FR2476320A1

FR2476320A1 - Nouveau reactif immunologique pour la detection en tubes du facteur rhumatoide dans un echantillon biologique et procede de preparation de ce nouveau reactif

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Publication number: FR2476320A1
Application number: FR8003440A
Authority: FR
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Current assignee: Individual
Priority date: 1980-02-15
Filing date: 1980-02-15
Publication date: 1981-08-21
Also published as: GB2069694B; CA1168580A; GB2069694A; US4587222A; DE3105555C2; FR2476320B1; DE3105555A1; BE887494A

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN NOUVEAU REACTIF IMMUNOLOGIQUE POUR LA DETECTION EN TUBES DU FACTEUR RHUMATOIDE DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE ET UN PROCEDE DE PREPARATION DE CE NOUVEAU REACTIF. CE NOUVEAU REACTIF COMPREND UN COMPLEXE STABILISE FORME A PARTIR D'ANTIGENES GLOBULAIRES D'UNE PART ET D'ANTICORPS SOLUBLES A L'EGARD DE CES ANTIGENES GLOBULAIRES D'AUTRE PART, CE COMPLEXE STABILISE CONTENANT UNE QUANTITE RELATIVE D'ANTICORPS TELLE QUE LE SEUIL DE SENSIBILITE PAR RAPPORT AU SERUM STANDARD INTERNATIONAL DE POLYARTHRITE RHUMATOIDE DE L'OMS SE SITUE ENTRE ENVIRON 0,01 ET 1UIML, NOTAMMENT ENTRE ENVIRON 0,05 ET 0,30UIML.

Description

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NOUVEAU REACTIF IMMUNOLOGIQUE POUR LA DECTECTION EN

TUBES DU FACTEUR RHUMATOIDE DANS UN ECHANTILLON

BIOLOGIQUE ET PROCEDE DE PREPARATION DE CE NOUVEAU REACTIF

L'invention concerne un nouveau réactif permettant la mise en évidence in vitro du "facteur rhumatoMde" dans un sérum ou un échantillon biologique analogue, la technique

de mise en évidence elle-même, ainsi qu'un procédé de fa-

brication de ce réactif. On sait que le sérum des malades atteints de polyarthrite rhumatoide contient une globuline apparentée au

groupe de 82 macroglobulines qui sont appelées macroglobulines IgM.

Cette macroglobuline couramment appelée "facteur

rhumatolde" se caractérise en particulier par ses pro-

priétés agglutinantes ou hémagglutinantes vis-à-vis de complexes formés par des antigènes globulaires, notamment constitués par des globules rouges sanguins (ou hématies), et leurs iso-ou hétéro-immunsérums correspondants pris en doses sub-agglutinantes. C'est le principe de la réaction de WAALER-ROSE ou des réactions qui en dérivent et qui

sont considérées comme les plus spécifiques de la poly-

arthrite chronique évolutive (PCE).

Pour la clarté de l'exposé qui suit, il est pro-

posé d'emblée de définir ce que désigneront respective-

ment dans ce qui suit les expressions "agglutination" et "hémagglutination", d'une part, et "titre d'agglutination",

d'autre part.

Les expressions "agglutination" ou encore "agglu-

tination sur lame" seront utilisées pour désigner la ré-

action visible à l'oeil nu qui peut être observée sur une lame, lorsque l'on met en présence un réactif contenant

un complexe tel que défini ci-dessus avec un sérum conte-

nant le facteur rhumatoïde. On utilisera également en-

core l'expression "agglutination" lorsque l'on mettra en

contact des antigènes globulaires, notamment globules rou-

ges sanguins ou hématies, avec une dose d'immunsérum

suffisant à produire cette réaction d'agglutination.

On utilisera l'expression "hémagglutination" pour désigner le phénomène que constitue la formation d'un "tapis" ("mat pattern" selon l'expression anglaise courarmment ut-lisée pour dêsigner ce p-omn Lorsque l'on met en contact dans e tube une solution diluée du

susdit complexe avec une solution, généralement el!e-

même diluée, du sérum à tester lorsque celui-ci contient le facteur rhumatoide. Comme précgdemment le même phéno- mène peut être observé, lorsque l'on met en présence les

constituants initiaux entrant dPr2 la formation du nom-

plexe, c'est-à-dire l'antigène globulaire avec une dilu-

tion hyperhém'luaEt nantede l'immunsérum c rrespondant,

c'est-à-dire avec une dilution inférieure à celle qui cor-

respond au titre d'hémagglutinatLo., tel qu'il est défini

ci-après, donc avec un excès d'immunséruTn.

Au contraire, l'absence du facteur rhumatoide

dans le sérum testé ou encore la mise en contact de l'an-

tigène globulaire avec une dilution "sub-agglutinante" de l'immunsérumn, se traduisent par une simple sédimentation

des globules de l'antigène globulaire, ceux-ci se ccncen-

trant alors dans le fond du tube. Cette "hémagglutination",

ou au contraire cette "sédimentation" (traduisant l'ab-

sence d'hémagglutination) se reconnaissent aisément lorsque les mises en contact susdites sont effectuées dans les éléments de tubes des nicroplaques couramment utilisées dans les laboratoires. On sait que ces tubes comportent

en génére une partie-supérieure cylindrique et/ou se ter-

minant par un fond conique. Dans le cas de l'hémagglutina-

tion, on peut observer au bout d'un certain temps la for-

mation d'un "tapis" ("mat pattern")recouvrant en général sensiblement la totalité du fond conique, tandis qu'au

contraire la "sédimentation" se manifeste par la concen-

tration en un "bouton" étroit des antigènes globulaires à

l'extrême pointe de ces mêmes tubes.

L'expression "titre d'agglutination"' sera utilisée pour désigner la dernière dilution donnant sur lame des agglutinats visibles à l'oeil nu, en d'autres termes, la

dilution située juste avant la première dilution plus im-

portante qui n'induira plus la formation desdits aggluti-

nats (réaction négative).

De même, on désignera par "titre d'hémagglutina-

tion" la dernière dilution qui, en tube,conduit à la forma-

tion du susdit "tapis" ou "mat pattern", c'est-à-dire la dilution précédant celle plus importante, pour laquelle on

n'observera alors plus qu'une "sédimentation".

Le "titre d'agglutination" s'avère nettement plus faibleque le "titre d'hémagglutination", dans un rapport qui, approximativement, peut être de l'ordre de i à 40 dans le cas d'hématies de mouton formolées et de

sérum hémolytiaue de lapin anti-mouton.

Les deux techniques, à savoir "agglutination sur lame" et "hémagglutination en tube ou microplaque", sont

utilisées dans l'état de la technique.

La première technique (agglutination sur lame) est

aisée à mettre en oeuvre. L'agglutination donne une indi-

cation qualitative rapide de la présence ou non dans le sé-

rum testé du facteur rhumatoide.

La deuxième technique (hémagglutination en tube ou microplaque) est capable de donner en outre des indications

approximativement quantitatives quant à la teneur du fac-

teur rhumatoide du sérum testé, notamment grâce à la dé-

termination possible du seuil de dilution qui sépare celle des dilutions la moins élevée qui entraîne la formation du

"tapis" ou "mat pattern" et cellesdes dilutions plus éle-

vées, pour lesquelles on observe une sédimentation.

Il est bien connu que l'une des difficultés que l'on a rencontrées dans le passé en ce qui concerne le test sur lame, et qui dans la pratique n'est pas à ce jour

résolue dans le cas des tests en tubesou microplaques, con-

sistent dans l'instabilité des complexes naturels que

forment les antigènes globulaires ou hématies avec les an-

ticorps des immunsérums correspondants.

Cette difficulté a été surmontée dans le cas des

réactifs destinés aux tests sur lame.

Il est connu que MILGROM et ses collaborateurs (Arthritis and Rheumatism.. 7 (1) pages 1 à 7 (1964)) ont proposé, pour tenter de remédier aux difficultés de mise en oeuvre du test sur lame initialement mis au point par WAALER et ROSE, d'avoir recours à un complexe formé d'hématies de mouton qui avai '- auparavant été soumises

à un traitement de formolation et d'un sérum de lapin anti-

hématies de mouton, pris à une dilution quatre fois infé-

t4o rieure à la dilution la plus élevée induisant, dans un dosage en tube, une hémagglutination en tapis (en d'autres

termes, quatre fois inférieure au titre d'hémagglutination).

selon MILGROM, le réactif obtenu peut être conservé pendant quelque temps, notamment deux mois, à 40C, ou à l'état congelé, sans pertes appréciables d'activité sérologique. Toujours selon ces auteurs, le réactif ainsi formé permet, lorsqu'il est mis en contact sur lame avec un sérum humain

dilué vingt fois au sein d'un tampon isotonique de chlo-

rure de sodium, de déceler la présence du facteur rhuma-

toide, par agglutination de ce réactif lorsque le facteur

rhumatolde est présent, après un maintien au repos du mé-

lange à la température ambiante pendant une durée de cinq à dix minutes. Une telle réaction reste cependant trop lente dans la pratique, surtout si l'on tient compte de la vitesse avec laquelle le milieu liquide de suspension tend à s'évaporer, à partir de l'instant o le mélange est

placé sur la lame.

Le brevet français no 1.484.727 et son certifi-

cat d'addition no 92.415 décrivent un réactif perfectionné permettant cette fois-ci une réaction quasi instantanée sur lame lorsque le facteur rhumatoide est présent dans le sérum testé. Il se caractérise par la présence, dans le complexe antigène-anticorps soluble, d'une concentration beaucoup plus élevée en anticorps, ce qui peut être atteint grâce aux procédés perfectionnés décrits dans ces titres de

propriété industrielle, procédés qui consistent à sou-

mettre le complexe préalablement formé entre l'immun-

sérum et les antigènes globulaires, notamment hématies de mouton (lesquelles avaient antérieurement subi ou non un traitement par le formol ou un aldéhyde analogue), à un post-traitement de stabilisation par le formol ou aldéhyde

analogue. Ce perfectionnement présente un caractère essen-.

tielen ce que le réactif formé est d'une utilisation aisée, la réaction recherchée, lorsqu'elle se produit, s'effectuant avant que le mélange étalé sur la lame ait eu

le temps de sécher.

Si le problème de la réalisation d'un réactif efficace et stable a été résolu de façon satisfaisante

pour ce qui est des tests de diagnostic sur lame de la pré-

sence ou non du facteur rhumatoïde, il n'en est pas toujours encore ainsi pour ce qui concerne les réactifs utilisés pour le test en tubes ou microplaques. En effet, les réactifs

décrits dans la Liitérature pour le test sur lamne présen-

tent la caractéristique de donner lieu spontanément à la formation des hémagglutinations en tapis,en présence ou non du facteur rhumato7de. Ils sont donc inutilisables dans des essais de détection de ce facteur dans des sérums

susceptibles de le contenir, voire d'en être exempts.

Certes MILGROM rapporte des essais préliminaires mettant en jeu des hématies prétraitées par le formol et sensibilisées par une dilution subhemagglutinante d'un

sérum de lapin anti-mouton. La technique décrite n'est ce-

pendant jamais entrée dans la pratique, ne serait-ce que pour le motif que]a teneur en anticorps du complexe ainsi

f'-rm;é est excessivement faible, en raison de la déspéci-

fication importante des sites antigéniques initialement présents dans .s hématies, sous l'effet de la formolation

antérieure desdites hématies.

De toute façon, un tel réactif n'était pas de nature à discriminer sérieusement le facteur.rh-.umatoide,

éventuellement présent, des hétéro-anticerps naturels (anti-

hématies de mouton ou anticorps de FORSMA;)présents dans tous les sérums humains à des titres élevés, dont on connaît

la capacit_ qu'ils ont d'également produire des hémaggluti-

nations, et ce, même si on a eu soin de procéder à une ad-

sorption préalable des sérums à tester dans le but d'éli-

miner les anticorps parasites.

L'invention a pour but de remédier aux difficul-

tés qui précèdent, plus particulièrement de fournir un réactif à la fois stabilisé et sélectif pour la détection

du facteur rhumatoide dans des essais en tubes ou micro-

plaques mettant en jeu une hémagglutination, sans qu'il soit nécessaire de procéder dans des gammes de dilution extrêmes du sérum et de lui faire subir une adsorption préalable des anticorps parasites susceptibles de masquer

le facteur rhumatoide.

Le complexe stabilisé selon l'invention, formé à partir d'antigènes globulaires, notamment d'hématies,d'une

part, et d'anticorps solubles à l'égard de ces anti-

antigènes globulaires, tels qu'ils sont susceptibles d'être fournis par un immunsérum préparé au-préalable à l'égard desdits antigènes globulaires, d'autre part, ce comriplexe étant approprié pour la détection du facteur rhumatoîde dans des essais en tubesou microplaques, est caractérisé en ce qu'il contient une quantité relative d'anticorps conférant à ce complexe un seuil de sensibilité par rapport au Sérum Standard International de polyarthrite rhumatoïde de l'COMS se situant entre environ 0,01 et 1 UI/ml, notamment entre environ 0,05 et 0,30 UI/ml, ce qui correspond corme seuil de détection du facteur rhumatoide dans un sérum dilué au 40ème respectivement aux intervalles

d'environ 0,4 à 40 UI/ml et d'environ2àl2UI/ml, et en ce qu'il est sta-

bilisé au point de ne pas donner lieu à une hémagglutination spontanée en l'absence de facteur rhumtoide, notanmnt en présence d'un sérum exempt

de facteur rhumatoide.

Le complexe selon l'invention peut également être défini pour ce qui est de la teneur relative en anticorps qu'il retient par rapport à la teneur relative maximum qui peut être fixée sur des antigènes globulaires

analogues n'ayant pas subi le traitement conforme au procédé selon 1 'in-

vention, tel qu'il sera défini plus loin, en l'absence d'hémagglutination.

En particulier, la teneur relative en anticorps du complexe selon 1 'inven-

tion se situe entre environ 2 et environ 20, de préférence environ 3 et

environ 10 unités h&megglutinantes, etart entendu cue 'unrité hnmaggluti-

nante correspond à la teneur relative en anticorps susceptible d'être rete-

nue par les antigènes globulaires correspondants n'ayant pas

subi de traitement selon l'invention, en l'absence d'h(magglu-

tination. Le procédé selon l'invention pour obtenir le

complexe si -indiqué est caractérisé en ce que les anti-

gènes globulaires retenus et qui serviront de support pour les anticorps provenant d'immunsérums correspondants font l'objet:

-d'au moins deux traitements successifs avec deux agents res-

pectivement distincts du type aldéhyde ou agent tannant du type de ceux

qui sont capables de former avec l'hnémoglobine des hématies une combinai-

son entrainant une transformation cbimioue de 1 'hémoglobine, notamment sous forme d'un composé brunâtre, le premier et, éventuellement même le second de ces traitements étant effectués avant la mise en

contact de ces antigènes globulaires avec les anticorps des-

tinés à être retenus sur ceux-ci et, - un traitement par au moins une substance notamment de type protidique telle que l'albumine ayant des propriétés dispersives,

c'est-à-dire permettant à cette substance d'entrer en compéti-

tion avec les anticorps sensibilisants: - en se fixant sur la membrane du globule rouge; - ou en se combinant avec les anticorps dans le cas o le complexe immunologique globules rouges (ayant subi un traitement avec un agent du type aldéhyde ou avec un agent tannant)-anticorps est traité par un agent du type aldéhyde

ou par un agent tannant en présence d'albumine.

Le traitement avec la substance telle que l'albumi-

ne peut être réalisé simultanément avec le traitement final par le premier type d'agent sus-mentionné (ou tout traitement

avec un tel agent en sus des deux traitements minima envisa-

gés ci-dessus) ou séparément à titre de traitement final.

Avantageusement, les agents du type aldéhydeou agent de tan-

nage sont choisis parmi l'aldéhyde formique, le glutaraldéhyde, l'aldéhyde pyruvique ou aldéhyde analogue, l'agent préféré

étant le glutarald.éhyde ou encore, en ce qui concerne plus par-

ticulièrement les agents tannants, l'acide tannique, les ta-

nins végétaux et synthétiques, la para benzoquinone, l'acide

sulfosalicylique, les substances tannantes d'origine miné-

rale telles que sels de chrome, chlorure de chrome, zirconium, silicate de soude, hyposulfite de soude, etc. En ce qui concerne le deuxième type de substance,

on peut avoir recours à la place de l'albumine, plus par-

ticulièrement à la sérum-albumine boeine à d'autres substances de

même nature albuminoide en particulier au sérum d'autres es-

pèces animales ou au sérum humain ou à des fractiors albumine

a et e globulines isolées de ces sérums, ou à l'une quelcon-

que des protéines Su lait ou; l'un quelconque do leur mé-

lanqo.

D'autres substances peuvent jouer à un degré moin-

dre un rôle uniquement dispersant en particulier dans la zone

de sensibilisation comprise entre 2 et 5 unités hémagglutinan-

tes de sérum hémolytique; ce sont le polyvinyle pyrrolidone connu notamment sous la désignation Subtosan, les émulsifiants de type anionique, cationique ou non ionique, le déplacement

vers les pH alcalins jusqu'à environ 9,2 pouvant être avanta-

geux. Avantageusement, le traitement avec la substance

protidique et dispersante est effectué à une température-supé-

rieure à 370C, de préférence entre 50 et 60WC à un pH compris entre environ 7 et environ 8,5. De même, les traitements avec

les aldéhydes ou agents tannants, de préférence le dernier de-

ces traitements, sont effectués dans les mêmes conditions de

température et de pH.

Ces divers traitements s'effectuent en suspension,

les concentrations relatives des agents mis en oeuvre corres-

pondant avantageusement à celles qui sont indiquées plus loin

dans les exemples.

L'invention prend avantage de l'effet inattendu in-

duit par l'albumine ou autre substance protidique ou disper-

sante, et en particulier de la combinaison de l'albumine, ou

d'une autre substance-protidique ou dispersante avec le glu-

taraldéhyde, notamment lorsqu'elle est utilisée dans les con-

ditions qui ont été définies ci-dessus, de déplacer vers les

faibles dilutions le seuil au-délà duquel il n'est plus pos-

sible d'éviter l'hémagglutination spontanée à bref délai des complexes formés par la mise en contact des teneurs relatives correspondantes d'antigènes globulaires, notamment d'hématies, et d'anticorps correspondants, sans pour autant influencer de

façon défavorable la sensibilité du réactif ainsi formé vis-

à-vis du facteur rhumatoide dans des tests en tubes. La plus forte teneur en anticorps du réactif selon l'invention permet

par conséquent de discriminer de façon très sélective le fac-

teur rhumatoide éventuellement présent des hétéro-anticorps, antihématies d'origine étrangère ou anticorps de FORSMAN

présents dans les sérums humains.

L'invention concerne donc également un procédé de détection du facteur rhumatoide ou analogue, caractérisé par la mise en présence du complexe tel que ci-dessus défini avec

un sérum d'étude (ou autre échantillon biologique, en parti-

culier liquide articulaire) dans des tubes ou analogues et

par la détection ou non d'une hémagglutination dispersée se-

lon que le sérum contient ou non le facteur rhumatoide. Le procédé de détection est avantageusement mis en oeuvre dans des conditions semblables à celles qui ont déjà été proposées dans le passé pour la détection en tubes ou microplaques des complexes hématies-anticorps préparés de façon extemporanée, le réactif et le sérum ou analogue

à étudier étant éventuellement dilués au préalable, cepen-

dant sans qu'il soit nécessaire de réaliser une adsorption préalable de l'échantillon à tester en vue d'en éliminer les

anticorps parasites.

La présence du facteur rhumatoide dans le sérum d'un

patient se traduit au contraire par une absence de sédimenta-

tion et plus particulièrement par la formation de tapis d'hé-

maties sensibilisées après quelques heures de contact au sein d'une solution tampon, notamment à pH sensiblement neutre, du moins jusqu'à un degré ou seuil de dilution déterminé. Ce degré ou seuil fournit également une indication quantitative quant à la teneur en facteur rhumatoide susceptible d'être

présente dans le sérum étudié.

Des caractéristiques supplémentaires de l'invention

25. apparaîtront encore au cours de la description non limitative

qui suit de réactifs conformes à l'invention et de leurs modes d'élaboration.

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1 ) Choix des réactifs.

Le complexe selon l'invention peut être obtenu à partir de tout globule rouge et de tout sérum hémolytique sensibilisant, tel que ceux figurant au tableau ci-après: Globules rouges Sérume sensibilisants A ou B Iso immun-sérum anti A ou anti B O Rh+ (CD) Sérum anti-Rh Mouton Lapin antimouton Mouton Lapin anti-chèvre Chèvre Lapin anti-chèvre Chèvre Lapin anti-mouton Boeuf Lapin anti-boeuf Cobaye Lapin anti-cobaye Poule Lapin anti-poule Mouton Cobaye anti-mouton Mouton Cheval anti-mouton Souris Lapin anti-souris Cobaye Lapin anti-cobaye Mouton Cobaye anti-mouton Cheval Cobaye anti-cheval Boeuf Cobaye anti-boeuf Mouton Iso immun-sérum de mouton Mouton Chèvre anti-mouton Cynocéphale Lapin anti-cynocéphale Chat Lapin anti-chat

x ORh + (CD): système rhésus se caractérisant par la pré-

sence, dans les globules rouges, des paires de gènes allé-

lomorphes dénommés CD.

Le système globules rouges humains O Rhésus négatif-sé-

rum de lapin anti-globules rouges humains s'avère particulièrement

intéressant d'après les essais effectués sur ce complexe.

) Préparation des globules rouges.

Le sang de mouton est prélevé de façon stérile

sur un agent anti-coagulant tel que l'acide éthylène-

diamine tétraacétique (E.D.T.A.) (connu également sous le nom de "Complexon III") en solution à lg/l dans du sérum physiologique à 9 g/l. On peut également avoir recours à d'autres agents anticoagulants comme par exemple le citrate

de sodium.

Les globules fraîchement recueillis (9 volumes pour un volume d'E.D.T.A.) sont aussitôt lavés 4 fois au moyen

de sérum physiologique (9g ClNa/litre). Si le liquide sur-

nageant présente encore de l'hémolyse (ce qui peut être véri-

fié au colorimètre à 530 Tp) on effectue un ou plusieurs

lavages supplémentaires.

Les globules rouges lavés peuvent alors être soit remis en suspension dans du sérum physiologique à 10%, en vue de sa mise en contact ultérieure avec l'immun-sérum ou encore, et de préférence, être au préalable soumis à un pré-traitement.par le formol ou encore par un agent apte à fournir des tanins; notamment en opérant comme suit

Prénaration des formules rouges formolés.

2 un vorume de globules rouges de

Jt 1 mouton en sus-

pension entre 5 et 15% dans du sérum physiologique (solu-

tion à 9g/l de ClNa) on ajoute un volume égal d'une solution de formol diluée entre 1 et 5 % dans du sérum physiologique (le formol appliqué étant un formol à 40 % préalablement neutralisé jusqu'à pH 7,2 au moyen d'une solution normale

de soude).

On fait incuber la suspension sous agitation lente et constante à une température comprise entre 25 et 560C

pendant douze à vingt deux heures suivant les lots. On pro-

cède ensuite à 2 ou 3 lavages au moyen de sérum physiolo-

gique.

4 ) Préparation du sérum hémolytique de lapin anti-mouton. Les globules rouges frais de mouton préparés de la façon décrite ci-dessus sont dilués au moyen de la moitié

de leur volume de sérum physiologique.

On injecte à un lapin 4 ou 5 fois, à une semaine

d'intervalle, 3 ml de ces globules rouges par voie sous-

cutanée puis on procède à deux injections par voie intra-

* veineuse. Après vérification du titre du sérum, on prélève le sang de l'animal par ponction de la carotide, une

semaine après la dernière injection.

Après coagulation du sang, on recueille le sérum

que l'on chauffe à 56 C pour détruire le complément.

On conserve alors le sérum dans des ampoules

stériles à +40C.

) AIustement du titre du sérum hémolytigue_ On utilise ce sérum hémolytique complet de lapin anti-mouton ou la fraction IgG qui est obtenue à partir de

ce sérum par des procédés biochimiques connus.

Pour déterminer le titre hémagglutinant du sérum,

on pratique une série de dilutions en progression géomé-

trique du sérum hémolytique à étudier (ou de la fraction

IgG) sous un volume de 50 'pl de 1/40ème) à 1/40000ème.

On introduit une microgoutte de 16 à 25 pl d'hématies

formolées (ou encore par exemple d'hématies formolées trai-

tées au glutaraldéhyde ou d'hématies formolées traitées à l'acide tannique). La concentration des hématies se situe

entre 0,5et2,5 % (volume du culot d'hématies mesuré vis-à-

vis du tampon véhicule à V/V).

Le titre du sérum correspond à l'inverse de la dernière dilution présentant une absence de sédimentation

des hématies. Au titre mesuré,par exemple 1/5000e, cor-

respond 1 unité hémagglutinante. La. sensibilisation décrite ci-Erès des hématies sera effectuée en excès d'anticorps de 2 à 20 unités hémagglutinantes, soit du 1/2500e au

1/250e selon la sensibilité souhaitée.

62 Stabilisation du complexe immunologique formé

parla_c_.ojnbinaison d'hématies formolées et des anticorps.

anti-hématies de l'espèce correspondante.

La formolation des hématies telle que décrite dans le brevet et le certificat d'addition susdits, est insuffisante pour assurer la stabilité définitive du

complexe pendant une longue période, vis à vis de l'hémagglu-

tination spontanée, compte tenu du grand excès d'anticorps utilisé. La formolation à haute température 50 - 56 C permet d'améliorer la résistance des hématies.Mais pour

assurer une stabilité de très longue durée il est indispen-

sable selon l'invention de pratiquer un deuxième traitement par le formol ou par une autre substance aldéhydique tel que

le glutaraldéhyde ou une substance telle que l'acide.tanni-

que, ayant des propriétés tannantes, en pré-

sence d'albumine ou d'une protéine ayant des propriétés équivalentes.

Les exemples suivants sont donnés à titre illus-

tratif et nullement limitatif.

ler exemple: Des globules rouges de mouton formolés, tels que ceux obtenus sous 3 ) ci-dessus sont remis en suspension entre 5 et 10% dans du sérum de lapin anti-mouton ou la fraction IgG purifiée de ce sérum, lui-mame dilué à Ome concentration

JO de 5 à 20 unités hémagglutinantes en tampon phosphaté 7,2.

Le canomplexe globules rouces anticornDs est alors trai-

té par un volume de glutaraldéhyde à la concentration de 0,1 à 3 % ou de solution d'acide tannique à la concentration de 0,010 à 0,05 % en tampon phosphaté 7,2 contenant de 1 g à 10 g/l d'albumine bovine à une température au moins égale à 37 C et de préférence comprise entre environ 50 C et 56 C

pendant un minimum d'une heure.

Le complexe stabilisé obtenu est lavé plusieurs fois en tampon phosphaté 7,2 contenant 3 g/l d'albumine bovine, puis finalement repris à la concentration de 0,5 à 2,5 % dans une solution de tampon phosphaté de pH 7,2 à 8,2 contenant de l'albumine bovine à la concentration de 1 à 10 g/1 puis finalement repris dans une solution de tampon phosphaté de pH 7,2

à 8,2 contenant de l'albumine bovine à la concentration de 1 à 10 g/l.

Les agents conservateurs utilisés peuvent être le merthiolate à 0,1 g/l, connu notanment sous la désignation Merseptyl ou l'azide de sodium à

1 g /0o. D'autres agents conservateurs pourront également être utilisés.

Une suspension d'hématies témoins non sensibilisées sera ajus-

tée dans les mêmes conditions de 0,5 à 2,5 % dans une solution de tampon

phosphaté de pF 7,2 à 8,2.

2ème exemple.

Les globules rouges formolés tels qu'obtenus sous 3 sont remis en susrension 5 et 10 % dans un tamDon phosphaté de oH 7,2. Cette susoen-

sion est traitée avec un volume soit d'une solution de glutaraldéhyde à la concentration de 0,1 à 3% en tampon phosphaté de pH 7,2 pendant au moins une 1/2 heure, soit d'une solution d'acide tannique de 0,010 à 0, 05% dans le même tampon phosphaté 7,2 pendant au moins une 1/2 heure, à la température de 37 C. On procède ensuite à plusieurs

lavages en tampon phosphaté.

Les hématies ainsi traitées sont remises en sus-

pension entre 5 et 10 % dans du sérum de lapin anti-mouton ou la fraction IgG purifiée de ce sérum lui-meme dilué à une concentration de 2 à 5 unités hémagglutinantes en tampon phosphaté 7,2 contenant de 1 à 10 g. d'albumine

bovine par litre.

L'ensemble est chauffé sous agitation continue

pendant au moins une 1/2 heure entre 50 et 56 C.

On procède à plusieurs lavages en tampon phos-

phaté 7,2.

Le complexe immunologique ainsi stabilisé sera finalement remis en suspension à la concentration de 0,5 à 2,5 % dans une solution de tampon phosphaté de pH 7,2 à 8,2 contenant de l'albumine bovine à la concentration de 1 à 10 g/l, ou dans une solution de sérum de lapin normal à la concentration de 1 à 10 % (V/V) ou dans une solution de

Merseptyl à 0,1 g %ou d'azide de sodium à 1 g 0/o -

DESCRIPTION DE LA NOUVELLE TCHNIQUE D'HDFAGGLUTINATION DIRECE EN

microplaques pour le titrage du "Facteur Rhunatoide".

Avec le réactif stabilisé selon l'invention il est possible de réaliser une nouvelle méthode de titrage du facteur rhumatoide par exemple en microplaques de type connu sous la désignation commerciale "Microtiter System". Les caractéristiques et les avantages du nouveau procédé de titrage ressortiront plus clairement de la

description qui va suivre:

On utilise des microplaques en matière plastique

munis d'alvéoles cylindriques dans leur partie supé-

rieure et dont le fond est conique (en V). On peut également

4 7532C

utiliser des plaques munies d'alvéoles dont le fond est en forme de U ou encore des tubes de verre ou en matière plastique dont le fond est en U. Pour les dilutions du sérum on utilise une solution de tampon de pH 6 à 8, 2; on peut utiliser tous les types de tampon connus, tampon phosphaté, tampon tris, tampon glycocolle, avec ou sans adjonction d'albumine, etc. Le tampon phosphaté de pH 7,2 est particulièrement bien adapté.

On peut alors procédér comme suit.

0I ) On effectue une dilution mère au 1/20ème du sérum à examiner. On place 50 pl du sérum dans un tube de Kahn à

usage unique et on ajoute 950 4l de solution tampon.

2 ) On distribue à l'aide d'une micropipette 50 pil de solution tampon dans les 12 alvéoles d'une rangée d'une plaque "microtiter system". On place 50 pl de la dilution mère du sérum dans la lère alvéole, on mélange avec le tampon et on transfère 50 pl de la lère alvéole dans la 2ème, puis après mélange dela2ème dans la 3ème et ainsi de suite jusqu'à la llème. On rejette enfin 50 pl de la 11ème. On obtient ainsi par les dilutions suivantes: lère 2é 3e 4e 5e 6e 7e 8e 9e

1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240

e 11 e

1/20480 1/40960

On introduit dans la 12e alvéole 50 pl de la dilution mère

du sérum au 1/20e. On mélange avec le tampon et on rejette 50 pl.

Cette dilution au 1/40e est additionnée d'une microgoutte (1/60e ml) d'un réactif d'"hématies témoins" (hématies ayant subi les mêmes traitements que celles contenues dans le réactif

témoin, à l'exception de la sensibilisation par l'immun-

sérum anti-hématies). Le mélange obtenu constitue le témoin sérum. On dépose une microgoutte (1/60e ml) du réactif hématies sensibilisées stabilisées dans les.11

alvéoles.

On agite la plaque afin d'assurer une bonne

homogénéisation puis on laisse la plaque immobile à tem-

pérature ambiante à l'abri des vibrations pendant toute la

durée du test.

24 6320

On effectue la lecture environ 2 heures après.

Interprétation des résultats: Réaction positive: absence de sédimentation des hématies. Réaction négative: bouton punctiforme d'hématies sédimentées. Le titre du sérum en facteur rhumatoide correspond à la plus forte dilution du sérum pour laquelle on observe

une absence de sédimentation des hématies. La stabilité pro-

longée du complexe immunologique capable de révéler le "fac-

teur rhumatoïde" au moins 2 ans à + 4 C a permis de réaliser

un préétalonnage de ce réactif, selon la méthode décrite ci-

dessus pour tester les sérums humains, par rapport au sérum standard in-

ternational de polyarthrite rhumatoide de l'OMS défini dans Bull. Who (S.

G. AIDERSON, MW Bentzon, V. Houba P. KRAG: International reference prepa-

paration ofrheumatoidarthritis serum, Bull.Who 42: 311, 1970).

L'étalon international en poudre de 17,1 mg qui correspond à UI est repris dans 4 ml de solution tampon phosphaté de pH 7,2 soit une concentration de 25 UI/ml. La solution est ensuite r4nartie dans une

série de tube cqui seront conservés au congélateur à -20 C.

On réalise sous En volume de 50 microlitres corme pour les

sérums étudiés une série de dilutions de l'étalon en micro-

plaques à partir de 1/8e, 1/16e, 1/32e, 1/64e, 1/128e, 1/256e,

1/512e, 1/1 024e, 1/2 048e, en tampon phosphaté 7,2. On intro-

duit dans chaque alvéole une microgoutte (1/60e ml) du réactif hématies sensibilisées dont le titre est à déterminer. Le

seuil de sensibilité limite correspond à la plus forte dilu-

tion de l'étalon présentant une hémagglutination des hématies.

Par exemple, si la dilution est 1/256e, le titre de la préparation d'hématies sensibilisées sera de 25: 256 = 0,1 UI/ml, ce qui correspond pour un sérum dont la première dilution étudiée est de 1/40e

à une sensibilité de 4 UI/ml. Ainsi le titre du sérum en fac-

teur rhumatoide peut être exprimé directement en UI/ml.

Ainsi, par exemple, une réaction positive limite au

1/1 280e correspond-elle, lorsqu'on opère une série de dilu-

tions avec un lot de réactifs stabilisés dont le seuil de sen-

sibilité est de 0,1 à 128 UI/ml 7 comme il résulte du ta-

bleau suivant, dans lequel les rapports indiqués représentent des dilutions et les nombres

?47532C

indiqués en UI/ml représentent chacun des concentrations correspondantes de facteur rhumatoide, qui seraient décelées dans la mesure ou la dilution correspondante serait représentative d'une "réaction

positive limite".

UI/ml : UI/ml 1/40e........ 1/80e....... 1/160e........ 1/320e........ 1/640e........ : 4: ::

: 8:4

::

: 16:

: 32:

: 64:

::

1/1 280e.....

1/2 560e.....

1/5 120e.....

1/10 240e....

1/20 480e....

1/40 960e....

_______________

* 128

: 256 : 512 1 024 2 048

: 4 096

?476320

REMDICATIONS

1. Complexe stabilisé formé à partir d'antigènes globulaires, notamment d'hématies, d'une part, et d'anticorps solubles à l'égard de oes antigènes globulaires, tels qu'ils sont susceptibles d'être fournis par un immunsérum préparé au préalable à l'égard desdits antigènes glo- bulaires, d'autre part, ce complexe étant approprié pour la détection

du facteur rhumatoide dans des essais en tubes ou microplaques, caracté-

risé en ce qu'il contient une quantité relative d'anticorps conférant à

ce ccmplexe un seuil de sensibilité par rapport au sérum standard inter-

national de polyarthrite rhumatoïde de 1 'CM4S se situant entre environ

0,01 et 1 UI/ml, notamment entre environ 0,05 et 0,30UI/ml ce qui cor-

respond cutoe seuil de détection du facteur rhumatoïde dans un sérum di-

lué au 40ère respectivement aux intervalles d'environ 0,4 à 40 UI/ml et d'environ2à 12 UI/ml, et en ce qu'il est stabilisé au point de ne pas 'donner lieu à une hémagglutination spontanée en 1 'absence de ce facteur

rhumatoïde, notamment en présence d'un sérum exempt de facteur rhumatoïde.

2. Complexe stabilisé formé à partir d'antigènes glo-

bulaires, notamment d'hématies, d'une part, et d'anticorps so-

lubles à l'égard de ces antigènes globulaires, tels qu'ils sont

susceptibles d'être fournis par un immunsérum préparé au préa-

lable à l'égard desdits antigènes globulaires, d'autre part,

ce complexe étant approprié pour la détection du facteur rhu-

matoide dans des essais en tubes ou microplaques, caractérisé en ce que la teneur relative en anticorps qu'il retient 'our rapport à lo teneur relative maximum qui peut etrc fixée sur des antigènes globulaires analogues se situe entre environ

2 et environ 20, de préférence environ 3 et environ 10 unités-

hémagglutinantes. 3. Procédé de préparation de complexe stabilisé

selon les revendications 1 à 2, caractérisé en ce que les an-

tigènes globulaires retenus et qui serviront de support pour les anticorps provenant d'immunsérums correspondants font l'objet:

- d'au moins deux traitements successifs avec deux agents res-

pectivement distincts du type aldéhyde ou agent tannant du type de ceux qui sont capables de former avec l'hémoglobine des hématies une combinaison entrainant une transformation chimique de l'hémoglobine, notamment sous forme d'un composé brunâtre, le premier et, éventuellement même le second de ces traitements étant effectués avant la mise en contact

?476320

de ces antigènes globulaires avec les anticorps destinés à être retenus sur ceux-ci et, - un traitement par au moins une substance notamment de type

protidique telle que l'albumine ayant des propriétés disper-

sives, c'est-à-dire permettant à cette substance d'entrer en compétition avec les anticorps sensibilisants: - en se fixant sur la membrane du globule rouge; - ou en se combinant avec les anticorps dans le cas o le complexe immunologique globules rouges (ayant subi un traitement avec un agent du type aldéhyde ou avec un agent tannant)-anticorps est traité par un agent du type aldéhyde

ou par un agent tannant en présence d'albumine.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le traitement avec la substance telle que l'albumine peut être réalisé simultanément avec le traitement final par le premier type d'agent sus-mentionné -ou tout traitement avec un tel agent en sus des deux traitements minima selon la

revendication 3- à titre de traitement final.

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le traitement peut être réalisé séparément du traitement avec le premier type d'agent sus-mentionné -ou tout traitement avec un tel agent en sus des deux traitements minima selon la

revendication 3- à titre de traitement final.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications

3 à 5 caractérisé en ce que les agents du type aldéhyde sont

choisis parmi l'aldéhyde formique, le glutaraldéhyde, l'aldé-

hyde pyruvique ou aldéhyde analogue, l'agent préféré étant le glutaraldéhyde. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé

en ce que l'agent du type aldéhyde est le glutaraldéhyde.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 3 5 ', caractérisé en ce que l'agent tannant est choi-

si parmi l'acide tannique, les tanins végétaux et synthéti-

ques, la para benzoquinone, l'acide sulfosalicylique, les substances tannantes d'origine minérale telles que sels de chrome, chlorure de chrome, zirconium, silicate de soude,

hyposulfite de soude.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications

3 à 8, caractérisé en ce que le deuxième type de substance est constitué par l'albumine notamment l'albumine bovine, par d'autres substances de même nature albuminoide en particulier le sérum d'autres espèces animales ou par du sérum humain ou

des fractions albumines a et globulines isolées.de ces sé-

rums ou par l'une quelconque des protéines du lait ou par

l'un quelconque de leur mélange.

1C. Procédé selon l'une quelconque des&revehdications-

3 - 9, caractérisé-en ce que la substance ayant des proprié-

tés dispersives est choisie parmi le polyvinylepyrrolidone,

les émulsifiants de type anionique, cationique ou non ionique.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications

3 à 10, caractérisé en ce-que le traitement avec la substance-

électronégative et dispersante est effectué à une température supérieure à 37 C, de préférence entre 50 et 60-C à un pH

compris entre environ 7 et environ 8,5.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications

3 à 11, caractérisé en ce que les traitements avec les aldéhy-

des ou agents tannants, de préférence le dernier de ces trai-

tements, sont effectués dans les conditions de température

et de pH définies selon la revendication 11. -

13. -rocéeé de ao tection Au eacteur rhumato d.e ou -

analogue, caractérisé par la mise en présence du complexe -

tel que-défini selon les revendications 1 et 2, avec un se-:

rum d'étude (ou autre échantillon biologique, en particulier -

liquide articulaire) -dans des tubes ou analogues et par la détection ou non d'une hémagglutination dispersée selon que

le sérum contient ou non le facteur rhumatoide.

14. Procédé de détection selon la revendication 13 = caractérisé en ce qu'il est-mis en oeuvre dans des conditions semblables à celles qui ont déjà été proposées dans le passé

pour la détection en tubes ou microplaques des complexes -

hématies-anticorps préparés de façon extemporanée, le ri.Ptif

et le sérum -ou analogue à étudier étant éventuèllemertt dilués -

au préalable, cependant sans qu'il soit nécessaire de réaliser une adsorption préalable de l'échantilloh à tester en vue d'en éliminer les anticorps parasites. -:

24,7632C

15. Procédé de détection selon les revendications

13 et 14, caractérisé en ce que la présence du facteur rhu-

matoide dans le sérum d'un patient se traduit par une absen-

ce de sédimentation et plus particulièrement par la formation de tapis d'hématies sensibilisées après quelques heures de

contact au sein d'une solution tampon, notamment à pH sensi-

blement neutre, du moins jusqu'à un degré ou seuil de dilu-

tion déterminé.