FR2618227A1 - Procede d'essai pour la determination quantitative de la presence d'une substance dans un echantillon et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede. - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé d'essai pour déterminer quantitativement la présence d'une substance à analyser dans un échantillon par liaison spécifique, dans lequel l'échantillon est mis en contact avec un matériau de support en phase solide 309 sur lequel est immobilisé un premier réactif de liaison spécifique à la substance à analyser et avec un réactif de liaison spécifique marqué qui peut participer à une réaction " en sandwich " ou " concurrente " avec le premier réactif en présence de la substance à analyser et dans lequel le marqueur participe à une réaction chimioluminescente dont la lumière émise par celle-ci est utilisée comme moyen pour déterminer l'ampleur selon laquelle le réactif de liaison spécifique marqué s'est lié (si tel est le cas) à la phase solide, caractérisé en ce que la lumière est enregistrée sur une pellicule sensible à la lumière 307 et en ce que la lumière est obtenue à partir d'une source ponctuelle de telle façon que la taille de l'image formée sur la pellicule procure une mesure de la quantité de la substance à analyser dans l'échantillon.

Description

La présente invention est relative à des essais par liaison spécifique, et

en particulier à des essais immulogiques ainsi qu'à des appareils grâce auxquels on peut

enregistrer les résultats de ces essais.

On connaît déjà des systèmes d'essai immunologique en phase solide, par exemple à base de particules. Ils permettent

la détermination qualitative et/ou quantitative d'une subs-

tance immunogène dans un échantillon d'essai par l'intermédiaire d'une réaction de liaison immunologique entre la substance immunogène (la substance à analyser) et au moins un réactif associé de liaison spécifique à cette dernière, au moins un de ces réactifs de liaison associés étant lié à un matériau

de support insoluble en contact avec un milieu liquide com-

prenant l'échantillon d'essai. Le fait que le complexe immuno-

logique résultant soit lié au matériau de support, peut-être avantageusement utilisé au cours de la détermination ultérieure de l'ampleur suivant laquelle la réaction de liaison a eu lieu. La détermination est habituellement effectuée en utilisant un réactif associé de liaison spécifique marqué, et la réaction de liaison peut-être soit une réaction "concurrente" ou une réaction "en sandwich", chacune de celles-ci étant maintenant

largement utilisée dans la technique.

Dans une réaction "concurrente" caractéristique, le milieu d'essai qui est en général aqueux, est mis en contact avec la phase solide du support sur lequel est immobilisé un réactif de liaison spécifique (par exemple un anticorps monoclonal) qui est spécifique de la substance destinée à être déterminée, et le milieu d'essai contient une quantité

connue de la substance à analyser (ou un analogue de celle-

ci possédant les mêmes épitopes), portant un marqueur et une quantité connue d'un échantillon qui est supposé contenir

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la substance à analyser. En l'absence de substance à analyser dans l'échantillon, la substance à analyser ou un analogue marqué se lie au réactif de liaison spécifique immobilisé sur le support en phase solide, et on détermine l'ampleur de cette liaison par des expériences classiques. Lorsque l'échantillon contient la substance à analyser, celle-ci rentre en compétition avec la substance à analyser ou l'analogue marqué vis-à- vis du réactif de liaison spécifique, et l'ampleur selon laquelle le réactif de liaison spécifique se lie au composant marqué, est lO donc réduite. En comparant celle-ci avec le résultat témoin (c'est-à-dire le résultat obtenu en l'absence de la substance à analyser), on en déduit une mesure de la concentration en

substance à analyser dans l'échantillon.

Dans une réaction "en sandwich" caractéristique, le premier réactif de liaison spécifique à la substance à analyser est immobilisé sur le support en phase solide, et le milieu

d'essai qui est à nouveau généralement aqueux, contient éga-

lement un deuxième réactif de liaison spécifique à la substance à analyser et portant un marqueur. En l'absence de substance à analyser, aucune liaison n'a lieu entre le réactif immobilisé Pt le réactif marqué. Lorsque la substance à analyser est présente, elle fait office de pont entre les réactifs de liaison spécifique marqué et immobilisé, et ceci donne lieu

à la liaison indirecte du réactif marqué sur la phase solide.

L'ampleur de cette liaison fournit une mesure de la concen-

tration en substance à analyser dans l'échantillon. Les spéci-

ficités du réactif immobilisé et du réactif marqué à l'égard de la substance à analyser, peuvent être différentes, mais si la molécule à analyser possède plus d'un épitope identique,

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il est possible d'utiliser le même réactif de liaison spéci-

fique tant sous la forme immobilisée que sous la forme marquée libre. Le brevet européen n 0149565 (Amersham International PLC), décrit des essais tels que des essais immunologiques et des essais de mesure immunologiques en deux sites, réalisés en utilisant un réactif marqué et un autre réactif lié à des particules susceptibles d'être attirées par magnétisme qui peuvent être mises en suspension mais qui sont insolubles dans un milieu d'essai liquide, dans lesquels après que le réactif marqué ait été fractionné entre la phase liquide et les particules selon des proportions qui dépendent de la concentration d'une substance à analyser dans un échantillon, la phase liquide est éliminée et les particules sont remises en suspension dans un autre milieu liquide, et on observe la concentration en marqueur. Le procédé d'essai décrit est

particulièrement adapté à des systèmes de marquage par fluores-

cence et chimioluminescence, et il peut être mis de manière appropriée en oeuvre dans des plaques à plusieurs puits dans lesquelles les puits sont optiquement distingués les uns des autres, les observations étant effectuées par dessus ou par dessous les puits. A la page 5 du document EP 0149565, il est mentionné que la centrifugation des plaques de microtitrage

n'est pas appropriée, et qu'il est également difficile d'effec-

tuer des mesures utiles d'un quelconque signal optique produit

par les particules de matériau solide résultant de l'entrai-

nement d'un réactif particulier hors de la suspension. Pour cette raison les auteurs du document EP 0149565 maintiennent le fait que l'utilisation de particules sensibles à l'attraction magnétique qui sont remises en suspension dans un liquide avant l'observation du signal permet une large utilisation

des plaques de micro-titrage pour des essais immunologiques.

Le document EP 0149565 est relatif à des essais quanti-

tatifs dans lesquels le signal de fluorescence ou de chimiolumi-

nescence est lu numériquement par l'intermédiaire d'instruments. Il peut s'avérer effectivement vrai que de telles lectures sont

plus facilement obtenues à partir d'une phase solide parti-

culaire à l'état'dispersé.

Toutefois, contrairement à cet art antérieur, on a trouvé que l'on pouvait obtenir des résultats d'essai quantitatifs en utilisant un système procurant un signal de luminescence et une phase solide qui est localisée plutôt que dispersée dans un milieu d'essai, si le signal fourni par la phase solide localisée est enregistré en utilisant un film sensible à la lumière. Le besoin d'un équipement d'enregistrement optique coûteux, est donc évité, et la pellicule développée peut fournir un enregistrement permanent facilement conservable du résultat d'analyse. Ceci est particulièrement utile dans le cas de l'analyse d'échantillons à grande échelle dans des hôpitaux, des cliniques et des laboratoires médicaux. La présente invention procure des techniques spécifiques grâce auxquelles on peut effectuer des essais simples et non délicats mettant en oeuvre

une pellicule sensible à la lumière comme moyen d'enregistrement.

La présente invention a principalement pour objet un essai pour analyser une substance dans un échantillon, dans

lequel on utilise un signal de luminescence pour la détermi-

nation du résultat d'essai, et le signal est enregistré sur une pellicule sensible à la lumière, la lumière enregistrée étant issue d'une source ponctuelle de telle façon que la taille de l'image formée sur la pellicule, procure une mesure

de la quantité d'une substance à analyser dans l'échantillon.

La présente invention a de manière plus spécifique pour objet un procédé d'essai pour déterminer quantitativement la présence d'une substance à analyser dans un échantillon par une liaison spécifique, mettant en oeuvre un matériau de

support en phase solide sur lequel est immobilisé un premier-

réactif de liaison spécifique à la substance à analyser, et un réactif marqué qui peut participer à une réaction "en sandwich" ou "concurrente" avec le premier réactif en présence de la substance à analyser, et dans lequel le marqueur participe à une réaction chimioluminescente, la lumière émise par celle-ci étant utilisée comme moyen de détermination de l'ampleur selon laquelle le réactif marqué s'est lié (si tel est le cas) à la phase solide, caractérisé en ce que la lumière est enregistrée sur une pellicule sensible à la lumière, et en ce que la lumière est obtenue à partir d'une source ponctuelle de telle façon que la taille de l'image formée sur la pellicule procure une mesure

de la quantité de la substance à analyser dans l'échantillon.

Par source ponctuelle, on comprendra que la surface de la phase solide sensibilis'e, présentée à la pellicule sensible à la lumière, est substantiellement plus petite que la surface de la pellicule sensible à la lumière qui est exposée à la source lumineuse. En pratique, la surfacede la phase solide présentée à la pellicule est de préférence pas plus grande - qu'environ 50% de la surface de la pellicule exposée, et plus particulièrement pas plus grande qu'environ 25%. Ceci est

décrit plus en détail ci-dessous à l'aide d'un exemple.

Dans un mode de réalisation de la présente invention, la phase solide délimite elle-même la source ponctuelle. Ceci est de préférence obtenu en localisant dans une petite zone d'un récipient, un support en phase solide particulaire sur lequel la substance émettant de la lumière s'est liée. Si on effectue par exemple l'essai dans un petit puits, par exemple un puits

d'un ensemble de puits dans un plateau transparent caractéris-

tique à plusieurs puits, à la fin du procédé d'essai, la phase

solide particulaire peut être localisée dans une zone étroi-

tement délimitée à la base du puits, et la faible masse de la phase solide accumulée fait office de source ponctuelle. Ceci peut être facilement réalisé en pratique en utilisant des puits qui ont une section transversale plus étroite à la base qu'au sommet. Des exemples caractéristiques comprennent des puits qui sont étroitement évasés ou dont la partie inférieure se termine par un fond de forme ronde ou conique. La forme interne du puits concentre donc la petite quantité de phase solide particulaire localisée, en une masse étroitement délimitée à la base du puits. Dans ce mode de réalisation, on a trouvé que l'on pouvait

obtenir des résultats quantitatifs étonnement précis en dispo-

sant le puits ou l'ensemble de puits ai voisinage immédiat d'une pellicule sensible à la lumière qui peut enregistrer la lumière émise à partir de la source ponctuelle délimitée par le support

particulaire. La pellicule sensible à la lumière est de préfé-

rence en contact direct avec la paroi inférieure du puits.

Dans une variante de réalisation de la présente invention, la source ponctuelle est délimitée par un orifice disposé au voisinage immédiat du récipient, à l'extérieur de celui-ci, dans lequel l'essai est réalisé. Dans ce mode de réalisation le support en phase solide ne délimite pas lui-même la source ponctuelle, et il peut être enconséquence présent, si on

le souhaite, en une masse nettement plus importante de matériau.

En fait, le matériau de support peut comprendre, si on le

souhaite, une phase solide particulaire sous forme dispersée.

Des variantes comprennent une phase solide particulaire loca-

lisée, une seule particule plus importante'de phase solide, telle qu'une perle, ou une phase solide localisée de manière permanente, par exemple sous la forme d'une paroi intérieure

sensibilisée du récipient dans lequel l'essai est effectué.

Dans tous ces modes de réalisation, l'orifice externe délimite la source ponctuelle à partir d'une zone plus importante de matériau émettant de la lumière. Afin d'atteindre la mesure

quantative nécessaire du résultat d'essai, il est indispen-

sable, dans ce mode de réalisation, de faire en sorte que la pellicule sensible à la lumière soit espacée de l'orifice plut8t que placée en contact direct de celui-ci. La distance entre la pellicule et l'orifice ne doit pas être si importante que lorsque de la lumière qui émerge de l'orifice, atteint la pellicule, l'intensité de celle-ci sot trop faible pour former une image utile sur la pellicule. Dans une situation pratique caractéristique, en utilisant un ensemble de puits d'une plaque multipuits transparente classique comme récipients dans lesquels on effectue des essais individuels, l'orifice

peut être ménagé à l'aide d'une plaque perforée placée directe-

ment sous le puits. Chaque orifice doit être au moins situé

au voisinage de l'axe vertical central de son puits associé.

La plaque perforée doit être en contact direct avec la paroi inférieure des puits, et le pellicule doit être disposée sous la plaque perforée, mais espacée de celle-ci selon la distance critique pour permettre l'obtention d'un résultat quantitatif. Dans une situation pratique caractéristique, en utilisant des puits classiques ayant un diamètre intérieur au sommet d'environ 8 à 10 mm. Les orifices doivent avoir une dimension maximum, par exemple un diamètre, d'au moins

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0,5 mm environ. De préférence la dimension maximale n'est pas supérieure à 3 mm environ. Les orifices doivent, encore plus avantageusement, avoir une dimension maximum d'environ 1 à environ 2mm. La distance entre la face inférieure de la plaque perforée et la pellicule sensible à la lumière doit être au moins d'environ O,5mm, et elle ne doit en général pas dépasser environ 5mm. En général, la distance optimum est de 1 à 3 mm. L'homme du métier appréciera que, quelque que soit le dispositif pratique, de simples expériences auront besoin d'être réalisées avant que les valeurs optimales de

ces paramètres puissent être établies.

Un organe d'espacement perforé est de préférence prévu entre la plaque perforée et la pellicule afin de maintenir précisément la distance nécessaire entre l'orifice et la

pellicule.

Un avantage de ce deuxième mode de réalisation sur le premier, consiste en ce que l'orifice délimite la source ponctuelle, et la source ponctuelle est donc indépendante

de l'importance réelle de la phase solide produisant la lumière.

On peut ainsi obtenir une plus grande souplesse de mise en oeuvre. En outre, la phase solide peut, si on le souhaite, être choisie de façon à ce qu'elle fasse également office d'écran pour empêcher de la lumière parasite, par exemple produite par un marqueur non lié également présent dans le milieu, d'accéder à l'orifice. Si la phase solide consiste par exemple en une seule grosse perle opaque, remplissant presque la partie inférieure du récipient, seule la lumière produite par la partie inférieure de la perle, peut accéder

à l'orifice.

Si la phase solide localisée est disposée au fond d'un tube et que la pellicule est directement disposée sur le tube, la lumière formera une tâche sur la pellicule dont la surface variera en fonction de la quantité de lumière émise à partir du marqueur qui s'est lié au support. On peut examiner simultanément de cette façon plusieurs récipients d'essai en utilisant une seule pièce de pellicule, et la quantité relative de lumière émise à partir de chaque récipient

peut être estimée en comparant les tâches sur la pellicule.

En conséquence, dans un mode de réalisation, la présente invention a pour objet un procédé d'essai dans lequel, après incubation appropriée avec un échantillon et un réactif de liaison spécifique marqué dispersible ou soluble, un matériau

de support en phase solide portant un agent de liaison spéci-

fique immobilisé, est disposé de manière localisée à l'intérieur d'un milieu liquide au voisinage d'une pellicule sensible à la lumière afin de permettre la détection de lumière à partir d'une source ponctuelle, le marqueur étant capable

de participer à une réaction chimique donnant lieu à la produc-

tion de lumière par chimio-luminescence, et le milieu liquide

contenant des réactifs supplémentaires qui peuvent être néces-

saires pour provoquer la réaction.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention a pour objet un procédé d'essai d'une substance à analyser, dans lequel: (a) on prépare un milieu d'essai aqueux contenant: (i) un matériau de support en phase solide particulaire sur lequel est immobilisé un réactif de liaison spécifique à la substance destinée à être déterminée, le support en phase de solide particulaire étant susceptible d'être mis

en suspension dans le milieu d'essai aqueux, mais étant faci-

lement localisable dans celui-ci; ii) un échantillon que l'on suppose contenir la substance destinée à être déterminée; et iii) un réactif marqué soluble ou dispersible dans le milieu d'essai qui est soit un deuxième réactif de liaison spécifique susceptible de participer avec la substance à analyser et le premier agent de liaison spécifique, à une réaction "en sandwich", ou la substance à analyser elle-même ou un analogue de la substance à analyser, et le marqueur est un réactif chimioluminescent; (b) on incube le milieu d'essai pour permettre au réactif marqué de se lier au support en phase solide particulaire (c) on localise le support en phase solide particulaire dans le milieu d'essai; (d) on replace ou on dilue le milieu d'essai en utilisant un milieu liquide qui est ajouté avec ou qui contient des réactifs supplémentaires qui peuvent être nécessaires pour provoquer la réaction de chimioluminescence; et (e) on mesure sur une pellicule sensible à la lumière, la lumière de chimioluminescence à partir d'une source ponctuelle

comprenant un marqueur lié au support en phase solide particu-

laire dans un état localisé.

Dans une variante des procédés mentionnés ci-dessus, l'incubation est réalisée en deux étapes mettant en oeuvre une incubation initiale du matériau de support en phase solide particulaire et de l'échantillon en l'absence de réactif marqué, au moins la majeure partie de l'échantillon étant éliminée et remplacée par un milieu liquide contenant le réactif marqué dispersible ou soluble, ainsi qu'une deuxième incubation après quoi les étapes (c) à (e) de la séquence mentionnée ci-dessus, sont effectuées. Une étape de localisation doit être réalisée avant que la majeure partie de l'échantillon ne soit éliminée entre les deux étapes d'incubation. A titre d'autre variante, on peut ajouter plus tôt dans le procédé au moins un, ou en fait tous les réactifs nécessaires au déroulement de la réaction chimioluminescente, par exemple au cours de l'étape (a) ou lorsque le réactif marqué est

ajouté dans une incubation en deux étapes.

Le support en phase solide particulaire, comprend de

préférence des particules sensibles à l'attraction magnétique.

L'utilisation de dispositifs "photographiques" pour enregistrer les résultats des réactions luminescentes dans des procédés analytiques, est déjà connue. Ces dispositifs sont par exemple décrits dans la demande de brevet européen n 0071859 et dans le brevet britannique n 2169704. Ce dernier document décrit un appareil d'enregistrement, comprenant un receptacle pour plusieurs récipients réactionnels, ce réceptacle comprenant une plaque comportant une série de

trous ménagés dans celle-ci pour recevoir une série de réci-

pients réactionnels, un boîtier pour loger le réceptacle, ce bottier étant adapté pour empêcher l'entrée de lumière parasite et comprenant un couvercle ouvrant, des moyens de maintien d'une pellicule photographique au voisinage de la face inférieure de la plaque, et un obturateur amovible destiné à

être interposé entre la pellicule et la plaque, le dit optura-

teur amovible étant déplaçable entre une position fermée et une position ouverte, dans cette dernière position la pellicule étant exposée en cours d'utilisation, et ladite plaque étant disposée (a) de façon à reposer sur et être supportée par ledit obturateur lorsque ce dernier est dans sa position fermée, et

(b) de façon à chuter en direction de la pellicule photographi-

que lorsque l'obturateur est déplacé dans sa position ouverte.

Cet appareil n'a pas été préalablement utilisé pour fournir des résultats analytiques quantitatifs par enregistrement de la

lumière émise à partir de sources ponctuelles.

La présente invention fournit un dispositif amélioré pour déterminer le résultat d'un essai spécifique en utilisant la lumière émise par une réaction chimioluminescente commé moyen de détermination quantitative de la présence d'une substance à analyser dans un échantillon, le dispositif comprenant un réceptacle pour plusieurs récipients réactionnels, le réceptacle comprenant une première plaque comportant une série de trous ménagés dans celle-ci pour recevoir une série de récipients réactionnels, un bottier pour loger le réceptacle, le boîtier étant adapté pour empêcher l'entrée de lumière parasite et comprenant un couvercle ouvrant, des moyens pour maintenir une pellicule photographique au voisinage de la face inférieure de la plaque et un obturateur amovible destiné à être interposé entre la pellicule et la plaque, cet obturateur amovible étant déplaçable entre une position fermée et une position ouverte, dans cette dernière position la pellicule étant exposée en cours d'utilisation, et une deuxième plaque perforée interposée entre la base du réceptacle et l'opturateur, les perforations individuelles de celle-ci ménageant chacune un orifice sous un trou individuel prévu dans le réceptacle, chaque orifice ayant une surface nettement inférieure à celle de son trou associé dans le réceptacle, en combinaison avec des moyens pour maintenir une distance prédéterminée entre la pellicule et la plaque perforée lorsque l'opturateur est déplacé jusqu'à sa

position ouverte.

Les moyens pour maintenir la distance, comprennent de préférence une troisième plaque perforée dans laquelle les perforations sont nettement plus importantes que les orifices ménagés dans la deuxième plaque, chaque perforation dans la troisième plaque étant située directement au-dessous d'un orifice dans la deuxième plaque. L'ensemble des trois plaques est de préférence agencé pour reposer sur et être supporté par l'obturateur lorsque ce dernier est dans sa position fermée, et de façon à chuter sur la pellicule photographique

lorsque l'obturateur est déplacé jusqu'à sa position ouverte.

La pellicule sensible à la lumière doit être très "rapide" afin d'assurer que de faibles quantités de lumière puissent être enregistrées et différenciées pour obtenir une information quantitative. Des pellicules ayant des sensibilités de par exemple 20 000 ASA sont maintenant disponibles dans le commerce et elles sont particulièrement appropriées. La pellicule Polaroïd est très appropriée et commode et un dispositif photographique comme celui décrit, peut être adapté sur l'arrière d'un appareil Polaroid Q standard disponible commercialement. Cependant, la taille des épreuves d'une pellicule normale obtenue de cette manière est insuffisante pour couvrir la totalité de la surface de la plaque multipuits d'un laboratoire standard 96puits (8x12 puits) et il est donc conseillé d'utiliser des plaques ayant un plus petit nombre de puits, par exemple l'utilisation de plaques standard qui ont été

coupées àune taille inférieure.

Si on le souhaite, tout risque d'interférence avec de la lumière issue d'un reste de marqueur non lié dans la masse de l'échantillon, peut être minimisé en incorporant dans le milieu d'essai, un agent d'atténuation qui bloque ou absorbe

cette lumière.

Dans un mode de réalisation la présente invention fournit un procédé d'essai immunologique à base de particules, dans lequel on utilise un réactif de liaison spécifique associé qui est marqué de telle façon que le marqueur fournisse de manière continue un signal de chimioluminescence. dans le milieu d'essai, ce signal étant masqué, inhibé ou autrement supprimé lorsque le réactif de liaison associé marqué est uniformément dispersé dans le milieu d'essai, et dans lequel, après la réaction de liaison,une concentration locale du matériau de support particulaire est effectuée dans le milieu d'essai de telle façon que la concentration locale du réactif de liaison associé

marqué porté par les particules, fournisse un flux lumineux.

local qui est suffisant pour surmonter la capacité de suppres-

sion du signal du milieu d'essai et donc, fournir un signal de chimioluminescence détectable dont l'amplitude dépend de l'ampleur de la liaison formée entre la substance immunogène à analyser et le réactif de liaison spécifique associé porté par les particules. Dans ce mode de réalisation, un procédé d'essai immunologique selon la présente invention est en conséquence caractérisée en ce que: a) le marqueur émet de manière continue de la lumière en étant dans le milieu d'essai; b) le marqueur étant dispersé dans le milieu d'essai, que le marqueur soit libre ou lié dans un complexe lié au matériau de support, la lumière est masquée, inhibée ou autrement supprimée; c) la formation d'un complexe avec le réactif de liaison associé marqué et l'autre réactif de liaison associé, ne gêne pas en soi de manière importante, la lumière émise par le marqueur; et d) un signal lumineux détectable est fourni seulement lorsque le matériau de support sur lequel est lié le marqueur complexé, est localisé dans une zone relativement petite à l'intérieure

du milieu d'essai.

La phase solide, par exemple le support particulaire, a initialement accès à l'ensemble du milieu d'essai, et elle -15 peut donc se trouver sous l'influence d'une quelconque activité de suppression de la lumière dont est dotée le milieu dans son ensemble. La phase solide est ensuite placée dans une situation dans laquelle elle possède une relative liberté vis-à-vis de l'échantillon dans son ensemble, et elle est

donc moins influencée par l'effet suppresseur de la lumière.

Le déplacement de la phase solide est la seule action qui

nécessite d'être réalisée afin d'obtenir un résultat lisible.

La production d'un signal constant par le marqueur lui-même, évite la nécessité d'ajouter d'autres réactifs et de procéder

à d'autres stimulations après que la localisation des particu-

les ait eu lieu, et elle fournit une sensibilité maximum de détection pour une complexité ou un nombre d'opérations

minimum. La simple action de localisation physique des particu-

les de support est la seule qui soit nécessaire pour produire un signal lumineux détectable. La suppression de la lumière

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émise par le réactif de liaison associé marqué lorsqu'il

est dispersé dans le milieu d'essai, représente la caractéris-

tique la plus importante de ce mode de réalisation de la

présente invention.

Dans la présente invention, on utilise un marqueur qui est chimioluminescent ou luminescent ou qui participe à une réaction chimioluminescente avec d'autres composants du milieu Si le milieu est opaque ou au moins insuffisamment translucide pour que la lumière soit observable lorsque le réactif de liaison spécifique associé marqué est uniformément dispersé dans le milieu, aucun signal optique n'est détectable. En variante, le milieu peut contenir une substance chimique qui interagit avec un composant du système produisant de la lumière, et ilempêche ou inhibe la production d'un signal optique. La localisation ultérieure du support particulaire sur lequel est lié un complexe faisant intervenir le réactif de liaison spécifique associé marqué, peut donner lieu à un signal optique localisé qui a une intensité suffisante

pour être détectable.

Un tel système peut être obtenu en utilisant par exemple de la péroxydase de raifort comme marqueur, avec du luminol et un péroxyde (tel que H202) dans le milieu. Le milieu peut contenir un colorant chimiquement suffisammment inerte pour ne pas être affecté par la réaction avec le péroxyde, qui procure au milieu une densité optique à une longueur d'onde appropriée suffisamment élevée ( une densité optique de préférence d'au moins environ 2) pour rendre la lumière produite par le marqueur dispersé, insignifiante en comparaison avec celle qui est observable à partir d'une concentration localisée du marqueur. L'utilisation de colorant (agents d'atténuation) qui absorbent la lumière à des longueurs d'ondes comprenant celles de la luminescence émise dans des essais immunologiques mettant en oeuvre des réactions luminescentes comme système de marquage, est décrite dans le document EP 0165072. En variante, le milieu d'essai peut contenir un réactif chimique qui gêne la production du phénomène de luminescence. Une autre façon de réduire ou d'éliminer le signal de chimioluminescence dans l'ensemble de l'échantillon d'essai,

consiste à incorporer un réactif d'extinctiondans l'échantillon.

Si l'on utilise par exemple de la péroxydase de raifort comme marqueur en la faisant réagir avec un péroxyde et du luminol en solution pour produire de la lumière visible, la réaction peut être inhibée en incorporant dans l'échantillon, un réactif

concurrent tel que l'acide gallique ou de l'acide thiodiglycol-

lique. Il peut être avantageux d'incorporer un système fluores-

cent qui puisse absorber la lumière de chimioluminescence et qui émette à une longeur d'onde différente. Un tel système peut aider à discriminer l'effet de la lumière produite dans l'échantillon dans son ensemble, en particulier si la lumière émise est observée à travers un filtre approprié. Par exemple, la lumière bleue émise par le luminol peut être absorbée par une coumarine qui émet de la lumière jaune/verte. L'agent fluorescent peut être disposé sur ou au voisinage des moyens

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c;e détection de signal. En variante, l'agent fluorescent

peut être utilisé comme agent de masquage dispersé dans l'ensem-

ble de l'échantillon, de sorte que seule une production loca-

lisée de chimioluminescence est observable.

Bien que le luminol (5-amino-2, 3-dihydro-1, 4-phtalazine- dione) soit un agent chimioluminescent particulièrement préféré pour être utilisé dans le contexte de la présente inventidn,

on peut utiliser une variété d'autres composés et de réactions.

On peut par exemple utiliser d'autres dérivés de la 2,3-dihydro-

1, 4-phtalazinedione, tel que le dérivé 6-aminé (isoluminol) D'autres exemples comprennent la luciférine et les esters d'acridinium. Ces systèmes sont de manière générale décrits par exemple dans les documents GB 1552607, GB-A- 2112779 and GB-B- 2095830. En général, les réactions chimioluminescentes tendent à durer peu de temps, ce qui peut donner lieu à des

contraintes temporelles qui s'exercent sur le procédé d'essai.

Il est donc utile d'accroître la durée d'émission de lumière, par exemple en ajoutant des réactifs qui prolongent ou retardent l'émission. La stimulation des réactions de chimioluminescence, en utilisant des composés tels que des 6-hydroxybenzothiazoles

substitués, du p-iodophénol, 4-phénylphénol et/ou du 2-chloro-

4-phénylphénol ainsi que des amines aromatiques, et décrites

dans les documents EP 87959, EP 116454 et GBA 2162946. L'utili-

sation de p-iodophénol est particulièrement préférée.

Un autre mode de réalisation de la présente invention, consiste en un procédé d'essai à base de particules, dans lequel on utilise: (a) une première population de particules localisables (par exemple des particules "magnétiques"), portant un réactif associé de liaison spécifique à une substance chimique à analyser; (b) un réactif associé de liaison spécifique non porté par une particule et marqué de telle façon que le réactif associé de liaison spécifique produise de manière continue dans le

milieu d'essai, un précurseur pour une réaction chimiolumines-

cente; (c) un réactif consommateur dispersé dans le milieu d'essai, qui rentre efficacement en compétition avec le précurseur et qui inhibe donc la production de chimioluminesce lorsque le réactif associé de liaison spécifique marqué reste dispersé Y- \ \- \" \,s.ss dans le milieu d'essai; (d) une deuxième population de particules localisables portant ou contenant un réactif qui peut réagir avec le précurseur pour donner lieu à un phénomène de chimioluminescence, et dans lequel la localisation simultanée des deux populations de particules au voisinage d'une pellicule sensible à la lumière, permet d'observer la chimioluminescence produite selon une quantité qui dépend de l'ampleur suivant laquelle le réactif associé de liaison spécifique porté par la première

population de particules, s'est lié à la substance à analyser.

Dans le mode de réalisation précédent, le marqueur peut être par exemple de la glucose oxydase réagissant avec du glucose et de l'oxygène dans le milieu d'essai pour produire du péroxyde d'hydrogène comme précurseur, l'agent consommateur peut être une enzyme de type catalase, et le réactif lié peut être de la péroxydase de raifort qui interagit avec le luminol dans le milieu d'essai. Si on le souhaite, le réactif lié peut être porté à la surface ou piégé à l'intérieur

des particules de la deuxième population.

L'addition séquencielle des composants dans le milieu d'essai peut être avantageuse, par exemple pour ménager un temps approprié ("incubation") pour que la ou chaque réaction de liaison immunologique ait lieu avant l'addition d'un substrat

nécessaire à la production d'un signal de chimioluminescence.

On remarquera que la production continue de lumière a uniquement lieu lorsque les substrats nécessaires ont été ajoutés. Cette addition est toujours effectuée avant que la phase solide

soit relocalisée dans la zone ou l'environnement de détection.

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La continuité de la production de lumière peut durer au moins pendant la période de temps nécessaire à la localisation de la phase solide et à la détection par la pellicule de

la lumière ainsi produite.

La période d'incubation nécessaire pour qu'ait lieu la ou chaque réaction de liaison spécifique, dépend de bons nombres de facteurs, tels que la nature des réactifs et de la substance à analyser, de leurs concentrations relative

et absolue et de facteurs physiques, tels que la température.

Ces paramètres sont familiés à l'homme d'art. En général, la période d'incubation n'excède pas environ une heure, et dans

la plupart des applications elle est d'environ 30 mn à une heure.

La localisation du matériau de support peut être obtenue selon une large variété de procédés. Ainsi que cela a été mentionné précédemment, la phase solide sensibilisée peut

former une partie (ou en fait la totalité) de la paroi intérieu-

re du récipient dans lequel l'essai est effectué. En variante, une seule portion importante de phase solide sensibilisée, telle

que sous la forme d'une perle ou d'une tige, peut être incorpo-

rée dans le récipient et disposée au voisinage de la pellicule sensible à la lumière au moment de l'étape d'enregistrement. Par exemple, des perles en matière plastique (par exemple en polystyrène) sont fréquemment utilisées comme phase solide. On utilise également des billes d'acier enrobées de plastique de 2 à 5mm de diamètre, c'est-à-dire, ayant été recouvertes d'une enveloppe de polynère tel qu'un polycarbonate qui peut être appliqué à partir d'une solution. Ces dernières présentent l'avantage de pouvoir être mises en place en utilisant des aimants extérieurs. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, la phase solide comprend toutefois

plusieurs petites particules.

Il est possible de laisser les particules de phase solide

décantées par gravité, bien que ceci nécessite que l'on maintien-

ne une suspension uniforme des particules dans le milieu d'essai, par exemple par agitation, lors de la réaction de liaison. La centrifugation peut être utilisée comme variante à la gravitation. En variante, les particules peuvent être concentrées localement en faisant passer l'ensemble du milieu d'essai à travers une membrane ou un filtre poreux de façon

à concentrer ainsi les particules sous un faible volume.

Une autre variante consiste à utiliser un matériau de support particulaire qui sous l'influence du magnétisme ou d'une autre force appliquée extérieurement, peut être forcé à venir dans un endroit particulier à l'intérieur du volume du milieu d'essai. Les particules peuvent être déplacées à travers un milieu d'essai enproduisant à l'aide d'ultrasons une onde

stationnaire motrice.

Une phase solide particulaire peut être réalisée à partir de n'importe quel matériau de support approprié. Des particules dites "magnétiques" (c'est-à-dire des particules qui peuvent être sollicitées pour se déplacer à travers un liquide sous l'influence d'un champ magnétique) d'une variété de tailles appropriées, allant par exemple demoins environ lum à plus d'environ 300 um, sont disponibles dans le commerce. Pour une séparation de gravité, on préfère des tailles particulaires d'au moins environ 50 um et non supérieur à 300 um, en fonction de la densité du matériau. Des perles acryliques dérivées d'oxiranne disponibles dans le commerce, sont particulièrement adaptées, en particulier pour des essais mettant en oeuvre des haptènes marqués. Des techniques de sensibilisation et/ou de liaison de ces supports en phase solide sur des réactifs de liaison, tels que des immuglobulines, sont bien connues d'après les techniques classiques de l'art antérieur,

et elles ne font pas partie de la présente invention.

261822 7

La variété des substances à analyser auxquelles la présente invention peut être appliquée, est vaste. A titre d'exemple, uniquement, on peut mentionner les suivantes: les hormones stéroides, telles que celles impliquées au cours de la grossesse et qui ont une influence sur la fertilité, par exemple la progestérone et les oestrogènes; les métabolites urinaires tels que l'oestrone-3-glucuronide et le prégnanediol-3-glucu, ronide; les hormones peptidique telles que la gonadotrophine chorioniquehumaine, l'hormone lutéinisante et l'hormone folliculo-stimulante; des protéines telles que l'albumine urinaire, les béta-2 microglobulines et la protéine de liaison du rétinol; les lipoprotéines de basse et haute densités,

dont la détection est intéressante dans le contrôlecardiovas-

culaire, et la troponine cardiaque; des marqueurs de maladie infectueuses telles que les antigènes de Chlamydia, Neisseria, Herpes, Candida et HIV1 (SIDA) et les anticorps dirigés contre Treponema (Syphilis), Rubella et Toxoplasma, et des

immunoglobulines, telles que les anticorps monoclonaux.

Le milieu d'essai peut donc être dérivé de bons nombres de sources, en particuler les fluides corporels tels que l'urine, le sérum et le plasma. La présente invention est particulièrement adaptée à la sélection de milieux de culture cellulaire en égondaux immunoglobulines, par exemple dans la

production d'anticorps monoclonaux.

Les réactifs associés de liaison spécifique peuvent être des anticorps ou des antigènes polyclonaux ou monoclonaux,

des pectines ou des hormones ainsi que leurs récepteurs.

Ces substances sont bien connues dans la technique, bons nombres d'entre elles sont disponibles dans le commerce, et leur nature précise ne fait pas partie de la présente invention. Si l'échantillon que l'on suppose contenir la substance à analyser, est de nature variable ( par exemple un sérum et une urine) ou s'il contient des composants qui peuvent gêner les réactions de liaison spécifique ou la production du signal observable, il peut être avantageux de diluer l'échan- tillon par exemple avec de l'eau ou une solution tampon avant de mettre en oeuvre un procédé d'essai de la présente invention

afin de réduire la possibilité d'une telle interférence.

Dans ces conditions, il est possible d'accroStre la sensibilité d'un procédé analytique en éliminant au moins la majeure partie de l'échantillon d'essai avant d'observer le signal à partir du support en phase solide localisé. Ceci est avantageux dans la mesure o bons nombres d'échantillons naturels, tel qu'un sérum sanguin, contiennent des produits qui peuvent gêner la réaction de production d'un signal (en conduisant ainsi à un résultat qui, par observation erronée, est faible ou négatif), ou qui peuvent amorcer la réaction de production d'un signal (en conduisant ainsi à l'observation d'un faux résultat positif). Ce problème est déjà bien connu et bon nombre d'essais classiques mettent en oeuvre une série d'étapes "de lavage" destinées à séparer complètement la

phase solide de l'échantillon résiduel.

Dans une variante de réalisation de la présente invention le procédé analytique comprend en conséquence les étapes consistant: (a) à localiser le matériau de support en phase solide après une période d'incubation appropriée dans l'échantillon d'essai (b) à éliminer au moins la majeure partie de l'échantillon d'essai liquide;

(c) à ajouter une certaine quantité d'un milieu liquide conten-

ant d'autres réactifs qui sont nécessaires pour provoquer la réaction d'émission de lumière; et

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(d) à relocaliser (si cela est nécessaire) le matériau de support en phase solide particulaire, et à enregistrer une

lumière émise à partir d'une source ponctuelle.

Une variante du mode de réalisation mentionné dans le paragraphe juste précédent, comprend les étapes consistant (a) à localiser le matériau de support en phase solide après une période d'incubation appropriée dans un premier milieu liquide contenant ou comprenant l'échantillon d'essai sans

le réactif marqué.

(b) à éliminer au moins la majeure partie de l'échantillon d'essai liquide; (c) à ajouter une certaine quantité d'un deuxième milieu liquide contenant le réactif marqué; (d) à relocaliser le matériau de support en phase solide après une période d'incubation appropriée; (e) à éliminer au moins la majeure partie du deuxième milieu liquide;

(f) à ajouter une certaine quantité d'un milieu liquide conte-

nant d'autres réactifs qui sont nécessaires pour provoquer la réaction d'émission de lumière; (g> à relocaliser (si cela est nécessaire) le matériau de support en phase solide particulaire et à enregistrer une

quelconque lumière émise à partir d'une source ponctuelle.

Selon une simplification de ce dernier mode de réalisation, les deuxième et troisième milieux liquides peuvent être un seul et même milieu, de sorte que l'on doit seulement réaliser

une seule opération d'élimination et de remplacement de liquide.

En variante, le troisième milieu liquide peut être ajouté dans le récipient à la fin de la deuxième étape d'incubation sans éliminer une quelconque quantité du deuxième milieu liquide.

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Selon un autre aspect de la présente invention, on a toutefois trouvé qu'il n'était pas nécessaire de laver la phase solide si efficacement que tout l'échantillon d'essai

résiduel et/ou le réactif marqué non lié soient éliminés.

En fait, un avantage de la présente invention consiste en ce que dans ce mode de réalisation, on peut obtenir un procédé d'analyse qui élimine la majeure partie du milieu liquide en utilisant le nombre minimum d'opérations tout en obtenant un résultat analytique fiable. Le but consiste à éliminer

une proportion importante du milieu liquide du récipient.

En général, cette proportion est d'au moins environ 50 %, et plus fréquemment d'au moins environ 90 % par rapport au

volume total de liquide dans le récipient.

Une solution consiste à décanter le liquide surnageant

après localisation du support en phase solide particulaire.

Le récipient dans lequel la réaction analytique est effectuée et ensuite remplie avec un autre milieu liquide. Si cela est nécessaire, ce procédé peut être répété pour ménager une étape de lavage intermédiaire (impliquant une relocalisation

du matériau de support particulaire avant une deuxième décanta-

tion et remplissage du récipient), mais, si cela est possible, ceci doit ê!re évité afin de minimiser le nombre d'opérations nécessaires à l'essai dans son ensemble. Dans tous les cas, le milieu de remplissage doit contenir des réactifs qui sont nécessaires à l'amorçage ou à la stimulation de la réaction chimioluminescente. En variante à la décantation, le milieu liquide peut

être éliminé du récipient à l'aide d'une pipette ou en siphonant.

Toutes les techniques de séparation qui viennent juste d'être décrites peuvent conduire à un problème de rejet du

liquide qui a été éliminé du récipient. Dans un mode de réali-

sation particulièrement préféré de la présente invention, on préfère utiliser un dispositif à effet de mèche pour absorber la majeur partie du liquide surnageant du récipient réactionnel par capillarité. L'expression "dispositif à effet de mèche" est utilisée ici pour désigner n'importe quel organe poreux qui peut être imergé dans le récipient pour absorber un liquide dans celui-ci, et cet organe pouvant ensuite être retiré du récipient tout en ne dérangeant presque pas le support

en phase solide particulaire localisé qui reste dans le réci-

pient. Après le retrait du dispositif à effet de mèche contenant le liquide absorbé, le récipient peut être rempli avec un autre milieu liquide. Si cela est nécessaire, on peut intercaler un étage de lavage et utiliser un deuxième dispositif à effet

de mèche pour éliminer le liquide de lavage après la relocali-

sation du matériau de.support particulaire.

Le dispositif à effet de mèche peut être réalisé à partir

* d'un matériau poreux ou fibreux susceptible d'absorber rapi-

dement un liquide. La porosité du matériau peut être unidirec-

tionnelle (c'est-à-dire avec des pores s'étendant complètement ou principalement parallèlement à l'axe longitundinal du

dispositif à effet de mèche) ou multidirectionnelle (omnidirec-

tionnelle, de sorte que le dispositif à effet de mèche a une structure spongieuse amorphe). On peut utiliser des matières

plastiques poreuses, telles que du polypropylène, du poly-

éthylène (de préférence avec un poids moléculaire très élevé),

du fluorure de polyvinylidène, une résine d'éthylène et d'acé-

tate de vinyle, une résine d'acrylonitrile et du polytétra-

fluoro-éthylène. Des mèches peuvent également être réalisées à

2 6 1 8 2 2 7

partir de papier ou d'autres matériaux cellulosiques, tels que de la nitro-cellulose. Les matériaux qui sont aujourd'hui utilisés dans les pointes des stylos dits à pointe feutre, sont particulièrement appropriés, et on a en fait trouvé que les pointes unitaires qui sont actuellement disponibles dans le

commerce pour la fabrication de tels stylos, forment un disposi-

tif à effet de mèche idéal pour être utilisé conformément à la présente invention. Les puits des plateaux à plusieurs puits ont de manière caractéristique une capacité de 300 à 400 ul, et une pointe unitaire ayant un diamètre d'environ 5mm et une longueur d'environ 3cm, peut former un dispositif à effet de mèche idéal pour éliminer rapidement un volume allant jusqu'à par exemple

environ 400 ul d'un milieu liquide à partir d'un tel puits.

La vitesse à laquelle un liquide est absorbé dans le dispositif à effet de mèche à partir du récipient, doit être choisie de telle façon qu'elle ne soit ni trop rapide, ni trop lente. Le dispositif à effet de mèche doit de préférence être capable d'absorber la majeure partie du milieu liquide dans le récipient en quelques secondes, mais il doit toujours avoir la capacité d'absorber encore du liquide. En pratique, si le dispositif à effet de mèche absorbe un liquide presque instantanément et qu'il est ensuite immédiatement retiré du récipient, un important film de liquide peut rester en adhérant sur les parois du récipient. Si la vitesse d'absorption est légèrement plus lente, ou si on laisse le dispositif à effet de mèche dans le récipient pendant une courte période de temps, un tel film liquide résiduel peut s'écouler au fond du récipient et être absorbé par le dispositif à effet de mèche. Au contraire, si le dispositif à effet de mèche absorbe le liquide seulement lentement (par exemple en quelques minutes plutôt qu'en quelques secondes) , ceci peut prolonger de manière indue le temps de traitement, et cela doit de

préférence être évité.

Lorsque l'on utilise le dispositif à effet de mèche

pour absorber un milieu liquide à partir d'un récipient conte-

nant un matériau de support particulaire, il est préférable de localiser le matériau de support particulaire dans un endroit hors de contact avec le dispositif à effet de mèche afin d'éviter que le matériau de support particulaire n'adhère sur, ou en fait soit absorbé dans, le dispositif à effet

de mèche par l'écoulement du liquide.

Les plateaux à plusieurs puits classiques, contiennent

plusieurs puits disposés selon un réseau. Un réseau correspon-

dant de mèches peut être utilisé conformément à la présente invention pour éliminer simultanément, si on le souhaite,

du liquide de chaque puits de l'ensemble du réseau de puits.

Un avantage particulier de la présente invention consiste en ce que du liquide peut être éliminé du récipient d'analyse sans risque de répandre du liquide ou de devoir rejeter le liquide éliminé sous une forme s'écoulant librement. Le liquide reste dans le dispositif à effet de mèche, et il peut être rejeté beaucoup plus facilement. Un avantage important d'un dispositif à effet de mèche selon la présente invention, consiste en ce que lorsqu'il a absorbé le milieu liquide, il peut être retiré du récipient et manipulé sans risque d'égouttage du milieu liquide. Ceci est particulièrement important lorsque l'on effectue les essais analytiques sur des échantillons supposés contenir des organismes de maladie infectueuse. Le risque de formation d'un aérosol est également minimisé, ce qui constitue un aspect important lorsque des milieux liquides contenant des organismes infectueux sont

en cause.

Les dimensions et la forme globale du dispositif à effet de mèche peuvent être choisies de façon à éliminer le volume optimum de liquide du récipient d'analyse tout en ne perturbant pas autant que possible le support en phase de solide ( et

donc tout matériau sensible lié à celui-ci).

On va maintenant décrire uniquement à titre d'exemple des modes de réalisation de la présente invention en se référant

aux dessins annexés.

Dispositif d'enregistrement Un dispositif d'enregistrement "photographique" décrit dans la présente invention, est illustré sur les figures 1 et 2 des dessins annexés. La figure 1 illustre une vue générale du dispositif dans son ensemble représenté avec le couvercle du corps d'appareil photographique en position ouverte. La figure 2 illustre une vue en élévation en coupe partielle du dispositif selon la ligne AA de la figure 1, le couvercle du corps d'appareil photographique étant en

position fermée.

Le dispositif d'enregistrement illustré sur les figures 1 et 2 fonctionne principalement selon les principes décrits

dans le brevet britannique no 2169704.

En se référant à la figure 1, le dispositif d'enregis-

trement comprend un appareil photographique instantané "Polaroid" standard disponible dans le commerce de type "back" 100 comprenant une partie articulée 101 susceptible d'être ouverte pour recevoir une pellicule (non représentée), et un obturateur coulissant 102 qui peut être tiré à partir du c8té 103 de

l'appareil "back" pour exposer la pellicule. Un corps rectangu-

laire plat 105 perforé au centre par une grande ouverte rectan-

gulaire 106 à travers laquelle on peut exposer une pellicule à de la lumière lorsque l'obturateur 102 est tiré en position ouverte, et disposé sur la partie supérieure 104 de l'appareil

photographique "back". L'ouverture 106 loge une plaque faci-

lement amovible 107 perforée avec plusieurs trous verticaux 108 disposés selon un réseau régulier et qui peuvent recevoir les puits d'un plateau standard à plusieurs puits disponible dans le commerce (non représenté). Au voisinage d'une extrémité de la plaque 107, on a prévu un petit bouton 109 fixé à la surface supérieure de la plaque et permettant de saisir la plaque et de la retirer du corps 105 en la soulevant. La profondeur du corps 105 est supérieure à l'épaisseur de la plaque 107, et le bouton 109 ne s'étend pas au-dessus de la partie supérieure 110 formée par le corps 105. Un couvercle susceptible d'être fermé 111 articulé à l'arrière 112 du dispositif, peut être basculé vers le bas pour fermer la partie supérieure du corps 105. Un joint d'étanchéité à la lumière est ménagé par une étroite nervure continue 113 qui

s'étend autour de la face inférieure 114 du couvercle suscep-

tible d'être fermé 112 au voisinage du bord 115 du couvercle, et cette nervure pénètre dans une fente continue correspondante 118 qui s'étend autour de la partie supérieure 110 du corps 105. En se référant à la figure 2, le dispositif est illustré en reposant sur une surface 200 par l'intermédiaire de pieds 201 fixés au fond 202 de l'appareil photographique "back" 100. Les détails de réalisation de l'appareil photographique

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"badk", ne sont pas illustrés dans la mesure o ceux-ci sont tout à fait classiques et o ils ne font pas l'objet de la présente invention. Le couvercle 111 est illustré en position fermée, la nervure 113 s'étendant dans la fente 116 à la partie supérieure 110 du corps 105. L'obturateur 102 est illustré en position fermée, et la plaque perforée 107 est

représentée reposant sur la surface supérieure 203 de l'obtura-

teur. Lorsque l'obturateur 102 est ouvert, la plaque perforée 107 tombe et vient reposer sur une pellicule (non représentée)

qui s'étend jusqu'en dessous de l'obturateur.

La figure 2 illustre également un plateau transparent à plusieurs puits 204 reposant dans la plaque perforée 107, les puits individuels à fond rond 205 s'étendant dans les puits 108 ménagés dans la plaque perforée. L'épaisseur de la plaque est-elle que chaque puits s'étend jusqu'au fond de chaque trou, et donc lorsque la plaque vient reposer sur la pellicule après que l'obturateur ait été ouvert, chaque puits est en contact direct avec la pellicule. Un des puits

est illustré en contenant un échantillon de liquide 206 conte- nant une phase solide particulaire 207 localisée à la base du puits. La

quantité de phase solide 207 est fortement exagérée dans un but d'illustration, tandis qu'en pratique, le volume

occupé par la phase solide particulaire lorsqu'elle est locali-

sée est très faible.

A la fin d'un procédé d'analyse réalisée dans un plateau à plusieurs puits reposant dans la plaque perforée, une phase solide particulaire peut être localisée au fond de chaque puits (par exemple par effet magnétique), et la plaque perforée est disposée à l'intérieur de la cavité ménagée dans le corps

d'appareil photographique, et le couvercle est fermé. L'obtu-

rateur peut ensuite être ouvert pour exposer la pellicule et permettre d'enregistrer sur la pellicule, la lumière de chimioluminescence produite dans une réaction chimique induite

par un composant marqué lié à la phase solide localisée.

On a illustré uniquement à titre d'exemple sur les figures 3 à 6 des dessins annexés, divers procédés de production

de sources ponctuelles conformément à la présente invention.

On se référera à la figure 3 sur laquelle est illustré un seul puits transparent 300 (formant une partie d'un réseau de tels puits dans une plaque à plusieurs puits) est illustré en section en élévation, celui-ci reposant dans sa plaque de montage opaque 301. Le diamètre du puit diminue rapidement vers l'extrémité inférieure 302 en délimitant une partie conique étroite à la base du puit. La plaque de montage 301 est illustrée en appui direct sur la face supérieure d'une pellicule sensible à la lumière 303 et le puits 300 s'étend jusqu'à la base 304 de la plaque de montage de sorte que l'extrémité 302 du puits est également en contact direct avec la pellicule. Les parois verticales 305 du trou 306 ménagé dans la plaque de montage 301 recevant le puit 300, délimitent

une zone exposée 307 de la pellicule, ayant un diamètre net-

tement supérieur à celui du puits au niveau de son extrémité voisine du fond. Le puits contient un certain volume 308 de réactif liquide ainsi qu'une faible quantité 309 d'une phase solide particulaire finement divisée qui a été localisée, par exemple par magnétisme, au fond du puits. En raison de la faible quantité de phase solide particulaire présente

et des dimensions internes du puits, la phase solide particu-

laire est concentrée en un très faible volume au fond du puits, et si la phase solide porte un réactif capable d'émettre de la lumière à la suite d'une réaction de chimioluminescence, la lumière est entièrement émise dans une région qui est beaucoup plus petite que la surface de pellicule exposée

et elle se comporte en conséquence comme une source ponctuelle.

Bien que la phase solide accumulée soit seulement séparée de la pellicule par l'épaisseur du matériau transparent formant la paroi de puits, ceci est néanmoins suffisant pour permettre à la tache de lumière formée sur la pellicule d'avoir un diamètre relativement plus ou moins important en fonction

de la quantité de lumière produite par la phase solide.

L'utilisation d'un orifice pour former une source ponctuel-

le de lumière, est illustrée sous les figures 4, 5 et 6.

On se référera à la figure 4 sur laquelle on a illustré en section en élévation, un seul puits transparent 400 à fond rond et à section décroissante disposé dans sa plaque de montage opaque 401. Immédiatement en-dessous de la base 402 de la plaque 401 et en contact avec le fond 403 du puits, on a disposé une plaque mince opaque perforée 404 comportant une petite perforation 405 située immédiatement sous le fond

du puits. La largeur de la perforation 405 est nettement infé-

rieure au diamètre du trou 406 ménagé dans la plaque de montage et recevant le puits. Sous la plaque perforée 404, on a prévu une pellicule sensible à la lumière 407 séparée de cette dernière par une petite distance x. Le puits contient un certain volume 408 d'un réactif liquide ainsi qu'une seule grosse perle opaque 409 comme phase solide qui est représentée en appui au fond du puits et qui remplit presqu'entièrement la partie inférieure du puits. Le diamètre de la perle 409 est nettement supérieure à la taille de l'orifice 405. Si la surface de la perle porte un réactif lié qui peut émettre de la lumière à la suite d'une réaction de chimioluminescence, la lumière issue de la surface de la perle immédiatement au voisinage de l'orifice, peut traverser celui-ci et arriver sur la pellicule. Le diamètre de la tache produite sur la pellicule varie en fonction de la quantité de lumière émergeant

de l'orifice ainsi que de l'importance de la distance x.

On a illustré sur la figure 5 une variante de réalisation

dans laquelle le puits 500 est à fond plat et dans laquelle.

la surface intérieure 501 du puits dans la partie inférieure de celui-ci est sensibilisée avec des réactifs, et elle fait office de phase solide localisée de manière permanente. Si de la lumière chimioluminescence est émise à partir de réactifs

marqués qui se sont liés à cette surface sensibilisée, l'en-

semble de la partie inférieure émet de la lumière, mais seule la lumière traversant l'orifice 502 heurtera la pellicule 503 sus-jacente. Comme précédemment, le diamètre de la tache formée sur la pellicule dépend de la quantité de lumière

traversant l'orifice.

Un autre mode de réalisation est illustré sur la figure 6 o le puits 600 est à fond rond, mais en étant relativement large à sa base, et il contient une masse importante 101 de phase solide particulaire recouvrant presque la totalité du fond 602 du puits. Un orifice 603 délimite une zone beaucoup plus petite à travers laquelle de la lumière peut passer et il

se comporte en conséquence comme une source ponctuelle.

On se référera à la figure 7 sur laquelle on a illustré en section en élévation, une paire de puits 700 et 701 d'un réseau d'une plaque transparente à plusieurs puits, reçus dans une plaque de montage opaque 702. La disposition générale est telle que cela a été décrit ci-dessus en référence à la

figure 4.

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Toutefois dans ce cas, la plaque perforée opaque 703 qui

ménage l'orifice 704 sous chaque puits, est séparée de la pelli-

cule 705 sus-jacente par une autre plaque perforée opaque plus épaisse 706 dans laquelle les trous 707 ont un diamètre nettement plus important que les orifices 704 et, en fait comme cela est illustré sur le dessin, ils ont le même diamètre

que les trous ménagés dans la plaque de montage 702 qui reçoi-

vent les puits. Chaque trou ménagé dans la plaque séparatrice 706 délimite une zone 708 de pellicule qui peut être exposée à de la lumière traversant l'orifice. Dans la mesure o la plaque séparatrice est opaque, chaque zone délimitée sur

la pellicule, est séparée des zones associées aux puits environ-

nants, et le risque pour que de la lumière issue d'un orifice vienne heurter la surface de pellicule située sous un autre

orifice voisin, est minimisé.

On se référera à la figure 8 sur laquelle on a illustré par une vue "en éclaté", les éléments composites d'un réceptacle pour un plateau à plusieurs puits. Pour simplifier le dessin, le plateau transparent 800 est illustré en comportant un réseau de 12 puits disposés en 4 groupes de 3, mais en pratique,

le nombre de puits est normalement beaucoup plus important.

Le plateau à plusieurs puits peut être disposé dans une plaque de montage perforée opaque 801 comportant un trou 802 pour loger chaque puits. L'épaisseur 803 de la plaque

de montage est identique à la profondeur extérieure du puits.

Sous la plaque de montage 801, on a prévu une plaque opaque perforée 804 comportant un nombre correspondant de petits orifices 805 situés chacun dans l'axe vertical d'un trou de la plaque de montage 801. Sous la plaque perforée 804, on a prévu une plaque d'espacement opaque 805 comportant également le même nombre de trous qui, dans ce cas, ont le même diamètre que les trous ménagés dans la plaque de montage 801. L'épaisseur 807 de la plaque d'espacement 806 délimite la distance séparant chaque orifice 805 d'une pellicule sensible à la lumière (non représentée) qui peut être directement

placée sous la plaque d'espacement.

Exemple 1

On a utilisé dans l'essai d'analyse de hCG suivant, un appareil d'enregistrement "photographique" qui est à la base tel que

cela vient d'être décrit.

MATERIAUX

a) Phase solide Particules de polystyrène macroporeuses disponibles dans le commerce (Dyno: Dynosphères XP-6006), taille moyenne : 2,6 Vm à l'intérieure desquelles de l'oxyde de fer est uniformément réperti. Ces perles sphériques uniformes comportent une enveloppe extérieure à base de méthacrylate d'hydroxyéthyle

à groupes latéraux tosyle. Les groupes tosyle peuvent facile-

ment subir une réaction de substitution nucléophile avec des groupes aminos tels que ceux qui sont présents à la surface extérieure d'une protéine, ce qui conduit à une immobilisation Elles ont été sensibilisées avec un anticorps monoclonal

de souris anti-hCG selon le procédé suivant.

Dans une portion aliquote d'une suspension contenant des Dynosphères XP6006 (10mg), on a ajouté un tampon d'acide borique (0,005M, pH: 9,5, 0,5 ml). A cela, on a ajouté la solution d'anticorps (200pg dans lml de solution saline de tampon phosphate (PBS), pH: 7,2) puis un tampon d'acide

borique (0,5m, ajusté à un pH de 9,5 avec NaOH, 0,5ml).

On a laissé cela pendant une nuit sur un agitateur orbital

à la température ambiante pour effectuer la condensation.

Les perles ont ensuite été décantées avec un aimant et la solution protéique a été aspirée. Elles ont été lavées une fois avec une PBS (5ml), et l'opération de condensation a été répétée, mais cette fois en utilisant de l'albumine de sérum bovin (BSA, 20mg) pour condenser tous les groupes tosyle n'ayant pas réagi. Les perles ont ensuite été lavées pendant une nuit dans un tampon de phosphate (KH2PO4 0,25M, ajusté à un pH8 avec une solution de NaOH contenant 0,5% de BSA et 0,1 % de Tween 20, 5ml) afin d'éliminer de la surface des perles tout anticorps absorbé. Enfin, les perles ont été lavées dans le même tampon (2 x 5 ml) et elles ont ensuite été lavées dans une PBS (2 x 5ml) et conservées à 4 C, dans un volume connu de tampon de PBS + Tween (PBST) contenant

0,1% de BSA et 0,01% de Thimérosal comme conservateur.

b) Conjugué On a conjugué le même anticorps monoclonal de souris anti-hCG avec de la péroxydase de raifort comme enzyme, en

utilisant un procédé classique dans un tampon de PBST.

c) Substanc_ à analyser On a mis en oeuvre une variété d'échantillons d'urine contenant des concentrations connues de hCG allant de O jusqu'à 405mUI/ml. d) Solution de Luminol Solution dans un tampon Tris/HC 0,1 à un pH de 8,5, de luminol à lmM, de para-iodophénol à lmM et de péroxyde d'urée

à 10 mM.

e) Pellicule photographique Pellicule Polaroïd 0 type 612 noir et blanc à contrast

élevé de 20 000 ASA.

PROTOCOLE

On a prélevé à l'aide d'une pipette dans chaque puit

d'une série de puits à fond rond d'un plateau ("de micro-

titrage") à plusieurs puits classique en matière plastique transparente: pl d'un échantillon de substance à analyser correspondant à la plage de concentration mentionnée ci-dessus; 501l d'un conjugué; et p1 de la phase solide (0,05 % de solide pour obtenir 25pg de phase solide par puits); et on a noté la position de chaque échantillon dans la série

de puits du plateau.

Le plateau a été recouvert avec un film en matière plasti-

que et agité sur un agitateur de laboratoire à la température ambiante pendant une heure. Le plateau a ensuite été disposé sur une série de petits aimants correspondant à la série

de puits du plateau afin de localiser la phase solide particu-

laire au fond de chaque puits. Apres environ 2 minutes, le film en matière plastique a été retiré et (la série d'aimants étant maintenue en place sous le plateau) le liquide surnageant a été séparé par décantation dans chaque puits, et le plateau a été asséché puis séparé des aimants. On a ajouté 200 1pl de tampon PBST dans chaque puits, et on a laissé le plateau pendant une heure sans agitation. La phase solide a ensuite été relocalisée au fond de chaque puits et on a répété les étapes de décantation et de lavage. Le plateau a ensuite

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été retiré de la série d'aimants et on a ajouté 10Oul de la composition à base de luminol dans chaque puits. Une minute après le plateau a été à nouveau disposé sur la série d'aimants pendant 2 minutes et ensuite doucement retiré et disposé dans la plaque perforée de l'appareil photographique, le

dispositif complet a été mis en place dans l'appareil photogra-

phique et le couvercle a été fermé. L'obturateur a été ouvert

et la pellicule a été exposée pendant 5 minutes.

Les figures 9 et 10 des dessins annexés illustrent le

résultat caractéristique obtenu. Une photographie caractéris-

tique est illustrée sur la figure 9, deux séries de puits parallèles ayant été utilisées dans l'expérience afin d'obtenir des résultats en double. Le diamètre croissant des taches

sur la pellicule exposée est en corrélation avec la concentra-

tion croissante de substance à analyser dans les échantillons.

Le graphe illustré sur la figure 10 dans lequel le diamètre de tache (X) a été porté en fonction de la concentration en hCG (Y) exprimée en mUI/ml, montre qu'en tenant compte de l'erreur expérimentale, il y a une corrélation linéaire raisonnable entre la variation logarithmique de concentration

et le diamètre de tache.

Exemple 2

Cet exemple illustre l'examen de surnageants obtenus à partir de cultures de lignées cellulaires productrices d'anticorps monoclonaux ainsi que l'élimination partielle

d'échantillon entre deux étapes d'incubation.

MATERIAUX ET PROTOCOLE

Phase solide On a utilisé des perles de type Dynosphère XP-6006 comme phase solide particulaire ainsi que cela est décrit

dans l'exemple 1. Elles ont été sensibilisées avec des immuno-

globulines de lapin anti-souris Dakopatts Z259.

Anticorps de lapin anti-souris marqué par la biotine Le réactif Dakopatts Z259 (immunoglobulines de lapin anti-souris), a été marqué avec la biotine par réaction avec du biotine N-hydroxy succinimide (BNHS) à un pH de 7,5. On a

éliminé le BNHS n'ayant pas réagi par une dialyse poussée.

Conjugué d'avidine et de péroxydase de raifort On a utilisé un conjugué d'avidine marquée par de la péroxydase de raifort, commercialisé par Sigma sous le nO

A3151 de la façon recommandée par les fabricants.

MECHES

On a utilisé deux types de "mèche" pour éliminer le

fluide d'échantillon au cours de l'incubation en deux parties.

Ceux-ci consistaient en pointes unitaires pour stylos à pointe

feutre disponibles dans le commerce.

a) Pointes unitaires en polyéthylène à porosité omni-direction-

nelle de forme cylindre ayant une extrémité pointue conique régulière fabriquée par Porex Technologies, Fairburn, Georgia, USA. Celles-ci étaient capables d'absorber 200pl d'eau en

environ 14 secondes.

b) Pointes unitaires fibreuses principalement non directionnel-

les "en forme de burin", fabriquées par Stylex S.A., Lamone-

Lugano, Switzerland. Celles-ci étaient capables d'absorber

200p1 d'eau en moins d'une seconde.

Milieu HS Un "milieu HS" consiste en sérum de cheval à 5% dans un milieu RPMI 1640 comprenant: 1) 500ml de milieu RPMI 1640 commercial (Flow Laboratories) 2) 25ml de sérum de cheval 3) 5ml de pénicillinesteptomycine (Penicilline: 5000UI/ml et streptomycine: 5000ug/ml) 4) 5ml de Pyruvate de sodium, lOOmM ) 5ml de L-Glutamine, 200mM

PROTOCOLE D'ESSAI

1. On a incubé pendant 30 minutes à la température ambiante sur un agitateur, 5pl de la suspension de Dynosphères à 0,625% avec 15Fl de l'échantillon d'anticorps dilué dans un milieu HS à 5 % à l'intérieur des puits à fond rond d'un plateau de "micro-titrage" classique en matière plastique transparente moulée. L'échantillon était une solution d'anticorps monoclonal de souris contenant des concentrations allant de lng/ml jusqu'à 500g/ml dans un milieu HS, ou contenant un milieu HS vierge

comme témoin.

2. Après l'incubation, les Dynosphères ont été localisées avec un aimant, et l'excès de solution d'anticorps a été éliminé par absorption en utilisant soit une mèche Stylex

ou Porex.

3. On a ensuite ajouté dans chaque puits en remettant en suspen-

sion les Dynosphères, 30pl d'un complexe de biotine (RAM) et de péroxydase de raifort préalablement formé. Le complexe consistait en volume égaux d'anticorps de lapin anti-souris marqué par la biotine à 1/500 et de conjugué 1/2000 d'avidine et de péroxydase de raifort mélangés ensemble et laissés au repos pendant un minimum de 30 minutes. Les dynosphères ont été incubées avec le complexe pendant 30 minutes à la température

ambiante sur un agitateur.

4. On a ensuite ajouté 150ul de réactifs luminescents, et les dysnosphères ont été localisées au fond sur un aimant pendant deux minutes. Les réactifs comprenaient: du luminol à 10mM, du p-iodophénol à 5mM et du péroxyde d'urée à 1OmM selon un rapport volumique de 1:1l:1, et on a ajouté 15ul - d'une encre noire commerciale par ml de mélange avant introduc-

tion dans les puits.

5. Après localisation magnétique des dynosphères, les puits ont été exposés en regard d'une pellicule Polaroid R de 20000 ASA dans un appareil photographique tel que cela est décrit dans l'exemple 1 pendant environ 1 à 2 minutes. On a laissé la pellicule se développer pendant 1 minute au terme de laquelle chaque résultat positif s'est manifesté sous la forme d'une

tache blanche sur un fond noir.

RESULTATS

L'essai a permis-de détecter des anticorps à des concen-

trations de lng/ml jusqu'à 500ug/ml tandis que le milieu HS vierge n'a pas provoqué la formation d'une tache. A l'intérieur de certaines limites, la taille des taches était liée à la concentration de la substance à analyser, mais au-delà de cette limite il y avait un effet de plateau, et la taille des taches tendaient ensuite à diminuer pour une concentration en substance à analyser très élevée. Une épreuve typique est illustrée en figure 11 des dessins ci-joints et les résultats d'un essai typique représentés graphiquement en figure

12.

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EXEMPLE 3

L'appareil d'enregistrement photographique

des Exemples 1 et 2 a été utilisé.avec de légères modi-

fications dans un essai pour l'immunoglobuline G (lgG) d'une souris. Une plaque multi-puits, "Micro-titre" transparente, flexible et raccourcie a été adaptée dans une plaque amovible qui a été ajustée à une plaque à orifice et une plaque d'espacement comme représenté sur les figures 4, 7 et 8 des dessins annexés. Selon cet

arrangement, chaque puits est placé au-dessus d'un ori-

fice de 2 mm de diamètre espacé, soit de 3 mm ou 1,8 mm

de la surface de la pellicule, selon la plaque d'espa-

cement utilisée. Comme le dispositif est amovible, il.

est interchangeable avec le dispositif standard utilisé dans les Exemples 1 et 2. Les trous dans la plaque d'espacement sont circulaires et ont un diamètre de 8 mm, définissant ainsi une taille maximale nominale de spot

de 8 mm de diamètre.

MATERIELS

a) Phase solide

Des billes d'acier recouvertes d'une enve-

loppe en matière plastique (3 mm dia.), désignées ci-

après par le terme de billes, sont sensibilisées avec des Dakopatts d'immunoglobuline de lapin anti-souris Z 259 selon le procédé suivant. L'immunoglobuline est diluée à une concentration de 47 pg/ml dans 0,05 M d'un tampon carbonate/bicarbonate, pH 9,6, et cette solution est ajoutée aux billes à un taux de 50 Ipl par bille

(par exemple 5 ml pour 100 billes). Cette solution sen-

sibilisée est laissée en présence avec les billes durant 16 heures (toute une nuit) à température ambiante après quoi elle est décantée et les billes sont rincées deux

fois avec de l'eau distillée.

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CONJUGUE

Un conjugué disponible dans le commerce composé d'une peroxidaseimmunoglobuline de lapin conjuguée à de l'immunoglobuline de souris (Dako, code P161) a été utilisé. Les dilutions ont été

effectuées avec du PBST contenant 0,5 % BSA.

SUBSTANCE A ANALYSER

Une série d'échantillons a été préparée par dilution d'une solution de référence de IgG de souris monoclonal purifié dans du PBST contenant 0,1 % de BSA pour obtenir des concentration de ng/ml ng/ml 1 ng/ml 0,1 ng/ml 0,01 ng/ml

COCKTAIL LUMINOL

Le mélange réactif luminescent consiste en une solution de 1 mM luminol, 1 mM para-iodophénol et

10 mM de perborate de sodium.

PELLICULE PHOTOGRAPHIQUE

L'appareil d'enregistrement photographique est chargé avec une pellicule Polaroid de type 612 noir

et blanc à contrast élevé de 20.000 ASA. -

PROTOCOL

Dans les puits d'un plateau raccourci ont été

introduits des volumes de 150 pl,des solutions échantil-

lon, 3 pour chacune des concentrations. Dans une série supplémentaire de 3 puits, il a été introduit le diluant

PBST/0,5 % BSA pour un contr8le négatif. Une bille sensi-

bilisée a été ajoutée à chacun des puits.

Le plateau (plus les échantillons et les billes) est placé sur un agitateur dans un incubateur à 37 C et incubé pendant 30 minutes après quoi les échantillons sont évaporés. Pour ce faire, le plateau est placé sur un bloc portant une série de petits aimants positionnés de façon à ce que chaque bille soit maintenue sur le côté de son puits, suffisamment déplacée pour permettre à un tube étroit d'être inséré vers le fond du puits. Chaque puits a été rempli avec du PBST qui a ensuite été éliminé par aspiration de la même façon pour

fournir un rinçage minimal.

Ensuite, des volumes de 150 pl de conjugué (dilué 1/1000) sont ajoutés à chaque puits contenant une bille et le plateau est de nouveau incubé sous agitation pendant 30 minutes à 37 C. Après cette étape d'incubation le conjugué est éliminé par aspiration comme précédemment

et chaque bille est rincée 7 fois avec du PBST.

Chaque bille rincée a été ensuite récupérée avec 150 pl de cocktail luminol et le plateau a été placé dans l'appareil "photographique" avec un support de plateau standard. La pellicule a été exposée aux puits

(contenant les billes et lecocktail) durant 30 secondes.

Le plateau a été transféré à un support modifié avec une plaque d'espacements de 3 mm et des orifices de 2 mm, replacé dans l'appareil photographique et exposé à la pellicule durant 2 minutes. Ceci est répété avec une autre plaque d'espacement de 1,8 mm et une quatrième exposition a été réalisée selon ce dernier montage mais

seulement pour 1 minute. Les conditions variées enregis-

trées sont résumées dans le tableau 1.

TABLEAU 1

Conditions Epreuve n Restriction Espace au- Temps d'orifice dessus de la d'exposition pellicule 1 Aucune Aucune 30 sec 2 2 mm 3 mm 120 sec 3 2 mm 1,8 mm 120 sec 4 2 mm 1,8 mm 60 sec

RESULTATS

Les épreuves caractéristiques sont présentées

sur la figure 13 des dessins ci-joints.

L'exposition de 30 secondes (épreuve 1) avec aucune restriction d'orifices montre que les échantillons de 100 ng/ml produisent le plus de lumière alors que dans l'autre extrême les contrôles de zéro produisent un niveau

de lumière à peine détectable. En absence d'une restric-

tion d'orifices, les hauts rendements de lumières donnent néanmoins une image floue, enchevauchée. A 1 ng/ml, il y a un spot plein aigu mais audessous de cette valeur les

spots sont déchiquetés et mal-définis.

L'épreuve 2 donne une image plus claire. Les échantillons de 1 ng/ml, 10 ng/ml et 100 ng/ml donnent des spots identiques, pleins, alors que les échantillons de 0,1 ng/ml donnent des spots pâles et flous - et ceux

de 0,01 ng/ml donnent une tâche à peine détectable.

Quand l'espace entre l'orifice et la pellicule est réduit à 1,8 mm (épreuve 3), une plus grande résolution est obtenue de telle sorte que les échantillons de 1 ng/ml donnent un spot de taille réduite, que les échantillons de 0,1 ng/ml donnent un spot de taille encore plus petit et que les échantillons de 0,01 ng/ml sont détectables avec de très petits spots. Le contr8le zéro donne des

spots de faible contrastes àpeine perceptibles d'inten-

sité plus basse que l'échantillon 0,01 ng/ml.

En réduisant le temps d'exposition de secondes à 60 secondes (épreuve 4), la sensibilité et la gamme dimensionnelle sont légèrement changées, avec les échantillons de 100 ng/ml donnant les seuls spots de dimension pleine et les spots pour tous les autres ayant leur diamètre de dimension progressivement réduite.

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Claims (26)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'essai pour déterminer quantitativement la présence d'une substance à analyser dans un échantillon au moyen d'une liaison spécifique, mettant en oeuvre un matériau de support en phase solide (207; 309; 409; 501; 601) sur lequel est immobilisé un premier réactif de liaison spécifique de la substance à analyser, et un réactif marqué qui peut participer à une réaction "en sandwich" ou "concurrente" avec le premier réactif en présence de la substance à analyser, et dans lequel le marqueur participe à une réaction chimioluminescente dont la lumière émise par celle-ci est utilisée comme moyen de détermination de l'ampleur selon laquelle le réactif marqué s'est lié (si tel est le cas) à la phase solide, caractérisé en ce que la lumière est enregistrée sur une pellicule sensible à la lumière (307; 407; 503; 705) et en ce que la lumière est obtenue à partir d'une source ponctuelle de telle façon que la taille de l'image formée sur la pellicule procure une mesure de la quantité

de la substance à analyser dans l'échantillon.

2. Procédé d'essai selon la revendication 1, caractérisé en ce que la surface de la phase solide présentée à la pellicule sensible à la lumière n'est pas plus grande que 50 % environ de la surface de la pellicule

exposée à la source lumineuse.

3. Procédé d'essai selon la revendication 2, caractérisé en ce que la surface de la phase solide orientée en direction de la pellicule sensible à la lumière n'est pas plus grande que 25 % environ de la surface

de la pellicule exposée à la source lumineuse.

4. Procédé d'essai selon l'une quelconque des revendications

précédentes, caractérisé en ce que la phase solide délimite elle-même la

source ponctuelle.

5. Procédé d'essai selon la revendication 4, caractérisé en ce que la phase solide est particulaire et en ce que la source ponctuelle est formée en localisant la phase solide particulaire dans une petite zone d'un

récipient (205; 300; 400; 500; 600; 700) dans lequel l'essai est effectué.

6. Procédé d'essai selon la revendication 5, caractérisé en ce que la formation de la source ponctuelle est obtenue en localisant une phase solide particulaire au fond d'un puits à section transversale

nettement plus étroite à la base qu'au sommet.

7. Procédé d'essai selon l'une quelconque des revendications 4

à 6, caractérisé en ce qu'il est effectué dans au moins un puits d'un plateau classique à plusieurs puits (204), et en ce que pour enregistrer le signal de luminescence, la pellicule sensible à la lumière (307) est disposée en

contact direct avec le fond des puits du plateau.

8. Procédé d'essai selon l'une quelconque des revendications I

à 3, caractérisé en ce que la source ponctuelle est délimitée par un orifice (405; 502; 603; 704) situé au voisinage immédiat de l'extérieur du récipient dans lequel l'essai est réalisé, et en ce que la pellicule sensible à

la lumière (407; 503; 705) est espacée de l'orifice.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est prévu un organe d'espacement perforé (706) entre l'orifice et la pellicule afin de maintenir précisément une distance (X) entre l'orifice et la pellicule.

10. Procédé d'essai selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisé en ce que l'essai est réalisé dans au moins un puits d'un plateau à plusieurs puits classique, et en ce que l'orifice est ménagé par une plaque perforée (404; 703) qui peut être disposée directement en dessous du plateau de telle façon qu'il y ait un orifice situé directement

sous chaque puits.

11. Procédé d'essai selon l'une quelconque des revendications 8

à 10, caractérisé en ce que chaque orifice a une dimension maximum d'environ I à environ 2 mm, et en ce que la distance (X) entre l'orifice et la pellicule sensible à la lumière est d'au moins environ 0,5 mm, mais n'est

pas supérieure à environ 5 mm.

12. Procédé d'essai selon la revendication 11, caractérisé en ce

que la distance entre l'orifice et la pellicule est de l'ordre de I à 3 mm.

13. Procédé d'essai selon l'une des revendications précédentes,

caractérisé par un milieu liquide contenant des réactifs au voisinage de la pellicule.

14. Procédé d'essai selon l'une des revendications I à 12,

caractérisé par la préparation d'un milieu d'essai aqueux.

15. Procédé d'essai selon la revendication 14, caractérisé par

une incubation en deux phases.

16. Procédé d'essai selon l'une des revendications I à 12,

caractérisé par un agent marqué engendrant sans cesse un signal chimioluminescent.

17. Procédé d'essai selon la revendication 16, caractérisé en ce

que l'agent est le luminol ou un dérivé analogue du 2,3-dihydro-

1,4-phthalazinedione.

18. Procédé d'essai selon la revendication 17, caractérisé en ce

que la réaction chimioluminescente est renforcée par du para-iodophénol.

19. Procédé d'essai selon l'une des revendications I à 18,

caractérisé en ce qu'il s'agit d'un essai immunitaire.

20. Procédé d'essai selon l'une des revendications 1 à 19,

caractérisé par l'utilisation d'un ensemble à puits.

21. Dispositif pour déterminer le résultat d'un effet de liaison

spécifique en utilisant la lumière émise par une réaction chimiolumi-

nescente comme moyen de détermination quantitative de la présence d'une substance à analyser dans un échantillon, caractérisé en ce que le dispositif comprend un réceptacle (107) pour plusieurs récipients réactionnels (205), le réceptacle comprenant une première plaque comportant urr ensemble de trous (108) formés dans celle-ci pour recevoir un ensemble de récipients réactionnels, un boîtier (105) destiné à recevoir le réceptacle, le boîtier étant adapté pour empêcher la pénétration de lumière parasite et comprenant un couvercle susceptible d'être ouvert (111), des moyens pour maintenir une pellicule photographique au voisinage de la face inférieure de la plaque et un obturateur amovible (102) destiné à être interposé entre la pellicule et la plaque, ledit obturateur amovible étant déplaçable entre une position fermée et une position ouverte, dans cette dernière position la pellicule étant exposée en cours d'utilisation, et une deuxième plaque perforée (404; 703) interposée entre la base du réceptacle et l'obturateur dont les perforations individuelles (405; 502; 603; 704) ménagent chacune un orifice situé en dessous d'un trou individuel ménagé dans le réceptacle, chaque orifice ayant une surface nettement inférieure à celle de son trou asspcié ménagé dans le réceptacle, en combinaison avec des moyens pour maintenir une distance prédéterminée entre la pellicule et la plaque

perforée lorsque l'obturateur est déplacé jusqu'à sa position ouverte.

22. Dispositif selon la revendication 21, caractérisé en ce que les moyens pour maintenir la distance, comprennent une troisième plaque perforée (706) dans laquelle les perforations (707) sont nettement plus importantes que les perforations ménagées dans la deuxième plaque (702), chaque perforation dans la troisième plaque étant située directement sous

un orifice de la deuxième plaque.

23. Dispositif selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'ensemble de trois plaques est disposé de façon (a) à reposer sur, et être supporté par l'obturateur lorsque ce dernier est dans sa position fermée et (b) à chuter sur la pellicule photographique (705) lorsque l'obturateur est

déplacé jusqu'à sa position ouverte.

24. Dispositif selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé

en ce que chaque ouverture a une dimension maximale d'au moins 5 mm environ.

25. Dispositif selon la revendication 24, caractérisé en ce que chaque ouverture a une dimension maximale d'environ I à environ 2 mm, la distance ouverture/pellicule étant d'au moins 0,5 mm, mais pas plus grande

que 5 mm.

26. Dispositif selon la revendication 25, caractérisé par une

distance ouverture/pellicule comprise entre 1 et 3 mm.