FR2607257A1 - Procede de traitement biologique par ultrasons, notamment pour tests immuno-hematologiques - Google Patents

Abstract

UNE PLAQUETTE DE MICROTITRATION 21 EST IMMERGEE DANS UN LIQUIDE 29 CONTENU DANS UN RECIPIENT 20. UN GENERATEUR HAUTE FREQUENCE 23 EXCITE UN TRANSDUCTEUR 24, DONT LE RAYONNEMENT ULTRASONORE EST RENVOYE PAR UN REFLECTEUR MOBILE 25 SUR LES RANGEES DE CAPSULES 22-I QUE COMPORTE LA MICROPLAQUE 21. AVEC UNE FREQUENCE ULTRASONORE DE L'ORDRE DU MEGAHERTZ, ON ACCELERE CONSIDERABLEMENT LES EFFETS D'AGREGATION DES PARTICULES EN SUSPENSION PAR LIAISON ANTIGENE, ANTICORPS RECHERCHE DANS LES TESTS IMMUNOLOGIQUES.

Description

Procédé de traitement biologique tar ultrasons, notamment p=-r tests immuno-hématologiques.

I nvention concerne les traitements biologiques, et notammant les tests immuno-hématologies.

l'agglutination, technique de bas~ en immunologie, est un p@énomène complexe conduisant à - réunion en amas de cel iles telles que les globules rouges ou les bactéries ou e---ore de virus. On peut aussi utiliser des particules autres que vivantes, l'exemple le plus connu étant celui des microbilles de latex, ou des particules de charbon.

Ces particules sont en suspension dans un milieu liquide haologique, qui peut être défini comme comprenant de l'eau associée à un électrolyte tampon convenable (sérum physiolo g-;ue), et contenant en solution -es protéines.

.- test immunologique fait aussi intervenir des antigènes t-- sites antigéniques) et des anticorps. Les antigènes re-avent être les élements en suspension eux-mêmes, auquel c-s les anticorps sont présents en solution dans le milieu liquide. Inversement, les anticorps peuvent être portés par les particules en suspension, les antigènes étant alors e@ solution.

Matériellement, le liquide biologique à tester est contenu dans des récipients qui sont parfois entre des tubes à essais, ou, mieux, une plaque de microtitration, définissant un roseau bidimensionnel de capsules propres à recevoir chacune un échantillon.

La réponse au test dépend essentielleme=- de la répartition de la dersité optique existant dans chag@e capsule, au bout d'un temps plus ou moins long, selon la réaction. On sait faire une mesure automatique de cette iii=-:e. On sait de même autamatiser certaines des phases de préparation des tests immunologiques.

La phase ~'agglutination proprement dite. peut être conduite en recourant à des artifices de milieu, comme des enzymes, macromolécules, polycations, antiglobulames, ou autres.

Actuellennt, on peut soit laisser sédimenter les hématies (ou autres) sous l'effet de la gravita-=, soit centrifuger la que de micro-titration.

La techr@que de sédimentation libre demande un temps assez long, q l'on a pu réduire un peu en ce lisant des plaques à capsules en forme d'escalier (OLYMPUS
La centrfugation des plaquettes de micr@@itration accélère davantage la réaction ; cependant, l'effet de centrifugation provoque -ne sédimentation systématique es hématies - agglutinées cz non - au fond des capsules. e- peut alors recourir à différ-=tes techniques complémentaires. qui prennent du temps : -clinaison des plaques à température un peu plus élevée, -j bien remise en suspension des hématies libres, par exemple par agitations successives à vitesse lente.

Ces tec--ques, délicates à mettre en ouvre, ne sont guère automatisables.

De plus, elles sont de nature à introdu@@@ une perte de sensibil@@é, $notamment lorsqu'on centrifage un milieu qui est le siège d'une faible réaction, où les agglutinats sont petits.

Le temps de sédimentation et donc de formation ce l'image, limite donc les performances des appareils de test actuellement utilisés.

La présente invention vient améliorer la situation.

Un premier but de l'invention est de permettre d'accélérer et/ou d'amplifier l'agglutination.

Un autre but d=- 'invention est d'accélérer en =-tre la sédimentation, zDur éviter le recours à la centrifugation, autant que possible.

L'invention a ei@ore pour but de permettre la remise en suspension d'hématies (ou autres), par des moyes simples et automatisables, dans les cas où une telle opération est.

nécessaire.

L'invention fait intervenir à cet effet des ul-= sons, d'une manière partic@lière.

L'usage d'ultrasons en milieu vivant a déjà fa-- l'objet de plusieurs observations.

La formation amas de globules rouges, toutes -es demilongueurs d'onde, dans un embryon de poulet vi@int, a été constatée dans 'article : "A microscope viewing ultrasonic iradiation chamber", J.B. POND, B. WOODWARD et M@RY DYSON, phys. Med. Biol., 1971, Vol. 16, N 3, pp 521-514. Une simulation numérique de la formation des amas a été proposée ultérieurement : "Blood cell banding in ultrasc@@c standing wave fields : @ physical analysis" GAIL TER HA@@ et S.J.

WYARD, Ultraso@@d d in Med. & Biol., Vol. 4, pp 111, 123,
Pergamon Press, 1978.

Ces publications prennent en compte - la force dite pression de radiation", comme depuis long- temps, du moins lorsq'il s'agit de l'effet d'une onde acoustique stationnaire sur une sphère en milieu non visque-x - l'effet de viscosité I"viscous drag") - les forces interparticulaires, qui existent lorsque lu- sieurs corps voisins sont soumis au champ électrique s-a- tionnaire ; et - des effets secondes dus à la présence de bulles gaz, aux distorsions subies par l'onde acoustique (for-es d'Oosen, ou "Oosen-type forces"), ainsi qu'aux variations de la viscosité en fonctions de la température.

Plus récemment, l'Art-le "Interparticle forces on re blood cells in a standing w-=.e field" M.A.H. WEISER et R.E. APFEL,
Acustica 56 (2), pp l-'.-128, 1984, a proposé une analv-=e de la force intercelltlaire dans un champ d'ondes acotstiques stationnaires, et en a déduit la position d'équilibre e deux hématies pour une fréquence acoustique déterminée.

Cependant ces calculs ne sont valides que dans le cas e distances interpartic-aires élevées.

L'observation de POND, WOODWARD et DYSON, et les analyses qu'elle a suscitée, concernent des expérimentations i: vivo.

A côté de cela, une Observation in vitro a été rendue :-ubli- que : "Segregation an- sedimentation of red blood cells in ultrasonic standing waves", N. VASHON BAKER, Nature 239, oct(l3), 1972, pp 398-399.L'auteur constate que, dans des récipients de polystyrène contenant du sang complet c-- des cultures de celui-ci, la sédimentation naturelle des héma- ties est grandement accélérée, sous un champ acoustique de 3W/cm2 à 1MHz. Son également relevés d'une part l'in- fluence de la densité en globles rouges de la suspension, d'autre part le fait que la séimentation accélérée n'est observée que lorsque le champ acoustique se propage horizontalement (ségrégation selc des bandes de sédimentation verticales). N.V.BAKER en tire que la ségrégation n'est pas due à des forces de Bernc-.lli, comme suggéré par POND,
WOODWARD et DYSON, mais plutfr à des courants de convection provoqués par la variation périodique de la densité des suspensions cellulaires.

La présente invention a pour teint de départ des observations d'une autre nature.

Les particules en suspension ans un milieu liquide se chargent électriquement.

Les forces élémentaires qui e--trent en jeu sont - la répulsions électrostatig-es due à la double couche électrique ; et - l'attraction de type LONDCi - VAN DER WAALS.

Dans l'exemple du sang humai@, ces forces ont pour effet que les globules rouges s'ac wègent, en présence de pontages macromoléculaires, à la façon de "piles d'assiettes".

De son côté, l'agglutination wes hématies (ou érythrocytes) intervient lorsque la suspension permet une fixation d'anticorps sur des structures an--éniques.

I1 a maintenant été constaté rue, compte-tenu des propriétés électriques et physicochimig-es des globules rouges, les réactions d'agglutination érythrocytaire sont substantiellement améliorées sous l'effet des ultrasons.

L'invention s'applique tout ~'abord à un procédé de traitement biologique, dans leque on place dans un récipient un milieu liquide biologique contenant des particules en suspension, ce milieu et ces particules étant associées l'un à des anticorps, l'autre à des antigènes, de sorte qu'une réaction immunologique peut s'établir entre les anticorps et les antigènes, réaction dont le résultat est déterminé en fonction de l'agrégation des particules. Selon l'invention, on applique au milieu liquide un faisceau cohérent d'ultrasons, à une fréquence comprise entre 0,1 et 100 MHz, de préférence comprise entre 0,5 et 20 MHz, environ.

La densité de puissance du faisceau -'ultrasons peut aller de C, à 100 W/cm2, de préférence de 0,5 à 20 W/cm2, environ.

Pra~ quement, le récipient (tube à essais, ou mieux, plaque de nicrotitration) est mis extérieurement au contact d'un milieu de transfert d'ultrasons, en -rincipe d'un liquide tel que de l'eau.

Ava-ageusement, la direction du champ ultrasonore dans le récipient est sensiblement alignée sur la verticale de celw ci.

Plus restrictivement, le milieu lit de est de l'eau associée à un tampon de pH et contenant des protéines en solution, et les particules sont des ce: ales ou des microparticules propres à former substrat de réaction.

Dans une application particulière, De milieu liquide est une solution d'hématies à faible co=:entration.

Dans une autre explication, les particules sont des micro particules de latex.

Sel:- un aspect de l'invention, le faisceau d'ultrasons est appliqué de manière à établir ur régime sensiblement stationnaire dans une direction de 'espace, mais de fa çon non uniforme, ou non continue (dans l'espace et/ou dans le temps).

En d'autre termes, il doit s'agir d'un champ acoustique "non progressif, c'est-à-dire qui ne se propage pas indéfiniment. Quoique les modes propres en soiett très difficiles à défnir, le récipient va constituer une sorte de cavité résenante pour les ultrasons.

Quant à la cohérence du champ acoustique, ele peut être définie comme suit : le temps de cohérence ct champ acoustique doit être supérieur au temps d'aller-retour des ondes dans le récitent.

I1 est possible d'opérer par interruptions répétées du champ moustique.

endant l'application du champ, les hématies s'aggrègent en paquets, piégés dans les ventres de vibration, et qui sont le siège de la réaction d'agglutination. Lorsque ces paquets atteignent une certaine taille critique, ils tombent ou sédimentent, créant un culot au fon du récipient.

A ce moment, ''application du champ acoustique peut être interrompue.

Or, le culot emporte des hématies agglutinées (réaction pratiquement irréversible) en même temps que des hématies simplement agrégées (réaction sensiblement réversible).

Une autre fa:n d'opérer, particulièrement irréressante, consiste à wobuler légèrement la fréquence < champ acoustique.

De préférence, cette wobulation est conduite de manière à faire descendre lentement les ventres de vibration vers le fond du re=ipient. Elle peut aussi être déplacée en sens inverse, si :'on veut réaliser une remise et suspension des hématies, agglutinées ou non.

L'homme de l'art com-rendra qu'il faut donc choisir l'am- plitude et la vitesse de cette wobulation en fonction de la rapidité de la c des réactions d'agglutination - présence desquelles on se trouve.

Une autre constatation très importante a été faite : l'invention permet d'accélérer les réactions d'agglutiLs-ion, sans en altérer les résultats. Les réactifs et les modes opératoires utilisés jusqu'à présent peuvent donc être conservés.

I1 semble par contre que la sensibilité des tests st-t augmentée, en particul-er pour les réactions d'agglut--.=tion faibles.

Un autre aspect de l'invention concerne précisément te telles réactions faibles.

Les techniques actuelles utilisent la centrifugatie- pour accélérer la sédimettation. La mise en oeuvre de cette centrifugation est en elle-même délicate ; il faut non@mment un rayon de gyration important, pour que la centrifagation produise des effets homogènes sur tous les récipient (tubes ou capsules de microplaques).

Mais la centrifugation sédimente toutes les hématies. aggrégées ou agglutinées. Une remise en solution des hémsties aggrégées - opération elle aussi très délicate - est donc nécessaire.

L'invention permet aussi d'effectuer par ultrasons tette remise en solution.

Bien qu'on puisse utiliser à cet effet le même type de champ acoustique que précédemment, il semble actuellement tréfé- rable que le faisce~-= d'ultrasons soit focalisé, s le milieu liquide con--ou dans le récipient.

Ainsi, l'invention permet dans la plupart des cas d'éviter la centrifugation. Mais, lorsque celle-ci demeure nécessaire1 la remise en solution peut etre obtenue d'une manière simple par ultrasons, en évitant de briser les petits agrégats.

Certains procédés immuno-hématologiques, comme le test de
COOMBS (réaction amplifiée par antiglobulines) nécessitent un ou plusieurs lavages de la suspension d'hématies. Un lavage classique comprend les étapes suivantes : centrifugation, aspiration du surnageant, redistribution du liquice laveur, remise en suspensic=.

Des ultrasons de basse fré,-ence ont déjà été utilisés po- l'homogénéisation et la dispersion de suspensions. Mais l'effet obtenu est accompagné de cavitation, qui provoque la destruction (lyse) d'une partie des cellules.

I1 a été découvert qu'avec tn faisceau ultrasonore selon l'invention (typiquement, fréquence de 1 à 10 MHz), les globules rouges sont remises quasi-instantanément en suspension sans effet de lyse a la cavitation.

Ceci ouvre la voie à une attomatisation complète des tests nécessitant des lavages, comme le test de COOMBS, (réaction de COOMBS indirecte) dont cn connaît l'intérêt pour la déter- mination des incompatibilités Rhésus foeto-maternelles ou autres réactions immuno-hératologiques.

L'invention concerne égalent une installation de traitement biologique, qui comporte une cellule à ultrasons, pr pre à appliquer un faisceau cohérent d'ultrasons, de fréquence comprise entre 0,1 et 100 MHz, à au moins un récipient contenant un milieu liquide biologique avec des particules en suspension.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention app=-- raitront à l'examen de la rescription détaillée ci-après, et des dessins annexés, s lesquels - la figure 1 est un schéma fonctionnel rappelant les différentes phases d'un test d'immuno-bématologie ; - la figure 1A est un schéma fonctionnel semblable à la faire 1, pour le cas où la mise en oeuvre du test nécessite une centrifugation - la figure 2A est un schéma simplifié, en coupe, d'un premier dispositif expérimental pour la mise en oeuvre de l'in vettion - La figure 2B est un schéma simptCié, également en coupe, d'un second dispositif pour la mise en oeuvre de l'invention ;; - La figure 3 est un diagramme temporel montrant un signal wobulé en fonction du temps es figures 3A et 3B sont des diagrammes spatiaux montrant l'effet de la wobulation de la filtre 3 - la figure 4 est un schéma simplifié, en coupe, d'un autre dispositif pour la mise en oeuvre te l'invention - la figure 5 est un schéma simplifié, également en coupe, d'encore un autre dispositif expérimental pour la mise en oeuvre de l'invention ; et -a figure 6 est un schéma simplifié, en coupe, d'une va rente du dispositif expérimental e la figure 5.

Comme déjà relevé, l'invention pe- s'appliquer à différents tubes de suspensions biologiques, tans lesquelles les élé cette en suspension peuvent être les éléments vivants, tels que des globules rouges, des bact4=ies ou des virus, ou b-=n des particules inertes tels que des microbilles de latex ou de charbon. Sauf mention ontraire, la présente description détaillée concerne le cas où les éléments en suspensic- sont des globules rouges ou hématies.

Par ailleurs, les tests immunologiques peuvent être conduits avec pour récipients des tubes à essais. ~= supposera maintenant qu'il s'agit de plaquettes de micr@titration que l'on appellera plus brièvement "microplagpettes". Un modèle courant ce microplaques comporte 8 x 12, soit 96 récipients élémentaires, que l'on appelle aussi capsules.

Dans un test immuno-hématologique ordina-e, la première étape 11 figures 1 et 1A) consiste en le remplissage au automatique des microplaques, qui comprend - la distribution de l'échantillon dans traque capsule - la dilution de l'échantillon dans champ capsule, par addition d'un agent de dilution convenable, comme du sérum physiologique - la distribution du ou des réactifs en quantité contrôlée dans les tifférentes capsules.

Maintenant, un distributeur à microseri@@pe peut, en moins d'une miette, assurer la dilution et la partition des réactifs tans les 96 capsules de la micrx laque.

L'étape suivante 12 est l'incubation, d@@ant laquelle se produit c non la réaction d'agglutination.

Lorsque a réaction impliquée est une réation forte, soit par elle-ême, soit par le fait qu'on uzise des artifices de milieu (enzymes, macromolécules, polysations, antiglobulines, par exemple), on peut se contester de laisser sé dimenter simplement les hématies, sous @ effet de la gravi- tation, tomme illustré par l'étape 17 o a figure 1.

Cette technique dite de sédimentation ire demande un temps assez long, qui dépasse couramment la o@@i-heure. Ordinaire ment, la mesure quantitiative de l'agglutination se ait avec des microplaques dont le fond est en U ou V. avec un nouveau type de microplaques, dont les capsules 0= un fond en forme d'escalier, la société OLYMPUS a permis 3- réduire un peu le temps de sédimentation, qui descend à t minutes environ.

On procède ensuite à la lecture des résultats, et l'étape 18. S'il y a aggl-=ination, un culot de sédimentation est présent au fond de la capsule. Dans le cas contratre, celleci est recouverte 'une manière uniforme, L'acqu-s-tion des mesures peut ttnc être automatisée, puisqu'i s'agit a priori d'une mestre de densité optique à travers la capsule en différents pol=ts.

Ensuite, en général à l'aide d'un micro-ordinateur on procède à un traitement des mesures et à une présentation des résultats. I1 fat en effet tenir compte des cas t le résultat n'est pas air, ainsi que des conditions particu- lières propres à taque test.

La figure 1A concerne le cas d'une réaction d'ag-=tina- tion lente, ou faible. Après l'incubation, ou pelant celleci, on procéde habituellement à une centrifugation 13, qui accélère la réaction, en concentrant toutes les hématies, agglutinées ou ncr, au fond des capsules. Bien ertendu, des étapes supplémentaires sont nécessaires pour effectuer la lecture de l'-=-ge.

Une première façon= de procéder consiste à incliner les microplaques selon - angle d'environ 750 par rapport à l'horizontale, pendait un temps d'environ 5 minutes, -= in d'observer des différentes images qui permettent de quantifier l'agglutination. to procédé est délicat à mettre et oeuvre, surtout lorsque l'automatisation complète est désarée.

Une autre façon ce procéder consiste à effectuer s agitations successir-a des microplaques, à vitesse Lente, pour remettre en suspension les hématies libres, c'est-à-dire celles qui ont été sédimentées, mais ne sont pas agglutins.

Là encore, la manipulation est délicate, et on observe souvent une perte de sensibilité due à l'agitation, dans le cas où la réaction est faible, et où par conséquent les aggltti- nats sont petits. De plus, ce procédé est lui aussi diffiti- lement automatisable, car il nécessite une manipulation des microplaques.

Ensuite, les lectures de densité optique et le traitement des résultats peut s'effettuer selon des étapes 18 et 19 semblables à celles de la figure 1.

I1 est maintenant fait référence à la figure 2A. On y vc-t une microplaque 21, monté en partie supérieure d'un réc~- pient 20 empli d'un liquide 29 tel que de l'eau. Un génerateur haute fréquence 2 excite un transducteur ultras nore 24, qui applique un tramp acoustique vers un réflec- teur 25 positionné pour renvoyer ce champ vers la rangés de capsules 22i de la microplaque 21. Comme illustré par la flèche 26, le réflecteur 25 peut être déplacé, de fa çon à permettre l'insoni-cation de l'une quelconque des rangées de capsules 22-1 s 22-n que comporte la microplaque 21.

Une variante de ce dispositif est illustrée sur la figure 2B. On y voit un générateur haute fréquence 23 qui alimente une série de transducteurs 24-1 à 24-n, insonifiant cha une rangée 22-1 à 22-n des capsules de la microplaque 2
La microplaque peut être Incorporée dans la cellule à utra- sons ainsi constituée s- aucune modification.Son déplate- ment entre l'automate de remplissage et le lecteur d'images peut être assuré à l'aide d'un tapis roulant, contrôlé p=-- un programme prédétermive. Dans la cellule à ultrasons, le ou les transducteurs 24 et éventuellement le réf lecte 25 sont immergés dans le liquide 29, tandis que la micr- plaque 21 est maintenue à la surface du liquide. Le liqttte 29 assure la propagation des ondes ultrasonores dans les -apsules de la microplaque 21. L'interface liquide air, tant dans la microcapsule que potr le liquide 29, sert de réflecteur presque parfait pour établir un champ ultrasomore stationnaire.

Les figures 2A et 2B ont montré que le générateur d'ultrasons peut être constitué soit de couples (éléments piézo électriques/réflecteur) associés à un moteur pour assurer :'insonification de chaque cellule, soit d'une batterie t' éléments piézo-électriques qu- assure cette insonification d'une manière directe, et E-multanément, pour chaque -ellule.

ne focalisation et/ou une oriettation électronique du faiseau peuvent être réalisées, à partir d'une matrice de trans tuteurs.

ien qu'une fourchette de fréquance plus large puisse être rise en oeuvre, il est préféré ae la fréquence des ultrasons soit comprise entre 0,5 et 20 MHz, environ. Dans la plupart des cas, cette fréquence sera comprise entre 1 et 10 MHz. Le choix de la fréquence dépend du type de réaction, ainsi que de l'impédance acons use et de l'épaisseur de -a microplaque.

ta densité de puissance du faisceau d'ultrasons peut varier en de larges limites suivant les applications. Elle sera -e préférence, au niveau des tr-==sducteurs, de 0,5 à 20 watts/centimètre carré, le plus souvent d'environ 1 à 5 watts/centimère carré.

te générateur 23 va produire sclr un signal monochromatique, continu ou intermittent, soit = signal à fréquence wobulée.

ne excitation monochromatique permet une agglomération rapide des amas de particules, en deux bandes séparées chaune d'une demi-longueur d'onde. L'arrêt de l'émission acoustique provoque une sédimentation rapide par simple gravita tion, car la vitesse de sédimentation est d'autant plus grande que la taille des particules est plus importante.

On comprendra plus loin que l'excitation monochromatique intermittente est intéressante pour certaines applications.

La raison en est qu'elle permet d'obtenir des effets de remise et suspension d'hématies sédimentées mais non agglutinées, wai peuvent alors à nouveau réagir, et s'agglutiner, à nouveau d'une manière accélérée, compte tenu de l'application d'ultrasons.

Par ailiers, dans ce qui précède, le chatp ultrasonore appliqué aux capsules est vertical. Avec un champ vertical, il apparait préférable que l'insonification soit intermittente.

Si l'on pouvait utiliser un champ ultrastnore horizontal pour des tests à microplaques, alors l'insonification pourrait pîts aisément être rendue continue.

La figure 3 montre une variante très interessante de 1'in- vention. Cette variante fait usage d'une vobulation descendante de fréquence. Plus précisément, la fréquence d'excitation varie de f2 à fl, de façon symétrique autour d'une valeur centrale fO, et ce avec une pério-e de répétition,
Tr. Cette wobulation descendante de fréquence permet de déplacer les noeuds et les ventres du champ ultrasonore et par conséquent les amas d'hématies vers le fond des capsules.Cela est illustré schématiquement sur les figures 3A et 3-, où l'on voit que le dernier noeud, qui est en position A sur la figure 3A, descend en position B au fond de la capsule sur la figure 3B, lorsqu'c= passe du temps t0 au temps tO+Tr.

Ceci accélère de façon très notable la sédimentation spontanée dans la microplaque.

Il semble de plus qu'en choisissant con-enablement la fré quence de répétition Fr = l/Tr, on puisse réaliser une sédimentation différentielle, c'est-à-dire que des particules de tailles différentes vont se sédimenter à des vitesses différentes.

L'amplitude de wchulation, c'est-à-dire la différence f2-f13 dépend essentiellement du volume de suspension à insonifier, et de la distance entre la sonde oc transducteur ultrasonore 24 et l'interface liquide/air.

En pratique, il @ aura lieu de déterminer l'intetsité acoustique, la fréquence de travail, la fréquence de répétition et le temps d'i--onification pour chaque type ce réaction.

On sait que, courte tenu de la différence que pressentent les hématies agglutinées et libres quant à l'a-- sion sur une surface, une réaction positive est caractérsée par une image en vo~~e, tandis qu'une réaction négative est caractérisée par un anneau ou un point rond au ttnd des capsules.

Le lecteur d'images va donc analyser les intensités optiques centrales, et un réseau périphérique d'intersité optique, dans chape capsule. Le rapport de ces --tensités permet de classer la réaction en positive, négative ou douteuse.

La lecture peut aussi se faire uniquement par = système d'analyse d'image en réseau, intéressant toute la surface de la capsule. @ien entendu, les valeurs de seuil de ce rapport dépendez du type de réaction concernées et ces valeurs de seuils sont préalablement inscrites ns le programme d'analyse correspondant.

Les moyens de l'invention permettent une accél--ation substantielle de la réalisation des tests immunologrques, et surtout une automation complète de celle-ci.

Lorsqu'on sait que le distributeur actuel utilisé pour l'éta- pe 11 permet le remplissage des capsules en moins d'une minute, et que la lecture d'image automatique prend égale- ment très peu de temps, il est très intéressant d'utiliser les moyens de l'inventicn, qui abaissent considérablernett le temps intermédiaire nécessaire pour que la lecture ptis- se se faire.

On donnera ci-après des exemples de réactions conduites selon l'invention.

EXEMPLE 1 (TABLEAU 1)
Cet exemple intéresse - test de groupage sanguin ABO.

Les antigènes sont portés par des hématies d'un donneur de groupe Al. La dilution s'effectue à 1 % dans du sérum physiologique (NaCl) à 3 O/oo.

L'anticorps est un sérum de test anti-A, tel que fournt par le Centre National te Transfusion Sanguine.

Les résultats sont montrés dans le Tableau 1 annexé, dt---s lequel
V désigne la tension d'excitation des transducteurs et volts, f désigne la fréquence centrale d'excitation en MHz,
T1 indique la durée d'itsonification, en secondes,
T2 indique la durée de sédimentation, en secondes et/ct minutes, suivant le cas.

Un échantillon de contrôle a été préparé suivant les me-no- des de la technique antérieure. Le temps de sédimentatttn était de 30 minutes. Les résultats ont été fortement ptsi- tifs ou positifs jusqu^2 la dilution 1/128, douteux po la dilution 1/256, et négatifs pour les autres dilutions plus faibles.

Deux expériences ont été conduites avec insonification, la durée de sédimentation étant de 12 minutes dans le premier cas, et de 1 minute 30 secondes dans le second. Les résultats sont les mêmes pour ces deux expérimentations, puisque ces résultats sont fortement positifs jusqu'à la dilution 1/256, douteux pour 1/512, et négatifs pour les dilutions plus faibles.

On observe tout d'abord que la durée de sédimentation peut être rendue très faible, puisc;'il n'y a aucune différence après l'insonification entre la sédimentation de 12 minutes et celle de 1'30".

On observe aussi que les résultats obtenus avec insonification sont tout à fait cohérents avec ceux que l'on obtenait par les moyens de la technique antérieure.

On observe enfin que l'application d'ultrasons confère à la méthode une meilleure sensi1ité, puisque l'échantillon douteux à la dilution 1/2E devient maintenant positif, le doute ne subsistant plus :'à la dilution 1/512.

EXEMPLE 2 (TABLEAU 2)
Cet exemple concerne un test relatif à l'hépatite B, dit "recherche AG HBS".

On recherche l'antigène HBS dates le sérum de trois sujets, dénotés respectivement Tra, Na, Dix.

Les anticorps sont portés par des hématies sensibilisées, ainsi que des anticorps de contrôlez disponibles dans les kits dits Hématest VKO1, vend par la Société américaine
Wellcome.

Les paramètres de l'application d'ultrasons sont définis comme précédemment.

Suivant la méthode habituelle dans ce genre de test, chaque échantillon est soumis à l'anticorps de test, puis au réactif de contrôle, et ce d'abord sans ultrasons, ensuite avec ultrasons, comme indiqué dans le Tableau 2.

Pour l'antigène Tra, on observe une réponse négative dans tous es cas, avec ou sans ultrasons.

Pour ~'antigène Nal, la réponse est positive pour le test et nértive pour le contrôle, avec un temps de sédimentation te 40 minutes.

Le tableau 3 annexé montre que, après 'application d'ultrasons 5 3,5 MHz pendant 15 secondes, on peut obtenir le même résultat au bout d'un temps de 2'30- seulement.

En ce citai concerne le troisième échantillon, la méthode classique donnait un résultat positif -usqu'à la dilution 1/12 , douteux pour 1/256, et négatif pour 1/512.

Toujctrs après application d'ultrasons à 3,5 MHz pendant 15 secondes et au bout d'un temps de sédimentation de 2,5 minutes seulement (au lieu de 40 minutes), l'application de 11--nvention permet d'obtenir exactement le même résultat.

On cc--Yoit immédiatement les avantages pratiques considérables e l'on peut tirer d'une telle rapidité, combinés avec a possibilité d'automatiser co=Iètement le test.

EXEMPLE 3 (TABLEAU 3)
Cet temple concerne le phénotypage dans les groupes Rhésus
RH, en sera décrit en référence au tableau 3.

L'ar-:gène est constitué des hématies d'un donneur référen- cé D cc EE. Ces hématies sont diluées en suspension à 1 % dans du sérum physiologique NaCl à 9 O/oc.

Les anticorps sont les tests sérums Anti #, Anti E et Anti
C, vendus par la Société Ortho Diagnostic Systems.

Le tableau 3 montre que l'application d'ultrasons à la fréquence de 3,5 MHz pendant 20 secondes permet la lecture au bout de 2 -nutes, avec des résultats conformes au phénotype du donneur.

Comparativement, cette lecture aurait nécessité 20 minutes, avec les moyens de la technique antérieure.

De par sa gratte rapidité, le procédé selon l'invention permet dans beaucoup des cas d'éviter la phase de centrifugation, et les complications qui en résultert,
Par ailleurs, i1 existe des réactions, dont les tests dits à réaction de COOMBS indirecte, qui nécessitez un ou plusieurs lavages de la suspension d'hématies, le lavage classique compret=-t impérativement : la centif@ation, 1'as- piration du surnageant, la redistribution du liquide laveur et la remise en suspension.

Lorsque le récipient de test est une microplae, un tel lavage demande une manipulation délicate de cette microplaque, aux étapes de centrifugation et d'agitation. Cela empêche l'auto=tisation du test.

Comme déjà mentionné, on a proposé d'homogénétser et de disperser des suspensions par ultrasons. Mais cette solution n'est pas utilisables dans la plupart des tests biologiques, car l'eff et d'homogénéisation et de dispersion est lié à la cavitation créée par des ultrasons te basse fréquence, ce q provoque la destruction d'une partie des cellules.

La présente invention propose d'opérer différemment.

Selon l'invention, les capsules de la microplaque so-- insonifiées avec un faisceau ultrasonore de fréquence relati- vement haute, typiquement 1 à 10 MHz. I1 a été observe que, dans ces conditions, l'onde ultrasonore ne provoque plus de cavitation, donc pas d'hémolyse des cellules. A co=i- tion de positionner correctement le faisceau ultrason-=re, de manière à créer un tourbillon dans les capsules, o observe une remise en suspension quasi-instantanée des lobu- les rouges. Contrairement aux méthodes d'agitation de La technique antérieure, ce procédé est très rapide, et acilement automatisable.

Ceci peut être mis e. oeuvre à l'aide de dispositifs aspéri- mentaux des figures 2 et 2B.

Cependant, il sera scient préférable d'utiliser un faisceau ultrasonores focalisé, comme on le verra maintenant.

Le réflecteur 25 est maintenant sur la figure 4 un réflecteur concave 25C, qui permet une focalisation du faisceau -'traso- nore sur une rangée de capsules, de telle manière que le faisceau soit convergent à l'intérieur de la capsule.

Comme précédemment, c- peut insonifier les différente capsules en déplaçant le réflecteur 25-C suivant la flèche 26.

Une variante consiste aussi à prévoir une batterie de ~dans ducteurs (analogue à telle de la figure 2B), mais agettés soit individuellement, soit en combinaison les uns a les autres, pour produire en faisceau convergent ou wobulé au niveau de chacune tes rangées de capsules.

Bien entendu, au lie de déplacer le réflecteur 25 (figure 2A) ou 25-C (figure 4 , on pourra préférer déplacer la plaquette 21 elle-même, remarque étant faite que le dispositif comprendra le plus souvent un tapis roulant pour amener cette plaquette au niveau de la cellule à ultrasons.

Il a été observé plus haut que l'invention peut être mise en oeuvre soit avec un seul transducteur ultrasonore associé à un réflecteur mobile, scit avec un réseau de transducteurs ultrasonores, dont chacun est propre à exciter par exemple l'une des capsules de la microplaque.

On a indiqué aussi l'intérêt 'une wobulation de fréquence du signal ultrasonore, qui permet de produire un champ ultrasonore stationnaire cohérent, mais lentement mobile.

On peut aussi obtenir un tel champ ultrasonore stationnaire cohérent et lentement mobile et utilisant deux transducteurs (ou plus), auxquels on fait émettre des signaux qui présentent entre eux un décalage de phase variable avec le temps.

Ceci peut conduire à prévoir plusieurs transducteurs pour chaque capsule.

La fréquence de répétition (ce la wobulation, ou bien les décalages de phases variables avec le temps) est avantageusement choisie de telle faton qu'un nouveau cycle de variations commence lorsque les particules qui étaient situées au premier noeud correrasndant à la fréquence de départ de la wobulation sont parvenues au premier ventre correspondant à la fréquence de in de la wobulation, comme cela est visible d'après les Figures 3A et 3B.

Ainsi, l'invention permet l'emagglutination automatisée et accélérée en plaques de ritrotitration, pour les tests suivants - groupage ABO et rhésus, - détermination des phénotype, - recherche des anticorps ir--guliers, - test d'antigène HB (hépatite B) d'anticorps syphilis et antitetanique, ou autres anticorps courants, - réactions d'hémagglutinations passives.

L'invention permet aussi de mettre et oeuvre les tests du genre Coombs, sans aucune centrifugation ni agitation mécanique.

Par ailleurs, une remise en suspension peut aisément être réalisée, en produisant des faisceau i'ultrasons sphériques, 'est-à-dire convergents, dires vers la paroi des capsules. On obtient ainsi un tourbillon dans les capsules, et une remise en suspension quasi-ins-antanée des particules libres, c'est-à-dire non agglutinées. L'intérêt est qu'en opérant en haute fréquence, l'homogénfisation et la remise en suspension se font sans cavitation ni destruction des celîtes.

Cela est applicable à un procédé de lavage à ultrasons, dans Les plaques de microtitration ot en tubes à essais.

Ce la age est combiné à la sédimentatton et à la remise en suspension par ultrasons.

L'automate utile à cet effet consiste en un distributeur, unie mité de lavage à ultrasons, et = aspirateur du sur nageant.

On atra observé aussi que l'inventiot permet la sédimentation accélérée de particules de latex ou autres particules supports utilisables en réaction d'agglutination artificielle, ou bien radio-immunoîogi=e, ou bien pour des réactions immuno-enzymatiques.

I1 est maintenant fait référence aui ligures 5 et 6, pour la description de variantes de l'invention. Le récipient 30 est ici constitué d'une cuve, possédant un orifice d'entrée Dl en partie basse, à gauche, p@@@ recevoir par exemple du sang. Cette cuve possède deux orifices de sortie en partie droite, et haut une sortie 32H pour le plasma, et en bas une sortie 32L pour le culot de sédimentation.

Le long de la paroi de gauche de la cuve 30 est prévu un transducteur -altrasonore 34 excité par un générateur 33.

La paroi oppcsé 35 de la cuve 30 est agencée en réflecteur.

Un champ stationnaire cohérent est ainsi développé à l'intérieur de la cuve 30. I1 permet la sédimentation au niveau des ventres @TV du champ ultrasonore. Il en résulte un mouvement de convention, qui se traduit par une remontée aux emplacements des noeuds 37N du champ ultrasopore.

Compte tenu te l'atténuation des ultrasons -n-=s les suspensions, ici De sang, la largeur optimale de la cellule de sédimentation 30 dépend de la fréquence ultn-sonore utilisée.

A la fréquente de 3MHz, à laquelle la force te radiation des uîtrascts permet d'agglomérer les hématies en quelques secondes, cette largeur est de 0,5 centimètre pour le sang total.

Le montage te la figure 5 permet, pour une suspension concentrée d'ettectuer une séparation préliminatre ou pré-séparation.

-La séparait finale peut ensuite intervenir. après cette pré-séparation, ou bien directement si la suspension initiale était peu concentrée.

Le montage ce la figure 6 permet d'effectuer cette séparation finale.

Dans ce mottage, le récipient 40 présente et partie gauche une entrée 41 pour le sang, en partie droite des sorties 42H en haut pour le plasma et 42L en bas p: le culot.

Un générateur 43 excite un transducteur 44 mis au contact de la surface supérieure du liquide présent dans le réci- pient 40. A l'opposé, le fond du récipient 40 reçoit en 45 soit un réflecteur, soit un autre transducteur ul=a- sonore, comme on le verra ci-après.

L'organe 45 étant un pur réflecteur, le signal produit par le générateur 43 est wobulé dans les conditions indiquées plus haut. Les amas agglomérés sont alors déplacés vers le bas du fait de cette wobulation de fréquence, ou ien grâce à une excitation intermittente du générateur, lequel cas il y a alternante des phases d'agglomération et te sédimentation.

Si l'organe 45 est = autre transducteur, celui-ci est alors excité avec un signa de même fréquence que le transttcteur 44, mais avec un déasage variable de façon linéaire ou quasi-linéaire avec De temps.

Ce déphasage crée ut déplacement quasi-continu des noeuds et des ventres d'interférences, et entraine un déplatement des hématies vers le bas, effet renforcé par l'accélération de la pesanteur, c'est-à-dire la gravitation.

Un montage analogue à celui de la figure 6, mais dans lequel les deux transductetrs sont montés horizontalement, te part et d'autre d'une membrane, permet d'effectuer la séparation finale avec cette membrane de filtration.

L'intérêt de l'usage d'ultrasons est qu'en ce cas la couche de polarisation habttueîlement rencontrée sur la membrane peut être considératlement réduite ou même détruite par la force de radiation ultrasonore. Cela dépend de l'équi- libre entre les fortes hydrauliques, les forces viseuses et les forces liées à la pression de radiation ultrasohore.

En pareil cas, le croix de la fréquence ultrasonore dépend de la taille des particules à filtrer. L'intensité apousti- que nécessaire est fonction des caractéristiques de la suspension et de la pression transmembranaire. De préférence, les deux transducteurs utilisés travaillent à la même fréquence, mais avec un déphasage quasi-linéaire dans le temps et un taux de répétition choisi comme indiqué plus haut. TABLEAU 1

<SEP> ULTRASONS <SEP> DILUTION
<tb> <SEP> V <SEP> f <SEP> T1 <SEP> T2 <SEP> 1/4 <SEP> 1/8 <SEP> 1/16 <SEP> 1/32 <SEP> 1/64 <SEP> 1/128 <SEP> 1/256 <SEP> 1/512 <SEP> 1/1024 <SEP> 1/2048
<tb> Contrôle <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP>
Ultrasons <SEP> 40 <SEP> 3.5 <SEP> 10m <SEP> 12' <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP>
Ultrasons <SEP> 40 <SEP> 3.5 <SEP> 20m <SEP> 1,30" <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> - <SEP> TABLEAU 2

<SEP> REACTIFS <SEP> ULTRASONS <SEP> DILUTION
<tb> <SEP> V <SEP> f <SEP> T1 <SEP> T2 <SEP> 1/4 <SEP> 1/8 <SEP> 1/16 <SEP> 1/32 <SEP> 1/64 <SEP> 1/128 <SEP> 1/256 <SEP> 1/512
<tb> Tra. <SEP> + <SEP> Test <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 40' <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Tra. <SEP> + <SEP> Contrôle <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 40' <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Tra. <SEP> + <SEP> Test <SEP> 40 <SEP> 3,5 <SEP> 15" <SEP> 2'30" <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Tra <SEP> + <SEP> Contrôle <SEP> 40 <SEP> 3,5 <SEP> 15" <SEP> 2'30" <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Nal. <SEP> + <SEP> Test <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 40' <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Nal.<SEP> + <SEP> Contrôle <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 40' <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Nal <SEP> + <SEP> Test <SEP> 40 <SEP> 3,5 <SEP> 15" <SEP> 2,30" <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Nal <SEP> @ <SEP> Contrôle <SEP> 40 <SEP> @,5 <SEP> 15" <SEP> 2,@0"
<tb> Dix <SEP> + <SEP> test <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 40' <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> +
<tb> Dix.<SEP> + <SEP> Contrôle <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 40' <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Dix <SEP> + <SEP> Test <SEP> 40 <SEP> 3,5 <SEP> 15" <SEP> 2,30" <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> # <SEP> +
<tb> Dix <SEP> + <SEP> Contrôle <SEP> 40 <SEP> 3,5 <SEP> 15" <SEP> 2,30" <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> TABLEAU 3

<SEP> REACTIFS <SEP> ULTRASONS
<tb> <SEP> V <SEP> f <SEP> T1 <SEP> T2 <SEP> 1/2 <SEP> 1/3 <SEP> 1/4 <SEP> 1/6 <SEP> 1/8 <SEP> 1/12 <SEP> 1/16 <SEP> 1/24
<tb> Anti <SEP> - <SEP> C <SEP> 40 <SEP> 3,5 <SEP> 20" <SEP> 2' <SEP> + <SEP> # <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Anti <SEP> K <SEP> 40 <SEP> 1,5 <SEP> 20" <SEP> 2' <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Anti- <SEP> C <SEP> 40 <SEP> 3,5 <SEP> 20" <SEP> 2' <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>

Claims (8)

Revendications.

1. Procédé de traitement biologique dans lequel on place dans un récipient (21) un milieu liquide biologique (22) contenant des particules en suspension, ce milieu et ces particules étant associés l'un à des anticorps, l'autre à des antigènes, de sorte qu'une réaction immunologique peut s'établir entre les anticorps et les antigènes, réaction dont le résultat est déterminé en fonction de l'agré- gation des particules, caractérisé en ce qu'on applique au milieu liquide (22) un faisceau cohérent d'ultrasons (23, 24, 25), à une fréquence comprise entre 0,1 et 100

MHz.

2. Procédé selon la revetication 1, caractérisé en ce cu- la fréquence des ultrasons est comprise entre 0,5 et 20

MHz, environ.

3. Procédé selon l'une ces revendications 1 et 2, caract- risé en ce que la densité de puissance du faisceau d'ul--- sons est de 0,1 100 W/cit2, de préférence 0,5 à 20 W/cm2, environ.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le récipient (21) est mis extérieurement au contact d'un milieu de transfert d'ultrasons, en part culièrement d'un liquide 29) tel que de l'eau.

5. Procédé selon la revettication 4, caractérisé en ce qte (21) est une plaque de ri:rotitration.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la direction du champ ultrasonore dans le récipient est sensiblemet alignée sur la verticale de ce- lui-ci, 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu liquide (22) est de l'eau associe à un tampon de pH et contenant des protéines en solution, et en ce que les particules sont des cellules ou des microparticules propres à former substrat de réaction.

@. Procédé selon la revendicaticn 7, caractérisé en ce que le milieu liquide (22) est une solution d'hématies à faible concentration.

3. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que

Des particules sont des microparticules de latex.

10. Procédé selon l'une des revetdications 7 à 9, caractérisé en ce que le faisceau d'ultrasons, est appliqué de wanière à établir un régime sen=-blement stationnaire dans tne direction de l'espace.

il. Procédé selon l'une des reetdications 1 à 6, caractérisé en ce que le faisceau d'ultrasons est focalisé sur

De milieu liquide, ce qui permet la remise en solution des particules sans effet de lyse lié à la cavitation.

12. Installation de traitement biologique, caractérisé en e qu'elle comporte une cellule à ultrasons, propre à apliqueur un faisceau cohérent d'ultrasons, de fréquence comprise entre 0,1 et 100 MHz, à at moins un récipient contetant un milieu liquide biologic-:e avec des particules en suspension.