FR2601456A1 - Procede de detection a haute sensibilite d'anticorps indiquant une exposition au sida, necessaires et accessoires pour sa mise en oeuvre - Google Patents

Abstract

DES ANTICORPS AYANT UNE SPECIFICITE POUR DES SITES ANTIGENIQUES SUR DES VIRUS ASSOCIES AU SIDA SONT DETECTES DANS UN ECHANTILLON DE FLUIDE CORPOREL EN FAISANT INCUBER L'ECHANTILLON AVEC DES ANTIGENES PROVENANT D'UN VIRUS DU SIDA IMMOBILISES SUR UN SUPPORT SOLIDE, EN ASSOCIANT A CHACUN DES COMPLEXES ANTIGENE-ANTICORPS UN SYSTEME PRODUISANT UN SIGNAL, ET EN DETERMINANT LE NIVEAU DU SIGNAL PROVENANT DES COMPLEXES ASSOCIES OBTENUS. UN NECESSAIRE COMPRENANT UNE SERIE DE BANDES SOLIDES SUR LESQUELLES SONT IMMOBILISEES LES DIVERSES PROTEINES DANS UN ELECTROPHORETOGRAMME, PLUS DES SOLUTIONS DE CONJUGUE, DU SUBSTRAT ET DES AGENTS DE LAVAGEDILUTION EST EGALEMENT DECRIT, DE MEME QU'UN PLATEAU 11 COMPORTANT PLUSIEURS CUVES 12 POUR EFFECTUER UNE SERIE DE DOSAGES SIMULTANEMENT. DES SYSTEMES 13, 14 PRESENTS DANS CHAQUE CUVE PERMETTENT L'INSERTION D'UN TUBE D'ASPIRATION POUR ELIMINER LE LIQUIDE TOUT EN EVITANT LE CONTACT DU TUBE AVEC LES SURFACES DES BANDES.

Description

PROCEDE DE DETECTION A HAUTE SENSIBILITE D'ANTICORPS INDIOUANT UNE

EXPOSITION AU SIDA, NECESSAIRES ET

ACCESSOIRES POUR SA MISE EN OEUVRE.

La présente invention concerne la détection

d'anticorps dirigés contre les divers virus reconnus comme donnant naissance au Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise (SIDA). En particulier, l'invention concerne l'analyse de fluides corporels pour y rechercher ces an10 ticorps comme indication d'une exposition au SIDA.

Des exemples de virus reconnus comme associés au SIDA comprennent le virus III de la leucémie des lymphocytes T humains (HTLV-III), le virus associé à la lymphadénopathie (LAV) et le virus apparenté au syndrome 15 d'immunodéficience acquise (ARV). Des essais pour rechercher la présence d'anticorps dirigés contre ces virus ont été mis au point à la suite d'études séroépidémiologiques qui indiquent que lorsqu'il existe des taux détectables de ces anticorps, un virus 20 infectieux peut également exister. En tout cas, la présence des anticorps est- considérée comme une indication d'une exposition antérieure au virus ou d'une infection par celui-ci, et suggère la possibilité de la

présence permanente du virus ou du génome viral.

Les analyses communément utilisées pour la détection de l'anticorps sont affligées de pourcentages élevés de résultats faussement positifs et faussement négatifs, outre qu'ils sont fastidieux et lents à exécuter. Une analyse présentant une fiabilité et une 30 sensibilité améliorées est nécessaire, de même qu'une

analyse qui puisse être achevée en un temps plus court.

Les analyses concernées par la présente invention sont celles effectuées en mettant en contact un échantillon de fluide corporel (de préférence du 35 sérum ou du plasma) avec des antigènes d'un virus du SIDA pour provoquer l'association des anticorps anti-SIDA présents dans le fluide avec les antigènes et la formation de complexes immunologiques. Chaque complexe est alors associé avec un système produisant un signal, et le niveau du signal provenant des systèmes 5 associés est mesuré en tant qu'indication de la présence des anticorps dans l'échantillon. Le virus est généralement lysé et séparé électrophorétiquement en

fractions avant l'analyse.

Conformément à la présente invention, un néces10 saire d'analyse utile pour des essais multiples a été mis au point. Le nécessaire contient une série de supports en phase solide, sur lesquels les antigènes viraux sont déjà adsorbés avant l'emballage. Les antigènes adsorbés sont de préférence des taches de type "Western 15 blots" d'éléctrophorétogrammes du virus lysé. Le nécessaire contient en outre une solution d'un conjugué formé en associant un anticorps anti-Ig humaine avec un système produisant un signal. Le système produisant un signal est de préférence un système à deux constituants, 20 tels qu'une enzyme et un substrat, un des constituants (l'enzyme) faisant partie du conjugué et le second constituant (le substrat) étant dans une solution séparée. Les Western blots peuvent commodément être préparés sous la forme d'une série de bandes identiques 25 découpées dans une tache rectangulaire unique dans la direction perpendiculaire aux bandes. La tache utilisée dans une telle préparation peut résulter du transfert à partir d'un électrophorétogramme unique ayant une dimension transversale allongée, et consistant ainsi en 30 une série de longues bandes parallèles. Des nécessaires préférés contiennent également des diagrammes de comparaison, ou des reproductions de ceux-ci, tels que des photographies. Ces diagrammes sont les mêmes supports avec des diagrammes d'adsorption des antigènes 35 identiques, après incubation avec des échantillons positifs et négatifs et à développement approprié avec le

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même système producteur de signal. Ceci permet à l'utilisateur du nécessaire de comparer les échantillons d'essai analysés par l'utilisateur avec des échantillons connus déjà analysés et interpréter ainsi les résultats des essais d'une manière uniforme. Selon un autre aspect de l'invention, il a été trouvé qu'un système producteur de signal mettant en jeu une combinaison de phosphatase alcaline et d'un substrat constitué de chlorure de nitrobleu tétrazolium et de 10 phosphate de 5bromo-4-chloro-3-indolyle (NBT/BCIP) est doué d'une sensibilité inhabituelle lorsqu'il est utilisé conjointement avec un Western blot dans une analyse relative aux anticorps du SIDA. Dans des modes de réalisation préférés, la phosphatase alcaline est conjuguée 15 avec de anti-Ig humaine de chèvre ou de lapin qui est capable de se lier avec l'anticorps dont on cherche à détecter la présence. L'analyse peut être effectuée en préparant un Western blot d'un électrophorétogramme du virus lysé, le fond étant bloqué par des protéines du 20 lait et un détergent. La tache est ensuite mise à incuber d'abord avec un échantillon du fluide d'essai (de préférence du sérum), puis avec une solution du conjugué et enfin avec une solution du substrat

NBT/BCIP.

Un autre aspect de l'invention réside dans un plateau multi-cuvettes pour maintenir les bandes de Western blot dont il a été question ci-dessus, une dans chaque cuvette, complètement immergée dans les liquides d'analyse. Des systèmes présents dans chaque cuvette 30 permettent une élimination complète des liquides par aspiration sans contact entre les bandes, ni aucune matière externe (et potentiellement contaminante). Dans des modes de réalisation préférés, le plateau est en outre équipé d'une doublure démontable qui s'adapte à frotte35 ments doux sur le plateau et présente des protubérances s'étendant dans chacune des cuvettes. Le but de la doublure est de maintenir une bande dans chaque cuvette en vue de l'expédition. La doublure est retirée du plateau avant l'exécution des analyses. Un couvercle s'adaptant 5 à frottements doux, dépourvu des protubérances qui s'étendent dans les cuvettes, est utilisé au cours de

l'analyse dans les stades d'incubation du procédé.

La figure 1 est une vue en perspective d'un plateau multi-réceptacle conçu pour permettre l'exécution 10 simultanée d'un certain nombre d'analyses conformément &

la présente invention.

La figure 2 est une vue en perspective d'une

doublure d'expédition pour le plateau de la figure 1.

La figure 3 est une vue en perspective d'un cou15 vercle pour le plateau de la figure 1, destiné à être

utilisé au cours de l'exécution d'une analyse.

Les virus du SIDA utilisables pour préparer les matières d'analyse utilisées dans la présente invention sont mis à la disposition du public par diverses sour20 ces. On peut par exemple obtenir le HTLV-III auprès de

Organon Teknika Corporation, Bionetics Laboratory Products Div., Charleston, Caroline du Sud; Prototech Incorporated, St. Paul, Minnesota; ou de Ortho Pharmaceutical Corporation, Raritan, New Jersey. On peut aussi 25 obtenir le LAV auprès de Genetic Systems, Seattle, Washington.

On peut encore utiliser un isolat différent provenant d'un patient atteint du SIDA gui a été adapté & la survie en culture de tissus et mis en production. On 30 préfère que le virus soit utilisé sous forme lysée. Ceci peut être réalisé par des procédés classiques, tels que par exemple l'utilisation de SDS (dodécylsulfate de

sodium) dans une solution tampon.

Le support en phase solide peut être n'importe 35 quelle matière en phase solide inerte capable d'immobiliser les protéines virales. Des supports préférés sont des membranes absorbantes telles que par exemple la nitrocellulose, le papier aminobenzyloxyméthyle (ABM), le papier traité par le 2-aminophénylthioéther (APT), le nylon, le nylon modifié par une charge, le papier diazo5 benzyloxyméthyle (DBM), le papier traité par le 2-diazophénylthioéther (DPT), et la cellulose diéthylaminoéthylée (DEAE). La nitrocellulose est particulièrement préférée. Les protéines virales sont séparées en régions 10 ou bandes séparées, disposées spatiallement suivant une disposition choisie à l'avance pour l'immobilisation sur le support. La séparation est réalisée commodément par fractionnement électrophorétique des protéines dans un gel en plaque tel que l'agarose ou le polyacrylamide, le 15 polyacrylamide étant préféré. La disposition spatiale

est ainsi celle de l'électrophorétogramme obtenu. L'immobilisation des bandes sur le support peut être réalisée par transfert direct à partir du gel. Ceci peut être effectué par transfert par diffusion (Southern blotting) 20 ou par transfert électrophorétique (Western blotting).

Ce dernier est préféré. L'immobilisation est réalisée par adsorption superficielle par contact, de préférence

sans agent de liaison intermédiaire.

Pour améliorer l'uniformité d'un essai au sui25 vant et pour réduire au minimum les résultats d'essai faussement positifs, on préfère qu'il y ait des concentrations approximativement égales de chaque protéine virale dans chaque tache isolée. Il est rare que les virus eux-mêmes fournissent ces niveaux de concentration, et 30 il est par conséquent souhaitable que certaines bandes soient diminuées ou augmentées au cours du processus de séparation des bandes. Ceci peut s'effectuer en utilisant l'HPLC (chromatographie liquide haute performance) ou la chromatographie d'affinité pour concentrer ou 35 supprimer des bandes appropriées. Si, par exemple, un échantillon de virus contient une quantité excessive de

protéine p24, on peut faire passer l'échantillon à travers une colonne de lectine qui retiendra toutes les protéines à l'exception de la p24. Les protéines liées sont ensuite éluées sélectivement, et la p24 est 5 renvoyée au mélange dans une proportion appropriée. Un autre exemple est celui d'échantillons de virus déficients en p41 qui peuvent être complétés avec de la p41 pure obtenue par HPLC à partir d'un autre virus ou d'une autre source de la protéine à une concentration 10 choisie.

Un agent de blocage est généralement inclus pour empêcher une liaison non spécifique dès que l'immobilisation des protéines virales s'est produite. Les protéines du lait et des détergents sont des agents de blocage 15 particulièrement efficaces, généralement appliqués en

solution aqueuse avec un agent antimousse. Une concentration typique des protéines du lait est dans l'intervalle d'environ 1 % à environ 10 % en poids.

Le nécessaire de la présente invention rassemble 20 les divers constituants nécessaires pour effectuer simultanément plusieurs analyses conformes à la description ci-dessus. Parmi les constituants du nécessaire

figure une série de bandes pratiquement identiques de la matière en phase solide, chacune avec les protéines 25 virales immobilisées sur une de ses faces et espacées à des intervalles sur sa longueur. Les bandes peuvent commodément être découpées dans une membrane Western blot transferée à partir d'un gel en plaque unique. Les bandes sont par conséquent identiques en ce qui concerne 30 les types, les quantités et les positions des protéines

virales. Les bandes sont de préférence marquées pour indiquer le côté sur lequel les protéines sont liées et pour indiquer l'orientation adéquate, garantissant ainsi que toutes les bandes sont présentées dans le même 35 ordre.

Un second constituant du nécessaire est une solution d'un conjugué d'un anticorps spécifique des anticorps de l'échantillon qui se lient aux protéines virales, l'autre constituant du conjugué étant une enzyme 5 appropriée, de préférence une phosphatase alcaline.

L'anticorps du conjugué sera une anti-immunoglobuline humaine, telle que l'anti-IgG, l'anti-IgM ou l'anti-IgA humaines ou un anticorps spécifique d'une autre classe ou sous-classe d'anticorps. On préfère l'anti-IgG 10 humaine.

La quantité de conjugué utilisée est une quantité qui dépasse la gamme attendue pour la quantité d'anticorps de l'échantillon dans chaque analyse, de telle sorte que tous les anticorps de l'échantillon 15 présents sur le support se lient pour former des complexes. La concentration du conjugué dans la solution sera choisie sur la base de la sensibilité. La concentration la plus basse qui donnera des résultats lisibles sur un échantillon étalon sera généralement 20 utilisée. Dans la plupart des applications, celle-ci se

situera entre les dilutions 1:500 et 1:3000.

Un troisième constituant est une solution du substrat sur lequel agit l'enzyme, de préférence la combinaison NBT/BCIP dans des quantités approximativement 25 équimolaires. La quantité de substrat utilisée est une

quantité suffisante pour produire une modification détectable résultant de l'action de l'enzyme. Pour le NBT/ BCIP, cette quantité se situera généralement dans l'intervalle d'environ 1 x 10- mole/litre à environ 30 10 x 10 mole/litre pour chaque constituant.

Une solution de lavage contenant l'agent de blocage peut également être incorporée. En outre, des bandes de comparaison complètement développées représentant des échantillons positifs connus et négatifs connus sont 35 incluses comme guide pour l'opérateur. Ces bandes peuvent se présenter sous forme de photographies dans un manuel d'instruction ou être des bandes réelles. En outre, des réceptacles sont inclus pour recevoir les bandes d'essai individuelles et les plonger dans les échantillons, les réactifs et les solutions de lavage en vue 5 de l'incubation et de l'agitation, tout en permettant l'aspiration des liquides à divers stades du processus d'analyse. Un mode de réalisation donné à titre d'exemple illustratif d'un plateau multi-réceptacle 11 utilisable 10 dans la pratique de la présente invention est représenté à la figure 1. Le plateau contient une série de réceptacles ou cuvettes allongés 12, disposés en parallèle, - chacun étant d'une longueur suffisante pour loger une bande de milieu de support en phase solide, et d'une 15 largeur suffisante pour que la bande puisse reposer avec sa face vers le haut. A une extrémité de chaque cuvette, se trouve une barrière de rétention comprenant d'une paire de protubérances 13, 14, qui maintiennent la bande (non représentée) éloignée d'une paroi d'extrémité 15 de 20 chaque cuvette, définissant ainsi un puits 16 dans lequel un tube d'aspiration (non représenté) peut être inséré pour soutirer les liquides sans venir au contact de la bande. Les protubérances 13, 14 sont séparées par un intervalle 17, qui, bien qu'insuffisamment large pour 25 permettre le passage de la bande, permet l'écoulement du liquide et par conséquent le drainage de tout le liquide présent dans chacune des cuvettes dans le puits 16 pour

l'élimination par aspiration.

Un doublure 21 pour le plateau de la figure 1 30 est représentée dans la figure 2. La doublure est en une matière transparente fine et a le même contour que la surface supérieure du plateau 11. Elle présente ainsi une série de projections rectangulaires 22 s'étendant vers le bas, ayant la même forme que les cuvettes 12. 35 Dans le mode de réalisation représenté, les projections 22 ainsi que les cuvettes 12 sont légèrement effilées vers le bas, de telle sorte que les projections s'adaptent aisément dans les cuvettes lorsque la doublure est placée sur la cuvette. La doublure joue un rôle dans l'expédition, en particulier lorsque le 5 plateau est emballé avec une bande d'essai placée dans chaque cuvette. La doublure maintient les bandes en place au cours du transport et de la manipulation du

plateau, et est retirée avant l'exécution de l'analyse.

Un couvercle 31 tel que représenté à la figure 3 10 peut également être inclus dans le nécessaire d'essai.

Le couvercle représenté est un couvercle de matière transparente fine semblable à la doublure 21 de la figure 2, mais sans les projections 22. Les parois latérales 23, 32 tant de la doublure que du couvercle, respec15 tivement, s'effilent vers le haut pour faciliter la jonction de toutes les pièces. Le couvercle est utilisé au cours de l'analyse elle- même, et il sert à retenir les fluides d'essai et les bandes dans les cuvettes au cours de l'agitation qui est généralement effectuée au 20 cours des stades d'incubation de l'analyse. L'agitation

peut consister en un balancement léger du plateau.

L'exemple suivant est donné à titre d'illustration et n'est destiné ni à définir, ni à limiter la portée de l'invention de quelque manière. 25 EXEMPLE I. Préparation d'un électroDhorétoaramme sur nitrocellulose Le virus HTLV-III est fourni par Organon Teknika. Le virus a été désactivé avec 0,5 % de déter30 gent, après avoir été extrait par lyse cellulaire à partir de cellules H9 qui avaient été infectées par

le virus.

Le virus est dilué et lysé dans une solution tampon à 10 mg pour 50 ml de solution finale, et 35 fractionné par électrophorèse sur un gel en plaque

de polyacrylamide à 10 % en présence de dodécysul-

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fate de sodium. Les bandes de protéines obtenues sur le gel sont transférées par électrophorèse sur une feuille de nitrocellulose. Le côté de la feuille portant les bandes de protéines est alors marqué 5 avec une ligne le long du bord correspondant au sommet de l'électrophorétogramme. La feuille est ensuite lavée plusieurs fois dans du Tween 20 à 0,3 % dans une solution saline tamponnée au phosphate et de l'azide de sodium à 0,1 % dans de l'eau 10 désionisée, puis découpée en 32 bandes mesurant 11 cm x 0,34 cm. Les deux bandes des extrémités sont conservées pour le contrôle de qualité. Des immunoessais étalons sont effectués sur ces bandes d'extrémité en utilisant des sérums témoins po15 sitifs et négatifs pour confirmer la présence de

protéines virales.

II. PréDaration du réactif On prépare une solution de produit de lavage/ dilution en combinant les ingrédients suivants dans 20 de l'eau désionisée (sur la base d'un volume final de 24 litres): TRIS 580,9 g Lait écrémé sec 1,2 kg Antimousse A 7,7 ml Tween 20 720 ml NaCl 1120 g NaN3 24 g HCl pour ajuster le pH à 7,5 30 On prépare une solution de conjugué d'enzyme en utilisant un conjugué de phosphatase alcaline et d'anti-IgG humaine obtenu auprès de Bio-Rad Laboratories, Inc., Chemical Division, Richmond, 35 Californie, en combinant 2,05 parties en volume de la solution de produit de lavage/dilution ci-dessus avec 18,45 parties en volume d'eau désionisée, et en ajoutant du conjugué dans une quantité choisie à l'avance, suffisante pour donner des résultats détectables. La quantité peut être choisie à 5 l'avance sur la base d'une détermination de point

final en utilisant des dilutions en série.

On prépare une solution de substrat en combinant 3,12 parties en poids de phosphate de 5-bromo4-chloro-3-indolyle et 6,25 parties en poids de 10 chlorure de nitrobleu tétrazolium avec du tampon TRIS 0,1M, de l'azide de sodium, du diméthylformamide et de l'eau désionisée, en ajustant le pH à

9,5 0,1 avec de l'acide chlorhydrique.

III. Analyse.

On utilise un plateau contenant dix cuvettes comme dans le dessin. Une bande est placée dans chacune des cuvettes, avec les marques des lignes vers le haut, et toutes sur un côté. La solution de produit de lavage/dilution est alors ajoutée dans 20 une quantité de 3 ml à chaque cuvette, en saturant

chaque bande. Un échantillon provenant d'un patient est ajouté à chaque cuvette à raison de 30 microlitres par échantillon, et la cuvette est balancée doucement (incubée) pendant trente minutes à la 25 température ambiante.

On aspire ensuite les cuvettes sous-vide et on ajoute dans chacune 5 ml de solution de produit de lavage/dilution, puis on fait incuber pendant dix minutes. On répète ensuite l'aspiration et le 30 lavage. Après aspiration, on ajoute dans chaque cuvette 3 ml de solution de conjugué d'enzyme et on reprend l'incubation pendant trente minutes. On aspire les cuvettes, et on ajoute dans chacune 5 ml de solution de produit de lavage/dilution, puis on 35 incube pendant dix minutes. On aspire les cuvettes et on répète le lavage. On ajoute alors la solution

de substrat & raison de 3 ml par cuvette, puis on fait incuber pendant dix minutes et on aspire. On lave ensuite chaucune des cuvettes avec 5 ml d'eau désionisée, deux fois avec 5 minutes d'incubation à 5 chaque fois, puis on aspire et on examine les bandes. Des bandes colorées apparaissent dans une disposition déterminée par l'électrophorétogramme, indiquant- la présence d'anticorps dirigés contre un virus associé au SIDA dans chacun des échantillons. 10 La description détaillée qui précède est

donnée essentiellement dans un but d'illustration.

Il est évident pour l'homme du métier que de nombreuses modifications, variations et substitutions supplémentaires, non mentionnées ici, 15 pourraient être apportées sans sortir de l'esprit

et du cadre de l'invention.

Claims (27)

REVENDICATIONS

1. Procédé de détermination de la présence d'an5 ticorps ayant une spécificité pour des sites antigéniques sur un virus associé au SIDA dans un échantillon de fluide corporel, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: (a) mettre l'échantillon en contact avec des 10 antigènes choisis dans le groupe constitué de ce virus associé au SIDA et de fractions de celui-ci pour former des complexes de ces anticorps avec ces antigènes; (b) associer à chacun de ces complexes un 15 système produisant un signal comprenant: (i) un conjugué de phosphatase alcaline avec un second anticorps ayant une affinité pour ces complexes, et (ii) un mélange de chlorure de nitro20 bleu de tétrazolium et de phosphate de 5bromo-4-chloro-3-indolyle dans des quantités suffisantes pour produire une modification de couleur par contact avec la phosphatase alcaline; et 25 (c) déterminer le niveau du signal provenant de ces systèmes de production de signaux associés comme une indication de la présence de

ces anticorps dans cet échantillon.

2. Procédé suivant la revendication 1, 30 caractérisé en ce que le second anticorps est une

anti-Ig humaine.

3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, dans

lequel le chlorure de nitrobleu de tétrazolium et le phosphate de 5-bromo4-chloro-3-indolyle sont dans des 35 quantités approximativement équimolaires.

4. Procédé suivant l'une des revendications 1 à

3, caractérisé en ce que les antigènes sont un lysat

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d'un virus associé au SIDA.

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que les antigènes sont un lysat de

HTLV-III.

6. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que les antigènes sont un lysat de LAV.

7. Procédé suivant la revendication 4,

caractérisé en ce que les antigènes sont un lysat de 10 ARV.

8. Procédé suivant l'une des revendications 4 à

7, caractérisé en ce que les antigènes sont fractionnés électrophorétiquement et transférés à un milieu de

support en phase solide.

9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que le milieu de support en phase

solide est la nitrocellulose.

10. Procédé pour déterminer la présence d'anticorps ayant une spécificité pour des sites antigéniques 20 sur un virus associé au SIDA dans un échantillon de sérum humain, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: (a) plonger dans cet échantillon un support en phase solide sur lequel est adsorbé un élec25 trophorétogramme de fractions protéiques d'un virus associé au SIDA lysé pour former des complexes immobilisés de ces anticorps avec ces fractions protéiques; (b) faire incuber ces complexes immobilisés 30 avec une solution d'un excès d'un conjugué d'anti-Ig humaine et de phosphatase alcaline pour lier ce conjugué à ces complexes immobilisés; (c) séparer ces complexes immobilisés liés au 35 conjugué du conjugué restant - dans cette solution; (d) faire incuber ces complexes immobilisés liés au conjugué séparés avec une solution de chlorure de nitrobleu tétrazolium et de-phosphate de 5-bromo-4-chloro-3indolyle pour produire 5 une modification de coloration détectable indiquant la présence de ces anticorps dans cet échantillon.

11. Nécessaire d'essai diagnostique pour l'analyse d'échantillons d'un fluide corporel pour y rechercher 10 la présence d'anticorps ayant une spécificité pour des sites antigéniques sur un virus associé au SIDA, ce nécessaire d'essai diagnostique comprenant: une pluralité de supports en phase solide sur chacun desquels sont adsorbés des antigènes de ce 15 virus associé au SIDA dans des régions séparées placées dans une disposition choisie à l'avance, cette disposition choisie à l'avance et la densité de chaque antigène adsorbé étant toutes deux pratiquement identiques d'un de ces supports en 20 phase solide au suivant; une solution d'un conjugué du premier constituant d'un système producteur de signal à deux constituants avec un second anticorps ayant une affinité de liaison pour des complexes de ces an25 tigènes avec ces anticorps, dans une quantité suffisante pour tous ces supports en phase solide; et

une solution du second constituant de ce système de production de signal à deux constituants, 30 dans une quantité suffisante pour tous ces supports en phase solide.

12. Nécessaire d'essai diagnostique suivant la revendication 11, caractérisé en ce que le système de production de signal à deux constituants est un système 35 qui produit une modification observable visuellement

lorsque les deux constituants sont combinés.

13. Nécessaire d'essai diagnostique suivant la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que le premier constituant est une enzyme capable d'agir sur le

second constituant pour produire un signal détectable.

14. Nécessaire d'essai diagnostique suivant l'une

des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que le premier constituant est une phosphatase alcaline et le second constituant est un substrat capable de subir une modification détectable par contact avec la phosphatase 10 alcaline.

15. Nécessaire d'essai diagnostique suivant la revendication 14, caractérisé en ce que le second constituant est un mélange de chlorure de nitrobleu tétrazolium et de phosphate de 5-bromo-4-chloro-315 indolyle dans des quantités suffisantes pour produire une modification de coloration par contact avec la

phosphatase alcaline.

16. Nécessaire d'essai diagnostique suivant l'une

des revendications 11 à 16, caractérisé en ce qu'il 20 comprend en outre une solution d'un agent bloquant pour

réduire la liaison non spécifique sur le support en

phase solide.

17. Nécessaire d'essai diagnostique suivant la

revendication 16, caractérisé en ce que l'agent bloquant 25 est constitué de protéines du lait.

18. Nécessaire d'essai diagnostique suivant la

revendication 11 à 17, caractérisé en ce que la répartition choisie à l'avance est un électrophorétogramme transféré sur le support en phase solide à partir d'un 30 milieu de séparation électrophorétique.

19. Nécessaire d'essai diagnostique suivant l'une

des revendications 11 à 18, dans lequel le support en

phase solide est de la nitrocellulose.

20. Nécessaire d'essai diagnostique suivant l'une 35 des revendications 11 à 19, caractérisé en ce que la

disposition choisie & l'avance est un Western blot d'un

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électrophorétogramme desdits antigènes.

21. Nécessaire d'essai diagnostique suivant l'une

des revendications 11 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un réceptacle pour maintenir le 5 support en phase solide immergé dans l'échantillon ou dans les solutions.

22. Nécessaire d'essai diagnostique pour analyser plusieurs échantillons de fluide corporel humain pour y rechercher la présence d'anticorps de type IgG ayant une 10 spécificité pour des sites antigéniques sur un virus associé au SIDA, ce nécessaire d'essai diagnostique comprenant: plusieurs bandes découpées dans un support solide sur lequel est adsorbé par "Western blot" 15 un électrophorétogramme d'antigènes de ce virus associé au SIDA dans des bandes allongées transversales à ces susdites bandes; une solution d'un conjugué d'anti-IgG humaine et de phosphatase alcaline; une solution de chlorure de nitrobleu tétrazolium et de phosphate de 5-bromo-4-chloro-3indolyle dans des quantités approximativement équimolaires; une solution de protéines du lait; et un plateau contenant plusieurs compartiments retenant les liquides, ayant chacun une taille suffisante pour recevoir un de ces supports

solides complètement immergé dans du liquide.

23. Plateau pour faire incuber des bandes de ma30 tière en phase solide dans des liquides réactifs, ce plateau comprenant: plusieurs compartiments allongés retenant les liquides, dimensionnés chacun pour recevoir une bande complètement immergée dans du liquide; et 35 une barrière dans chacun de ces compartiments allongés retenant les liquides pour retenir une

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bande de ce type à distance d'une paroi d'extrémité de celui-ci, tout en permettant

l'écoulement de liquide à travers celui-ci.

24. Plateau suivant la revendication 23, 5 caractérisé en ce que la barrière comprend une protubérance s'étendant vers le haut & partir de la base de chacun des compartiments allongés retenant du liquide.

25. Plateau suivant la revendication 23, 10 caractérisé en ce que la barrière comprend une paire de protubérances s'étendant vers le haut à partir de la base de chacun des compartiments allongés retenant du liquide, cette paire étant séparée par un intervalle

plus étroit que la largeur de chacune des bandes.

26. Appareil pour retenir des bandes de matière en phase solide à faire incuber dans des liquides réactifs, caractérisé en ce qu'il comprend: un plateau contenant plusieurs compartiments allongés retenant du liquide, chacun étant dimen20 sionné pour recevoir une bande complètement immergée dans du liquide, chaque compartiment contenant une barrière disposée pour retenir une bande à distance d'une paroi d'extrémité de celui-ci, tout en permettant un écoulement de 25 liquide à travers celui-ci; et une doublure amovible dont les contours

s'adaptent à la surface supérieure du plateau avec des projections s'étendant dans chacun de des compartiments allongés retenant du liquide 30 pour stabiliser la position de chacune des bandes.

27. Appareil suivant la revendication 26, caractérisé en outre un couvercle dont les contours sont tels qu'il ferme chacun des compartiments allongés rete35 nant les liquides en y laissant suffisamment d'espace

pour l'agitation des liquides réactifs qui y sont placés.