FR2525234A1 - Procede d'immobilisation de substances biologiques dans des polymeres de polyalkylene-imine condenses - Google Patents
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Abstract
PROCEDE D'IMMOBILISATION D'UNE SUBSTANCE BIOLOGIQUE PAR PREPARATION D'UN COMPOSITE DE SUBSTANCE BIOLOGIQUE NON SOLUBILISE. ON CONDENSE UN POLYMERE DE POLYALKYLENE-IMINE AVEC UNE QUANTITE APPROPRIEE D'UN POLYACIDE CARBOXYLIQUE EN PRESENCE D'UNE QUANTITE APPROPRIEE D'UN AGENT DE CONDENSATION, LA SUBSTANCE BIOLOGIQUE ETANT MELANGEE AVEC LE POLYMERE DE POLYALKYLENE-IMINE PENDANT LA REACTION DE CONDENSATION. LA CONDENSATION DU POLYMERE RESULTE DU PONTAGE DES GROUPEMENTS AMINE DU POLYALKYLENE-IMINE PAR LE POLYACIDE CARBOXYLIQUE. APPLICATION A LA PREPARATION DE L'ACIDE ASPARTIQUE, DE LA PHENYLALANINE ET DU TRYPTOPHANE, ENTRE AUTRES.
Description
Procédé d'immobilisation de substances biologiques dans des polymères de
polyalkylène-imine condensés La présente invention concerne un procédé
d'immobilisation de substances biologiques Plus particulière-
ment, l'invention concerne l'immobilisation de substances biologiques par emprisonnement de ces substances au sein d'un polymère. Des substances biologiques telles que les enzymes ou les micro-organismes ou les cellules producteurs d'enzymes sont souvent utilisées comme catalyseurs pour des réactions de synthèse et pour des techniques d'analyse De tels catalyseurs sont souhaitables car ils opèrent avecune grande
spécificité et un bon rendement dans des conditions -
réactionnelles généralement douces.
Comme les enzymes et les autres biocatalyseurs sont généralement solubles dans l'eau, ils conviennent à l'utilisation dans des systèmes réactionnels de type discontinu La réutilisation de ces enzymes et autres biocatalyseurs est limitée, en raison de difficultés de récupération de ces substances à partir du milieu réactionnel usé, sous une forme active ou utilisable Par ailleurs, ces substances tendent à rester dans le produit préparé sous forme d'impuretés Afin d'éviter ces problèmes, des procédés ont été mis au point pour immobiliser les substances biologiques qui font preuve d'une activité catalytique sur des supports solides insolubles L'immobilisation est censée avoir pour résultat une substance biologique stabilisée capable de
résister aux rigueurs d'une utilisation répétée ou continue.
Plusieurs procédés d'immobilisation des substances biologiques ont été signalés Des enzymes ont été immobilisées par absorption sur des substances insolubles telles que le charbon, le verre, la cellulose, le gel de phosphate de calcium, la montmorillonite et les résines organiques d'échange d'ions, entre autres L'immobilisation a également été
réalisée par emprisonnement dans des gels d'amidon et d'acryl-
amide, par liaison covalente entre des enzymes et des polymères organiques insolubles, ainsi que par liaison
covalente entre les molécules d'enzyme elles-mêmes.
Les procédés de la technique antérieure donnent souvent des produits ayant une activité enzymatique réduite par rapport à celle de la substance biologique libre correspondante On sait que ces substances biologiques sont sensibles à la dénaturation ou à l'inactivation thermique et chimique La perte d'activité biologique se produit souvent lorsque les opérations d'immobilisation sont effectuées dans des conditions très sévères, lesquelles peuvent être particulièrement problématiques lorsque des réactions de condensation de polymères sont en jeu En outre, les produits obtenus avec les procédés de la technique antérieure sont souvent peu avantageux du point de vue de leur caractère hydrophile, de leur résistance mécanique, de leur durabilité
et de leur porosité.
Il a maintenant été découvert que des substances biologiques pouvaient être immobilisées d'une manière simple et économique tout en conservant un haut degré de leur activité catalytique Le procédé de la présente invention permet d'obtenir un composite de substance biologique non solubilisé contenant la substance biologique emprisonnée dans un polymère de polyalkylène-imine condensé Bien qu'on prépare ce composite en menant les réactions de condensation du polymère en présence de la substance biologique, les conditions réactionnelles sont si douces qu'il ne se produit qu'une très faible perte d'activité De tels composites font preuve d'une excellente résistance mécanique et d'une excellente durabilité En outre, il est possible de régler le caractère hydrophile de ces substances en faisant varier le degré de condensation Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir un composite que l'on peut séparer des mélanges réactionnels par simple filtration, ou que l'on peut utiliser dans des procédés à réaction continue tels que ceux dans lesquels un substrat réagissant circule dans un
réacteur formé par une colonne à garnissage.
Conformément au procédé selon la présente invention, on condense un polymère de polyalkylène-imine avec une quantité appropriée d'un polyacide carboxylique en présence d'une quantité appropriée d'un agent de condensation, et on mélange ladite substance biologique avec ledit polymère de polyalkylène-imine pendant ladite réaction de condensation. L'addition de l'agent de condensation a pour résultat la formation d'un composite de substance biologique non
solubilisé, dans lequel la substance biologique est immobili-
sée au sein du polymère L'immobilisation de la substance biologique au sein du polymère peut se faire par emprisonnement physique aussi bien que par liaison de covalence entre le polyalkylène-imine ou l'agent de condensation et des groupements réactifs de la substance biologique Par exemple, la substance biologique peut être immobilisée par liaison covalente, étant donné que les groupements amine et carboxyle de la substance biologique
peuvent prendre la place soit d'un groupement amine du poly-
alkylène-imine soit d'un groupement carboxylique du poly-
acide carboxylique, et en fin de compte se trouver liés par
covalence au polymère.
Le procédé selon la présente invention permet de préparer une large variété de composites de substance biologique qui peuvent différer par leur caractère hydrophile, leur résistance mécanique, leur durabilité et leur porosité En diminuant le degré de condensation il est possible d'obtenir un composite ayant une plus grande solubilité dans l'eau En ajoutant des agents de réticulation multifonctionnels, il est possible d'augmenter la résistance mécanique et la durabilité du composite polymère-substance biologique, dans lequel les groupements fonctionnels supplémentaires augmentent la condensation du polymère de polyalkylèneimine. La porosité globale de la matrice peut être augmentée par addition d'une matière en particules soluble dans l'eau au mélange de polymère préalablement à la condensation complète La substance sèche est ensuite éliminée par addition d'eau après la condensation, ce qui dissout le solide Les parties du composite qui avaient été déplacées par les solides restent inoccupées, ce qui a pour effet d'augmenter la porosité de la matrice Toute substance en particules soluble dans l'eau qui n'a pas d'effet néfaste appréciable sur le polymère ou la substance biologique peut être utilisée pour augmenter la porosité du mélange Les polyacides carboxyliques solubles dans l'eau, tels que ceux qui ont réagi avec les polyalkylène-imines non condensés, conviennent particulièrement bien pour augmenter la porosité de la matrice, car les excès utilisés pour augmenter la porosité ne gênent pas notablement les réactions de condensation. Les polyalkylène-imines qui sont utilisés dans le procédé et dans les composites selon la présente invention sont des polymères qui peuvent être synthétisés par polymérisation par addition, catalysée par des acides, de monomères d'alkylène-imine Ces polymères ont généralement un poids moléculaire qui varie entre 30 000 et 100 000, suivant les conditions de réaction, et ont de préférence une
structure à chaîne ramifiée.
Le polyéthylène-imine (PEI) est un polyalkylène-
imine préféré, car il est actuellement facile de se le procurer à un prix relativement peu élevé, et il se comporte bien dans les réactions de condensation utilisées dans le procédé selon la présente invention Le polyéthylène-imine est obtenu par polymérisation avec ouverture de cycle de l'éthylène-imine en présence de catalyseurs, d'acides minéraux par exemple Ce polymère est hautement ramifié et contient
des groupements amine primaires, secondaires et tertiaires.
Le PEI est soluble dans l'eau, et lors de la condensation des chaînes du polymère il se forme un produit insoluble dans l'eau Un procédé de condensation très efficace fait appel à un polyacide carboxylique -(PCA) pour "ponter" les groupements amine sur les chaînes adjacentes du PEI Des
agents de condensation, qui sont de préférence des carbo-
diimides, facilitent-la condensation Les réactions mises en jeu dans la préparation du polyéthylène-imine condensé selon la présente invention sont schématisées ci-dessous ( 1) H 2 C CH 2 >lCH 2 CH 2 NlnlCH 2 CH 2 NHlri'CH 2 CH 2 NH 2 N, ICH 2 CH 2 NH In'q-CH 2 CH 2 NH 2 (PEI) 1 +
0 NH 3
Il c-o-
> 1 R
1 +
c-o 13 il (PEI) ( 2) (PEI) NH 2 COOH R - COOH NH 2 (PEI)
(PEI) _
O NH 3 +
l O I
R + 2
C-O IH 3 +
(C (PEI)
O NH 2
lJ 1 R 1-s 1 1
1 C-O-C
N ff 1
R" C-O-C
DI) O
(NHPEI 2)
(PEI) NH-R'
> N-R"
N-R" NH-R'
( PE) ____
O NH 2
il l,NH-R' C-O-C o N-R" R
/, N-R"
C-O-C NH-R' (PEI) NH O=C R O=C NH (PEI) NH 2 (PEI) Rn NH I
+ 2 O = C
NH R' La réaction ( 1) illustre la polymérisation de l'éthylène-imine pour former le PEI ayant une structure à chaîne ramifiée, dans laquelle N et n' sont des nombres entiers plus grands que O et n" peut être égal à O (ce qui signifie que le groupement lCH 2 CH 2 NHl est absent) ou plus grand que 0. La réaction ( 2) montre la formation d'un sel des groupements ( 3) ( 4) amine du PEI avec un polyacide carboxylique, R pouvant être une liaison directe ou un groupement hydrocarboné éventuellement substitué, par exemple un groupement hydrocarboné à chaîne droite ou ramifiée contenant éventuellement des groupements alicycliques, oléfiniques ou aromatiques, ainsi que divers groupements fonctionnels tels que les groupements hydroxyle, carbonyle, carboxyliques, amine, nitrile, amide, ester, etc, qui n'ont pas d'effet néfaste sur la réaction de condensation, sur les substances biologiques ou sur le composite résultant La nature de ces groupements peut varier dans une large mesure en donnant une large gamme de polyacides carboxyliques utilisables, comme on le verra plus loin Les réactions ( 3) et ( 4) montrent la condensation du PEI et du polyacide carboxylique à l'aide d'un carbodiimide comme agent de condensation R' et R" sont des groupements hydrocarbonés qui, de même que les autres produits réagissants et que les conditions des réactions
représentées, sont décrits plus complètement ci-après.
En général, les polyacides carboxyliques qui conviennent a l'utilisation dans la présente invention peuvent être des acides carboxyliques éventuellement /
substitués comportant au moins deux groupements carboxyliques.
De préférence, ces polyacides carboxyliques sont solubles dans l'eau, si bien que l'on peut les utiliser pour augmenter la
porosité du composite, ainsi que pour condenser le poly-
alkylène-imine Des exemples de polyacides carboxyliques que l'on peut utiliser dans les procédés et les composites selon la présente invention comprennent les acides adipique, azélalque, 1,11-undécanedioique, 1,12dodécanediolque, traumatique, pentadécanedioique, hexadécanedioique, sébacique, subérique, glutarique, malonique, pimellique, succinique, malique, maléique, glutamique, aspartique, oxalique, fumarique, polyaspartique, etc On préfère utiliser les diacides carboxyliques dans la présente invention, et ceux-ci comprennent l'acide maléique, l'acide succinique, l'acide glutarique et l'acide adipique Les polyacides carboxyliques supérieurs comprennent toute substance contenant au moins deux groupements acide carboxylique, par exemple des substances polymères de haut poids moléculaire, telles que l'acide polyaspartique, dont le poids moléculaire va de 5 000 à 70 000 environ Les réactions de condensation sont généralement exothermiques, c'est pourquoi on a avantage à refroidir les mélanges réactionnels à une température qui n'a pas d'effet néfaste sur la substance biologique que l'on souhaite immobiliser, par exemple à une température de 370
environ ou moins.
Le rapport molaire du polyacide carboxylique au polyalkylène-imine (PCA:PAI) peut varier dans une large mesure en raison de la variation du poids moléculaire des produits réagissants D'une manière générale, le polyacide carboxylique peut être utilisé dans n'importe quelle quantité appropriée pour la condensation, et le rapport du PCA au PAI s'établit généralement entre 1:20 et 1:0005 Dans les cas o l'on ajoute un polyacide carboxylique pour augmenter la porosité du composite selon la présente invention, on utilise souvent un excès molaire considérable de ce polyacide carboxylique. Pour préparer les composites, on peut avoir recours aà un ordre d'addition quelconque des ingrédients Par exemple, la substance biologique à immobiliser peut être introduite à n'importe quel moment précédant la solidification du polymère,
mais il est préférable de l'ajouter après l'addition du poly-
acide carboxylique au polyalkylène-imine Un procédé préféré de préparation des composites selon la présente invention consiste à ajouter une quantité appropriée d'un polyacide carboxylique au polyalkylène-imine, dans des conditions de prépolymérisation, de façon à former un prépolymère soluble dans l'eau Ce prépolymère est généralement un liquide visqueux, auquel la substance biologique peut commodément être ajoutée et être maintenue en suspension pendant la réaction de condensation On ajoute ensuite l'agent de condensation pour provoquer la condensation et la
solidification du composite polymère-substance biologique.
On maintient le p H du mélange réactionnel à un niveau tel qu'il n'y ait pas d'inactivation ou d'effet néfaste sensible sur la substance biologique Ce p H peut s'établir entre 2 et
12 environ et s'établit de préférence entre 5 et 10 environ.
La quantité de substance biologique ajoutée au polymère peut varier en fonction de l'utilisation finale précise du composite de substance biologique En général, elle s'établit d'environ 0,001 à 10 g (poids sec) par gramme de polyalkylène-imine utilisé, et de préférence d'environ 0,1 g à 5 g par gramme de PAI La substance biologique peut comporter des enzymes, des cellules microbiennes, des antigènes, des anticorps, des antibiotiques, des hydrates de carbone, des co-enzymes, des cellules végétales, des cellules animales, des bactéries, des levures, des champignons, des cultures tissulaires ou des mélanges des précédents Les enzymes peuvent être ajoutées au mélange réactionnel en solution aqueuse ou sous forme de poudre, de préférence sous cette dernière forme Les cellules peuvent être ajoutées sous
la forme de pâte humide ou de particules sèches.
Comme indiqué plus haut, pour provoquer la condensation des chaînes de polyalkylène-imine par l'intermédiaire de polyacides carboxyliques, on a avantage à utiliser un agent de condensation D'une manière générale, tout agent de condensation qui catalyse ou facilite la réaction des amines et des acides carboxyliques peut être utilisé Des exemples de ces agents de condensation comprennent le N-éthyl-5-phényl-isoazolium-3-sulfonate, la N éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2-dihydroquinoléine, et divers carbodiimides Les carbodiimides sont préférés comme agents de condensation, et ces agents comprennent généralement les composés de formule R'-N=C=N-R" dans laquelle R' et R" sont des groupements hydrocarbonés contenant de 3 à environ 20 atomes de carbone, de préférence d'environ 5 à environ 12 atomes de carbone Ces carbodiimides utilisés comme agents de condensation comprennent le 1-éthyl-3,3-diméthylaminopropyl
carbodiimide, le dicyclohexyl carbodiimide, le métho-para-
toluène sulfonate de 1-cyclohexyl-3-( 2-morpholino-éthyl) carbodiimide, ainsi que leurs sels Les carbodiimides servant d'agents de condensation sont ajoutés au mélange réactionnel
dans une quantité propre à assurer la condensation, c'est-à-
dire généralement dans une quantité sensiblement stoechiométrique, par exemple d'environ 0,2 à 3 fois, de préférence d'environ 0,5 à 1,5 fois, la quantité stoechiométrique Chaque molécule de carbodiimide réagit avec un seul groupement acide du polyacide carboxylique Par exemple, des rapports molaires du carbodiimide au diacide carboxylique égaux à 2:1 environ sont généralement utilisés dans le procédé selon la présente invention; mais on utilise des rapporte molaires beaucoup plus faibles si on fait appel' à un excès de polyacide carboxylique pour augmenter la porosité du composite Lors de l'addition de l'agent de condensation, à la température ambiante, il se produit une polymérisation notable dans un délai d'une trentaine de secondes, et cette polymérisation est généralement complète
dans un délai de 2 heures environ.
Des formes de réalisation spécifiques de la
présente invention peuvent en outre mettre en jeu un post-
traitement du composite par un agent de réticulation des fonctions amine pour lui conférer un supplément de stabilité et de résistance mécanique Ces agents de réticulation comprennent le dialdéhyde'glutarique, les diisocyanates, les polyisocyanates, la 2,4,6-trichloro-S-triazine, lebisoxirane,
le bisimidate, la divinylsulfone, le 1,5-difluoro-2,4-dinitro-
benzène, etc Le dialdéhyde glutarique est préféré pour cela.
En utilisant les procédés décrits ci-dessus selon la présente invention il est possible d'immobiliser une large variété de substances biologiques pour produire de nouveaux composites biocatalytiques Dans les exemples suivants, les modes opératoires d'immobilisation sont décrits plus en détail Ces exemples décrivent la manière et le procédé de réalisation et d'utilisation de l'invention et indiquent diverses formes de réalisation de l'invention mais ne doivent
pas être considérés comme la limitant.
EXEMPLE I
On a mélangé du polyéthylène-imine ( 4,0 grammes d'une solution aqueuse à 30 %) avec de l'acide succinique ( 2 grammes) La température du mélange est montée à 450 C, et on l'a laissée redescendre à 220 C A ce stade, le mélange résultant était un prépolymère soluble dans l'eau On a préparé une solution aqueuse d'aspartase exempte de cellules conformément au mode opératoire décrit à l'Exemple I, paragraphe 1 de la demande de brevet français déposée le 15
juillet 1982 sous le N' 82 12369 au nom de la demanderesse.
On a ensuite ajouté 1 ml de cette solution d'aspartase au mélange de prépolymère soluble dans l'eau, que l'on a ensuite
condensé en lui ajoutant du chlorhydrate de 1-éthyl-3,3-
diméthylaminopropyl carbodiimide sous forme de poudre.
L'addition de ce L agent de condensation a provoqué, en 30 secondes, une polymérisation donnant un composite de substance biologique fixé, sous forme de gel On a ensuite broyé ce gel dans un mortier avec un pilon pour obtenir de
petites particules.
EXEMPLE II
On a placé le composite de substance biologique en particules de l'Exemple I dans 50 ml d'une solution de fumarate d'ammonium 1 M et de sulfate de magnésium 0,001 M, à p H 8,5, et on a agité ce mélange pendant 30 minutes On a filtré la solution et on a répété deux fois le processus,
en prolongeant la seconde agitation pendant 16 heures.
On a ensuite placé les, particules dans 35 ml de la même solution de fumarate d'ammonium à 370 C Au bout d'une heure, on a constaté que les particules biologiquement actives avaient transformé 1509 gmoles de fumarate d'ammonium en acide L-aspartique On a ensuite rincé les particules avec une solution fraiche de fumarate d'ammonium, on les a séchées partiellement puis on les a à nouveau placées dans ml d'une solution de fumarate d'ammonium à 370 C A nouveau, au bout d'une heure, 1509 gmoles de fumarate d'ammonium avaient été transformées en acide Laspartique, ce qui indiquait que l'activité biologique du composite s'était conservée.
EXEMPLE III
On a mélangé du polyéthylène-imine ( 6 grammes) avec de l'acide succinique en poudre ( 3 grammes) et on a
laissé le mélange se refroidir à la température ambiante.
On a préparé une pâte de cellules humide contenant environ 75 % en poids d'eau à partir de E coli contenant de l'aspartase fraîche, par le mode opératoire suivant On a préparé un milieu de fermentation en dissolvant, dans un litre d'eau, 24 g d'extrait de levure, 30 g d'acide fumdrique, 2 g de carbonate de sodium, 2 mmoles de sulfate de magnésium et 0,1 mmole de chlorure de calcium, et on a ajusté le p H à 7,2 environ à l'aide d'ammoniaque A>ce milieu on a inoculé 1 ml d'une culture de E coli (ATCC No 31976) que l'on avait fait incuber pendant 12 à 16 heures à 370 C dans un milieu de peptone contenant 0,5 % de glutamate monosodique On a fait incuber ce milieu inoculé pendant 12 à 14 heures à 370 C On a récolté les cellules par centrifugation à 5000 tours-par minute pendant 30 minutes On a ajouté régulièrement au prépolymère 3 gde la pâte de cellules humide obtenue On a
ensuite ajouté du chlorhydrate de 1-éthyl-3,3-diméthylamino-
propyl carbodiimide (EDAC-H Cl) ( 2 g) et on a mélangé pendant
une minute environ Le mélange résultant s'est polymérisé.
Après 2 heures de repos dans les conditions ambiantes, on a broyé en particules le mélange polymérisé On a ensuite fait tremper les particules de gel dans une solution aqueuse de fumarate d'ammonium 1,5 M, p H 8,5 à 220 C On a répété ce trempage avec du fumarate d'ammonium frais, puis on a rincé
le gel avec une troisième fraction de fumarate d'ammonium.
On a dosé l'activité d'aspartase du gel en mesurant la
disparition de l'acide fumarique à l'aide d'un spectro-
photomètre à 240 nm On a agité continuellement les particules de gel dans un réacteur discontinu à la température ambiante, pendant une heure, en présence de 75 ml de solution de fumarate d'ammonium On a noté un pourcentage de transformation de 98 % environ correspondant à l'équilibre connu de la réaction On a ensuite répété la réaction avec des résultats semblables Le Tableau I ci-dessous montre la diminution de la concentration du fumarate d'ammonium avec le
temps pour les deux réactions discontinues.
TABLEAU I
Diminution de la concentration du substrat en fonction du temps Durée de la mg/ml de fumarate d'ammonium
réaction -
(en minutes) 1 er essai 2 ème essai
0 174,0 174,0
77,9 78,6
30 37,6 36,5
1,8 2,7
EXEMPLE IV
On a chargé la moitié du gel utilisé pour les réactions discontinues de l'Exemple III dans une colonne de 0,9 cm de diamètre Le volume du lit résultant était de 14 cm 3 On a fait circuler de bas en haut dans la colonne une solution de fumarate d'ammonium 1,5 M ( 220 C; p H 8,5) à une vitesse d'l volume spatial (SV) par heure ( 14 cm 3/ heure), sans interruption pendant 70 jours On a analysé des échantillons de l'effluent pour mesurer la disparition du fumarate d'ammonium Les résultats sont donnés dans le Tableau II ci-dessous Le pourcentage initial de transformation dans la colonne était de 190 g de fumarate d'ammonium par litre de volume de lit par heure à 220 C, et ce pourcentage est tombé à 168 g/l/h après 70 jours de fonctionnement ininterrompu Cela représente une baisse de
rendement de 12 % seulement.
TABLEAU II
Jour % de transformation
1 95,4
2 95,9
22 96,8
38 93,1
84,2
EXEMPLE V
On a mélangé du PEI ( 3 grammes) avec 1,4 g d'acide succinique et on a laissé le mélange se refroidir à la température ambiante On a ajouté à ce mélange 1,5 g de cellules de levure récoltées Rhodotorula rubra (ATCC4056) contenant une enzyme, l'ammonia-lyase de phénylalanine On a
ensuite ajouté un gramme de chlorhydrate de 1-éthyl-3,3-
diméthylaminopropyl carbodiimide, et on a mélangé pendant 1 minute Le mélange résultant s'est polymérisé en une matière ressemblant à un gel rigide On a broyé ce gel dans un mortier avec un pilon, puis on l'a fait tremper, on l'a lavé et on l'a refait tremper dans une solution de substrat contenant de l'acide t-cinnamique et de l'ammoniaque à un p H de 9,5 La substance ainsi lavée est restée de couleur rouge, alors que la solution de lavage était à l'oeil nu incolore et limpide, ce qui indiquait que les cellules rouges de R rubra étaient restées dans les particules du composite Au bout de 39 heures, on a filtré le mélange réactionnel résultant et on a analysé la teneur en L-phénylalanine du filtrat On a constaté que la concentration de la phénylalanine dans le
filtrat était de 0,5 g/l environ.
EXEMPLE VI
On a procédé à une série d'expériences pour étudier les effets du polyacide carboxylique sur le système Pour chaque expérience, on a suivi le mode opératoire de l'Exemple III, avec les exceptions suivantes: on a utilisé 3 grammes de PEI, 2 grammes de polyacide carboxylique, 1,5 g de EDAC HC 1, et 1 gramme de pâte de cellules de E coli On a procédé à une réaction d'immobilisation séparée pour chacun
des polyacides carboxyliques suivants: azélaîque, 1,11-
undécanediolque, 1,12-dodécanediolque, traumatique, penta-
décanediolque, hexadécanediolque, sébacique, subérique, glutarique, malonique et pimellique Chacun de ces polyacides carboxyliques a permis d'immobiliser les cellules On a sélectionné six des composites résultants, de poids moléculaires très différents (glutarique, pimellique, sébacique, 1,11-undécanediolque, 1,12-dodécanedioique, et subérique) en vue d'essais analytiques de leur activité biologique On a constaté que chacun des six composites permettait de transformer le fumarate d'ammonium en acide aspartique.
EXEMPLE VII
On a mélangé du PEI ( 5 grammes) avec 1 gramme
d'acide polyaspartique, puis on a ajouté 1,5 gramme de EDAC-
H Cl La polymérisation s'est produite en 5 minutes, en formant un polymère ressemblant à un gel dur qui était insoluble dans l'eau.
EXEMPLE VIII
La synthétase de tryptophane (EC 4 2 1 20) est une enzyme qui peut être tirée de sources microbiennes très variées, par exemple de microorganismes du genre Proteus, Erwinia, Escherichia, Pseudomonas et Aerobacter (Voir
Methods in Enzymology, Chem Tech Rev Academic Press ( 1980)).
Cette enzyme peut être utilisée pour catalyser la transfor-
mation de l'indole et de la sérine en tryptophane Cet exemple décrit l'immobilisation d'un extrait d'enzyme de synthétase de tryptophane à partir de cellules de E coli On a mélangé du PEI ( 4 g) et de l'acide succinique ( 2 g), et on a laissé le mélange se refroidir à la température ambiante On a ajouté à ce mélange 0,5 ml de l'extrait d'enzyme, puis 1,5 g de EDAC H Cl On a broyé en particules le gel résultant et on l'a soigneusement lavé On a ensuite ajouté les particules résultantes à une solution de substrat contenant de la L-sérine 0,05 M et de l'indole 0,05 M On a constaté que le composite permettait de transformer le substrat en L-tryptophane dans le mélange réactionnel, dans
deux essais successifs.
Claims (26)
1 Procédé d'immobilisation d'une substance biologique par préparation d'un composite de substance biologique non solubilisé, consistant à condenser un polymère de polyalkylène-imine avec une quantité appropriée d'un polyacide carboxylique en présence d'une quantité appropriée d'un agent de condensation, ladite substance
biologique étant mélangée avec ledit polymère de poly-
alkylène-imine pendant ladite réaction de condensation.
2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que le polymère de polyalkylène-imine est le poly-
éthylène-imine, le polypropylène-imine, le polybutylène-
imine ou le polypentylène-imine.
3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que le polymère de polyalkylène-imine est le poly-
éthylène-imine. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polyacide carboxylique est un diacide
carboxylique.
Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le polyacide carboxylique est l'acide
adipique, azélaique, 1,11-undécanedioique, 1,12-dodécane-
diolque, traumatique, pentadécanedioique, hexadécanedioique, sébacique, subérique, glutarique, malonique, pimellique, succinique, malique, maléique, glutamique, aspartique,
oxalique, fumarique, ou polyaspartique.
6 Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le polyacide carboxylique est l'acide
succinique.
7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'agent de condensation est le N-éthyl-5-phényl-
isoxazolium-3-sulfonate ou la N-éthoxycarbonyl-2-éthoxy-
1,2-dihydroquinoléine. 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'agent de condensation est un carbodiimide.
9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé
en ce que le carbodiimide est le 1-éthyl-3,3-diméthylamino-
propyl carbodiimide, le dicyclohexyl carbodiimide, le métho-
para-toluènesulfonate de 1-cyclohexyl-3-( 2-morpholino-éthyl)
carbodiimide, ou un sel des précédents.
10 Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'agent de condensation est le 1-éthyl-3,3-
diméthylaminopropyl carbodiimide ou un sel de celui-ci.
11 Procédé selon la revendication 5, caractérisé
en ce que l'agent de condensation est le 1-éthyl-3,3-
diméthylaminopropyl carbodiimide ou un sel de celui-ci.
12 Procédé selon la revendication 1, 2, 3 ou 4,
caractérisé en ce que le rapport molaire du polyalkylène-
imine au polyacide carboxylique est de 1:20 à 1:0005 environ.
13 Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'on utilise l'agent de condensation dans une proportion comprise entre 0,2 et 3 fois environ la quantité
stoechiométrique par rapport au polyacide carboxylique.
14 Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'on utilise l'agent de condensation dans une proportion comprise entre 0,5 et 1,5 fois environ la quantité
stoechiométrique par rapport au polyacide carboxylique.
Procédé selon l'une quelconque des
revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on commence par
mélanger le polyalkylène-imine et le polyacide carboxylique, puis on ajoute la substance biologique, et enfin on ajoute
l'agent de condensation.
16 Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la substance biologique immobilisée est une enzyme.
17 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance biologique immobilisée comprend des
cellules entières.
18 Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que les cellules entières sont des cellules de E coli
qui contiennent de l'aspartase.
19 Procédé selon la revendication 9, caractérisé
en ce que la substance biologique est l'aspartase.
Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance biologique comprend de l'ammonia-lyase
de phénylalanine.
21 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance biologique comprend de la synthétase
de tryptophane.
22 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à faire subir au composite de substance biologique non solubilisé un post-traitement par un agent de réticulation des fonctions amine de façon à conférer au composite un supplément de résistance mécanique
et de stabilité.
23 Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'agent de réticulation des fonctions amine est le dialdéhyde glutarique, un diisocyanate, un polyisocyanate, la 2,4,6-trichloro-S-triazine, le bisoxirane, le bisimidate,
la divinylsulfone ou le 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzène.
24 Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'agent de réticulation des fonctions amine est le
dialdéhyde glutarique.
Composite de substance biologique non solubilisé comprenant une substance biologiquement active immobilisée au sein d'un polymère de polyalkylèneimine
condensé, des groupements amine des chaînes de ce poly-
alkylène-imine étant pontés par un polyacide carboxylique.
26 Composite selon la revendication 25, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est constituée par des enzymes,par des cellules microbiennes, par des antigènes, par des anticorps, par des antibiotiques, par des hydrates de carbone, par des co-enzymes, par des cellules végétales, par des cellules animales, par des bactéries, par
des levures, par des champignons ou par des cultures tissulaires.
27 Composite selon la revendication 25, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est
constituée par une enzyme ou par des cellules entières.
28 Composite selon la revendication 25, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est l'aspartase. 29 Composi Le selon la revendication 25, caractérisé en ce que la substance biologique est constituée par des cellules entières de E coli qui contiennent de l'aspartase. Composite selon la revendication 25, caractérisé en ce que la substance biologique comprend de l'ammonia-lyase
de phénylalanine.
31 Composite selon la revendication 25, caractérisé en ce que la substance biologique comprend de
la synthétase de tryptophane.
32 Procédé de préparation de l'acide aspartique, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact, dans des conditions propres à produire de l'acide aspartique, un substrat, contenant du fumarate d'ammonium, avec un composite de substance biologique non solubilisé, constitué d'aspartase,ou de cellules microbiennes contenant de
l'aspartase immobilisé au sein d'un polymère de poly-
alkylène-imine condensé, les groupements amine des chaînes
du polymère de polyalkylène-imine étant pontés par un poly-
acide carboxylique.
33 Procédé de préparation de la phénylalanine, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact, dans des conditions propres à produire de la phénylalanine, un substrat, contenant de l'acide t-cinnamique et de l'ammoniaque, avec un composite de substance biologique non solubilisé, constitué d'ammonia-lyase de phénylalanine ou de cellules microbiennes contenant de l'ammonia-lyase de phénylalanine, immobilisé au sein d'un polymère de polyalkylène-imine condensé, les groupements amine des chaînes du polymère de
polyalkylène-imine étant pontés par un polyacide carboxylique.
34 Procédé de préparation du tryptophane, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact, dans des conditions propres à produire du tryptophane, un substrat, contenant de l'indole et de la sérine, avec un composite de substancebiologique non solubilisé, constitué de synthétase de tryptophane ou de cellules microbiennes contenant de la synthétase de tryptophane, immobilisé au sein d'un polymère de polyalkylène-imine condensé, les
groupements amine des chaînes du polymère de polyalkylène-
imine étant pontés par un polyacide carboxylique.
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