FR2650186A1 - Monoclonal antibodies directed towards proteins involved in platelet functions, their application as a diagnostic and therapeutic agent - Google Patents

Abstract

The invention relates to monoclonal antibodies, or the idiotypic fragments of these monoclonal antibodies, which recognise antigens involved in the steps of platelet physiology, and especially in platelet adhesion and/or aggregation and/or secretion reactions and/or adhesion reactions of endothelial cells, which antibodies have the capacity to modulate platelet functions or endothelial functions induced by a low concentration of agonists, for example in the presence of 2.5 to 5 mu M ADP, 2 mu g/ml of collagen and 0.016 U/ml of thrombin, and the capacity of which antibodies to inhibit platelet functions is considerably reduced or even absent in the presence of high concentrations of agonists, for example in the presence of thrombin concentrations above 0.5 U/ml or collagen concentrations above 10 mu g/ml. It also relates to the diagnostic and therapeutic application of these antibodies.

Description

monoclonaux dirigés contre des protéines impliquées dans les fonctions plaquettaires. Leur avolication en tant au' agent diagnostique et théraneutipue. monoclonals directed against proteins involved in platelet functions. Their avolication as diagnostic agent and theraneutipue.

L'invention concerne des anticorps onoclonaux dirigés contre des protéines impliquées dans les fonctions plaquettaires et leur application en tant qu'agent diagnostique et thérapeutique. The invention relates to onoclonal antibodies directed against proteins involved in platelet functions and their application as a diagnostic and therapeutic agent.

Les mécanismes de l'adhésion, de 1'agrégation et de la sécrétion plaquettaires qui entrent dans les différentes étapes de la physiologie plaquettaire, font intervenir in vivo de nombreuses protéines et glycoprotéines, présentes au niveau des plaquettes, de façon permanente ou transitoire, ou/et présentes au niveau d'autres cellules telles que des cellules endothêliales. Certaines de ces protéines ou glycoprotéines ont été identifiées et des anticorps, notant des anticorps monoclonaux les reconnaissant, ont été préparés. The mechanisms of platelet adhesion, aggregation and secretion which enter into the various stages of platelet physiology, involve in vivo many proteins and glycoproteins, present at the level of platelets, permanently or transiently, or / and present in other cells such as endothelial cells. Some of these proteins or glycoproteins have been identified and antibodies, noting monoclonal antibodies recognizing them, have been prepared.

En particulier, des anticorps utilisables en tant que parqueurs d'activation plaquettaire pour des tests de diagnostic ont déjà été décrits. Le brevet américain 4 783 330 concerne par exemple des anticorps du type 1gG1 qui reconnaissent des plaquettes activées et au contraire ne reconnaissent pas les plaquettes inactivées, les granules aiurophiles des monocytes et des granulocytes. De préférence, ces anticorps monoclonaux reconnaissent une glycoprotéine de poids moléculaire voisin de 140 000 Da (gp140) sur des plaquettes humaines activées. In particular, antibodies which can be used as platelet activators for diagnostic tests have already been described. American patent 4,783,330 relates, for example, to antibodies of the 1gG1 type which recognize activated platelets and on the contrary do not recognize inactivated platelets, the aiurophilic granules of monocytes and granulocytes. Preferably, these monoclonal antibodies recognize a glycoprotein of molecular weight close to 140,000 Da (gp140) on activated human platelets.

Les inventeurs se sont maintenant plus particulièrement intéressés aux pathologies liées à la physiologie plaquettaire et à leur traitement par des moyens contrôlés. Dans cette optique, ils ont mis au point de nouveaux anticorps dirigés contre des épitopes particuliers de protéines, glycoprotéines ou complexes protéiques impliqués dans la physiologie plaquettaire. Ces anticorps ont été sélectionnés pour leur capacité spécifique d'interférence avec les fonctions plaquettaires. The inventors are now more particularly interested in pathologies linked to platelet physiology and their treatment by controlled means. To this end, they have developed new antibodies directed against specific epitopes of proteins, glycoproteins or protein complexes involved in platelet physiology. These antibodies were selected for their specific ability to interfere with platelet functions.

L'invention concerne donc de nouveaux anticorps dirigés contre des protéines, des glycoprotéines ou des complexes protéiques intervenant spécifiquement dans les réactions d'adhésion, d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire pouvant conduire à la formation de thrombus ou encore impliquées dans les processus l'inflammation ou de cicatrisation. Ces anticorps présentent l'avantage tout à fait intéressant dans le cadre de l'invention d'être capables de moduler les réactions mettant en oeuvre les plaquettes, telles qu'elles ont été décrites ci-dessus. The invention therefore relates to new antibodies directed against proteins, glycoproteins or protein complexes intervening specifically in adhesion, aggregation and / or platelet secretion reactions which may lead to the formation of thrombi or else involved in the processes. inflammation or scarring. These antibodies have the advantage which is quite advantageous in the context of the invention of being capable of modulating the reactions using the platelets, as they have been described above.

L'invention concerne en outre, la préparation et la sélection de ces anticorps monoclonaux ainsi que leur utilisation pour le diagnostic ou comme agent thérapeutique. Ils peuvent ainsi être appliqués au traitement de pathologies telles que les maladies cardiovasculaires, l'athérosclérose, les rétinopathies, le diabète et également, pour certains d'entre eux, dans le traitement des métastases tumorales. The invention further relates to the preparation and selection of these monoclonal antibodies as well as their use for diagnosis or as a therapeutic agent. They can thus be applied to the treatment of pathologies such as cardiovascular diseases, atherosclerosis, retinopathies, diabetes and also, for some of them, in the treatment of tumor metastases.

Dans le cadre des définitions ci-dessus, l'invention concerne des anticorps monoclonaux, ou les fragments idiotypiques de ces anticorps monoclonaux, reconnaissant des antigènes impliqués, soit -dans au moins une des étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire-, soit dans l'adhésion des cellules endothéliales ou encore dans les deux types d'actions, caractérisés en ce qu'ils ont la capacité de moduler les fonctions plaquettaires ou les fonctions endothéliales, induites par une faible concentration d'agonistes, par exemple en présence de 2.5 à 5 uM d'ADP, ou 2 pg/ml de collagene, -ou 0,016 U/ml de thrombine et en ce que leur capacité d'inhibition des fonctions plaquettaires est considérablement réduite voir absente en présence de concentrations élevées d'agonistes, par exemple en présence de concentrations en thrombine supérieure à 0,5 U/ml ou en collagène supérieure à 10 ug/ml.  In the context of the above definitions, the invention relates to monoclonal antibodies, or the idiotypic fragments of these monoclonal antibodies, recognizing the antigens involved, either in at least one of the stages of platelet physiology and in particular in the reactions of adhesion and / or aggregation and / or platelet secretion, either in the adhesion of endothelial cells or in both types of actions, characterized in that they have the capacity to modulate the platelet functions or endothelial functions, induced by a low concentration of agonists, for example in the presence of 2.5 to 5 μM of ADP, or 2 μg / ml of collagen, -or 0.016 U / ml of thrombin and in that their capacity for inhibition platelet function is considerably reduced or even absent in the presence of high concentrations of agonists, for example in the presence of thrombin concentrations greater than 0.5 U / ml or greater collagen at 10 ug / ml.

Les fragments idiotypiques dont il est question ci-dessus sont des fragments Fab, Fab', F(ab' )2 préparés selon les > éthodes classiques, notamment par digestion enzymatique par exemple avec la pepsine ou la papaine, selon le résultat recherché. The idiotypic fragments referred to above are Fab, Fab ', F (ab') 2 fragments prepared according to the> conventional methods, in particular by enzymatic digestion, for example with pepsin or papain, depending on the desired result.

Ces fragments idiotypiques sont encore caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus de tout ou partie de leur fraction constante Fc. These idiotypic fragments are further characterized in that they are devoid of all or part of their constant fraction Fc.

Des anticorps monoclonaux ainsi définis, ou leurs fragments idiotypiques présentent la propriété particulièrement intéressante de se fixer sur un épitope d'une protéine, d'une glycoprotéine ou d'un complexe protéique, de telle sorte que l'activité physiologique normale de cette protéine, glycoprotéine ou de ce complexe, est modulée. Monoclonal antibodies thus defined, or their idiotypic fragments have the particularly advantageous property of binding to an epitope of a protein, of a glycoprotein or of a protein complex, so that the normal physiological activity of this protein, glycoprotein or this complex, is modulated.

Dans la suite les termes de protéine, glycoprotéine. complexe protéique seront parfois regroupés scous le terme antigène. In the following the terms of protein, glycoprotein. protein complex will sometimes be grouped together under the term antigen.

Cette modulation de l'activité physiologique normale plaquettaire ou au niveau des cellules endothéliales dont question ci-dessus correspond, dans le cadre des définitions de l'invention, à une inhibition partielle de certaines fonctions telles que les réactions d'adhésion, d'agrégation ou de sécrétion ou de plusieurs de ces réactions, qui ont lieu à la suite de stimulation provenant par exemple de lésions au niveau de l'endothélium vasculaire ou encore à une inhibition de réactions au niveau des cellules endothéliales. Cette limitation doit être telle que l'action des anticorps choisis ou de leurs fragments,. This modulation of normal platelet physiological activity or at the level of endothelial cells of which the question above corresponds, within the framework of the definitions of the invention, to a partial inhibition of certain functions such as adhesion and aggregation reactions. or secretion or of several of these reactions, which take place following stimulation originating for example from lesions at the level of the vascular endothelium or alternatively at an inhibition of reactions at the level of endothelial cells. This limitation must be such that the action of the antibodies chosen or of their fragments.

éventuellement en combinaison avec d'autres substances, prévient la formation d'un thrombus.possibly in combination with other substances, prevents the formation of a thrombus.

Les propriétés de modulation des anticorps selon l'invention peuvent varier avec la nature de l'anticorps et l'antigène reconnu. En tout état de cause, les anticorps de l'invention n'inhibent plus les fonctions plaquettaires en présence de fortes concentrations de thrombine (supérieure à 0,5 U/ml) ou de collagène (supérieure à 10 ug/ml).  The modulation properties of the antibodies according to the invention can vary with the nature of the antibody and the recognized antigen. In any event, the antibodies of the invention no longer inhibit platelet functions in the presence of high concentrations of thrombin (greater than 0.5 U / ml) or collagen (greater than 10 ug / ml).

Il en résulte que ces anticorps peuvent être utilisés dans le traitement de pathologies telles que celles citées précédemment, sans présenter le désavantage de bloquer de manière excessive les processus physiologiques plaquettaires, ce qui risquerait d'entrainer des phénomènes hémorragiques. As a result, these antibodies can be used in the treatment of pathologies such as those mentioned above, without having the disadvantage of excessively blocking the physiological platelet processes, which would risk causing hemorrhagic phenomena.

Selon un premier aspect préféré de l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope d'une protéine, d'une glycoprotéine ou d'un complexe protéique choisi(e) parmi le groupe des glycoprotéine GMP140, complexe gpIIb-IIIa, complexe gpIa-IIa, complexe gpIc-IIa ou glycoprotéine gpIIa.  According to a first preferred aspect of the invention, the monoclonal antibodies or their idiotypic fragments are characterized in that they recognize an epitope of a protein, a glycoprotein or a protein complex chosen from the group of GMP140 glycoprotein, gpIIb-IIIa complex, gpIa-IIa complex, gpIc-IIa complex or gpIIa glycoprotein.

Les antigènes ci-dessus, interviennent à différents niveaux de la physiologie plaquettaire. The above antigens are involved at different levels of platelet physiology.

La GMP140 a été décrite par McEver et al dans
Cell (vol 56 - 1033.1044, 24 Mars 1989 > . Les autres antigènes ont ' été décrits dans différentes publications telles que McEver et al, (1984) J. Biol. GMP140 has been described by McEver et al in
Cell (vol 56 - 1033.1044, March 24, 1989>. The other antigens have been described in various publications such as McEver et al, (1984) J. Biol.

Chem. 259: 9799-9804; Hsu-Lin, S.C. et al, (1984) J.Chem. 259: 9799-9804; Hsu-Lin, S.C. et al, (1984) J.

Biol. Chem. 259: 9121-9126; Kunicki, T.J. et al, (li88) J. Biol. Chem. 263: 4516-4519 et Hemler, M.E.Biol. Chem. 259: 9121-9126; Kunicki, T.J. et al, (li88) J. Biol. Chem. 263: 4516-4519 and Hemler, M.E.

et al, (1988), J. Biol. Chem. 263, 7660-7665.et al, (1988), J. Biol. Chem. 263, 7660-7665.

Selon un autre aspect préféré de l'invention une catégorie d'anticorps ou leurs fragments idiotypiques est encore caractérisée en ce que ces anticorps ou fragments reconnaissent un épitope ayant un effet fonctionnel vis à vis des fonctions normalement exercées par l'antigène qui le contient. According to another preferred aspect of the invention, a category of antibodies or their idiotypic fragments is further characterized in that these antibodies or fragments recognize an epitope having a functional effect with respect to functions normally exercised by the antigen which contains it.

Selon un autre aspect préféré de l'invention, certains anticorps monoclonaux sont sensibles à la réduction chimique de l'antigène qu'ils reconnaissent. According to another preferred aspect of the invention, certain monoclonal antibodies are sensitive to the chemical reduction of the antigen which they recognize.

En conséquence, ils sont inactivés lorsque l'antigène normalement reconnu est réduit chimiquement.As a result, they are inactivated when the normally recognized antigen is chemically reduced.

L'effet fonctionnel de l'épitope vis à vis de l'antigène qui -1-e contient indique que cet antigène ne peut exercer ses fonctions dans la physiologie plaquettaire si l'épitope n'est pas présent ou s'il est inactivé. The functional effect of the epitope on the antigen which contains -1-e indicates that this antigen cannot exercise its functions in platelet physiology if the epitope is not present or if it is inactivated.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope présent sur la GMP140, en un site exposé à la surface des plaquettes activées, lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques étant capables d'interférer avec les réactions d'agrégation etou de sécrétion plaquettaire. In an advantageous embodiment of the invention, the monoclonal antibodies or their idiotypic fragments are characterized in that they recognize an epitope present on GMP140, at a site exposed on the surface of activated platelets, said antibodies or their idiotypic fragments being able to interfere with aggregation and / or platelet secretion reactions.

Des anticorps particulièrement préférés sont les anticorps LYP20 ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes. Particularly preferred antibodies are LYP20 antibodies or antibodies with equivalent immunological and functional properties.

D'une façon générale, pour les anticorps monoclonaux selon l'invention, on évaluera les "propriétés immunologiques et - fonctionnelles équivalentes" par un test visant à vérifier que l'antigène reconnu est identique à celui qui est reconnu par l'anticorps de comparaison (en l'occurence
LYP20) et un test déterminant la capacité des anticorps isolés, à moduler les fonctions plaquettaires dans les conditions (concentrations en agonistes) qui ont été définies précédemment.In general, for the monoclonal antibodies according to the invention, the "equivalent immunological and functional properties" will be evaluated by a test aimed at verifying that the recognized antigen is identical to that which is recognized by the comparison antibody. (in this case
LYP20) and a test determining the capacity of the isolated antibodies, to modulate the platelet functions under the conditions (concentrations of agonists) which have been defined previously.

L'anticorps LYP20 (encore désigné par P20) a également la capacité de reconnaitre la GMP140 présente à la surface des cellules endothéliales. De plus cet anticorps ne reconnait plus la GMP140 lorsqu'elle est sous forme chimiquement réduite, c'est à dire lorsque son poids moléculaire passe de 128 kDa à 130 kDa. The antibody LYP20 (also designated P20) also has the capacity to recognize the GMP140 present on the surface of endothelial cells. In addition, this antibody no longer recognizes GMP140 when it is in chemically reduced form, that is to say when its molecular weight goes from 128 kDa to 130 kDa.

Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épi tope présent au niveau de la glycoprotéine IIa, du complexe Ia-IIa, du complexe
Ic-IIa, de la glycoprotéine GP110-120, lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'interférer avec les réactions physiologiques plaquettaires.In another advantageous embodiment of the invention, the monoclonal antibodies or their idiotypic fragments are characterized in that they recognize an epi tope present at the level of the glycoprotein IIa, of the complex Ia-IIa, of the complex
Ic-IIa, glycoprotein GP110-120, said antibodies or their idiotypic fragments having the capacity to interfere with physiological platelet reactions.

Ces anticorps reconnaissent un épi tope ou un déterminant porté par la glycoprotéine IIa. These antibodies recognize an epi tope or a determinant carried by the glycoprotein IIa.

En conséquence ils reconnaissent les -complexes protéiques mettant en oeuvre la glycoprotéine IIa ou ses produits de transformation ou de dégradation. Consequently, they recognize the protein complexes using the glycoprotein IIa or its transformation or degradation products.

D'une façon particulièrement préférée, ces anticorps sont les anticorps LYP22 ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes. In a particularly preferred manner, these antibodies are the LYP22 antibodies or antibodies having equivalent immunological and functional properties.

Des tests anologues à ceux décrits ci-dessus sont utilisés pour sélectionner les anticorps ayant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes en prenant pour base de comparaison, LYP22.  Tests analogous to those described above are used to select the antibodies having equivalent immunological and functional properties using as a basis for comparison, LYP22.

L'anticorps monoclonal LYP22 (encore désigné par
P22) présente l'avantage particulier d'être dirigé contre- des -protéines fonctionnant comme récepteurs du collagène sur les plaquettes et qui sont donc importantes pour l'adhésion des plaquettes aux parois des vassaux sanguins endommagés. Cet anticorps reconnait également un épi tope localisé sur une sousunité beta (ss) des lymphocytes VLA. De plus l'anticòrps monoclonal LYP22 reconnait des antigènes présents sur des cellules endothéliales, ces antigènes ayant les mêmes caractéristiques que ceux présents sur les plaquettes.The monoclonal antibody LYP22 (also designated by
P22) has the particular advantage of being directed against -proteins which function as receptors for collagen on the platelets and which are therefore important for the adhesion of the platelets to the walls of the damaged blood vessels. This antibody also recognizes an epi tope located on a beta (ss) subunit of VLA lymphocytes. In addition, the monoclonal antibody LYP22 recognizes antigens present on endothelial cells, these antigens having the same characteristics as those present on platelets.

Les anticorps LYP20 et LYP22 présentent l'avantage inhiber l'activité plaquettaire à un niveau d'environ 60% en présence de faibles concentrations d'agonistes telles que par exemple (2,5-5 M d'ADP, 2 g/ml de collagéne, 0,016 U/ml throibine). Ceci correspond à une modulation de l'activité plaquettaire dans la mesure où celle-ci n'est pas totalement inhibée. The antibodies LYP20 and LYP22 have the advantage of inhibiting platelet activity at a level of approximately 60% in the presence of low concentrations of agonists such as for example (2.5-5 M ADP, 2 g / ml of collagen, 0.016 U / ml throibine). This corresponds to a modulation of the platelet activity insofar as this is not totally inhibited.

D'autres anticorps particulièrement intéressants pour la réaii;ation de l'invention, sont des anticorps mônoclonaux où leurs fragments idiotypiques caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope du complexe IIb-IIIa à la surface des plaquettes stimulées, lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'inhiber les fonctions plaquettairès et étant dépourvus de cette capacité lorsqu'ils sont en présence de fortes concentrations d'agonistes telles que décrites ci-dessus. Other antibodies of particular interest for the practice of the invention are monoclonal antibodies in which their idiotypic fragments characterized in that they recognize an epitope of the IIb-IIIa complex on the surface of the stimulated platelets, said antibodies or their fragments idiotypic having the capacity to inhibit platelet functions and being devoid of this capacity when they are in the presence of high concentrations of agonists as described above.

Des anticorps particulièrement préférés sont les anticorps LYP18, ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes. Particularly preferred antibodies are LYP18 antibodies, or antibodies with equivalent immunological and functional properties.

Des tests analogues à ceux décrits ci-dessus sont utilisés pour sélectionner les anticorps ayant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes, en prenant pour base de comparaison, LYP18.  Tests analogous to those described above are used to select the antibodies with equivalent immunological and functional properties, taking as a basis of comparison, LYP18.

Ces anticorps et notamment l'anticorps LYP18 présentent l'avantage de détecter à la fois des antigènes présents sur des plaquettes au repos et des antigènes exprimés après stimulation des cellules. These antibodies and in particular the LYP18 antibody have the advantage of detecting both antigens present on resting platelets and antigens expressed after stimulation of the cells.

L'invention concerne également un mélange d'anticorps monoclonaux ou de fragments idiotypiques de ces anticorps ou encore un mélange d'anticorps et de fragments, caractérisé en ce qu'il comprend au moins- deux anticorps ou fragments différents décrits précédemment. The invention also relates to a mixture of monoclonal antibodies or of idiotypic fragments of these antibodies or also to a mixture of antibodies and fragments, characterized in that it comprises at least two different antibodies or fragments described above.

Des mélanges particulièrement préférés d'anticorps et/ou de fragments de ces anticorps sont par exemple des mélanges comprenant LYP20 et LYP22 ou/et leurs fragments idiotypiques. Un autre mélange préféré est celui de LYP20 et LYP18 et/ou leurs fragments idiotypiques. Particularly preferred mixtures of antibodies and / or fragments of these antibodies are for example mixtures comprising LYP20 and LYP22 or / and their idiotypic fragments. Another preferred mixture is that of LYP20 and LYP18 and / or their idiotypic fragments.

Les anticorps ou leurs fragments idiotypiques répondant au définition de l'invention sont particulièrement intéressants pour leurs propriétés de modulation des fonctions plaquettaires. Ces anticorps ou leurs fragments idiotypiques peuvent à cet égard être utilisés en temps qu'agents antiplaquettaires chez des patients présentant des risques de troubles des fonctions plaquettaires et en particulier des problèmes concernant la formation des thromboses. A cet égard les anticorps de l'invention et leurs fragments permettent, de ne pas inhiber complètement les fonctions plaquettaires ce qui géneralement entrainent un risque de saignement dangereux pour le patient traité. The antibodies or their idiotypic fragments corresponding to the definition of the invention are particularly advantageous for their properties of modulation of platelet functions. These antibodies or their idiotypic fragments can in this respect be used as antiplatelet agents in patients presenting risks of disturbances of platelet functions and in particular problems concerning the formation of thromboses. In this regard, the antibodies of the invention and their fragments make it possible not to completely inhibit the platelet functions, which generally entail a risk of dangerous bleeding for the patient treated.

Les anticorps ou leurs fragments définis dans les pages précédentes peuvent donc etre utilisés séparément ou dans des mélanges afin de cibler l'inhibition des fonctions plaquettaires selon les besoins et/ou -d'obtenir des niveaux d'inhibition des fonctions plaquettaires adaptés à la situation que l'on souhaite éventuellement traiter. The antibodies or their fragments defined in the preceding pages can therefore be used separately or in mixtures in order to target the inhibition of platelet functions as required and / or to obtain levels of inhibition of platelet functions adapted to the situation. that we want to possibly treat.

L'invention vise par ailleurs des anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques tels qu'ils ont été décrits plus haut caractérisés en ce qu'ils sont marqués, le marquage étant de préférence réalisé avec une substance radioactive, notamment un radioélément halogénique ou métallique, par exemple 131I, 1111n ou 99T, ou par une substance fluorescente. The invention further relates to monoclonal antibodies or their idiotypic fragments as described above, characterized in that they are labeled, the labeling being preferably carried out with a radioactive substance, in particular a halogenic or metallic radioelement, by example 131I, 1111n or 99T, or with a fluorescent substance.

La substance de marquage doit être choisie en fonction de l'utilisation souhaitée des anticorps, in vitro ou in vivo. Dans le cas où ces anticorps sont utilisés in vivo, la substance choisie doit être phisiologiquement acceptable pour l'homme, et adaptée à la détection par des moyens tels que l'imagerie. The labeling substance must be chosen according to the desired use of the antibodies, in vitro or in vivo. In the case where these antibodies are used in vivo, the substance chosen must be physiologically acceptable to humans, and suitable for detection by means such as imaging.

Différents protocoles de marquage pourront être utilisés, en fonction du marqueur choisi. On aura par exemple recours aux techniques décrites dans la publication Mason, DW et al (1980) Biochem J 187, 1-9. Different labeling protocols may be used, depending on the marker chosen. For example, the techniques described in the publication Mason, DW et al (1980) Biochem J 187, 1-9 will be used.

Pour les techniques relatives à l'utilisation des anticorps après le marquage, on se référera par exemple à la publication McGregor JL et al (1986) Eur
J. Bioche 159, 443449. For the techniques relating to the use of antibodies after labeling, reference may be made, for example, to the publication McGregor JL et al (1986) Eur
J. Bioche 159, 443449.

L'invention concerne à cet égard un procédé pour le marquage d'anticorps ou de leurs fragments tels qu'ils ont été definis précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
- mise en contact de l'anticorps ou de ses fragments que l'on souhaite marquer, avec un marqueur déterminé, par exemple un radioélément, dans des conditions permettant le couplage du marqueur et de l'anticorps,
- le cas échéant purification par exemple par filtration sur gel, pour éliminer les composants n'ayant pas réagi.The invention relates in this regard to a method for labeling antibodies or their fragments as defined above, characterized in that it comprises the following steps
contacting the antibody or its fragments which it is desired to mark, with a determined marker, for example a radioelement, under conditions allowing the coupling of the marker and the antibody,
- if necessary purification, for example by gel filtration, to remove the unreacted components.

Si le marquage sur les anticorps ou leurs fragments est réalisé de façon indirecte par exemple avec le technetium 99 on aura recours aux agents chélatants connus pour complexer le marqueur et réaliser le couplage avec l'anticorps ou les fragments. Des agents chélatants utilisables sont par exemple les acides polyaminocarboxyliques, notamment le DTPA (acide diéthylène triamine pentaacétique), des analogues de l'acide diethylène triamine pentaacétique (EDTA) des composés diaminodithiols, triaminothiols (ex : les (thioacétamide/ pentanoile) des amines polycycliques des dithiosemicarbozones et des métallothionines ou des anhydrides de ces acides, notamment des anhydrides cycliques. Ces agents chélatants sont préparés par des méthods connues. Pour le marquage au technetium, on pourra par exemple se référer à la publication Eckelman et al Nucl, Med. If the labeling on the antibodies or their fragments is carried out indirectly, for example with technetium 99, use will be made of known chelating agents to complex the marker and to carry out the coupling with the antibody or the fragments. Chelating agents which can be used are, for example, polyaminocarboxylic acids, in particular DTPA (diethylene triamine pentaacetic acid), analogs of diethylene triamine pentaacetic acid (EDTA) of diaminodithiol compounds, triaminothiols (e.g. (thioacetamide / pentanoil) of polycyclic amines dithiosemicarbozones and metallothionines or anhydrides of these acids, in particular cyclic anhydrides These chelating agents are prepared by known methods.For labeling with technetium, reference may for example be made to the publication Eckelman et al Nucl, Med.

Biol. vol 16 nO 2, pp 171-176, 1989).Biol. vol 16 no 2, pp 171-176, 1989).

Entre également dans le cadre de l'invention, ltépitope reconnu par les anticorps monoclonaux définis précédemment ou encore reconnu par les fragments idiotypiques de ces anticorps cet épi tope étant présent au niveau d'un antigène impliqué dans les étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/tu de sécrétion plaquettaire etZou dans les réactions d'adhésion des cellules endothéliales, ledit antigène étant choisi plus particuliérei.nt parmi les protéines GMP140 la glycoprotéine gplIa ou les complexes gpIIb-IIIa, gpIa-IIa, gpIc-Ila, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un épitope conformationnel, nécessaire à l'activité dans les réactions ci-dessus de l'antigène qui le contient. Also within the scope of the invention, the epitope recognized by the monoclonal antibodies defined above or else recognized by the idiotypic fragments of these antibodies, this epi tope being present at the level of an antigen involved in the stages of platelet physiology and in particular in adhesion and / or aggregation reactions and / tu of platelet secretion and Zou in adhesion reactions of endothelial cells, said antigen being chosen more particularly from the GMP140 proteins, the glycoprotein gplIa or the gpIIb-IIIa complexes , gpIa-IIa, gpIc-Ila, characterized in that it is a conformational epitope, necessary for activity in the above reactions of the antigen which contains it.

Un épitope particulier de l'invention est un épitope sensible à la réduction de l'antigène qui le contient. A particular epitope of the invention is an epitope sensitive to the reduction of the antigen which contains it.

L'invention concerne de façon plus spécifique les épitopes distincts reconnus par chacun des anticorps
LYP20 et LYP22.The invention relates more specifically to the distinct epitopes recognized by each of the antibodies.
LYP20 and LYP22.

Un autre épi tope visé dans le cadre de l'invention est un épitope répondant aux définitions génerales ci-dessus caractérisé:
a) en ce qu'il est reconnu par le complexe IIb Illa de plaquettes humaines.Another epi tope aimed within the framework of the invention is an epitope corresponding to the general definitions above characterized:
a) in that it is recognized by the IIb Illa complex of human platelets.

b) en ce-qu'il n'est, pas reconnu par le complexe
IIb-IIIa de plaquettes de chien,
c) en ce qu'il est reconnu par l'analogue du complexe IIb-IIIa (complexe IIb-IIIa like), présent sur des cellules endothéliales.b) in that it is not recognized by the complex
Dog platelets IIb-IIIa,
c) in that it is recognized by the analogue of the IIb-IIIa complex (IIb-IIIa like complex), present on endothelial cells.

De façon préférée cet épitope est l'épitope reconnu par l'anticorps LYP18. Preferably, this epitope is the epitope recognized by the LYP18 antibody.

Les épitopes reconnus par les différents anticorps ou fragments idiotypiques de ces anticorps sont encore caractérisés comme suit
Un premier protocole pour les caractériser comprend :
- la dégradation protéolytique de la glycoprotéine supposée contenir l'épitope,
- la localisation du déterminant de l'anticorps monoclonal par SDS PAGE et Western blot, à partir de petits fragments dé glycoprotéine,
- l'obtention de la séquence d'acides aminés du (des) fragment(s) reconnu(s) par l'anticorps monoclonal,
- la production de peptides se chevauchant,
- la sélection du ou des peptide (s) capables d'inhiber la liaison de l'anticorps avec son récepteur lors d'un test de réaction d'inhibition mettant en oeuvre l'anticorps monoclonal et la glycoprotéine purifiée ou les plaquettes lavées.The epitopes recognized by the different antibodies or idiotypic fragments of these antibodies are further characterized as follows
A first protocol to characterize them includes:
- the proteolytic degradation of the glycoprotein supposed to contain the epitope,
the localization of the determinant of the monoclonal antibody by SDS PAGE and Western blot, from small fragments of glycoprotein,
- obtaining the amino acid sequence of the fragment (s) recognized by the monoclonal antibody,
- the production of overlapping peptides,
- the selection of the peptide (s) capable of inhibiting the binding of the antibody with its receptor during an inhibition reaction test using the monoclonal antibody and the purified glycoprotein or the washed platelets.

Cette technique peut être mise en oeuvre par référence aux publications de Foster P.A et al (1988)
J Biol Chem 263, 5230-5234 et Geysen MH et al Ciba
Foundation Symposium 119, 130-149.This technique can be implemented by reference to the publications of Foster PA et al (1988)
J Biol Chem 263, 5230-5234 and Geysen MH et al Ciba
Foundation Symposium 119, 130-149.

Un autre protocole pouvant être mis en oeuvre comporte
- l'utilisation d'anticorps monoclonaux ayant un effet inhibiteur et capables de se livrer en Western blot,
- l'isolement du gène complet de glycoprotéine à partir d'une banque de cDNA gtll d'une lignée cellulaire exprimant l'antigène reconnu par l'anticorps,
- le séquençage du gène,
- l'isolement de cDNA de différentes tailles, reconnus par l'anticorps monoclonal,
- la détermination, à partir du cDNA isolé, du déterminant de l'anticorps monoclonal selon un procédé conforme au premier protocole.Another protocol that can be implemented includes
- the use of monoclonal antibodies having an inhibitory effect and capable of delivering in Western blot,
- isolation of the complete glycoprotein gene from a cDNA gtll library from a cell line expressing the antigen recognized by the antibody,
- gene sequencing,
- the isolation of cDNA of different sizes, recognized by the monoclonal antibody,
- Determination, from the isolated cDNA, of the determinant of the monoclonal antibody according to a process in accordance with the first protocol.

Ce protocole peut êtreréalisé par référence à la publication Bahou WF et al (1989) J Clin Invest 84, 56-61. This protocol can be carried out by reference to the publication Bahou WF et al (1989) J Clin Invest 84, 56-61.

L'invention vise également une composition pour le diagnostic de l'activation plaquettaire chez un sujet suseptible de présenter une pathologie associée à des troubles de la physiologie plaquettaire en particulier pour mettre en évidence une thrombopathie, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux anticorps différents ou leurs fragments idiotypiques tels qu'ils ont été définis ci-dessus, de préférence des anticorps dirigés contre des protéines ou glycoprotêines distinctes, en particulier un mélange d'anticorps choisi parmi LYP20, LYP22 et LYP18 ou encore leurs fragments idiotypiques. Pour les besoins de - la détection, ces anticorps ou fragments d'anticorps sont marqués. The invention also relates to a composition for the diagnosis of platelet activation in a subject likely to present a pathology associated with disorders of platelet physiology in particular for demonstrating thrombopathy, characterized in that it comprises at least two different antibodies or their idiotypic fragments as defined above, preferably antibodies directed against distinct proteins or glycoproteins, in particular a mixture of antibodies chosen from LYP20, LYP22 and LYP18 or their idiotypic fragments. For the purposes of - detection, these antibodies or antibody fragments are labeled.

D'autres compositions pour le diagnostic de l'activation plaquettaire, répondant aux définitions ci-dessus. sont des compositions caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre des anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques dirigés contre la thrombospondine et de préférence des anticorps du type LYP9 ou/et LYP11. Other compositions for the diagnosis of platelet activation, meeting the above definitions. are compositions characterized in that they further comprise monoclonal antibodies or their idiotypic fragments directed against thrombospondin and preferably antibodies of the LYP9 or / and LYP11 type.

Les anticorps LYP9 et LYP11 sont des anticorps dirigés contre la- thrombospondine obtenus par une méthode telle que celle décrite dans la publication de Clezardin-et al (Eur J Biochem. 154, 95-102 (1986)). The antibodies LYP9 and LYP11 are antibodies directed against thrombospondin obtained by a method such as that described in the publication of Clezardin-et al (Eur J Biochem. 154, 95-102 (1986)).

Let compositions pour la diagnostic décrites cidessus peuvent d'être utilisées pour détecter in vitro dans un échantillon biologique tel que [...] la présence d'antigènes plaquettaires, significative d'un état de throsbore.  The diagnostic compositions described above can be used to detect in vitro in a biological sample such as the presence of [...] platelet antigens, indicative of a state of throsbore.

Ces compositions sont également utilisables pour le diagnostic in vivo, lorsque les anticorps monoclonaux ou leurs fragments ont préalablement été marqués avec 'une substance physiologiquement acceptable pour l'homme dans des conditions permettant leur détection avec des appareils adaptés et en particulier gracie aux méthodes de gamma-scintigraphie et de RNK.  These compositions can also be used for in vivo diagnosis, when the monoclonal antibodies or their fragments have been previously labeled with a substance physiologically acceptable to humans under conditions allowing their detection with suitable devices and in particular free from gamma methods. -scintigraphy and RNK.

Un autre avantage des compositions pour le diagnostic précédemment décrites est de permettre un diagnostic sélectif de la présence de certains antigènes particuliers caractéristiques d'étapes déterminées de'la physiologie plaquettaire. Another advantage of the compositions for diagnosis previously described is to allow a selective diagnosis of the presence of certain particular antigens characteristic of determined stages of platelet physiology.

Une catégorie d'anticorps monoclonaux ou de fragments selon l'invention peut également être utilisée, sous la forme d'une composition pour le diagnostic in vitro, pour la mise en évidence de mélanomes métastasiques et les différencier par rapport à des mélanocytes bénins. Ces anticorps monoclonaux sont de préférence les anticorps LYP18 de l'invention ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles analogues, notamment leur capacité à reconnaître l'analogue du complexe
IIb-IIIa (IIb-IIIa like).A category of monoclonal antibodies or of fragments according to the invention can also be used, in the form of a composition for in vitro diagnosis, for the detection of metastatic melanomas and to differentiate them with respect to benign melanocytes. These monoclonal antibodies are preferably the LYP18 antibodies of the invention or antibodies having similar immunological and functional properties, in particular their capacity to recognize the analogue of the complex
IIb-IIIa (IIb-IIIa like).

Le complexe IIb-IIIa like est caractérisé par un poids moléculaire identique, sous forme réduite ou non réduite, à celui de la glycoprotéine plaquettaire
IIb-IIIa. Ce complexe IIb-IIIa like présente en outre un fragment IIb-ss like (forme réduite) comme les plaquettes IIb réduites.The IIb-IIIa like complex is characterized by an identical molecular weight, in reduced or unreduced form, to that of platelet glycoprotein
IIb-IIIa. This IIb-IIIa like complex also has an IIb-ss like fragment (reduced form) like the reduced IIb platelets.

L'invention vise par ailleurs une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un anticorps monoclonal ou ses fragments idiotypiques ou encore un mélange d'anticorps et de fragments selon ce qui a été décrit précédemment ou un mélange des ces différents anticorps et ou fragments idiotypiques, en combinaison avec un véhicule pharmaceutique acceptable. The invention further relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises, as active principle, a monoclonal antibody or its idiotypic fragments or a mixture of antibodies and fragments according to what has been described above or a mixture of these different antibodies and or idiotypic fragments, in combination with an acceptable pharmaceutical vehicle.

Selon un premier aspect préféré de l'invention, de telles compositions pharmaceutiques peuvent être utilisées pour les traitements de différentes pathologies résultant de troubles de la physiologie plaquettaire ou liés à ces fonctions plaquettaires.  According to a first preferred aspect of the invention, such pharmaceutical compositions can be used for the treatment of various pathologies resulting from disorders of platelet physiology or linked to these platelet functions.

Une utilisation des compositions pharmaceutiques comprenant les anticorps de l'invention ou leurs fragments peut être le traitement de maladies cardiovasculaires. A use of the pharmaceutical compositions comprising the antibodies of the invention or their fragments can be the treatment of cardiovascular diseases.

Selon un autre aspect particulier de la réalisation -de l'invention, les compositions phareaceutiques sont caractérisées en ce que le (les) anticorps ou leurs fragments idiotypiques, sont
- soit couplés à une substance anticoagulante ou à une substance ayant une activité thrombolytique, cette substance pouvant être par exemple le TPA, la streptokinase ou l'urokinase,
- soit modifiés au niveau de l'une de leurs chaînes idiotypiques de façon à remplacer l'un des fragments variables ou au moins une partie de ces fragments par l'une des susdites substances anticoagulantes.According to another particular aspect of the implementation of the invention, the pharmaceutical compositions are characterized in that the antibody (ies) or their idiotypic fragments, are
- either coupled to an anticoagulant substance or to a substance having a thrombolytic activity, this substance possibly being for example TPA, streptokinase or urokinase,
- or modified at the level of one of their idiotypic chains so as to replace one of the variable fragments or at least part of these fragments with one of the above-mentioned anticoagulant substances.

Lorsque le fragment idiotypique de l'anticorps est couplé avec- une substance ayant une activité décrite ci-dessus, la liaison entre le fragment et cette substance est une liaison covalente résultant de la mise en oeuvre d'un protocole tel que celui décrit par Bode et al (1985) Science 229, 765. D'autres techniques utilisables sont celles décrites par Frantz et Roberteon dans Infect and Immunity, 33, 193-198 (1981) ou celle décrite dans Environnement Microbiology (octobre 1981) vol. 42 n 4, 611-614 par
P.E. Kauffrann. When the idiotypic fragment of the antibody is coupled with a substance having an activity described above, the bond between the fragment and this substance is a covalent bond resulting from the implementation of a protocol such as that described by Bode et al (1985) Science 229, 765. Other techniques which can be used are those described by Frantz and Roberteon in Infect and Immunity, 33, 193-198 (1981) or that described in Environment Microbiology (October 1981) vol. 42 no 4, 611-614 by
PE Kauffrann.

Dans la pratique, on utilisera avantageusement comme agent de couplage les composés suivants, cités à titre non limitatif : aldéhyde glutarique, chloroformiate d'éthyle, carbodiimides hydrosolubles [N-éthyl-N (3-diméthylamino-propyl) carbodiimide, Hall, diisocyanates, -bis-diazobenzidine, di- et trichloro-s-triazines, bromures de cyanogène, benzoquinone, ainsi que les agents de couplage mentionnés dans Scand. J. Immunol., 1978, vol. 8, p. In practice, the following compounds, cited without limitation, will advantageously be used as coupling agent: glutaric aldehyde, ethyl chloroformate, water-soluble carbodiimides [N-ethyl-N (3-dimethylamino-propyl) carbodiimide, Hall, diisocyanates, -bis-diazobenzidine, di- and trichloro-s-triazines, cyanogen bromides, benzoquinone, as well as the coupling agents mentioned in Scand. J. Immunol., 1978, vol. 8, p.

7-23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON).7-23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON).

Dans le cas où la composition pharmaceutique est composée d'un anticorps ou d'un mélange de ces anticorps et/ou de leurs fragments idiotypiques couplés ou modifiés par une substance anticoagulante ou thrombolytique, cette composition, associée à un véhicule physiologiquement acceptable est administrée au patient selon une dose comparable à celle qui serait utilisée pour un des constituants de la composition pris isolément. In the case where the pharmaceutical composition is composed of an antibody or a mixture of these antibodies and / or of their idiotypic fragments coupled or modified by an anticoagulant or thrombolytic substance, this composition, associated with a physiologically acceptable vehicle is administered to the patient according to a dose comparable to that which would be used for one of the constituents of the composition taken in isolation.

L'invention vise en outre l'utilisation d'anticorps ou de leurs fragments idiotypiques pris séparément ou en mélange, pour la fabrication d'un médicament déstiné au traitement des pathologies liées à des troubles de la physiologie plaquettaire. The invention further relates to the use of antibodies or their idiotypic fragments taken separately or as a mixture, for the manufacture of a medicament intended for the treatment of pathologies linked to disorders of platelet physiology.

Selon un autre aspect préféré de l'invention les compositions pharmaceutiques ci-dessus peuvent être utilisées dans une application différente du traitement des maladies cardiovasculaires pour bloquer la prolifération des cellules malignes de mélanomes et ainsi contrarier l'invasion métastasique de ces cellules. L'invention concerne à cet égard des compositions pharmaceutiques comprenant l'anticorps monoclonal LYP18 ou encore un anticorps ayant la propriété de bloquer la prolifération des cellules malignes de mélanomes, pour le traitement pour inhiber la croissance des mélanomes tumoraux in vivo. According to another preferred aspect of the invention, the above pharmaceutical compositions can be used in a different application from the treatment of cardiovascular diseases to block the proliferation of malignant melanoma cells and thus to counter the metastatic invasion of these cells. The invention relates in this regard to pharmaceutical compositions comprising the monoclonal antibody LYP18 or an antibody having the property of blocking the proliferation of malignant melanoma cells, for the treatment for inhibiting the growth of tumor melanomas in vivo.

L'invention concerne également un procédé de préparation des anticorps monoclonaux selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
a/ fusion de cellules spléniques de souris avec des cellules myélomateuses, lesdites souris étant préalablement immunisées avec l'antigène contre lequel on souhaite produire des anticorps, les cellules spléniques étant en excès par rapport aux cellules' myélomateuses, en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le PEG,
b/ culture des hybridomes formés par la fusion,
c1 clonage et sous-clonage des hybridomes producteurs des ant-icorps recherchés,
d/ production d'ascites dans les souris,
et récupération et purification desdits anticorps.The invention also relates to a process for preparing the monoclonal antibodies according to the invention characterized in that it comprises the following steps
a / fusion of mouse spleen cells with myeloma cells, said mice being previously immunized with the antigen against which it is desired to produce antibodies, the spleen cells being in excess with respect to myeloma cells, in the presence of a promoter of merger, for example PEG,
b / culture of the hybridomas formed by the fusion,
c1 cloning and subcloning of hybridomas producing the desired antibodies,
d / production of ascites in mice,
and recovery and purification of said antibodies.

Pour la production des anticorps LYP18 ou LYP20 on utilise à titre d'antigène, des plaquettes de sang humain traitées d la chymotripsine. Dans ce cas, les cellules myelomateuses utilisées pour la fusion sont par exemple des cellules Sp2/0-Agl4. For the production of LYP18 or LYP20 antibodies, human blood platelets treated with chymotripsin are used as the antigen. In this case, the myeloma cells used for the fusion are for example Sp2 / 0-Agl4 cells.

Pour a préparation des antidorps LYP21 ou LYP22, on utilise un mélange des antigènes GMP140, glycoprotéines Ia. Ic, IIa, GP110-115 pour ismuniser les souris. Dans ce cas, les cellules myélomateuses utilisées pour la fusion sont avantageusement des cellules P3 x 63 Ag 8
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples et les figures qui suivent
Figure 1
Profile dilution des extraits plaquettaires traités au Lubrol obtenus à partir d'une colonne Q de Sepharone å flux rapide sur FPLC.For the preparation of the LYP21 or LYP22 antibodies, a mixture of the GMP140 antigens, glycoproteins Ia, is used. Ic, IIa, GP110-115 to immunize mice. In this case, the myeloma cells used for the fusion are advantageously P3 x 63 Ag 8 cells.
Other characteristics and advantages of the invention will appear in the examples and the figures which follow.
Figure 1
Dilution profile of platelet extracts treated with Lubrol obtained from a Q column of Sepharone with fast flow on FPLC.

La fraction éluée de la colonne de Sepharose WGA a été dialysé contre 0,1 b de Lubrol dans un tampon
Tris. Le pic 1 a été élué à 0,15 M NaCl, le pic 2 à 0,25M NaCl et le pic 3 à 0,32M NaCl. The fraction eluted from the WGA Sepharose column was dialyzed against 0.1 b of Lubrol in a buffer
Tris. Peak 1 was eluted at 0.15 M NaCl, peak 2 at 0.25M NaCl and peak 3 at 0.32M NaCl.

Figure 2 :
Comparaison des données obtenues en SDS-PAGE de
GPIIb-IIIa, de l'antigène de S12 et P20.Figure 2:
Comparison of data obtained in SDS-PAGE from
GPIIb-IIIa, S12 and P20 antigen.

Des lysats de plaquettes marquées avec 1125 ont été incubés avec des IgG non-immunes (lignes 1, 5),
P20 (lignes 2, 6), avec S12 (lignes 3, 7) et avec un anticorps anti-GPIIb-IIIa (lignes 4, 8). Des échantillons ont été dénaturés dans des conditions non-réductrices (lignes 1, 2, 3, 4) et réductrices (lignes 5, 6, 7, 8), placées sur un gradient SDS-PAGE 5-15 % et autoradiographiées. La ligne 9 montre le lysat total marqué non-réduit.Platelet lysates labeled with 1125 were incubated with non-immune IgG (lines 1, 5),
P20 (lines 2, 6), with S12 (lines 3, 7) and with an anti-GPIIb-IIIa antibody (lines 4, 8). Samples were denatured under non-reducing (lines 1, 2, 3, 4) and reducing (lines 5, 6, 7, 8) conditions, placed on a 5-15% SDS-PAGE gradient and autoradiographed. Line 9 shows the total unreduced labeled lysate.

Figure 3
Liaison d'anticorps monoclonal P20 à des plaquettes non-stimulées et stimulées.Figure 3
Binding of monoclonal antibody P20 to unstimulated and stimulated platelets.

Des plaquettes lavées à une concentration de 108/ml ont été incubées pendant 30 minutes à 250C dans une solution complété de Tyrode avec différentes concentrations (0,1-4 g/ml) de P20 marqué avec 1125.  Platelets washed at a concentration of 108 / ml were incubated for 30 minutes at 250C in a solution supplemented with Tyrode with different concentrations (0.1-4 g / ml) of P20 labeled with 1125.

Les plaquettes lavées ont permis de montrer une liaison accrue de P20 marqué avec I125 après stimulation par 1U/ml d'alpha-thrombine.The washed platelets made it possible to show an increased binding of labeled P20 with I125 after stimulation with 1U / ml of alpha-thrombin.

Figure 4
Comparaison du nombre d'anticorps P20 marqués avec 1125 et des constantes Kd pour des plaquettes nonstimulées et des plaquettes stimulées avec la thrombine.Figure 4
Comparison of the number of P20 antibodies labeled with 1125 and Kd constants for unstimulated platelets and platelets stimulated with thrombin.

Des plaquettes non-stimulées ont accroché 2,400 t 266 anticorps P20 marqués, par plaquette (Rd =2,3nM + 0,54). Les plaquettes stimulées à la thrombine ont permis d'accrocher 12200 t 1184 anticorps P20 marqués, par plaquette (Kd=5,0nM t 0,61). Une analyse Scatchard des donnés d'accrochage des plaquettes de 4 doneurs a été utilisée. Unstimulated platelets hung 2,400 t 266 labeled P20 antibodies per platelet (Rd = 2.3nM + 0.54). The platelets stimulated with thrombin made it possible to attach 12,200 t 1,184 labeled P20 antibodies, per plate (Kd = 5.0nM t 0.61). A Scatchard analysis of the platelet attachment data from 4 donors was used.

Figure 5 :
Effet de P20 sur l'adhésion plaquettaire.Figure 5:
Effect of P20 on platelet adhesion.

L'effet de P20 sur l'adhésion des plaquettes marquées avec Cr@@ au niveau des puits de microtitation recouverts avec de la fibronectine (FN), du fibrinogene (FG) et du collagène a été testé. Les plaquettes ont té incubées avec 10 pg/ml de P20 pendant 30 minutes à 370C avant. incubation dans les puits recouverts. Des contrôles négatifs ont été réalisés en utilisant des puits recouverts avec BSA et le nombre de plaquettes accrochées a été comparé avec celui obtenu pour de puits recouverts avec FN, FG et du collagène. The effect of P20 on the adhesion of the platelets labeled with Cr @ @ at the microtitation wells coated with fibronectin (FN), fibrinogen (FG) and collagen was tested. The platelets were incubated with 10 µg / ml P20 for 30 minutes at 370C before. incubation in the covered wells. Negative controls were carried out using wells covered with BSA and the number of hooked platelets was compared with that obtained for wells covered with FN, FG and collagen.

Figure 6 :
Effet de P2O sur l'agrégation plaquettaire
L'anticorps monoclonal P20 (50 g/ml) inhibe partiellement t60 %) l'agrégation induite par 2,5 M d'ADP, une dose dé 40 g/ml inhibe l'agrégation induite par 2 g/ml de collagène (63 t d'inhibition).Figure 6:
Effect of P2O on platelet aggregation
The monoclonal antibody P20 (50 g / ml) partially inhibits t60%) the aggregation induced by 2.5 M ADP, a dose of 40 g / ml inhibits the aggregation induced by 2 g / ml collagen (63 t inhibition).

P20 (90 g/ml) inhibe égalemenmt (50 %) l'agrégation induite par 0,016 U/ml de thrombine. P20 (90 g / ml) also inhibits (50%) the aggregation induced by 0.016 U / ml of thrombin.

EXEMPLE 1 - Isolement et caractérisation de glycoprotéines de
Dlaquettes par chromatographie FPLC suivie d'un séquence en phase gazeuse.EXAMPLE 1 - Isolation and characterization of glycoproteins from
Plates by FPLC chromatography followed by a gas phase sequence.

Dans cette expérience on a isolé des glycoprotéines présentes en faible quantité à la surface des plaquettes. Pour cela on a utilisé la chromatographie rapide en phase liquide (FPLC) ainsi que le séquençage en phase gazeuse permettant de procéder à l'étude de la structure, des caractères immunologiques et fonctionnels des glycoprotéines présentes sur les plaquettes, en faible quantité. In this experiment, glycoproteins present in small quantities on the surface of the platelets were isolated. For this, rapid liquid chromatography (FPLC) was used, as well as gas phase sequencing, making it possible to study the structure, immunological and functional characteristics of the glycoproteins present on the platelets, in small quantities.

Les membranes plaquettaires solubilisées dans du sodium déoxycholate ont été appliquées sur une colonne de germe de blé (WGA) et de lectine (Lens Culinaris
LCH) montée séquentiellement avec une chromatographie
FPLC. Les glycoprotéines éluées des colonnes de lectine dans un détergent non ionique ont ensuité été séparées sur une colonne échangeuse d'anions (Mono-Q).Platelet membranes solubilized in sodium deoxycholate were applied to a column of wheat germ (WGA) and lectin (Lens Culinaris
LCH) sequentially mounted with chromatography
FPLC. The glycoproteins eluted from the lectin columns in a nonionic detergent were then separated on an anion exchange column (Mono-Q).

Les pics élués à partir de la colonne Mono-Q à différentes concentrations de NaCl ont été soumis à des électrophorèses en une et deux dimensions sur des gels de polyacrylamide SDS et analysés en Western blot sur des membranes Immobilon PVDF. Les glycoprotéines présentes sur les membranes Immobilon ont été directement séquencées en utilisant un séquenceur automatique en phase gazeuse. La colonne WGA a permis de lier un mélange d'antigènes comprenant la gpIb, la gpIIIb (ou gpIV) la gpIIb-IIIa en plus d'un certain nombre de protéines telles que gpl50/155 (poids moléculaire non réduit/réduit) gap150/130, gap130/135, gp128/132 et gap115/120. Ces glycoprotéines séparées par FPLC ont ensuite pu être identifiées en utilisant un anticorps monoclonal (AcM) ou des anticorps polyclonaux. La gp128/132 a été identifiée comme correspondant' a la GMP140 ou PADGEM par un anticorps monoclonal LYP21. La gplSO/155-et la gp132/135 ont été identifiées sous s forme de complexe GPIa-IIa par un anticorps monoclonal LYP22.La colonne LCH a permis de lier principalem,ent le complexe GPIIb-IIIa, identifié par un anticorps monoclonal anti-GPIIb-IIIa (LYP4).The peaks eluted from the Mono-Q column at different NaCl concentrations were subjected to one- and two-dimensional electrophoresis on SDS polyacrylamide gels and analyzed in Western blot on Immobilon PVDF membranes. The glycoproteins present on Immobilon membranes were directly sequenced using an automatic gas phase sequencer. The WGA column made it possible to link a mixture of antigens including gpIb, gpIIIb (or gpIV) gpIIb-IIIa in addition to a certain number of proteins such as gpl50 / 155 (molecular weight not reduced / reduced) gap150 / 130, gap130 / 135, gp128 / 132 and gap115 / 120. These FPLC-separated glycoproteins could then be identified using a monoclonal antibody (mAb) or polyclonal antibodies. Gp128 / 132 has been identified as corresponding to GMP140 or PADGEM by a monoclonal antibody LYP21. GplSO / 155- and gp132 / 135 were identified as a GPIa-IIa complex by a monoclonal antibody LYP22. The LCH column was used to link mainly the GPIIb-IIIa complex, identified by an anti-monoclonal antibody. GPIIb-IIIa (LYP4).

Les parties N-terminales d'un nombre limité de ces glycoprotéines séparées ont été microséquencées en utilisant un séquenceur en phase gazeuse. L'usage combiné de FPLC et du séquençage en phase gazeuse permet un isolement rapide et une caractérisation des glycoprotéines plaquettaires. Par ailleurs, l'identification des séquences d'acides aminés Nterminales permet la synthèse de sondes oligonucléotidiques pour cribler et isoler différents clones cDNA de glycoprotéines à partir de banques de données.The N-terminal portions of a limited number of these separate glycoproteins were microsequenced using a gas phase sequencer. The combined use of FPLC and gas phase sequencing allows rapid isolation and characterization of platelet glycoproteins. Furthermore, the identification of Nterminal amino acid sequences allows the synthesis of oligonucleotide probes to screen and isolate different cDNA clones of glycoproteins from databases.

Matériels et méthodes
Préparation des membranes
Des concentrés de plaquettes humaines ont été obtenus au centre de transfusion sanguine de Beynost.Materials and methods
Preparation of membranes
Human platelet concentrates were obtained from the Beynost blood transfusion center.

Les membranes plaquettaires ont été préparées selon la méthode décrite par Cooper et al (1979, Proc. Natl.The platelet membranes were prepared according to the method described by Cooper et al (1979, Proc. Natl.

Acad. Sci. 76: 1069-11073), en utilisant 10 unités de concentré de plaquettes humaines (50.10/unité). Les globules rouges sédimentés ont été séparés des plaquettes par centrifugation, à 160g pendant 25 minutes, a 25 C. Les plaquettes ont été isolées et lavées en utilisant la méthode de Massini et al modifiée par Mc Gregor et al, (respectivement 1974,
Biochimica and Phyica Acta 372: 109-121; 1979, Thromb.Acad. Sci. 76: 1069-11073), using 10 units of human platelet concentrate (50.10 / unit). The sedimented red blood cells were separated from the platelets by centrifugation, at 160 g for 25 minutes, at 25 C. The platelets were isolated and washed using the method of Massini et al modified by Mc Gregor et al, (respectively 1974,
Biochimica and Phyica Acta 372: 109-121; 1979, Thromb.

Res. 16: 437-452). Les plaquettes lavées ont été resuspendues (5.10/ml) dans 15 mM Tris (Hydroxymethyl-Aminométhane) -HCL (Boerhinger
Mannheim, Meylan France) à pH 7,4 avec 5mM EDTA (BDH,
Poole, Grande Bretagne) et 1 uM de leupeptine (Boerhinger Mannheim). Ces plaquettes ont ensuite été soumises à un appareil à sonication Branson réglé sur le mode discontinu avec un cycle d'opération de 50 % et un niveau dtintensité des ultrasons de 5. Les plaquettes traitées par ultrasons ont été centrifugées à 40C pendant 20 minutes à 9000g dans un rotor à angle fixe SS34 en utilisant une centrifugeuse Sorvall RC2B (Dupont de Nemours, Newtown, Connecticut, . USA). Le surnageant a ensuite été retiré et centrifugé pendant une heure à 40C à 100 000g dans un rotor à angle variable TST 55.5 en utilisant une centrifugeuse
Kontron 2060 (Kontron, Zurich, Swisse).Les membranes sous forme de culot ont été resuspendues dans un tampon contenant 10 mM Tris-HCL à pH 8,2, dans 5 mM
EDTA et 1 uM de leupeptine.Res. 16: 437-452). The washed platelets were resuspended (5.10 / ml) in 15 mM Tris (Hydroxymethyl-Aminomethane) -HCL (Boerhinger
Mannheim, Meylan France) at pH 7.4 with 5mM EDTA (BDH,
Poole, Great Britain) and 1 µM leupeptin (Boerhinger Mannheim). These wafers were then subjected to a Branson sonication device set to batch mode with an operating cycle of 50% and an ultrasound intensity level of 5. The wafers treated by ultrasound were centrifuged at 40C for 20 minutes at 9000g in a fixed angle rotor SS34 using a Sorvall RC2B centrifuge (Dupont de Nemours, Newtown, Connecticut,. USA). The supernatant was then removed and centrifuged for one hour at 40C at 100,000g in a TST 55.5 variable angle rotor using a centrifuge.
Kontron 2060 (Kontron, Zurich, Swisse). The pellet membranes were resuspended in a buffer containing 10 mM Tris-HCL at pH 8.2, in 5 mM
EDTA and 1 µM leupeptin.

Extraction avec le sodium deoxycholate (DOC):
Les membranes plaquettaires ont été traitées pendant 30 minutes à 40C avec du sodium deoxycholate 1 % (w/w) (Merck, Darmstadt, RFA) dans 10 MM Tris-HCl à pH 8,2 avec 5 mM EDTA et 1 pM de leupeptine. Les membranes extraites des plaquettes ont été soumises à une ultracentrifugation à 40C pendant 30 minutes à 100000 g dans un rotor à angle variable TST 55.5 en utilisant une centrifugeuse Kontron 2060. Le surnageant ultracentrifugé a été collecté.Extraction with sodium deoxycholate (DOC):
The platelet membranes were treated for 30 minutes at 40C with sodium deoxycholate 1% (w / w) (Merck, Darmstadt, RFA) in 10 MM Tris-HCl at pH 8.2 with 5 mM EDTA and 1 pM leupeptin. The membranes extracted from the platelets were subjected to ultracentrifugation at 40C for 30 minutes at 100,000 g in a TST 55.5 variable angle rotor using a Kontron 2060 centrifuge. The ultracentrifuged supernatant was collected.

Chromatoqranhie d'affinité sur lectine
Le germe de blé-lectine (WGA) lié au Sepharose 6MB (Pharmacia, Uppsala, Suède) a été placé dans une colonne de verre HR10/10 (100 mm x 10 mm) (Pharmacia).Lectin affinity chromatography
The wheat germ lectin (WGA) linked to Sepharose 6MB (Pharmacia, Uppsala, Sweden) was placed in an HR10 / 10 glass column (100 mm × 10 mm) (Pharmacia).

La colonne a ensuite été reliée à un système de chromatographie rapide en phase liquide (FPLC) (Phareacia). La colonne a été équilibrée dans un tampon de départ contenant 10 mM Tris-HCl à pH 8,2 avec 0,5 % DOC, 5 mM EDTA. Les membranes des plaquettes solubilisées ont été déposées sur la colonne avec un débit de 0,5 ml/mn et la colonne a été lavée avec unX tampon de départ jusqu'à l'obtention d'une de;isité optique égale à la valeur de base. Les glycoprotéines liées à la colonne de WGA ont été éluées aveç un sucre, le N-Acetyl Glucosamine 2,5 % [Sigma, Saint Louis, MO, USA). Les pics d'élution ont été dialysés pendant une nuit contre 10 mM Tris-HCl à pH 7,4 avec 0,1 % de lubrol PX (Sigma).The column was then connected to a rapid liquid chromatography (FPLC) system (Phareacia). The column was equilibrated in a starting buffer containing 10 mM Tris-HCl at pH 8.2 with 0.5% DOC, 5 mM EDTA. The membranes of the solubilized platelets were deposited on the column with a flow rate of 0.5 ml / min and the column was washed with a starting buffer until an optical loss equal to the value of based. The glycoproteins linked to the WGA column were eluted with a sugar, N-Acetyl Glucosamine 2.5% [Sigma, Saint Louis, MO, USA). The elution peaks were dialyzed overnight against 10 mM Tris-HCl at pH 7.4 with 0.1% lubrol PX (Sigma).

Chromatographie d'échange d'anions:
Les glycoprotéines éluées à partir de la colonne de lectine et resuspendues dans du lubrol PX ont été placées sur une colonne d'échange d'anions MONO Q
HR5/5 (50 mm x 5 mm) (Pharmacia). Le tampon de départ contenait 0,1 % de lubrol PX dans 20 mM Tris-HCl à pH -7,4 et le tampon final était compsé de 0,1 % lubrol PX dans Tris-HCl a pli 7,4 contenant 1M de chlorure de sodium (Merck). Un grandient a été établi pendant 25 minutes avec un débit de 1 ml/mn. Anion exchange chromatography:
Glycoproteins eluted from the lectin column and resuspended in PX lubrol were placed on a MONO Q anion exchange column
HR5 / 5 (50 mm x 5 mm) (Pharmacia). The starting buffer contained 0.1% lubrol PX in 20 mM Tris-HCl at pH -7.4 and the final buffer was 0.1% lubrol PX in Tris-HCl folded 7.4 containing 1M chloride sodium (Merck). A grandient was established for 25 minutes with a flow rate of 1 ml / min.

Chromatographie d'immunoaffinité
Les glycoprotéines éluées à partir de la colonne
MONO Q ont été- identifiées sur des colonnes d'immunoaffinité en utilisant les anticorps monoclonaux LYP21 (dirigés contre la GMP140) et LYP22 (dirigés contre la gplIa) liés au Sepharose-4B. Ces anticorps ont été obvenus après immunisation de souris avec un mélange de glycoprotéines isolées par affinité sur colonne WGA et chromatographie d'échange d'anions.Immunoaffinity chromatography
Glycoproteins eluted from the column
MONO Q were identified on immunoaffinity columns using the monoclonal antibodies LYP21 (directed against GMP140) and LYP22 (directed against gplIa) linked to Sepharose-4B. These antibodies were obtained after immunization of mice with a mixture of glycoproteins isolated by affinity on a WGA column and anion exchange chromatography.

Les glycoprotéines IIb-IIIa ont été identifiées sur colonne d'immunoaffinité en utilisant l'anticorps monoclonal LYP4 décrit par Mc Gregor et al (1986, Eur.The glycoproteins IIb-IIIa were identified on an immunoaffinity column using the monoclonal antibody LYP4 described by Mc Gregor et al (1986, Eur.

J. Biochem. 159: 443-440).J. Biochem. 159: 443-440).

EXEMPLE 2 - Inhibition de l'agrégation plaauettaire induite par le collagène, avec des anticorps monoclonaux anti gpIa-IIa,
On a mis en évidence qu'une glycoprotéine (gp) Ia-IIa (VLA-2) a un rôle important dans l'adhésion des plaquettes au collagène. Les plaquettes d'un patient présentant un défaut en gpIa ne subissent pas d'agrégation en réponse au collagène. Un anticorps monclonal LYP22, a été obtenu à partir de souris immunisées avec un mélange de glycoprotéines membranaires de plaquettes, isolées par chromatographie d'affinité à l'aide d'agglutinine de germe de blé couplée à une chromatographie d'échange d'anions.EXAMPLE 2 Inhibition of collagen-induced platelet aggregation with anti-gpIa-IIa monoclonal antibodies,
It has been demonstrated that a glycoprotein (gp) Ia-IIa (VLA-2) has an important role in the adhesion of platelets to collagen. The platelets of a patient with a gpIa defect do not undergo aggregation in response to collagen. A monclonal antibody LYP22, was obtained from mice immunized with a mixture of membrane glycoproteins from platelets, isolated by affinity chromatography using wheat germ agglutinin coupled with anion exchange chromatography.

Une immunoprécipitation ultérieure d'un lysat de plaquettes solubilisées dans un détergent, iodées en surface, a montré que LYP22 précipitait deux glycoprotéines ayant un poids moléculaire estimé dans des conditions non réductrices et réductrices (NR/R) de 140/155 kDa, et de 120/135 kDa respectivement. Les changements des poids moléculaires de ces deux glycoprotéines dus à la réduction sont en accord avec ceux précédemment décrits -pour GPIa et bPIIa respectivement. Quand des plaquettes solubilisées avec du Lubrol ont été mises en contact avec le LYP22 sur une colonne d'affinité de sépharose, deux autres glycoprotéines (120/128 et 100/105 kDa) ont été détectées en quantité beaucoup plus faible à l'aide du bleu de Coomassie.Des études des liaisons de l'anticorps LYP22 marqué avec l'iode 125 (Il25) aux plaquettes ont montré que les liaisons sont de l'ordre de 7708 + 928 molécules par plaquette au repos et 8940 # 86 liaisons de molécules par plaquette activée avec la thrombine (Kd = 65,6nM i 1,43nM). Ces données suggèrent que l'expression en surface des sites de liaisons au LYP22 n'est pas augmentée après l'activation des plaquettes. Subsequent immunoprecipitation of a lysate of surface-iodized, detergent-dissolved platelets showed that LYP22 precipitated two glycoproteins having an estimated molecular weight under non-reducing and reducing conditions (NR / R) of 140/155 kDa, and 120/135 kDa respectively. The changes in molecular weights of these two glycoproteins due to the reduction are in agreement with those previously described - for GPIa and bPIIa respectively. When platelets solubilized with Lubrol were contacted with LYP22 on a sepharose affinity column, two other glycoproteins (120/128 and 100/105 kDa) were detected in much lower quantities using the Coomassie blue. Studies of the binding of the antibody LYP22 labeled with iodine 125 (Il25) to platelets have shown that the bonds are of the order of 7708 + 928 molecules per plate at rest and 8940 # 86 molecule bonds. by platelet activated with thrombin (Kd = 65.6nM i 1.43nM). These data suggest that surface expression of LYP22 binding sites is not increased after activation of platelets.

Pour déterminer l'effet de LYP22 sur les fonctions plaquettaires, des études d'agrégation avec des plaquettes humaines lavées ont été réalisées. To determine the effect of LYP22 on platelet function, aggregation studies with washed human platelets were performed.

LYP22 inhibe partiellement l'agrégation plaquettaire induite par une faible dose de collagène (lug/ML) mais n'a pas d'effet sur d'autres agonistes. Cependant,
LYP22 n*a pas d'effet sur l'adhésion des plaquettes au collagène, à la fibronectine ou au fibrinogène en présence de 2 mK de magnésium ou de calcium.LYP22 partially inhibits platelet aggregation induced by a low dose of collagen (lug / ML) but has no effect on other agonists. However,
LYP22 has no effect on the adhesion of platelets to collagen, fibronectin or fibrinogen in the presence of 2 mK of magnesium or calcium.

Ces résultats montrent que
a/ LYP22 est dirigé contre le complexe GPIa-IIa,
b/ le complexe GPIa-IIa peut être lié à deux autres protéines qui ne ont pas exprisées à la surface des plaquettes,
c/ le complexe GPIa-IIa est impliqué dans l'agrégation plaquettaire induite par le collagène.These results show that
a / LYP22 is directed against the GPIa-IIa complex,
b / the GPIa-IIa complex can be linked to two other proteins which have not expressed on the surface of the platelets,
c / the GPIa-IIa complex is involved in collagen-induced platelet aggregation.

EXEMPLE 3 - Inhibition des fonctions plaguettaires de plaquettes humaines' Par fln anticorps monoclonal LYP20 dirigé contre une glycoprotéine de membrane dont l'exPression dépend de l'activation.EXAMPLE 3 Inhibition of the Plaguettary Functions of Human Platelets By a monoclonal antibody LYP20 directed against a membrane glycoprotein, the expression of which depends on activation.

Un nombre limité de glycoprotéines de membrane (Ib, IIb-IIIa, Ia-II,a, Ic-IIa, IIIb), jouent un rôle important dans l'agrégation plaquettaire et l'adhésion. On a utilisé les anticorps monoclonaux LYP2O-et LYP21. Les anticorps LYP20 ont été obtenus après ismunisation d'une souris BALB/C avec un concentré de plaquettes de sang humain lavées, traitées à la chymotrypsine. Les anticorps monoclonaux LYP21 ont été obtenus avec des glycoprotéines de membrane de plaquettes éluées à partir d'une colonne d'affinité à l'agglutinine de germe de blé.L'immunoprécipitation faisant appel à des lysats plaquettaires marqués en surface, activés à l'aide de thrombine, a montré que LYP20 et LYP21 précipitent une protéine de 128 kDa (non réduite) et 132 kDa (réduite) qui est appelée gap128. Les anticorps LYP20 et LYP21 reconnaissent des épitopes distincts sur la gp128, le déterminant antigénique de LYP20 étant dépendant de la présence de ponts disulfure intacts. Des plaquettes au repos lavées ont permis de lier 2400 + 270 molécules par anticorps LYP20 marqué avec l'iode 125 et 12.200 + 1.184 molécules par anticorps après activation par 1 U/ml de thrombine. A limited number of membrane glycoproteins (Ib, IIb-IIIa, Ia-II, a, Ic-IIa, IIIb) play an important role in platelet aggregation and adhesion. The monoclonal antibodies LYP2O- and LYP21 were used. The LYP20 antibodies were obtained after immunization of a BALB / C mouse with a concentrate of washed human blood platelets, treated with chymotrypsin. The monoclonal antibodies LYP21 were obtained with platelet membrane glycoproteins eluted from a wheat germ agglutinin affinity column. Immunoprecipitation using surface-labeled platelet lysates activated at using thrombin, showed that LYP20 and LYP21 precipitate a protein of 128 kDa (unreduced) and 132 kDa (reduced) which is called gap128. The antibodies LYP20 and LYP21 recognize distinct epitopes on gp128, the antigenic determinant of LYP20 being dependent on the presence of intact disulfide bridges. Washed resting platelets made it possible to bind 2400 + 270 molecules per antibody LYP20 labeled with iodine 125 and 12,200 + 1,184 molecules per antibody after activation with 1 U / ml of thrombin.

Ces données montrent que LYP20 et LYP21 sont dirigés contre une protéine de surface plaquettaire (gap128) dont l'expression dépend de l'activation plaquettaire et de la sécrétion. La gp128 migre conjointement avec l'antigène plaquettaire immunoprécipité par un anticorps dirigé contre la glycoprotéine GMP140 ou
PADGEM. Ceci montre que la gp128 est liée ou identique à la GMP140 ou PADGEM. Afin de déterminer le rôle potentiel de la gp128 dans les fonctions plaquettaires, les études concernant l'agrégation avec des plaquettes humaines lavées ont été réalisées. Des fragments F(ab)z' de LYP20 mais pas de LYP21 inhibent partiellement l'agrégation plaquettaire et la libération induite par 2,5uM d'ADP, 2ug/ml de collagène et 0,016U/ml de thrombine.Ces résultats montrent que
a/ LYP20 et LYP21 sont dirigés contre des épi topes différents de la protéine de surface plaquettaire (gp128) dont l'expression dépend de l'activatión plaquettaire
bX la gp128 est liée ou identique à la GMP140 ou PADGEM
c/ la gpl28 exposée à la surface de plaquettes activées peut jouer un rôle important dans l'agrégation plaquettaire.These data show that LYP20 and LYP21 are directed against a platelet surface protein (gap128) whose expression depends on platelet activation and secretion. Gp128 migrates jointly with the platelet antigen immunoprecipitated by an antibody directed against the glycoprotein GMP140 or
PADGEM. This shows that gp128 is linked to or identical to GMP140 or PADGEM. In order to determine the potential role of gp128 in platelet functions, studies on aggregation with washed human platelets were performed. F (ab) z 'fragments of LYP20 but not of LYP21 partially inhibit platelet aggregation and release induced by 2.5 uM ADP, 2 µg / ml collagen and 0.016 U / ml thrombin. These results show that
a / LYP20 and LYP21 are directed against different epi topes of the platelet surface protein (gp128) whose expression depends on the platelet activation
bX the gp128 is linked or identical to the GMP140 or PADGEM
c / gpl28 exposed on the surface of activated platelets can play an important role in platelet aggregation.

EXEMPLE 4 - Préparation d'anticorPs monoclonaux dirigés contre la glycoprotéine GMP 140
- Matériel
L'adénosyldiphosphate (ADP), l'aprotinine, la fibronectine (FN), la lactoperoxidase et la leupeptine, le lubrol WX, la N-acétyl glucosamine, l'orthophényldiamine (OPD), le fluorure de phénylméthylsulphonyle (PMSF), la prostaglandine El (PGE1) et le triton X-100 ont été obtenus auprès de
Sigma (stLouis, MO, USA). Le 5' Chrome, l'125 Iode et la 14C séroténine ont été obtenus chez Amersham
International (U.R.). La peroxidase de raifort conjuguée a des anticorps anti-souris de chèvre, la gélatine, le réactif de développement de couleur HRP et le Tween 20 ont été obtenus auprès de BioRad (Richront, CA, USA).Le sodium deoxycholate (DOC), le dithiothreitol (DTT), la leupeptine et le PMSF ont été obtenus auprès de Merck (Darmstadt, RFA). Le polyethylene Glycol (PEG) et le Sodium Dodecyl Sulphate (8DS) ont été obtenus auprès de BDH (Poole,
U.K.) te gel à flux rapide Q-sepharose (Q Sepharose fast flow gel (marque déposée)), la protéine A sépharose, l'agglutinine de germe de blé (WGA) et un système complet FPLC ont été obtenus auprès de
Pharmacia (Uppsala, Suède). La sérum albumine bovine (BSA) et les anticorps IgG anti-souris de lapin proviennent de Miles Laboratories (Naperville, IL, USA). Le collagène provient de Hormon-Chemie (Munich,
RFA).La Thrombine a été obtenue auprès de Hoffman-La
Roche (Bâle, Suisse) et l'alpha-thrombine, le fibrinogène (FG) proviennent de IMCO. La pansorbine provient de Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Tous les.EXAMPLE 4 Preparation of Monoclonal Antibodies Directed Against the GMP 140 Glycoprotein
- Hardware
Adenosyldiphosphate (ADP), aprotinin, fibronectin (FN), lactoperoxidase and leupeptin, lubrol WX, N-acetyl glucosamine, orthophenyldiamine (OPD), phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), prostaglandin El (PGE1) and triton X-100 were obtained from
Sigma (stLouis, MO, USA). 5 'Chromium, 125 Iodine and 14C serotenin were obtained from Amersham
International (UR). Horseradish peroxidase conjugated to goat anti-mouse antibodies, gelatin, HRP color development reagent and Tween 20 were obtained from BioRad (Richront, CA, USA). Sodium deoxycholate (DOC), dithiothreitol (DTT), leupeptin and PMSF were obtained from Merck (Darmstadt, RFA). Polyethylene Glycol (PEG) and Sodium Dodecyl Sulphate (8DS) were obtained from BDH (Poole,
UK) te Sepharose fast flow gel (Q Sepharose fast flow gel), protein A sepharose, wheat germ agglutinin (WGA) and a complete FPLC system were obtained from
Pharmacia (Uppsala, Sweden). Bovine serum albumin (BSA) and rabbit mouse IgG antibodies are from Miles Laboratories (Naperville, IL, USA). Collagen comes from Hormon-Chemie (Munich,
FRG). Thrombin was obtained from Hoffman-La
Roche (Basel, Switzerland) and alpha-thrombin, fibrinogen (FG) come from IMCO. Pansorbine is from Calbiochem (La Jolla, CA, USA). All.

réactifs de culture cellulaire ont été obtenus auprès des laboratoires Flow (Les Ulis, France) et Intermed (Lyon, France). Le 2,4,6,10 teramethylpentadecane (Pristane) provient de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA). Les membranes de difluorure de polyvinylidène (Immobilon) proviennent de Millipore
Corporation (Bedford, MA, USA}. Le D-phényl-L-propyl
L-arginine chloromethyl cétone (PPACK) proviennent de
Calbiochem-Behring (Paris, France).cell culture reagents were obtained from Flow (Les Ulis, France) and Intermed (Lyon, France) laboratories. 2,4,6,10 teramethylpentadecane (Pristane) comes from Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA). Polyvinylidene difluoride membranes (Immobilon) come from Millipore
Corporation (Bedford, MA, USA}. D-phenyl-L-propyl
L-arginine chloromethyl ketone (PPACK) comes from
Calbiochem-Behring (Paris, France).

- Méthodes
a) Préparation de Plaquettes et Marquage
Des concentrés de plaquettes (Centre de
Transfusion Sanguine de de Beynost) ont été lavés selon la technique de Massini et al (1974), Biochim biophys. Acta 372, 109-121.- Methods
a) Preparation of Platelets and Marking
Platelet concentrates (Center for
Beynost's Blood Transfusion) were washed using the technique of Massini et al (1974), Biochim biophys. Acta 372, 109-121.

Les protéines de surface ont été iodées selon la méthode décrite par Philipps et Al. (1977) J. Clin. The surface proteins were iodinated according to the method described by Philipps et Al. (1977) J. Clin.

Invest. 60, 535-545, en utilisant la lactoperoxidase.Invest. 60, 535-545, using lactoperoxidase.

Les plaquettes utilisées dans les études de fixation, d'agrégation et d'adhésion proviennent du sang (1 volume ACD : 6 volumes de sang) de volontaires normaux. Les plaquettes ont été isolées et lavées selon la technique de Mustard et Al. (1972) Br. J. The platelets used in the fixation, aggregation and adhesion studies come from the blood (1 volume ACD: 6 volumes of blood) of normal volunteers. The plates were isolated and washed according to the technique of Mustard et Al. (1972) Br. J.

Haematol. 22, 193-204 avec de légères modifications 20 ng/ml PGE1 et 10-6M PPACK ont été ajoutés au premier lavage. Haematol. 22, 193-204 with slight modifications 20 ng / ml PGE1 and 10-6M PPACK were added on the first wash.

b) Isolement des glycoprotéines de membrane plaquettaire
Les plaquettes lavées conformément à la méthode de Massini et Al. citée. plus haut ont été resuspendues à 40 x 10@ cellules/ml dans 0,02 M Tris-HCl à pH 8,6, avec 0,005 M EDTA, 1% (w/v} de DOC, 17U/ml d'aprotinine, lmM de leupeptine. La solubilisation à été réalisée à 40C sous agitation constante pendant une heure. Le . lysat a été centrifugé à 100.000 g pendant une heure à 40C. Le surnageant a été dilué dans 5 volumes de 0,02 M Tris-HCl à pH 8,6, lmM EDTA, 0,5% (w/v) DOC tampon A) et déposé sur une colonne de sépharose 6B-WGA.La colonne était pré-équilibrée dans le tampon A et couplée à un système de chromatographie rapide en phase liquide (FPLC). La colonne a été lavée à 0,4 ml/minute avec le tampon A jusqu'a ce que le matériel non fixé soit éliminé. La fraction spécifiquement liée a été éluée par 2,5% (w/v) de Nacétyl glucosamine. La fraction collectée a été dialysée pendant une nuit contre un mélange de 0,02 M
Tris-HCl à PH 7,4 avec 0,005 M EDTA et 0,1% de Lubrol
PX à 4 C. L'échantillon dialysé a été soumis à une chromathographie d'échange d'anions en utilisant une colonne Q å flux rapide, reliée au système FPLC et pré-équilibrée dans 0,02 M Tris-HCl à pH 7,4 contenant 0,1% (w/v) de lubrol WX (tampon B).L'échantillon a été appliqué sur la colonne à un débit de 2 ml par minute et les différentes fractions ont été éluées en utilisant un gradient de NaCl(0 à l M) dans le tampon
B. Chaque fraction a été collectée, concentrée et analysée par SDS-PAGE en utilisant la technique
Laemmli (1970) Nature 227, 680-685. La concentration de protéine a été déterminée par la méthode de Lowry (1951) modifée par Markwell (1978) Anal. Biochem. 87, 206-210. Pour plus de détails concernant l'isolement des glycoprotéines on pourra se reporter à exemple 1.b) Isolation of platelet membrane glycoproteins
The plates washed in accordance with the method of Massini et Al. Cited. above were resuspended at 40 x 10 @ cells / ml in 0.02 M Tris-HCl at pH 8.6, with 0.005 M EDTA, 1% (w / v} DOC, 17U / ml aprotinin, lmM of leupeptin. The solubilization was carried out at 40C with constant stirring for one hour. The. lysate was centrifuged at 100,000 g for one hour at 40C. The supernatant was diluted in 5 volumes of 0.02 M Tris-HCl at pH 8.6, lmM EDTA, 0.5% (w / v) DOC buffer A) and deposited on a sepharose column 6B-WGA. The column was pre-equilibrated in buffer A and coupled to a rapid chromatography system in liquid phase (FPLC). The column was washed at 0.4 ml / minute with buffer A until the loose material was removed. The specifically bound fraction was eluted with 2.5% (w / v) of Nacetyl glucosamine. The collected fraction was dialyzed overnight against a mixture of 0.02 M
Tris-HCl at pH 7.4 with 0.005 M EDTA and 0.1% Lubrol
PX at 4 C. The dialysed sample was subjected to an anion exchange chromathography using a fast flow Q column, connected to the FPLC system and pre-equilibrated in 0.02 M Tris-HCl at pH 7, 4 containing 0.1% (w / v) of lubrol WX (buffer B). The sample was applied to the column at a flow rate of 2 ml per minute and the different fractions were eluted using an NaCl gradient ( 0 to l M) in the buffer
B. Each fraction was collected, concentrated and analyzed by SDS-PAGE using the technique
Laemmli (1970) Nature 227, 680-685. The protein concentration was determined by the method of Lowry (1951) modified by Markwell (1978) Anal. Biochem. 87, 206-210. For more details concerning the isolation of glycoproteins, reference may be made to example 1.

c) Production d'anticorps monoclonaux
c.l) Préparation de l'anticorps LYP21
Des souris BALB/c (des femelles de 6 semaines), obtenues chez IFFA CREDO (L'Arbresle, France), ont été immunisées intrapéritonéalement avec 100ug d'un mélange de 4 glycoprotéines (isolées de la façon décrite ci-dessus et correspondant aux glycoprotéines GMP140, Ia, Ic, IIa, GP110-115), avec un volume égal d'adjuvant complet de. Freund. Deux semaines plus tard, 100ug de l'antigène ont été injectés aux souris en présence d'adjuvant incomplet de Freund.c) Production of monoclonal antibodies
cl) Preparation of the LYP21 antibody
BALB / c mice (6 week old females), obtained from IFFA CREDO (L'Arbresle, France), were immunized intraperitoneally with 100 μg of a mixture of 4 glycoproteins (isolated as described above and corresponding to glycoproteins GMP140, Ia, Ic, IIa, GP110-115), with an equal volume of complete adjuvant of. Freund. Two weeks later, 100 µg of the antigen was injected into the mice in the presence of incomplete Freund's adjuvant.

On a vérifié que le sérum des souris réagissait vis à vis de l'antigène en utilisant la technique
ELISA. A cet égard, on rappelle brièvement la technique : des puits de plastique ont été recouverts avec 100u1 d'antigène (mélange de 4 glycoprotéines) dilués à 2pg/ml dans un tampon de bicarbonate (25 mM
Na2CO3, 25mM NaHCO3, pH 9,6) laissés pendant 3 heures à 370C. Les puits ont été lavés et saturés avec 0,5% de BSA dans un tampon Tris(l5mM Tris-HCl, pH 7,4, 2mM
CaCl2, 0,05% (w/v) Tween) pendant 30 minutes à température ambiante.Le sérum de souris ou les surnageants d'hybridomes (100p1) ont été incubés dans les puits pendant.l heure à 370C. Après 3 lavages dans un tampon Tris, un anticorps. anti-souris de chèvre (anticorps secondaire, dilué à 1/3000) conjugé à la peroxidase a été ajouté à chaque puits et soumis à réaction pendant 30 minutes à 370C. Les puits ont ensuite été lavés une nouvelle fois et remplis avec une solution de 100p1 de substrat (4 mg OPD dans 10 ml de 0,1M tampon citrate, à pH 5, avec 0,7 ul de 30%HzO2). La réaction a été arrêtée avec 100 l de 4NH2SO4, 4N. La densité optique a été mesurée avec un lecteur de plaque.The serum of the mice was verified to react with the antigen using the technique
ELISA. In this regard, the technique is briefly recalled: plastic wells were covered with 100 μl of antigen (mixture of 4 glycoproteins) diluted to 2 μg / ml in a bicarbonate buffer (25 mM
Na2CO3, 25mM NaHCO3, pH 9.6) left for 3 hours at 370C. The wells were washed and saturated with 0.5% BSA in Tris buffer (15 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM
CaCl2, 0.05% (w / v) Tween) for 30 minutes at room temperature. Mouse serum or hybridoma supernatants (100p1) were incubated in the wells for 1 hour at 370C. After 3 washes in Tris buffer, an antibody. goat anti-mouse (secondary antibody, diluted to 1/3000) conjugated with peroxidase was added to each well and subjected to reaction for 30 minutes at 370C. The wells were then washed again and filled with a solution of 100 μl of substrate (4 mg OPD in 10 ml of 0.1M citrate buffer, pH 5, with 0.7 μl of 30% HzO2). The reaction was stopped with 100 l of 4NH2SO4, 4N. The optical density was measured with a plate reader.

Quatre semaines après la première injection, les souris immunisées ont subi un rappel avec i00pg de mélange d'antigènes. Les cellules spléniques ont été fusionnées 4 jours plus tard selon la méthode de Kohler et Milstein (1975) Nature 256, 177-18.1, avec des cellules myelomateuses 23X63Ag8 selon un rapport de lO:l, en présence de PEG. Les hybridomes ont été divises,. 24 heures plus tard, sur des plaques à 24 puits, dans un milieu hypoxanthine/aminoptérine/thymidine (HAT) avec des macrophages du péritoine de souris non immunes de la même souche que les souris immunisées, en tant que cellules nourricières.Les surnageants d'hybridomes ont été criblés en utilisant la technique ELISA décrite plus haut. Des surnageants positifs ont été testés pour leur capacité d'accrochage aux antigènes de surface de membrane plaquettaire marqués, selon le protocole décrit dans la partie "Immunoprécipitation", ainsi que pour leur capacité d'accrochage sur des antigènes de membrane plaquettaire non marqués, transférés sur des membranes Immobilon selon le protocole décrit dans "Ismunoblot". Des puits positifs ont été clonés et sous-clonés par dilution limitée et criblés à nouveau en utilisant les mêmes techniques avant la. production d'ascites dans les souris BALB/c traitées avec du pristane. Des immunoglobulines onoclonales ont été purifiées par la méthode Ey et al. (1978) Immunochemistry 15, 429-436 en utilisant une chromatotraphie d'affinité sur protéine Asépharose, Les fragments F(ab'): d'un anticorps monoclonal ont été préparés conformément à la technique décrite Lamoyi et al (1986) Meth in Enzym, vol 121, p 652-663, Acad. Press INC.  Four weeks after the first injection, the immunized mice were boosted with i00pg of the mixture of antigens. The spleen cells were fused 4 days later according to the method of Kohler and Milstein (1975) Nature 256, 177-18.1, with myeloma cells 23X63Ag8 in a ratio of 10: 1, in the presence of PEG. The hybridomas were divided ,. 24 hours later, on 24-well plates, in hypoxanthine / aminopterin / thymidine (HAT) medium with macrophages of the peritoneum of non-immune mice of the same strain as the immunized mice, as feeder cells. hybridomas were screened using the ELISA technique described above. Positive supernatants were tested for their ability to attach to labeled platelet membrane surface antigens, according to the protocol described in the "Immunoprecipitation" section, as well as for their ability to attach to unmarked, transferred platelet membrane antigens. on Immobilon membranes according to the protocol described in "Ismunoblot". Positive wells were cloned and subcloned by limited dilution and re-screened using the same techniques before the. production of ascites in BALB / c mice treated with pristane. Onoclonal immunoglobulins were purified by the method Ey et al. (1978) Immunochemistry 15, 429-436 using affinity chromatography on protein Asepharose, F (ab '): fragments of a monoclonal antibody were prepared according to the technique described Lamoyi et al (1986) Meth in Enzym , vol 121, p 652-663, Acad. Press INC.

c.2) Préparation de l'anticorps LYP20
L'anticorps monoclonal LYP20a a été obtenu après immunisation de souris BALB/C avec des plaquettes de sang humain traitées à la chymotrypsine et lavées.c.2) Preparation of the LYP20 antibody
The monoclonal antibody LYP20a was obtained after immunization of BALB / C mice with platelets of human blood treated with chymotrypsin and washed.

Le traitement à la chymotrypsine (0,2 mg/ml/l09 plaquettes) a été fait pendant 30 minutes à 370C. Les plaquettes ont ensuite été lavées. Les plaquettes traitées à la chymotrypsine (1 x 108 plaquettes/100 ml) ont été mélangées avec un volume égal (100 ml) d'adjuvant complet et injectées intrapéritonéalement à des souris BALB/C. Les souris ont été immunisées 3 fois en 3 semaines avec les plaquettes ainsi traitées. Treatment with chymotrypsin (0.2 mg / ml / 109 platelets) was done for 30 minutes at 370C. The plates were then washed. The chymotrypsin-treated platelets (1 x 108 platelets / 100 ml) were mixed with an equal volume (100 ml) of complete adjuvant and injected intraperitoneally into BALB / C mice. The mice were immunized 3 times in 3 weeks with the platelets thus treated.

Puis ces souris ont été laissées au repos pendant un mois avant de surbir un rappel avec les plaquettes traitées à la chymotrypsine. Trois. jours après les cellules spléniques (de la rate) ont été prélevées et fusionnées avec des cellules Sp2/O.Ag4 selon la technique décrite précédemment pour préparer les anticorps LYP21. Les surnageants de fusion obtenus avec les plaquettes traitées à la chymotrypsine ont été sélectionnés pour leur capacité à inhiber les fonctions plaquettaires.Then these mice were left to rest for a month before overbearing a booster with the platelets treated with chymotrypsin. Three. days after the spleen cells (from the spleen) were removed and fused with Sp2 / O.Ag4 cells according to the technique described above to prepare the LYP21 antibodies. The fusion supernatants obtained with the platelets treated with chymotrypsin were selected for their capacity to inhibit platelet functions.

Immunopréci ta tion
L'immunoprécipitation a été réalisée selon la méthode décrite par McEver-et al (1984)' J. Biol. Chem.Immunopreci ta tion
The immunoprecipitation was carried out according to the method described by McEver-et al (1984) 'J. Biol. Chem.

259, 9799-9804. Les plaquettes ont été activées (lU/ml de trombine pendant. 10 minutes, suivi par 10-'M
PPACK pendant 10 minutes) préalablement à une iodation, solubilisées dans 0,01M Tris-HCl, 0,15M
NaCl, lmM EDTA, contenant 1% de lubrol PX (tamon S) et microcentrifugées. Les surnageants marqués ont été incubés avec soit le surnageant d'hybridomes, soit le fluide d'ascite ou l'anticorps purifié pendant 2 heures à température ambiante, sous agitation constante. 10 ul- d'anticorps purifié anti-souris de lapin, dilué selon un rapport 1/10 dans le tampon S ont été ajoutés à chaque échantillon et placé sur un agitateur à balancier à température ambiante pendant 30 minutes.La protéine A sépharose (10% dans le tampon S) a été incubée (1 volume de lysat pour 2 volumes de protéines A) avec chaque échantillon, sur un agitateur à balancier pendant 30 minutes à température ambiante. Une centrifugation a ensuite été réalise à 9.000 g pendant 2 minutes dans une centrifugeuse Eppendorf. Chaque culot de centrifugation a été lavé 4 fois dans le tampon S.259, 9799-9804. Platelets were activated (lU / ml trombin for 10 minutes, followed by 10-'M
PPACK for 10 minutes) prior to iodization, dissolved in 0.01M Tris-HCl, 0.15M
NaCl, 1 mM EDTA, containing 1% PX lubrol (S-wire) and microcentrifuged. The labeled supernatants were incubated with either the hybridoma supernatant, the ascites fluid or the purified antibody for 2 hours at room temperature, with constant shaking. 10 μl of purified anti-rabbit mouse antibody, diluted 1/10 in buffer S were added to each sample and placed on a rocking shaker at room temperature for 30 minutes. Protein A Sepharose (10 % in buffer S) was incubated (1 volume of lysate for 2 volumes of protein A) with each sample, on a rocking shaker for 30 minutes at room temperature. Centrifugation was then carried out at 9,000 g for 2 minutes in an Eppendorf centrifuge. Each centrifugation pellet was washed 4 times in buffer S.

Après le dernier lavage, chaque culot a été resuspendu dans 0,4 ml de tampon Laemmli (1970) Nature 227, 680-685, puis chauffé à 1000C pendant 5 minutes. Une partie aliquote de chaque échantillon a été réduite en présence de 0.04M DTT. Tous les échantillons ont été ensuite microcentrifugés et le surnageant a été conservé à -700C.After the last washing, each pellet was resuspended in 0.4 ml of Laemmli (1970) Nature 227 buffer, 680-685, then heated at 1000C for 5 minutes. An aliquot of each sample was reduced in the presence of 0.04M DTT. All samples were then microcentrifuged and the supernatant was stored at -700C.

SDS-PAGE et ismunoblot
Une électrophorèse sur gel en une dimension a été réalisée selon la méthode de Laemmli. La technique
SDS-PAGE en deux dimensions (non réduit/réduit) a été réalisée selon la méthode de Phillips et Al. (1977) J.SDS-PAGE and ismunoblot
One-dimensional gel electrophoresis was performed according to the Laemmli method. The technique
Two-dimensional SDS-PAGE (unreduced / reduced) was performed according to the method of Phillips et Al. (1977) J.

Clin. Invest. 60, 535-545. Les gels ont été colorés à l'argent selon la méthode de Merril ét Al. (1982)
Electrophoresis, 3, 17-23.Clin. Invest. 60, 535-545. The gels were stained with silver according to the method of Merril et al. (1982)
Electrophoresis, 3, 17-23.

Les gels et les membranes Immobilon ont été équilibres dans 0.025M Tris, 0,192 M glycine, à pH8,3, pendant 30 minutes avant de réaliser un western blot. The Immobilon gels and membranes were equilibrated in 0.025M Tris, 0.192 M glycine, at pH 8.3, for 30 minutes before carrying out a western blot.

Les protéines ont été transférêes par électrophorèe selon la méthode de- Towbin (1979) Proc. Acad. Sci.The proteins were transferred by electrophoresis according to the method of-Towbin (1979) Proc. Acad. Sci.

U.S.A. 76, 4350-4354, à partir du gène vers la membrane Immobilon en utilisant un appareil miniblot de BioRad à 100 V pendant une heure. Après le transfert, la membrane a été laissée pendant 30.U.S.A. 76, 4350-4354, from the gene to the Immobilon membrane using a 100 V BioRad miniblot apparatus for one hour. After transfer, the membrane was left for 30.

minutes dans un tampon TBS (0,02 M Tris, 0,05 M NaCl, pH 7.5) contenant 0,05% (w/v) tween-20 et 3% (w/v) de gélatine pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Les bandes Immobilon ont été coupées etplacées dans un tube contenant soit le surnageant d'hybridomes, soit le fluide ascitique soit l'anticorps purifié. Chaque tube a été soumis à réaction sur un bloc pendant une heure à température ambiante. Les bandes ont ensuite été lavées trois fois dans un tampon TBS contenant 0,05% (w/v) de Tween-20 et 1% (w/v) de gélatine. Ils ont ensuite été incubés pendant 30 minutes en présence de peroxidase de raifort conjuguée à des anticorps anti-souris de chèvre, dilués à 1/3000 dans un tampon tween TBS avec 1% de gélatine. Toutes les bandes ont été lavées et une fois dans un tampon TBS-tween et deux fois dans le
TBS.Le substrat a été préparé rapidement en utilisant 60 mg de réactif de développement de couleur HRP dans 20 ml de méthanol à température de la glace, 100 ml de
TBS et 60V1 de 30% de H202. La réaction a été arrêtée en rinçant les bandes avec de l'eau distillée.minutes in TBS buffer (0.02 M Tris, 0.05 M NaCl, pH 7.5) containing 0.05% (w / v) tween-20 and 3% (w / v) gelatin to block binding sites not specific. The Immobilon bands were cut and placed in a tube containing either the hybridoma supernatant, the ascites fluid or the purified antibody. Each tube was subjected to reaction on a block for one hour at room temperature. The strips were then washed three times in TBS buffer containing 0.05% (w / v) Tween-20 and 1% (w / v) gelatin. They were then incubated for 30 minutes in the presence of horseradish peroxidase conjugated to anti-goat mouse antibodies, diluted to 1/3000 in a tween TBS buffer with 1% gelatin. All strips were washed once in TBS-tween buffer and twice in
TBS. The substrate was prepared quickly using 60 mg of HRP color development reagent in 20 ml of methanol at ice temperature, 100 ml of
TBS and 60V1 of 30% H202. The reaction was stopped by rinsing the strips with distilled water.

Etude de la fixation des plaquettes
Le nombre d'anticorps monoclonaux LYP20 ET LYP21 marqués avec I-1 2 5 fixés à des plaquettes non stimulées et à des plaquettes stimulées (par l'ADP et la thrombine) ont été testés selon la méthode par
McGregor et Al. (1986) Eur. J. Biochem. 159, 443-449.Study of platelet fixation
The number of monoclonal antibodies LYP20 AND LYP21 labeled with I-1 2 5 fixed to unstimulated platelets and to stimulated platelets (by ADP and thrombin) were tested according to the method by
McGregor et Al. (1986) Eur. J. Biochem. 159, 443-449.

Lorsque la thrombine (lU/ml) a été utilisée, son activité a été bloquée avec 10-6 M PPACK avant l'addition des autres réactifs. Les plaquettes. non stimulées et stimulées ont été incubées avec différentes concentrations des anticorps monoclonaux marqués P20 'ou P21 (0,1 à 4 g/ml) pendant 30 minutes à 250 C. Ensuite 50 l de la suspension ont été repris et, étalés sur des tubes Eppendorf 400 ul contenant 300 ul de 20% (w/v) sucrose et 2% (w/v) BSA dans une solution.When thrombin (1U / ml) was used, its activity was blocked with 10-6 M PPACK before the addition of the other reagents. Platelets. unstimulated and stimulated were incubated with different concentrations of the monoclonal antibodies marked P20 'or P21 (0.1 to 4 g / ml) for 30 minutes at 250 C. Then 50 l of the suspension were taken up and spread on tubes Eppendorf 400 μl containing 300 μl of 20% (w / v) sucrose and 2% (w / v) BSA in a solution.

Les tubes ont été centrifugés dans une microcéntrifugeuse Eppendorf, pendant 6 minutes. Les extrémités des tubes de centrifugation ont été coupées et la quantité d'anticorps marqués avec l'iode 125 (I125) fixés a été déterminée avec un compteur gamma. The tubes were centrifuged in an Eppendorf microcentrifuge for 6 minutes. The ends of the centrifuge tubes were cut and the amount of antibody labeled with iodine 125 (I125) attached was determined with a gamma counter.

La fixation non spécifique a été réalisé par l'addition d'anticorps non marqués concentrés 100 fois. Le nombre de sites de fixation et la constante de dissociation (CD) ont été déterminés par analyse
Scatchard.Nonspecific binding was achieved by the addition of unlabeled antibodies concentrated 100 times. The number of binding sites and the dissociation constant (CD) were determined by analysis
Scatchard.

Aaréaation et Sécrétion plaguettaires
Des etudes d'agrégation ont été réalisées avec des plaquettes lavées traitées avec la sérotonine 14C selon la méthode de Greenberg et al. (1979...). Les plaquettes, ajustées à 2 x 108 plaquettes/ml ont aggrégé avec 2,5 pM ADP, 2pg/ml de collagène ou 0,016 U/ml de thrombine en présence ou à l'absence soit de l'anticorps monoclonal P20 soit de l'anticorps monoclonal P21, (anticorps monoclonal complet ou fragment F(ab)'2). Après chaque agrégation, la suspension a été microcentrifugée et 100 ul de surnageant ont été passés dans un compteur pour mesurer le niveau de sécrétion.Plaguettary secretion and secretion
Aggregation studies have been carried out with washed platelets treated with serotonin 14C according to the method of Greenberg et al. (1979 ...). The platelets, adjusted to 2 × 108 platelets / ml, aggregated with 2.5 μM ADP, 2 μg / ml of collagen or 0.016 U / ml of thrombin in the presence or in the absence of either the monoclonal antibody P20 or the monoclonal antibody P21, (complete monoclonal antibody or fragment F (ab) '2). After each aggregation, the suspension was microcentrifuged and 100 µl of supernatant was passed through a counter to measure the level of secretion.

Adhésion Dlaauettaire
Les études d'adhésion ont été réalisées sur des plaquettes lavées traitées avec du 51Cr (0,1 mCi par 5 x 109 plaquettes) selon la méthode décrite par
Cazenave et al. (1979...), PGE1 (20 ng/ml) a été ajouté à une solution de Tyrode pendant toute la procédure. Les puits plastiques ont été recouverts avec 100 ul de BSA (0,5 %), de la fibronectine (2 pg/ml), du fibrinogène (2 pg/ml) ou du collagène (2 pg/ml) dans 25 mM de tampon de bicarbonate à pH 9,5 pendant 3 heures à 37 OC. Les puits ont été bloqués pendant 90 minutes à température ambiante avec 1 % de
BSA.Les plaquettes ajustées à hauteur de 5 x 108 cellule/ml ont été préincubées avec soit l'anticorps monoclonal P20 ou l'anticorps monoclonal P21 (10 ug/ml) à 37 C pendant une heure. La suspension de plaquettes préincubées (100 ul) a été ajoutée à chaque puits et soumise à réaction à 370C pendant une heure.Dlaauettaire Membership
The adhesion studies were carried out on washed platelets treated with 51Cr (0.1 mCi per 5 × 109 platelets) according to the method described by
Cazenave et al. (1979 ...), PGE1 (20 ng / ml) was added to a Tyrode solution during the whole procedure. The plastic wells were covered with 100 µl of BSA (0.5%), fibronectin (2 µg / ml), fibrinogen (2 µg / ml) or collagen (2 µg / ml) in 25 mM buffer of bicarbonate at pH 9.5 for 3 hours at 37 OC. The wells were blocked for 90 minutes at room temperature with 1% of
BSA. Platelets adjusted to the height of 5 x 108 cells / ml were preincubated with either the monoclonal antibody P20 or the monoclonal antibody P21 (10 μg / ml) at 37 ° C. for one hour. The suspension of preincubated platelets (100 µl) was added to each well and reacted at 370C for one hour.

Tous les puits ont été lavés soigneusement dans une solution de Tyrode afin d'enlever les plaquettes non accrochées. Les puits ont ensuite uété séparés et soumis un comptage individuel sur compteur gamma.All wells were washed thoroughly in a Tyrode solution to remove the unhooked platelets. The wells were then separated and submitted for individual counting on a gamma counter.

RéSULTATS
Isolement des glycoprotéines de membranes plaquettaires
Des extraits de plaquettes obtenus après traitement avec un détergent ont été solubilisés dans 1 % de DOC et soumis un chromatographie d'affinité (WGA) en présence de 0,5 % DOC à pH 8,6. Aucune glycoprotéine du complexe GPIIb-IIIa n'était présente dans la fraction éluée comme le montrent les analyses
SDS-PAGE et ELISA. Après dialyse contre 0,1 .% de
Lubrol WX, cette fraction- a été appliquée sur une colonne Q d'échange d'anions à flux rapide, et éluée dans du NaCl. Le premier pic contient quatre protéines comme le montre le résultat de SDS-PAGE. Les poids moléculaires étaient respectivement de 85, 120, 130 et 150 kD dans des conditions non réductrices et 85, 125, 140 et 155 après réduction.Aucune glycoprotéine GPIb nétait présente dans cette fraction comme le montre la détection après coloration à l'argent du gel.Results
Isolation of platelet membrane glycoproteins
Platelet extracts obtained after treatment with a detergent were dissolved in 1% DOC and subjected to affinity chromatography (WGA) in the presence of 0.5% DOC at pH 8.6. No glycoprotein of the GPIIb-IIIa complex was present in the eluted fraction as shown by the analyzes
SDS-PAGE and ELISA. After dialysis against 0.1% of
Lubrol WX, this fraction was applied to a fast flow anion exchange column Q and eluted in NaCl. The first peak contains four proteins as shown by the result of SDS-PAGE. The molecular weights were respectively 85, 120, 130 and 150 kD under non-reducing conditions and 85, 125, 140 and 155 after reduction. No GPIb glycoprotein was present in this fraction as shown by the detection after silver staining of the gel.

Cependant, la GPIb était présente dans le pic n 3. La première fraction a-été séléctionnée pour immuniser les souris de façon à produire des anticorps monoclonoaux spécifiques pour les quatre antigènes de membrane plaquettaire.However, GPIb was present in peak # 3. The first fraction was selected to immunize mice so as to produce monoclonal antibodies specific for the four platelet membrane antigens.

Production anticorps monoclonaux
Des surnageants d'hybridomes ont été criblés avec un mélange de 4 glycoprotéines en utilisant la technique ELISA. Plusieurs surnageants ont présenté une réaction vis à vis du mélange d'antigènes. Les anticorps sélectionnés P20 et P21, ont été purifiés sur Sépharose protéine A et ces, deux anticorps ont été caractérisés comme étant des IgG1 puisqu'ils sont été élués à pH 6.Monoclonal antibody production
Supernatants of hybridomas were screened with a mixture of 4 glycoproteins using the ELISA technique. Several supernatants have shown a reaction to the mixture of antigens. The selected antibodies P20 and P21 were purified on Sepharose protein A and these two antibodies were characterized as being IgG1 since they were eluted at pH 6.

Identification de l'antigène plaguettaire reconnu par
P20 et P21
Les lysats de plaquettes marquées 'immunoprécipités par P20 et P21 ont été comparés dans la méthode SDS-PAGE, à ceux immunoprécipités par l'anticorps S12 dirigé contre la GMP-140 et décrit par
McEver dans la publication déjà citée. Une autre comparaison a été faite vis-å-vis de 1'anticorps monoclonal spécifique du complexe GPIIb-IIIa. Des autoradiogrammes (Fig. 3l montrent clairement que l'antigène reconnu par P20 n'est ni la GPIIb ni la (GPIIIa. Le poids moléculaire apparent de cet antigène a été estimé à environ 130 kD (non-réduit) et 140 kD (réduit).L'antigène reconnu par P20 migre en même temps que l'antigène immunoprécipité par un anticorps
S12 de McEver qui ne présente aucune réaction de modulation des fonctions plaquettaires. Les mêmes résultats ont été obtenus avec P21.Identification of the plaguettary antigen recognized by
P20 and P21
The platelet lysates labeled 'immunoprecipitated by P20 and P21 were compared in the SDS-PAGE method, with those immunoprecipitated by the antibody S12 directed against GMP-140 and described by
McEver in the publication cited above. Another comparison was made with respect to the monoclonal antibody specific for the GPIIb-IIIa complex. Autoradiograms (Fig. 3l clearly show that the antigen recognized by P20 is neither GPIIb nor (GPIIIa. The apparent molecular weight of this antigen has been estimated at approximately 130 kD (unreduced) and 140 kD (reduced The antigen recognized by P20 migrates at the same time as the antigen immunoprecipitated by an antibody
S12 of McEver which does not show any modulation reaction of the platelet functions. The same results were obtained with P21.

Ce résultat a été confirmé par une analyse
Western blot. L'anticorps monoclonal P20 s'accroche spécifiquement à l'antigène dans des conditions dénaturantes non-réductrices. Le poids moléculaire apparent de la tache était estimé à 128 kD. Cependant,
P21 a reconnu l'antigène dénaturé dans des conditions non-réductrices et réductrices.This result was confirmed by an analysis
Western blot. The monoclonal antibody P20 specifically clings to the antigen under non-reducing denaturing conditions. The apparent molecular weight of the spot was estimated at 128 kD. However,
P21 recognized the denatured antigen under non-reducing and reducing conditions.

Accrochage de l'anticorDs P20 aux plaquettes lavées
Des plaquettes lavées (4 donneurs) ont accroché 2.400 t 266 molécules d'anticorps P20 marqués, par plaquette non-stimulée (Kd=2,3nM + 0,54) et 12.200 t 1184 molécules d'anticorps P20 marquées par cellule après stimulation avec la thrombine (Kd=5nM + 0,61) (Fig. 5, 6). L'anticorps marqué P21 n'a reconnu ni les plaquettes au repos ni les plaquettes stimulées.Attachment of P20 anticorDs to washed platelets
Washed platelets (4 donors) hung 2,400 t 266 labeled P20 antibody molecules, per unstimulated platelet (Kd = 2.3nM + 0.54) and 12,200 t 1,184 labeled P20 antibody molecules per cell after stimulation with thrombin (Kd = 5nM + 0.61) (Fig. 5, 6). The P21-labeled antibody recognized neither resting nor stimulated platelets.

Effet des anticorps P20 et P21 sur l'adhésion plaquettaire
Ni P20 ni P21 n1 ont un effet significatif sur l'adhésion des plaquettes présentes sur des puits plastiques recouverts de fibronectine, de fibrinogène ou de collagène (Fig. 7). Effect of antibodies P20 and P21 on platelet adhesion
Neither P20 nor P21 n1 have a significant effect on the adhesion of platelets present on plastic wells covered with fibronectin, fibrinogen or collagen (Fig. 7).

Effet de P20 et P21 sur l'aaréqation plaguettaires et la sécrétion
P20 inhibe partiellement l'agrégation induite à
I'ADP (60 %), au collagène (63 %) et à la thrombine (50 %) comparée au contrôle. Des fragments Fab de P20 permettent l'obtention des mêmes résultats (Fig.8).Effect of P20 and P21 on plaguettary aeration and secretion
P20 partially inhibits induced aggregation at
ADP (60%), collagen (63%) and thrombin (50%) compared to control. Fab fragments of P20 allow the same results to be obtained (FIG. 8).

P20 permet aussi la réduction de la sécrétion plaquettaire induite par le collagène et la thrombine.P20 also reduces the platelet secretion induced by collagen and thrombin.

P21 n'a pas d'effet sur l'agrégation plaquettaire. P21 has no effect on platelet aggregation.

DISCUSSION
Des anticorps monoclonaux dirigés contre la,
GMP-140 des plaquettes solubilisées ont été produits.DISCUSSION
Monoclonal antibodies against,
GMP-140 solubilized platelets were produced.

Ces anticorps P20 et P21 testés par im.unoprécipitation ont montré qu'ils présentent une spécificité pour l'antigène de membrane plaquettaire également reconnu par l'anticorps S12 de McEver.These P20 and P21 antibodies tested by immunoprecipitation have shown that they have specificity for the platelet membrane antigen also recognized by the S12 antibody of McEver.

Cependant, à la différence de l'anticorps S12, P20 et
P21 sont dirigés contre un épi tope conformationel de la GMP-liO. De plus, P20 est actif sur les fonctions plaquettaires. Une autre caractéristique de ces anticorps est qu'ils reconnaissent la GMP-140 dénaturée comme le montrent les résultats positifs de
Western "blot. P20 reconnait uniquement la GMP-140 non-rEduite alors que P21 reste actif contre la
GMP-140 réduite. Ces résultats suggèrent que le site de liaison du P20 contiènt des ponts disulfure. En revanche, le site de liaison de P21 ne contient probablement pas dé ponts disulfure. On peut conclure à ce stade que P20 et P21 sont spécifiques d'épitopes différents sur la GHP-140 plaquettaire.However, unlike the antibodies S12, P20 and
P21 are directed against a conformal spike of GMP-liO. In addition, P20 is active on platelet functions. Another characteristic of these antibodies is that they recognize denatured GMP-140 as shown by the positive results of
Western "blot. P20 recognizes only non-reduced GMP-140 while P21 remains active against
GMP-140 reduced. These results suggest that the P20 binding site contains disulfide bridges. In contrast, the P21 binding site probably does not contain disulfide bridges. It can be concluded at this stage that P20 and P21 are specific for different epitopes on platelet GHP-140.

Les plaquettes au repos lavées ont permis de fixer environ 2000 molécules d'anticorps P20 marqué avec l'iode. Après activation des plaquettes avec l'alpha-thrombine, les plaquettes ont accroché environ 12 000 molécules d'anticorps P20 marqués. L'activation à l'ADP n'a pas accru la liaison des anticorps P20. The washed resting platelets made it possible to fix approximately 2000 molecules of P20 antibody labeled with iodine. After activation of the platelets with alpha-thrombin, the platelets have attached approximately 12,000 molecules of labeled P20 antibodies. Activation to ADP did not increase binding of P20 antibodies.

Les plaquettes ont probablement été légèrement activées" pendant les étapes de lavage bien que PGE1 et
PPACK aient été ajoutées au niveau du premier lavage.The platelets were probably slightly activated "during the washing steps although PGE1 and
PPACK were added at the level of the first wash.

Les' antièorps P21 marqués ne s'accrochent ni aux plaquettes au repos ni aux plaquettes stimulées avec la thrombine. Des expériences de controle sur des échantillons de P21 ont été réalisées afin de vérifier la réactivité de P21 vis-à-vis de la GMP-140 solubilisée. Ces résultats se sont averés positifs. On en conclut que P21 ne s'accroche pas à des plaquettes. The labeled P21 antibodies do not cling to resting platelets or to platelets stimulated with thrombin. Control experiments on samples of P21 were carried out in order to verify the reactivity of P21 with respect to the solubilized GMP-140. These results were found to be positive. We conclude that P21 does not cling to platelets.

entières qu'elles soient activées ou non, l'épitope reconnu par P21 n'étant en pas accessible sur la membrane native de la GMP-140. Le site de liaison de
P21 pourrait être exprimé soit sur la face- cytoplasmique de GMP-140, cette séquence demeurant cytoplasmique après l'activation et l'expression des alpha-granules au niveau de membrane. On pourrait également penser que l'accrochage de P21 n'est pas possible à cause de la conformation de la GMP-140 native qui masque ltépitope de P21. Cependant, P21 réagit avec, des plaquettes entières solubilisées dans le Triton X-100 et soumises à une immunoélectrophorèse croisée, conditions qui ne sont apparement pas dénaturantes.whether activated or not, the epitope recognized by P21 not being accessible on the native membrane of the GMP-140. The link site of
P21 could be expressed either on the cytoplasmic face of GMP-140, this sequence remaining cytoplasmic after activation and expression of alpha-granules at the membrane level. One might also think that the attachment of P21 is not possible because of the conformation of the native GMP-140 which masks the epitope of P21. However, P21 reacts with whole platelets dissolved in Triton X-100 and subjected to cross immunoelectrophoresis, conditions which are apparently not denaturing.

P20 inhibe partiellement l'agrégation plaquettaire et la sécrétion. S12 est connu pour son absence d'effet au niveau de l'agrégation plaquettaire. Ceci confirme bien que S12 et P20 sont dirigés contre des épitopes différents. L'effet inhibiteur de l'anticorps P20 sur l'agrégation plaquettaire induite par la thrombine ou le collagène est tout à fait en accord avec la localisation de la
GMP-140 à l'intérieur de la membrane des alphagranules. Après activation avec la thrombine ou le collagène la membrane des alpha-granules fusionne avec la membrane plasmatique des plaquettes et la GMP-140 devient un recepteur de surface. De plus, la sécrétion de Sérotonine C14 est affectée par la présence de P20.P20 partially inhibits platelet aggregation and secretion. S12 is known for its lack of effect on platelet aggregation. This confirms that S12 and P20 are directed against different epitopes. The inhibitory effect of the antibody P20 on the platelet aggregation induced by thrombin or collagen is entirely in agreement with the localization of the
GMP-140 inside the membrane of alphagranules. After activation with thrombin or collagen the membrane of alpha-granules fuses with the plasma membrane of platelets and GMP-140 becomes a surface receptor. In addition, the secretion of Serotonin C14 is affected by the presence of P20.

EXEMPLE 5:
Recherche de la présence de glycoprotéine gplîb-I.IIa- like sur des ' tissus normaux et des tissus néoplastiaues, grâce à des anticorps LYP18
Matériels et méthodes.EXAMPLE 5:
Search for the presence of glycoprotein gplîb-I.IIa- like on normal tissues and neoplastic tissues, using LYP18 antibodies
Materials and methods.

Etudes de tissus
Des tissus normaux, anormaux et des tissus présentant des lésions benignes de la peau ont été obtenus auprès du Département de Pathologie et du
Dermatologie à l'université de Stanford au centre medical. 16 échantillons des tissus normaux d'organes séléctionnés (tableau 1) et 96 biopsies de tumeurs (tableau 2-et 3) ont été obtenus auprès du département de pathotogie. Les biopsies de tumeur comprennent 21 cas de mélanome malin présentant des métastases au niveau des ganglions lymphatiques, 20 cas de lymphomes n'appartenant pas à la catégorie des Iymphooees Hodgkin (1 petit lymphocytaire, 5 lymphomes folliculaires divisés, 3'lymp'hoies folliculaires mixtes, 3 lymphomes diffus, 2,lymphomes diffus à large cellule, 1 lymphome immunoblastiques à grande cellule, 3 lymphomes petits non-divisés et 2 lymphoblastiques), 4 cas de maladie de Hodgkin, 2 cas de thynone, 28 cas de carcinomes comprennant '19 cas de carcinomes primaires (sein 6, ovaire 4, oropharynx 3, poumon 2, colon 2, éstomac 1, thyroide'. 1),- 9 cas de carcinomes métastasiques dans les ganglions lymphatiques (3 adénocarcinomes, 3 squameux, 3 faiblement différenciés), 7 tumeurs neuroendocrines (4 carcinomes du poumon, 2 tumeurs des îlots pancréatiques et un carcinome medullaire de la thyroide), 1 cas dysgerminome des ovaires, 10 cas de sarcomes (5 ostéosarcomes, 3 sarcomes d'Ewing et 2 histiocytomes fibreux maligne) et 3 cas de neuroblastomes. 13 cas de lésions benignes de la peau ont été obtenus au département de dermatologie comprennant 9 nevis (1 jonction, 1 composé, 2 dermiques, 2 displastiques et 3 congénitaux), 3 lentigo-éphélides et 1 dermatofibrome. Tissue studies
Normal, abnormal tissue and tissue with benign skin lesions were obtained from the Department of Pathology and
Dermatology at Stanford University at the medical center. 16 samples of normal tissue from selected organs (Table 1) and 96 tumor biopsies (Table 2-and 3) were obtained from the pathotogy department. Tumor biopsies include 21 cases of malignant melanoma with metastases to the lymph nodes, 20 cases of lymphomas not belonging to the Hodgkin's lymphoma category (1 small lymphocyte, 5 divided follicular lymphomas, 3 mixed follicular lymphomas , 3 diffuse lymphomas, 2, diffuse large cell lymphomas, 1 large cell immunoblastic lymphomas, 3 small undivided lymphomas and 2 lymphoblastics), 4 cases of Hodgkin's disease, 2 cases of thynone, 28 cases of carcinomas including '19 primary carcinomas (breast 6, ovary 4, oropharynx 3, lung 2, colon 2, stomach 1, thyroid '. 1), - 9 cases of metastatic carcinoma in the lymph nodes (3 adenocarcinomas, 3 scaly, 3 poorly differentiated) , 7 neuroendocrine tumors (4 carcinomas of the lung, 2 pancreatic islet tumors and one medullary thyroid carcinoma), 1 case ovarian dysgerminoma, 10 cases of sarcomas (5 osteosarcomas, 3 Ewin's sarcomas g and 2 malignant fibrous histiocytomas) and 3 cases of neuroblastomas. 13 cases of benign skin lesions were obtained in the dermatology department including 9 nevis (1 junction, 1 compound, 2 dermals, 2 displastic and 3 congenital), 3 lentigo-ephelides and 1 dermatofibroma.

AnticorPs monoclonaux
Les anticorps monoclonaux LYP2 et LYP18 ont été.Monoclonal antibodies
The monoclonal antibodies LYP2 and LYP18 were.

séléctionnés pour réaliser les expériences ci-après.selected to carry out the experiments below.

LYP2 (IgGi) et LYP18 (IgG2.) ne croisent pas lors d'une immunoélectrophorèse croisée avec les glycoprotéines de plaquettes IIb ou Illa séparées par l'EDTA mais reconnaissent un déterminant présent sur le complexe glycoprotéique IIb-IIIa intact calcium médié (McGregor et al, Eur J Biochem 1986, 159: 443-449). LYP2 et LYP18 ont été purifiés à partir de fluide d'ascite sur une colonne protéine A-Sepharose 4B comme décrit dans la référence McGregor et al prédédemment cité, à des concentrations s'étalant dans un intervalle de 1,0 à 1,5 mg/ml et en utilisant une dilution de 1:200.L'anticorps monoclonal dirigé contre une glycoprotéine IIIa de plaquette (IgGz) a été obtenu auprès de Dakopatts (Santa Barbara, CA) sous forme d'un surnageant de culture puis utilisé à une dilution de 1:50. L'anticorps monoclonal purifié
Leu 9 (CD7)(IgG2a) a servi d'anticorps contrôle à une dilution de 1:200 et a été obtenu de Becton-Dickinson (Mountain View, CA).LYP2 (IgGi) and LYP18 (IgG2.) Do not cross during cross-immunoelectrophoresis with EDTA-separated platelet glycoproteins IIb or Illa but recognize a determinant present on intact calcium mediated glycoprotein complex IIb-IIIa (McGregor and al, Eur J Biochem 1986, 159: 443-449). LYP2 and LYP18 were purified from ascites fluid on a protein A-Sepharose 4B column as described in the previously cited reference McGregor et al, at concentrations ranging from 1.0 to 1.5 mg / ml and using a dilution of 1: 200. The monoclonal antibody directed against a platelet glycoprotein IIIa (IgGz) was obtained from Dakopatts (Santa Barbara, CA) in the form of a culture supernatant and then used at a 1:50 dilution. The purified monoclonal antibody
Leu 9 (CD7) (IgG2a) served as control antibody at a dilution of 1: 200 and was obtained from Becton-Dickinson (Mountain View, CA).

Marquaqe immunohistologique
Tous les tissus normaux, anormaux ainsi que les spécimens présentant des lésions bénignes de la peau ont été gelés, traités dans la même façon et colorés comme décrit par Bindl (Am J Clin Pathol 1986;85 490-493). En bref, des sections de cryostat séchées à l'air, fixées avec de l'acétone (4-5 pm) ont été incubées pendant 30 minutes dans une chambre humidifiée, avec les différents anticorps monoclonaux.Immunohistological labeling
All normal, abnormal tissue as well as specimens with benign skin lesions were frozen, treated in the same way and stained as described by Bindl (Am J Clin Pathol 1986; 85 490-493). Briefly, air-dried sections of cryostat fixed with acetone (4-5 μm) were incubated for 30 minutes in a humidified chamber, with the various monoclonal antibodies.

Les sections ont ensuite été incubées par série (avec des lavages dans un tampon salin de phosphate entre les incubations dans un récipient de Coplin contenant des immunoglobulines anti-souris de chèvres biotinylées (Jackson ImmunoResearch Laboratories, est
Grove, PA). Puis ces sections ont été traitées avec de la peroxidase de, raifort conjugée avec de la streptavidine (Jackson), chaque incubation durant 30 minutes à 4 C. La coloration a été developpée avec 3 mg/ml 3,3 diamino-benzidine (Sigma Chemical Co/, St
Louis, MO) et 0,3 s de peroxide d'hydrogène, pendant 5 minutes d temperature ambiante.Après coloration du produit -de réaction avec de sulfate de cuivre 0,5 % dans du NaCl IX pendant 5 minutes, les sections ont été lavées, colorées avec 2 % de bleu de méthylène, déshydratées et recouverts d'une lamelle-. Pour l'étude de la lésion dérivée de melanocbte pigmenté, la phosphatase alkaline conjugée avec la streptavidine (Jackson) a été substituée å. la peroxidase et la coloration a été réalisée dans un Fast Red Salt (FRS,
Sigma) pendant 20 minutes comme décrit précédemment.The sections were then incubated in series (with washes in phosphate buffered saline between incubations in a Coplin container containing biotinylated goat anti-mouse immunoglobulins (Jackson ImmunoResearch Laboratories, est
Grove, PA). Then these sections were treated with peroxidase, horseradish conjugated with streptavidin (Jackson), each incubation for 30 minutes at 4 C. The coloration was developed with 3 mg / ml 3.3 diamino-benzidine (Sigma Chemical Co /, St
Louis, MO) and 0.3 s of hydrogen peroxide, for 5 minutes at room temperature. After staining the reaction product with 0.5% copper sulfate in IX NaCl for 5 minutes, the sections were washed, stained with 2% methylene blue, dehydrated and covered with a coverslip. For the study of the lesion derived from pigmented melanocyte, alkaline phosphatase conjugated with streptavidin (Jackson) was substituted for. peroxidase and staining was carried out in a Fast Red Salt (FRS,
Sigma) for 20 minutes as previously described.

Résultats
LYP18 colore fortement les mégacaryocytes dans la moelle osseuse, les plaquettes, ainsi que les capillaires recouvrant les cellules endothéliales, les vénules- '- et' - les artérioles présents dans des tissus normaux L'anticorps monoclonal LYP18 presente également une forte réaction de coloration avec l'épithélium giomérulaire des glandes endométriques et colore faiblement les cellules des muscles lisses.Results
LYP18 strongly colors the megakaryocytes in the bone marrow, the platelets, as well as the capillaries covering the endothelial cells, the venules - '- and' - the arterioles present in normal tissues. The monoclonal antibody LYP18 also exhibits a strong staining reaction with the giomerular epithelium of the endometrial glands and weakly colors the smooth muscle cells.

Cependant, un grand nombre de tissus normaux, provenant de différents organes n'a pas été coloré avec l'anticorps monoclonal LYP18 (tableau 1). Les anticorps monoclonaux LYP2 ont coloré les mégacaryocytes et les plaquettes avec la même intensité que LiP18 mais ils n'ont pas présentés de liaison avec les les autres tissus normaux. L'anticorps monoclonal de controle Dako, dirigé contre la gpIIIa colore fortement les mégacaryocytes, les plaquettes, l'épithélium glomérulaire et les glandes endométriques mais colore faiblement les cellules endothéliales et les cellules du muscle lisse. Parmi les cellules normales d'un type donné, on observe pas de variation significative de l'intensité du nombre de cellule coloré par ces 3 anticorps monoclonaux.However, a large number of normal tissues from different organs were not stained with the LYP18 monoclonal antibody (Table 1). The LYP2 monoclonal antibodies stained the megakaryocytes and platelets with the same intensity as LiP18, but they did not show binding with other normal tissues. The monoclonal control antibody Dako, directed against gpIIIa strongly colors the megakaryocytes, the platelets, the glomerular epithelium and the endometrial glands but weakly colors the endothelial cells and the smooth muscle cells. Among normal cells of a given type, no significant variation in the intensity of the number of cells stained by these 3 monoclonal antibodies is observed.

Parmi les 21 cas de mélanomes étudiés, 16 (75%) ont donné lieu à une réaction avec l'anticorps LYP18. Among the 21 cases of melanoma studied, 16 (75%) gave rise to a reaction with the antibody LYP18.

Les anticorps monoclonaux LYP18 produisent une coloration variable au niveau des mélanomes. A l'exception d'un seul cas de coloration très faible, on a remarqué aucune variation de cellule à cellule dans l'intensité de la coloration pour chaque cas particulier. LYP18 présente une image cytoplasmique faible et diffuse avec une coloration renforcée au niveau de la membrane périphérique. Les intensités de coloration et le pourcentage de mélanomes liés avec l'anticorps Dako anti-gpIIIa est identique à la coloration obtenue avec LYP1S. The LYP18 monoclonal antibodies produce variable staining in melanomas. With the exception of a single case of very weak staining, no cell-to-cell variation in the intensity of staining was noted for each particular case. LYP18 has a weak and diffuse cytoplasmic image with enhanced staining at the peripheral membrane. The staining intensities and the percentage of melanomas linked with the Dako anti-gpIIIa antibody is identical to the staining obtained with LYP1S.

LYP2 ne s'accroche pas au mélanome malin métastasique. En revanche les mélanocytes normaux présents au niveau de la peau, de lentigines, des dermatofibromes, et des mélanocytes activés formant un nevi, qui comprennent des mélanocytes de types de jonctionnel composé, dermique, displastique et congénital ne permettent pas l'accrochage des anticorps LYP18, LYP2 ou Dako anti-gpIIIa (tableau 2). LYP2 does not cling to metastatic malignant melanoma. On the other hand, the normal melanocytes present in the skin, lentigines, dermatofibromas, and activated melanocytes forming a nevi, which include melanocytes of the junctional compound, dermal, displastic and congenital types do not allow the attachment of the LYP18 antibodies. , LYP2 or Dako anti-gpIIIa (Table 2).

Parmi les 75 tumeurs non mélanocytiques, seulement 3 (4%) ont entrainé une coloration pour
LYP18 (voir tableau 3): un carcinome des papilles thyroïdiennes métastasiques, un adénocarcinome endométrique primaire des ovaires, très faiblement positif, et un ostéosarcome faiblement positif. 96% (72 parmi 75) n'ont pas présenté d'accrochage de
LYP18. Les anticorps Dako anti-gpIIIa se sont accroches à différentes tumeurs, de la même façon que le LYP18. LYP2 n'est pas lié aux différentes tumeurs étudiées.Among the 75 non-melanocytic tumors, only 3 (4%) caused staining for
LYP18 (see table 3): a carcinoma of the metastatic thyroid papillae, a primary endometrial adenocarcinoma of the ovaries, very weak positive, and a weak positive osteosarcoma. 96% (72 of 75) did not show a hooking of
LYP18. Dako anti-gpIIIa antibodies have clung to different tumors in the same way as LYP18. LYP2 is not linked to the different tumors studied.

Discussion
Ces études démontrent la présence de glycoprotéines IIB-IIIa-like sur les cellules de mélanoses malins etastasiques et l'absence de ces complexes glycoprotéiques sur des mélanocytes bénins.Discussion
These studies demonstrate the presence of IIB-IIIa-like glycoproteins on malignant etastatic melanosis cells and the absence of these glycoprotein complexes on benign melanocytes.

Des sections congelées de biopsies de mélanomes n'ont pas été reconnues par d'autres anticorps monoclonaux (LYP2) également dirigés contre le complexe plaquettaire IIb-IIIa mais ont reconnu l'anticorps monoclonal anti-gpIIIa Dako, ce qui suggère que l'un des composants du complexe intégrine sur les mélanomes malins métastasiques est la gpIIIa. L'absence de reconnaissance par LYP2 pourrait indiquer des différences de structure entre les glycoprotéines
IIb-IIIa-like des mélanomes et le complexe plaquettaire.Frozen sections of melanoma biopsies were not recognized by other monoclonal antibodies (LYP2) also directed against the platelet complex IIb-IIIa but recognized the monoclonal anti-gpIIIa Dako antibody, suggesting that one component of the integrin complex on metastatic malignant melanomas is gpIIIa. Lack of recognition by LYP2 could indicate structural differences between glycoproteins
IIb-IIIa-like melanomas and the platelet complex.

La présence de glycoprotéines IIb-IIIa-like encore désignées par cytoadhésines sur les cellules des mélanomes malins mais pas sur des cellules de mélanocytes bénins, peut être interprêtée comme l'expression aberrante d'antigène ayant lieu lors du processus de passage à l'état malin. Les cytoadhésines présentes sur les mélanomes peuvent donner aux cellules. malignes des propriétés qui peuvent faciliter l'invasiofl métastasique et peuvent également expliquer leur interaction avec les protéines adhésives de la matrice extracellulaire et avec d'autres cellules du sang.  The presence of IIb-IIIa-like glycoproteins still designated by cytoadhesins on cells of malignant melanomas but not on cells of benign melanocytes, can be interpreted as the aberrant expression of antigen taking place during the process of transition to the state clever. The cytoadhesins present on melanomas can give cells. malignant properties which can facilitate metastatic invasiofl and can also explain their interaction with the adhesive proteins of the extracellular matrix and with other blood cells.

La raison pour laquelle un quart n'a pas été reconnu par LYP18 n'est pas claire. Il est possible. It is not clear why a quarter was not recognized by LYP18. It is possible.

que les cellules tumorales n'aient pas synthétisé ces glycoprotéines ou que les antigènes aient été exprimés mais à un niveau non détectable. Si la première hypothèse est correcte, elle peut impliquer le fait que l'expression des glycoprotéines de IIb-IIIa-like n'est pas un facteur essentiel pour l'établissement de métastases dans les mélanomes malins. Parmi les différents néoplasmes n'appartenant pas au type des mélanomes, seulement 4% présentaient une liaison avec LEP18. La réactivité de LYP18 avec 3 sur 75 néoplasmes non mélanocytiques malins, pourrait être due à la synthèse d'antigènes IIb-IIIa-like par ces tumeurs.that tumor cells have not synthesized these glycoproteins or that antigens have been expressed but at an undetectable level. If the first hypothesis is correct, it may imply that the expression of IIb-IIIa-like glycoproteins is not an essential factor for the establishment of metastases in malignant melanomas. Among the various neoplasms not belonging to the melanoma type, only 4% had a link with LEP18. The reactivity of LYP18 with 3 out of 75 malignant non-melanocytic neoplasms, could be due to the synthesis of IIb-IIIa-like antigens by these tumors.

Une autre hypothèse peut être que ce même épi tope est présent sur une molécule différente ou qu'une coloration non spécifique a eu lieu. L'absence de réactivité de LYP18 avec une grande majorité des tumeurs non mélanocytiques étudiée suggère que l'expression aberrante des glycoprotéines IIb-IIIalike n'est pas universelle parmi les cellules malignes, y compris celles qui présentent des sites métastasiques. Another hypothesis may be that this same epi tope is present on a different molecule or that a non-specific staining has taken place. The lack of reactivity of LYP18 with a large majority of the non-melanocytic tumors studied suggests that the aberrant expression of the IIb-IIIalike glycoproteins is not universal among malignant cells, including those with metastatic sites.

Tableau I :
Réactivité de LYP18 aux sections congelées de tissus normaux
Tissus Coloration des types cellulaires * Hoelle osseuse megacaryocytes
Amygdales o
Thymus o
Rate o
Ganglion lymphatique 0 8ang périphérique 0
Foie o
Reins épithelium glomérulaire
Peau o
Estomac o
Thyroide o
Poumon o
Prostate o
Seins Uterus -glandes endometriales * Tous les tissus présentent une réactivité de LYP18 avec les cellules endothéliales et avec les plaquettes dans les sections de tissus. Table I:
LYP18 reactivity to frozen sections of normal tissue
Tissues Staining of cell types * Bone hoelle megakaryocytes
Tonsils o
Thymus o
Rate o
Lymph node 0 8ang peripheral 0
Liver o
Kidneys glomerular epithelium
Skin o
Stomach o
Thyroid o
Lung o
Prostate o
Uterus Breast - Endometrial Glands * All tissues show LYP18 reactivity with endothelial cells and with platelets in tissue sections.

Tableau 2 : Fixation de LYP 18 aux mélanomes et aux élanocytes normaux sur des sections congelées.Table 2: Fixation of LYP 18 to melanomas and normal elanocytes on frozen sections.

Lésions Nombre de réactions/Nombre testés
Mélanomes 16/21 (75S)
N. Mélanocytes
Peau normale 0/2
Lentigines 0/3
Dermatofibrome 0/1
Nevi 0/9
Tableau 3t
Réaction de LYP18 avec des sections congelées de différentes tuteurs
Types histopathologiques Nbre de réaction/Nbre testés
Lymphomes non Hodgkiniesn 0/20
stade initial 0/9
stade intermédiaire 0/5
stade avancé 0/6
Maladie de Hodgkin (MCHD) 0/4
Thymomes 0/2
Carcinomes
metastatiques
malpighien 0/3
glandulaire 1/3
Tumeures neuroendocrines
bin différentiées 0/3
mal différentiées 0/4
Sarcomes
ostéosarcome 1/5
sarcoe Erwing 0/3
M.F.H. . 0/2
Autres
neuroblastome 0/3
dygermonome 3/75 Lesions Number of reactions / Number tested
Melanomas 16/21 (75S)
N. Melanocytes
Normal skin 0/2
Lentigines 0/3
Dermatofibroma 0/1
Nevi 0/9
Table 3t
LYP18 reaction with frozen sections from different tutors
Histopathological types No. of reactions / No. tested
Non-Hodgkin's lymphoma 0/20
initial stage 0/9
intermediate stage 0/5
advanced stage 0/6
Hodgkin's disease (MCHD) 0/4
Thymomas 0/2
Carcinomas
metastatic
Malpighian 0/3
glandular 1/3
Neuroendocrine tumors
differentiated bin 0/3
poorly differentiated 0/4
Sarcomas
osteosarcoma 1/5
sarcoe Erwing 0/3
MFH. 0/2
Other
neuroblastoma 0/3
dygermonomist 3/75

Claims (17)

REVENDICATIONS 1/ Anticorps monoclonaux, ou les fragments idiotypiques de ces anticorps monoclonaux, reconnaissant des antigènes impliqués dans les étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire, et/ou d'adhésion des cellules endothéliales caractérisés en ce qu'ils ont la capacité de moduler les fonctions plaquettaires ou les fonctions endothéliales induites par une faible concentration d'agonistes, par exemple en présence de 2,5 à 5M dlADP ou 2g/ml de collagène ou 0,016 U/ml de thrombine et en ce que leur capacité d'inhibition sur les fonctions plaquettaires est considérablement réduite, voire absente, en présence de concentrations élevées d'agonistes, par exemple en présence de concentrations en thrombine supérieure à 0,5 U/ml ou en collagène supérieur à 10g/ml.CLAIMS 1 / Monoclonal antibodies, or the idiotypic fragments of these monoclonal antibodies, recognizing antigens involved in the stages of platelet physiology and in particular in adhesion and / or aggregation and / or platelet secretion reactions, and / or adhesion of endothelial cells characterized in that they have the capacity to modulate the platelet functions or the endothelial functions induced by a low concentration of agonists, for example in the presence of 2.5 to 5M dlADP or 2 g / ml of collagen or 0.016 U / ml of thrombin and in that their capacity to inhibit platelet functions is considerably reduced, or even absent, in the presence of high concentrations of agonists, for example in the presence of thrombin concentrations greater than 0.5 U / ml or in collagen greater than 10g / ml. 2/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idictypiques selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope d'une protéine ou d'une glycoprotéine choisie parmi la glycoprotéine GMP140, le complexe gpIIb-IIIa, le complexe gpIa-IIa, le complexe gpIc-IIa ou la gpIIa. 2 / Monoclonal antibodies or their idictypic fragments according to claim 1, characterized in that they recognize an epitope of a protein or a glycoprotein chosen from the glycoprotein GMP140, the gpIIb-IIIa complex, the gpIa-IIa complex, the gpIc-IIa complex or gpIIa. 3/ Anticorps monoclonaux ou 'leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope ayant un effet fonctionnel vis à vis de la protéine, la glycoprotéine ou le complexe protéique qui le contient et en ce qu'il est sensible à la réduction de l'antigène qui le contient.3 / Monoclonal antibodies or 'their idiotypic fragments according to any one of claims 1 or 2, characterized in that they recognize an epitope having a functional effect with respect to the protein, the glycoprotein or the protein complex which contains it and in that it is sensitive to the reduction of the antigen which contains it. 4/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 & à 3. caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope présent sur a GMPl4O, exposé à la surface des plaquettes activées, les dits anticorps ou leurs fragments idiotypiques étant capables d'interférer avec les réactions d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire et étant en particulier caractérisés en ce qu'il s s'agit d'anticorps LYP20 ou d'anticorps présentant des propriétés imrunologiques et fonctionnelles, equivalentes. 4 / Monoclonal antibodies or their idotypic fragments according to any one of claims 1 & to 3. characterized in that they recognize an epitope present on a GMPl4O, exposed on the surface of activated platelets, said antibodies or their idiotypic fragments being capable of interfering with aggregation and / or platelet secretion reactions and being in particular characterized in that they are LYP20 antibodies or antibodies having equivalent immunological and functional properties. 5i Anticorps monoclon@ux ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 -à 3, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope présent au niveau de la glycoprotéine IIa, du complexe Ia-Ila, ces anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'interférer avec les réactions d'agrégation plaquettaires et étant en particulier caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps LYP22 ou d'anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles equivalentes. 5i Monoclon @ ux antibodies or their idiotypic fragments according to any one of claims 1 to 3, characterized in that they recognize an epitope present at the level of glycoprotein IIa, of the Ia-Ila complex, these antibodies or their idiotypic fragments having the capacity to interfere with platelet aggregation reactions and being in particular characterized in that they are LYP22 antibodies or antibodies having equivalent immunological and functional properties. 6/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope du complexe IIb-IIIa à la surface des plaquettes stimulées le dits anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'inhiber les fonctions plaquettaires et tant dépourvus de cette capacité en présence d'une forte concentration d'agonistes par exemple de thrombine (supérieure à 0,56 / Monoclonal antibodies or their idiotypic fragments according to any one of Claims 1 to 3, characterized in that they recognize an epitope of the IIb-IIIa complex on the surface of the stimulated platelets, the said antibodies or their idiotypic fragments having the capacity to '' inhibit platelet functions, both lacking this capacity in the presence of a high concentration of agonists, for example thrombin (greater than 0.5 U/ml) ou d'e collagène (supérieure à 10 g/ml) et étant en particulier caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps LYPIS, ou d'anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles éguivalentes. U / ml) or of collagen (greater than 10 g / ml) and being in particular characterized in that they are LYPIS antibodies, or antibodies having equivalent immunological and functional properties. 7/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'ils sont marqués le marquage étant de préférence réalisé avec une substance radioactive, notamment 131I, 111In ou 99T, ou par une substance fluorescente.7 / Monoclonal antibodies or their idiotypic fragments according to any one of Claims 1 to 6, characterized in that they are marked, the marking preferably being carried out with a radioactive substance, in particular 131I, 111In or 99T, or by a fluorescent substance . 8/ Epitope present au niveau d'un antigène impliqué dans les étapes de la physilogie plaquettaire et en particulier dans les réactions c'adhésion et/ou d'agrégation plaquettaire et/ou d'adhésion des cellules endothéliales ledit antigène étant choisi plus particulièrement parmi les protéines GMP140 la glycoprotéine gpIIa ou les complexes gpIIb-IIIa, gpIa-IIa, gpIc-IIa, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un épitope conformationnel, nécessaire à l'activité dans les réactions ci-dessus de l'antigène qui le contient - 9/ Epitope selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est sensible à la réduction de l'antigène qui le contient.8 / Epitope present at the level of an antigen involved in the stages of platelet physiology and in particular in the reactions of adhesion and / or platelet aggregation and / or of adhesion of endothelial cells, said antigen being chosen more particularly from the proteins GMP140 the glycoprotein gpIIa or the complexes gpIIb-IIIa, gpIa-IIa, gpIc-IIa, characterized in that it is a conformational epitope, necessary for activity in the above reactions of the antigen containing it - 9 / Epitope according to claim 8, characterized in that it is sensitive to the reduction of the antigen which contains it. 10/ Epitope selon la revendication D-. caractérisé en ce qu'il est reconnu par l'anticorps YP20. 10 / Epitope according to claim D-. characterized in that it is recognized by the antibody YP20. 11/ Epitope selon la revendication It. caractérisé en ce qu'il est reconnu par l'anticorps LYP22.11 / Epitope according to claim It. characterized in that it is recognized by the antibody LYP22. 12/ Epitope selon la revendication 8 ou la revendication 9,12 / Epitope according to claim 8 or claim 9, a) en ce qu'il est reconnu par le complexe IIb a) in that it is recognized by the IIb complex IIIa de plaquettes humaines.IIIa of human platelets. b) en ce qu'il n'est pas reconnu par le complexe b) in that it is not recognized by the complex IIb-IIIa de plaquettes de chien,Dog platelets IIb-IIIa, c) en ce qu'il est reconnu par l'analogue du complexe IIb-IIIa des cellules endcthéliales, et en particulier en ce qu'il s'agit de :'épitope reconnu par l'anticorps LYPîS.  c) in that it is recognized by the analogue of the IIb-IIIa complex of endcthelial cells, and in particular in that it is: the epitope recognized by the antibody LYPîS. 13/ Composition pour le diagnostic de l'activation plaquettaire chez un sujet susceptible de présenter une thrombose ou pour la localisation d'un thrombus, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux anticorps différents ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, de préférence des anticorps dirigés contre des protéines ou glycoprotéines distinctes, en particulier un mélange d'anticorps choisis parri LYP20, LYP22, LYP18, ou leurs fragments idiotypiques.13 / Composition for the diagnosis of platelet activation in a subject likely to present a thrombosis or for the localization of a thrombus, characterized in that it comprises at least two different antibodies or their idiotypic fragments according to any one of the Claims 1 to 7, preferably antibodies directed against distinct proteins or glycoproteins, in particular a mixture of antibodies selected by LYP20, LYP22, LYP18, or their idiotypic fragments. 14/ Composition selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'elle comprend en outre des anticorps monoclonaux, ou leurs fragments idiotyB ques. dirigés contre la thrombospondine et de préférence-des anticorps du type LYP9 ou/et LYP11.14 / A composition according to claim 13, characterized in that it further comprises monoclonal antibodies, or their idiotyB fragments. directed against thrombospondin and preferably antibodies of the LYP9 or / and LYP11 type. 15/ Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif un anticorps monoclonal ou/et ses fragments idiotypiques, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou un mélange de ces différents anticorps, ou/et fragments idiotypiques, en combinaison avec un véhicule pharmaceutique acceptable.15 / Pharmaceutical composition, characterized in that it comprises, as active principle, a monoclonal antibody or / and its idiotypic fragments, according to any one of claims 1 to 7, or a mixture of these different antibodies, or / and fragments idiotypic, in combination with an acceptable pharmaceutical vehicle. 16/ Composition-pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que le ou les anticorps, ou fragments idiotypiques, de ces anticorps sont - soit couplés à une substance anti-coagulante, ou une substance ayant une un activité thrombolytique, cette substance pouvant être -par exemple le tPa, la streptokinase, l'urokinase, - soit modifiés au niveau de l'une de leurs chaines idiotypiques de façon à remplacer l'un des fragments ou au moins une partie de ce fragment, par l'une des susdites substances anticoagulantes. 16 / Pharmaceutical composition according to any one of claims 9 or 10, characterized in that the antibody or antibodies, or idiotypic fragments, of these antibodies are - either coupled to an anti-coagulant substance, or a substance having an activity thrombolytic, this substance which can be - for example tPa, streptokinase, urokinase, - is modified at the level of one of their idiotypic chains so as to replace one of the fragments or at least a part of this fragment, by one of the above anticoagulant substances. 17/ Utilisaticn d'anticorps, ou de leurs fragments idiotypiques, selon l'une quelconque des revendic@tions 1, 2 3, 4 ou 6 ou d'un mélange de ces anticorps monoclonaux ou de leurs fragments idiotypiques, pour la fabricatior. d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées à des troubles de la physiologie plaquettaire.17 / Use of antibodies, or their idiotypic fragments, according to any one of claims 1, 2 3, 4 or 6 or a mixture of these monoclonal antibodies or their idiotypic fragments, for manufacturing. of a medicament intended for the treatment of pathologies linked to disorders of platelet physiology. 18/ Procédé pour la préparation d'anticorps monoclonaux selon l'une quelconque es revendications 1 à 4, comprenant les tapes suivantes 18 / A method for the preparation of monoclonal antibodies according to any one of claims 1 to 4, comprising the following steps a) fusion ce cellules spléniques de souris ayant préalablement été immunisées avec des antigènes purifiés avec des cellules du myélo-e en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le PEG a) fusion this spleen cells of mice having previously been immunized with antigens purified with myelo-e cells in the presence of a fusion promoter, for example PEG b) culture des hybridomes produites par la fusion dans un milieu HAT en présence de macrophages du péritoine de souris normales, b) culture of the hybridomas produced by the fusion in a HAT medium in the presence of macrophages of the peritoneum of normal mice, c) criblage du surnageant des hybridomes pour détecter la présence des anticorps recherchés, notamment pal ira méthode ELISA, c) screening of the hybridoma supernatant to detect the presence of the antibodies sought, in particular pal ira ELISA method, d) sélection et clonage, e cas échéant à plusieurs reprises, des hybridomes producteurs des anticorps, d) selection and cloning, e if necessary several times, of the antibody-producing hybridomas, e) production d'ascites à partir de souris dans lesquelles ont été transférés les connes positifs pour la production d'anticorps monoclona-~x,  e) production of ascites from mice into which the positive connes have been transferred for the production of monoclona- ~ x antibodies, f) purification des anticorps ronoclonaux obtenus . f) purification of the ronoclonal antibodies obtained. Elle concerne aussi l'application diagnostique et thérapeutique de ces anticorps. It also relates to the diagnostic and therapeutic application of these antibodies. 19/ Hybridomes producteurs des anticorps monoclonaux selon la revendication 4 ou la revendication 6, tels tels qu'obtenus par fusion des cellules myélomateuses Sp2/O-Agl4 avec des cellules spléniques de souris préalablement immunisées avec des plaquettes de sang humain traitées à la chymotrypsine 0,2mg @1/109 plaquettes).19 / Hybridomas producing monoclonal antibodies according to claim 4 or claim 6, as obtained by fusion of myeloma cells Sp2 / O-Agl4 with spleen cells of mice previously immunized with platelets of human blood treated with chymotrypsin 0 , 2mg @ 1/109 platelets). 20/ Hybridomes producteurs des anticorps monoclonaux selon la revendication 5 caractérises tels qu'obtenus par fusion des cellules mélomateuses P3 x 63 Ag8 avec des cellules spléniques de souris préalablement immunisées avec un mélange d'antigènes GMP140, glyco@rotéines Ia, Ic, IIa, GP110-115. 20 / Hybridomas producing monoclonal antibodies according to claim 5 characterized as obtained by fusion of P3 x 63 Ag8 meloma cells with spleen cells from mice previously immunized with a mixture of GMP140 antigens, glyco @ roteins Ia, Ic, IIa, GP110-115.