novel membrane site, Am. J. - Sealey et al (1996): Specific Prorenin / Renin binding (ProBP) Identification and Characterization of a novel membrane site, Am. J.

Hypertens., 9 : 491-502. Hypertens., 9: 491-502.

- Takahashi et al, (1983), J. Biol. 93 : 1583-94 - Van Kesteren et al, (1997) Mannose 6-Phosphate ReceptorMediated internalization and Activation of Prorenin by Cardiac Cells, Hypertension, 30 : 1389-1396. - Takahashi et al, (1983), J. Biol. 93: 1583-94 - Van Kesteren et al, (1997) Mannose 6-Phosphate ReceptorMediated internalization and Activation of Prorenin by Cardiac Cells, Hypertension, 30: 1389-1396.

- Zhang et al, (1996) A yeast three-hybrid-method to clone ternary protein complex components, Analytical Biochemistry, 242,68-72. - Zhang et al, (1996) A yeast three-hybrid-method to clone ternary protein complex components, Analytical Biochemistry, 242,68-72.

Claims

REVENDICATIONS

1. Protéine isolée à activité de récepteur de la rénine, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ! D n 2, ou no 8. 1. Isolated protein with renin receptor activity, comprising the amino acid sequence SEQ! D no 2, or no 8.

2. Polypeptide isolé comprenant la séquence d'acides aminés SEO ID no 4. 2. Isolated polypeptide comprising the amino acid sequence SEO ID No. 4.

3. Polypeptide isolé comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID no 6. 3. Isolated polypeptide comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 6.

4. Acide nucléique isolé, comprenant une séquence nucléotidique codant pour une protéine selon la revendication 1, de préférence comprenant la séquence choisie parmi SEQ ID no 1, ou no 7. 4. Isolated nucleic acid, comprising a nucleotide sequence coding for a protein according to claim 1, preferably comprising the sequence chosen from SEQ ID No. 1, or No. 7.

5. Acide nucléique isolé, comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon la revendication 2, de préférence la séquence SEQ ID no 3. 5. An isolated nucleic acid, comprising a nucleotide sequence coding for a polypeptide according to claim 2, preferably the sequence SEQ ID No. 3.

6. Acide nucléique isolé, comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon la revendication 3, de préférence la séquence SEQ ID no 5. 6. Isolated nucleic acid, comprising a nucleotide sequence coding for a polypeptide according to claim 3, preferably the sequence SEQ ID No. 5.

7. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 4 à 6. 7. Cloning and / or expression vector containing a nucleic acid according to any one of claims 4 to 6.

8. Cellule hôte transfectée par un vecteur selon la revendication 7. 8. Host cell transfected with a vector according to claim 7.

9. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6, pour l'obtention de sondes ou d'amorces ayant au moins 15 nucléotides, qui hybrident spécifiquement avec la séquence d'acide nucléique des 9. Use of a nucleic acid according to one of claims 4 to 6, for obtaining probes or primers having at least 15 nucleotides, which specifically hybridize with the nucleic acid sequence of

revendications 4 à 6, ou son complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation. claims 4 to 6, or its complement, under stringent hybridization conditions.

10. Procédé de production d'une protéine récepteur de la rénine recombinant ou d'un polypeptide fragment de celle-ci, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6, est transféré dans une cellule hôte, qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression d'une protéine ou d'une polypeptide selon la revendication 1,2 ou 3, respectivement. 10. A method for producing a recombinant renin receptor protein or a polypeptide fragment thereof, in which a vector containing a nucleic acid according to one of claims 4 to 6, is transferred into a host cell, which is cultured under conditions allowing expression of a protein or polypeptide according to claim 1,2 or 3, respectively.

11. Anticorps dirigé contre la protéine ou le polypeptide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3. 11. Antibodies directed against the protein or the polypeptide as defined in one of claims 1 to 3.

12. Utilisation d'au moins un anticorps selon la revendication 11 pour la détection ou la purification d'une protéine ou le polypeptide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique. 12. Use of at least one antibody according to claim 11 for the detection or purification of a protein or the polypeptide as defined in one of claims 1 to 3 in a biological sample.

13. Kit comprenant : - au moins un anticorps selon la revendication 11, éventuellement fixé sur un support ; - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre la protéine ou le polypeptide de l'une des revendications 1 à 3 et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes. 13. Kit comprising: - at least one antibody according to claim 11, optionally attached to a support; - Means for revealing the formation of specific antigen / antibody complexes between the protein or the polypeptide of one of claims 1 to 3 and said antibody and / or means for quantifying these complexes.

14. Procédé d'obtention d'un animal non humain dans lequel soit on invalide le gène codant pour la protéine telle que définie à la revendication 1, soit on intègre dans son génome une séquence recombinante codante pour ladite protéine. 14. Method for obtaining a non-human animal in which either the gene coding for the protein as defined in claim 1 is invalidated, or a recombinant sequence coding for said protein is integrated into its genome.

15. Animal non humain susceptible d'être obtenu par le procédé de la revendication 14. 15. A non-human animal capable of being obtained by the process of claim 14.

16. Procédé de détection de l'expression du récepteur de la rénine dans un échantillon cellulaire ou tissulaire, comprenant les étapes consistant à : -préparer l'ARN dudit échantillon ; - mettre en contact ledit ARN obtenu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique tel que défini dans la revendication 4 ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression du récepteur de la rénine. 16. A method of detecting the expression of the renin receptor in a cell or tissue sample, comprising the steps consisting in: preparing the RNA of said sample; - contacting said RNA obtained with a probe having a nucleotide sequence capable of specifically hybridizing with a nucleic acid as defined in claim 4; - detect the presence of mRNA hybridizing with this probe, indicative of the expression of the renin receptor.

17. Procédé de détection in vitro de l'expression du récepteur de la rénine dans des cellules ou un tissu par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact lesdites cellules ou ledit tissu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique tel que défini dans la revendication 4 ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression du récepteur de la rénine. 17. A method of in vitro detection of the expression of the renin receptor in cells or a tissue by in situ hybridization, comprising the steps consisting in: - bringing said cells or said tissue into contact with a probe having a nucleotide sequence capable to specifically hybridize with a nucleic acid as defined in claim 4; - detect the presence of mRNA hybridizing with this probe, indicative of the expression of the renin receptor.

18. Procédé de criblage de composés susceptibles de se lier à la protéine récepteur selon la revendication 1, appelés ligands dudit récepteur, dans lequel on met en contact lesdits composés avec ladite protéine récepteur ou un polypeptide selon la revendication 2 et on évalue le taux de liaison entre lesdits composés et ladite protéine récepteur. 18. A method of screening for compounds capable of binding to the receptor protein according to claim 1, called ligands for said receptor, in which said compounds are brought into contact with said receptor protein or a polypeptide according to claim 2 and the level of bond between said compounds and said receptor protein.

19. Procédé d'évaluation des propriétés pharmacologiques des composés capables de se lier à la protéine récepteur selon la revendication 1, appelés ligands du récepteur de la rénine, comprenant les étapes consistant à : a) cultiver des cellules exprimant ladite protéine récepteur, en présence d'au moins un ligand dudit récepteur ; et b) évaluer la capacité du ligand à moduler l'activité du récepteur. 19. A method for evaluating the pharmacological properties of the compounds capable of binding to the receptor protein according to claim 1, called renin receptor ligands, comprising the steps consisting in: a) culturing cells expressing said receptor protein, in the presence at least one ligand of said receptor; and b) evaluate the capacity of the ligand to modulate the activity of the receptor.

20. Méthode de criblage de molécules inhibant ou activant la liaison entre la rénine et le récepteur, comprenant : - la mise en contact d'une molécule à tester avec (i) un premier partenaire de liaison qui est la protéine récepteur telle que définie à la revendication 1 ou un fragment de celui-ci capable de fixer la rénine de préférence un polypeptide selon la revendication 2, et (ii) un deuxième partenaire de liaison qui est la rénine ou un fragment de celle-ci capable de fixer la protéine récepteur telle que définie à la revendication 1, le (s) dit (s) premier et/ou deuxième partenaire (s) de liaison étant au besoin marqué (s) de manière à être détectés, - l'évaluation de l'inhibition ou de l'activation de l'interaction entre lesdits partenaires de liaison par la molécule à tester. 20. A method of screening for molecules inhibiting or activating the binding between renin and the receptor, comprising: - bringing a molecule to be tested into contact with (i) a first binding partner which is the receptor protein as defined in claim 1 or a fragment thereof capable of binding renin preferably a polypeptide according to claim 2, and (ii) a second binding partner which is renin or a fragment thereof capable of binding the receptor protein as defined in claim 1, the said first and / or second binding partner (s) being, if necessary, marked so as to be detected, - the evaluation of the inhibition or activation of the interaction between said binding partners by the molecule to be tested.

21. Composition pharmaceutique comprenant : i) une protéine telle que définie dans la revendication 1, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable ; ou ii) un acide nucléique tel que défini dans la revendication 4, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 21. A pharmaceutical composition comprising: i) a protein as defined in claim 1, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle; or ii) a nucleic acid as defined in claim 4, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.

22. Composition pharmaceutique comprenant : i) un anticorps dirigé contre la protéine de la revendication 1, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable ; ou ii) un acide nucléique anti-sens de l'acide nucléique tel que défini dans la revendication 4, bloquant son expression, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 22. A pharmaceutical composition comprising: i) an antibody directed against the protein of claim 1, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle; or ii) a nucleic acid antisense nucleic acid as defined in claim 4, blocking its expression, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.

23. Utilisation d'une composition pharmaceutique selon la revendication 21 ou 22 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'affections impliquant le système rénine/angiotensine. 23. Use of a pharmaceutical composition according to claim 21 or 22 for the manufacture of a medicament intended for the treatment of conditions involving the renin / angiotensin system.