FI99116C - Process for producing horse interferon - Google Patents

Abstract

The invention relates to a process for the preparation of equine interferon gamma (EqIFN- gamma ), DNA sequences which encode this polypeptide, suitable vectors and host organisms which contain these DNA sequences, and EqIFN- gamma itself. The invention also relates to DNA part-sequences which encode polypeptides which differ structurally from the natural EqIFN- gamma polypeptide. The use of the proteins is also described.

Description

- 99116- 99116

Menetelmä valmistaa hevosen γ-interferonia Käsillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa hevosen γ-interferonia (hevosinterferoni-γ, EqIFN-γ), tätä polypep-5 tidiä koodaavat DNA-sekvenssit, näitä DNA-sekvenssejä sisältävät sopivat vektorit ja isäntäorganismit sekä itse EqIFN-γ. Käsillä olevan keksinnön kohteena ovat edelleen DNA-osasekvenssit, jotka koodaavat polypeptidejä, jotka eroavat rakenteellisesti luonnonmukaisesta EqlFN-γ-polypeptidistä. Kuvauksen koh-10 teenä on myös proteiinien käyttö.The present invention relates to a process for the preparation of equine γ-interferon (equine interferon-γ, EqIFN-γ), DNA sequences encoding this polypeptide, suitable vectors and host organisms containing these DNA sequences, and EqIF itself. γ. The present invention further relates to DNA subsequences encoding polypeptides that are structurally different from the native EqIFN-γ polypeptide. The description also targets the use of proteins.

Interferonit ovat proteiineja, joita erittyy eukaroyyttisoluis- ta virusinfektioiden ja muiden ärsytysten jälkeen ja jotka toisaalta voivat suojata soluja virusinfektiolta. Toistaiseksi 15 tunnetaan kolme interferoniluokkaa: näistä käytetään nimityksiä interferoni-a, interferoni-β ja interferoni-γ (lyhennettynä ^ IFN-a, IFN-β ja IFN-γ) . Nämä eroavat toisistaan rakenteeltaan .·. : ja vaikutuksiltaan. Interferonit voivat siten vaikuttaa immuu- • « nijärjestelmän soluja tai myös soluen erikoistumista ja tuumo-/•2 0 rin kasvua säätelevästi.Interferons are proteins that are secreted from eukaryotic cells after viral infections and other stimuli and, on the other hand, can protect cells from viral infection. So far, three classes of interferon are known: these are referred to as interferon-α, interferon-β, and interferon-γ (abbreviated ^ IFN-α, IFN-β, and IFN-γ). These differ in structure. : and effects. Thus, interferons can affect the cells of the immune system or also regulate cell specialization and tumor growth.

• · • · • « · . F. Wheelock löysi 965 polypeptidin, joka suojasi määrättyjä soluja virusinfektioilta (Science 149. 310 (1965). Polypeptidejä, .. joilla on nämä ominaisuudet, kutsutaan nimillä imuuni-interfe- •_/25 roni, tyypin II interferoni, interferoni-γ tai IFN-γ, vaikkakin */ ' tällöin on kysymys lymfokineeneihin lukeutuvasta polypeptidi- : luokasta, γ-ihmisinterferonin lisäksi tunnetaan tähän mennessä ·«· « :***: naudan, hiiren ja rotan γ-interferonit. Kaikki tähän mennessä • · · tunnetuksi tulleet γ-interferonit ovat glykolysoidussa muodos- *30 sa, jolloin glykolysoitumisella ei kuitenkaan ole mitään vaiku-• · tusta biologiseen aktiivisuuteen (Keller et ai., J. Biol. Chem. 258. 8010 (1983) .• · • · • «·. F. Wheelock discovered 965 polypeptides that protected certain cells from viral infections (Science 149. 310 (1965). Polypeptides with these properties are termed immune interferon, type II interferon, interferon-γ, or IFN-γ, although * / 'is a class of polypeptides belonging to lymphokines, in addition to human interferon γ, bovine, mouse and rat interferons γ are still known. The resulting γ-interferons are in glycosylated form, however, glycolysis has no effect on biological activity (Keller et al., J. Biol. Chem. 258. 8010 (1983)).

Interferonien uskottiin kauan vaikuttavan lajispesifisesti. In 35 vitro -kokeet kuitenkin osoittivat, että nautojen IFN-preparaa-tit saattoivat laukaista antiviraalisen vaikutuksen apinoilla - 99116 2 ja ihmisillä (Tovey, M.G. et ai. J. Gen. Virol 3.6, 341-344 (1977)). Tämä lajien välinen aktiivisuus riippuu mahdollisesti geenien tai proteiinien enemmän tai vähemmän suuresta homolo-giasta: tätä olettamusta ei ole voitu todistaa eläinperäisten 5 interferonien vähäisen määrän vuoksi.Interferons were long believed to be species-specific. However, in vitro experiments showed that bovine IFN preparations could trigger antiviral activity in monkeys - 99116 2 and humans (Tovey, M.G. et al. J. Gen. Virol 3.6, 341-344 (1977)). This interspecies activity may depend on the more or less high homology of the genes or proteins: this assumption has not been proven due to the small amount of interferons of animal origin.

Todetusta lajien välisestä aktiivisuudesta huolimatta on vieraan lajin interferoneja käytettäessä otettava huomioon sivuvaikutukset kuten antigeenisyys, jotka hoidon kannalta eivät 10 ole sallittavia.Despite the observed inter-species activity, the use of alien interferons must take into account side effects such as antigenicity, which are not permissible from a therapeutic point of view.

Koska toisaalta kuitenkin hyötyeläinten ja kotieläinten hoidolla on merkittävä taloudellinen arvo, eri lajeille tarvitaan interferoneja, joita eläinlääkärit voivat käyttää.On the other hand, however, because the care of farm and domestic animals has significant economic value, there is a need for interferons for different species that can be used by veterinarians.

1515

Eri lajien pitkälle puhdistettu eläininterferoni tarjoaa lisäksi tervetulleen tilaisuuden tutkia interferonien vaikutusmekanismeja ja saada näin malleja, jotka voidaan siirtää ihmisiin.In addition, highly purified animal interferon from different species offers a welcome opportunity to study the mechanisms of action of interferons and thus obtain models that can be transferred to humans.

« · ’•.'•20 Ensimmäiset tutkimukset eläinperäisillä interferoneilla suori-tettiin luonnon solumateriaalista saaduilla preparaateilla; · tällä menetelmällä valmistettujen interferonien saanto ja puh- • '· taus saattavat osoittautua sopimattomaksi lääkeaineiden valmis- : : : tamiseen.«· '•.' • 20 The first studies with animal interferons were performed with preparations derived from natural cellular material; · The yield and purification of interferons prepared by this method may prove unsuitable for the preparation of drugs.

I II I

2525

Rekombinantti-DNA-tekniikan kehittymisen kautta on mahdollista • .”·. tuottaa mikro-organismeilla heterologisia proteiineja. Näin on . *. valmistettu esimerkiksi myös ihmisinterferoneja (Hu-IFN); viime • · « ·;!/ aikoina myös erilaisia ei-ihmisperäisiä interferoneja.Through the development of recombinant DNA technology, it is possible to •. ”·. produces heterologous proteins by microorganisms. It is so . *. also prepared, for example, human interferons (Hu-IFN); in recent • · «·;! / times also various non-human interferons.

*•••*30 • · · j Käsillä olevan keksinnön kohteena oli valmistaa geeniteknolo- ':"· gista tietä hevosen γ-interferonia ja tähän tarvittavia DNA-sekvenssejä. 1 liIt was an object of the present invention to prepare a genetic engineering route for equine γ-interferon and the DNA sequences required for this purpose.

Huomionarvoista on se, että EqIFN-Y:aa kuten myös kaikkia tähän mennessä tunnetuiksi tulleita γ-interferoneja koodaa kyseisessä 99116 3 organismissa yksi geeni, jossa on suurimmat sekvenssit, jotka katkaisevat rakennegeenin: geenit muodostuvat eksoneista ja introneista, jolloin vain eksonit koodaavat proteiinia. Vain määrätyt systeemit, esimerkiksi systeemit nisäkässoluissa voi-5 vat ymmärtää introneja. Introneja sisältävät DNA-sekvenssejä ei voida käyttää muissa systeemeissä, esimerkiksi E.colissa.It is noteworthy that EqIFN-Y, like all γ-interferons known to date, is encoded in this 99116 3 organism by a single gene with the largest sequences cleaving the structural gene: the genes are composed of exons and introns, with only the exons encoding the protein. Only certain systems, for example systems in mammalian cells, can understand introns. DNA sequences containing introns cannot be used in other systems, for example E. coli.

Käsillä olevan keksinnön tavoitteena oli siten valmistaa EqIFN-y:aa koodaava, introneja sisältämätön DNA-sekvenssi.It was therefore an object of the present invention to provide an intron-free DNA sequence encoding EqIFN-γ.

1010

Keksinnön mukainen DNA-molekyyli tunnetaan siitä, että se käsittää hevos-interferoni-y:aa koodaavan sekvenssin:The DNA molecule of the invention is characterized in that it comprises a sequence encoding equine interferon-γ:

R1 TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA 15 GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCGR1 TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA 15 GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG

CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAACTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA

AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTCAAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC

GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACTGAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT

: '*· ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT: '* · ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT

'.’*20 AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC'.' * 20 AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC

CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATGCTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG

AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCTAAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT

CAG AAG CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAACAG AAG CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA

• « « 25 tai • · • · ·• «« 25 or • · • · ·

R2 GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTCR2 GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC

« « ·«« ·

AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTGAAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG

: GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC: GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC

• · ·• · ·

‘•••*30 CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG‘••• * 30 CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG

AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAAAAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA

·:··: GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA·: ··: GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA

GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTTGAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT

CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTGCAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG

35 TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA35 TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA

TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAATTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA

- 99116 4 jolloin R1 on ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC TAT, 5 ATG TAT tai TAT, 10 R2 ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC CAG, 15 ATG CAG tai CAG.- 99116 4 wherein R1 is ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC TAT, 5 ATG TAT or TAT, 10 R2 ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC CAG, 15 ATG CAG or CAG.

: ·* Tällaisen signaalisekvenssin avulla saadaan määrätyissä isäntä-organismeissa aikaan halutun polypeptidin erittyminen sytoplas-masta. Tällöin proteiini prosessoidaan ja signaalipeptidi loh-·.· kaistaan; saadaan valmis proteiini. "Keskeneräisen" polypepti-j ·.. din eristämiseksi on hajotettava isäntäorganismin, esimerkiksi :Y: E.coli-bakteerin solut, jotka eivät kykene prosessoimaan poly- 25 peptidejä, jotka sisältävät signaalipeptidisekvenssin. Käsillä olevan keksinnön kohteena ovat myös nämä "keskeneräiset" EqIFN-y:t, joissa on täydelliset tai epätäydelliset signaali- \ peptidisekvenssit.: · * Such a signal sequence allows the secretion of the desired polypeptide from the cytoplasm in certain host organisms. The protein is then processed and the signal peptide is cleaved; a finished protein is obtained. To isolate an "incomplete" polypeptide, cells of a host organism, for example: Y: E. coli, that are unable to process polypeptides containing a signal peptide sequence must be disrupted. The present invention also relates to these "unfinished" EqIFN-γ with complete or incomplete signal / peptide sequences.

• · · • · · • · · · • · · | · • ••*30 Valmiin EqIFN-y:n saamista varten voidaan aloitusmetioniini • · · : * : erottaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi CNBnlla ·:··: tai CNCl:lla.• · · • · · • · · · · · • •• * 30 To obtain the finished EqIFN-γ, the starting methionine • · ·: *: can be separated by methods known per se, for example CNB ·: ··: or CNCl.

Tämä EqIFN-y:aa koodaava DNA-sekvenssi sisältää kuitenkin vain 35 sellaisia kodoneja, joita E.coli käyttää voimakkaasti ekspres-However, this DNA sequence encoding EqIFN-γ contains only 35 codons that are strongly expressed by E. coli.

IIII

99116 5 soiduissa, soluille ominaisissa geeneissä (Gouy ja Gautier,99116 5 in cellular genes (Gouy and Gautier,

Nucl. Acids Res. 1ϋ, 7055 (1982)).Nucl. Acids Res. 1, 7055 (1982)).

Käsillä olevan keksinnön tavoitteena oli edelleen valmistaa 5 ensi kertaa EqIFN~Y:aa homogeenisessa, puhtaassa muodossa:It was a further object of the present invention to prepare 5 for the first time EqIFN-Y in a homogeneous, pure form:

Edellä jo mainittiin, että EqIFN-y:n eristäminen ja puhdistaminen luonnonmukaisesta solumateriaalista ei sovi tämän tavoitteen tyydyttävään saavuttamiseen. Keksinnön mukaisesti käyte-10 tään tämän tavoitteen saavuttamiseen siten keksinnön mukaisia DNA-sekvenssejä. Nämä sekvenssit varustetaan vastaavilla kont-rollisekvensseillä, liitetään sopiviin vektoreihin ja viljellään näillä transformoituja sopivia isäntäorganismeja tai isän-täsoluviljelmiä. Muodostuneet polypeptidit eristetään ja puh-15 distetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä.It has already been mentioned above that the isolation and purification of EqIFN-γ from natural cellular material is not suitable for the satisfactory achievement of this goal. According to the invention, the DNA sequences according to the invention are thus used to achieve this object. These sequences are provided with the corresponding control sequences, ligated into appropriate vectors, and cultured with suitable host organisms or host cell cultures. The resulting polypeptides are isolated and purified by methods known per se.

Saadut polypeptidit vastaavat seuraavia kaavoja: : '·· 1 5 10 15 : -.:20 Tyr Tyr Cys Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys ’’· 20 25 30The resulting polypeptides correspond to the following formulas: '·· 1 5 10 15: -.:20 Tyr Tyr Cys Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys'' · 20 25 30

Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro * 35 40 45 • " Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys • · * · *2 5 50 55 60Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro * 35 40 45 • "Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys • · * · * 2 5 50 55 60

Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75

Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr • · · 80 85 90 |30 Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser Γ": 95 100 105 • · »Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr • · · 80 85 90 | 30 Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser Γ ": 95 100 105 • ·»

Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp • · · ; ·’ 110 115 120 ’«·: Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met 35 125 130 135Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp • · ·; · ‘110 115 120’ «·: Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met 35 125 130 135

Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser 140 145Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser 140 145

Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin ***Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin ***

Kaava VFormula V

99116 6 tai99116 6 or

Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro 5 Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp LysGin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro 5 Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys

Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu PheLys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp ThrGlu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr

Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr SerIle Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser

Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp 10 Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai MetLys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp 10 Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met

Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg SerAsn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser

Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin ***Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin ***

Kaava Va 15 Kromosomaalista sekvenssiä käytettäessä saadaan nisäkässolujen transformoinnin jälkeen EqIFN-γ luonnossa esiintyvässä, glyko-lysoidussa muodossa (autenttinen EqIFN-γ). Keksinnön mukaiset sekvenssit ovat erityisen sopivia valmistettaessa EqIFN-y:aa : “ mikro-organismeissa, erityisesti valmistettaessa EqIFN-y:aa :. ‘.:20 E.coli-bakteerissa, jolloin polypeptidi ekspressoituu glykoly-soi tumattomassa muodossa.Formula Va 15 Using a chromosomal sequence, after transformation of mammalian cells, EqIFN-γ is obtained in a naturally occurring, glycosylated form (authentic EqIFN-γ). The sequences of the invention are particularly suitable for the preparation of EqIFN-γ in microorganisms, in particular for the preparation of EqIFN-γ. ‘.: 20 in E. coli, wherein the polypeptide is expressed in non-glycosylated form.

J '·. Käsillä olevan keksinnön tavoitteena oli edelleen valmistaa s : : luonnon EqlFN-y.n modifikaatioita.J '·. It was a further object of the present invention to prepare modifications of s:: natural EqlFN-γ.

25 j\. Proteiinin modifikaatioita voidaan valmistaa siten, että esi- j*:*. merkiksi joko proteiini derivatisoidaan tai pilkotaan entsyymi- . *. käsittelyllä tai proteiinia koodaava DNA-sekvenssi modifioidaan • · · deletoimalla tai fragmentoimalla ja tämä sekvenssi saatetaan t*“: , ..... .25 j \. Protein modifications can be prepared by pre- and *: *. for example, either the protein is derivatized or cleaved by an enzyme. *. by treatment or the DNA sequence encoding the protein is modified by • · · deletion or fragmentation and this sequence is brought into t * “:, ......

♦y 30 ekspressoimaan sopivassa isantaorganismissa.♦ y 30 to be expressed in a suitable host organism.

• · · • · · • ·• · · • · · • ·

• I• I

·:··: Keksinnön mukaisesti syntetisoidaan kemiallisesti EqIFN-y:n modifiointia koodaavat DNA-sekvenssit. Jotta yksittäisten osien muuttamista varten olisi mahdollista manipuloida geeniä yksin-35 kertaisesti, rakennetaan täydelliseen DNA-sekvenssiin useita ainutkertaisia restriktioentsyymien katkaisukohtia.·: ··: According to the invention, DNA sequences encoding the modification of EqIFN-γ are chemically synthesized. In order to be able to manipulate the gene singly for the purpose of altering individual portions, several unique restriction enzyme cleavage sites are constructed in the complete DNA sequence.

99116 799116 7

EqIFN-γιη muita modifioituja muotoja voidaan keksinnön mukaisesti saada siten, että erilaisia oligonukleotidejä rakennetaan yksinään tai erilaisina yhdistelminä, joissa on vastaavat kont-rollisekvenssit, sopiviin vektoreihin, viljellään näillä trans-5 formoituja isäntäorganismeja ja eristetään ja puhdistetaan muodostuneet proteiinit.Other modified forms of EqIFN-γιη can be obtained according to the invention by constructing different oligonucleotides alone or in different combinations with corresponding control sequences in suitable vectors, culturing the transformed host organisms and isolating and purifying the proteins formed.

Asetettujen tavoitteiden saavuttamista varten eristettiin Blinin ja Staffordin modifioidulla menetelmällä (Blin, N.; 10 Staffod, P.W. Nucl. Acids Res. (1976), 2. (2303-2308)) suurimo-lekyylistä DNA:ta hevosen kudoksesta, parhaiten maksasta ja pilkottiin tilastollisesti erityisen endonukleaasien avulla.To achieve the set goals, large molecular DNA was isolated from equine tissue, preferably liver, by a modified method of Blin and Stafford (Blin, N .; 10 Staffod, PW Nucl. Acids Res. (1976), 2. (2303-2308)). statistically with the help of specific endonucleases.

Näin saadut eri kokoiset fragmentit fraktioitiin koon perusteella, parhaiten jotta muodostuisi 10 - 23 kb fragmentteja ja 15 jotta voitaisiin kloonata vektoriin, esimerkiksi Lambda-vektoriin, esimerkiksi Lambda EMBL3A-vektoriin. Tämän jälkeen näitä vektoreita kasvatettiin isäntäorganismissa, esimerkiksi E.coli-bakteerissa, transformoinnin jälkeen. Tämä hevos-DNA-kirjasto : " tutkittiin ihmisen "γ-interferoni-koettimen" avulla epästrigen-\'*:20 teissä hybridisointiolosuhteissa. Alhainen stringenttiys mah-,.Y dollistaa sellaisten DNA-sekvenssien löytämisen, joilla on ero-j.j : ja "koettimeen" nähden.The fragments of different sizes thus obtained were fractionated by size, preferably to form 10 to 23 kb fragments and to be cloned into a vector, for example a Lambda vector, for example a Lambda EMBL3A vector. These vectors were then grown in a host organism, e.g., E. coli, after transformation. This equine DNA library: "was studied with the human" γ-interferon probe "under unstretched hybridization conditions. The low stringency mah -,. Allows the discovery of DNA sequences with differential jj". probe ".

iY: Se voidaan valmistaa joko pilkkomalla kirjallisuudesta tunnet- 25 tujen plasmideja restriktioentsyymien avulla tai syntetisoimal-ϊ*.φ> la kemiallisesti sinänsä tunnetuilla oligonukleotidien syntee-simenetelmillä. Tällä "koettimella" on HuIFN-Y:aa koodaava sek- • · · ·, venssi. Positiivisia hybridisointisignaaleja antavia Lambda- • · · ·*!/ klooneja voitiin tunnistaa viisi.It can be prepared either by digestion of plasmids known from the literature with restriction enzymes or by chemical synthesis by oligonucleotide synthesis methods known per se. This "probe" has a sequence encoding HuIFN-Y. Five Lambda • · · · *! / Clones giving positive hybridization signals could be identified.

*•••*3 0* ••• * 3 0

j ·: Näistä eristetyistä rekombinantti-faageista puhdistettiin DNAj ·: DNA was purified from these isolated recombinant phages

·:··· tavanomaisilla menetelmillä. Faagi-DNA:t karakterisoitiin hyb- ridisoimalla "HuIFN-Y-koettimen" kanssa sen jälkeen kun ne oli pilkottu eri restriktioentsyymeillä ja tämän jälkeen analysoitu 35 Southern-menetelmällä (Southern, J.Mol. Biol. 98: 503-517, 1975). Eristettiin yksi Lambda Eq-Y2-kloonin ainutkertaisesti 99116 8 hybridisoituva 4,6 kb pitkä BamHI-fragmentti ja kloonattiin pUC9-plasmidin (Vieira ja Messing, Gene 19: 259-268, 1982)·: ··· by conventional methods. Phage DNAs were characterized by hybridization with the "HuIFN-Y probe" after digestion with various restriction enzymes and then analyzed by the Southern method (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975). . One uniquely 99116 8 hybridizing 4.6 kb BamHI fragment of Lambda Eq-Y2 clone was isolated and cloned into plasmid pUC9 (Vieira and Messing, Gene 19: 259-268, 1982).

Bam-Hi-katkaisukohtaa.Bam Hi-cut-off point.

5 E.coli-bakteerin, esimerkiksi JMlOl-kannan transformoinnin jälkeen valmistettiin saaduista pesäkkeistä plasmidi-DNA:ta mini-valmistusmenetelmällä (Birnboim ja Doly, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1423, 1979) ja karakterisoitiin pilkkomalla restriktioent-syymeillä. Plasmidille, jossa on haluttu BamHI-insertti, annet-10 tiin nimeksi pAHlll. M13mp8- tai M13mp9-vektoreihin (Vieira ja Messing, Gene 19, 259-268, 1982) viemisen jälkeen sekvenssoi-tiin pAHlll-plasmidin BamHI-insertin päätä Didesoxy-meneteläml-lä (Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977). Sekvenssien vertaaminen ihmisen γ-interferoni-geenin 15 kanssa (Gray ja Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) osoitti homologien olevan suuren ei-koodaavien 5'- ja 3'-alueiden kanssa. Tästä voitiin päätellä, että oli eristetty täydellinen EqIFN-Y-geeni.After transformation of E. coli, for example strain JM101, plasmid DNA was prepared from the resulting colonies by a mini-preparation method (Birnboim and Doly, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1423, 1979) and characterized by digestion with restriction enzymes. The plasmid with the desired BamHI insert was named pAHIII. After insertion into M13mp8 or M13mp9 vectors (Vieira and Messing, Gene 19, 259-268, 1982), the end of the BamHI insert of plasmid pAH111 was sequenced by the Didesoxy method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977). Comparison of the sequences with the human γ-interferon gene (Gray and Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) showed that the homologues were large with the non-coding 5 'and 3' regions. From this, it could be concluded that the complete EqIFN-Y gene had been isolated.

:.*·:20 Plasmidin pAHlll 4,6 kb pitkä BamHI-insertti sekvensoitiin täy- dellisesti Didesoxy-menetelmällä. BamHI-fragmentin koko sek- ·,· · venssi saatiin yhdistämällä M13-alikloonien osasekvenssejä, I ·· jotka oli saatu kloonaamalla restriktiofragmentit (EcoRI, i:.· Hindlll, PstI, Pstl-Bglll, HindiII-BamHI) suunnatulla tavalla 25 vastaavasti katkaistuihin M13mp8- tai M13mp9-vektoreihin.The 4.6 kb BamHI insert of plasmid pAH111 was completely sequenced by the Didesoxy method. The entire sequence of the BamHI fragment was obtained by combining the subsequences of the M13 subclones obtained by cloning the restriction fragments (EcoRI, i:. · HindIII, PstI, PstI-BglII, HindIII-BamHI) in a directed manner into the correspondingly truncated ones. To M13mp8 or M13mp9 vectors.

Osasekvenssejä saatiin lisää siten, että 2,0 kb pitkä BamHI- BGlII-fragmentti tai 2,0 kb pitkä Pstl-fragmentti kloonattiin . *. Mml3mp8-vektoriin "haulikkomenetelmällä". Saadut osasekvenssit • » · •*|/ yhdistettiin tietokoneohjelman avulla 4664 bp pitkäksi koko-| · •••*30 naissekvenssiksi, joka on esitetty kuviossa 1.Additional subsequences were obtained by cloning a 2.0 kb BamHI-BGII fragment or a 2.0 kb PstI fragment. *. To the Mml3mp8 vector by the "shotgun method". The resulting subsequences • »· • * | / were combined using a computer program to be 4664 bp long | · ••• * 30 into the female sequence shown in Figure 1.

• · · • · · « · ψ · ·:·; Hevosen γ-interferonigeenin proteiinia koodaava alue saatiin analysoimalla avoin lukukehys tietokoneen avulla ja vertaamalla muiden lajien γ-interferonigeeneihin (Gray ja Goeddel, Nature 35 298: 859-863; Gray ja Goeddel, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 5842-5846, 1983; Dijkema et ai., EMBO J. 4: 761-767, 1985; 99116 9• · · • · · «· ψ · ·: ·; The protein coding region of the equine γ-interferon gene was obtained by computer analysis of the open reading frame and comparison with γ-interferon genes of other species (Gray and Goeddel, Nature 35 298: 859-863; Gray and Goeddel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5842- 5846, 1983; Dijkema et al., EMBO J. 4: 761-767, 1985; 99116 9

Cerretti et ai., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986). Proteiinia koodaavan alueen katkaisee kolme intronia, jolloin ensimmäisessä eksonissa on koodattu 20 aminohappoa pitkä, hydrofobinen signaalipeptidi ja valmiin EqlFN-y-polypeptidin 18 amino-5 happoa (emäkset 366-479). Toinen eksoni koodaa aminohappoja 19-41 (emäkset 1639-1707), kolmas eksoni koodaa aminohappoja 42-102 (emäkset 1803-1985), neljäs eksoni koodaa karboksi-pää-tä, jossa on aminohapot 103-146 (emäkset 3307-3441). mRNArn polyadenylaation kaksi signaalisekvenssiä (AATAAA) ovat asemis-10 sa 4010 ja 4020. Valmiin EqlFN-γ-polypeptidin asemissa 86-88 on ainut mahdollinen N-glykolysoitumiskohta (Asn-Ser-Ser), joka osuu yhteen naudan γ-interferonin toisen N-glykolysoitumiskoh-dan (Asn-Gly-Ser) kanssa (kuvio 2). Valmis EqlFN-γ-polypeptidi sisältää yllättäen vain yhden ainoan kysteiiniryhmän asemassa 15 3, jolloin luonnonmukaisten ihmisen ja hiiren γ-interferonien kanssa analogisesti ensimmäiset kolme amino-terminaalista aminohappo (tässä tapauksessa Tyr-Tyr-Cyr) todennäköisesti lohkeavat kehossa proteolyyttisesti.Cerretti et al., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986). The protein coding region is cleaved by three introns, with the first exon encoding a 20 amino acid hydrophobic signal peptide and 18 amino-5 acids of the mature EqIFN-γ polypeptide (bases 366-479). The second exon encodes amino acids 19-41 (bases 1639-1707), the third exon encodes amino acids 42-102 (bases 1803-1985), the fourth exon encodes a carboxy terminus having amino acids 103-146 (bases 3307-3441). The two signal sequences for polyadenylation of mRNA (AATAAA) are at positions 1010 and 4020. At positions 86-88 of the mature EqIFN-γ polypeptide, there is a single possible N-glycolysis site (Asn-Ser-Ser) that coincides with the second N- with a glycolysis site (Asn-Gly-Ser) (Figure 2). Surprisingly, the mature EqIFN-γ polypeptide contains only a single cysteine group at position 15 3, where analogous to natural human and mouse γ interferons, the first three amino-terminal amino acids (in this case Tyr-Tyr-Cyr) are likely to be proteolytically cleaved in the body.

*:20 Jotta rekombinantti EqIFN-γ voisi ekspressoitua valmiissa muo-dossaan Excherichia coli -bakteerissa, rakennettiin oligonukle-:.·· otideista synteettinen geeni. Se koodaa samaa aminohapposek-| venssiä kuin luonnon EqlFN-y-geeni, mutta sisältää kuitenkin i :: ainoastaan sellaisia yksittäisten aminohappojen kodoneja, joita 25 käytetään E.colin runsaasti ekspressoimissa, solujen omissa geeneissä (Gouy ja Gautier, Nucl. Acids Res. 10: 7055-7074, 1982) . Lisäksi rakennettiin mukaan useita ainutkertaisia rest- • · · . riktioentsyymien katkaisukohtia, jotka mahdollistavat geenin • m · ♦ · · ***.' yksinkertaisen manipuloinnin yksittäisten osien muuttamista i ··· 30 varten. Synteettinen geeni EqIFN-y:aa varten rakennettiin kah-·· · • tena muunnelmana yhteensä 16:ta erilaisesta oligonukleotidista.*: 20 In order for recombinant EqIFN-γ to be expressed in its final form in Excherichia coli, a synthetic gene was constructed from oligonucleosides. It encodes the same amino acid sequence than the natural EqIFN-γ gene, but contains only those single amino acid codons that are used in E. coli-richly expressed cellular genes (Gouy and Gautier, Nucl. Acids Res. 10: 7055-7074, 1982). ). In addition, several unique rest- • · · were built. cleavage sites of sulfur enzymes that allow the gene to be • m · ♦ · · ***. ' modification of individual parts of simple manipulation for i ··· 30. The synthetic gene for EqIFN-γ was constructed in two variants from a total of 16 different oligonucleotides.

Ensimmäinen muunnos koodaa valmista EqIFN-y:aa, jossa on 146 aminohappoa ja aloitusmetioniini, toinen muoto koodaa amino-päässä kolmen aminohapon verran (Tyr-Tyr-Cys) lyhennettyä poly-35 peptidiä ja aloitusmetioniinia muodossa, jossa se luultavasti luonnon organismissa esiintyisi.The first variant encodes a mature EqIFN-γ of 146 amino acids and a starting methionine, the second form encodes a three amino acid truncated poly-35 peptide at the amino terminus (Tyr-Tyr-Cys) and a starting methionine in a form that would probably be present in a natural organism.

99116 1099116 10

Synteettisen EqlFN-γ-geenin rakenne on esitetty kuviossa 3. Valmistamiseen käytetyt oligonukleotidit syntetisoitiin Applied Biosystems Model 381A DNA-syntetisointilaitteen avulla ja puhdistaminen ja suolojen poisto suoritettiin elektroforeesin 5 avulla. Kuviossa 3 esitetyllä oligonukleotideilla on seuraavat rakenteet:The structure of the synthetic EqIFN-γ gene is shown in Figure 3. The oligonucleotides used for preparation were synthesized using an Applied Biosystems Model 381A DNA synthesizer, and purification and desalting were performed by electrophoresis. The oligonucleotides shown in Figure 3 have the following structures:

EG-1 5'-TACTACTGCC AGGCTGCTTT CTTTAAAGAA ATCGAAAACC TGAAAGAATAEG-1 5'-TACTACTGCC AGGCTGCTTT CTTTAAAGAA ATCGAAAACC TGAAAGAATA

CTTCAACGCT CG-3'CTTCAACGCT CG-3 '

10 EG-2 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTGGCA10 EG-2 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTGGCA

GTAGTA-3'GTAGTA-3 '

EG-3 5'-TAACCCAGAC GTTGGTGACG GTGGTCCGCT GTTCCTGGAC ATCCTGAAAAEG-3 5'-TAACCCAGAC GTTGGTGACG GTGGTCCGCT GTTCCTGGAC ATCCTGAAAA

ACTGGAAAGA AGACTCTG-3'AGACTCTG-3 'ACTGGAAAGA

EG-4 5'-TTCTTTCCAG TTTTTCAGGA TGTCCAGGAA CAGCGGACCA CCGTCACCAAEG-4 5'-TTCTTTCCAG TTTTTCAGGA TGTCCAGGAA CAGCGGACCA CCGTCACCAA

15 CGTCTGGGTT ACGAGCG-3'15 CGTCTGGGTT ACGAGCG-3 '

EG-5 5'-ACAAAAAGAT CATCCAGTCT CAGATCGTTT CTTTCTACTT CAAACTGTTCEG-5 5'-ACAAAAAGAT CATCCAGTCT CAGATCGTTT CTTTCTACTT CAAACTGTTC

GAAAACCTGA AAGACAACC-3'GAAAACCTGA AAGACAACC-3 '

EG-6 5'-TTTCAGGTTT TCGAACAGTT TGAAGTAGAA AGAAACGATC TGAGACTGGAEG-6 5'-TTTCAGGTTT TCGAACAGTT TGAAGTAGAA AGAAACGATC TGAGACTGGA

: " TGATCTTTTT GTCAGAGTC-3': "TGATCTTTTT GTCAGAGTC-3 '

*.*'.’20 EG-7 5 ' -AGGTTATCCA GAAATCGATG GACACTATCA AAGAAGATCT GTTCGTTAAA*. * '. ’20 EG-7 5'-AGGTTATCCA GAAATCGATG GACACTATCA AAGAAGATCT GTTCGTTAAA

..'!' TTCTTCAACT CG-3'.. '!' TTCTTCAACT CG-3 '

: EG-8 51-TCGACGAGTT GAAGAATTTA ACGAACAGAT CTTCTTTGAT AGTGTCCATC: EG-8 51-TCGACGAGTT GAAGAATTTA ACGAACAGAT CTTCTTTGAT AGTGTCCATC

! *.. GATTTCTGGA TAACCTGGTT GTC-3 '! * .. GATTTCTGGA TAACCTGGTT GTC-3 '

j’:*: EG-9 5 '-TCGACTTCTA AACTGGAAGA CTTCCAGAAA CTGATCCAGA TCCCAGTTAAj ': *: EG-9 5'-TCGACTTCTA AACTGGAAGA CTTCCAGAAA CTGATCCAGA TCCCAGTTAA

25 CGACCTGAAA-3'25 CGACCTGAAA-3 '

·*·.. EG-10 5 '-GCTGAACTTT CAGGTCGTTA ACTGGGATCT GGATCAGTTT CTGGAAGTCT· * · .. EG-10 5'-GCTGAACTTT CAGGTCGTTA ACTGGGATCT GGATCAGTTT CTGGAAGTCT

TCCAGTTTAG AAG-3 ' • · ·TCCAGTTTAG AAG-3 '• · ·

EG-11 5'-GTTCAGCGTA AGGCTATCTC TGAACTGATC AAAGTTATGA ACGACCTGTCEG-11 5'-GTTCAGCGTA AGGCTATCTC TGAACTGATC AAAGTTATGA ACGACCTGTC

• « · : TCCAAAAGCT AA-3 ' • · ·• «·: TCCAAAAGCT AA-3 '• · ·

*••*30 EG-12 5 ' -CGCAGGTTAG CTTTTGGAGA CAGGTCGTTC ATAACTTTGA TCAGTTCAGA* •• * 30 EG-12 5 '-CGCAGGTTAG CTTTTGGAGA CAGGTCGTTC ATAACTTTGA TCAGTTCAGA

:’·’: GATAGCCTTA C-3' • ·: '·': GATAGCCTTA C-3 '• ·

*:*·: EG-13 5 ' -CCTGCGTAAA CGTAAACGTT CTCAGAACCC ATTCCGTGGT CGTCGTGCTC*: * ·: EG-13 5'-CCTGCGTAAA CGTAAACGTT CTCAGAACCC ATTCCGTGGT CGTCGTGCTC

TTCAGTAAG-3'TTCAGTAAG-3 '

EG-14 5'-GATCCTTACT GAAGAGCACG ACGACCACGG AATGGGTTCT GAGAACGTTTEG-14 5'-GATCCTTACT GAAGAGCACG ACGACCACGG AATGGGTTCT GAGAACGTTT

35 ACGTTTA-3'35 ACGTTTA-3 '

IIII

99116 11 EG-15 5'-CAGGCTGCTT TCTTTAAAGA AATCGAAAAC CTGAAAGAAT ACTTCAACGC TCG-3' EG-16 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTG-3' 5 Synteettisen EqlFN-y-geenin kokoaminen tapahtui kahtena palana. Geenin ensimmäinen osa valmistettiin kahdeksan oligonukleotidin EG-1 - EG-8 avulla sall-katkaisukohtaan asti ja geenin toinen puolisko valmistettiin kuudesta oligonukleotidista EG-9 - EG-14 Sall-katkaisukohdasta BamHI-katkaisukohtaan asti. Rakennettaes-10 sa EqIFN-y:an muoto, joka oli lyhennetty aminopäässä kolmen aminohapon verran, käytettiin oligonukleotidien EG-l ja EG-2 asemesta oligonukleotideja EG-15 ja EG-16.99116 11 EG-15 5'-CAGGCTGCTT TCTTTAAAGA AATCGAAAAC CTGAAAGAAT ACTTCAACGC TCG-3 'EG-16 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTG-3' 5 Synthesis of synthetic EqlFin The first portion of the gene was prepared with eight oligonucleotides EG-1 to EG-8 up to the sall cleavage site and the second half of the gene was prepared from six oligonucleotides EG-9 to EG-14 from the SalI cleavage site to the BamHI cleavage site. In constructing the form of EqIFN-γ, which was truncated at the amino terminus by three amino acids, oligonucleotides EG-15 and EG-16 were used instead of oligonucleotides EG-1 and EG-2.

Keksinnön kohteena eivät ole ainoastaan geeni-sekvenssit, jotka 15 koodaavat spesifisesti keksinnön mukaisia interferoneja, vaan myös modifikaatiot, jotka voidaan saada helposti ja rutiininomaisesti mutatoimalla, hajottamalla, transposoimalla tai addition avulla. Keksintö kattaa myös jokaisen sekvenssin, joka : " koodaa keksinnön mukaisia interferoneja {so. jolla on tässä *. *:20 yhteydessä kuvattu biologinen aktiivisuusspektri) ja joka on annettuihin sekvensseihin verrattuna degeneroitu; alan ammatti-:.· · ihmiset kykenevät degeneroimaan koodaavien alueiden DNA-sek- • '·· venssejä. Keksintöön sisältyy myös jokainen sekvenssi, joka » koodaa polypeptidiä, jolla on keksinnön mukaisten interferonien 25 aktiivisuusspektri ja joka hybridisoituu annettujen sekvenssien (tai niiden osien) kanssa tringenteissä olosuhteissa (esim.The invention relates not only to gene sequences which specifically encode the interferons of the invention, but also to modifications which can be easily and routinely obtained by mutation, digestion, transposition or addition. The invention also encompasses any sequence which: "encodes the interferons of the invention (i.e., having the biological activity spectrum described herein *. *: 20) and which is degenerate relative to the given sequences; one skilled in the art is able to degenerate the DNA of the coding regions. The invention also encompasses any sequence that encodes a polypeptide having the activity spectrum of the interferons of the invention and that hybridizes to the given sequences (or portions thereof) under stringent conditions (e.g.

·*·*· olosuhteissa, jotka selektoivat yli 85% :n, mieluummin yli 90% :n . *. homologian) .· * · * · Under conditions that select for more than 85%, preferably more than 90%. *. homology).

• · i *·· · • · · t : *;· 30 Hybridisoinnit suoritetaan 6xSSC/5x Denhardtin liuos/0,1% SDS- • · · • \·* seoksessa 65°C:ssa. Stringenttiysaste määrätään pesuvaiheessa.Hybridizations are performed in 6xSSC / 5x Denhardt's solution / 0.1% SDS- • · · • · at 65 ° C. The degree of tension is determined in the washing step.

DNA-sekvenssien, joiden homologia on noin 85% tai enemmän, se-lektoimiseen sopivat olosuhteet ovat siten 0,2xSSC/0,01% SDS/65°C ja DNA-sekvenssien, joiden homologia on noin 90% tai 35 enemmän, selektoimiseen sopivat olosuhteet ovat 0,lxSSC/0,01% SDS/65°C.Thus, suitable conditions for selecting DNA sequences with about 85% or more homology are 0.2xSSC / 0.01% SDS / 65 ° C, and suitable for selecting DNA sequences with about 90% or 35 more homology. conditions are 0.1xSSC / 0.01% SDS / 65 ° C.

99116 1299116 12

Keksinnön mukaisia interferoni-geenejä voidaan laittaa jokaiseen organismiin olosuhteissa, joissa saadaan korkeita saantoja. Sopivat isännät ja vektorit ovat alan ammattimiehen parhaiten tuntemia; esimerkkien suhteen viitattakoon patenttijulkai-5 suun EP-A-0.093.619.The interferon genes of the invention can be introduced into any organism under conditions of high yields. Suitable hosts and vectors are best known to those skilled in the art; for examples, reference should be made to EP-A-0.093.619.

Ekspressointiin käytetään parhaiten prokaryootteja, esimerkiksi E.coli K 12 kantaa 294 (ATCC No. 31 446) tai E.coli X1776 kantaa (ATCC No. 31.537). Edellä mainittujen kantojen kaltaisesti 10 voidaan käyttää myös E.coli W 3110 (F-, Lambda-, prototroofi, ATCC No. 27325) kantaa, basilleja kuten Bacillus subtilis -bakteeria ja muita Enterobacteriaceae-bakteereita kuten Salmonella typhimurium tai Sarratia marcescens -bakteereita ja erilaisia pseudomonades-bakteereita.Prokaryotes are best used for expression, for example, E. coli K 12 strain 294 (ATCC No. 31,446) or E. coli X1776 strain (ATCC No. 31,537). As in the above-mentioned strains, E. coli W 3110 (F, Lambda, prototroph, ATCC No. 27325), bacilli such as Bacillus subtilis and other Enterobacteriaceae such as Salmonella typhimurium or Sarratia marcescens and various strains can also be used. pseudomonades bacteria.

15 Näiden isäntien kanssa voidaan yleisesti sanoen käyttää plas-midi-vektoreita, jotka sisältävät isäntäsolujen kanssa yhteensopivista lajeista peräisin olevia kontrollisekvenssejä. Vekto-’· " rissa on tavallisesti replikaatiokohdan lisäksi tunnistamisse-:.*·:20 kvenssjä, jotka mahdollistavat transformoitujen solujen selek-toinnin fenotyypin perusteella. Esimerkiksi E.coli transformoi-·,· · daan tavallisesti pBR322:lla, so. E.coli-lajeista peräisin ole-i valla plasmidilla (Bolivar, et ai., Gene 2., 95 (1977)). pBR322 jV: sisältää geenin ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenttiydel- 25 le, mikä antaa mahdollisuuden identifioida transformoidut so-lut. pBR322-plasmidin tai myös muiden plasmidien on lisäksi sisällettävä promoottoreita tai ne on varustettava promootto- , *. reillä, joita mikrobiorganismi voi käyttää omien proteiiniensa * * * **j#* ekspressointiin. Rekombinantti-DNA:n valmistamisessa useimmiten | · ♦♦·* 30 käytettyihin promoottoreihin kuuluvat β-laktamaasti- (penisil-j·: Iinaasi) ja laktoosipromoottori-systeemit (Chang et ai., Nature :··· 275. 615 (1978); Itakura et ai., Science 198. 1 + 056 (1977);In general, plasmid vectors containing control sequences from species compatible with the host cells can be used with these hosts. The vector usually contains, in addition to the site of replication, 20 identification sequences that allow selection of the transformed cells by phenotype. For example, E. coli is usually transformed with pBR322, i.e. E. coli. coli species (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977)) pBR322 jV: contains a gene for ampicillin and tetracycline resistance, allowing the identification of transformed cells. in addition, the plasmid or other plasmids must contain promoters or be provided with promoter lines that can be used by the micro-organism to express its own proteins * * * ** j # *. promoters include the β-lactamast (penicillin) and lactose promoter systems (Chang et al., Nature: 275. 615 (1978); Itakura et al., Science 198. 1 + 056 (1977)). ;

Goeddel et ai., Nature 281. 544 (1979)) ja tryptofaani(trp)-promoottorisysteemit (Goeddel et ai., Nucleic Acids Res. &, 35 4057 (1980); EP-A-0.036.776). Näiden erityisen käyttökelpoisten promoottorien lisäksi on myös kehitetty ja käytetty muita mik- 99116 13 robipromoottoreita. Keksinnön mukaisten interferonien geenisekvenssi voidaan laittaa esimerkiksi bakteerifaagin Lambda (PL)Goeddel et al., Nature 281. 544 (1979)) and tryptophan (trp) promoter systems (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. &, 35 4057 (1980); EP-A-0.036.776). In addition to these particularly useful promoters, other microbial promoters have also been developed and used. The gene sequence of the interferons of the invention can be inserted, for example, into the bacterial phage Lambda (PL).

Leftward-promoottorin kontrollin alaiseksi. Tämä promoottori on erityisen tehokas, ohjattavissa oleva promoottori. Ohjauksen 5 mahdollistaa Lambda-repressori, josta tunnetaan vierekkäiset restriktiokatkaisukohdat. Tämän repressori-geenin lämpötila-herkkä alleeli voidaan liittää vektoriin, joka sisältää EqlFN-γ-sekvenssin. Jos lämpötila kohotetaan 42°C:een, repressori inaktivoituu ja promoottori aktivoituu. Tätä systeemiä käyttä-10 mällä on mahdollista muodostaa kloonipankki, jossa funktionaalinen IFN-sekvenssi sijaitsee ribosomin sitoutumiskohdan läheisyydellä eri etäisyyksillä Lambda-PL-promoottorista. Nämä kloonit voidaan tämän jälkeen tutkia ja selektoida niistä korkeimman saannon omaavat.Under the control of the Leftward promoter. This promoter is a particularly potent, controllable promoter. Control 5 is enabled by a Lambda repressor from which adjacent restriction cleavage sites are known. A temperature-sensitive allele of this repressor gene can be inserted into a vector containing the EqIFN-γ sequence. If the temperature is raised to 42 ° C, the repressor is inactivated and the promoter is activated. Using this system, it is possible to form a clone bank in which the functional IFN sequence is located in the vicinity of the ribosome binding site at different distances from the Lambda-PL promoter. These clones can then be examined and selected to have the highest yields.

1515

Keksinnön mukaisia proteiineja koodaavan sekvenssin ekspressio ja translaatio voi myös tapahtua muiden säätelysysteemien kontrollin alaisena, joita voidaan pitää "homologisina" organismin • " kanssa sen transformoimattomassa muodossa. Siten sisältää esi-:.'i20 merkiksi laktoosista riippuvan E.colin kromosomaalinen DNA ..'I' laktoosi- tai lak-operonin, joka mahdollistaa laktoosin hajot-·,; · tamisen erittämällä β-galaktositaasi-entsyymiä.Expression and translation of the coding sequence for the proteins of the invention may also occur under the control of other regulatory systems that may be considered "homologous" to the organism in its untransformed form, thus containing, for example, lactose-dependent E. coli chromosomal DNA. a lactose or laccon operon which allows the breakdown of lactose by the secretion of the enzyme β-galactositase.

i‘\.i '\.

I · i : : Lak-kontrollielementit voidaan saada myös bakteerifaagista 25 Lambda-plac5, joka infektoi E.coli-bakteeria. Faagin lak-opero- ·*·.. ni voidaan saada transduktoimalla samoista bakteerilajeista.I · i:: Lak control elements can also be obtained from bacterial phage Lambda-plac5, which infects E. coli. The phage lak opero- · * · .. ni can be obtained by transduction from the same bacterial species.

* · · • · · 4 4 · * . *. Säätelysysteemejä, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisessa • « · **j/ menetelmässä, voidaan myös saada plasmidi-DNA:sta, joka on or-| · ·;·* 30 ganismille ominainen. Lak-promoottori-operaattori-systeemi voi-I*: daan indusoida IPTG:lla.* · · • · · 4 4 · *. *. Regulatory systems that can be used in the method of the invention can also be obtained from plasmid DNA that is or- | · ·; · * 30 characteristic of ganism. The Lak promoter-operator system can be induced by IPTG.

f »f »

Yhtä hyvin voidaan käyttää muitakin promoottori-operaattori-systeemejä tai niiden osia: esimerkiksi arabinoosi-operaattori, 35 kolisiini E1-operaattori, galaktoosi-operaattori, alkalinen 99116 14 fosfataasi-operaattori, trp-operaattori, ksyloosi-A-operaatto-ri, tae-promoottori jne.Other promoter-operator systems, or parts thereof, may be used as well: for example, the arabinose operator, the colicin E1 operator, the galactose operator, the alkaline 99116 14 phosphatase operator, the trp operator, the xylose A operator, promoter, etc.

Prokaryoottien lisäksi voidaan käyttää myös eukaryoottisia 5 mikro-organismeja kuten hiivaviljelmiä. Saccharomyces cere-visiae on eukaryoottisista mikro-organismeista yleisimmin käytetty, vaikkakin saatavissa on joukko muitakin lajeja. Saccharomyces-hiivassa ekspressointiin käytetään esimerkiksi plasmidia YRp7 (Stinchcomb et ai. Natur 282. 39 (1979); Kings-10 man et ai., Gene 7., 141 (1979); Tschumper et ai., Gene 3J), 157 (1980)) ja plasmidia YEpl3 (Bwach et ai., Gene 8., 121-133 (1979)) . Plasmidi YRp7 sisältää TRP1-geenin, joka tekee mahdolliseksi leimata selektointia varten hiivamutantin, joka ei kykene kasvamaan tryptofaanittomassa alustassa, esimerkiksi ATCC 15 No. 44076.In addition to prokaryotes, eukaryotic microorganisms such as yeast cultures can also be used. Saccharomyces Cere-visiae is the most commonly used of the eukaryotic microorganisms, although a number of other species are available. For expression in Saccharomyces yeast, for example, plasmid YRp7 (Stinchcomb et al. Natur 282. 39 (1979); Kings-10 man et al., Gene 7, 141 (1979); Tschumper et al., Gene 3J), 157 (1980) is used. )) and plasmid YEpl3 (Bwach et al., Gene 8, 121-133 (1979)). Plasmid YRp7 contains the TRP1 gene, which makes it possible to label for selection a yeast mutant which is unable to grow in a tryptophan-free medium, for example ATCC No. 44076.

TRPl-vaurion läsnäoloa hiivaisännän genomin tunnusmerkkinä voidaan tällöin käyttää tehokkaana apukeinona transformaation • » ί " osoittamisessa, kun viljellään ilman tryptofaania. Aivan vas-* · V’j20 taavalla tavalla käyttäytyy plasmidi YEpl3, joka sisältää hii- vageenin LEU 2, jota voidaan käyttää LEU-2-miinus-mutantin täy- ·.· dentämiseen. Hiivavektoreille sopiviin promoottori-sekvenssei- • «The presence of TRP1 damage as a hallmark of the yeast host genome can then be used as an effective aid in detecting transformation when cultured without tryptophan. Plasmid YEpl3, which contains the yeast LEU 2, can be used in a manner similar to that of LEU 2 To complement the -2-minus mutant, suitable promoter sequences for yeast vectors.

| hin kuuluvat seuraavien geenien 5' -viereinen alue: ADH I| include the 5 'region of the following genes: ADH I

(Ammere G., Methods of Enzymology 101. 192-201 (1983)) .(Ammere G., Methods of Enzymology 101. 192-201 (1983)).

« « 25 3-fosfoglyseraatti-kinaasi (Hitzeman et ai., J. BIol. Chem.3-phosphoglycerate kinase (Hitzeman et al., J. BIol. Chem.

255 r 2073 (1980) ) ja muut glyolyyttiset entsyymit (Kawasaki ja .Fraenkel, BBRC 108. 1107-1112 (1982)) kuten enolaasi, glyse- * * ψ riinialdehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasi, heksokinaasi, pyru- i · *··* 30 vaatti-dekarboksylaasi, fosfofruktokinaasi, glukoosi-6-fos-faatti-isomeraasi, fosfoglukoosi-isomeraasi ja glukokinaasi. Sopivien ekspressioplasmidien rakentamisessa voidaan käyttää näihin geeneihin liittyviä terminaatiosekvenssejä myös ekspres-siovektorissa ekspressoitavan sekvenssin 31-päässä mahdollista-35 maan mRNA:n polyadenylaatio ja terminaation.255 r 2073 (1980)) and other glycolytic enzymes (Kawasaki and .Fraenkel, BBRC 108. 1107-1112 (1982)) such as enolase, glycine * * ψ rine aldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyru- ·· * 30 clothing decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, phosphoglucose isomerase and glucokinase. Termination sequences associated with these genes can also be used to construct suitable expression plasmids. Polyadenylation and termination of mRNA is possible at the 31-end of the sequence to be expressed in the expression vector.

- 99116 15- 99116 15

Muita promoottoreita, joilla lisäksi on etuna kasvuolosuhteiden kontrolloima transkriptio, ovat seuraavien geenien promoottorialueet: alkoholi-dehydrogenaasi-2-, isosytokromi C, hapan fos-fataasi, hajottavat entsyymit, jotka ovat kytkeytyneet typpi-5 metaboliaan, edellä mainittu glyseriinialdehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasi ja entsyymit, jotka vastaavat maltoosin ja ga-laktoosin käytöstä. Lämpötilaltaan säädellyissä systeemeissä voidaan käyttämällä lämpötilasta riippuvia sir mutaatioita käyttää promoottoreita, joita säätelevät hiivan Mating-tyyppi-10 nen locus, esimerkiksi geenien BARI, MFal. STE2. STE3. STE5.Other promoters that also have the advantage of growth-controlled transcription include the promoter regions of the following genes: alcohol dehydrogenase-2, isocytochrome C, acid phosphatase, degrading enzymes involved in nitrogen-5 metabolism, the aforementioned glycerol aldehyde dehydrogenase and enzymes responsible for the use of maltose and galactose. In temperature-controlled systems, using temperature-dependent sir mutations, promoters regulated by the yeast Mating-type 10 locus, e.g., the genes BARI, MFal, can be used. STE2. STE3. STE5.

promoottoreita, (Rhine Ph.D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz ja Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. part I, 181-209 (1981) . Gold Spring Harbor Laboratory). Nämä mutaatiot vaikuttavat hiivojen 15 lepäävien Mating-tyyppisten kasettien ekspressioon ja siten epäsuorasti Mating-tyypistä riippuviin promoottoreihin. Yleisesti sopii kuitenkin jokainen plasmidivektori, joka sisältää hiivan kanssa yhteen sopivan promoottorin, originääriset \ ' '* replikaatio- ja terminaatiosekvenssit.promoters, (Rhine Ph.D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. part I, 181-209 (1981). Gold Spring Harbor Laboratory). These mutations affect the expression of the resting Mating-type cassettes of the yeast and thus indirectly the Mating-type-dependent promoters. However, in general, any plasmid vector containing a promoter compatible with yeast will have the original replication and termination sequences.

· 20 „7 Mikro-organismien lisäksi sopivia isäntäorganismeja ovat myös ;,: · monisoluisten organismien viljelmät. Periaatteessa voidaan I käyttää jokaista tällaista viljelmää riippumatta onko se selkä- ; rankaisen tai selkärangattoman eläimen viljelmästä. Suurin mie- 25 lenkiinto kohdistuu kuitenkin selkärankaisten soluihin, ja si- ·*·,, ten selkärankaisten solujen kasvattaminen viljelmässä (kudos- viljelmä) on viime vuosina johtanut rutiinimaiseen menetelmään , (Tissue Culture, Academic Press, Kruse ja Patterson, toim.· 20 „7 In addition to microorganisms, suitable host organisms are also ;,: · cultures of multicellular organisms. In principle, I can use any such culture, whether or not dorsal; from a culture of a captive or invertebrate animal. However, the greatest interest is in vertebrate cells, and the growth of these vertebrate cells in culture (tissue culture) has in recent years led to a routine method, (Tissue Culture, Academic Press, Kruse, & Patterson, eds.

« « · ·“/ (1973)). Tällaisista hyödyllisistä isäntäsolulinjoista ovat S · *;·' 30 esimerkkejä VERO- ja HeLa-solut, CHO-solut ja WI38, BHK, COS-7 • · · ' *#i ja MDCK-solulinjat. Näille soluille tarkoitetut ekspressiovek-torit sisältävät tavallisesti (tarvittaessa) replikaation aloituskohdan, promoottorin, joka sijaitsee ekspressoitavan geenin edellä yhdessä kaikkien tarvittavien ribosomien sitoutumiskoh-35 tien kanssa. RNA-katkaisukohdat, polyadenylaatiokohdat ja transkriptionaaliset terminaatiosekvenssit.«« · · “/ (1973)). Examples of such useful host cell lines include S · *; · '' VERO and HeLa cells, CHO cells, and WI38, BHK, COS-7 • · · '* # i, and MDCK cell lines. Expression vectors for these cells usually contain (if necessary) an origin of replication, a promoter located upstream of the gene to be expressed, together with all the necessary ribosome binding sites. RNA cleavage sites, polyadenylation sites, and transcriptional termination sequences.

99116 1699116 16

Nisäkässoluissa käytettäessä ovat ekspressiovektoreiden kontrollifunktiot useimmiten peräisin virusmateriaalista. Tavallisesti käytetyt promoottorit ovat esimerkiksi peräisin Polyoma 5 Adenovirus 2:sta ja erityisen usein SV 40 -viruksesta (Simian Virus 40). SV 40 -viruksen varhaiset ja myöhäiset päätepromoot-torit ovat erityisen hyödyllisiä, koska kummatkin on helposti saatavissa viruksesta fragmenttina, joka sisältää vielä myös SV 40 -viruksen viraalisen replikaatiokohdan. (Fiers et ai., 10 Nature 273. 113 (1978)). Myös SV 40 -viruksen pienempiä tai suurempia fragmentteja voidaan käyttää, edellyttäen, että ne sisältävät lähes 250 bp pitkän sekvenssin, joka ulottuu HindiII-katkaisukohdasta viraalisen replikaation aloituskohdan Bgll-katkaisukohtaan asti. Lisäksi on myös mahdollista ja usein 15 suositeltavaa käyttää promoottori- tai kontrolli-sekvenssejä, jotka ovat normaalisti liittyneet haluttuihin geenisekvenssei-hin, edellyttäen että nämä kontrollisekvenssit sopivat yhteen isäntäsolusysteemien kanssa.When used in mammalian cells, the control functions of expression vectors are most often derived from viral material. Commonly used promoters are, for example, from Polyoma 5 Adenovirus 2 and particularly often from SV 40 virus (Simian Virus 40). The early and late terminal promoters of the SV 40 virus are particularly useful because both are readily available from the virus as a fragment that also contains the SV 40 viral replication site. (Fiers et al., 10 Nature 273. 113 (1978)). Smaller or larger fragments of SV 40 virus may also be used, provided that they contain a sequence of nearly 250 bp in length from the HindIII cleavage site to the BglII cleavage site of the viral origin of replication. In addition, it is also possible and often advisable to use promoter or control sequences normally associated with the desired gene sequences, provided that these control sequences are compatible with the host cell systems.

.”•.20 Replikaation aloituskohta voi olla joko varustettu vastaavalla vektorirakenteella jotta voitaisiin rakentaa mukaan eksogeeni- • « ·'· nen aloituskohta, esimerkiksi SV 40 -viruksesta tai muista vi- . ruslähteistä (esim. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, jne.) tai sen voi. ”• .20 The origin of replication may either be provided with a corresponding vector construct in order to construct an exogenous origin of, for example, SV 40 virus or other vir-. sources (e.g. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, etc.) or can be

• « « I• «« I

;·. antaa isäntäsolujen kromosomaalinen replikaatiomekanismi. Jos ,v25 vektori integroidaan isäntäsolun kromosomiin, viimeksi mainittu • · · toimenpide on useimmiten riittävä.; ·. gives the chromosomal replication mechanism of host cells. If, v25 vector is integrated into the chromosome of the host cell, the latter • · · procedure is usually sufficient.

• · • · • ««• · • · • ««

Parhaiten voidaan keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit ekspressoi- ♦ » · • · · *. da myös ekspressioplasmidissa pER103 (E. Rastl-Dworkin et ai., :.: :30 Gene 21, 237-248 (1983) ja EP-A-0.115.613 - tallennettu DMS- kokoelmaan numerolle DSM 2773 20.12.1983) plasmidissa parpER33 :v. (EP-A-0.115.613) tai plasmidissa pRHIOO, sillä nämä vektorit • · . <<<; sisältävät kaikki säätelyelementit, jotka saavat aikaan kloona tun geenin korkean ekspressoitumisasteen. Keksinnön mukaisesti 35 käytetään synteettisen EqlFN-y-geenin ekspresiovektorina plas-midia pRHIOO, joka sisältää säädeltävän tryptofaanipromoottorinThe DNA sequences of the invention can best be expressed ♦ »· • · · *. da also in the expression plasmid pER103 (E. Rastl-Dworkin et al.,:.: 30 Gene 21, 237-248 (1983) and EP-A-0.115.613 - deposited in the DMS collection number DSM 2773 on 20.12.1983) in the plasmid parpER33 : v. (EP-A-0.115.613) or in plasmid pRHIOO, as these vectors • ·. <<<; contain all regulatory elements that result in a high level of expression of the cloned gene. According to the invention, plasmid pRHIOO, which contains a regulated tryptophan promoter, is used as an expression vector for the synthetic EqIFN-γ gene.

IIII

99116 1799116 17

Serratia marcescens -bakteerista ja keinotekoisen ribosomien sitoutumiskohdan. Ekspressioplasmidin pRHIOO valmistamista varten linearisoitiin plasmidi pER103 (Eva Dworkin-Rastl et ai.,Serratia marcescens and an artificial ribosome binding site. To prepare the expression plasmid pRHIOO, plasmid pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al.,

Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115.613) restriktioendonukleaa-5 silla Hindlll ja 51-terminaaliset fosfaattiryhmät poistettiin.Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115.613) with restriction endonuclease-5, the HindIII and 51-terminal phosphate groups were removed.

Tämä plasmidi-DNA sekoitettiin ja ligitoitiin fosforyloitu-jen oligonukleotidien d(AGCTTAAAGATGAGCT) ja d(CATCTTTA) kanssa. Ligaasireaktio suoritettiin pilkkomalla restriktioendonuk-10 leaasilla Sacl ja ligatoitiin lisäämällä T4-PNK:ia. Oligonuk-leotidit valmistettiin analogisesti patenttijulkaisussa EP-A- 0.115.613 kuvatun menetelmän kanssa. Tämän ligaasireaktion tuote lisättiin kompetentteihin E.coli HBlOl-soluihin ja inkuboi-tiin. Muodostuneista bakteeripesäkkeistä valittiin mielivaltai-15 sesti 12 ja näistä eristettiin plasmidit mikromitassa (Birnboim ja Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). Saatu DNA pilkottiin restriktioendonukleaasilla Sacl ja DNA erotettiin aga-roosigeelillä (1%, lx TBE-puskuri). DNA:n kulkeutuminen lineaarisena, noin 4400 bp suuruisena molekyylinä vahvasti Sacl-tun-."'.20 nistamiskohdan liittymisen plasmidiin. Yksi tällainen plasmidi valittiin mielivaltaisesti. E.coli HB101 transformoitiin vieläThis plasmid DNA was mixed and ligated with phosphorylated oligonucleotides d (AGCTTAAAGATGAGCT) and d (CATCTTTA). The ligase reaction was performed by digestion with the restriction endonuclease-10 Lease SacI and ligated by the addition of T4-PNK. Oligonucleotides were prepared analogously to the method described in EP-A-0.115.613. The product of this ligase reaction was added to competent E. coli HB101 cells and incubated. Of the bacterial colonies formed, 12 were arbitrarily selected and plasmids were isolated on a micro scale (Birnboim and Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). The resulting DNA was digested with restriction endonuclease SacI and the DNA was separated on an agarose gel (1%, 1x TBE buffer). The migration of DNA as a linear molecule of approximately 4400 bp was strongly associated with the incorporation of 20 sites of insertion into the plasmid. One such plasmid was chosen arbitrarily. E. coli HB101 was further transformed

II

kerran DNA: 11a, joka oli saatu tähän kuuluvasta minivalmistees- . .·. ta. Saaduista transformoiduista bakteereista valittiin yksi • « « · .··. pesäke ja tätä kasvatettiin suuremmassa mitassa. Tästä eristet- ,·.·25 ty plasmidi pilkottiin restriktioendonukleaaseilla EcoRI jaonce DNA obtained from this mini-preparation. . ·. ta. Of the transformed bacteria obtained, one • «« ·. ··. colony and this was grown on a larger scale. The plasmid isolated from this was digested with restriction endonucleases EcoRI and

* · I* · I

BamHI, DNA erotettiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä ja pie- .. nempi fragmentti eristettiin geelistä elektroeluoimalla. Tämä • * « noin 460 bp pitkä EcoRI-BamHI-DNA-fragmentti sekvensoitiin • » » • 4 * *, Sangerin menetelmällä (F. Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.BamHI, DNA was separated on a 1% agarose gel and the smaller fragment was isolated from the gel by electroelution. This EcoRI-BamHI DNA fragment, approximately 460 bp in length, was sequenced by the method of Sanger (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

• · ;30 (1977) 5463-5467) . Tällä tavoin analysoidulle plasmidille an- nettiin nimeksi pRHIOO.• ·; 30 (1977) 5463-5467). The plasmid analyzed in this way was named pRHIOO.

4 « I4 «I

« ,«,

Plasmidi pilkottiin Sacl-entsyymillä ja ylipitkät DNA-päät tasoitettiin käsittelemällä Klenowin fragmentilla (Amersham)The plasmid was digested with SacI and excess DNA ends were flattened by treatment with a Klenow fragment (Amersham).

35 kaikkien neljän dosoksinukleotiditrifosfaatin läsnäollessa. Reaktio pysäytettiin uuttamalla fenoli/kloroformilla ja DNA35 in the presence of all four dosoxynucleotide triphosphates. The reaction was stopped by extraction with phenol / chloroform and DNA

99116 18 väkevöitiin seostamalla etanolilla. Tämä käsittely tekee tryp-tofaanin promoottoriin liittyneenä tylpän DNA-pään, joka päättyy translaation aloituskodoniin "ATG". Tämän jälkeen pilkotaan linearisoitu plasmidi-DNA BamHI-.lla ja eristetään vektoriosa.99116 18 was concentrated by mixing with ethanol. This treatment, when associated with the tryptophan promoter, renders a blunt end of DNA terminating in the translation start codon "ATG". The linearized plasmid DNA is then digested with BamHI and the vector portion is isolated.

5 Näin esivalmisteltu pRHIOO plasmidi-vektori sekoitetaan liga-toitujen oligonukleotidien EG-1 - EG-8 ja EG-9 - EG-14 kanssa ja inkuboidaan ligatointipuskurissa T4 DNA-ligaasin kanssa. Kompetentiksi tehty E.coli, parhaiten JM101, transformoidaan 10 tällä ligatointiseoksella ja inkuboidaan yön yli. Saaduista transformanteista eristetään minipreparointimenetelmällä plasmidi-DNA ja rakenne selvitetään restriktioanalysoimalla ja sekvensoimalla Hindlll-BamHI-insertti. Plasmidille, jolla on haluttu rakenne valmiin EqIFN-y:n ekspressointia varten, anne-15 taan nimeksi pEqG-YYCl. Täysin analogisella tavalla kloonataan pRHIOO-vektorin oligonukleotidit EG-15,16 EG-3 - EG-8 ja EG-9 - EG-14 jotta saataisiin kolmen aminohapon verran lyhennetty EqIFN-γ. Plasmidille, jolla on haluttu rakenne, annetaan nimeksi pEqG-QAAl.The pRHIOO plasmid vector thus prepared is mixed with the ligated oligonucleotides EG-1 to EG-8 and EG-9 to EG-14 and incubated in ligation buffer with T4 DNA ligase. Competent E. coli, preferably JM101, is transformed with this ligation mixture and incubated overnight. Plasmid DNA is isolated from the resulting transformants by a miniprep method and the structure is elucidated by restriction analysis and sequencing of the HindIII-BamHI insert. The plasmid having the desired structure for expression of mature EqIFN-γ is named pEqG-YYCl. In a completely analogous manner, oligonucleotides EG-15.16 EG-3 to EG-8 and EG-9 to EG-14 of the pRHIOO vector are cloned to give a three amino acid truncated EqIFN-γ. The plasmid having the desired structure is named pEqG-QAA1.

.**’.20. ** ". 20

Solut voidaan transformoida vehikkeleillä lukuisilla menetel-·'· millä. Se voi tapahtua esimerkiksi kalsiumilla, jolloin joko ; solut pestään magnesiumissa ja DNA lisätään kalsiumiin suspen- doituihin soluihin tai solut saatetaan alttiiksi DNA:n ja kai- ,v£5 siumfosfaatin ko-sakalle. Seuraavassa geeniekspressiossa siir-• « « retään solut alustoille, jotka selektoivat transformoidut so- .. lut.Cells can be transformed with vehicles by a variety of methods. It can occur, for example, with calcium, in which case either; the cells are washed in magnesium and the DNA is added to the calcium-suspended cells or the cells are exposed to a coagulation of DNA and total phosphate. In the next gene expression, the cells are transferred to media that select for the transformed cells.

• « • »· « * · · • » ( « * « \ Jotta voitaisiin osoittaa E.coli JM101 solujen, jotka sisältä- » · ;30 vät plasmidin pEqG-YYCl tai pEqG-QAAl, ekspressoima interfero- • « · niaktiivisuus, bakteerit laitetaan inkuboinnin jälkeen sopivaan vil jelyalustaan ja supernatant is ta määritetään steriilisuoda- • 4 tuksen jälkeen interferoniaktiivisuus menetelmässä, joka mittaa VSV:n tai EMCV:n sytopaattisen vaikutuksen (CPE). Tähän käyte-35 tään NBL-6 soluja (ATCC CCL 57, hevosennahan epidermisoluja), jotka oli infektoitu VSV:lla (Vesicular-Stomatitis-virus), 99116 19 ja/tai A549-soluja (ATCC CLL185, ihmisen keuhkokarsinooma-solu-linja), jotka oli infektoitu EMCM:lla (Encaphalomyocarditis Virus) .In order to show the interferon activity expressed by E. coli JM101 cells containing plasmid pEqG-YYCl or pEqG-QAA1, after incubation, the bacteria are placed in a suitable culture medium and the supernatant is determined after sterile filtration by interferon activity in a method measuring the cytopathic effect (CPE) of VSV or EMCV using NBL-6 cells (ATCC CCL 57, equine epidermal cells) infected with VSV (Vesicular-Stomatitis virus), 99116 19 and / or A549 cells (ATCC CLL185, human lung carcinoma cell line) infected with EMCM (Encaphalomyocarditis Virus).

5 Ekspressoidut hevosinterferonit osoitetaan leimaamalla proteiinit maksisoluissa. Plasmidikoodatut proteiinit voidaan leimata selektiivisesti in vivo käyttämällä maksisolutekniikkaa (Sancar, A. Et ai., J. Bacteriol, 137. 692-693 (1979). E.coli CSR603 kannalla (CGSC 5830) ei ole mitään mekanismeja, joilla 10 korjata UV-säteilyn aiheuttamat DNA-vauriot. Säteilyttäminen sopivalla UV-säteilyannoksella tuhoaa bakteerikromosin, kun taas sitä vastoin oleellisesti pienemmät ja useampina kopioina solua kohti läsnäolevat plasmidi-DAN:t jäävät toimintakykyisiksi. Sen jälkeen kun kaikki vaurioitumattomat, lisääntyvät solut 15 on tapettu D-sykloseriini-antibiootilla ja endogeeninen mRNA on hajotettu, transkriptoidaan ja translatoidaan jäljelle jääneissä soluissa vain yhä plasmidissa koodatut geenit. Muodostuneet proteiinit voidaan leimata radioaktiivisesti ja osoittaa liittämällä mukaan 35S-metioniinia. E.coli CSR603 transformoidaan .**•.20 tavanomaisilla menetelmillä ekspressioplasmideilla ja transfor-moidut bakteerit selektoidaan ambisilliinipitoisella agar-mal-<·· joilla. Maksisolujen valmistaminen ja proteiininen leimaaminen . tapahtuu A. Sancarin ohjeiden mukaisesti. Molekyylipainon stan- * * » « dardina käytetään 14C-metyloitua proteiiniseosta (Amersham). ,•.*.25 Kontrolleina käytetään pER103-plasmidia, joka sisältää vain h « · promoottorin ilman interferonigeeniä, ja pER2l/l-plasmidia, .. joka sisältää kaksi kopiota humaania IFN-a2arg-geeniä.5 Expressed equine interferons are detected by labeling proteins in maximal cells. Plasmid-encoded proteins can be selectively labeled in vivo using the liver cell technique (Sancar, A. et al., J. Bacteriol, 137, 692-693 (1979)). The E. coli CSR603 strain (CGSC 5830) does not have any mechanisms to correct UV Irradiation with an appropriate dose of UV radiation destroys the bacterial chromosome, whereas substantially smaller and multiple copies of plasmid DAN remain functional after all intact, proliferating cells have been killed by the D-cycloser. and the endogenous mRNA is digested, transcribed and translated in the remaining cells only the genes still encoded in the plasmid The resulting proteins can be radiolabeled and detected by the incorporation of 35S-methionine E. coli CSR603 is transformed. ** • .20 by expression methods with bacteria of expression ambicillin pips are selected Preparation of liver cells and protein labeling. takes place according to the instructions of A. Sancar. A 14C-methylated protein mixture (Amersham) is used as the molecular weight standard. As a control, plasmid pER103 containing only the h «· promoter without the interferon gene and plasmid pER21 / l containing two copies of the human IFN-a2arg gene are used.

• · · • · · • · · • 4 « *, Tunnetut biologiset ja immunologiset määritykset sopivat kek- • · ;.:;3 0 sinnön mukaisten tuotteiden karakterisoimiseen. Koska sekä a-, • · · β- että γ-interferoneille on ominaista PFU- ja CPE-määritykses-sä osoitettavissa oleva antiviraalinen ominaisuus, keksinnön mukaisen EqIFN-y:n erottamiseen a-EqIFN:sta ja/tai β-EqIFN-.sta käytetään hyödyksi interferonin erilaista antigeenisyyttä.4 · *, The known biological and immunological assays are suitable for characterizing the products according to the invention. Since both α-, • · · β- and γ-interferons are characterized by an antiviral property detectable in the PFU and CPE assays, the separation of EqIFN-γ according to the invention from α-EqIFN and / or β-EqIFN-. utilizes the different antigenicity of interferon.

35 99116 2035 99116 20

EqIFN-ocn ja/tai EqIFN-£:n vastaiset antiseerumit eivät neutraloi keksinnön mukaisia polypeptidejä. Toiseksi erotuskriteerik-si sopii keksinnön mukaisten polypeptidien happolabiilisuus sekä herkkyys natriumdodekyylisulfaatille (SDS). Sekä inkuboin-5 ti 0,2%:sen SDS-liuoksen kanssa että polypeptidien inkubointi pH-arvolla 2 muutaman tunnin ajan 4°C:ssa tuhoaa virusten vastaisen aktiivisuuden lähes täydellisesti. EqIFN-α ja EqIFN-β ovat samoissa olosuhteissa stabiileja.Antisera against EqIFN-α and / or EqIFN-? Do not neutralize the polypeptides of the invention. Another distinguishing criterion is the acid lability of the polypeptides of the invention as well as their sensitivity to sodium dodecyl sulfate (SDS). Both incubation with 0.2% SDS and incubation of the polypeptides at pH 2 for a few hours at 4 ° C almost completely destroys the antiviral activity. EqIFN-α and EqIFN-β are stable under the same conditions.

10 Hevosgenomin sekvenssien, joilla on korkea homologia interfe-ronigeenin kanssa, kokonaisluvun osoittamista varten pilkotaan suurimolekyylinen hevos-DNA täydellisesti vastaavilla restrik-tioentsyymeillä ja nämä pilkotut DNA:t erotetaan koon perusteella. Nitroselluloosasuodattimille suoritetun Southern-siir-15 ron, denaturoinnin ja DNA:n kiinnittämisen jälkeen jokainen suodatin hybridisoidaan nik-translatoimattomien koettimien kanssa. Koettimena EqIFN-y:lle käytetään plasmidista pEqG-YYCl saatua fragmenttia, joka sisältää koodaavan sekvenssin koko valmiille interferonille. Tämän jälkeen suodattimet pestään . *.20 stringenteissä olosuhteissa. Autoradiografia tapahtuu DuPontTo demonstrate the integer number of sequences in the equine genome with high homology to the interferon gene, the high molecular weight equine DNA is completely digested with the corresponding restriction enzymes and these digested DNAs are separated by size. After Southern transfer, denaturation, and DNA attachment to nitrocellulose filters, each filter is hybridized to n-untranslated probes. As a probe for EqIFN-γ, a fragment obtained from the plasmid pEqG-YYCl containing the coding sequence for the entire mature interferon is used. The filters are then washed. * .20 string conditions. Autoradiography is done by DuPont

Cronex röntgenfilmillä käyttämällä Kodak Lanex-Regular vahvis-·:· tuskalvoja 7 päivää -80°C:ssa.Cronex X-ray film using Kodak Lanex-Regular reinforcement films for 7 days at -80 ° C.

• * « · ;·. Isännän suoritetun transformoinnin, geenin ekspression ja solu- •.*.25 jen viljelyn olosuhteissa, joissa keksinnön mukainen proteiini • « · ekspressoituu, jälkeen voidaan tuote erottaa tavalliseen tapaan tunnetuilla kromatografisilla erotusmenetelmillä, jolloin saa- • i « daan materiaalia, joka sisältää proteiineja, joissa on tai ei • « · • « * *. ole Leader- ja Tailing-sekvenssit. Keksinnön mukaiset interfe- • · :.·;30 ronit voidaan ekspressoida niin, että N-päässä on Leader-sek-venssi (Pre-IFN) , joka interferonit eräät isäntäsolut voivat :*.·. poistaa. Jos näin ei ole, Leader-polypeptidi (kun se on läsnä) on siten, lohkaistava pois jotta saataisiin valmista interferonia. IFN-klooni voidaan vaihtoehtoisesti modifioida niin, että 35 valmis proteiini muodostuu mikro-organismissa suoraan Pre-IFN:n asemesta. Tätä tapausta varten voidaan käyttää hiivan Mating- li 21 - 99116 feroraonin prekursori-sekvenssiä MF-α-Ι jotta taattaisiin fuusioidun proteiinin oikea "kypsyys" ja tuotteiden erottuminen kasvatusalustaan tai periplasmiseen tilaan. Funktionaalisen tai valmiin IFN:n DNA-sekvenssi voi olla liitetty MF-a-l:n kans-5 sa oletettuun katepsiinimäiseen katkaisukohtaan (Lys-Arg:in jälkeen) asemaan 256 aloituskodonista ATG lähtien (Kurjan, Herskowitz, Cell IQ., 933-943 (1982) .• * «·; ·. After transformation of the host, expression of the gene and culturing of the cells under which the protein of the invention is expressed, the product can be separated in the usual manner by known chromatographic separation methods to obtain a material containing the proteins. with or without • «· •« * *. no Leader and Tailing sequences. The interferons of the invention may be expressed with a Leader sequence (Pre-IFN) at the N-terminus, which interferons may: *. remove. If this is not the case, the Leader polypeptide (when present) must thus be cleaved off to obtain the finished interferon. Alternatively, the IFN clone can be modified so that the mature protein is formed in the microorganism directly in place of Pre-IFN. For this case, the yeast Matingli 21-99116 ferorone precursor sequence MF-α-Ι can be used to ensure proper "maturity" of the fused protein and separation of the products into the culture medium or periplasmic space. The DNA sequence of the functional or mature IFN may be linked with MF-α1 to the putative cathepsin-like cleavage site (after Lys-Arg) at position 256 from the start codon ATG (Kurjan, Herskowitz, Cell IQ., 933-943 ( 1982).

Seuraavassa yleiskaaviossa on kuvattu menetelmä, jolla EqlFN-y 10 voidaan puhdistaa esimerkiksi bakteereista.The following general scheme describes a method by which EqIFN-γ 10 can be purified from, for example, bacteria.

1. Solut uutetaan johtokyvyltään suuressa lyysauspuskurissa (noin pH 8) johtamalla homogenisaattorin läpi korkeassa paineessa; poistovirta jäähdytetään jäähauteessa.1. The cells are extracted in a high conductivity lysis buffer (about pH 8) by passing through a homogenizer under high pressure; the effluent is cooled in an ice bath.

15 2. DNA saostetaan lisäämällä polyetyleeni-iminiä samalla sekoittaen, esimerkiksi 4°C:ssa.2. DNA is precipitated by adding polyethyleneimine with stirring, for example at 4 ° C.

3. Bakteeriproteiinit saostetaan pH:n avulla, jolloin EqIFN-γ : *.20 jää jälleen liuokseen.3. Bacterial proteins are precipitated by pH, leaving EqIFN-γ: * .20 in solution again.

•:· 4. Kiintoaines erotetaan sentrifugoimalla 4°C:ssa.•: · 4. The solid is separated by centrifugation at 4 ° C.

• · · 5. Supernatantti väkevöidään (pH-arvon uudelleen säädön jäl- ,*.*.25 keen) esimerkiksi ultrasuodattamalla.• · · 5. The supernatant is concentrated (after readjustment of the pH, *. *. 25 keen), for example by ultrafiltration.

* · · • · 6. Konsentraatti dialysoidaan johtokyvyltään alhaista puskuria « · · ... vasten.* · · • · 6. The concentrate is dialyzed against a buffer of low conductivity «· · ....

♦ · · • · ;30 7. Kiintoaines erotetaan sentrifugoimalla, jolloin EqIFN-γ jää • · · ‘..,ί liuokseen.♦ · · • ·; 30 7. The solid is separated by centrifugation, leaving EqIFN-γ in the solution.

« · 8. Ioninvaihtokromatografoidaan karboksymetyyliselluloosalla eluoimalla gradientilla, jonka ionivahvuus kasvaa.«· 8. Ion exchange chromatography on carboxymethylcellulose eluting with a gradient of increasing ionic strength.

35 22 - 99116 9. Kromatografoidaan kalsiumfosfaatti-geelillä ja eluoidaan gradientilla, jonka ionivahvuus kasvaa.35 22 - 99116 9. Chromatograph on a calcium phosphate gel and elute with a gradient of increasing ionic strength.

10. Ioninvaihtokromatografoidaan karboksimetyyliselluloosalla 5 heikosti denaturoivissa olosuhteissa ja eluoidaan gradientilla, jonka ionivahvuus kasvaa.10. Ion exchange chromatography on carboxymethylcellulose 5 under weakly denaturing conditions and eluted with a gradient of increasing ionic strength.

11. Erotetaan geelisuodatuskromatografiän avulla.11. Separate by gel filtration chromatography.

10 Mainitulla menetelmällä on mahdollista päästä puhtaudeltaan yli 95%:n materiaalisaantoihin.10 With said method it is possible to obtain material yields with a purity of more than 95%.

Tässä kohdassa mainittakoon, että keksinnön mukaisissa interferoneissa ei ole kysymys vain interferoneista, jotka on kuvattu 15 yksitellen, vaan myös näiden polypeptidien jokaisesta modifikaatiosta, joka ei oleellisesti muuta hevos-γ-IFN-aktiivisuut-ta. Näihin modifikaatioihin sisältyvät esimerkiksi molekyylin lyhentäminen, esimerkiksi N- tai C-terminaalisessa päässä, aminohappojen vaihtaminen muihin ryhmiin, molekyylin kemialli-. '.2.0 set ja biokemialliset sitomiset muihin molekyyleihin, jotka ovat inerttejä tai aktiivisia. Viimeksi mainituissa modifikaa-·’" tioissa voi olla kysymys esimerkiksi hybridimolekyyleistä, jot-It should be noted at this point that the interferons of the invention are not only interferons described individually, but also any modification of these polypeptides that does not substantially alter the equine γ-IFN activity. These modifications include, for example, truncation of the molecule, e.g., at the N- or C-terminus, exchange of amino acids with other groups, chemical-. .2.0 and biochemical binding to other molecules that are inert or active. The latter modifications may be, for example, hybrid molecules which

• ( I• (I

:ka muodostuvat yhdestä tai useammasta keksinnön mukaisesta ini'. _ terferonista ja/tai tunnetuista a- tai β-interferoneista.: consist of one or more ini 'according to the invention. _ terferon and / or known α- or β-interferons.

t • · 25 i : : • ·t • · 25 i:: • ·

Uusia, keksinnön mukaisia interferoneja voidaan käyttää biolo- ;·. giseen vaikutuskirjoonsa perustuen kaikenlaatuisissa hoidoissa, • · ♦ \..4 joihin myös tunnettuja interferoneja käytetään. Näihin kuuluvat • · » esimerkiksi herpes, nuhavirus, Equine-Abortion-virus, erilaiset • · :.::30 syöpälajit ja vastaavat. Uusia interferoneja voidaan käyttää • · · yksinään tai yhdistelmänä muiden tunnettujen interferonien tai biologisesti aktiivisten tuotteiden kanssa, esimerkiksi IFN-alfan, IL-2:n, muiden imuuni-modulaattoreiden ja vastaavien kanssa.The novel interferons of the invention can be used biologically; based on its spectrum of activity in all types of therapies, • · ♦ \ .. 4 which also use known interferons. These include • · »herpes, rhinitis virus, Equine-Abortion virus, various • ·:. :: 30 cancers and the like. The novel interferons can be used alone or in combination with other known interferons or biologically active products, for example, IFN-alpha, IL-2, other immune modulators, and the like.

35 - 99116 2335 - 99116 23

Keksinnön mukaisia interferoneja voidaan antaa parenteraalises-ti tapauksissa, joissa tarvitaan tuumorien vastaista tai virusten vastaista hoitoa, ja tapauksessa, jossa esiintyy immunosup-ressiivisia ominaisuuksia. Annostelu ja annostelumäärät voivat 5 olla samanlaiset kuin mitä tällä hetkellä käytetään IFN-materi-aalien kliinisissä tutkimuksissa, esimerkiksi noin (1-10) x 106 yksikköä päivässä, ja preparaateilla, joiden puhtaus on yli 1%, esimerkiksi 5 x 107 yksikköön asti päivässä.The interferons of the invention may be administered parenterally in cases where anti-tumor or anti-viral treatment is required and in cases where immunosuppressive properties are present. Dosage and dosage amounts may be similar to those currently used in clinical trials of IFN materials, for example, about (1-10) x 10 6 units per day, and formulations greater than 1% pure, for example, up to 5 x 10 7 units per day.

10 Kun kyseessä on oleellisesti homogeeninen, bakteereiden avulla tuotettu keksinnön mukainen IFN, voidaan tarkoituksenmukaista annostelumuotoa varten parenteraalisessa käytössä esimerkiksi liuottaa 3 mg EqIFN-y:aa 25 ml:aan 5%:sta eläinperäistä seeru-mialbumiinia, parhaiten hevos/koira-seerumialbumiinia. Tämä 15 liuos viedään sen jälkeen bakteerisuodattimen läpi ja suodatettu liuos jaetaan aseptisesti sataan pulloon, joista kukin sisältää 6 x 106 yksikköä puhdasta, parenteraaliseen antamiseen sopivaa interferonia. Ennen käyttöä pulloja säilytetään parhaiten kylmässä (-20°C). Keksinnön mukaiset aineet voidaan formu-; '..20 loida tunnetulla tavalla niin, että saadaan farmaseuttisesti : käyttökelpoisia aineita. Tällöin keksinnön mukainen polypepti- ·· di sekoitetaan farmaseuttisen, hyväksyttävän kantajan kanssa.In the case of a substantially homogeneous bacterial IFN according to the invention, for example, 3 mg of EqIFN-γ can be dissolved in 25 ml of 5% serum albumin of animal origin, preferably horse / dog serum albumin, for a suitable dosage form for parenteral use. This solution is then passed through a bacterial filter and the filtered solution is aseptically dispensed into one hundred vials, each containing 6 x 10 6 units of pure interferon suitable for parenteral administration. Before use, bottles are best stored refrigerated (-20 ° C). The substances according to the invention can be formulated; '..20 melt in a known manner to give pharmaceutically: useful substances. In this case, the polypeptide of the invention is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier.

: Tavanomaisia kantajia ja niiden formulointia on kuvattu E.W.: Conventional carriers and their formulation are described in E.W.

I'. Martinin teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, mihin jV.25 erityisesti viitataan. Sopivia farmaseuttisia aineita, jotka • · sopivat tehokkaaseen käyttöön vastaanottajalla (potilaalla), ;·. saadaan sekoittamalla keksinnön mukaiset interferonit mitatun • * * määrän kanssa kantajaa. Parhaiten käytetään parenteraalista • · · applikointia.I '. Martin's Remington's Pharmaceutical Sciences, specifically referred to in jV.25. Suitable pharmaceutical agents that are suitable for effective use by the recipient (patient); is obtained by mixing the interferons of the invention with a measured amount of carrier. Parenteral • · · application is best used.

• · • · · :30 • · · Käsillä olevan keksinnön kohteena ovat edelleen monoklonaaliset :·.·. vasta-aineet keksinnön mukaisia polypeptidejä vastaan, hybrido- I t masolut, jotka tuottavat tällaisia vasta-aineita, ja näiden valmistusmenetelmät. Parhaiten pidetään hybridomasolulinjoja ja 35 näiden erittämiä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat spesifisesti EqIFN-y:n kanssa. Menetelmälle, jolla tällaisia 99116 24 monoklonaalisia vasta-aineita valmistetaan, on tunnusomaista, että pienet nisäkkäät, esimerkiksi kaniinit tai hiiret immunisoidaan keksinnön mukaisilla polypeptideillä, tällä tavoin immunisoitujen eläinten B-lymfosyytit fuusioidaan myeloomasolu-5 jen kanssa, muodostuneet hybridomasolut kloonataan, sen jälkeen viljellään in vitro tai injisoimalla hiiriin ja eristetään vasta-aineet viljelmistä.The present invention further relates to monoclonal:. antibodies against the polypeptides of the invention, hybridoma cells producing such antibodies, and methods for their preparation. Hybridoma cell lines and the secreted monoclonal antibodies that specifically react with EqIFN-γ are preferred. The method for producing such 99116 24 monoclonal antibodies is characterized in that small mammals, for example rabbits or mice, are immunized with the polypeptides of the invention, B lymphocytes from animals immunized in this way are fused with myeloma cells, and the resulting hybridoma cells are cloned, cloned. in vitro or by injection into mice and isolating antibodies from cultures.

Keksinnön kohteena ovat edelleen immuno-affiniteettikromato-10 grafia-pylväät ja immunomäärityksiin tarkoitetut testikitit, jotka sisältävät näitä vasta-aineita.The invention further relates to immunoaffinity chromatographic columns and test kits for immunoassays containing these antibodies.

Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti immunisoidaan hiiret, esimerkiksi Balb/c-hiiret, sinänsä tunnetuilla tavoilla. Erääs-15 sä hyvin pidetyssä suoritusmuodossa injisoidaan keksinnön mukaisia polypeptidejä noin kerran viikossa tai myös pidemmin välein useamman viikon aikana, esimerkiksi 5-12 viikon aikana, kunnes vasta-ainetta tuottavia B-lymfosyyttejä on muodostunut riittävä määrä.According to the method of the invention, mice, for example Balb / c mice, are immunized in a manner known per se. In one well-liked embodiment, the polypeptides of the invention are injected about once a week or also at longer intervals over several weeks, for example, 5 to 12 weeks, until a sufficient number of antibody-producing B lymphocytes are formed.

:*’*.·20 : *.: Immunisoitujen hiirten B-lymfosyyttejä sisältävät elimet, ,:· esimerkiksi pernasolut poistetaan ja fuusioidaan sellaisten : myeloomasolujen kanssa, jotka mutaation vuoksi eivät kasva se- i’,, lektiivisessä viljelyalustassa. Tällaiset myeloomasolut ovat ,'.‘.25 tunnettuja, ja näitä ovat esimerkiksi solut, joista käytetään nimityksiä X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 ;·. NS/l tai SP2/0. Eräässä hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa • · · .···. fuusioidaan immunisoitujen hiirten pernasoluja solulinjan • · · X63-Ag8.6.5.3 myeloomasolujen kanssa. Fuusio suoritetaan sinän- • · * · · : 3O sä tunnetuilla menetelmillä sekoittamalla B-lymfosyyttejä ja • · · ‘,..· myeloomasoluja samalla kun lisätään solujen fuusiointiainetta kuten polyetyleeniglykolia, Sendai-viruksia, kalsiumkloridia « t ·...: tai lysolesitiiniä. Parhaiten fuusioidaan polyetyleeniglykolin, esimerkiksi polyetyleeniglykolin, jonka molekyylipaino on vä-35 Iillä 1000 ja 4000, läsnäollessa. Fuusion jälkeen viljellään muodostuneita hybridejä sinänsä tunnetulla menetelmällä selek-: * '*. · 20: * .: B-lymphocyte-containing organs from immunized mice, for example, spleen cells are removed and fused with: myeloma cells that do not grow in a selective culture medium due to mutation. Such myeloma cells are known and include, for example, cells designated X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NS1-Ag4 / 1, MOPC-21; NS / 1 or SP2 / 0. In a preferred embodiment, the • · ·. ···. fusing spleen cells from immunized mice with myeloma cells of the cell line • · · X63-Ag8.6.5.3. The fusion is performed by methods known per se by mixing B lymphocytes and • · · ', .. · myeloma cells while adding a cell fusing agent such as polyethylene glycol, Sendai viruses, calcium chloride or lysolecithin. . It is best fused in the presence of polyethylene glycol, for example polyethylene glycol having a molecular weight of between 1000 and 4000. After fusion, the hybrids formed are cultured by a method known per se.

IIII

99116 25 tiivisessä viljelyalustassa, joka on täydennetty hypoksantii-nilla, aminopteriinillä ja tymidiinillä (HAT-alusta). Fuusioi-tumattomat myeloomasolut eivät kykene kasvamaan tässä alustassa ja ne, kuten myös normaalit lymfosyytit kuolevat.99116 in 25 dense culture medium supplemented with hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium). Non-fused myeloma cells are unable to grow in this medium and, like normal lymphocytes, die.

55

Hybridoma-viljelmien supernatanteista voidaan tutkia sinänsä tunnetuilla menetelmillä niiden spesifisten vasta-aineiden pitoisuus, esimerkiksi radio-immunomäärityksen tai aglutinoinnin avulla. Hybridomasolut, jotka tuottavat spesifisyydeltään halu-10 tunlaisia vasta-aineita, erotetaan kloonaamalla fuusioinnin muodostamasta mitä erilaisimpien hybridomasolujen seoksesta. Tätä varten valmistetaan sinänsä tunnetulla menetelmällä, josta käytetään nimitystä "limiting dilution", viljelmiä lähtemällä yhdestä ainoasta kasvavasta solusta.Supernatants from hybridoma cultures can be assayed for their specific antibodies by methods known per se, for example, by radioimmunoassay or agglutination. Hybridoma cells that produce antibodies of the desired specificity are separated by cloning from a mixture of the most diverse hybridoma cells formed by fusion. For this purpose, cultures are prepared by a method known per se, called "limiting dilution", starting from a single growing cell.

1515

Massatuotantoa varten viljellään hybridoma-soluklooneja, jotka tuottavat spesifisyydeltään halutunlaisia vasta-aineita, joko sinänsä tunnetuissa alustoissa in vitro tai niitä injisoidaan hiiriin niiden määrän lisäämiseksi. Eräässä hyvänä pidetyssä • · : *··20 suoritusmuodossa injisoidaan hybridomasoluja pristaanilla esi-i’.j käsiteltyihin hiiriin, poistetaan Aszites-neste ja vasta-aineet '· eristetään tästä saostamalla ammoniumsulfaattiliuoksella.For mass production, hybridoma cell clones are produced that produce antibodies of the desired specificity, either in vitro in media known per se or injected into mice to increase their number. In a preferred embodiment, hybridoma cells are injected into mice pretreated with pristane, the Aszites fluid is removed, and the antibodies are isolated therefrom by precipitation with ammonium sulfate solution.

1 I l1 I l

I | t II | t I

I·, Näiden hybridomasolujen avulla saatuja spesifisiä vasta-aineita < jV.25 voidaan käyttää sinänsä tunnetulla tavalla immunoaffiniteetti-• · kromatografia-pylväiden valmistamiseen. Keksinnön eräässä hyvä- ;·. nä pidetyssä suoritusmuodossa lisätään sopivaan kantajaan (joka • * * on suspendoitu puskuriliuokseen) vasta-aineliuosta, sitoutumat- • « t tomat osat pestään tämän jälkeen pois ja salvataan kantajamate- • ♦ • · ♦ :.::30 naalin vapaat paikat.Specific antibodies obtained from these hybridoma cells can be used in a manner known per se to prepare immunoaffinity chromatography columns. In one aspect of the invention; In this preferred embodiment, an antibody solution is added to a suitable carrier (suspended in a buffer solution), the unbound portions are then washed away, and the free sites of the carrier are blocked.

• · · i : ··♦ « j'.'. Vasta-aineita voidaan käyttää myös terapiassa.• · · i: ·· ♦ «j '.'. Antibodies can also be used in therapy.

Hybridomasolujen avulla saatuja spesifisiä vasta-aineita voi-35 daan käyttää sinänsä tunnetulla tavalla testikittien valmistamiseen. Nämä testikitit voivat perustua mitä erilaisimpiin me- . 99116 26 netelmiin, esimerkiksi radio-immunomääritykseen, lateksi-aglu-tanointiin, täplä-testeihin, kompetetiiviseen tai Sandwich-radio- immunomääritykseen, entsyymi-immunomääritykseen, immuno-fluorosenssiin tai immunokemiallisiin entsyymitesteihin.Specific antibodies obtained by hybridoma cells can be used in a manner known per se to prepare test kits. These test kits can be based on a wide variety of me-. 99116 26 methods, for example, radioimmunoassay, latex agglutination, spot assays, competitive or Sandwich radioimmunoassay, enzyme immunoassay, immunofluorescence, or immunochemical enzyme assays.

55

Eriteltynä keksinnön kohteena ovat: polypeptidit oleellisesti puhtaassa muodossa - joilla on hevos-interferoni-γ:n (EqIFN-γ) biologiset ja immunologiset ominaisuudet; 10 - jotka eivät oleellisesti sisällä muita eläinperäisiä prote iineja; - joissa ei ole natiivia glykolysaatiota; - joissa on metioniini-aminohappo ennen N-pään 1. aminohappoa; - joilla on aminohapposekvenssi 15 15 10 15In particular, the invention relates to: polypeptides in substantially pure form - having the biological and immunological properties of equine interferon-γ (EqIFN-γ); 10 - substantially free of other proteins of animal origin; - without native glycolysis; - having a methionine amino acid before the N-terminal 1 amino acid; having the amino acid sequence

Tyr Tyr Cys Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys 20 25 30Tyr Tyr Cys Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys 20 25 30

Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro : '··20 35 40 45Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro: '·· 20 35 40 45

Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys 50 55 60 j Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe i'\, 65 70 75 i" ·' ·25 Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr • · 80 85 90Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys 50 55 60 j Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe i '\, 65 70 75 i "·' · 25 Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr • · 80 85 90

Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser • «· /;·. 95 100 105 • · *Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser • «· /; ·. 95 100 105 • · *

Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp • · : 30 no 115 120 • · · *...· Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met « 125 130 135Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp • ·: 30 of 115 120 • · · * ... · Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met «125 130 135

Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser 140 145 35 Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin *** « 4 li - 99116 27 taiAsn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser 140 145 35 Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin *** «4 li - 99116 27

Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro 5 Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp LysGin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro 5 Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys

Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu PheLys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp ThrGlu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr

Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr SerIle Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser

Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp 10 Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai MetLys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp 10 Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met

Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg SerAsn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser

Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin *** DNA-molekyyli, jotka koodaavat: 15 - polypeptidiä, jolla on EqIFN-Y:n biologiset ja immunologiset ominaisuudet; - edellä annettua polypeptidiä; - valmista EqIFN-γ.Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin *** DNA molecule encoding: a polypeptide having the biological and immunological properties of EqIFN-Y; - the above polypeptide; - prepare EqIFN-γ.

« · : '>·20 DNA-molekyylit, jotka I t *11 *j - sisältävät täydellisen, luonnonmukaisen geenin EqlNF-yrlle; *" - nukleotidit«·: '> · 20 DNA molecules that I t * 11 * j - contain a complete, natural gene for EqlNF; * "- nucleotides

t I I I I It I I I I I

I · , ,I ·,,

ί ·, ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATTί ·, ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT

,V.25 i · · • ·, V.25 i · · • ·

TTG GGT TCT TCT ACC TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAATTG GGT TCT TCT ACC TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA

f e « « « · \v ---------1 N T R 0 N I 1------- « « ·f e «« «· \ v --------- 1 N T R 0 N I 1 -------« «·

ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGAC CTTTTAATAATACTTACATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGAC CTTTTAATAATACTTAC

• «• «

ί.! ί 3 0 TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCTί.! ί 3 0 TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT

I I ·I I ·

l...: ACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGTl ...: ACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT

• ;'. ‘: TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA•; '. ‘: TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA

I |I |

•..,: GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT• ..,: GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT

ii

AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG 3 5 ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGCAGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG 3 5 ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAGCTGAAATT

. 99116 28. 99116 28

GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG ATTTTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA 5 TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT 10 TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTTGCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG ATTTTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA 5 TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT 10 TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT

TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GDATTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GDA

15 AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC15 AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC

-------------------X N T R O N I 2-------------------- X N T R O N I 2-

TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGTTTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT

• '-.20 TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG• '-.20 TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG

III 4 I I 4III 4 I I 4

GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TACGAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC

< « « 4 I (<«« 4 I (

! ·,. TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG! · ,. TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG

• V. 25 t · 4• V. 25 t · 4

AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AACAGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC

( » t I < « ·(»T I <« ·

AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG AAT CAG ATTAGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG AAT CAG ATT

» · I»· I

« ♦ » « • · ·.· : 30 -----------1 N T R O N I 3-----------------------------«♦» «• · ·. ·: 30 ----------- 1 NTRONI 3 ------------------------- ----

««I«« I

CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCTCCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT

»»

i ” ’. TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCCi ”’. TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC

• I• I

I iI i

.,.; TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT.,.; TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT

< I<I

GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA 3 5 GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAGGATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA 3 5 GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC CTTGTTCGTGAGATGAAATCC

. 99116 29. 99116 29

AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT GGGTTCACTAAAATTT CTATGATCTTCTTTGCTCTATAAT C CTACAATTCTGTGGACAGA AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC 5 CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG 10 GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA 15 GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCCAGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT GGGTTCACTAAAATTT CTATGATCTTCTTTGCTCTATAAT C CTACAATTCTGTGGACAGA AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC 5 CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG 10 GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA 15 GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC

AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTCAATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC

*•,‘120 ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG* •, ‘120 ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG

: CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA: CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA

«II I • · I ' · * « * * *«II I • · I '· *« * * *

25 TAG25 TAG

• · • · • · · tai • « *• · • · • · · or • " *

TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAATAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA

• · • · · · *••.*30 -----1 N T R O N I 1------- :*·'; ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATACTTAC • ·• · • · · · * ••. * 30 ----- 1 N T R O N I 1 -------: * · '; ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATACTTAC • ·

•. - ·; TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT•. - ·; TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT

ACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA 3 5 GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGGACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA May 3 GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG

. 99116 30. 99116 30

ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG ATTTTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT 5 TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTCAAATTATTTGCT 10 TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTTACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG ATTTTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT 5 TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTCAAATTATTTGCT 10 TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT

15 TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GCA15 TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GCA

AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATCAGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC

: ’·· -------------------1 N T R O N I 2-: ‘·· ------------------- 1 N T R O N I 2-

'.'•.'20 TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT'.' • .'20 TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT

: : TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG:: TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG

:V: GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC: V: GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC

2525

*.*. TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG*. *. TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG

• · · • · ·• · · • · ·

AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AACAGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC

• · • · « • · · · :···:30 AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT * • · · • · · ....: -----------I N T R O N I 3-----------------------------• · • · «• · ·: ···: 30 AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT * • · · • · · ....: -------- --- INTRONI 3 -----------------------------

CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC 3 5 TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCACCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC May 3 TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA

l! 99116 31l! 99116 31

GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT 5 GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCCTACAATTCTGTGGACAGA AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT 10 GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT 15 TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCCGTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT 5 GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCCTACAATTCTGTGGACAGA AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT 10 GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT 15 TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA GCTAACATATTCCTGG TGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC

V<'20 AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTCV <'20 AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC

: ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG: ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG

CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA 25 ·· * * * • *CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA 25 ·· * * * • *

• I I• I I

/:·. TAG/ ·. TAG

• · « · · 32 99116 50 55 60• · «· · 32 99116 50 55 60

AAA ΑΤΑ ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAA CTC TTTAAA ΑΤΑ ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAA CTC TTT

65 70 7565 70 75

GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAC ACCGAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAC ACC

5 80 85 905 80 85 90

ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGC AGC ACC AGCATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGC AGC ACC AGC

95 100 10595 100 105

AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT CCG GTA AAT GATAAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT CCG GTA AAT GAT

110 115 120110 115 120

10 CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC ATC AAA GTG ATG10 CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC ATC AAA GTG ATG

125 130 135125 130 135

AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGTAAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT

140 145140 145

CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA TAGCAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA TAG

15 tai '.:2 0 -11 5 10 1515 or '.: 2 0 -11 5 10 15

; ATG TAC TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA; ATG TAC TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA

·!'·.. 20 25 30·! '· .. 20 25 30

GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCGGAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG

25 35 40 4525 35 40 45

CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAACTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA

• I · 50 55 60 « · ·• I · 50 55 60 «· ·

AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTCAAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC

• · • « « :·: : 65 70 75 ··*• · • ««: ·: 65 70 75 ·· *

1..·:3 0 GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT1 .. ·: 3 0 GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT

Γ·*: 80 85 90 • ·Γ · *: 80 85 90 • ·

·:·; ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT· ·; ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT

95 100 105 AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC 35 110 115 12095 100 105 AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC 35 110 115 120

CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA CTT ATGCTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA CTT ATG

I.I.

99116 33 125 130 13599116 33 125 130 135

AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCTAAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT

140 145 CAG AAC CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA 5 tai -11 5 10 15140 145 CAG AAC CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA 5 or -11 5 10 15

ATG CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTCATG CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC

10 20 25 3010 20 25 30

AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTGAAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG

35 40 4535 40 45

GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATCGAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC

50 55 6050 55 60

15 CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG15 CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG

65 70 7565 70 75

AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAAAAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA

80 85 9080 85 90

: ’·· GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA: '·· GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA

:.‘1:20 95 100 105:. ’1:20 95 100 105

GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTTGAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT

110 115 120110 115 120

CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTGCAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG

: V: 125 130 135: V: 125 130 135

25 TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA25 TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA

I1. 140 143 • « · «I1. 140 143 • «·«

TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAATTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA

• · · « • « · ja mahdollisesti lisäksi johto-sekvenssin ‘•••:30• · · «•« · and possibly in addition to the lead sequence ‘•••: 30

:1·1: ATG ΑΑΤ TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT: 1 · 1: ATG ΑΑΤ TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT

• ·• ·

·:··: TTG GGT TCT TCT ACC·: ··: TTG GGT TCT TCT ACC

tai ATG:n, - hybridisoituvat jonkin edellä mainitun DNA-molekyylin kanssa 35 olosuhteissa, joissa homologia on yli 85%, parhaiten yli 90%, jolloin nämä DNA-molekyylit voivat olla alkuperältään luonnon- 34 99116 mukaisia, synteettisiä tai puolisynteettisiä ja voivat olla lähisukuisia näiden DNA-tnolekyylien kanssa mutaatioiden, nukleotidi-substituoiden, nukleotidi-deleetioiden, nukleotidi-inserttien ja nukleotidien inversioiden kautta ja jotka koodaa-5 vat polypeptidejä, joilla on EqIFN-y:n biologinen ja immunologinen aktiivisuus.or ATG, - hybridize to one of the aforementioned DNA molecules under conditions of homology of more than 85%, preferably more than 90%, these DNA molecules may be of natural, synthetic or semi-synthetic origin and may be closely related. with these DNA molecules through mutations, nucleotide substitutions, nucleotide deletions, nucleotide inserts, and nucleotide inversions, and which encode polypeptides having the biological and immunological activity of EqIFN-γ.

DNA-molekyylit: jotka sisältävät nukleotidit 10DNA molecules: containing nucleotides 10

EG-1 51-TACTACTGCC AGGCTGCTTT CTTTAAAGAA ATCGAAAACC TGAAAGAATAEG-1 51-TACTACTGCC AGGCTGCTTT CTTTAAAGAA ATCGAAAACC TGAAAGAATA

CTTCAACGCT CG-3' tai 15CTTCAACGCT CG-3 'or 15

EG-2 5’-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTGGCAEG-2 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTGGCA

GTAGTA-3' : *' taiGTAGTA-3 ': *' or

EG-3 5 '-TAACCCAGAC GTTGGTGACG GTGGTCCGCT GTTCCTGGAC ATCCTGAAAAEG-3 5'-TAACCCAGAC GTTGGTGACG GTGGTCCGCT GTTCCTGGAC ATCCTGAAAA

ACTGGAAAGA AGACTCTG-3 ' I * · : : : tai 25ACTGGAAAGA AGACTCTG-3 'I * ·::: or 25

EG-4 5'-TTCTTTCCAG TTTTTCAGGA TGTCCAGGAA CAGCGGACCA CCGTCACCAAEG-4 5'-TTCTTTCCAG TTTTTCAGGA TGTCCAGGAA CAGCGGACCA CCGTCACCAA

.*:*· CGTCTGGGTT ACGAGCG-3 ' • · • « « • · · ··· " tai •:::=3o. *: * · CGTCTGGGTT ACGAGCG-3 '• · • «« • · · ··· "or • ::: = 3o

Γ·': EG-5 5'-ACAAAAAGAT CATCCAGTCT CAGATCGTTT CTTTCTACTT CAAACTGTTCΓ · ': EG-5 5'-ACAAAAAGAT CATCCAGTCT CAGATCGTTT CTTTCTACTT CAAACTGTTC

• · ·:··: GAAAACCTGA AAGACAACC-3 ' tai li 35 99116 35• · ·: ··: GAAAACCTGA AAGACAACC-3 'or li 35 99116 35

EG-6 5'-TTTCAGGTTT TCGAACAGTT TGAAGTAGAA AGAAACGATC TGAGACTGGAEG-6 5'-TTTCAGGTTT TCGAACAGTT TGAAGTAGAA AGAAACGATC TGAGACTGGA

TCATCTTTTT GTCAGAGTC-31TCATCTTTTT GTCAGAGTC-31

EG-7 5'-AGGTTATCCA GAAATCGATG GACACTATCA AAGAAGATCT GTTCGTTAAAEG-7 5'-AGGTTATCCA GAAATCGATG GACACTATCA AAGAAGATCT GTTCGTTAAA

5 TTCTTCAACT CG-3' tai5 TTCTTCAACT CG-3 'or

EG-8 5'-TCGACGAGTT GAAGAATTTA ACGAACAGAT CTTCTTTGAT AGTGTCCATCEG-8 5'-TCGACGAGTT GAAGAATTTA ACGAACAGAT CTTCTTTGAT AGTGTCCATC

10 GATTTCTGGA TAACCTGGTT GTC-3' tai10 GATTTCTGGA TAACCTGGTT GTC-3 'or

EG-9 5'-TCGACTTCTA AACTGGAAGA CTTCCAGAAA CTGATCCAGA TCCCAGTTAAEG-9 5'-TCGACTTCTA AACTGGAAGA CTTCCAGAAA CTGATCCAGA TCCCAGTTAA

15 CGACCTGAAA-3' tai : *·* EG-10 5'-GCTGAACTTT CAGGTCGTTA ACTGGGATCT GGATCAGTTT CTGGAAGTCT \‘\:20 TCCAGTTTAG AAG-3 ' i tai15 CGACCTGAAA-3 'or: * · * EG-10 5'-GCTGAACTTT CAGGTCGTTA ACTGGGATCT GGATCAGTTT CTGGAAGTCT \' \: 20 TCCAGTTTAG AAG-3 'i or

I < II <I

i (Y: EG-11 5 ' -GTTCAGCGTA AGGCTATCTC TGAACTGATC AAAGTTATGA ACGACCTGTCi (Y: EG-11 5'-GTTCAGCGTA AGGCTATCTC TGAACTGATC AAAGTTATGA ACGACCTGTC

25 TCCAAAAGCT AA-3' • · • · » · · tai • · · • · • · »25 TCCAAAAGCT AA-3 '• · • · »· · or • · · • · • ·

:;5.: EG-12 5 ' -CGCAGGTTAG CTTTTGGAGA CAGGTCGTTC ATAACTTTGA TCAGTTCAGA:; 5 .: EG-12 5 '-CGCAGGTTAG CTTTTGGAGA CAGGTCGTTC ATAACTTTGA TCAGTTCAGA

*•••*30 GATAGCCTTA C-3 ' • · « • · · • » • · tai EG-13 5'-CCTGCGTAAA CGTAAACGTT CTCAGAACCC ATTCCGTGGT CGTCGTGCTC 35 TTCAGTAAG-3' • 99116 36 tai EG-14 5'-GATCCTTACT GAAGAGCACG ACGACCACGG AATGGGTTCT GAGAACGTTT ACGTTTA-3' 5 tai EG-15 5'-CAGGCTGCTT TCTTTAAAGA AATCGAAAAC CTGAAAGAAT ACTTCAACGC TCG-3' 10 tai EG-16 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTG-3' 15 jotka koodaavat EqIFN-Y:n osa-alueita, ja näiden DAN-molekyylien koodaamat polypeptidit; - jotka hybridisoituvat jonkin edellä mainitun DNA-molekyylin kanssa olosuhteissa, joissa homologia on yli 85%, parhaiten yli « '· " 90%, jolloin nämä DNA-molekyylit voivat olla alkuperältään *. '120 luonnonmukaisia, synteettisiä tai puolisynteettisiä ja lähisu- i kua näiden DNA-molekyylien kanssa mutaatioiden, nukleotidisubs-; tituutioiden, nukleotidi-deleetioiden, nukleotidi-insertioiden '·· ja nukleotidien inversioiden kautta ja koodata EqIFN-y:n osa-: : : alueita, sekä näiden DNA-molekyylien koodaamat polypeptidit.* ••• * 30 GATAGCCTTA C-3 '• · «• · · •» • EG-13 5'-CCTGCGTAAA CGTAAACGTT CTCAGAACCC ATTCCGTGGT CGTCGTGCTC 35 TTCAGTAAG-3' • 99116 36 or EG-14 5'-GATCCTTACT GAAG ACGACCACGG AATGGGTTCT GAGAACGTTT ACGTTTA-3 '5 or EG-15 5'-CAGGCTGCTT TCTTTAAAGA AATCGAAAAC CTGAAAGAAT ACTTCAACGC TCG-3' 10 or EG-16 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATT regions, and polypeptides encoded by these DAN molecules; - which hybridize to one of the abovementioned DNA molecules under conditions of homology of more than 85%, preferably more than "90%", in which case these DNA molecules may be of natural, synthetic or semi-synthetic origin and close to with these DNA molecules through mutations, nucleotide substitutions, nucleotide deletions, nucleotide insertions and nucleotide inversions, and to encode EqIFN-γ subregions, as well as polypeptides encoded by these DNA molecules.

2525

Rekombinantti-DNA-molekyylit, esimerkiksi vektorit, parhaiten * plasmidit, jotka sisältävät: , - edellä mainittua polypeptidiä koodaavan insertin; • · r *··/ - edellä mainitun DNA-molekyylin; | · ·;·*30 - edellä mainitun DNA-molekyylin funktionaalisessa yhteydessä « · * • ekspression kontrollisekvenssin kanssa niin, että se voi repli-'!"i koitua mikro-organismeissa kuten prokaryooteissa, esimerkiksi E.coli-bakteerissa, eukaryooteissa, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae-hiivassa, ja nisäkässoluissa, esimerkiksi hevosso-35 luissa;Recombinant DNA molecules, for example vectors, preferably * plasmids containing: - an insert encoding the above-mentioned polypeptide; • · r * ·· / - the above-mentioned DNA molecule; | · ·; · * 30 - in functional association with the expression control sequence of the aforementioned DNA molecule so that it can replicate in microorganisms such as prokaryotes, e.g. E. coli, eukaryotes, e.g. Saccharomyces cerevisiae yeast, and in mammalian cells, for example, horse-35 bones;

IIII

37 99116 - vähintään kaksi nimillä EG-1 - EG-16 merkittyä DNA-molekyyliä liitettynä toisiinsa mielivaltaisena yhdistelmänä funktionaalisessa yhteydessä ekspression kontrollisekvenssin kanssa niin, että nämä voivat replikoitua mikro-organismeissa kuten prokary-5 ooteissa, esimerkiksi E.coli-bakteereissa, eukaryooteissa, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae-hiivassa ja nisäkässoluissa, esimerkiksi hevossoluissa.37 99116 - at least two DNA molecules labeled EG-1 to EG-16 linked together in an arbitrary combination in functional association with an expression control sequence so that they can replicate in microorganisms such as prokaryotes, e.g. E. coli, eukaryotes, for example Saccharomyces cerevisiae in yeast and mammalian cells, for example horse cells.

Rekombinantti-DNA-molekyylit, kuten plasmidit pAHlll, pRH28l/5, 10 pRH282/5, pGNl, pGN3, pGN20, pEqGE-QAA2 tai pEqG-QAA3.Recombinant DNA molecules such as plasmids pAH111, pRH281 / 5, pRH282 / 5, pGN1, pGN3, pGN20, pEqGE-QAA2 or pEqG-QAA3.

Isäntäorganismit, jotka on transformoitu jollakin edellä mainitulla rekombinantti-DNA-molekyylillä, esimerkiksi prokaryootit, parhaiten E.coli, erityisesti E.coli JM101 tai HB101, eukaryoo-15 tit, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae tai nisäkässolulin-jat, parhaiten hevossolulinjat.Host organisms transformed with one of the above-mentioned recombinant DNA molecules, for example prokaryotes, preferably E. coli, in particular E. coli JM101 or HB101, eukaryotes, for example Saccharomyces cerevisiae or mammalian cell lines, preferably equine cell lines.

Menetelmä valmistaa keksinnön mukaisia polypeptidejä, jolloin • « • «* « • * .:20 a) sopivat isäntäorganismit, esimerkiksi edellä mainitut, transformoidaan geneettisillä informaatioilla, jotka koodaavat - keksinnön mukaisia polypeptidejä, parhaiten edellä mainituillaThe method for producing the polypeptides of the invention, wherein: a) suitable host organisms, for example those mentioned above, are transformed with genetic information encoding - polypeptides of the invention, preferably with the above-mentioned

« I«I

| '·« rekombinantti-DNA-molekyyleillä, 4 t » ♦ ' I « i 25 b) ekspressoidaan informaatio, joka tuottaa keksinnön mukaiset polypeptidit isäntäorganismissa, ja * · « * · · • « · , c) eristetään keksinnön mukaiset polypeptidit.| Recombinant DNA molecules, 4 h »b) expressing information producing the polypeptides of the invention in the host organism, and * ·« * · · • «·, c) isolating the polypeptides of the invention.

• φ » * 4 ft Φ4 m * *44 i : ·*· 30 Polypeptidit, jotka voidaan valmistaa näillä menetelmillä.• φ »* 4 ft Φ4 m * * 44 i: · * · 30 Polypeptides that can be prepared by these methods.

• 4 *• 4 *

l I Il I I

* · ♦ 4 •!"; Keksinnön mukaisten polypeptidien käyttö terapeuttisessa hoi dossa ja/tai immunisoinnissa tai farmaseuttisten preparaattien valmistamiseksi.* · ♦ 4 •! "; Use of the polypeptides of the invention in therapeutic treatment and / or immunization or for the preparation of pharmaceutical preparations.

35 99116 3835 99116 38

Terapeuttiseen hoitoon, esimerkiksi hevosten hoitoon tarkoitettu aine, jolle on tunnusomaista, että se sisältää farmaseuttisesti inerttien kantajien lisäksi tehokkaan määrän keksinnön mukaista polypeptidiä.An agent for therapeutic treatment, for example in the treatment of horses, characterized in that it contains, in addition to pharmaceutically inert carriers, an effective amount of a polypeptide of the invention.

55

Menetelmä valmistaa monoklonaalisia vasta-aineita keksinnön mukaisia polypeptidejä vastaan, tunnettu siitä, että isäntä-eläimet immunisoidaan polypeptidillä, näiden isäntäeläimien B-lymfosyytit fuusioidaan myeloomasolujen kanssa, alikloonataan 10 monoklonaalisia vasta-aineita erittävät hybridi-solulinjat ja viljellään in vitro tai in vivo.A method of making monoclonal antibodies against the polypeptides of the invention, characterized in that the host animals are immunized with the polypeptide, the B lymphocytes of these hosts are fused with myeloma cells, subcloned into hybrid cell lines secreting monoclonal antibodies, and cultured in vitro or in vivo.

Hybridi-solulinjat, jotka erittävät monoklonaalista vasta-ainetta keksinnön mukaista polypeptidiä vastaan.Hybrid cell lines that secrete a monoclonal antibody against a polypeptide of the invention.

1515

Monoklonaaliset vasta-aineet, jotka kokonaan tai osittain neutraloivat spesifisellä tavalla keksinnön mukaisten polypeptidien vaikutuksen tai jotka sitoutuvat spesifisesti johonkin mainit- * “ tuun polypeptidiin.Monoclonal antibodies which completely or partially neutralize the action of the polypeptides of the invention or which bind specifically to one of said polypeptides.

* « 9 4 4 . “.20 ’/ Monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö terapiassa ja/tai jonkin · keksinnön mukaisen polypeptidin kvalitatiiviseen ja/tai kvanti- j tatiiviseen määrittämiseen.* «9 4 4. “.20” / Use of monoclonal antibodies in therapy and / or for the qualitative and / or quantitative determination of a polypeptide of the invention.

t I » « < I · · 4 · 25 Edellä mainittujen monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö jon-kin keksinnön mukaisen polypeptidin puhdistamiseen.Use of the aforementioned monoclonal antibodies to purify a polypeptide of the invention.

p 4 ♦· * t « * ♦ · % , *. Keksinnön mukaisten polypeptidien määrittämiseen tarkoitettu t · ♦ • · « ' testikitti, joka sisältää edellä mainittuja monoklonaalisia i *: 'j· 30 vasta-aineita.p 4 ♦ · * t «* ♦ ·%, *. A test kit for the determination of the polypeptides of the invention comprising the above-mentioned monoclonal antibodies.

t · · • · · • · t rt · · • · · • · t r

Kuvioiden selitykset:Explanations of the figures:

Kuvio 1: Lambda Eq-y2:sta saadun 4664 bp pitkän BamHI-fragmen- 35 tin DNA-sekvenssi. Koodattu aminohapposekvenssi ja intronin asema on annettu. Negatiivisesti numeroidut 39 99116 aminohapot viittaavat hydrofobiseen signaalipepti-diin. Valmiin EqIFN-y:n ainoa potentiaalinen N-glyko-lysaatiokohta kohdassa 86-88 on alleviivattu. RNA-polymeraasin sitoutumiselle tärkeät sekvenssit CCATC 5 ja TATAAAA ovat alleviivattuja, kuten myös kaksi sig- naalisekvenssiä mRNA:n polyadenylaatiolle (AATAAA).Figure 1: DNA sequence of a 4664 bp BamHI fragment from Lambda Eq-γ2. The encoded amino acid sequence and intron position are given. Negatively numbered 39,99116 amino acids refer to a hydrophobic signal peptide. The only potential N-glycolysis site for mature EqIFN-γ at 86-88 is underlined. The sequences CCATC 5 and TATAAAA important for RNA polymerase binding are underlined, as are the two signal sequences for mRNA polyadenylation (AATAAA).

Kuvio 2: Eri lajien γ-interferonien aminohapposekvenssien ver tailu. Signaalipeptidi on osoitettu eteen asetetun 10 "S"-numeroidun aminohapon avulla. "Konsensus"-sek venssi isoina kirjaimina tarkoittaa jokaista aminohappoa, joka on kaikissa γ-interferoneissa identtinen, ja pieninä kirjaimina aminohappoja, joita esiintyy yli 75%:ssa γ-interferoneista.Figure 2: Comparison of amino acid sequences of γ-interferons from different species. The signal peptide is indicated by a 10 "S" numbered amino acid. The "consensus" sequence in upper case means each amino acid that is identical in all γ interferons and in lower case amino acids that are present in more than 75% of γ interferons.

1515

Kuvio 3: Hevos-γ-interferoni-geenin kokonaissynteesiin käytet tyjen oligonukleotidien kaaviollinen esitys. Yksittäisten oligonukleotidien pituus sekä niiden nume-.. rointi on annettu. Restriktiokatkaisukohdat, joita on J20 synteettisen geenin sisällä vain kerran, on numeroi- * · ♦ ’· tu.Figure 3: Schematic representation of oligonucleotides used in the overall synthesis of the equine γ interferon gene. The length of the individual oligonucleotides and their numbering are given. Restriction cleavage sites that are present only once within the J20 synthetic gene are numbered * · ♦ ’· tu.

• · • · ·’” : Kuvio 4: Luonnollisen geenin (eq) ja synteettisen geenin (syn) - " valmista EqIFN-y:aa koodaavien sekvenssien vertailu, V.25 kun kyseessä on E.coli-bakteerissa optimoidun geenin ekspressio. Erilaiset emäkset on merkattu täydellä.• · • · · '”: Figure 4: Comparison of the coding sequences of the natural gene (eq) and the synthetic gene (syn) -" finished EqIFN-γ, V.25 for the expression of the gene optimized in E. coli. Various the bases are marked in full.

• · • · • · · • · « .1 Kuvio 5: Taulukko valmista EqIFN-y:aa varten käytetyille kodo- : neille. Vasemmalla reunalla on annettu kodonin ensim- • · « • 1.13 0 mäinen emäs, keskellä toinen emäs ja oikealla reunal- • · la kolmas emäs. Taulukossa on annettu käytettyjen • · · • « · : kodonien lukumäärä kyseiselle aminohapolle luonnolli- 35 Kuvio 6: Ekspressioplasmidin pRHIOO rakenne.• · • · • · · • · «.1 Figure 5: Table for the codons used for the finished EqIFN-γ. The first base of the codon is given on the left • • «• 1.13 0 base, the second base in the middle and the third base on the right. The table shows the number of codons used for the amino acid in question. • Figure 6: Structure of the expression plasmid pRHIOO.

· sessa geenissä sekä suluissa synteettiselle geenille.· In the gene and in parentheses for the synthetic gene.

40 9911640 99116

Kuvio 7: pGN20:n rakenne ja restriktiokartta.Figure 7: Structure and restriction map of pGN20.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä yksityiskohtaisesti keksintöä rajoittamatta.The following examples illustrate the invention in detail without limiting the invention.

55

Materiaalit Lähtöaineet saatiin osittain kaupallisesti ja osittain EMBL-laitoksesta. Heidelberg. E.coli JM101, pUC9 ja M13mp8 saatiin 10 Bethesda Research Laboratories -laboratoriosta, E.coli-kannat, joissa oli supressorifaktori sup F, esimerkiksi E.coli NM526, 538 ja 539 ja vektorit Lambda-EMBL3 tai 3A olivat peräisin EMBL-laitoksesta ja niitä on myös saatavissa Stehelin/Basel-yhtiöstä (Sveitsi).Materials The starting materials were obtained partly commercially and partly from the EMBL plant. Heidelberg. E. coli JM101, pUC9 and M13mp8 were obtained from 10 Bethesda Research Laboratories, E. coli strains with suppressor factor sup F, for example E. coli NM526, 538 and 539 and vectors Lambda-EMBL3 or 3A were from EMBL and they are also available from Stehel / Basel (Switzerland).

15 1. Hevos-DNA:n eristäminen15 1. Isolation of equine DNA

Pakastettu kudos, esimerkiksi hevosen maksa hienonnettiin nes-·, temäisessä typessä hienojakoiseksi jauheeksi ja sitä inkuboi-*. 20 tiin 3 tuntia 55°C:ssa seoksessa: 0,5M EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml proteinaasi K (20 ml/g kudosta).Frozen tissue, for example, the horse's liver, was ground in liquid nitrogen to a fine powder and incubated. 20 hours at 55 ° C in a mixture of: 0.5M EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5% SDS, 0.1 mg / ml proteinase K (20 ml / g tissue).

I Proteiinit poistettiin saadusta viskoosista liuoksesta uutta-*;' 1 maila fenolilla ja uuttamalla kolme kertaa fenoli/klorofor-" mi/isoamyylialkoholi-seoksella (25/24/1 til.), dialysoitiinI Proteins were removed from the resulting viscous solution by extraction; 1 club with phenol and extraction three times with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25/24/1 vol.) Was dialyzed

• · I• · I

‘•‘•'25 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl -seosta vasten ja DNA saostettiin kahdella tilavuudella etanolia. Kuivattiin täy- • * : ’·* dellisesti tyhjössä, minkä jälkeen DNA liuotettiin TE-puskuriin • · · *.* · (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) 4°C:ssa ja sitä ja 1,273 g •.*. CsCl/ml-liuosta sentrifugoitiin 62 tuntia nopeudella 40.000 • · · · .*•*.30 kierrosta minuutissa 20°C:ssa (Sorvali 50Ti-roottori) . CsCl-• · • · · kradientti poistettiin tipoittain, DNA-pitoiset jakeet dialy- • · · : ' soitiin TE-puskuria vasten ja sen jälkeen DNA saostettiin kahdella tilavuudella etanolia, pestiin 70%:11a etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin uudelleen TE-puskuriin (4°C).‘•’ • ’25 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl and DNA were precipitated with two volumes of ethanol. After complete drying in vacuo, the DNA was dissolved in TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) at 4 ° C and 1.273 g. g •. *. The CsCl / ml solution was centrifuged for 62 hours at 40,000 • · · ·. * • * .30 rpm at 20 ° C (Sorvali 50Ti rotor). The CsCl gradient was removed dropwise, the DNA-containing fractions were dialyzed against TE buffer and then the DNA was precipitated with two volumes of ethanol, washed with 70% ethanol, dried and redissolved in TE buffer. (4 ° C).

li 35 99116 41li 35 99116 41

Valmiissa DNA-preparaatissa ei ollut RNA:a ja se oli pidempi kuin 50 kb (määritettiin elektroforeesin avulla 0,45%:sella agaroosigeelillä).The finished DNA preparation was free of RNA and was longer than 50 kb (determined by electrophoresis on a 0.45% agarose gel).

5 2. Hevos-DWA:n osittainen pilkkominen endonukleaasilla ia frak- tiointi koon perusteella5 2. Partial endonuclease digestion and size fractionation of equine DWA

Kaksi kertaa 50 μg hevos-DNA:a inkuboitiin 37°C:ssa 1,6 yksikön kanssa Sau3A-entsyymiä 450 μΐ-.ssa reaktiomediumia (10 mM 10 Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 1 mM ditiotreitoli). 15, 25 ja 40 minuutin kuluttua otettiin 150 μ1:η näytteet ja näihin lisättiin 15 mM EDTA:a. Reaktio pysäytettiin lämmittämällä 10 minuuttia 70°C:ssa. Lisättiin 0,3 M Na-asetaattia, pH 6,0, minkä jälkeen DNA sekoitettiin 2,5 tilavuudella etanolia. TE-15 puskuriin uudelleenliuottamisen jälkeen DNA erotettiin koon perusteella elektroforeesikäsittelemällä yön yli jännitteellä noin lV/cm 0,45%:11a agaroosigeelillä TBE-puskurissa (10,8 g/1 Tris, 5,5 g/1 boorihappo, 0,93 g/1 Na2EDTA). Koemarkkereiden ··. (EcoRI:lla ja HindIII:lla kaksoispilkottu ja HindIII:lla pii- • « · ,·, £0 kottu Lambda-DNA) erotettiin leikkaamalla geelipala, jossaTwice 50 μg of equine DNA was incubated at 37 ° C with 1.6 units of Sau3A enzyme in 450 μΐ of reaction medium (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2 1 mM dithiothreitol). After 15, 25 and 40 minutes, 150 μl samples were taken and 15 mM EDTA was added. The reaction was stopped by heating at 70 ° C for 10 minutes. 0.3 M Na acetate, pH 6.0 was added, after which the DNA was mixed with 2.5 volumes of ethanol. After redissolution in TE-15 buffer, DNA was separated by size by electrophoresis overnight at a voltage of about 1V / cm on a 0.45% agarose gel in TBE buffer (10.8 g / l Tris, 5.5 g / l boric acid, 0.93 g / l). 1 Na2EDTA). Experimental markers ··. (Lambda DNA digested with EcoRI and HindIII and silicon digested with HindIII) was separated by cutting a piece of gel in which

• I I• I I

’/ DNA:n pituus oli 10 - 23 kb, DNA elektroeluoitiin geelistä dia-lyysiletkussa 3 tunnin aikana 300 V:lla (puskuri 0,1 x TBE), ' puhdistettiin käyttöohjeen mukaisesti Elutip-D-pylvässä'/ DNA length was 10 to 23 kb, DNA was electroeluted from the gel in a dialysis tubing for 3 hours at 300 V (buffer 0.1 x TBE),' purified according to the instructions on the Elutip-D column

I II I

< | < , (Schleicher und Schull) ja tämän jälkeen saostettiin etanolil- '•'•'25 la.<| <, (Schleicher und Schull) and then ethanol was precipitated.

• · • · • " Hevos-DNA-fragmenttien itsestään liittymisen, mikä toisaalta• · • · • "Equine DNA fragments self-joining, which on the other hand

• « I• «I

V * voi johtaa hevos-DNA-sekvenssien keinotekoisiin hybrideihin ja • toisaalta liian suuriin ja siten ei enää Lambda-faageihin lai- • » · « i***.30 tettavissa oleviin DNA-paloihin, estämiseksi kokofraktioidut • · · hevos-DNA-palat defosforyloitiin.V * can lead to artificial hybrids of equine DNA sequences and • on the other hand, too large and thus no longer Lambda phage-spreadable DNA fragments, to prevent size-fractionated equine DNA sequences. the pieces were dephosphorylated.

Tätä varten DNA:a inkuboitiin 30 minuuttia 37°C:ssa 140 μΐ:ssa reaktiomediumia (50 mM Tris-HCl pH 9,5, 10 mM MgCl2, 0,1 mM 35 Zn-asetaatti, 1 mM spermidiini) yhdessä 5 yksikön kanssa nau-dansuolifosfataasia. Lisättiin vielä 5 yksikköä entsyymiä ja 42 99116 inkuboitiin 30 minuuttia. EDTA:a lisättiin 25 mM loppukonsent-raatioon, minkä jälkeen DNA uutettiin kerran fenoli/klorofor-mi/isoamyylialkoholi-seoksella (25/24/1 til.), 2 kertaa kloro-formi/isoamyylialkoholi-seoksella (24/1 til.), ja kertaa die-5 tyylieetterillä, saostettiin etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin 0,1 x TE-puskuriin.To this end, the DNA was incubated for 30 minutes at 37 ° C in 140 μΐ of reaction medium (50 mM Tris-HCl pH 9.5, 10 mM MgCl 2, 0.1 mM 35 Zn acetate, 1 mM spermidine) together with 5 units nau-dansuolifosfataasia. An additional 5 units of enzyme were added and 4299116 were incubated for 30 minutes. EDTA was added to a final concentration of 25 mM, after which the DNA was extracted once with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25/24/1 v / v), twice with chloroform / isoamyl alcohol (24/1 v / v). , and times with diethyl ether, precipitated with ethanol, dried and dissolved in 0.1 x TE buffer.

3. Hevosaenomi-DNA-kiri aston rakentaminen 10 Defosforyloidut 10 - 23 kb hevos-DNA-fragmentit kloonattiin3. Equine DNA Nominal Construction of Aston 10 Dephosphorylated 10-23 kb equine DNA fragments were cloned

Lambda-vektorissa, esimerkiksi vektoreissa Lambda-EMBL3 tai -3A (Frischauf, A.M. et ai. J. Mol. Biol. , 12S2., 827-842 (1983), jossa on G-A-T-C kohesiivit päät, poistamalla faagi-DNA:n sisäinen BamHI-fragmentti.In a Lambda vector, for example Lambda-EMBL3 or -3A (Frischauf, AM et al. J. Mol. Biol., 12S2., 827-842 (1983)) with GATC cohesive ends, by removing the internal BamHI of the phage DNA. fragment.

1515

Vektoria kasvatettiin E.coli-kannassa, jossa oli supressorifak-tori sup F, esimerkiksi E.coli NM526, 538 tai 539 (Frischauf, A.M. et ai. J. Mol. Biol., 170. 827-842 (1983), LB-liemessä .. (Miller; Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor \ 20 Lab. Cold Spring Harbor, New York) 5 mM MgS04:n kanssa, saos-The vector was grown in an E. coli strain with the suppressor factor sup F, for example E. coli NM526, 538 or 539 (Frischauf, AM et al. J. Mol. Biol., 170. 827-842 (1983), LB- broth .. (Miller; Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor \ 20 Lab. Cold Spring Harbor, New York) with 5 mM MgSO 4, precipitated

t I It I I

’· '· tettiin polyetyleeniglykolilla ja puhdistettiin CsCl-tiheys-' kradientti-sentrifugoimalla kaksi kertaa (0,71 g CsCl/ml liuos-: ta, 40 tuntia nopeudella 45.000 kerrosta minuutissa, 20°C) .It was 'polyethylene glycol' and purified by CsCl density gradient centrifugation twice (0.71 g CsCl / ml solution, 40 hours at 45,000 rpm, 20 ° C).

: Dialysoitiin TE-puskuria vasten, minkä jälkeen proteiinit pois- l.:.*25 tettiin faagi-DNA:sta uuttamalla kaksi kertaa fenoli/klorofor-mi/isoamyylialkoholi-seoksella (24/1 til.) ja väkevöitiin saos- • · • ’·· tamalla etanolilla.: Dialyzed against TE buffer, then the proteins were removed from the phage DNA by extraction twice with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (24/1 v / v) and concentrated by precipitation. With ethanol.

I I i • · * • · · , \t EMBL3A-vektorin pääte fragment it saatiin pilkkomalla BamHI :11a • * i *1!.*3 0 täydellisesti 50 μg f aagi-DNA: a 2 tuntia 37°C:ssa 450 μl:ssa *** fraktiomediumia (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM di- • · · ; tiotretoli) , pysäyttämällä reaktio 15 mM EDTA:lla 10 minuutin aikana 70°C:ssa ja saostamalla DNA etanolilla.II i • · * • · ·, \ t The terminal fragment of the EMBL3A vector was obtained by digestion with BamHI • * i * 1!. * 3 0 completely 50 μg of phage DNA for 2 hours at 37 ° C 450 μl *** fraction medium (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2, 1 mM di- • · ·; thiotretol), stopping the reaction with 15 mM EDTA for 10 minutes at 70 ° C and precipitating the DNA ethanol.

li - 99116 43li - 99116 43

Uudelleenliittymisen välttämiseksi keskifragmentti jälkipilkot-tiin EcoRI:lla ja eronnut oligonukleotidi poistettiin seostamalla isopropanolilla.To avoid recombination, the middle fragment was post-digested with EcoRI and the separated oligonucleotide was removed by mixing with isopropanol.

5 BamHI-pilkottua Lambda-DNA:a pilkottiin tätä varten täydellisesti EcoRIilla 2 tunnin aikana 37°C:ssa seoksessa: 450 μΐ 10 mM Tris-HCl pH 7,5 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 15 mM EDTA:a ja lämmittämällä 10 minuuttia 70°C:ssa. Na-asetaattia lisättiin 0,3 M loppukonsentraati-10 oon asti, minkä jälkeen 3 suurta DNA-fragmenttia saostettiin 0,6 tilavuuksilla isopropanolia 15 minuutin ajan 0°C:ssa, pestiin 2 kertaa 0,45 M Na-asetaatti/0,6 til. isopropanolilla ja 1 kerta 0,3 M Na-asetaatti/2,5 til. etanolilla ja liuotettiin 15 /xl:aan 0,1 x TE-puskuria. BamHI/EcoRI-linkkerit jäävät tässä 15 menetelmässä liuokseen. EMBL3A-fragmentit (8 μg) yhdistettiin noin 5 μg) yhdistettiin noin 5 μg:n kanssa 10 - 23 kb hevos-DNA:a ja 10 yksikön kanssa T4-DNA-likaasia (NEN) ja inkuboitiin yön yli 14°C:ssa ja yksi päivä 4°C:ssa 50 /xl:ssa ligatointime-diumia (66 mM Tris-HCl pH 7,2, 0,1 m NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ,20 EDTA, 5 mM ditiotreitoli, 0,5 mM ATP) . Ligatoitu DNA-seos pa-To this end, 5 BamHI-digested Lambda DNA was completely digested with EcoRI over 2 hours at 37 ° C in a mixture of: 450 μΐ 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, and the reaction was stopped by the addition of 15 mM EDTA. and heating for 10 minutes at 70 ° C. Na acetate was added to a final concentration of 0.3 M, after which 3 large DNA fragments were precipitated with 0.6 volumes of isopropanol for 15 minutes at 0 ° C, washed twice with 0.45 M Na acetate / 0.6 vol. with isopropanol and 1 time 0.3 M Na acetate / 2.5 vol. ethanol and dissolved in 15 μl of 0.1 x TE buffer. The BamHI / EcoRI linkers remain in solution in this method. EMBL3A fragments (8 μg) were pooled at about 5 μg) were combined with about 5 μg of 10-23 kb equine DNA and 10 units of T4 DNA licase (NEN) and incubated overnight at 14 ° C and one day at 4 ° C in 50 μl of ligation medium (66 mM Tris-HCl pH 7.2, 0.1 m NaCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM, 20 EDTA, 5 mM dithiothreitol, 0.5 mM ATP). The ligated DNA mixture

« I I«I I

'· / kattiin valmiisiin Lambda-faagipartikkeleihin in vitro-Lambda- • · ; pakkaussysteemissä (Schalenghe, F. et ai; Chromosoma, 82.'· / Coated on ready-made Lambda phage particles in vitro Lambda • ·; in a packaging system (Schalenghe, F. et al .; Chromosoma, 82.

: 205-216 (1981) ) .: 205-216 (1981)).

V.;25 Tämän systeemin komponentit, so. ultraääniuute (SE) , pakastus-sulatus-lysaatti (FTL), puskurit Ml ja A valmistettiin mainitun • * { ’·· artikkelin (Schalenghe. F. et ai; Chromosoma, £2, 205-216 • · · : (1981)) mukaisesti. Ligatoidun DNA-seoksen 10 μ1:η suuruisia ; .·, eriä inkuboitiin 2 minuuttia huoneen lämpötilassa 25 μ1:η kans- • · · • ••#30 sa SE-uutetta, joka myös oli sulatettu jäistä 30 minuutin aika- t · ’·’ na kuten FTL-lysaattikin, lisättiin 100 μΐ FTL-lysaattia ja • · · • · # • inkuboitiin edelleen 60 minuuttia huoneen lämpötilassa. Pak- kausseos laimennettiin 150 μ1:1ΐ3 Lambda-laimenninta (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgS04 1 Mm EDTA) ja säilytettiin 4°C:ssa. 35 44 99116 4. Hevos-v-interferonin (EqIFN-v) geenin kloonaus ia sekvens-sointi A. Täydellisen EqlFN-y-geeni-kloonin eristäminen 5 E.coli NM528 (supF) kannan infektointiin käytettiin hevos-DNA-kirjastoa. Bakteeriviljelmä, jota oli yli yön kasvatettu LB-ravintoliuoksessa (10 g/1 tryptoni, 5 g/1 hiivauute, 10 g/1 NaCl, pH 7,4) joka sisälsi 0,2% maltoosia, säädettiin 10 mM 10 MgS04:ssa 2,0 optiseen tiheyteen (600 nm). Tämän suspension kulloinkin 0,5 ml:n suuruiset erät infektoitiin 50.000 pfu-yk-siköllä (plakinmuodostusyksikkö) DNA-kirjaston Lambda-faageja ja levitettiin LB-pehmytagarkerroksen kanssa LB-agar-maljoille, jotka sisälsivät 10 mM magnesiumsulfaattia (halkaisija 15 13,5 cm). Rekombinantti-Lambda-faageja seulottiin yhteensä 1,5 x 106. Viljeltiin yön yli 37°C:ssa, minkä jälkeen jokaisen maljan faageista valmistettiin kaksinkertaiset kopiot nitrosel-luloosalla (Benton ja Davis, Science 196:180-182, 1977)). Faagi-DNA:n denaturoinnin jälkeen (1 minuuttia seoksessa: 0,5 N .·, '20 NaOH, 1,5 M NaCl) , neutraloinnin (2 kertaa 3 minuuttia seokses- I tV.; 25 The components of this system, i. ultrasonic extract (SE), freeze-thaw lysate (FTL), buffers M1 and A were prepared according to the aforementioned article (Schalenghe. F. et al .; Chromosoma, £ 2, 205-216 • · ·: (1981) ). 10 μ1 of the ligated DNA mixture; ., Batches were incubated for 2 minutes at room temperature with 25 μl of SE extract, which was also thawed on ice for 30 minutes as an FTL lysate, 100 μΐ of FTL lysate and • · · • · # • were further incubated for 60 minutes at room temperature. The kit mixture was diluted with 150 μl: 1ΐ3 Lambda diluent (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgSO 4 in 1 Mm EDTA) and stored at 4 ° C. 35 44 99116 4. Cloning and Sequencing of the Equine V-Interferon (EqIFN-v) Gene A. Isolation of a Complete EqIFN-γ Gene Clone An equine DNA library was used to infect 5 E. coli NM528 (supF) strains. Bacterial culture grown overnight in LB medium (10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl, pH 7.4) containing 0.2% maltose was adjusted to 10 mM in 10 MgSO 4. .0 optical density (600 nm). 0.5 ml aliquots of this suspension were infected with 50,000 pfu units (plaque forming unit) of Lambda phages from the DNA library and plated with the LB soft agar layer on LB agar plates containing 10 mM magnesium sulfate (diameter 15 13.5 cm). A total of 1.5 x 10 6 recombinant Lambda phages were screened. Cultured overnight at 37 ° C, after which duplicate copies of each phage were prepared with nitrocellulose (Benton and Davis, Science 196: 180-182, 1977). After denaturation of the phage DNA (1 minute in the mixture: 0.5 N, · 20 NaOH, 1.5 M NaCl), neutralization (2 times for 3 minutes in the mixture).

sa: 0,5 M Tris-HCl pH 7,5 1,5 M NaCl) ja huuhtelun jälkeen ’ (1 minuuttia seoksessa: 2 x SSC, 1 x SSC, 0,15 M NaCl, 15 mMsa: 0.5 M Tris-HCl pH 7.5 1.5 M NaCl) and after rinsing ’(1 minute in mixture: 2 x SSC, 1 x SSC, 0.15 M NaCl, 15 mM

‘ Na-sitraatti) kuivattiin suodattimen ilmassa ja DNA kiinnitet-, tiin paistamalla 2 tuntia 80°C:ssa. Suodattimia pestiin yön yli **25 65°C:ssa liuoksessa 1,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% SDS, ja esihybridisoitiin 4-6 tuntia 65°C:ssa (hybridisoin- • ’·* tiliuos: 0,9 M NaCl, 50 mM NaH-,P04, pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,1% • ·« " * • · e V 1 Ficoll, 0,1% polyvinyylipyrrolidoni, 0,1% naudanseerumialbumii- • ni, 0,1% SDS, 20 mg/ml ultraäänikäsitelty ja denaturoitu • · · · ,***.30 lohensperma-DNA) . Hybridisointi suoritettiin 20 tunnin aikana • · · 65°C:ssa juuri valmistetussa liuoksessa, joka sisälsi suodatin- • · · ' ta kohti 106 cpm tavanomaisilla menetelmillä radioaktiivisesti leimattua HuIFN-γ "koetinta". Suodattimet pestiin ei-stringen-teissä olosuhteissa 3 x SSC, 0,1% SDS-seoksessa 65°C:ssa ja 35 autoradiografoitiin. Kolmen plakkipuhdistuksen suorittamisen li 99116 45 jälkeen voitiin tunnistaa viisi Lambda-kloonia, jotka antoivat positiiviset hybridisoitumissignaalit.‘Na citrate) was dried in filter air and the DNA was fixed by frying for 2 hours at 80 ° C. The filters were washed overnight ** at 65 ° C in 1.5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1% SDS, and prehybridized for 4-6 hours at 65 ° C (hybridization). Solution: 0.9 M NaCl, 50 mM NaH-, PO 4, pH 7.4, 5 mM EDTA, 0.1% V · Ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0 , 1% bovine serum albumin, 0.1% SDS, 20 mg / ml sonicated and denatured • · · ·, ***. 30 salmon sperm DNA) Hybridization was performed for 20 hours at • · · 65 ° C just in a prepared solution containing 106 cpm per filter of radiolabeled HuIFN-γ “probe.” The filters were washed under non-stringent conditions with 3 x SSC, 0.1% SDS at 65 ° C. and 35 were autoradiographed.After performing three plaque purifications li 99116 45, five Lambda clones could be identified that gave positive hybridization signals.

DNA puhdistettiin näistä eristetyistä rekombinantti-faageista 5 tavanomaisilla menetelmillä (Maniatis et ai., Ibid.). Erilaisilla restriktioentsyymeillä pilkkomisen ja tämän jälkeisen Southern-analyysin (Southern, J.Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) jälkeen faagi-DNA:t karakterisoitiin hybridisoimalla HuIFN-y "koettimen" kanssa. Eristettiin yksi ainutkertaisesti hybridi-10 soituva kloonin Lambda Eq-y2 4,6 kb pitkä BamHI-fragmentti ja tämä kloonattiin pUC9-plasmidin BamHI-katkaisukohtaan (Vieira ja Messing, Gene 19: 259-268, 1982). E.coli JMlOl-kannan trans-formoinnin jälkeen valmistettiin saaduista pesäkkeistä minipre-parointimenetelmällä (Birnboim ja Doly, Nucl. Acids Res. 7: 15 1513-1523, 1979) plasmidi-DNA ja karakterisoitiin pilkkomalla restriktioentsyymeillä. Plasmidille, jolla oli haluttu BamHI-insertti, annettiin nimeksi pAHlll. Plasmidin pAHlll BamHI-insert in päät, sen jälkeen kun mukaan oli laitettu M13mp8- tai ·, M13mp9-vektorit (Vieira ja Messing, Gene 19, 259-268, 1982), \ 20 sekvenssoitiin Didesoxy-menetelmällä (Sanger et ai., Proc.DNA was purified from these isolated recombinant phages by conventional methods (Maniatis et al., Ibid.). After digestion with various restriction enzymes and subsequent Southern analysis (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975), phage DNAs were characterized by hybridization to HuIFN-γ "probe". A single 4.6 kb BamHI fragment of the Lambda Eq-γ2 clone of hybrid-10 ringing was isolated and cloned into the BamHI cleavage site of plasmid pUC9 (Vieira and Messing, Gene 19: 259-268, 1982). After transformation of the E. coli JM101 strain, plasmid DNA was prepared from the resulting colonies by the miniprep method (Birnboim and Doly, Nucl. Acids Res. 7: 15 1513-1523, 1979) and characterized by digestion with restriction enzymes. The plasmid with the desired BamHI insert was named pAHIII. The ends of the BamHI insert of plasmid pAHIII, after insertion of the M13mp8 or M13mp9 vectors (Vieira and Messing, Gene 19, 259-268, 1982), were sequenced by the Didesoxy method (Sanger et al., Proc. .

Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977). Sekvenssien vertaa-! minen ihmis-y-interferonigeenin (Gray ja Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) kanssa osoitti homologia olevan suuren koodaa-\ mattomien 5'- ja 31-alueiden välillä. Tästä voitiin päätellä, i « '·'· 25 että oli eristetty täydellinen EqlFN-y-geeni .Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977). Sequence comparison-! Coupling with the human γ-interferon gene (Gray and Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) showed high homology between the 5 'and 31' non-coding regions. From this, it could be concluded that the complete EqIFN-γ gene had been isolated.

: *· B. Kloonista Lambda Eq-y2 saadun hevos-y-interferonigeenin sek-• · · : venssointi.: * · B. Sequencing of the equine γ-interferon gene from clone Lambda Eq-γ2.

• · * · » • « · • ♦ · · ,*”.30 pAHlll-plasmidin 4,6 kb pitkä BamHI-insertti sekvenssoitiin • » · "•m täydellisesti Didesoxy-menetelmällä. BamHI-fragmentin koko sek-• · · ' ’ venssi saatiin yhdistämällä M13-alikloonien osasekvenssit, jotka oli saatu kloonaamalla suunnatulla tavalla restriktiofrag-mentit (EcoRI, Hindlll, PstI, Pstl-Bglll, Hindlll-BamHI) vas-35 taavasti pilkottuihin M13mp8 tai M13mp9-vektoreihin. Lisää osasekvenssejä saatiin siten, että 2,0 kb pitkä BamHI-Bgllll- 99116 46 fragmentti tai 2,0 kb pitkä Pstl-fragmentti kloonattiin "hau-likkomenetelmällä" M13mp8-vektoriin. Kummatkin DNA-fragmentit hajotettiin ultraäänen avulla pienemmiksi palasiksi ja DNA-päät tasattiin inkuboimalla E.coli DNA-polymeraasin I (Klenowin 5 fragmentti) kanssa, kun mukana oli 0,1 mM kutakin neljää desok-sinukleotidifosfaattia (reaktiopuskuri: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreiitti, 0,5 mg/ml naudanseerumialbu-miini: 1 h 25°C:ssa). Fraktioitiin koon perusteella agaroosi-geelissä, minkä jälkeen eristettiin DNA-fragmentit, joiden pi-10 tuus oli noin 0,4 - 1,0 kb, ja ligatoitiin M13mp8-vektorinThe 4.6 kb BamHI insert of plasmid 30 pAH111 was completely sequenced by the Didesoxy method. The entire sequence of the BamHI fragment was sequenced. The sequence was obtained by combining the subsequences of the M13 subclones obtained by directional cloning of the restriction fragments (EcoRI, HindIII, PstI, PstI-BglII, HindIII-BamHI) into the correspondingly digested M13mp8 or M13mp9 vectors. The 2.0 kb BamHI-BglII-99116 46 fragment or the 2.0 kb PstI fragment was cloned by "search method" into the M13mp8 vector, both DNA fragments were sonicated into smaller pieces and the DNA ends were aligned by incubation with E. coli DNA. polymerase I (Klenow 5 fragment) in the presence of 0.1 mM each of the four deoxynucleotide phosphates (reaction buffer: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2, 1 mM dithiothreitol, 0.5 mg / ml bovine serum albumin) -mine: 1 h at 25 ° C) F was digested by size on an agarose gel, followed by isolation of DNA fragments with a length of about 0.4 to 1.0 kb and ligation into the M13mp8 vector.

Smal-katkaisukohtaan. Saadut osasekvenssit yhdistettiin tietokoneohjelman avulla 4664 bp pitkäksi kokonaissekvenssiksi, joka on esitetty kuviossa 1.Smal cleavage site. The resulting subsequences were combined by computer program into a total sequence of 4664 bp, as shown in Figure 1.

15 Hevos-γ-interferonigeenin proteiineja koodaava alue saatiin avoimen lukukehyksen tietokoneen tukeman analyysin avulla ja vertaamalla muiden lajien γ-interferonigeeneihin (Gray ja Goeddel, Nature 298: 859-863; Grau ja Goeddel, Proc. Natl.The protein coding region of the equine γ interferon gene was obtained by open-frame computer-assisted analysis and comparison with γ interferon genes from other species (Gray and Goeddel, Nature 298: 859-863; Grau and Goeddel, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 80: 5842-5846, 1983; Dijkema et ai., EMBO J. 4: .·, 20 761-767, 1985; Gerretti et ai., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986). Proteiineja koodaavan alueen katkaisee kolme intronia, jolloin ensimmäisessä eksonissa on koodattu 20 aminohappoa pitkä, hydrofobinen signaalipeptidi ja valmiin EqlFN-y-polypepti-din 18 aminohappoa (emäkset 366-479). Toinen eksoni koodaa * ‘ 25 aminohappoja 19 - 41 (emäkset 1639 - 1707) , kolmas koodaa aminohappoja 42 - 102 (emäkset 1803 - 1985) ja neljäs eksoni » « koodaa karboksi-päätä, jossa on aminohapot 103 - 146 (emäkset * * * 3307 - 3441) . Kohdissa 4010 ja 4020 on mRNA:n polyadenylaation j:*· 2 signaalisekvenssiä (AATAAA). Valmiin EqlFN-y-polypeptidin I**";30 asemissa 86 - 88 on ainoa mahdollinen N-glykolysaatiokohta (Asn-Ser-Ser) , joka sopii yhteen naudan γ-interferonin toisen N-glykolysaatiokohdan (Asn-Gly-Ser) kanssa (kuvio 2). Valmis EqIFN-Y-polypeptidi sisältää yllättäen vain yhden ainoan kyste-iiniryhmän asemassa 3, jolloin luonnonmukaisten ihmis- ja 35 hiiri-y-interferonien kanssa analogisesti ensimmäiset kolme 99116 47 amino-terminaalista aminohappoa (tässä tapauksessa Tyr-Tyr-Cys) todennäköisesti lohkaistaan protolyyttisesti organismissa.Acad. Sci. USA 80: 5842-5846, 1983; Dijkema et al., EMBO J. 4:., 20, 761-767, 1985; Gerretti et al., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986). The protein coding region is cleaved by three introns, with the first exon encoding a 20 amino acid long hydrophobic signal peptide and 18 amino acids of the mature EqIFN-γ polypeptide (bases 366-479). The second exon encodes amino acids 19 to 41 (bases 1639 to 1707), the third encodes amino acids 42 to 102 (bases 1803 to 1985) and the fourth exon encodes a carboxy terminus having amino acids 103 to 146 (bases * * * 3307 - 3441). At positions 4010 and 4020, there are j: * · 2 signal sequences (AATAAA) for mRNA polyadenylation. Positions 86 to 88 of the mature EqIFN-γ polypeptide I ** "; 30 have the only possible N-glycolysis site (Asn-Ser-Ser) that is compatible with the second N-glycolysis site (bovine γ-interferon) (Asn-Gly-Ser) ( Figure 2) The finished EqIFN-γ polypeptide surprisingly contains only a single cysteine group at position 3, with the first three 99116 47 amino-terminal amino acids (in this case Tyr-Tyr-Cys) being analogous to natural human and 35 mouse γ interferons. ) is likely to be protolytically cleaved in the organism.

5. Synteettisen geenin valmistaminen valmiille EaIFN-v:lle 55. Preparation of a synthetic gene for mature EaIFN-v 5

Rekombinantti-EqlFN-yrn ekspressoimiseksi valmiissa muodossaan Escherichia coli -bakteerissa rakennettiin synteettinen geeni oligonukleotideistä. Se koodaa samaa aminohapposekvenssiä kuin luonnonmukainen EqlFN-y-geeni, mutta se sisältää kuitenkin ai-10 noastaan sellaisia yksittäisiä aminohappojen kodonia, joita käytetään E.colin suuresti ekspressoimissa, solun omissa geeneissä (Gouy ja Gautier, Nucl. Acids Res. 10: 7055-7074, 1982). Lisäksi rakennettiin mukaan useita ainutkertaisia restriktio-entsyymien katkaisukohtia, mikä mahdollistaa geenin yksinker-15 täisen manipuloinnin, kun halutaan muuttaa yksittäisiä paloja. EqlFN-ytn synteettinen geeni rakennettiin kahtena muunnelmana yhteensä 16 erilaisesti oligonukleotidista. Ensimmäinen muunnelma koodaa valmista EqlFN-yraa, jossa on 146 aminohappoa plus ··. aloitus-metioniini ja toinen muoto koodaa aminopäässä kolmen « '20 aminohapon verran (Tyr-Tyr-Cys) lyhennettyä polypeptidiä plus aloitus-metioniinia, jollaisena se luultavasti saattaa esiintyä luonnonmukaisessa organismissa.To express the recombinant EqIFN herb in its mature form in Escherichia coli, a synthetic gene was constructed from oligonucleotides. It encodes the same amino acid sequence as the native EqIFN-γ gene, but contains only 10 single amino acid codons used in E. coli's highly expressed cellular genes (Gouy and Gautier, Nucl. Acids Res. 10: 7055- 7074, 1982). In addition, several unique restriction enzyme cleavage sites were included, allowing simple manipulation of the gene to alter individual pieces. The synthetic gene for EqIFN-yt was constructed in two variants from a total of 16 different oligonucleotides. The first variant encodes a ready-made EqIFN with 146 amino acids plus ··. the starting methionine and the second form encode a truncated polypeptide at the amino terminus of three «'20 amino acids (Tyr-Tyr-Cys) plus the starting methionine as it is likely to be present in a natural organism.

, Synteettisen EqIFN-y:n rakenne on esitetty kuviossa 3. Valmis- i : ‘ ‘ 25 tamiseen käytetyt oligonukleotidit syntetisoitiin Applied Bio-systems Model 381A DNA-syntetisointilaitteen avulla, puhdistet- • « • ’* tiin elektroforesoimalla denaturoiduissa 12-prosenttisissa po-• · « • · c *·* c lyakryyliamidigeeleissä (7 M urea) ja suolat poistettiin eks- : kluusiokromatograf iän avulla Sephadex G-25:lla (Pharmacia).The structure of the synthetic EqIFN-γ is shown in Figure 3. The oligonucleotides used for the preparation were synthesized using an Applied Bio-systems Model 381A DNA synthesizer, purified by electrophoresis in denatured 12% polymer. C · · * c ly · acrylamide gels (7 M urea) and salts were removed by flash chromatography on Sephadex G-25 (Pharmacia).

• · « · » : 30 • · ·• · «·»: 30 • · ·

OliQonukleotidien kokoaminen synteettiseksi EcIFN-v-aeeniksi • · ·Assembly of OliQonucleotides into Synthetic EcIFN-v Gene • · ·

Synteettisen EqlFN-y-geenin rakentaminen tapahtui kahtena palana. Geenin ensimmäinen osa valmistettiin kahdeksan oligonukleo-35 tidin EG-1 - EG-8 avulla Sall-katkaisukohtaan asti ja geenin toinen puolisko kuudesta oligonukleotidista EG-9 - EG-14 Sall- * 48 99116 katkaisukohdasta BamHI-katkaisukohtaan asti. Aminopäässä kolmen aminohapon verran lyhennettyyn EqlFN-γ-muotoon käytettiin oligonukleotideja EG-15 ja EG-16 oligonukleotidien EG-l ja EG-2 asemesta.The construction of the synthetic EqIFN-γ gene took place in two pieces. The first part of the gene was prepared with eight oligonucleotides EG-1 to EG-8 up to the SalI cleavage site and the second half of the gene from six oligonucleotides EG-9 to EG-14 from the SalI * 4899116 cleavage site to the BamHI cleavage site. Oligonucleotides EG-15 and EG-16 were used instead of oligonucleotides EG-1 and EG-2 at the amino terminus of the three amino acid truncated form of EqIFN-γ.

55

Keskenään komplementtiset oligonukleotidit fosforyloitiin kulloinkin parittain 5'-päässä. Kulloinkin 100 pmoolia kumpaakin oligonukleotidia (esimerkiksi EG-3 ja EG-4, tai EG-5 tai EG-6 jne.) inkuboitiin 10 minuuttia 37°C:ssa 9 μΐ-.ssa kinaasi-pusku-10 ria (70 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreiitti), 2 μCi [γ"32Ρ]ΑΤΡ (Amersham) käyttämällä 10 yksikköä T4-polynuk-leotidikinaasia (New England Biolabs), tähän lisättiin 1 μΐ 10 mM ATP-liuosta ja inkuboitiin vielä 50 minuuttia 37°C:ssa. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla 10 minuuttia 95°C:ssa. DNA-15 päiden myöhempi liittyminen estettiin jättämällä fosforyloimat-ta oligonukleotidit EG-l, EG-15, EG-9 ja EG-14. Ne sekoitettiin kyseisen komplementtisen oligonukleotidin kanssa vasta polynuk-leotidikinaasin inaktivoinnin jälkeen, kuumennettiin 5 minuut-·. tia 95°C:ssa ja jäähdytettiin huoneen lämpötilaan.Mutually complementary oligonucleotides were in each case phosphorylated in pairs at the 5 'end. In each case, 100 pmoles of each oligonucleotide (e.g., EG-3 and EG-4, or EG-5 or EG-6, etc.) were incubated for 10 minutes at 37 ° C in 9 μΐ kinase buffer-10 (70 mM Tris). HCl pH 7.6, 10 mM MgCl 2, 5 mM dithiothreitol), 2 μCi [γ "32Ρ] ΑΤΡ (Amersham) using 10 units of T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs), to which was added 1 μΐ of 10 mM ATP solution, and incubated for an additional 50 minutes at 37. The reaction was stopped by heating for 10 minutes at 95. Subsequent joining of the DNA-15 ends was prevented by non-phosphorylation of oligonucleotides EG-1, EG-15, EG-9, and EG-14. was mixed with that complementary oligonucleotide only after inactivation of the polynucleotide kinase, heated for 5 minutes at 95 ° C and cooled to room temperature.

/, 20/, 20

Oligonukleotidin EG-1+2 (tai toisessa osassa EG-15+16), EG-3+4, EG-5+6 ja EG-7+8 seokset yhdistettiin, seokseen lisättiin 1 μΐ 5 M natriumkloridia, kuumennettiin 5 minuuttia 70°C:ssa ja jäähdytettiin huoneen lämpötilaan. Tähän liuokseen lisättiin * - 25 5 μΐ 10 mM ATP:a, 2 μΐ ditiotreiittia, 1,5 μΐ 10 x ligatointi- puskuria, (0,66 M Tris-HCl pH 7,2, IM NaCl, 100 mM MgCl2, • · * 10 mM EDTA, 50 mM ditiotreiitti) ja 80 yksikköä T4 DNA-ligaasia • · · V (new England Biolabs) ja inkuboitiin 48 tuntia 4°C:ssa. Ligaa- • :*· sireaktion kulkua seurattiin erottamalla geelielektroforeetti-··« * i***.30 sesti pienen reaktioerän DNA-fragmentit 5%:sessa, ei-denaturoi-··· vassa polyakryyliamidigeelissä ja sen jälkeen autoradiokrafoi- « · ♦ maila. Samalla tavalla liitettiin keskenään kuusi oligonukleotidia EG-9 - EG-14. Reaktio pysäytettiin uuttamalla fenolin ja kloroformin seoksessa ja DNA saatiin saostamalla etanolilla.The mixtures of oligonucleotide EG-1 + 2 (or in another part EG-15 + 16), EG-3 + 4, EG-5 + 6 and EG-7 + 8 were combined, 1 μΐ of 5 M sodium chloride was added to the mixture, heated for 5 minutes at 70 ° C and cooled to room temperature. To this solution was added * - 25 5 μΐ 10 mM ATP, 2 μΐ dithiothreitol, 1.5 μΐ 10 x ligation buffer, (0.66 M Tris-HCl pH 7.2, 1M NaCl, 100 mM MgCl 2, • · * 10 mM EDTA, 50 mM dithiothreitol) and 80 units of T4 DNA ligase • · · V (new England Biolabs) and incubated for 48 hours at 4 ° C. The progress of the ligative reaction was monitored by gel electrophoretic separation of a small batch of DNA fragments on a 5% non-denaturing polyacrylamide gel followed by autoradiographing. club. In a similar manner, six oligonucleotides EG-9 to EG-14 were ligated together. The reaction was quenched by extraction with a mixture of phenol and chloroform, and DNA was obtained by precipitation with ethanol.

35 99116 49 6. Ekspressioplasmidin pRH 100 rakentaminen35 99116 49 6. Construction of the expression plasmid pRH 100

Kaikki entsyymireaktiot suoritettiin valmistajien antamissa olosuhteissa.All enzyme reactions were performed under the conditions specified by the manufacturers.

5 7 μg plasmidia pER103 (Eva Dworkin-Rastl et ai., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115-613) linearisoitiin 50 μΐ:ssa reaktiomediu-mia restriktioendonukleaasilla Hindlll. Inkuboitiin 1 tunti 37°C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 50 μΐ 2 X DIP-puskuria (2 x 10 CIP-puskuri = 20 mM Tris, pH =9,2, 0,2 mM EDTA). 5'-terminaaliset fosfaattiryhmät poistettiin lisäämällä 2 yksikköä vasi-kansuolesta saatua alkalista fosfataasia (CIP); inkubointi kesti 30 minuuttia 45°C:ssa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 4 μΐ 0,5 mM EDTA-liuosta sekä lisäämällä 10 μΐ IM Tris, pH = 8,0 15 liuosta. Proteiinit poistettiin uuttamalla 2 kertaa fenolilla ja kerran fenolilla ja kloroformilla. DNA saostettiin vesifaa-sista lisäämällä 0,1 til. 3 M natriumasetaattiliuosta pH =5,5 ja 250 μΐ etanolia ja DNA-sakka pestiin sentrifugoinnin jälkeen ··. kerran 70% :11a etanoliliuoksella. DNA kuivattiin ja sen jälkeen5 μg of plasmid pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115-613) was linearized in 50 μΐ of the reaction medium with restriction endonuclease HindIII. Incubation was for 1 hour at 37 ° C, followed by the addition of 50 μΐ of 2 X DIP buffer (2 x 10 CIP buffer = 20 mM Tris, pH = 9.2, 0.2 mM EDTA). The 5 'terminal phosphate groups were removed by the addition of 2 units of alkaline phosphatase (CIP) from Vasiocola; incubation lasted 30 minutes at 45 ° C. The reaction was stopped by adding 4 μ 4 of 0.5 mM EDTA solution and adding 10 μΐ of IM Tris, pH = 8.0 solution. Proteins were removed by extraction twice with phenol and once with phenol and chloroform. DNA was precipitated from the aqueous phase by adding 0.1 vol. 3 M sodium acetate solution pH = 5.5 and 250 μΐ ethanol and the DNA pellet was washed after centrifugation ··. once with 70% ethanol solution. The DNA was dried and then

« I I«I I

,·, 20 pelletti liuotettiin 20 μΐ-.aan TE-puskuria (10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA).The pellet was dissolved in 20 μΐ TE buffer (10 mM Tris pH = 8.0, 1 mM EDTA).

! 1 μg kutakin synteettisesti valmistettua oligonukleotidia , d(AGCTTAAAGAATGAGCT) ja d(CATCTTTA) fosforyloitiin kulloinkin i « i · * ‘ 25 10 μΐ-.ssa reaktioliuosta lisäämällä 10 yksikköä T4-PNK-entsyy miä (polynukleotidikinaasi) sekä 1 mM rATP:a. Reaktio tapahtui • · : ·· 37°C:ssa ja kesti 45 minuuttia. Reaktio pysäytettiin kuumenta-««· *·* * maila 10 minuuttia 70°C:ssa.! 1 μg of each synthetically prepared oligonucleotide, d (AGCTTAAAGAATGAGCT) and d (CATCTTTA) were each phosphorylated in 10 μl of reaction solution by the addition of 10 units of T4-PNK enzyme (polynucleotide kinase) and 1 mM rATAT. The reaction took place at 37 ° C for 45 minutes. The reaction was quenched with heat for 10 minutes at 70 ° C.

« * • · * • « « ··« ♦ i’*‘;30 Sekoitettiin kulloinkin 5 μΐ plasmidiliuosta ja fosforyloitua • « · oligonukleotidia ja lämmitettiin 5 minuuttia 70°C:ssa. Tämän « · · jälkeen liuos jäähdytettiin 0°C:een ja lisättiin 2 μΐ 10 x li-gaasipuskuria (500 mM Tris, pH = 7,5), 100 mM MgCl2:a, 200 mM DTT:a (ditiotreiitti), 1 mM rATP:a, 500 μg/ml BSA:a (nauhasee-35 rumialbumiini) sekä 2 μΐ vettä ja 10 yksikköä T4-DNA-ligaasia.In each case, 5 μΐ of the plasmid solution and the phosphorylated oligonucleotide were mixed and heated at 70 ° C for 5 minutes. «* • · * •« «··« ♦ i '*'; The solution was then cooled to 0 ° C and 2 μl of 10 x li gas buffer (500 mM Tris, pH 7.5), 100 mM MgCl 2, 200 mM DTT (dithiothreite), 1 mM rATP, 500 μg / ml BSA (ribbon-35 rum albumin) and 2 μΐ water and 10 units of T4 DNA ligase.

50 9911650 99116

Reaktio kesti 40 tuntia ja se suoritettiin 4°C:ssa. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla 10 minuuttia 70°C:ssa.The reaction lasted 40 hours and was performed at 4 ° C. The reaction was stopped by heating at 70 ° C for 10 minutes.

2 μΐ tätä ligaasireaktioseosta yhteensä 30 μΐ-.ssa. liuosta pil-5 kottiin 3 tunnin aikana 37°C:ssa 10 yksiköllä restriktioendo-nukleaasia Sacl (New England Biolabs). Reaktio pysäytettiin kuumentamalla 10 minuuttia 70°C:ssa. 5 ml tätä reaktioseosta ligatoitiin 16 tuntia 14°C:ssa yhteensä 3 0 μl:ssa lisäämällä 10 yksikköä T4-PNK-entsyymiä.2 μΐ of this ligase reaction mixture for a total of 30 μΐ. the solution was inoculated for 3 hours at 37 ° C with 10 units of restriction endonuclease Sacl (New England Biolabs). The reaction was stopped by heating at 70 ° C for 10 minutes. 5 ml of this reaction mixture was ligated for 16 hours at 14 ° C in a total of 30 μl by adding 10 units of T4-PNK enzyme.

10 200 μΐ-.aan kompetentteja E.coli HBlOl-bakteereita lisättiin 10 μΐ tätä ligaasireaktioseosta. Bakteereita pidettiin 45 minuuttia jäillä ja sen jälkeen lämmitettiin 2 minuuttia 42°C:ssa DNA:n sisään viennin mahdollistamiseksi. Tämän jälkeen baktee-15 risuspensiota inkuboitiin jälleen 0°C:ssa 10 minuuttia. Tämän jälkeen transformoidut bakteerit siveltiin LB-agarille, joka sisälsi 50 μg/ml ampisilliiniä.To 10,200 μΐ of competent E. coli HB101 bacteria was added 10 μΐ of this ligase reaction mixture. The bacteria were kept on ice for 45 minutes and then heated for 2 minutes at 42 ° C to allow export into DNA. The bacterial 15 suspension was then incubated again at 0 ° C for 10 minutes. The transformed bacteria were then plated on LB agar containing 50 μg / ml ampicillin.

”.ti Muodostuneista bakteeripesäkkeistä valittiin 12 mielivaltaises- 4 .·, ;20 ti ja näistä eristettiin plasmidit mikromitassa (Birnboim ja ,!, Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). Saatu DNA katkais- ·, tiin restriktioendonukleaasilla Sacl ja DNA erotettiin agaroo- sigeelillä (1%, 1 X TBE-puskuri) . DNA:n kulkeutuminen lineaa- « < - . risena noin 4400 bp suuruisena molekyylinä vahvisti Sacl-tun-Of the bacterial colonies formed, 12 were selected arbitrarily and plasmids were isolated on a micro scale (Birnboim and,!, Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). The resulting DNA was digested with restriction endonuclease SacI and the DNA was separated on an agarose gel (1%, 1 X TBE buffer). DNA transport is linear. as a molecule of approximately 4400 bp, confirmed the SacI

< I<I

* I I* I I

’ ‘ 25 nistamiskohdan liittymisen plasmidiin. Yksi tällainen plasmidi valittiin mielivaltaisesti. E.coli HB101 transformoitiin vielä • · • · • ** kerran siihen kuuluvan minipreparaatin DNA:11a. Saaduista 4 r » *·* ‘ transformoiduista bakteereista valittiin yksi pesäke ja sitä ? viljeltiin suuremmassa mitassa. Tästä eristetty plasmidi pii- *«« « l*‘*;30 kottiin restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI. DNA erotet-»·· tiin l%:lla agaroosigeelillä ja pienempi fragmentti eristettiin t * * ' geelistä elektroeluoimalla. Tämä noin 460 bp pitkä EcoRI-BamHI- DNA-fragmentti sekvenssoitiin Sangerin menetelmällä (F. Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (1977) 5463-5467). Tällä tavoin 35 analysoiduille plasmidille annettiin nimeksi pRHIOO.‘‘ 25 insertion sites into the plasmid. One such plasmid was chosen arbitrarily. E.coli HB101 was transformed once more • • • · • ** once with the DNA of its miniprep. From the 4 r »* · *‘ transformed bacteria obtained, one colony and that? cultivated on a larger scale. The plasmid isolated from this was inoculated with restriction endonucleases EcoRI and BamHI. DNA was separated on a 1% agarose gel and the smaller fragment was isolated from the gel by electroelution. This approximately 460 bp EcoRI-BamHI DNA fragment was sequenced by the method of Sanger (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1977) 5463-5467). The 35 plasmids analyzed in this way were named pRHIOO.

li 51 99116li 51 99116

7. Synteettisen EqlFN-y-geenin vienti ekspressioplasmidiin pRHIOO7. Export of the synthetic EqIFN-γ gene into the expression plasmid pRHIOO

10 μg plasmidia pRHIOO pilkotaan täydellisesti 100 μΐ-.ssa reak-5 tiopuskuria Sacl:lla ja entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla 10 minuuttia 70°C:ssa. Ylipitkät DNA-päät tasataan käsittelemällä Klenowin fragmentilla (Amersham) , kun mukana on 10 μτη kutakin neljää desoksinukleotiditrifosfaattia (30 minuuttia, 25°C). Reaktio pysäytetään uuttamalla fenoli/kloroformilla ja 10 DNA väkevöidään saostamalla etanolilla. Näiden käsittelyjen avulla muodostuu tryptofaanipromoottoriin liittyen tylppä DNA-pää, joka päättyy translaation aloituskodoniin "ATG". Lineari-soitu plasmidi-DNA jälkipilkotaan BamHI:lla ja vektoriosa eristetään agaroosigeelistä elektroforeettisen erottamisen jälkeen. 15 50 ng edellä kuvatulla tavalla esivalmistettua pRHIOO plasmi-divektoria sekoitettiin 20 pmoolin kanssa ligatoituja oligo-nukleotideja EG-1 - EG-8 ja EG-9 - EG-14 ja inkuboidaan 24 tun-)’*ti tia 14°C:ssa 10 μΙ’.εβΆ ligatointipuskuria (66 mM Tris-HCl pH | 20 7,2, 100 mM NaCl, · 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM ditiotreiitti, 1 mM ATP) yhden yksikön kanssa T4 DNA-ligaasia (Boehringer . Mannheim). Tällä ligatointiseoksella transformoidaan kalsium- ; kloridikäsittelyllä kompotentiksi tehty E.coli JM101 ja inku- i . . boidaan yön yli 37°C:ssa. Saaduista transformanteista eriste- 25 tään plasmidi-DNA minipreparointimenetelmällä ja rakenne selvi-tetään HindiII-BamHI-insertin restriktioanalyysin ja sekvens- ♦ 4 soinnin avulla. Plasmidille, jolla on valmiin EqIFN-y:n eks- • ♦ · *·* pressoinnille haluttu rakenne, annetaan nimeksi pEqG-YYCl. Täy- l sin analogisella tavalla kloonataan oligonukleotidit EG-15,16, l'm': 30 EG-3 - EG-8 ja EG-9 - EG-14 pRHIOO-vektoriin, jotta saataisiin kolmen aminohapon verran lyhennetty EqIFN-γ. Rakenteeltaan ha- « · ' lutulle plasmidille annetaan nimeksi pEqG-QAAl.10 μg of plasmid pRHIOO is completely digested in 100 μΐ of reaction buffer with SacI and the enzyme is inactivated by heating for 10 minutes at 70 ° C. Excess DNA ends are aligned by treatment with a Klenow fragment (Amersham) in the presence of 10 μτη for each of the four deoxynucleotide triphosphates (30 minutes, 25 ° C). The reaction is stopped by extraction with phenol / chloroform and the DNA is concentrated by precipitation with ethanol. These treatments result in the formation of a blunt DNA end associated with the tryptophan promoter, terminating in the translation initiation codon "ATG". The linearized plasmid DNA is post-digested with BamHI and the vector portion is isolated from the agarose gel after electrophoretic separation. 50 ng of pRHIOO plasmid divector prepared as described above was mixed with 20 pmoles of ligated oligonucleotides EG-1 to EG-8 and EG-9 to EG-14 and incubated for 24 hours at 14 ° C. μΙ'.εβΆ ligation buffer (66 mM Tris-HCl pH | 7.2, 100 mM NaCl, · 10 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 5 mM dithiothreitol, 1 mM ATP) with one unit of T4 DNA ligase (Boehringer. Mannheim ). This ligation mixture is used to transform calcium; chloride-treated component E. coli JM101 and incubator. . overnight at 37 ° C. Plasmid DNA is isolated from the resulting transformants by a miniprep method and the structure is elucidated by restriction analysis and sequencing of the HindIII-BamHI insert. The plasmid having the desired structure for extrusion of the finished EqIFN-γ is named pEqG-YYCl. In a completely analogous manner, oligonucleotides EG-15,16,11'''30 are cloned into the pRHIOO vector EG-3 to EG-8 and EG-9 to EG-14 to obtain a three amino acid truncated EqIFN-γ. The plasmid of the desired structure is named pEqG-QAA1.

35 99116 52 8. E.coli JM101 bakteereiden. -jotka sisältävät plasmidin pEqG-YYC1 tai pEqG-OAAl. interferoniaktiivisuuden ekspressio 100 ml bakteeriviljelmää inkuboidaan 37°C:ssa voimakkaasti 5 ravistellen seuraavassa tryptofaanittomassa alustassa (luvut alustalitraa kohti): 10 g (ΝΗ4)2Ρ04, 3,5 g KH2P04 pH 7,3 NaOH:lla, 0,5 g NaCl, 21 g cakaminohapot (happohydrolysoidut), 20 mg L-kysteiini, 20 mg 3-β-indoliakryylihappo (IAA, trypto-faanioperonin indusori) haluttaessa 50 - 100 mg ampisilliini.35 99116 52 8. E.coli JM101 bacteria. -containing plasmid pEqG-YYC1 or pEqG-OAA1. Expression of interferon activity 100 ml of bacterial culture is incubated at 37 ° C with vigorous shaking in the following tryptophan-free medium (figures per liter of medium): 10 g (ΝΗ4) 2Ρ04, 3.5 g KH2PO4 pH 7.3 with NaOH, 0.5 g NaCl, 21 g of cacamino acids (acid hydrolysed), 20 mg of L-cysteine, 20 mg of 3-β-indolacrylic acid (IAA, tryptophan operon inducer) if desired 50 to 100 mg of ampicillin.

10 Tämän jälkeen bakteerit pelletoidaan sentrifugoimalla 5 minuuttia nopeudella 4000 kierrosta minuutissa, suspendoidaan 1/10 viljelytilavuudella jääkylmään 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 30 mM NaCl -puskuria ja hajotetaan jäissä jäähdyttäen 2 kertaa 30 sekunnin ajan ultraäänielektrodin avulla (20 kHz, 100 Wattia).The bacteria are then pelleted by centrifugation for 5 minutes at 4000 rpm, suspended in 1/10 culture volume of ice-cold 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 30 mM NaCl buffer and lysed under ice-cooling twice for 30 seconds using an ultrasonic electrode (20 kHz, 100 watts).

15 Solujäännökset poistetaan 10 minuutin aikana nopeudella 10000 kierrosta minuutissa (4°C) ja steriilisuodatuksen jälkeen testataan supernatantista interferoniaktiivisuus määrityksessä, joka mittaa VS-viruksen (Vesicular Stomatitis virus) tai EMC-viruksen (Encephalomyocarditis virus) sytopaattisen vaikutuksen /,'20 (CPE).Cell debris is removed over 10 minutes at 10,000 rpm (4 ° C) and, after sterile filtration, the supernatant is tested for interferon activity in an assay that measures the cytopathic effect of Vesicular Stomatitis virus (VS) or Encephalomyocarditis virus (EMC). .

ii

Testaussvsteemi: ii. · t ! I .Test system: ii. · T! I.

, . NBL-6 solut (ATCC CCL 57, hevosen ihon epidermisolut)/VSV A549 < i I «,. NBL-6 cells (ATCC CCL 57, equine skin epidermal cells) / VSV A549 <i I «

’ ‘ 25 (ATCC CCL 185, ihmisen keuhkokarsinooma-solulinja)/EMCV‘’ 25 (ATCC CCL 185, human lung carcinoma cell line) / EMCV

9· • « • A 549-solujen tiitteri normitetaan ihmisen interferonistandar-« · * • t · ’ din avulla kansainvälisiksi yksiköiksi.9 · • «• The titre of A 549 cells is normalized to international units using the human interferon standard.

« « • · · ' · i · t“’i30 9. Ekspressoitujen hevos-interferonien osoittaminen leimaamalla«« • · · '· i · t “' i30 9. Detection of expressed equine interferons by labeling

f IIf II

proteiinit maksisoluissa • * · “ ♦ *proteins in liver cells • * · “♦ *

« I«I

I I I .I I I.

Plasmidikoodattuja proteiineja voidaan leimata selektiivisesti in vivo käyttämällä maksisolutekniikkaa. E.coli CSR603 trans-35 formoidaan tavanomaisella menetelmällä ekspressioplasmideilla ja transformoidut bakteerit selektoidaan ambisilliinipitoisella 99116 53 agar-maljoilla. Maksisolujen valmistaminen ja proteiinien leimaaminen tapahtuu A. Sancarin (a.a.o.) ohjeen mukaisesti. Soluja viljellään 15 ml:ssa alustaa (kts. esimerkki 8) ilman indo-liakryylihappoa 37°C:ssa optiseen tiheyteen OD600nni=0,5 asti ja 5 10 ml tätä viljelmää säteilytetään petrimaljalla 5 sekuntia 50 cm:n etäisyydeltä UV-germisidi-lampulla (15 wattia) samalla käännellen ja inkuboidaan edelleen 1 tunti 37°C:ssa. Viljelmiin lisätään 100 ^g/ml D-sykloseriiniä, inkuboidaan 14 tuntia 37°C:ssa ja sen jälkeen bakteereista poistetaan tumat sentrifu-10 goimalla. Solut pestään 2 kertaa 5 ml :11a Hershey-suolaliuosta, suspendoidaan 5 ml:aan Hershey-alustaa, jossa on 20 μg/ml indoliakryylihappoa, ja inkuboidaan 2 tuntia 37°C:ssa. Jokaiseen viljelmään lisätään 5 ^Ci/ml 35S-metioniinia (1000 Ci/mMol) ja ravistellaan 1 tunti 37°C:ssa. Solusta poistetaan tumat SDS-15 liuoksessa ja lyysataan 2-merkaptoetanoli-pitoisessa elektro-foreesi-koetinpuskurissa ja proteiinit erotetaan 15%:11a poly-akryyliamidigeelillä.Plasmid-encoded proteins can be selectively labeled in vivo using liver cell technology. E. coli CSR603 trans-35 is formed by a conventional method with expression plasmids and the transformed bacteria are selected on ambicillin-containing 99116 53 agar plates. Liver cell preparation and protein labeling are performed according to the instructions of A. Sancar (a.a.o.). The cells are cultured in 15 ml of medium (see Example 8) without indolacrylic acid at 37 ° C to an optical density of OD600nni = 0.5 and 5 ml of this culture are irradiated in a petri dish for 5 seconds at a distance of 50 cm with a UV germicide lamp (15 watts) while inverting and further incubated for 1 hour at 37 ° C. 100 [mu] g / ml D-cycloserine is added to the cultures, incubated for 14 hours at 37 [deg.] C. and then the bacteria are nucleated by centrifugation. The cells are washed twice with 5 ml of Hershey's brine, suspended in 5 ml of Hershey's medium containing 20 μg / ml of indoleacrylic acid and incubated for 2 hours at 37 ° C. Add 5 μCi / ml 35S-methionine (1000 Ci / mMol) to each culture and shake for 1 hour at 37 ° C. Nuclei are removed from the cell in SDS-15 solution and lysed in 2-mercaptoethanol-containing electrophoresis probe buffer, and proteins are separated on a 15% polyacrylamide gel.

Hershey-suolaliuos Hershey-alusta (100 ml:aa : “20 (litraa kohti) kohti Hershey-suolaliuosta)Hershey's saline Hershey's medium (100 ml: “20 (per liter) per Hershey's saline)

• I• I

« ( i I l 5,4 g NaCl 2 ml 20 % glukoosi ·,· : 3,0 g KCl 0,5 ml 2 % treoniini : 1,1 g NH4C1 1,0 ml 1 % leusiini :::25 15 mg CaCl2.2H20 1,0 ml 2 % proliini 0,2 g MgCl2·6H20 1,0 ml 2 % arginiini j*. # 0,2 mg FeCl3.6H20 0,1 ml 0,1% tiamiini .·*.·. 87 mg KH2P04 12,1 g Tris-HCl pH 7,4 • · · *·· *30 • · · • · *···* Kuivatun geelin autoradiogrammi valmistetaan 2 päivän jälkeen : ; valottamalla DuPont Cronex röntgenfilmillä käyttämällä Kodak ·;·: Lanex-Regular vahvistusfoliota -80°C:ssa. Molekyylipainostan- dardina käytetään 14C-metyloitua proteiiniseosta (Amersham).«(I I l 5.4 g NaCl 2 ml 20% glucose ·, ·: 3.0 g KCl 0.5 ml 2% threonine: 1.1 g NH4Cl 1.0 ml 1% leucine ::: 25 15 mg CaCl2.2H2O 1.0 ml 2% proline 0.2 g MgCl2 · 6H2O 1.0 ml 2% arginine j *. # 0.2 mg FeCl3.6H2O 0.1 ml 0.1% thiamine. 87 mg KH2PO4 12.1 g Tris-HCl pH 7.4 • · · * ·· * 30 • · · • · * ··· * The autoradiogram of the dried gel is prepared after 2 days: by exposure to DuPont Cronex X-ray film using Kodak : Lanex-Regular reinforcement foil at -80 [deg.] C. A molecular weight standard is used for a 14C-methylated protein mixture (Amersham).

35 Kontrolleina toimivat plasmidi pER103, joka sisältää nyt pro- 99116 54 moottorin ilman interferonigeeniä, ja plasmidi pER2l/l, joka sisältää kaksi kopiota humaani IFN-a2arg-geeniä.Plasmid pER103, which now contains the pro-99116 54 engine without the interferon gene, and plasmid pER2 / l, which contains two copies of the human IFN-α2arg gene, served as controls.

10. EqIFN-v:n kanssa hvbridisoituvien sekvenssien osoittaminen 5 qenomisessa hevos-DNA:ssa10. Demonstration of sequences hybridizing to EqIFN-v in 5 qenomic equine DNA

Seuraavalla tavalla osoitetaan niiden sekvenssien kokonaismäärä hevosgenomissa, joilla on korkea homologia interferonigeenin EqIFN-γ kanssa. 30 μg suurimolekyylistä hevos-DNA:a (esimerkki 10 1) pilkotaan täydellisesti 100 yksiköllä vastaavaa restriktio- entsyymiä 300 μ1:η reaktiotilavuuksissa ja kulloinkin erotetaan koon perusteella 10 μg tätä pilkottua DNA:a rataa kohti 0,8%:11a agaroosigeelillä.The total number of sequences in the equine genome with high homology to the interferon gene EqIFN-γ is demonstrated as follows. 30 μg of high molecular weight equine DNA (Example 10 1) is completely digested with 100 units of the corresponding restriction enzyme in 300 μl η reaction volumes and 10 μg of this digested DNA per lane is separated on a 0.8% agarose gel.

15 DNA Southern-siirretään nitroselluloosasuodattimille, denaturoidaan ja kiinnitetään, minkä jälkeen jokainen suodatin hybri-disoidaan noin 6xl06 cpm radioaktiivisesti leimatun "koettimen" kanssa (17 tuntia 65°C:ssa, 5 x SSC, 5 x Denhardtin liuos, .. 0,1% SDS, 20 μg/ml denaturoitua lohensiittiö-DNA:a). EqlFN-ym *t 20 "koettimena" käytetään plasmidista pEqG-YYCl saatua fragment-'' tia, joka sisältää koko valmista interferonia koodaavan sek- ·· venssin. Tämän jälkeen suodattimet pestään stringenteissä olo- isuhteissa: 4 x 45 minuuttia 65°C:ssa seoksella: 45 mM NaCl, i ' 4,5 mM Na3 sitraatti), 0,1% SDS. Autoradiografia tapahtuu V.;25 Du-Pont Cronex röntgenfilmillä käyttämällä Kodak Lanex-Regular vahvistusfolioita 7 päivää -80°C:ssa.Southern DNA is transferred to nitrocellulose filters, denatured and fixed, after which each filter is hybridized to approximately 6x10 6 cpm with a radiolabeled "probe" (17 hours at 65 ° C, 5 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 0.1 % SDS, 20 μg / ml denatured salmonid DNA). As a "probe" for EqlFN-ym * t, a fragment obtained from plasmid pEqG-YYCl containing the entire sequence of the finished interferon is used. The filters are then washed under stringent conditions: 4 x 45 minutes at 65 ° C with: 45 mM NaCl, 4.5 mM Na 3 citrate), 0.1% SDS. Autoradiography is performed on V.; 25 Du-Pont Cronex X-ray film using Kodak Lanex-Regular reinforcement films for 7 days at -80 ° C.

• · • · · • 11. Hevos-interferonien (OAA) eksoressio E.coli HBlOl/pEaGr . OAA2 : ssa ia HB101/pEctG-QAA3 : ssa • « · I _ .11. · • · · • 11. Exorse of equine interferons (OAA) E.coli HB101 / pEaGr. In OAA2 and HB101 / pEctG-QAA3 • «· I _.

... 30 : : *1* Jotta ekspressio saataisiin paremmaksi, käytettiin a) parannet-: tuja ekspressiovektoreita ja b) parannettua ribosomaalista si- toutumiskohtaa. Parannetut ekspressiovektorit perustuvat Serra-tia marcescens -bakteerista (Sma) saatuun trp-promoottoriin, 35 joka yksi emäs vaihtamalla tulee -35 alueella yhtäläiseksi yhteisen -35 alueen kanssa (pRH281), tai hybridi-trp-promootto- 55 99116 riin, jossa on Escherichia coli -bakteerin (Eco) ensimmäinen A/T-rikasalue tai toinen A/T-rikasalue plus Sma:n promoottori (pRTH282, S. Itoh, Gene 44 (1966), 29-36) . Ribosomaalisina sitoutumiskohtina käytettiin E.coli enterotoksiini II:n kohtia.... 30:: * 1 * To improve expression, a) improved expression vectors and b) an improved ribosomal binding site were used. The improved expression vectors are based on the trp promoter derived from Serratia marcescens (Sma), which by one base exchange becomes equal in the -35 region to the common -35 region (pRH281), or the hybrid trp promoter in 55 99116 with Escherichia coli (Eco) first A / T-rich region or second A / T-rich region plus the Sma promoter (pRTH282, S. Itoh, Gene 44 (1966), 29-36). E.coli enterotoxin II sites were used as ribosomal binding sites.

5 a) pRH28l/55 a) pRH28l / 5

Seuraavat oligonukleotidit valmistettiin Applied Biosystems DNA Synthesizer 381A laitteen avulla: 10The following oligonucleotides were prepared using an Applied Biosystems DNA Synthesizer 381A: 10

Trp-1: 5'-AATTGACGCTG-3 'Trp-1: 5'-AATTGACGCTG-3 '

Trp-3: 5'-ATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGATTGACATTGCCTTCGCGAACCA GTTAACTAGTACACA-3'Trp-3: 5'-ATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGATTGACATTGCCTTCGCGAACCA GTTAACTAGTACACA-3 '

Trp-5: 5'-AGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCAT-3' 15 Trp-2: 5'-TTAGCGATCAGCGTC-3'Trp-5: 5'-AGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCAT-3 '15 Trp-2: 5'-TTAGCGATCAGCGTC-3'

Trp-4: 5'-CGTGAACTTGTGTACTAGTTAACTGGTTCGCGAAGGCAATGTCAACCCT CTTTTTGCACAATGTT_3,Trp-4: 5'-CGTGAACTTGTGTACTAGTTAACTGGTTCGCGAAGGCAATGTCAACCCT CTTTTTGCACAATGTT_3,

Trp-6: 5'-CGATGAATTCGAGCTCATATTAAACCTCCTTACCGTCTCGAGC-3' • ’’20 100 pmoolia kutakin oligonukleotidia Trp-2 - Trp-5 fosforyloi- • · ' *· ' tiin erikseen 10 μΐ-.ssa.. Trp-1 ja -2, Trp-3 ja -4 sekä Trp-5 < < * ·« < ja -6 hybridisoitiin kiehauttamalla ja jäähdyttämättä hitaas- : ti. Oligonukleotidipariliuokset yhdistettiin ja ligatoitiin I t i ·' lisäämällä T4-DNA-ligaasia. 3 μg pAT153:a kaksoispilkottiin V.*25 EcoRIrlla ja Clal:lla. Suuren fragmentin puhdistamisen jälkeen tähän lisättiin noin 20 pmoolia oligonukleotideja ja ligatoi- tiin. Tämän jälkeen DNA transformoitiin E.coli HB101:ssa ja joidenkin saatujen pesäkkeiden plasmidit eristettiin. Promoot- . torin sisältä Pst-HindIII-fragmentti sekvensoitiin. Halutun • · · -- *I!.*30 sekvenssin toteamisen jälkeen voitiin yksi plasmidi ja tälle t : T annettiin nimeksi pRH28l/5.Trp-6: 5'-CGATGAATTCGAGCTCATATTAAACCTCCTTACCGTCTCGAGC-3 '•' '20 100 pmoles of each oligonucleotide Trp-2 to Trp-5 were phosphorylated separately at 10 μΐ. Trp-1 and -2, Trp-3 and -4 and Trp-5 <<* · «<and -6 were hybridized by slow boiling and cooling slowly. The oligonucleotide pair solutions were pooled and ligated by adding T4 DNA ligase. 3 μg of pAT153 was double digested with V. * 25 EcoRI and ClaI. After purification of the large fragment, about 20 pmoles of oligonucleotides were added and ligated. The DNA was then transformed into E. coli HB101 and plasmids from some of the resulting colonies were isolated. Promotional. inside the thorium, the Pst-HindIII fragment was sequenced. After the desired sequence was determined, one plasmid was obtained and named t: T: pRH281 / 5.

• · · "·"· Promoottoriosan sekvenssi on: 35 -35 56 99116• · · "·" · The sequence of the promoter portion is: 35-35 56 99116

5'-GAATTGACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGC 3'-CTTAACTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGTAACG5'-GAATTGACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGC 3'-CTTAACTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGTAACG

5 Xhol -10 Itranskription alku5 Xhol -10 Start of transcription

CTTCGCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAG GAAGCGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTCCTTCGCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAG GAAGCGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTC

10 RBS SstI EcoRI Clal GAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCATCGAT-3' CTCCAAATTATACTCGAGCTTAAGTAGCTA-5'10 RBS SstI EcoRI Clal GAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCATCGAT-3 'CTCCAAATTATACTCGAGCTTAAGTAGCTA-5'

Uuden ekspressiovektorin etuja ovat: 15 1) optimaalinen -35 alue trp-Sma promoottorissa 2) ainutkertainen Xhol-kohta ennen ribosomaalista sitoutumiskohtaa (RBS) mahdollistaa RBS:n vaihtamisen toiseen : 20 ;' 3) ekspressioplasmidi sisältää yhden translaation aloituskohdan ATG viiden nukleotidin verran RBS:n jälkeen I ' 4) tämä ATG:n G on SstsI-tunnistamissekvenssin (GAGCTC) ensim- : : 25 mäinen emäs. Katkaisemalla Sstl:lla ja sen jälkeen muodos tamalla suora pää saadaan käyttöön ekspressiovektori, jolla on translaation aloitusviiva ATG ja jonka viereen voidaan ligatoida vieras geeni alkaen lukukehyksen ensimmäisestä . *. emäksestä • I « * · · ... . 30 • · · *·;·* 5) yhdistelmä RBS-ATG ei sisällä lainkaan G:a tai C:a 6) alkuperäinen EcoRI-katkaisukohta tuhottiin valitsemalla oligonukleotidisekvenssi 5'-päähän. Promoottorin 31-päähän 35 voidaan siten muodostaa monikloonauskohta, joka muodostuu li 57 99116The advantages of the new expression vector are: 1) an optimal -35 region in the trp-Sma promoter 2) a unique XhoI site before the ribosomal binding site (RBS) allows the RBS to be exchanged for another: 20; 3) the expression plasmid contains one translation start site ATG five nucleotides after RBS I '4) this G of ATG is the first base of the SstsI recognition sequence (GAGCTC). Cleavage with SstI and subsequent formation of a straight end provides an expression vector having a translation start line ATG and adjacent to which a foreign gene can be ligated from the first reading frame. *. of base • I «* · · .... 5) the combination RBS-ATG does not contain any G or C 6) the original EcoRI cleavage site was destroyed by selecting the oligonucleotide sequence at the 5 'end. Thus, a multicloning site formed at 5751111 can be formed at the end 35 of the promoter 31

Sstlrsta, EcoRIrsta, Clalrsta ja HindIII:sta (jo pAT153-osassa).Sstlr, EcoRIr, Clalr and HindIII (already in pAT153).

b) pRH282/5 5b) pRH282 / 5 5

Samalla tavoin rakennettiin ekspressiovektori pRH282/5. Oli-gonukleotidit Trp-1 ja Trp-2 korvattiin oligonukleotideilla Trp-7 ja Trp-8: 10 Trp-7:5'-AATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATCATGCT-3'In a similar manner, the expression vector pRH282 / 5 was constructed. Oligonucleotides Trp-1 and Trp-2 were replaced with oligonucleotides Trp-7 and Trp-8: 10 Trp-7: 5'-AATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATCATGCT-3 '

Trp-8:5'-TTAGCGATCAGCATGATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGC-3'Trp-8-TTAGCGATCAGCATGATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGC 5'-3 '

Promoottoriosan sekvenssi pRH282/5:ssa on:The sequence of the promoter moiety in pRH282 / 5 is:

15 5'-GAATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATCATGCTGAT15 5'-GAATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATCATGCTGAT

3'-CTTAACGGGCAAGACCTATTACAAAAAACGCGGCTGTAGTAGTACGACTA3'-CTTAACGGGCAAGACCTATTACAAAAAACGCGGCTGTAGTAGTACGACTA

-35-35

CGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGCCTTCGCGAACCAGT '20 GCGATTTTGTAACACGTTTTT CTC C CAACTGTAACGGAAGCGCTTGGTCACGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGCCTTCGCGAACCAGT '20 GCGATTTTGTAACACGTTTTT CTC C CAACTGTAACGGAAGCGCTTGGTCA

XhoIXhoI

-10 (transkription alku RBS-10 (start of transcription in RBS

! ' TAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTTAATATGA! 'TAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTTAATATGA

\:· 2 5 ATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTCCTCCAAATTATACT\: · 2 5 ATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTCCTCCAAATTATACT

SstI EcoRI Clal GCTCGAATTCATCGAT-3' ; . CGAGCTTAAGTAGCTA-5· *”.*30 t : c) pGNl 1 μg plasmidia pUC18 kaksoispilkottiin BamHI:lla ja Sali :11a.SstI EcoRI Clal GCTCGAATTCATCGAT-3 '; . CGAGCTTAAGTAGCTA-5 · * ”. * 30 h: c) pGN1 1 μg of plasmid pUC18 was double digested with BamHI and SalI.

10 /xg:sta EqG-QAAl plasmidia eristettiin BamHI-Sall-kaksois-35 pilkkomisen avulla synteettisen hevos-γ-interferoni-geenin toinen puolisko ja tämä defosforyloitiin. Noin 20 nanogrammaa vek- 99116 58 toria ligatoitiin 100 nanogramman kanssa inserttiä ja DNA transformoitiin E.coli JMlOl-.ssa. Yhden pesäkkeen plasmidi tutkittiin pilkkomalla restriktioentsyymeillä ja tälle annettiin nimeksi pGNl.10 [mu] g of the EqG-QAA1 plasmid was isolated by BamHI-SalI double-35 digestion with the other half of the synthetic equine γ-interferon gene and dephosphorylated. Approximately 20 nanograms of vector was ligated with 100 nanograms of insert and DNA was transformed into E. coli JM101. The plasmid of one colony was examined by digestion with restriction enzymes and named pGN1.

5 d) pGN35 d) pGN3

Synteettisen geenin ensimmäinen puolisko koottiin yhdessä ri-bosomaalisen sitoutumiskohdan kanssa oligonukleotideistä: 10The first half of the synthetic gene was assembled together with the ribosomal binding site from oligonucleotides: 10

EqG-1: 5'-AGCTTCCCTCGAGAGGTTGAGGTGATTTATGCAGGCTGCTTTCTTTAAAGEqG-1: 5'-AGCTTCCCTCGAGAGGTTGAGGTGATTTATGCAGGCTGCTTTCTTTAAAG

AAATCGAAAACCTGAAAGAATACTTCAACGCTCGTAACCCAGACGTTGGT-3' EqG- 2 : 5'-GACGGTGGTCCGCTGTTCCTGGACATCCTGAAAAACTGGAAAGAAGACTC TGACAAAAAGATCATCCAGTCTCAG-3' 15 EqG-3: 51-ATCGTTTCTTTCTACTTCAAACTGTTCGAAAACCTGAAAGACAACCAGGT TATCCAGAAATCGATGGACACTATCAAAGAAGATCTGTTCGTTAAATTCT TCAACTCGTCGACTCCG-3'AAATCGAAAACCTGAAAGAATACTTCAACGCTCGTAACCCAGACGTTGGT-3 'EqG- 2: 5'-GACGGTGGTCCGCTGTTCCTGGACATCCTGAAAAACTGGAAAGAAGACTC TGACAAAAAGATCATCCAGTCTCAG-3' 15 EqG-3, 51-ATCGTTTCTTTCTACTTCAAACTGTTCGAAAACCTGAAAGACAACCAGGT TATCCAGAAATCGATGGACACTATCAAAGAAGATCTGTTCGTTAAATTCT TCAACTCGTCGACTCCG-3 '

EqG-4: 51-AATTCGGAGTCGACGAGTTGAAGAATTTAACGAACAGATCTTCTTTGATA GTGTCCATCGATTTCTGGATAACCTGGTTGTCTTTCAGGTTTTCGAACAG • " 20 TTTGAAGTAGAAAGAAACGATCTGAGACTG-3'EqG-4: 51-AATTCGGAGTCGACGAGTTGAAGAATTTAACGAACAGATCTTCTTTGATA GTGTCCATCGATTTCTGGATAACCTGGTTGTCTTTCAGGTTTTCGAACAG • "20 TTTGAAGTAGAAAGAAACGATCTGAGACTG-3 '

! · EqG-5: 5'-GATGATCTTTTTGTCAGAGTCTTCTTTCCAGTTTTTCAGGATGTCCAGGA! · EqG-5: 5'-GATGATCTTTTTGTCAGAGTCTTCTTTCCAGTTTTTCAGGATGTCCAGGA

ACAGCGGACCACCGTCACCAACGTC-3'ACAGCGGACCACCGTCACCAACGTC-3 '

EqG-6: 5'-TGGGTTACGAGCGTTGAAGTATTCTTTCAGGTTTTCCATTTCTTTAAAGA AAGCAGCCTGCATAAATCACCTCAACCTCTCGAGGGA-3' l.V 25 50 moolia kutakin oligonukleotidia fosforyloitiin, erityisesti: EqG-2 yhdessä EqG-5:n kanssa 7 μl:ssal EqG-3 ja EqG-8 yksinään kulloinkin 8 μΙ'.ββΆ. Kinaasireaktio pysäytettiin kuumentamalla * 100°C:een. EqG-3:een lisättiin 50 pmoolia EqG-4:aa (1 μΐ) ja • « * *“.*30 EqG-8:aan lisättiin 50 pmoolia EqG-l:a (1 μΐ) ja EqG-8:aan li- i : ”* sättiin 50 pmoolia EqG-l:a {1 μΐ). Nämä liuokset kuumennettiin vielä kerran 100°C:een ja jäähdytettiin hitaasti. Oligonukleo-tidipariliuokset yhdistettiin ja ligatoitiin T4-DNA-ligaasin kanssa yhteensä 30 μ1:3ΏΆ. 2 μg pUC18-plasmidia kaksoispilkot-35 tiin EcoRi:lla ja HindIII:lla, vektoriosa geelipuhdistettiin ja liuotettiin 50 μΐ-.aan vettä. 40 nanogrammaa vektoria ja 59 99116 noin 2 pikomoolia ligatoituja oligonukleotideja lagatoitiin 10 μΐ:ssa ja tämän jälkeen DNA transformoitiin E.coli JM101:ssa.EqG-6: 5'-TGGGTTACGAGCGTTGAAGTATTCTTTCAGGTTTTCCATTTCTTTAAAGA AAGCAGCCTGCATAAATCACCTCAACCTCTCGAGGGA-3 'lβ 25 μl 50 . The kinase reaction was stopped by heating * to 100 ° C. To EqG-3 was added 50 pmoles of EqG-4 (1 μΐ) and • «* *“. * To 50 EqG-8 was added 50 pmoles of EqG-1 (1 μΐ) and to EqG-8 li - i: ”* was adjusted to 50 pmoles of EqG-1 (1 μΐ). These solutions were heated once more to 100 ° C and slowly cooled. Oligonucleotide pair solutions were pooled and ligated with T4 DNA ligase for a total of 30 μl: 3ΏΆ. 2 μg of pUC18 plasmid was double-digested with EcoRI and HindIII, the vector portion was gel purified and dissolved in 50 μl of water. 40 nanograms of vector and 59 99116 approximately 2 picomoles of ligated oligonucleotides were digested at 10 μΐ and then the DNA was transformed in E. coli JM101.

5 Yhden saadun plasmidin EcoRI-Hindlll-insertti kloonattiin uudelleen plasmidin M13mp9 ja tutkittiin sekvenssi. Valittiin plasmidi, jolla oli odotetunlainen sekvenssi, ja tälle annettiin nimeksi pGN3.The EcoRI-HindIII insert of one of the resulting plasmids was recloned into plasmid M13mp9 and sequenced. A plasmid with the expected sequence was selected and named pGN3.

10 e) pGN2010 e) pGN20

Noin 3 μg plasmideja pGNl ja pGN3 kaksoispilkottiin HindIII:lla ja Sällillä. pGN3:n insertti ja pGNlista saadun Eq-y-interfe-roni-geenin vektori/2. puolisko geelipuhdistettiin. 0,2 μg pGN-15 3-plasmidia ligatoitiin noin 0,05 μg:n kanssa pGN3-inserttiä ja DNA transformoitiin E.coli JMlOlissa. Saadun kloonin plasmidi valittiin restriktiokuvion tutkimisen jälkeen ja tälle annettiin nimeksi pGN20.Approximately 3 μg of plasmids pGN1 and pGN3 were double-digested with HindIII and SalI. Insert of pGN3 and vector of Eq-γ-interferon-Roni gene derived from pGN1 / 2. half was gel purified. 0.2 μg of pGN-15 3 plasmid was ligated with approximately 0.05 μg of pGN3 insert and DNA was transformed in E. coli JM101. The plasmid of the resulting clone was selected after examining the restriction pattern and was named pGN20.

\ " 20 f) pEqG-QAA2 tai pEqG-QAA3 · Noin 10 μg:sta plasmidia pGN20 eristettiin XhoI-EcoRI-insertti, joka sisältää synteettisen hevos-γ-interferoni-geenin yhdessä : E.coli enterotoksiini II:n ribosomaalisen sitoutumiskohdan l.1.125 kanssa (C.H. Lee et ai., Infect. Immun. 42 (1983), 264-268; S.L. Moseley et ai., Infect. Immun. 39 (1983), 1167-1174)).F) pEqG-QAA2 or pEqG-QAA3 · An XhoI-EcoRI insert containing the synthetic equine γ-interferon gene together was isolated from approximately 10 μg of plasmid pGN20: E. coli enterotoxin II ribosomal binding site l. 1,125 (CH Lee et al., Infect. Immun. 42 (1983), 264-268; SL Moseley et al., Infect. Immun. 39 (1983), 1167-1174)).

• 1.. pRH28l/5 tai pRH282/5 kaksoispilkottiin Xholilla ja EcoRIilla.• 1 .. pRH281 / 5 or pRH282 / 5 was double digested with XhoI and EcoRI.

« ♦ · : : : 20 nanogrammaa vektoria ligatoitiin 20 nanogramman kanssa in- • serttiä ja DNA transformoitiin E.coli HBiOlissa. Valittiin • « · 35 11.130 muutama pesäke, eristettiin plasmidit ja nämä tutkittiin res-t · *11 triktioanalyysin avulla. Kulloinkin valittiin yksi plasmidi • « m ja tälle annettiin nimeksi pEqG-QAA2 (vektori: pRH281/5) tai pEqG-QAA3 (vektori pRH282/5).«♦ ·::: 20 nanograms of vector were ligated with 20 nanograms of • insert and DNA was transformed in E. coli HBiOl. A few colonies were selected, isolated, and examined by res-t analysis. In each case, one plasmid was selected and named pEqG-QAA2 (vector: pRH281 / 5) or pEqG-QAA3 (vector pRH282 / 5).

99116 60 g) Lysaattitesti interferoni-γ-aktiivisuudelle Yön yli vanha E.coli HB101/pEqG-QAA2 tai HB101/pEqG-QAA3-viljelmä laimennettiin 1:100 LB/Amp:lla (LB: 10 g/1 tryptoni, 5 5 g/1 hiivauute, 5 g/1 NaCl, 50 mg/1 ampisilliini) ja inkuboi- tiin edelleen 37°C:ssa. Kun optiseksi tiheydeksi (600 nm) oli saavutettu 0,3, lisättiin 50 mg/1 indoliakryylihappoa ja viljelmää inkuboitiin vielä 2 tuntia 37°C:ssa. Bakteerit erotettiin sentrifugoimalla ja hajotettiin ultraäänen avulla. Sterii-10 lisuodatetusta supernatantista testattiin NBL-6 soluilla (ATCC CCL 57) γ-interferoniaktiivisuus, jolloin viruksena käytettiin VSV (Vesicular Stomatitis virus) -virusta. Kummankin transformoidun bakteeriviljelmän (E.coli HB101/pEqG-QAA2 tai HB101/pEqG-QAA3) lysaattien interferoniaktiivisuudet olivat 15 noin 0,1 - 1 miljoonaa yksikköä/ml. Kontrollia varten testattiin identtisesti valmistettu E.coli HB10l/pRH281 lysaatti.99116 60 g) Lysate test for interferon-γ activity Overnight culture of E. coli HB101 / pEqG-QAA2 or HB101 / pEqG-QAA3 overnight was diluted 1: 100 with LB / Amp (LB: 10 g / l tryptone, 5 5 g / Yeast extract, 5 g / l NaCl, 50 mg / l ampicillin) and further incubated at 37 ° C. When the optical density (600 nm) was reached 0.3, 50 mg / l indoleacrylic acid was added and the culture was incubated for another 2 hours at 37 ° C. The bacteria were separated by centrifugation and lysed by ultrasound. The sterile-10 supplemented supernatant was tested for γ-interferon activity on NBL-6 cells (ATCC CCL 57) using VSV (Vesicular Stomatitis virus) virus as the virus. The interferon activities of the lysates of both transformed bacterial cultures (E. coli HB101 / pEqG-QAA2 or HB101 / pEqG-QAA3) ranged from about 0.1 to 1 million units / ml. For control, an identically prepared E. coli HB101 / pRH281 lysate was tested.

Tämän kontrollilysaatin aktiivisuus oli alle 100 yksikköä/ml.The activity of this control lysate was less than 100 units / ml.

i . .i. .

♦ · • « : \.♦ · • «: \.

♦ · · • · • « · * • ·♦ · · • · • «· * • ·

• · O• · O

• « · • · « · « ♦ ♦ 1 1.• «· • ·« · «♦ ♦ 1 1.

• ♦ ♦ · ·• ♦ ♦ · ·

Claims (6)

1. Rekombinant-DNA-molekyl, kännetecknad därav, att den omfattar en hast-interferon-γkodande sekvens: 5 R1 TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC1. Recombinant DNA molecule, characterized in that it comprises a fast interferon γ coding sequence: R1 TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC 10 GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT10 GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT 15 CAG AAG CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA eller R2 GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC 1 20 AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA I GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA l.*.· 25 GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG j TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA :T: ttc cgt ggt cgt cgt gct ctt cag taa • ♦ C « I * • · • ••,30 varvid R1 är t · • « · •« · ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC TAT, 1 ATG TAT eller 99116 TAT, R215 CAG AAG CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA or R2 GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC 1 20 AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA I GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC A TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA l. *. · 25 GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG j TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA: T: ttc cgt ggt cgt cgt gct ctt cag taa • ♦ C «I * • · • ••, 30 where R1 is t · •« · • «· ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC TAT, 1 ATG TAT or 99116 TAT, R2 2. Rekombinant-DNA-molekyl, kännetecknad därav, att den hybridiseras med nagon molekyl enligt patentkravet 1 i förhällanden 6xSSC/5x Denhardt's lösning/0,1 % SDS vid 15 65°C (85 % homologi) eller 0,lxSCC/0,01 % SDS/65°C (90 % ho mologi) , varvid denna DNA-molekyl kan vara av syntetisk eller halvsyntetiskt ursprung och som kodar en polypeptid med den biologiska och immunologiska aktiviteten hos EqIFN-γ. ‘ 202. Recombinant DNA molecule, characterized in that it is hybridized with any molecule according to claim 1 in ratios 6xSSC / 5x Denhardt's solution / 0.1% SDS at 65 ° C (85% homology) or 0.1xSCC / 0. 01% SDS / 65 ° C (90% homology), wherein this DNA molecule may be of synthetic or semi-synthetic origin and encodes a polypeptide with the biological and immunological activity of EqIFN-γ. '20 3. Rekombinant-DNA-molekyl, kännetecknad därav, att den en DNA-molekyl enligt patentkravet 1 eller 2.3. Recombinant DNA molecule, characterized in that it is a DNA molecule according to claim 1 or 2. 4. Rekombinant-DNA-molekyl enligt patentkravet 1, k ä n - ; netecknad därav, att den erhällna DNA-molekylen I ; : 25 funktionellt ansluter sig till expressionens kontrollsekvens och att den är replikerbar i prokaryoter, särskilt E.coli-bakterier. * • « * • * * • · , 5. Escherichia coli-bakterie, kännetecknad där- • ♦ · ***.‘30 av, att den är transformerad med en rekombinant-DNA-molekyl I* « **·* enligt patentkravet 3 eller 4, varvid den företrädesvis ut-görs av E.coli JM101 eller HB101.The recombinant DNA molecule of claim 1, wherein: undetected, that the DNA molecule obtained I; : Functionally adheres to the control sequence of expression and is replicable in prokaryotes, especially E. coli bacteria. 5. Escherichia coli bacterium, characterized in that it is transformed with a recombinant DNA molecule according to * claim 3 or 4, preferably being E. coli JM101 or HB101. 5 ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC CAG, ATG CAG eller5 ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC CAG, ATG CAG or 10 CAG.10 CAG. 6. Förfarande för att framställa EqIFN-γ, kännetec -35 k n a t därav, att 99116 6 6 a) Escherichia coli-bakterie transformeras med en DNA-mole-kyl enligt patentkravet 1-4, b) de transformerade bakterierna kultiveras i ett lämpligt 5 kultiveringssubstrat och c) nämnda polypeptid isoleras. • · ♦ « · « * * · « I » < I * B » 9 · • % · • « 4 · « • 4« ν' (41 t : • M « #· (A process for producing EqIFN-γ, characterized in that a) Escherichia coli bacterium is transformed with a DNA molecule according to claims 1-4, b) the transformed bacteria are cultured in an appropriate manner. and c) said polypeptide is isolated. • · ♦ «·« * * · «I» <I * B »9 · •% · •« 4 · «• 4« ν '(41 t: • M «# · (