CA1203741A - Procede de detection et de dosage d'une substance biologique par erythroadsorption - Google Patents

Abstract

" Procédé de détection et de dosage d'une substance biologique par érythroadsorption" 1. Procédé de détection d'une substance biologique immobilisée sur un support. 2. Il consiste : 1) à faire incuber, après lavage, la substance immobilisée sur un support avec le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes; 2) à ajouter des érythrocytes ; 3) à plonger l'ensemble dans une solution d'un agent fixateur, 4) à mesurer l'érythroadsorption, après avoir retourné le support afin de permettre l'élimination des globules rouges n'ayant pas réagi.

Description

7L?~
1.

" Proc~dé de détection et de dosage d'une substance biologique par érythroadsorption "
La présente invention est relative au domai~
ne biologique et plus particuli.èrement à la mise en ~-5 vidence, par érythroadsorption, d'une substance biologi-que immobilisée sur un support.
Elle concerne notamment des perfectionnements au procé~dé de détection et de closage d'une substance biologique par ~rythroadsorption d~crit dans la demande 10 de brevet FR 80 15 293, publiée 15 Jan.1982, no.~,486,657.
Dans cette demande de brevet FR 80 15 2~3 on a d~jà décrit un procédé de mise en évidence et de dosa-ge d'une substance biologique par érythroadsorption. Ce procede met en oeuvre, à ti~re de r~actif de dosage, le 15 produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un li-gand capable de réagir avec des érythrocytes, et des é-rythrocytes ~ titre de révélateur.
Ce proc~dé de détection et de dosage d'une substance biologique par ~rythroadsorption consiste :
1~ à immobiliser sur un support une substance ayant une affinit~ de fixation pour la subst2nce biolo-gique ~ doser;

2) à ~aire incuber cette substance avec le milieu liquide contenant la ~,ubstaDce biologique à do-25 ser;

3~ a faire incuber, après lavage, le milieu r~actionnel r~sultant avec le produit de couplage d'un ligand sp~ci~ique et dlun ligand capable de r~agir avec des ~rythrocytes;

4) ~ ajouter des érythrocytes; et

5) à déterminer l'érythroadsorption.
Ce proc~d~ est approprié pour doser, ~ titre de substances biologiques, des antig~nes, des anticorps, des haptènes, des hormones, des immunoglobulines et 35 au-tres substances d'int~rêt biologique.

~t~
~' 4~L

Selon les enseignements de ce brevet FR
80 15 2~3 la détermination de l'érythroadsorption peut se faire de plusieurs façons.
Par exemple, on peut constater visuellement 5 que les globules rouges sont adsorbés à la surface du support sur lequel a ét~ immobilis~e la substance ayant une af~inité de fixation pour la substance biologique à
doser. Dans ce cas, le procédé permet d'identifier dans un liquide biologique donné une subs-tance biologique 10 particulière. Si, au contraire, le liquide biologique ne contient pas la substance biologique particulière, les érythrocytes ne sont pas adsorbés et forment un cu-lot au fond du récipient, par exemple des puits de la microplaque. Le procédé de dosage par érythroadsorption 15 selon ce brevet FR 80 15 293 permet aussi de déterminer quantita~tivement une substance biologique donn~e. A cet effet, on élimine les globules rouges n'ayant pas réagi, par exemple par aspiration à la pipette. Puis on lyse les érythrocytes adsorbés, par exemple à l'eau distil-20 l~ée, et on dose par spectrophotom~trie les substanceslibér~es par les globules rouges, par exemple l'hémoglo-bine ou les substances arti~iciellement introduites par l'expérimentateur.
L'hémoglobine peut également etre dosée par ~5 une réaction enzymatique Par exemple, on peut utiliser un des substrats de la peroxydase, tels que l'ortho~di-anisidine ou l'ortho-phénylè~e-diamine La lecture se ~ait aussi par spectrophotom~trie à 400 nm pour l'ortho-dianisidine et à 492 nm pour l'ortho-ph~nylène-diamine.
La quantit~ de substances libér~es par les globules rouges, par exemple la quantité d'hémoglobine lib~r~e, est proportionnelle à la quantité de la subs-tance ~ doser, ce qui permet d'obtenir, par exemple, le dosage d'un ant.g~ne ou d'un anticorps présent dans l'é-35 chantillon en se r~férant à une gamme étalon d'hemolyse ~ ~l~w~

3~

des globules rouges ~tablie dans les memes conditions.
La détermination quantitative de l'~rythroad-sorption dé~inie ci-dessus nécessite donc l'~limination des globules rouge~ n'ayant pas r~agi et le dosage des 5 substances lib~r~es par les globules rouges ou des sub~
tances arti~ieiellement introduites par l'expérimenta-teur Dans ce proc~d~, la substance biologique ~
doser est immobilis~e sur ur. support par fixation sp~-10 eifique, e'est-à dire par l'interm~diaire dtune subs-tance ayant une affinit~ de fixatio~ pour la substance biologique à d~terminer.
On peut ~galement déterminer par ~rythroad-sorption~ selon le même mode op~ratoire, des substances 15 fixées sur un support par tout autre moyen, par exemple par adsorption passive ou par liaison chimique.
~ n a maintenant trouvé que la d~termination de l'erythr~adsorption peut etre effectu~e sans mettre en oeuvre une ~tape de dosage des substances lib~ré2s 20 par les globules rouges ayant ét~ adsorbé~ ou des subs-tances introduites par l'exp~rime~tateur Cette détermi-nation s'effectue d'une mani~re plus simple et permet u-ne meilleure quantification que celle d~crite dans le bre~et FR 80 15 293.
Ainsi, la pr~sente invention concerne un pro-c~d~ de d~tection et/ou de dosa~e, par érythroadsorp-tion, d'une substance biologique im~lobilisée sur un ~upport qui consiste ~ d~terminer llérythr~adsorption après avoir, d'une part élimin~ les globules rouges n'-30 ayant pas r~agi et d'autre part fix~ chimiquement sur l'immunoadsorbant les globules rouges adsorb~s, unique-Tnent par mise en oeuvre d'une ~olution d'un agent ixa-teur ~
Sous son aspect le plus ~éneral, la presente invention concerne un procede de dosage ~ualitatif etquantitat:if ~A

3a.

d'une substance biologique immobilisee sur un support, caract~rise en ce qu'il consiste~ tl) ~ faire incuber la substance immobilisee sur un support avec le produit de couplage d'un ligand sp~cifique et d~un ligand capable de reagir avec des erythrocytes; (2) ~ ajouter des érythrocytes; (3) a mettre l'ensemble en contac~ avec une solution d'un agent fixateur en séparant les erythrocy~es non fixés sur ledit ligand, (4~ ~ mesurer l'érythroad-sorption.
Sous un autre aspect le procede de dosage quali-tatif ou quantitatif d'une substance biologique par ~rythroadsorption consiste ~ immobiliser sur un support une substance ayant une affinite de fixation pour la substance biologique a doser, a faire incuber ladite substance immobilisee avec le milieu liquide contenant la ~ubstance biologique ~ doser, a faire incuber aprés lavage, le milieu réactionnel résultant avec le produit de couplage d'un ligand specifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes, a ajouter des erythrocytes et a determiner llerythroadsorption spécifique par hemolyse ou comptage, ledit procede etant caracterisé en ce que, aprés avoir ajouté les erythrocytes, on met en contact avec une solution d'un agen~t de fixation en separant les érythrocytes non fixés sur le ligand~ avant la mesure de 2S l'erythroadsorption Sou~ un autre aspect le presente invention concerne un coffret pour le dosage d'une substance bio-logique par ledit procédé caractérise en ce qu'il comporte: des anticorps anti-substance biologique a doser couples ~ un ligand susceptible de reagir avec des erythorcytes; du tampon phosphate; une solution d'agent fixateur; un support; et un support de reférence.
Sous un autre aspect le procéde consiste:

:35 1) ~ faire incuber, après lavage, la substan-ce immobilisée sur un support avec le produit de cou-plage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes;
2) ~ ajouter des ~rythrocytes;
3) à plonger l'ensemble dans une solution d'~
un agent fixateur, 4) à mesurer l'é;rythroadsorption, apr~s avoir retourné le support a~in de permettre l'~limination des 10 globules rouges n'ayant pas réagi.
A l'aide de la solution d'agent fixateur mise en oeuvre dans le procédé de l'invention, on fixe chimi-quement les ~rythrocytes adsorb(és à la surface du sup-port sur lequel a été immobilisée la substance biologi-15 que à mettre en évidence et on per~et l'élimination ra-pide des érythrocytes n'ayant pas réagi. Ainsi il se forme sur le support un tapis homogène d'~rythrocytes adsorbés et ~ixés chimiquement, dont la densit~ est fonction de la concentration de la substance à mettre 20 en évidance.
Par "agent ~ixateur" selon l'invention on dé~
signe tout a~ent capable de fixer les érythrocyte~ sur le support tout en évitant l'h~molyse de ceux-ci.
On r~alise :Eréque~ment des fixations de cellu-25 les vivantes en histologie pour l'~tude de celles-ci.
Les agents fixateu~s mis en oeuvre ~ cet ef~et doivent être t~ls qu'ils permettent la ~ixation desdites cellu-les avec un minimum de perturbations des structure~ cel-lulaires (voir Histochemistry, PEARSE Churchill Living-30 stone 3e ed. 1968 et "La Cellule" ~. DURAND et B. FAVARDCollec~ion Hexmann Paris 1967).
Dans le cas présent, il importe peu qu'il y ait ou non des perturbations des structures cellulaires, mais il est impéra-tif que la fixation, lorsqu'elle a 35 lieu, soit ~aite dans des condi-tions qui évitent l'hémo-lyse des érythrocytes.
La plupart des agents fixateurs monofonction-nels ou plurifonctionnels couramment utilisés dans le domaine de l'histologie conviennent aux ~illS de l'in-S vention, en particulier les aldéhydes, tels que le ~or-maldéhyde, le glutaraldéhyde, ce dernier étant préf~ré.
La concentration de la solution en l'agent fixateur doit être suffisante pour permettre la fixa-tion chimique des érythrocytes ayant réagi, mais elle 10 ne doit pas atteindre la concentration qui provoquerait une ~ixation en masse de tous les érythrocytes.
A titre d'exemple, on indiquera que, lorsque l'agent fixateur est le glutaraldéhyde, la concentration de la solution doit être comprise entre 0,1 et 0,5 % en 15 poids.
Le produit de couplage mis en oeuvre à titre de réacti~ dans le proc~dé selon l'invention est le pro-duit de couplage d'un ligand sp~cifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes Par "li~and" spéci~ique on désigne dans la pr~ésente description toute substance soluble qui peut r~agir de façon spécifique avec la substance ayant une affinit~ pour la substance biologique ~ doser ou avec la substance biologique elle-même.
Par "substance soluble" on désigne dans la pr~sente descri~tion toute substance soluble dans les milieux couramment utilisés pour les ré~actions biologi-ques. Il peut s'agir de milieux aqueux, tels que les milieu~ physiologiques, ou des m~langes de milieux a-30 queux et organiques De plus~ le ligand spécifique mis en oeuvre doit être tel que le produit de couplage ligand spéci-~ique-ligand capable de réagir avec des érythrocytes soit soluble en milieu aqueux.
Par "milieu aqueux", on d~signe selon l'in-~3~

vention les milieux aqueux, tamponnés ou non, couram-ment utilisés dans le domaine biologique, tels que les solutions tampon phosphate, les solutions tampons conte-nant un d~tergent, tel que le Tween*ou de la gélatine, 5 la s~rumalbumine bovine, la lactalbumine bovine et au-tres substances habituellement mises en oeuvre dans de tels domaines.
Les ligands sp~ci~iques r~pondant ~ une telle d~finition sont notamment les anticorps, les antig~nes lO macromol~culaires, les haptènes, les hormones et leurs r~cepteurs et substances similaires. Parmi les ligands sp~cifiques cités ci-dessus, on utilise le plus commu-n~ment les anticorps et les antigènes.
Le ligand capable de r~agir avec de~ érythro-15 cytes est une substance qui possède des sites de recon-~aissance de d~terminants spécifiques des ~rythrocytes ou des substances fix~es sur des ~rythrocytes.
A titre de tels ligands, on peut citer les anticorps anti-globules rouges, l'avidine, la biotine 20 e~ produits analogues On peut ~galement utiliser une lectine. Ainsi, le produit de couplage d'un ligand sp~-cifique avec un ligand capable de r~agir avec des éry-throcytes peut être le produit de couplage entre une leotine et un ligand sp~ci~ique, tel que décrit dans le 25 brevet FR 80 11 470, publiée 27 Nov. 1981, no 2,482,981, cite a titre de reférence. Le produit de couplage d'un ligand specifique avec un ligand capable de reagir avec des ~rythrocytes peut egalement être le produit de couplage entre une albumine et un ligand specifique, tel 30 que decrit dans la demande de brevet FR 82 04 247, publiee 12 Mars.1982,no.2,523,311, cit~ a titre de reference.
La détermination de 1' rythroadsorption peut être e~fectu~e soit visuellement, soit avec un photomè-tre r~glé ~ 414 nm, une loupe binoculaire ou un micros-35 cope invers~.
Le proc~d~ de l'invention est appropri~ pour * marque de commerce.

~` t~ J 1~ IL
7.

mettre en évidence, soit de manière quantitative, soitde manière qualitative, toute substance immobilisée sur un support d'une façon quelconque.
A titre de support, on peut utiliser n'impor-5 te quel support insoluble plat, présentant ou non descavités, tel que par exemple des feuilles ou bandes, des microplaques ou des tubes.
A titre de substance constitutive de tels supports, on peut utiliser la cellulose et ses dérivés, 10 le polyacrylamide, les polyméthacrylates d'alkyle et autres polym~res d'origine naturelle ou synthétique ainsl ~ue le verre.
On utilise avantageusement des microplaques pour immobiliser la substance biologique à doser, par 15 exemple des microplaques en polystyrène, ayant de~
puits en forme de U ou de V ou des puits ~ fond plat.
On peut également utiliser de3 tubes individuels ainsi que des supports plats, par exemple des feuilles de ni-trate de cellulose.
Par exemple, lorsque le support est une feuil-le de nitrate de cellulose, :La substance à mettre en é-vidence peut y être fixée ou déposée directement ou in-directement, par exemple par empreinte après une élec-trophorèse. De cette manière, on peut mettre en éviden-25 ce des IgG humaines.
Le proc~dé de l'invention convient également pour la détection des clônes d'hybridomes qui synthéti-sent des anticorps spbci~iques des antigènes ayant ser-vi à la fabrication dasdits hybridomes. Dans ce cas, on 30 pr~lève les surnageants des clônes, on fixe les surna-geants sur le nitrate de cellulose en ~euille et on ré-vèle la présence de l'anticorps en ajoutant un antigène spécifiq~e marqu~ avec un ligand capAble de réagir avec les érythrocytes Selon le procédé de l'invention, on peut met-~3~
~.

tre en évidence aussi bien une substance isol~e, qu'une substance contenue dans un milieu impur, étant donné que l'on met en oeuvre un réactif spéci~ique de la substance à déterminer S Selon une autre variante du procédé de l'~n-vention la substance biologique à mettre en ~vidence peut etre immobilisée sur le suppor-t d'une mani~re spé~
cifique, c'est-à dire par l'intermédiaire d'une substan-ce ayant une a~finité de ~ixation pour la substance bio-10 logique considérée.
Dans ce cas particulier, on immobilise tout d'abord sur le support une substance ayant une a~finité
de ~ixation pour la substance biologique à doser, puis on fait incuber cette substance ainsi immobilisée avec 15 le milieu liquide contenant la substance biologique à
déterminer; on peut alors effsctuer une détermination ~uantitative ou dosage. Sous cet aspect, le proc~dé de l'invention concerne un perfectionnement au proc~dé de détection et de dosage, par érythroadsorption d'une 20 substance biologique décrit dans la demande de brevet FR 80 15 2g3.
Selon cette variante, le procéd~ de l'inven-tion consiste :
1) ~ immobiliser sur un support une substance 25 ayant une a~inité de fixation pour la substance biolo-gique ~ doser;
2) ~ faire incuber cette substance avec le mi-lieu liquide contenant la substance biologique à doser;
3) ~ faire incuber, après lavage, le milieu 30 réac-tionnel résultant avec le produit de couplage d'un ligand sp~ci~ique et d'un ligand capable de reagir avec des ~rythrocytes;
4) à ajouter des ~rythrocytes;
5) ~ plonger l'ensemble dans une solution d'un 35 agent ~ixate~ur.

6) ~ mesurer l'érythroadsorption, après avoir retourné le support afin de permettre l'élimination des globules rouges n'ayant pas r~agi.
La substance ayant une affinité de fixation 5 vis-~-vis de la substance biologique ~ doser peut être toute substance capable de se ~ixer de façon sp~cifique avec ladite substance biologique. Par exemplej si la substance biologique à doser est un anticorps, la subs-tance ayant une af~inité de ~i~ation sera alors un an-10 tigène et r~ciproquement.
La substance ayant une a~finité de fixationpour la substance biologique à doser est immobilisée sur un support quelconque par des techniques classiques.
Les supports, par exemple ceux constitués de 15 ~euilles de nitrate de cellulose sur lesquels est fixée la substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique ~ doser constitue un moyen pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention.
Les premières étapes du procédé ci-dessus, à
20 savoir les ~tapes 1 à 3 sont réalisées conformément au brevet ~ 80 15 293. Si besoin est, 1'homme de 1'art pourxa se ré~rer à la description de ce brevet.
Cependant, on rappellera ci-après le mode o-pératoire général pour le dosage des anticorps, sans 25 pour au~ant en limiter la portée de l'invention à ce seul type de dosage.
Au cours de la première ~tape du proc~de de l'invention on immobilise sur un support des antig~nes (~g ) .
L'immobilisation des antigènes, qui consti-tuent dans ce cas particulier la substance ayant une affinité pour la substance biologique à doser, à savoir l'anticorps, est réalisée par exemple par adsorption passive ou, si nécessaire, par liaison covalente selon 35 la nature du support.

~P3~
1~ .

L'étape ~2) consiste en une incubation de 1'-antigène immobilisé avec le liquide biologique conte-nant l'anticorps (Ac) à doser, par exemple le sérum à
titrer. Après cette étape d'incubation, au cours de la-5 quelle l'antigène (Ag) interagit avec l'anticorps ~Ac)correspondant, s'il est présent dans le sérum à tester, on lave le suppor-t à l'aide d'une solution tampon, par exemple une solution de tampon phosphate contenant é-ventuellement un détergent tel que le "Tween" dénommé
10 ci~après PBS ou PBS Tween.
L'~tape (3) du procédé de l'invention consis-te à incuber le support résultant de l'étape (2) avec un produit de couplage ligand spécifique-ligand capable de r~agir avec des érythrocytes. Dans ce cas particu-15 lier, le ligand spéci~ique est un anticorps dirige con-tre les immunoglo~ulines de l'espèce humaine ou animale du s~rum à titrer. Après cette incubation, on lave le systeme résul-tant comme d~crit ci-dessus pour éliminer le produit de couplage nlayant pas réagi Puis, on ajou~
~O te des ~rythrocytes, qui sont adsorbés par le produit de couplage seulement si le sérum à titrer contient 1'-anticorps correspondant à l'antigène immobilisé, sinon les érythrocytes ne sont pas fix~és et tombent au fond du récipient Quel que soit le mode d'immobilisation de la substance biologique à d~terminer, on ajoute, selon un mode de r~alisation préféré du proc~dé de l'invention, suf~isamment d'érythrocytes pour remplir jusqu'à débor-dement les puits de la microplaque utilisée comme sup-30 port, a~in d'~viter la formation de bulles d'air dans les puits de ladite plaque. On recouvre ensuite ladite plaque, par exemple avec un film souple en matière plas-tique. Ainsi revêtue, la microplaque est plongée dans la solution d'agent ~ixateur, par exemple une solution de 35 glutaraldehyde, puis re-tournée le fond vers le haut. La ~3~
11 .

plaq~e flotte à la surface de la solution et le film est retiré En opérant de cette ~açon, les globules rouges non adsorbés sp~cifiquement sont ~liminés de la pla~ue, parce qu'ils tombent dans le fond du récipient 5 contenant la solution de l'agent fixateur.
L'action de l'agent ~ixateur, tel que le glu-tarald~hyde a deux e~ets :
1) les globules rouges trait~s par le gluta-rald~hyde décantent plus rapidement que les globules 10 rouges non trait~s;
2) les globules rouges liés de ~açoll spécifi-que 5ur la phase solide sont alors fix~s chimiquement par le glutaraldéhyde, de sorte que, la stabilit~ est augment~e.
Lorsque les globules rouges non liés sont é-liminés, la plaque est ret~urnée e~ ~vitant que les bul-les d'air p~nètrent dans les puits. Les puits, ayant re-çu un échan$illon n~gatif, sont vides. Les fonds des puits ayant reçu ltéchantillon positif sont recouverts 20 par un tapis de globules rouges dont la densit~ est fonction de la concentration de la substance à doser.
Le r~sultat final peut etre lu ~ l'oeil nu, avec un photombtre régl~ à 414 nm ou à l'aide d'une loupe binoculaire ou d'un microscope invers~.
Lorsqu'on utilise un support plat pour l'immo-bili~ation de la substance biologlque ~ mettre en ~vi-dence, par exemple une ~euille, on le ~ixe dans le ~ond d'un récipient avant l'additlon des ~rythrocytes et on opère comme ci-dessus.
Pour la mise en oeuvre du proc~dé de l'inven-tion, on met en oeuvre une suspension d'~rythrocytes dont la concentration n'a pas une importance critiqueO
Il suf~it dans la pratique de choisir une concentration capable de fournir l'~rythroadsorptioIl optimale. Grâce 35 ~ l'op~ration de retournement du support, qui constitue ~Z~3~7L.~1 12 .

une caractéristique essentielle du procéd~ de l'inven-tion, les érythrocytes éventuellement en excès ne gê-nent absolument pas la lecture, puisqu'ils sont ~limi-nés. En général, des concentrations de l'ordre de 0,5 %
5 sont convenables. On peut, cependant, sans inconvénient, utiliser des concentrations de 1 ou 2 %. On notera qu'-en dessous de 0,5 %, on n'est pas sur que l'érythroad-sorption soit optimale. Ceci constitue un avantage im-portant, car on n'a pas besoin d'étalonner de façon 10 précise la valeur des concentrations des suspensions d'érythrocytes.
Le procédé de l'invention permet d'étendre 1'-utilisation de la technique d'~rythroadsorption aux mé-thodes immuno-chimiques qui n~cessitent l'utilisation 15 d'un procédé de visualisation. Ainsi, les procédés d'au-t~radiographie, de coloration enzymatique, de fluores-cence peuvent être remplacés avantageusement par ce nou-veau procédé qui consiste à visualiser une substance en utilisant successivement un conjugué r~alisé en couplant 20 le ligand spécifique de la substance recherchée avec une lectine ou un anticorps anti-~lobules rouges, et une suspension de globules rouges.
La présente invention concerne également un co~ret pour la d~tection d'une substance biologi~ue, 25 ledit co~iret comprenant :
- des anticorps anti-substance biologique ~
doser couplés ~ un li~and susceptible de r~-agir avec des érythrocytes - du tampon PBS;
- une solution d'agent ~ixateur;
- un support - un support de r~f~rence Le support de r~férence mis en oeuvre dans le cof~ret selon l'invention est obtenu par le procédé de 35 détection de l'invention. Pour la r~alisation de ce sup-13 .

port de r~férence on immobilise une substance biologi-- que donnée avec le produit de couplage d'un ligand sp~-cifique et d'un ligand capable de réagir avec des éry-throcytes, on ajoute ensuite des érythrocytes de préfé-5 rence frais et on plonge l'ensemble dans une solution d'un agent de fixation, on retourne le support afin de permettre l'élimination des globules rouges n'ayant pas réagi et on obtient ainsi un support de référence, c'-est-à-dire un support sur lequel sont ~ixés des éryth-10 rocytes en une quantité correspondant à la substancebiologique donnée Pour illustrer mais sans aucunement limiter le perfectionnement selon l'invention, on donne les e-xemples ci-après :
15 EXE~PLE 1 : Détection qualitative d'IgG humaines adsor-b~es sur une feuille de nitrate de cellulose.
On a dépos~ 2/ul d'un tampon borate, 0,1 ~ pH
8,0 contenant des concentrations variables d'IgG humai-nes (de 100/ug/ml à l/ug/ml) sur une feuille de nitrate 20 de cellulose. Après évaporation (15 minut0s à tempéra-ture ambiante) et saturation avec de la g~latine, la feuille de nitrate de cellulose a été incub~e avec un conjugué réalisé en couplant des anticorps anti-IgG hu-maines avec des anticorps antiglobules rouges. Deux heu-25 res plus tard, la feuille a été lavée, attach~e physi-quement au fond d'un récipient. Le récipient a ensuite ét~ rempli avec une suspension (0,5 %) de globules rou-ges de mouton. Après une heure, les globules rouges ont ~té ~limin~s en renversant doucement le récipient dans 30 une solution pbysiologique tamponnée contenant 0~2 % de glutaraldéhyde. Quand tous les globules rouges ont été
~liminés~ on a retourn~ la feuille. De cette façon, il a été possible de voir un dépôt de globules rouges lors~
que la quantité d'IgG humaines fixées sur la feuille de 35 nitrate de cellulose était égale ou supérieure à 2 ng.

~P3~
14.

EXEMPLE 2 : D3sage d'IgE humaines Grâce ~ ce procédé d'élimination des érythro-cytes n'~yant pas réagi, on peut ~tablir des courbes d'étalonnage en utilisant des quantités données d'anti-S corps et d'antigènes~ telles que celles représentée surla figure annex~e, sur laquelle on a port~ en abscisses la concentration en IgE en Ul/ml de solutions connues d'IgE et en ordonnées le pourcentage d'érythroadsorp~
tion par rapport au plateau 100 % défini pour une con-10 centration en IgE de 100 UI/ml.
Pour établir cette courbe, on a procéd~ de lamanière suivante : les puits d'une plaque à fonds plats ont ~t~ remplis par 100/ul d'anticorps anti IgE (l/ug/
ml). La plaque a ~té incubée pendant 2 heures à 37~C et 15 une nuit à 4~C, puis lav~e avec du PBS contenant 0,1 %
de Tween 20. Les puits ont reçu alors 100/ul d'une dilu-tion du sérum de r~f~rence contenant une quantité connue d'IgE. La plaque a ensuite été incubée 4 heures à 37C
et 1 nuit à 4C. Après l'incubation, la plaque a été de 20 nouveau lavée et chaque puits à reçu 100/ul d'une solu-tion d'anticorps anti IgE couplés avec des anticorps anti-globules rouges de mouton. Après l'incubation (2 heures à 37C) et lavage de la plaque, les puits ont é-t~ remplis par 400/ul d'une suspension de globules rou-25 ges de mouton (0,5 %). Une heure plus tard, les globulesrouges non adsorh~s de ~açon sp~ci~ique ont été élimin~s selon le mode op~ratoire dé~crit dans l'exemple 1 et 1'-absorption de la lumière ~ 414 nm a été mesurée avec un photom~tre Titertek Multiskan MC. Les puits ayant re~u 30 la solution d'IgE ~ 100 UI/ml ont servi de réf~rence (100 % d'~rythroadso.rption) pour calculer le pourcenta-ge d'erythroadsorption.
EXEMPLE 3 :
Avec une bandelette de nitrate de cellulose préparée selon le proc~dé d~crit à l'exemple 1, on peut 3'~
15.

doser les IgG présentes dans un ~chantillon de s~rum.
L'intensit~ des taches d'érythrocytes ayant r~agi avec les anticorps anti IgG-lectine est comparée ~ celles pr~sentes sur la bandelette de r~férence et permet la 5 d~tection et le dosage des IgG pr~sentes dans ledit ~-chantillon.

Claims (13)

REVENDICATIONS

1.Procédé de dosage qualitatif et quantitatif d'une substance biologique immobilisée sur un support,caractérisé
en ce qu'il consiste:

1)à faire incuber la substance immobilisée sur un sup-port avec le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes;
2)à ajouter des érythrocytes;
3)à mettre l'ensemble en contact avec une solution d'un agent fixateur en séparant les érythrocytes non fixés sur ledit ligand, 4)à mesurer l'érythroadsorption.

2.Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séparation des érythrocytes non fixés se fait par re-tournement du support dans un bain d'agent fixateur.

3.Procédé selon l'une des revendications 1, carac-térisé en ce que la solution d'agent fixateur est une solu-tion tamponnée de glutaraldéhyde, à une concentration de 0,1 à 0,5 % en poids environ.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'on utilise un support plat comme support pour immobiliser la substance biologique à doser.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 carac-térisé en ce que l'on utilise un support plat comme support pour immobiliser la substance biologique à doser, et carac-térisé en ce que le support plat est une feuille ou une bande en nitrate de cellulose.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 carac-térisé en ce que l'on utilise un support plat comme support pour immobiliser la substance biologique à doser, et carac-térisé en ce que le support est fixé dans un récipient pour être saturé d'érythrocytes avant que l'ensemble soit introduit, avec retournement, dans le bain d'agent fixateur.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé
en ce que le support est une microplaque présentant des puits.

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé
en ce que le support est une microplaque présentant des puits, et caractérisé en ce qu'on remplit jusqu'à débordement les puits de la microplaque avec des érythrocytes, avant de recouvrir la plaque d'un film plastique souple, et de plonger la plaque ainsi revêtue dans une solution d'un agent fixateur puis, de retourner la plaque et enlever le film plastique, aprés quoi on laisse décanter les érythrocytes n'ayant pas réagi avant de mesurer l'érythroadsorption.

9,Procédé de dosage qualitatif ou quantitatif d'une substance biologique par érythroadsorption consistant à immobiliser sur un support une substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique à doser, faire incuber ladite substance immobilisée avec le milieu liquide contenant la substance biologique à doser, à faire incuber après lavage,le milieu réactionnel résultant avec le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes, à ajouter des érythrocytes et à déterminer l'érythroadsorption spécifique par hémolyse ou comptage,ledit procédé étant caractérisé en ce que,après avoir ajouté les érythrocytes,on met en contact avec une solution d'un agent de fixation en séparant les érythrocytes non fixés sur le ligant,avant la mesure de l'érythroadsorption.

10.Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que la séparation des érythrocytes non fixés se fait par retournement du support dans un bain d'agent fixateur.

11.Procédé selon l'une des revendications 9 caractérisé en ce que la solution d'agent fixateur est une solution tamponnée de glutaraldéhyde de concentration com-prise entre 0,1 et 0,5% en poids environ.

12.Procédé selon l'une des revendications 9 à 11 caractérisé en ce qu'on utilise une feuille ou une bande de nitrate de cellulose comme support.

13.Procédé selon l'une des revendications 9 à 11 caractérisé en ce qu'on utilise une microplaque à puits comme support.