FI98929C - Menetelmä, jossa käytetään tyyppiä II olevaa endoglykosidaasia - Google Patents

Description

. 98929

Menetelmä, jossa käytetään tyyppiä II olevaa endoglykosi-daasia Tämä keksintö koskee menetelmiä mikro-organismien, 5 kuten bakteerien, poistamiseksi pinnoilta käsittelemällä tyypin II endoglykosidaasilla yksin tai yhdistettynä toisiin entsyymeihin ja/tai puhdistusaineisiin.

Entsyymien käyttö proteiineista ja/tai hiilihydraateista koostuvien tahrojen poistamiseksi yhdessä eri puh-10 distusaineiden kanssa on hyvin tunnettua puhdistusainefor- mulaatioiden alalla. Tällaiset entsyymiformulaatiot on suunniteltu poistamaan erityyppisiä tahroja pehmeistä pinnoista, kuten kankaasta, ja kovista pinnoista, kuten posliinista ja metallista. Siten esimerkiksi proteaaseja, 15 kuten trypsiiniä, pankreatiinia, papaiinia ja bromelaii- nia, on raportoidusti käytetty puhdistusaineformulaatiois-sa proteiinia sisältävien tahrojen poistamiseen vaihtele-vantasoisella menestyksellä. Spesifisiä glykosidaaseja, kuten sellulaasia, lysotsyymia, amylaasia ja glukanaasia 20 on toisaalta formuloitu eri puhdistusaineiden kanssa tiet tyjen hiilihydraattitahrojen poistamiseksi. Muut puhdis-tusainekoostumukset ovat yhdistäneet proteaaseja ja glykosidaaseja tahrojen käsittelyä varten.

Jotkin puhdistusainekoostumuksissa käytetyt glyko-.. 25 sidaasit, esim. β-amylaasi, α-galaktosidaasi ja β-galak- tosidaasi, ovat eksoglykosidaaseja, jotka katkaisevat irti yhden tai useamman terminaalisen sokeritähteen oligosakkaridista tai polysakkaridista. Toiset glykosidaasit, esim. sellulaasi ja o-amylaasi, ovat endoglykosidaaseja, jotka 30 ovat reaktiivisia spesifisten, oligo- tai polysakkaridi- . substraatin sisäisten sidosten kanssa. Tällaisiin endogly- kosidaaseihin viitataan tässä tyypin I endoglykosidaasei-na. Vaikka puhdistusaineformulaatiot, joissa on yksi tai usempi proteaasi ja/tai glykosidaasi (mukaan lukien tyypin 35 I endoglykosidaasit), ovat parantaneet huomattavasti tah- . 98929 2 rojen poistoa, monet tahrat, esim. veri-, ulostemateriaa-li- ja ruumiin lian tahrat, jättävät usein jäämätahran käsittelyn jälkeen.

Piilolinssien puhdistuksen alalla on käytetty sa-5 mankaltaisia entsyymi/puhdistusaineformulaatioita kovien ja pehmeiden piilolinssien puhdistamiseksi ja steriloimiseksi. Monissa tapauksissa näitä formulaatioita on käytetty hajottamaan biokalvo, joka muodostuu piilolinssien pinnalle ja jota eri silmäpatogeenit, kuten Pseudomonas aeru-10 ginosa ja Staphylococcus epidermidis, käyttävät tällaiseen linssiin kiinnittymiseen. Ks. esim. Duran, J. A. ym. (1987), Arch. Ophthalmol·, 105, 106 - 109; Stern, G. A.

ym. (1987) Ophthalmology, 94, 115 - 119 (jossa raportoidaan musiinilla päällystettyjen piilolinssien käsittely 15 eri entsyymeillä, kuten pankreatiinilla, papaiinilla, trypsiinillä ja neuraminidaasilla Pseudomonaksen kiinnittymisen inhiboimiseksi); ja Slucher, M. M. ym. (1987) Arch. Ophthalmol., 105, 110 - 115.

Biokalvojen käyttö mikrobien kiinnittymiseen ei 20 rajoitu piilolinsseihin. Siten Streptococcus mutans käyt tää raportoidun mukaan solunulkoisia polysakkarideja hammaskiilteeseen kiinnittymiseen. EP-julkaisu nro 0 195 672 raportoi a-1,3-glukanaasin tai o-l, 6-glukanaasin käytön niiden solunulkoisten polysakkaridien pilkkomiseksi, joita • 25 Streptococcus mutans käyttää hammaskiilteeseen kiinnitty miseen .

Danielsson, A. ym. (1977), Botanica Marina, 20, 13 - 17, ovat myös raportoineet tiettyjen entsyymien vaikutuksen lasipinnoille kiinnittyneisiin soluihin. Siinä 30 raportoidun mukaisesti merivedestä eristetyn Pseudomonas- lajin annettiin kiinnittyä aluslaseille. Sen jälkeen laseja käsiteltiin joko pronaasilla, trypsiinillä, a-amylaa-silla (tyypin I endoglykosidaasi) tai lysotsyymilla (myös tyypin I endoglykosidaasi). Tässä raportissa käsittely 35 proteolyyttisillä entsyymeillä pronaasilla ja trypsiinillä - 98929 3 johti siihen, että osa kiinnittyneiden bakteerien populaatiosta irtosi, kun taas soluja hajottavalla entsyymillä lysotsyymillä nähtiin proteolyyttisiin entsyymeihin verrattuna pienempi aktiivisuus, a-amylaasilla ei raportoidun 5 mukaan ollut minkäänlaista aktiivisuutta.

Mikro-organismien piilolinsseihin, hammaskiilteeseen ja lasipintoihin kiinnittymisen lisäksi monet muut . pinnat ovat alttiita mikrobien kiinnittymiselle. Ks. esim.

Marrie, T. J. ym. (1984), J. Clin. Microbiology, 19, 991 -10 914 (bakteerien kiinnittyminen sydämentahdistimen johtoi hin ja paristoihin); Freimer, N. B. ym. (1978), Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, 86, 53 - 57 (mikro-organismien sitoutuminen makrofaageihin); ja Mirelman ym. (1982), To-kai J. Exp. Clin. Med., 7, 77 - 183 (mikrobien kiinnitty-15 mien nisäkkäiden limakalvojen pinnoille). Useita mekanis meja on esitetty kuvaamaan mikro-organismien, kuten bakteerien, kiinnittymistä ei-biologisiin kiinteisiin pintoihin. Ks. esim. Fletcher, M. (1987), Microbiological Sciences, 4_, 133 - 136, ja Duddridge, J. E. ym. (1983), Factors 20 Affecting the Adhesion of Bacteria to Surfaces in Microbial Corrosion, Delco Printing Co., Ltd., s. 28 - 35.

Vaikka näissä viitteissä pohditaan mikrobien kiinnittymistä eri pinnoille ja tekijöitä, jotka voivat liittyä tällaiseen kiinnittymiseen, niissä ei pohdita mikro-orga-• 25 nismien kasvun torjuntaa tällaisilla pinnoilla tai niiden poistamista niistä.

Tyypin II endoglykosidaasit, kuten termiä tässä käytetään, ovat luokka endoglykosidaaseja, jotka pystyvät katkaisemaan spesifisiä glykoproteiineissa esiintyviä si-30 säisiä glykosidisia sidoksia. Nämä endoglykosidaasit pilk kovat glykoproteiinista hiilihydraattirakenneosan kokonaan tai osan siitä riippuen reaktiivisen glykosidisen sidoksen paikasta glykoproteiinissa. Esimerkkeihin kuuluvat endo-B-N-asetyyliglukosaminidaasit (endo-D, endo-H, endo-L, endo-35 Cx, endo-Cn, Gal-tyyppinen endo-F ja endo-F) endo-a-N-ase- - 98929 4 tyyligalaktosaminidaasi ja endo-B-galaktosidaasit. Ks. esim. Tarentino, A. L. ym. (1985), Biochemistry, 24, 4665 - 4671; Arakawa, M. ym. (1974), J. Biochem., 7 6, 307 - 317; Plummer, T. H. ym. (1984) J. Biol. Chem., 259, 10700 5 - 10704; Tarentino, A. L. ym. (1975), Biochem. Biophys.

Res. Comm., 67, 455 - 462; ja Trimble, R. B. ym. (1984),

Anal. Biochem., 141, 515 - 522; sekä J. G. Beeleyn "Glycoprotein and Proteoglycan Techniques" (1985), luku 6, s.

153 - 300, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford. Sen li-10 säksi, että ne ovat spesifisiä glykoproteiinien sisäisille glykosidisille sidoksille, ainakin yksi endoglykosidaasi (endo-B-N-asetyyliglukosaminidaasi H) on osoittanut spesifisyyttä, joka tuottaa lipidiin liitettyjen oligosakkaridien katkaisun (Chalifour, R. J. ym. (1983) Arch. Biochem.

15 Biophys., 229, 386 - 394) ja raportoidun mukaan di-N-ase- tyylikitobioosisidosten katkaisun oligosakkarideissa ja glykoproteiineissa [Tarentino, A. L. (1974), J, Biol.

Chem., 249, 811 - 817] .

Tällaisia tyypin II endoglykosidaaseja on yleensä 20 käytetty pääasiassa analyyttisiin tarkoituksiin, esim.

proteiinin tai hiilihydraatin sekvenssin ja/tai spesifisten glykoproteiinien rakenteen ja toiminnan määrittämiseen. Ks. esim. Hsieh, P. ym. (1983), J. Biol. Chem., 258, 2555 - 2561 ja Geyar, R. ym. (1984), Eur. J. Biochem., . 25 143, 531 - 539. Tuoreessa raportissa tyypin II endoglyko- sidaasia raportoidun mukaan käytettiin Leishmania mexicana amazonensiksen glykoproteiiniantigeenin analysoimiseen [Chin Shen Chang ym. (1986), Mol. Biochem. Parasitol., 18, 197 - 210]. Tämä glykoproteiiniantigeeni saatettiin ensin 30 sitoutumaan immunologisesti immunoaffiniteettipallosiin ("immunobeads"). Sen jälkeen kun immunologisesti sitoutunut glykoproteiini oli saatettu reagoimaan analyyttisten endo-H-määrien kanssa, immunoaffiniteettipalloset pestiin puskurilla, joka sisälsi 1 % SDS:ä polyakryyliamidigeeli-35 elektroforeesin valmistelemiseksi. Analyysi paljasti mole- . 98929 5 kyylipainon pienenemisen, jonka katsottiin johtuvan hiilihydraatin irtoamisesta immunologisesti sitoutuneesta gly-koproteiiniantigeenistä.

Kuitenkaan tyypin II endoglykosidaaseja ei ole käy-5 tetty aineiden, mukaan luettuina glykoproteiinit ja glyko- lipidit, poistamiseen pinnoista ja aineista kuten kangas, piilolinssit, metallit, keraamiset aineet, solut, kudos ja näiden kaltaiset. Niitä ei myöskään ole käytetty mikro-organismien kasvun torjuntaan suspensiossa tai tällaisilla 10 pinnoilla.

Glykosidaaseja on käytetty yhdistelminä toisten entsyymien kanssa eri materiaalien poistoon, β-glykosidaa-sit kuvataan hiilihydraatteja metabolisoivina entsyymejä artikkelissa Anderson ym. (1964), Biochem. J., 90, 30.

15 Neuraminidaasin (N-asetyylineuraminaattiglykohydrolaasin) inhibiittorit nähdään mahdollisina antiviraalisina ja an-tibakteriaalisina aineina artikkeleissa Khorlin ym.

(1979), FEBS Letters, £), 17, ja Haskell ym. (1970), J.

Med. Chem., 13, 48. Dekstranaasin kuvataan katalysoivan 20 bakteerin polysakkaridin, dekstraanin (o-l,6-glukaanin) , hydrolyysiä isomaltoosiyksiköiksi artikkelissa Chaiet ym. (1970), Appi. Microbiol., 20, 421. Lysotsyymin (muramidaa-sin) kuvataan hydrolysoivan glykosidisia sidoksia joukon mikrobeja mukopolysakkaridisoluseinärakenteessa artikke-· 25 leissa Chipman ym. (1969), Science, 165, 454 ja Montague (1964) Biochem. Biophys. Acta, 86, 588. Lopuksi lysotsyymin inhibitio D-glukosamiinijohdannaisilla kuvataan artikkelissa Neuberger ym. (1967), Nature, 215, 524.

Tyypin II endoglykosidaaseja, kuten endo-B-N-ase-30 tyyliglukosaminidaaseja H, D, F ja/tai PNGaasi F:ä ei ole : kuitenkaan aiemmin yhdistetty antimikrobisiin aineisiin antimikrobisten koostumusten muodostamiseksi.

Edellä käsitellyt viitteet annetaan ainoastaan siksi, että ne on esitetty ennen käsillä olevan tapauksen 35 jättöpäivää, eikä mitään tässä pidä tulkita sen myöntämi- 98929 6 seksi, että tällaiset viitteet ovat tekniikan taso, tai sen, että keksijöillä ei ole oikeutta olla tällaista esittämistä aikaisempia aikaisemman keksinnön tai aikaisemmin jätettyjen patenttihakemusten nojalla.

5 Keksinnön tavoitteena on tuoda käytettäväksi mene telmiä, joissa käytetään tyypin II endoglykosidaaseja yksin tai yhdistelminä toisten entsyymien, puhdistusaineiden, pinta-aktiivisten aineiden ja/tai disulfidinkatkaisu-reagenssien kanssa, helpottamaan mikro-organismien, kuten 10 bakteerien, poistamista sellaisten materiaalien, kuten kankaan, piilolinssien, metallien, keraamisten aineiden, solujen, kudosten ja näiden kaltaisten pinnalta.

Tämän tarkoituksen mukaisesti keksintöön sisältyy menetelmä ainakin osan mikro-organismia irrottamiseksi 15 pinnasta, johon se on sitoutunut. Mikro-organismi on si toutunut pintaan osaksi sidoksella, joka on reaktiivinen tyypin II endoglykosidaasin kanssa. Menetelmälle on tunnusomaista, että tämä sidos katkaistaan tyypin II endogly-kosidaasilla ainakin osan mikro-organismia irrottamiseksi 20 pinnasta. Toista entsyymiä, puhdistusainetta ja/tai pinta- aktiivista ainetta voidaan käyttää yhdessä tämän menetelmän kanssa mikro-organismin irrotetun osan poistamiseksi pinnalta.

Edellä mainituissa menetelmissä disulfidinkatkaisu-* 25 reagenssia voidaan käyttää denaturoimaan mikro-organismiin liittynyttä proteiinia ja siten helpottaa katkaisua tyypin II endoglykosidaasilla tai toisella entsyymillä tai poistamista puhdistusaineella ja/tai pinta-aktiivisella aineella.

30 Kuvio 1 esittää N-sidoksellisten ja O-sidoksellis- ten glykoproteiinien yhteistä ydinrakennetta.

Kuvio 2 esittää eri tyypin II endoglykosidaasien substraatteja ja tunnettuja katkaisukohtia.

Kuvio 3 on kuvion 2 proteiinien aminohappojen, hii-35 lihydraattitähteiden ja katkaisukohtien yleinen esitys.

- 98929 7

Kuvio 4 esittää N-sidoksellisen glykoproteiinin ydinrakennetta, tyypin II endoglykosidaasin katkaisukohtaa ja proteiini- ja hiilihydraattiyksiköiden sekä tyypin II endoglykosidaasilla katkaistaessa muodostuvien aglykoni-5 ja hiilihydraattiosien suhdetta toisiinsa.

Kuviot 5A - 5E esittävät eri mekanismeja, joilla glykosideja sisältävä aine, mikro-organismit tai tyypin II , endoglykosidaasin kanssa reaktiiviset aineet voidaan ir rottaa pinnalta käsittelemällä tyypin II endoglykosidaa-10 silla pelkästään tai yhdistelmänä toisen entsyymin kanssa.

Kuviot 6A ja 6B ovat elektronimikroskooppikuvia (8100X) nailontilkuista, jotka on tahrattu ulosteella ja käsitelty endo-H:n ollessa läsnä tai ilman sitä.

Kuviot 7A - 7H ovat elektronimikroskooppikuvia 15 (5000X), jotka osoittavat endo-H:n ja muiden hiilihydraa- sientsyymien tehon puuvillatilkkuihin, jotka on tahrattu ulosteella.

Kuviot 8, 9, 10A ja 10B osoittavat endo-H:n ja klooriheksidiinin eri pitoisuuksien, yksin tai yhdistelmä-20 nä, vaikutuksen E. colin elinkykyisyyteen.

Kuviot 11 ja 12 osoittavat, että endo-H:ta sisältävä puhdistusainekoostumus on tehokkaampi poistamaan S. aureuksen sian iholta kuin puhdistusainekoostumus, joka ei sisällä endo-H:ta.

25 Kuvio 13 osoittaa, että endo-H on tehokkaampi ir rottamaan hometta suihkuverhosta kuin vesi tai puhdistus-ainekoostumus. Keskivalokuva on osasta suihkuverhoa. Muut neljä valokuvaa ovat suurennoksia vastaavista keskivaloku-. van neljänneksistä.

30 Kuvio 14 osoittaa endo-H:n antimikrobisen tehon yh dessä eri antimikrobisten aineiden kanssa.

*

Kuviot 15A - B ja 16A - B osoittavat endo-H:n tehon eri hiivalajeihin.

Kuviot 17 ja 18 osoittavat ulosteen irtoavan tehok-35 kaammin vaippamateriaalista puhdistusainekoostumuksella, joka sisältää endo-H:ta.

8 . 98929

Tyypin II endoglykosidaaseja sekä tällaisia endo-glykosidaaseja käyttäviä formulaatioita käytetään tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä irrottamaan ja/tai poistamaan pinnalta tyypin II endoglykosidaasien kanssa reak-5 tiivisia aineita. Tämän reaktiivisuuden mekanismia ei tun neta varmuudella. Joissakin tapauksissa tällaiset aineet ovat glykosideja tai glykosideja sisältäviä aineita, joissa uskotaan olevan sellaisia glykosidisia sidoksia, jotka ovat tyypin II endoglykosidaasien tunnettuja katkaisukoh-10 tia tai jotka ovat läheistä sukua tällaisille katkaisukoh- dille.

Tässä käytettynä "tyypin II endoglykosidaasit" ovat entsyymejä, jotka kykenevät katkaisemaan sidoksia glyko-proteiinin proteiini- ja hiilihydraattiosien liitoskohdas-15 sa tai lähellä sitä. Edullisesti tällaiset tyypin II endo glykosidaasit kykenevät katkaisemaan ainakin yhden gly-kosidisen sidoksen, joka on noin kolmen glykosidisen sidoksen säteellä proteiini- ja hiilihydraattiyksikön liitoskohdasta (mukaan luettuna proteiini- ja hiilihydraat-20 tiyksikön liitoskohdan muodostava glykosidinen sidos).

Edullisimmin tällaiset glykosidiset sidokset ovat noin kahden glykosidisen sidoksen säteellä proteiini- ja hiilihydraattiyksikön liitoskohdasta (ks. kuviot 1, 2 ja 3) .

" 25 Tyypin II endoglykosidaasit määritellään myös nii den spesifisyyksien mukaan tietyille, kuviossa 1 näytetyille N- ja O-sidoksellisten glykoproteiinien tunnettujen ydinrakenteiden glykosidisille sidoksille. Nämä vastaavat glykosidisia sidoksia aminohappojen seriini, treoniini tai 30 asparagiini ja ensimmäisen hiilihydraattitähteen välillä sekä glykosidisia sidoksia ainakin ensimmäisen, toisen ja kolmannen hiilihydraattitähteen välillä. Vaikka tämä ydin-rakenne kuvataan yksityiskohtaisemmin tämän jälkeen niiden spesifisten glykosidisten sidosten muodossa, joita esiin-35 tyvät tunnetuissa ydinrakenteissa, tällaisten spesifisten 4 - 98929 9 sidosten ei pidä tulkita olevan rajoittavia tälle tyypin II endoglykosidaasien määritelmälle. Tämän mukaisesti kaikki mahdolliset glykosidiset sidokset näiden aminohappojen ja hiilihydraattitähteiden välillä määrittelevät N-5 ja O-sidoksellisen glykoproteiinin ydinosan, jota käyte tään identifioimaan tyypin II endoglykosidaasit.

Tyypin II endoglykosidaaseja ei rajoita nykyinen tietämys glykoproteiinien ydinrakenteista ja tunnettujen endoglykosidaasien spesifisyydestä tällaisille ydinraken-10 teille. Kuvion 1 ydinrakenteiden vertailu kuvion 2 tyypin II endoglykosidaasien tunnettujen substraattien kanssa osoittaa, ettei tyypin II endoglykosidaaseja ole tunnistettu kaikille mahdollisille kuvion 1 ydinrakenteiden kat-kaisukohdille, jos niitä on olemassa. Lisäksi voi olla 15 olemassa muita ydinrakenteita, joita ei vielä ole tunnis tettu. Endoglykosidaasit, jotka reagoivat tällaisissa vielä tuntemattomissa ydinrakenteissa olevien sidosten kanssa, ovat myös tyypin II endoglykosidaaseja. Tämän mukaisesti sellaiset glykoproteiinien glykosidiset sidokset, 20 jotka määrittelevät tyypin II endoglykosidaasit, eivät rajoitu niihin sidoksiin, jotka sijaitsevat kolmen ensimmäisen glykoproteiinin proteiiniyksikköä lähinnä olevan joukossa, vaan saattavat ulottua kaukaisempiin glykosidi-siin sidoksiin ydinrakenteessa, esim. neljänteen tai vii-25 denteen glykosidiseen sidokseen proteiiniyksiköstä läh tien, tunnistetusta ydinrakenteesta riippuen.

Spesifisyys glykoproteiinien ydinrakenteille tarjoaa sopivan tyypin II endoglykosidaasien määritelmän, joka , erottaa ne tyypin I endoglykosidaaseista. Tyypin I endo- 30 glykosidaasit katkaisevat spesifisiä sidoksia oligo- ja polysakkarideissa, mutta yleensä ne eivät ole reaktiivisia niiden glykoproteiinien ydinrakenteen glykosidisten sidosten kanssa, jotka määrittelevät tyypin II endoglykosidaasit. Esimerkkejä tyypin I endoglykosidaaseista ja sidok-35 sista, joiden kanssa ne ovat reaktiivisia, on esitetty taulukossa I.

- 98929 10

Taulukko I

Tyypin I oligo- tai polysakkaridi- 5 endoqlykosidaasi substraatti e 1-4 a-amylaasi (Glc-Glc)n t 10 41-4 sellulaasi (Glc-Glc)n t 15__ 41-3 41-4 41-3 hyaluronidaasi GlcA-GlcNAc-GlcA-GlcNAc * t 20 —--- lysotsyyrait: fl\·' fil’4 βΙ-Α kananmunanvalkuaisen GlcNAc-MurHAc-GldNAc-MurNAo lysotsyymi f 1 T4:n lysotsyymi 25 mutanolysiini e1-4 «1-4 «1-6 «1-4 pullulanaasi Glc-(Gle-Glc-)Glc-Glc 30 f 35

GlcA on D-glukuronihappo MurNAc on N-asetyylimuramiinihappo t ilmaisee katkaisukohdan - 98929 11

Sellaisia spesifisiä glykosidisia sidoksia glyko-proteiineissa, jotka määrittelevät edullisia tyypin II en-doglykosidaaseja, esitetään kuviossa 2. Katkaisukohdat on ilmaistu pystynuolella. Yleinen esitys proteiinin aminoha-5 poista, hiilihydraattitähteistä ja kuvion 2 katkaisukoh- dista on esitetty kuviossa 3. Kuten voidaan nähdä, tyypin II endoglykosidaasit katkaisevat edullisesti ensimmäisiä, toisia tai kolmansia glykosidisia sidoksia N- tai O-sidok-sellisissa glykoproteiineissa. Nämä sidokset käsittävät 10 vastaavasti glykosidiset sidokset (1) proteiiniosan aspa- ragiinin, seriinin tai treoniinin ja ensimmäisen hiilihyd-raattitähteen välillä, (2) hiilihydraattitähteiden 1 ja 2 välillä ja (3) hiilihydraattitähteiden 2 ja 3 välillä.

Tämä spesifisyys määräytyy ensisijaisesti glykoproteiinin 15 hiilihydraattisekvenssin mukaan glykoproteiinin proteiini- osan vaikuttaessa jonkin verran spesifisyyteen ja reaktiivisuuteen. Siten glykosidisia sidoksia 2 ja 3 (jotka käsittävät vain hiilihydraattitähteiden välisiä glykosidisia sidoksia) tarkasteltaessa tyypin II endoglykosidaasit voi-20 vat olla reaktiivisia identtisten tai samankaltaisten gly- kosidisten sidosten kanssa, jotka sijaitsevat glykoproteiinin muilla alueilla, ehkä melko kaukana glykoproteiinin proteiini- ja hiilihydraattiosien liitoskohdasta.

Edeltävän määritelmän soveltaminen tiettyyn glyko-25 proteiiniin valaisee asiaa. Naudan tyroglobuliinia on ana lysoitu käyttäen endo-h-N-asetyyliglukosaminidaasi H:ta (endo-H:ta), α-mannosidaasia ja β-mannosidaasia [Tarenti-no, A. L. ym. (1973) J. Biol. Chem., 218, 5547]. Endo-H hydrolysoi glykosidisen sidoksen niiden kahden N-asetyyli-30 D-glukosamiinin välillä, joista toinen oli N-sidoksella : kiinni tyroglobuliinin proteiiniosan asparagiinissa. Endo- H-käsittelyllä vapautunutta tyroglobuliinin oligosakkaridi- eli hiilihydraattiosaa käsiteltiin myös a- ja β-man-nosidaasilla. Koska kumpikaan näistä entsyymeistä ei ole 35 spesifinen kuvioissa 1, 2 tai 3 esitettyjä vastaavien - 98929 12 substraattien kanssa, ne eivät ole tyypin II endoglykosi-daaseja, ja niitä voidaan luonnehtia joko eksoglykosidaa-siksi tai tyypin I endoglykosidaasiksi. Endo-H:n spesifisyys on sama kuin kuviossa 2 endo-H:lle esitetty ja siksi 5 endo-H on tyypin II endoglykosidaasi. Tämä on tietenkin triviaali sovellus. Mutta jos löydetään uusi endoglykosidaasi (esim. endo-X), jolla nähdään tämä spesifisyys tai yksi tai useampi muista kuvioiden 1, 2 tai 3 spesifisyyksistä, myös tämä endo-X olisi tyypin II endoglykosidaasi.

10 Tätä glykoproteiinispesifisyydelle perustuvaa tyy pin II endoglykosidaasin määritelmää ei kuitenkaan pidä tulkita rajoituksena mekanismille, jota tyypin II endogly-kosidaasit käyttävät aineen irrottamiseen ja/tai poistamiseen pinnalta. Vaikka on joissakin tapauksissa oletetta-15 vaa, että tyypin II endoglykosidaasit katkaisevat ainakin osan glykosidia irti pinnasta reagoimalla glykosidin gly-kosidisen sidoksen kanssa, keksintö ei rajoitu tällaiseen katkaisuun. Pikemminkin tyypin II endoglykosidaasien toiminta määritellään funktionaalisesti sen mukaan, että ne 20 kykenevät katkaisemaan irti pinnasta ainakin osan mitä tahansa tyypin II endoglykosidaasin kanssa reaktiivista ainetta.

Tässä käytettynä termi "endoglykosidaasi" käsittää tyypin I ja tyypin II endoglykosidaasit.

. 25 Tässä käytettynä termi "glykosidi" viittaa polymee riin, jolla on yksi tai useampia "hiilihydraattiosia" ko-valenttisesti glykosidisella sidoksella kiinni "aglykoni-osassa". Tämä glykosidin määritelmä on johdettu glykosidin tavallisesta määritelmästä, joka viittaa sellaiseen yhdis-30 teeseen, josta saadaan hydrolyysissä sokeri ja aglykoni, jolloin aglykoni on tällaisesta hydrolyysistä saatava yhdiste, joka ei ole sokeri. Tässä käytetyn mukaisesti glykosidi tuottaa tyypin II endoglykosidaasilla katkaistaessa aglykonin ja oligo- tai polysakkaridihiilihydraattiosan.

35 Aglykoniyksikkö ei kuitenkaan rajoitu yhdisteeseen, joka 13 S6929 ei ole sokeri, koska tyypin II endoglykosidaasi voi hydrolysoida glykosidin tuottaen aglykoniosan, joka sisältää yhden tai useamman sokeritähteen tyypin II endoglykosidaa-sin katkaisukohdasta riippuen. Lisäksi aglykoniosa voi 5 olla melko monimutkainen, kuten asia saattaisi olla pepti- doglykaanien kohdalla, joissa voidaan tavata hiilihydraat-timatriisissa kiinni olevia ristisidottuja peptidejä. Siten glykosideihin sisältyvät glykoproteiinit, glykolipi-dit, peptidoglykaanit ja näiden kaltaiset, joista tyypin 10 II endoglykosidaasilla käsiteltäessä saadaan hiilihydraat- tiosa ja aglykoniosa, missä hiilihydraattiosa ja aglykoniosa määritellään tyypin II endoglykosidaasin kat-kaisukohdan mukaan. Tämä glykosidin määritelmä tulee ilmeiseksi seuraavasta pohdinnasta.

15 Tässä käytettynä termi "glykoproteiini" viittaa glykosidiin, jossa on yksi tai useampi oligo- tai polysakkaridi kovalenttisesti kiinni peptidissä tai proteiinissa. Oligo- ja polysakkarideihin viitataan tässä joskus "hiili-hydraattiyksiköinä". Tällaiset hiilihydraattiyksiköt voi-20 vat kuitenkin poiketa glykosidin "hiilihydraattiosasta".

Kuten kuviossa 4 esitetään, hiilihydraattiyksikkö käsittää toisentyyppiseen molekyyliin, esim. proteiiniin tai peptidiin, kuten glykoproteiinissa, tai lipidiin kuten glykoli-pidissä, kiinnittyneen koko oligo- tai polysakkaridin. Jos · 25 tyypin II endoglykosidaasi katkaisee hiilihydraattiyksikön sen liitoskohdasta, esimerkiksi liitoskohdasta proteiiniin, niin hiilihydraattiyksikkö tarkoittaa samaa kuin glykosidin hiilihydraattiosa. Jos kuitenkin tyypin II endoglykosidaasi katkaisee hiilihydraattiyksikön sen sisällä 30 olevan glykosidisen sidoksen kohdalta, niin tällaisessa ·. katkaisussa muodostunut glykosidin hiilihydraattiosa on vähemmän kuin koko hiilihydraattiyksikkö. Tämä ero esitetään kuviossa 4 nuolen osoittamalle tyypin II endoglykosidaasin katkaisukohdalle.

- 98929 14

Glykoproteiinin hiilihydraattiyksiköt voivat olla oligosakkarideja, jotka sisältävät 1-10 hiilihydraatti-tähdettä (sokeritähdettä) tai lyhyitä polysakkarideja, jotka sisältävät tavallisesti 10 - 25 hiilihydraattitäh-5 dettä. Korkeammat eliöt, kuten eukaryootit, mukaan luet tuina hiiva- ja nisäkässolut, tuottavat monia glykoprote-iineja. Sidos glykoproteiinin hiilihydraattiyksikön ja peptidi-tai proteiiniyksikön välillä on glykosidinen sidos, joka on tulos kondensaatioreaktiosta proteiiniyksikön aminoha-10 pon sivuketjun ja hiilihydraattiyksikön ensimmäisen täh teen anomeerisen hiilen välillä. Tällaiset glykosidiset sidokset nisäkkäiden glykoproteiineissa ovat joko N-glyko-sidisia sidoksia (hiilihydraatti liitetty asparagiinin amidotyppeen) tai O-glykosidisia sidoksia (hiilihydraatti 15 liitetty seriinin tai treoniinin hydroksihappeen).

Hiilihydraattiyksikön (oligo- tai polysakkaridin) hiilihydraattitähteet (monosakkaridit) voivat olla toisissaan kiinni monilla eri tavoilla. Niinpä tällaiset hiilihydraattiyksiköt voivat olla haarautumattomia, lineaarisia 20 rakenteita tai monimutkaisia, haarautuneita rakenteita.

Yleensä kuitenkin jokainen hiilihydraattiyksikön hiilihyd-raattitähde on kiinni glykosidisella sidoksella, jossa toisen hiilihydraattitähteen anomeerinen hiili on liittynyt toisessa hiilihydraattitähteessä olevaan hydroksyyli-· 25 hiileen. Tällaiset glykosidiset sidokset voivat olla alfa- tai beeta-sidoksia riippuen anomeerisen hiilen konfiguraa-tiosta. Toisen tähteen anomeerinen hiili voi yhdistyä minkä tahansa toisen tähteen hydroksyylihiilistä kanssa. Siten monien glykoproteiinien monimutkaisuus juontuu monista 30 erilaisista glykosidisista sidoksista, joita tavataan täl laisten molekyylien hiilihydraattiyksiköissä.

Monissa membraaniglykoproteiineissa on asparagii-niin liitettyjä hiilihydraattiyksiköitä (peptidissä olevaan asparagiiniin N-glykosidisella sidoksella liitettyjä 35 hiilihydraattiyksiköitä). Tällaisten asparagiinisidoksel- . 98929 15 listen glykoproteiinien rakenne voi olla melko monimutkainen. Ks. esim. Schachter, H. (1984) Clinical Biochemistry, 17, 3-14. Monien näiden joukosta eri lähteitä saatavien asparagiinisidoksellisten membraaniglykoproteiinien (esim.

5 punasolujen plasmamembraanin glykoproteiineja, virusten vaippaglykoproteiineja) rakenne sekä liukoisten ei-memb-raaniglykoproteiinien rakenne viittaa siihen, että näillä kahdella tyypillä glykoproteiineja on monia yhteisiä ra-kennepiirteitä. Mts. 3. Tällaisten asparagiinisidoksellis-10 ten glykoproteiinien yhteinen ydinrakenne esitetään kuvi oissa 1 ja 4, joissa GlcNAc on N-asetyyli-D-glukosamiini ja Man on mannoosi. Merkinnät al-6, al-3 ja ftl-4 kuvaavat glykosidisen sidoksen tyyppiä eri hiilihydraattitähteiden välillä. Tämä ydinsidos muodostaa perustan lukuisille gly-15 koproteiineille, joissa on mikä tahansa lukumäärä hiili- hydraattitähteitä kiinni ytimessä. Mts. 5.

O-sidokselliset glykoproteiinit sisältävät ydinra-kenteen, jossa glykoproteiinin proteiiniyksikkö on kiinni hiilihydraattiyksikössä joko seriinin tai treoniinin hyd-20 roksyyliryhmän välityksellä. Tämän ydinrakenteen yleinen piirre on N-asetyyli-D-galaktosamiinin (GalNAc) läsnäolo seriiniin tai treoniiniin liitettynä. Muita tällaisten glykoproteiinien yksityiskohtia esitetään kuviossa 1, jossa NeuAc on N-asetyylineuramiinihappo, Gal on galaktoosi .· 25 ja L-Fuc on L-fukoosi. Kun Gal on toinen hiilihydraatti- tähde, glykosidinen sidos GalNAcrn ja Gal:n välillä on yleensä Bl-3. Katsausartikkelina glykoproteiinien, mukaan luettuina N- ja O-sidokselliset glykoproteiinit, raken-, teestä, biosynteesistä ja toiminnasta ks. Berger, E. G.

30 ym. (1982) Experimentia, 38, 1229 - 1258.

; '· Alemmat eliöt kuten prokaryootit, esim. bakteerit E. coli, Pseudomonas-lajit, Bacillus-lajit ja näiden kaltaiset, tuottavat peptidoglykaaneja ennemmin kuin glykoproteiineja. Peptidoglykaaneja tavataan bakteerien solu-35 seinissä ja tyypillisesti niillä on polysakkariditukiran- . 98929 16 ka, jossa on vuorotellen N-asetyyliglukosamiinia ja N-ase-tyylimuramiinihappoa. N-asetyylimuramiinihappotähteisiin on joskus liittynyt peptidisivuketjuja, jolloin ristisi-dottuja peptidisiltoja usein kulkee peptidisivuketjujen 5 välillä. Gram-positiivisten bakteerien soluseinä käsittää tyypillisesti noin 10 % peptidoglykaania, kun taas Gram-negatiivisten bakteerien soluseinän peptidoglykaaninpitoi-suus on tyypillisesti noin 50 %.

Peptidoglykaanit eivät kuitenkaan ole glykoprote-10 iineja, ainakaan siinä määrin kuin glykoproteiinien spesi fisiä glykosidisia sidoksia käytetään määrittelemään tyypin II endoglykosidaasien luokkaa. Siten endo-H on tyypin II endoglykosidaasi, koska se katkaisee sellaisen glykosi-disen sidoksen kahden N-asetyyliglukosamiinisokeritähteen 15 väliltä, joka esiintyy joissakin N-liitettyjä oligosakka rideja sisältävissä glykoproteiineissa. Ks. kuvio 4. Endo-H:lla voi kuitenkin olla jokin vielä määrittelemätön reaktiivisuus peptidoglykaanin kanssa, koska se pystyy helpottamaan ulosteen irtoamista pinnalta, kuten kangastilkuil-20 ta. Tällaisen ulosteen tiedetään sisältävän suolistobak- teereihin liittyviä peptidoglykaaneja. Lysotsyymit ovat peptidoglykaanin kanssa reaktiivia entsyymejä. Lysotsyymit, kuten kananmunan valkuaisen lysotsyymi, T4:n lysot-syymi ja mutanolysiini [Goodman ym. (1981), J. Bacteriol., ; 25 14 6, 755] eivät kuitenkaan ole tyypin II endoglykosidaa- seja. Tämä johtuu siitä, etteivät ne olennaisesti reagoi niiden N- ja O-sidoksellisissa glykoproteiineissa tavattujen ainutlaatuisten glykosidisten sidosten kanssa, joita käytetään määrittelemään tyypin II endoglykosidaasit. Ne 30 reagoivat kuitenkin peptidoglykaanien kanssa tuottaen N- asetyyliglukosamiinin ja N-asetyylimuramiinihapon disakka-rideja, joissa on kiinni peptidisivuketjuja. Näin ollen lysotsyymit luokitellaan tarkoituksenmukaisemmin tyypin I endoglykosidaasiksi. Siten, vaikkakin lysotsyymin ja endo-35 H:n reaktiivisuudessa peptidoglykaanien kanssa voi olla 17 - 93929 päällekkäisyyttä, ne ovat suurimmaksi osaksi toisensa poissulkevia, mitä tulee endo-H:n spesifisyyteen niitä glykosidisia sidoksia kohtaan, jotka määrittelevät tyypin II endoglykosidaasit, ja lysotsyymin olennaiseen reagoi-5 mattomuuteen niiden kanssa.

Tässä käytettynä "glykosidia sisältävä aine" tai "glykoproteiinia sisältävä aine" on pelkkä glykosidi tai , glykoproteiini tai glykosidi tai glykoproteiini yhdessä muun komponentin kanssa. Siten glykosideja sisältäviin 10 aineisiin kuuluvat glykosidit, kuten glykoproteiinientsyy- mit, esim. alkalinen fosfataasi, bromelaiini, karboksipep-tidaasi-Y; glykoproteiinihormonit, esim. koriongonadotro-piini, erytropoietiini; lektiinit, esim. perunasta ja soijapavusta saatavat lektiinit; seerumin glykoproteiinit, 15 esim. IgG-immunoglobuliini, tyroglobuliini, protrombiini ja näiden kaltaiset sekä sekalaiset glykoproteiinit, kuten hemoglobiini ja interferoni; ja kompleksiset hiilihydraatit. Esimerkkejä glykosideistä yhdessä muun komponentin kanssa ovat glykoproteiinit, jotka sisältävät membraanin 20 ainesosia, esim. punasolujen sisältämä glykoforiini, in fluenssaviruksen sisältämä hemagglutiniini, naudan verkkokalvon sisältämä rodopsiini ja fibroblastien sisältämä kollageeni. Glykosidejä sisältäviin aineisiin kuuluvat vielä virusten vaippaglykoproteiinit ja uloste, joka osak-; 25 si sisältää suolistobakteereihin liittyviä peptidoglykaa- neja. Siten viruksia, fibroblasteja, ulostetta jne. pidetään glykosideja sisältävinä aineina.

Tässä käytettynä "mikro-organismi" (johon joskus viitataan glykosideja sisältävänä mikro-organismina) on 30 sellainen, joka pystytään irrottamaan sen aineen pinnalta, . ·, johon se on sitoutunut, tyypin II endoglykosidaasilla.

Esimerkkejä ovat ulosteessa esiintyvät suolistobakteerit ja yleisesti piilolinssiä kontaminoivat bakteerit. Muita esimerkkejä ovat sienet ja levät, jotka voidaan irrottaa 35 pinnalta tyypin II endoglykosidaasilla.

- 98929 18 Tässä käytettynä termi "in vitro” viittaa ympäristöön, jossa keksinnön mukaiset menetelmät tai prosessit pannaan käytäntöön. Sitä käytetään vain eron saamiseksi termiin "in vivo", joka kuvaa ympäristöä, jossa tyypin II 5 endoglykosidaasit luonnossa esiintyvät, esim. eliöissä, jotka luonnostaan tuottavat tyypin II endoglykosidaasia. Tämän mukaisesti tyypin II endoglykosidaasia käyttävä in vitro -menetelmä on menetelmä tai prosessi, joka ei esiinny luonnossa. Termin in vitro ei kuitenkaan pidä tulkita 10 rajoittavan tällaisia menetelmiä "lasiin" tai sulkevan pois tällaisten menetelmien toteutuksen elävän eliön pinnalla tai sisällä. Keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan toteuttaa joukolla erilaisia muita pintoja kuin lasi, mukaan luettuina kangas, piilolinssit, metallipinnat, keraa-15 miset pinnat, solujen pinnat, muovipinnat, kudos ja näiden kaltaiset. Lisäksi tällaisia in vitro -menetelmiä voidaan toteuttaa esimerkiksi ihmisen suuontelossa, kuten edempänä kuvataan yksityiskohtaisemmin.

Joitakin tunnettuja tyypin II endoglykosidaaseja 20 luetellaan taulukossa II yhdessä tällaisten entsyymien luonnollisen biologisen lähteen kanssa. Joidenkin tyypin II endoglykosidaasien katkaisukohdat esitetään kuviossa 2. Katso J. G. Beeleyn "Glycoprotein and Proteoglycan Techniques" (1985), luku 6, s. 153 - 300, Elsevier, Amsterdam, *; 25 New York, Oxford. Eräs tyypin II endoglykosidaasi, jota ei luetella taulukossa II, on glykopeptidaasi F, johon joskus viitataan PNGaasi F:nä. PNGaasi F:ä voidaan saada Flavo-bacterium meningosepticumista. Se on myös kaupallisesti saatavana Boehringer Mannheim Biochemical -yhtiöstä, 30 Indianapolis, Indiana.

19 . 98929

—. I

P I C P 4J I

I Φ a I ·· Φ O <—I

a to O a Ch to -n <0 M a C M -H n) -H e> φ a a Φ fOOU. »ΓΟ a a. <0 a > a -pi >1 a, — — C >i a a >, a φ >1 Ό <s

p P a P 4-> to 4-) -HI

a) 3m φ ai a mu to c 3m to 4-) to Γ-4 c P (0 < m a> xz -η φ a to φ a xz z cu to aj a to α ο to p xz u a a t—t a a a c a c <o a

>1 tn O >i to >t-H to to m O

>,— O g >1— O 3m g O C O I

4-) D C -H P D C P M C a ΟΌ3

-H 4-1 C C a P G d Φ C g -H

to p to φ toptotopto Mac H XZ <D g -Η .* Φ g XZ g Φ O d p φ p to a φ P to Φ d tO P to p a to to atotoaatopc Φ to to to aa to c a-π to ap m m a n -ac~ , to gocpa gocgtoctoto φυ M O a D Φ to O a 3 O to Da > 03 a > a

p XZ MB) > XZ M XZ > Μ a P4t O

to pa p a »I to P Φ XI pa pap pa P P » P 3m P a -a totoa d φ μ φ a φ φμφφρφ>ιΦΟ tom to to Φ to >1 to (Οφ(ΟΙΟφΙΟΡΟ)ί£<ιΡΡΡ a xz a >, a a xz a a to a a d z a :to —

D <—I O I—ip '—t I—i O I—t 1 2 3—i a '—i to '—i I—I C D

Φ a to a a a atoaaioa-vato Φ tottou C Φ φτ3φ φ tu(i)M<i)a)Q)Oaap< a top to a to top to toto to a ton g c a z a xz φ xz m xz xzoxzzztozzaxzi x: tottou a 003 0X3 O Oto O 0X0 Og Oa >, M toa a Oa Ό >1 D Oa T! Oa T30 T3Ö M pad ά a M a x: a a m a a to a λ: a i a to to a

>, to Φ 03 tOPtOOtOlOXZtO to 1—I M M I

>, 1Φ Ito ΙΦ ΙΦ I 110 Ito 110 Φ Φ to a

E-t ZP Z-aZto ZP Z ZX Z -a O d > X XZ cG

a

a I

„ O I 03

9 x; a D

-¾ a p u * to a a

z> Ο Φ P

a to to xz to 3m 3 φ — c c α ο φ φ a 1° to to to to φ φ to O' to to o

a a D D D Co O' O C a a a P

C ρφρ c C-C a C Cato O m to to a d a C Ο ΟΌΜ

g uau M MM Φ g gCO

3 a M a P PO g D D O XZ

Φ a O' a M Mg Φ ΦΦ c α,α,Φ φ a g e c Mg

a to α a ts d aaPD

to φ to a a

to φ u Φ g gg M to totOM

D U 3m U D DD Φ D D a Φ u 3m g 3m a au p u ux:p

U gOg Ό Oa U U UOU

o opo a aM to o oaio U PO.P M MP X3 U U M X3 Φ Ο O. (U CX P ΡΟ Ο Ο ΟΦΟ Ό a ΦΜΦ to toM > a a x: 3> x: ex mpm o oog toga auto tto a pcop a aao a D a a to a ·· d Q t/3 '—' C/3 U O Ctl M (XUQ Q ω &4 2 to I o

to P

Ο XZ P

xZ to a 3 a to I—I (0 (0 O' O' (0 . a Cu a Ό • a a a • 3m C >i to 3m φ 3m o

p c P P

Φ d φ xz to p a to to

to a a to a I—I

I to 3m i to to a z to 3m Z ο O'

g I to p I to I

>i CD Ό I BTJ tS

>i I a a I a I

tooc „33(0 OCO

P T) a Q X d u o d a oa o e e g e g c ω φ tO φ (0 Φ - 98929 20

Kuten voidaan nähdä, endo-H, -F, -D, -Cx ja Gal- tyyppinen endo-F kaikki katkaisevat glykoproteiinin toisen glykosidisen sidoksen. Gal-tyyppisen endo-F:n tapauksessa tämä glykosidinen sidos on GlcNAc:n ja Gal:n välissä. En-5 do-H:n, -F:n, -D:n ja -Cx:n tapauksessa katkaisu on kahden

GlcNAc-tähteen välistä, jolloin substituentit U, V, W, X, Y ja Z määrittelevät spesifisyyden.

Endo-H katkaisee N-sidoksellisia glykoproteiineja, joissa on korkea mannoosipitoisuus. Siten kuviossa 2 W 10 käsittää 2 - 150 mannoositähdettä, Y käsittää 1-2 man- noositähdettä ja X, Z, V ja U ovat H (vety). Endo-H katkaisee myös hybridirakenteita, joissa W käsittää 1-2 mannoositähdettä ja Y ja/tai Z käsittää NeuNAc-Gal-GlcNAc:n tai samankaltaisia rakenteita ja V käsittää H:n 15 tai GlcNAc:n. Endo-H on edullinen keksinnön mukaisissa menetelmissä ja koostumuksissa käytettävä tyypin II endo-glykosidaasi.

Endo-D:llä ja endo-CI:llä on samantapaiset reaktiivisuudet, vaikka nämä entsyymit ovat eri lähteistä peräi-20 sin. Endo-D ja endo-Cx ovat aktiivisia glykoproteiinien N- sidoksellisia oligosakkarideja kohtaan ja katkaisevat run-sasmannoosisia rakenteita, jotka sisältävät enemmän kuin 5 mannoosihiilihydraattitähdettä, jolloin X käsittää ydin-rakenteeseen al-3-glykosidisella sidoksella liitetyn man-25 noosin, W käsittää ydinrakenteeseen al-6-glykosidisella

sidoksella liitetyn mannoosin ja muut substituentit kuviossa 2 ovat H. Endo-D katkaisee myös kompleksisten rakenteiden tai hydridirakenteiden ydinosan sen jälkeen, kun suurin osa haarojen sokeritähteistä on poistettu ekso-30 glykosidaaseilla, jolloin Y käsittää H:n tai GlcNAc:n ja U

käsittää H:n tai fukoosin kuviossa 2.

Endoglykosidaasi endo-F on aktiivinen sellaisia runsaasti mannoosia sisältäviä N-sidoksellisia glykoprote-iineja kohtaan, joissa kuviossa 2 X ja Y ovat yksi tai 35 useampia mannoositähteitä ja loput substituentit ovat H.

- 98929 21

Endo-F katkaisee myös kaksihaaraisia hybridirakenteita, joissa X ja W käsittävät ydinrakenteeseen al-3- ja al-6-glykosidisilla sidoksilla liitetyn mannoosin ja Y käsittää NeuNAc-Gal-GlcNAc:n tai samankaltaisen rakenteen ja U kä-5 sittää H:n tai fukoosin. Endo-F katkaisee myös kaksihaa raisia kompleksisia rakenteita. Tällaiset rakenteet käsittävät kuviossa 2 olevan endo-F:n substraatin ydinraken-, teen, jossa X ja Y käsittävät NeuNAc-Gal-GlcNAc:n tai sa mankaltaisia rakenteita ja U käsittää H:n tai fukoosin.

10 Endo-L:llä on samankaltainen reaktiivisuus katkais ta N-sidoksellisten glykoproteiinien toinen glykosidinen sidos. Se on spesifinen pienimolekyylipainoisille substraateille, joihin sisältyy Man-GlcNAc-GlcNAc-Asn. Endo-Cnilla nähdään endo-H:n kanssa samankaltainen spesifisyys.

15 Endo-a-N-asetyyligalaktosaminidaasi hydrolysoi sellaisia glykoproteiineja, joissa on O-sidoksella seriiniin tai treoniiniin liitettyjä oligosakkarideja, joissa GalNAc ja Gal ovat kaksi ensimmäistä hiilihydraattitähdettä. Myös endo-h-galaktosidaasin spesifisyys esitetään kuviossa 2, 20 jossa Rl voi olla jokin niistä mannooseista, joista hiili- hydraattiyksikön haarat voivat muodostua.

Tyypin II glykosidaasi glykopeptidaasi F (PNGaasi F) katkaisee N-sidoksellisissa glykoproteiineissa ensimmäisen glykosidisen sidoksen asparagiinin ja GlcNAc:n vä-" 25 liitä. Se katkaisee runsasmannoosisia rakenteita, joissa W, X ja Y käsittävät yhden tai useampia mannoositähteitä ja V ja Z käsittävät H:n fukoosin puuttuessa ensimmäisestä hiilihydraattitähteestä GlcNAc:sta. Se katkaisee myös hyb-, ridirakenteita, joissa W ja X käsittävät mannoosin, Y ja/- 30 tai Z käsittää NeuNAc-Gal-GlcNAc:n tai samankaltaisen ra kenteen ja V käsittää H:n tai GlcNAc:n, fukoosin tyypillisesti puuttuessa ensimmäisestä hiilihydraattitähteestä. Glykopeptidaasi F katkaisee myös kompleksisia rakenteita. Tällaiset rakenteet käsittävät kuviossa 2 esitetyn ydinra-35 kenteen, jossa Y ja W käsittävät NeuNAc-Gal-GlcNAc:n tai - 98929 22 samankaltaisen rakenteen, X ja Z käsittävät H:n, NeuNAc-Gal-GlcNAc:n tai samankaltaisen rakenteen, V käsittää H:n tai GlcNAc:n ja fukoosi on joskus läsnä ensimmäisessä hii-lihydraattitähteessä GlcNAc:ssa.

5 Endo-h-galaktosidaasin tiedetään katkaisevan glyko- sidisia sidoksia glykoproteiinin tai glykolipidin oligosakkarideissa. Tyypillinen glykoproteiinisubstraatti yhdessä endo-h-galaktosidaasin katkaisukohdan kanssa esitetään kuviossa 2, jossa R2 on proteiini, lipidi tai hiili-10 hydraatti ja R: on sokeritähde tai vety.

Tietenkään keksintö ei rajoitu endoglykosidaasien nykyiseen tunnettuun spesifisyyteen. Viime aikoihin asti kaupallisesti saatavana olleet endoglykosidaasit ovat olleet kalliita, mikä johtuu niiden suhteellisen alhaisista 15 ekspressiotasoista niiden luonnossa esiintyvissä lähteis sä. Niinpä tällaisten entsyymien reaktiivisuutta ei ole tutkittu laajasti. Kuitenkin geeniteknologisten menetelmien myötä suurempia määriä endoglykosidaaseja on tullut tai on tulossa saataviksi. Siinä määrin kuin muita reaktiivi-20 suuksia ja spesifisyyksiä saattaa löytyä näille tai muille endoglykosidaaseille, tällaisen reaktiivisuuden on tarkoitus kuulua keksinnön suoja-alaan.

Niinpä tässä käytettynä "tyypin II endoglykosidaa-sireaktiivinen aine" (johon viitataan myös "tyyppi II-25 reaktiivisena aineena" tai aineena, joka sisältää "tyyppi II-reaktiivisen sidoksen") on mikä tahansa aine, joka reagoi tyypin II endoglykosidaasin kanssa. Tyyppi II-reaktii-visiin aineisiin kuuluvat tietenkin glykosideja sisältävät aineet ja glykoproteiini. Mukaan kuuluvat kuitenkin myös 30 (1) muut, vielä tuntemattomat substraatit, jotka reagoivat tyypin II endoglykosidaasin kanssa muun kuin glykosidisen sidoksen kohdalta, ja (2) usean komponentin aggregaatit, jotka sisältävät komponentteja, joissa on tyyppi II-reak-tiivisia sidoksia.

35 Esimerkiksi mikro-organismeja, kuten bakteereita, - 98929 23 voidaan poistaa pinnoista käsittelemällä endo-H:lla. Tällä hetkellä ei tiedetä, kuinka tähän tulokseen päästään. Bakteerien ei tiedetä sisältävän sidoksia, jotka normaalisti reagoivat endo-H:n kanssa, ja niiden pintoihin, toisiin 5 mikro-organismeihin ja muihin aineisiin kiinnittymisen yksityiskohtia ei ymmärretä hyvin. Kuitenkin bakteerien on havaittu irtoavan endo-H:lla.

Lisäksi muihin tahroihin voi liittyä monimutkaisia aggregaatteja aineista, joista jotkin tai kaikki ovat re-10 aktiivisia tyypin II endoglykosidaasin kanssa. Termi tyyp pi II-reaktiivinen aine kattaa kaikki tällaiset tilanteet. Siten tyypin II endoglykosidaasin käyttöihin kuuluvat (1) tyyppi II-reaktiivisia aineita sisältävien pintojen puhdistaminen, (2) tyyppi II-reaktiivisten aineiden käsittely 15 pinnalle kiinnittymisen estämiseksi ja (3) tyyppi II-reak- tiivisten aineiden, kuten mikro-organismien, käsittely an-timikrobisen vaikutuksen tuottamiseksi.

Keksinnössä käytettäviä tyypin II endoglykosidaa-seja voidaan saada taulukossa II luetelluista eliöistä 20 ammattimiesten tuntemilla tavoilla. Jotkin taulukon II en- doglykosidaaseista, esim. Streptomyces plicatuksen (aluksi luokiteltu Streptomyces griseukseksi) S. plicatuksessa tai S. lividansissa tuotettu endo-H ja Diplococcus pneumoniaen endo-D ovat saatavissa kaupallisesti Boehringer Mannheim 25 Biochemical-yhtiöstä, Indianapolis, Indiana. Kaupallisesti saatavien valmisteiden lisäksi endo-H:ta voidaan saada E. colista, joka on transformoitu plasmidilla, joka koodittaa Streptomyces plicatuksen endo-H:n geeniä ja alkalisen fos-fataasin promoottoria [Oka, T. ym. (1985) Proc. Natl.

·, 30 Äcad. Sei. USA, 82, 7212 - 7216], samankaltaisilla mene telmillä kuin on raportoitu Streptomyces plicatuksen endo-H:n E. colissa kloonauksen ja ekspression suhteen [Robbins ym. (1981) J. Biol. Chem., 256, 10, 640]. Ks. myös Trum-bly, R. J. ym. (1985) J. Biol. Chem., 260, 5683. Endo-H:ta - 98929 24 voidaan myös saada Streptomyces-soluista, jotka on geeniteknisesti muunnettu ekspressoimaan Streptomyces plicatuk-sesta saatua endo-H:ta (EP-julkaisu nro 0 179 449, 30.

huhtikuuta 1986). Vaihtoehtoisesti endo-H:ta voidaan tuot-5 taa missä tahansa sopivassa isäntäsolussa, kuten Bacillus subtiliksessa, käyttäen ammattimiesten hyvin tuntemia menetelmiä. icatuksen (S. griseuksen) endo-H:n aminohappo ja DNA-sekvenssit on julkaistu [Robbins, P. W. ym. (1984) J. Biol. Chem., 259, 7577 - 7583).

10 Tässä esimerkeissä käytetty endo-H hankittiin kau pallisesti tai saatiin E. coli- tai B. subtilis-isännistä, jotka oli transformoitu ekspressoimaan S. plicatuksen endo-H : ta.

Yksi yksikkö endo-H-aktiivisuutta on se määrä ent-15 syymiä, joka tarvitaan vapauttamaan 1 pmol (3H)-dansyyli-

Asn-GlcNAc:a (3H)-dansyyli-Asn-(GlcNAc) „ (Man) 6:sta pH:ssa 5,5 37 °C:ssa yhdessä minuutissa [Tarentino, A. ym. (1978) Methods in Enzymology, 50, 574]. Muiden tyypin II endogly-kosidaasien yksikköaktiivisuudet määritellään samaan ta-20 paan asiaankuuluvan substraatin avulla.

Tietenkin voi olla olemassa muita tyypin II endo-glykosidaaseja, joita ei vielä ole tunnistettu. Tällaiset tyypin II endoglykosidaasit samoin kuin tässä kuvatut, V mukaan luettuina tällaisten endoglykosidaasien alleeliva- 25 riaatiot ja geeniteknologisin menetelmin tehdyt muunnelmat kuuluvat tämän keksinnön suoja-alaan.

Glykosidit ja glykosideja sisältävät aineet sitoutuvat usein suureen joukkoon erilaisia pintoja. Siten esimerkiksi glykoproteiinit, kuten vereen liittyvät (esim.

·. 30 glykosyloitunut hemoglobiini), voivat tahrata vaatteisiin, liinavaatteisiin ja näiden kaltaisiin käytettyjen kankaiden pintoja. Tällaiset tahrat ovat tähän asti olleet erittäin vastustuskykyisiä täydelliselle poistamiselle puhdistusaineilla tai puhdistusaineilla yhdessä eri entsyymien • . 98929 25 kanssa, joihin ei sisälly tässä keksinnössä käytettyjä en-doglykosidaaseja. Vielä eräs glykosideja sisältävä aine, joka tahraa pintoja, kuten kangasta, ja on vaikea poistaa tunnetuilla menetelmillä, on uloste. Tällaiset ulostetah-5 rat sisältävät useita suolistobakteereihin liittyviä gly kosideja ja glykosideja sisältäviä aineita (esim. peptido-glykaaneja), katabolisia eritteitä, mukaanlukien glykopro-teiineja, ja imeytymättömiä ravinteita ja näiden kaltaisia .

10 Muihin pintoihin, joihin glykosidit tai glykosideja sisältävät aineet voivat sitoutua, kuuluvat kovien ja pehmeiden piilolinssien pinnat. Pehmeät piilolinssit ovat tyypillisesti hydrofiilisiä ristisidoksellisia polymeerejä, joilla on hydrogeelirakenne, tai ne on valmistettu 15 silikonipolymeereistä. Ks. esim. US-patentit nro 3 403 393 ja 2 976 576. Toisaalta kovat piilolinssit on tyypillisesti valmistettu metakrylaatti- tai metyylimetakrylaattipo-lymeereistä. Muihin pintoihin kuuluvat luonnossa esiintyvät biofilmit, sydämentahdistimien johdot ja paristot, 20 solujen ja limakalvojen pinnat, hammaskiille, ruuankäsit- telyssä bakteerien ja hiukkasten poistamiseen käytettävät suodattimet; kemikaalit ja niiden kaltaiset; ilmastointilaitteiden suodattimet; erilaisten vesiympäristölle alt-'* tiina olevien rakenneosien, esim. veneiden, laiturien ja 25 niiden kaltaisten, pinnat; muovit ja komposiittimateriaa lit, kuten formica; ja metallit ja lejeeringit, kuten teräs, alumiini jne.

Kuten myöhemmin esitetään yksityiskohtaisesti, tyypin II endoglykosidaasit yksinään tai yhdessä toisen ent-·. 30 syymin, kuten subtilisiinin, kanssa joko puhdistusaineen kanssa tai ilman sitä parantavat tehokkaasti veri- ja ulostetahrojen poistamista kangastilkuista. Ei tiedetä täsmälleen, miten tällaiset tahrat tarttuvat tällaisiin tilkkuihin. Kuitenkin tällaisten aineiden tehostunut pois- 4 . 98929 26 taminen näistä tilkuista tyypin II endoglykosidaaseilla, yksin tai yhdessä muiden aineiden kanssa, viittaa siihen, että ainakin yksi glykosidinen sidos on kankaan ja tahran sen osan välillä, joka irtoaa käsittelemällä tyypin II en-5 doglykosidaasilla. Näihin tuloksiin perustuen seuraavat ovat ehdotettuja mekanismeja glykosideja sisältävien aineiden sitoutumiselle pintaan ja tällaisten aineiden irrottamiselle ja/tai poistamiselle tyypin II endoglykosi-daasilla. Näitä ehdotettuja mekanismeja ei kuitenkaan pidä 10 pitää rajoituksena keksinnön suoja-alalle.

Kuviot

Niinpä kuten kuviossa 5Δ esitetään, glykosidin sisältävä aine voi sitoutua pintaan toisin kuin immunologisella sidoksella. Tässä mielessä "immunologinen sidos" on 15 sellainen, joka on antigeenin ja tälle antigeenille spesi fisen vasta-aineen (polyklonaalisen tai monoklonaalisen) välillä. Kuten kuviosta 5A nähdään, glykosidin sisältävällä aineella on proksimaalinen osa pintaan sitoutuneena ja distaalinen osa, joka ulottuu poispäin proksimaalisesta 20 osasta. Proksimaalista ja distaalista osaa yhdistää glyko sidinen sidos, jonka kanssa tyypin II endoglykosidaasi on reaktiivinen. Kuten vielä kuvasta 5A nähdään, käsiteltäessä tyypin II endoglykosidaasilla glykosidin sisältävän aineen distaalinen osa "vapautuu" glykosidin sisältävän 25 aineen proksimaalisesta osasta. Siinä määrin kuin distaa linen osa ei ole muulla tavalla sitoutunut pintaan, se myös "poistuu" vaivatta pinnalta ja voidaan pestä pois nesteellä.

Kuviossa 5B glykosidin sisältävä aine, tässä ta-30 pauksessa glykoproteiini, joka sisältää hiilihydraattiyk- sikön ja proteiiniyksikön, esitetään pintaan sitoutuneena. Tämä glykosidin sisältävä aine sisältää lisäksi hiilihyd-raattiosan ja aglykoniosan, joita yhdistää glykosidinen sidos, joka on tyypin II endoglykosidaasin kanssa reaktii- - 98929 27 vinen. Tässä erityisessä tapauksessa glykosidin sisältävä aine (glykoproteiini) on sitoutunut pintaan glykosidin sisältävän aineen hiilihydraattiosan välityksellä. Käsiteltäessä tyypin II endoglykosidaasilla aglykoniosa irtoaa 5 glykosidin sisältävän aineen hiilihydraattiosasta. Kuten r kuviossa 5Δ, siinä määrin kuin aglykoniosa ei ole lisäksi muulla tavalla sitoutunut pintaan, aglykoniosa myös poistuu pinnalta.

Kuvio 5C kuvaa tilannetta, jossa glykosidin sisäl-10 tävä aine on sitoutunut pintaan ainakin kahden kiinnitty- mispisteen kautta. Kuten näkyy, pinnan ja glykosidin sisältävän aineen välillä on ensimmäinen, glykosidinen sidos. Lisäksi myös toinen, toisen entsyymin kanssa reaktiivinen sidos esiintyy pinnan ja glykosidin sisältävän ai-15 neen poistettavan osan välillä. Jos käsitellään vain tyy pin II endoglykosidaasilla, glykosidin sisältävän aineen ensimmäisestä, glykosidisesta sidoksesta distaalinen osa vapautuu pinnalta ainakin siinä määrin, kuin se oli ensimmäisen, glykosidisen sidoksen sitoma. Jos se saatetaan 20 kosketukseen toisen entsyymin kanssa, joka on reaktiivinen toisen esitetyn sidoksen kanssa, glykosidin sisältävän aineen se osa, joka on distaalinen ensimmäisestä, glykosidisesta sidoksesta ja toisesta sidoksesta, vapautuu pinnalta. Siinä määrin kuin tämä distaalinen osa ei ole muul-25 la tavalla sitoutunut pintaan, ts. muilla kontaktipisteil lä, jotka voivat olla reaktiivisia toisten entsyymien kanssa tai alttiita puhdistusaineille ja/tai pinta-aktii-visille aineille, tämä distaalinen osa irtoaa täysin pinnasta .

' 30 Kuviossa 5D nähdään mikro-organismi sitoutuneena pintaan ainakin osaksi kyseisen mikro-organismin glykosi-diosan välityksellä. Glykosidiosa sisältää tyypin II endo-glykosidaasin kanssa reaktiivisen glykosidisen sidoksen. Mikro-organismin glykosidisesta sidoksesta distaalinen, - 98929 28 irti katkaistu osa vapautuu pinnalta käsiteltäessä tyypin II endoglykosidaasilla. Siinä määrin kuin tämä irti katkaistu osa ei ole muulla tavalla sitoutunut pintaan, se myös poistuu pinnalta. Kuitenkin pintaan voi olla useampia 5 kosketuspisteitä, jotka voivat vaatia lisäkäsittelyä muil la entsyymeillä ja/tai puhdistusaineella tai pinta-aktii-visella aineella.

Kuviossa 5E nähdään tyypin II endoglykosidaasireak-tiivinen aine sitoutuneena pintaan. Tällä tyyppi II-reak-10 tiivisella aineella on proksimaalinen osa pintaan sitou tuneena ja distaalinen osa, joka ulottuu poispäin proksi-maalisesta osasta. Proksimaalista ja distaalista osaa yhdistää tyyppi II-reaktiivinen sidos, joka viittaa tyypin II endoglykosidaasin kanssa reaktiiviseen sidokseen. Käsi-15 teltäessä tyypin II endoglykosidaasilla tyyppi II-reaktii- visen aineen distaalinen osa "vapautuu" tyyppi II-reaktii-visen aineen proksimaalisesta osasta. On ymmärrettävä, että tyyppi II-reaktiiviset aineet voivat käsittää molekyylejä, mikro-organismeja tai sellaisten eri komponent-20 tien aggregaatteja, jotka voivat kiinnittyä pintaan. Siinä määrin kuin tyyppi II-reaktiivisen aineen distaalinen osa ei ole muulla tavalla sitoutunut pintaan, se myös "poistuu" vaivatta pinnalta ja voidaan pestä pois nesteellä.

Se tyypin II endoglykosidaasin määrä, jota käyte-25 tään tuottamaan kuvioissa yksilöityjen aineiden poistami nen määritellään funktionaalisesti tietyn aineen pinnasta poistamiseen "tehokkaaksi määräksi". Tämä määrä voi vaihdella riippuen käsiteltästä aineesta ja pinnasta. Tyypilliset määrät esitetään tässä yksityiskohtaisemmin esitet-30 tyjen spesifisten sovellutusmuotojen muodossa.

Toiset entsyymit

"Toisiin entsyymeihin" kuuluvat proteaasit, lipaa-sit, glykosidaasit, kuten lysotsyymi, ja näiden yhdistelmät. Eri proteaaseihin, joita voidaan yhdistää tyypin II

- 98929 29 endoglykosidaaseihin, kuuluvat subtilisiini, bromelaiini, papaiini, trypsiini, kymotrypsiini, pankreatiini, lysot-syymi ja näiden yhdistelmät. Tällaisia entsyymejä voidaan saada luonnossa esiintyvistä lähteistä, esim. subtilisii-5 nia Bacillus subtiliksesta, tai geeniteknologisin menetel min käsitellyistä klooneista, esim. subtilisiinia ja mu-tanttisubtilisiineja kuten kuvataan EP-julkaisussa nro 0 130 756. Ks. myös Wells, J. A. ym. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 7911 - 7915; Yang, M. ym. (1984) J. Bacterio-10 logy, 160, 15 - 21; Esteli, D. A. ym. (1985) J. Biol.

Chem,, 260, 6518 - 6521. Monia tällaisia entsyymejä tietysti on saatavana kaupallisista lähteistä.

Lisäksi tyypin II endoglykosidaaseja voidaan yhdistää lipaasien, kuten bakteerien, nisäkkäiden ja sienien 15 lipaasien ja näiden yhdistelmien kanssa.

Glykosidaaseihin, joita voidaan käyttää toisena entsyyminä, kuuluvat eksoglykosidaasit, toinen tyypin II endoglykosidaasi ja tyypin I endoglykosidaasit. Esimerkkejä ovat o- ja β-amylaasi, sellulaasi, pektinaasi, hemisel-20 lulaasi, dekstranaasi, eri glukanaasit ja näiden kaltai set, sekä näiden yhdistelmät.

Lisäksi tyypin II endoglykosidaasi voidaan yhdistää useamman kuin yhden edeltävistä toisen entsyymin luokista kanssa glykosidin sisältävän aineen pinnasta poistamisen 25 helpottamiseksi.

Kun tyypin II endoglykosidaasi yhdistetään yhden tai useamman toisen entsyymin kanssa, tyypin II endoglyko-sidaasin suhde toiseen entsyymiin on edullisesti noin 0,01:100 ja edullisimmin 1:1.

30 Disulfidinkatkaisureagenssit

Tyypin II endoglykosidaaseja voidaan käyttää myös yhdessä puhdistusaineiden kanssa joko yksin tai yhdessä yhden tai useamman toisen entsyymin ja/tai disulfidinkat-kaisureagenssin kanssa puhdistusainekoostumuksen muodos- - 98929 30 tamiseksi. Disulfidisidoksia katkaisemaan pystyviä aineita on erilaisia, mutta yleensä ne kuuluvat johonkin kolmesta luokasta: hapettimet, pelkistimet ja sekalaiset additio-substraatit, kuten ne, joista fumaarihappo ja natriumsul-5 fiitti ovat esimerkkeinä. Sopiviin hapettimiin kuuluvat vetyperoksidi, permuurahaishappo, natriumperboraatti ja hapettavat valkaisuaineet. Tehokkaisiin pelkistimiin kuuluvat ditiotreitoli (DTT), β-merkaptoetanoli (BME), natri-umboorihydridi ja näiden kaltaiset.

10 Vaihtoehtoisiin disulfidinkatkaisureagensseihin, joita ei ole helppo luokitella, kuuluvat elohopea(II)kloridi, nitroprussidi, tributyylifosfiini ja fosfotiolaatti. Erityisen hyödyllinen katkaisureagenssi on natriumsulfiit-ti, joka johtaa disulfidin sulfitolyysiin reaktion: 15 R-S-S-R + SO32 -> R-S-SO32 + 'SR mukaisesti. Tämän reaktion tasapainoa voidaan siirtää poistamalla tiolianioni käyttäen raskasmetalli-ioneja tai hapettimia. Hapetusvoima voidaan tuottaa ilmastamalla tai hapettimella kuten CuS04:lla tai natriumperboraatilla.

20 Edeltävää disulfideja katkaisemaan kykenevien ai neiden listaa ei ole tarkoitettu kattavaksi, ja päinvastoin siitä puuttuu aineita, jotka ovat tehokkaita, mutta eivät välttämättä soveliaita kaupalliseen tuotteeseen. Menestyäkseen kaupallisesti lisätyn aineen täytyy olla 25 suhteellisen halpa, eikä sillä saa olla sen aiottuun käyt töön nähden ei-toivottuja ominaisuuksia. Siten esimerkiksi, vaikka elohopea (II)kloridin käyttö toimisi keksinnön mukaisen menetelmän toteutuksessa, se ei olisi sovelias kaupalliseen käyttöön aiottuihin tavallisiin puhdistus-30 ainetuotteisiin, β-merkaptoetanoli ja DTT ovat kaupalli sesti saatavissa, mutta niissä on lievästi vastenmielinen tuoksu. Siksi erityisen edullisia aineita kaupalliseen formulaatioon ovat natriumsulfiitti (edullisesti yhdessä hapettimen kanssa) tai vetyperoksidi, jotka ovat halpoja - 98929 31 ja suhteellisen turvallisia. Katsauksia materiaaleista, jotka ovat hyödyllisiä disulfidisidosten katkaisuun löytyy esimerkiksi teoksissa Chemical Modification of Proteins, Means, G. E. ym., toim. (1971), Holden-Day, Inc., San 5 Francisco, Kalifornia, luku 8, ja Chemical Reagents for

Protein Modification, Lundbald, R. L. ym., toim. (1984), CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, luku 7.

Tyypillisesti tyypin II endoglykosidaasi yksin tai yhdessä yhden tai useamman toisen entsyymin kanssa muodos-10 taa 0,01 - 3 %, w/w, keksinnön mukaisista puhdistusaine- koostumuksista, jotka voivat sisältää myös disulfidinkat-kaisureagensseja, joiden määrä vaihtelee välillä noin 10 -40 % koostumuksesta, w/w. Mukana olevat määrät riippuvat tietysti endoglykosidaasin (ja toisen entsyymin, jos sitä 15 käytetään) ja disulfidinkatkaisureagenssin luonteesta, puhdistusaineen laimennuksesta pesuliuoksessa ja pesuolo-suhteista. Kuitenkin annetut vaihteluvälit ovat yleensä tyypillisiä.

Eräässä keksinnön sovellutusmuodossa pintoja, joi-20 hin on sitoutunut glykoproteiineja sisältäviä aineita, käsitellään yhdistelmällä (yhtäaikaisella tai peräkkäisellä) disulfidinkatkaisureagenssia, tyypin II endoglykosi-daasia ja toista entsyymiä sopivassa pHtssa ja lämpötilassa sopivan aikaa. Näitä olosuhteita voidaan tietysti vaih-25 della sen mukaan, kuin on tarkoituksenmukaista, ja tyypin II endoglykosidaasin, proteaasin ja disulfidinkatkaisureagenssin valinta riippuu jonkin verran tästä valinnasta. Kuitenkin usein tavattavat soveliaat olosuhteet ovat pH-arvot 5-12. Lämpötilat 20 - 55 °C, erityisesti 40 -30 55 °C vaiheilla, ja ajat 20 minuuttiin asti, yleensä 10 - 15 minuutin vaiheilla, ovat tyypillisiä ja edullisia. Edulliset ajat ja lämpötilat ovat ne, joita yleensä käytetään kotitalouspesukoneissa, talopesuloissa ja ammattipe-suloissa, koska ollakseen kaupallisesti toteutettavissa - 98929 32 menetelmä pitää suorittaa olosuhteissa, jotka ovat käyttäjän normaalisti saatavissa.

Toisessa keksinnön sovellutusmuodossa käytetään kaupallisia puhdistusaineita käyttäviä tavanomaisia pesu-5 menetelmiä, ja tyypin II endoglykosidaasi, toinen entsyymi ja disulfidinkatkaisureagenssi tuodaan käytettäviksi, joko erikseen tai yhdessä, lisäaineena, melko lailla valkaisu-aineen käyttömenetelmien tapaan. Niinpä nämä voidaan lisätä yhdessä puhdistusaineen kanssa pesuohjelman alussa tai 10 jossakin kohdassa keskellä, esimerkiksi noin puolen pesu- ohjelmasta mentyä. Tällä tavalla käsiteltynä, olettaen kiinteän tai nestemäisen puhdistusainekoostumuksen noin 1:500 laimennus (kiinteää ainetta noin 2 mg/ml), mielivaltaisia määriä tyypin II endoglykosidaasia, toista entsyy-15 miä ja disulfidinkatkaisureagenssia voidaan lisätä ilman tämän laimennuksen asettamaa ylärajaa. (Jos tyypin II endoglykosidaasi, toinen entsyymi ja disulfidinkatkaisureagenssi olisi lisätty alunperin puhdistusainekoostumuk-seen, ja jos esimerkiksi disulfidinkatkaisureagenssi muo-20 dostaisi 50 % koostumuksesta, vain 1 mg/ml saataisiin lo pulliseen pesuliuokseen. Kuitenkin, jos nämä materiaalit lisätään erikseen, tehokkaimmat määrät kulloistakin tyypin II endoglykosidaasia, disulfidinkatkaisureagenssia ja toista entsyymiä voidaan lisätä.) 25 Mitä tyypin II endoglykosidaasiin ja toiseen ent syymiin tulee, tarvitaan yleensä vain hyvin pieniä määriä. Tyypillisesti tyypin II endoglykosidaasia ja toista entsyymiä lisätään lopulliseen pitoisuuteen noin 1 - 500 pg/ml pesuliuosta kumpaakin entsyymiä. Disulfidinkatkaisu-30 reagenssin tapauksessa kuitenkin suuremmat määrät kuin puhdistusaineen laimennus sallii voivat olla toivottavia. Esimerkiksi disulfidisidosten katkaisu natriumboorihydri-diä käyttäen voidaan mukavasti suorittaa niinkin korkeilla reagenssin pitoisuuksilla kuin 0,2 M samaa luokkaa olevien - 98929 33 puskurimäärien ollessa läsnä (Lundbald, R. L. ym., Chemical Reagents for Protein Modification, mainittu edellä).

Vaikka tällaiset korkeat määrät ovat tavanomaisia, niitä ei välttämättä vaadita ja alhaisemmat pitoisuudet 5 ovat toimivia. Sulfitolyysi suoritetaan yleensä natrium- sulfiittipitoisuuksissa luokkaa 0,1 M, vaikka niinkin alhaisia pitoisuuksia kuin 0,01 M ja alempia voidaan myös käyttää. DTT on tehokasta käytettynä pitoisuuksissa luokkaa 0,02 - 0,1 M. Lyhyesti sanottuna disulfidinkatkaisu-10 reagenssin pitoisuutta voidaan vaihdella laajalla vaihte luvälillä millä tahansa näistä reagensseista ja teho säilyy. Optimipitoisuus kulloiseenkin sovellukseen riippuu tietenkin tahran laadusta ja reagenssin laadusta samoin kuin pesumenettelyn olosuhteista, mukaan luettuina aika, 15 lämpötila ja pH.

Vaihtoehtoisessa ja tarkoituksenmukaisemmassa lähestymistavassa tyypin II endoglykosidaasi, toinen entsyymi ja disulfidinkatkaisureagenssi lisätään alkuperäiseen puhdistusainekoostumukseen, ja menetelmä toteutetaan ta-20 vallisena pesumenettelynä käyttäen näitä muunnettuja puh distusaineita. Näissä olosuhteissa puhdistusainekoostumus vastaa edellä kuvattua, mutta koostumuksen määrää voidaan myös vaihdella välillä noin 0,5 - 10 mg/ml pesuliuosta tai enemmän riippuen jälleen pesuliuoksen ja -menettelyn 25 olosuhteista ja puhdistusaineen komponenttien liukoisuuk sista. Joka tapauksessa tyypin II endoglykosidaasin, di-sulfidinkatkaisureagenssin ja toisen entsyymin mukaan ottaminen puhdistusaineeseen rajoittaa näiden komponenttien pitoisuuksia puhdistusaineen laimennuksen mukaisesti. Si-30 ten, vaikka käytetään laimennusta 1:100 (10 mg/ml), ja esimerkiksi disulfidinkatkaisureagenssi rajoitetaan 50 %:in puhdistusainekoostumuksesta, maksimikonsentraatio 5 mg/ml disulfidinkatkaisureagenssia saatavassa pesuliuok-sessa on yläraja. Tietenkin disulfidinkatkaisureagenssin - 98929 34 pitoisuus puhdistusaineessa on tyypillisesti alle 50 %, mikä pakottaa disuldinkatkaisureagenssin pitoisuudet vielä alemmiksi.

Keksinnön mukaiset puhdistusainekoostumukset sisäl-5 tävät pääasiassa puhdistusaineaktiivisia aineita, suhtees sa pienempiä määriä disulfidinkatkaisureagenssia, jos sitä käytetään, ja melko pieniä määriä tyypin II endoglykosi-daasia ja toista entsyymiä, jos sitä käytetään, mikä on erityisen toivottavaa entsyymi komponenttien hintaa ajatel-10 Ien. Siten yleensä valmiste sisältää 60 - 90 % puhdistus aineaktiivisia aineita mukaan lukien tavanomaiset kaupalliset puhdistusaineiden lisäaineet, kuten pesuaineiden ra-kenneaineet ja valkaisuaineet, 0,01 - 3 % tyypin II endo-glykosidaasia ja toista entsyymiä sekä noin 10 - 40 % di-15 sulfidinkatkaisureagenssia.

Tietenkin on myös mahdollista lisätä vain yhtä näistä kolmesta lisäaineesta alkuperäiseen puhdistusaineeseen ja toimittaa muut erikseen pesuliuokseen. Erityisesti tyypin II endoglykosidaasi voidaan lisätä esipesuun ja sen 20 jälkeen toisen entsyymin sisältävä puhdistusaine, tai en- doglykosidaasin sisältävän puhdistusaineen lisäystä voi seurata tai edeltää käsittely toisella entsyymillä.

Puhdistuskoostumukset

Endo-D, -F ja -H ovat edullisia tyypin II endogly-25 kosidaaseja käytettäviksi puhdistuskoostumuksissa. Endo-H

on edullisin.

Glykosidia sisältävien aineiden poistamiseksi nämä koostumukset käsittävät edullisesti noin 0,1-1 200 miljoonasosaa, edullisemmin noin 1-1 000 miljoonasosaa, 30 edullisimmin noin 20 - 200 miljooonasosaa tyypin II endo- glykosidaasia, koostumuksen tyypistä riippuen. Puhdistus-koostumukset ovat edullisia. Pyykinpesuainekoostumukset ovat edullisimpia tässä käytettäviksi ja käsittävät edullisesti noin 0,1-1 200 miljoonasosaa tyypin II endogly-35 kosidaasia, edullisesti noin 20 - 200 miljoonasosaa endo- . 98929 35 D:tä, -F:ä tai -H:ta, edullisimmin noin 50 - 125 miljoonasosaa endo-H:ta.

Käytettäessä mikro-organismien torjuntaan tai poistoon koostumukset käsittävät edullisesti noin 0,1-1 200 5 miljoonasosaa, edullisemmin noin 1-1 000 miljoonasosaa, edullisimmin noin 20 - 400 miljooonasosaa tyypin II endo-glykosidaasia, edullisesti endo-H:ta. Puhdistuskoostumuk-set ovat edullisia ja käsittävät edullisesti samat määrät tyypin II endoglykosidaasia, edullisesti endo-H:ta.

10 Seuraavassa kuvataan ehdotuksia koostumustyypeiksi, jotka käsittävät tyypin II endoglykosidaasin, glykosidia sisältävien aineiden ja/tai mikro-organismien poistamiseen. Koostumukset voidaan tehdä ja niitä voidaan käyttää millä tahansa tavalla, joka ei tuhoa entsyymiaktiivisuut-15 ta. Ne voidaan tehdä mistä tahansa ainesosista, jotka ei vät kohtuuttomasti estä entsyymin aktiivisuutta. Koostumukset voivat olla pyykinpesuaineita, astianpesuaineita, kovien pintojen puhdistusaineita, hammaskiilteen puhdistusaineita, neste- ja palasaippuoita, antiperspirantteja, 20 shamppoita, kasvovoiteita, hedelmien ja vihannesten pin- tasäilöntäaineita tai kankaan pehmentäjiä.

Sen lisäksi, että tässä kuvatuilla puhdistuskoostu-muksilla puhdistetaan kankaita pesukoneissa tavallisin pesuohjelmin, niitä voidaan käyttää myös glykosidia sisäl-25 tävien aineiden ja/tai mikro-organismien poistamiseen muilta pinnoilta, kuten metalleilta ja lejeeringeiltä, kuten kirurgisissa instrumenteissa, putkistoissa, metalliastioissa ja näiden kaltaisissa esiintyviltä, muoveilta ja komposiittimateriaaleilta, kuten formicalta, ja venei-30 den, laitureiden ja näiden kaltaisten pinnoilta. Kulloi sestakin sovelluksesta riippuen koostumus voi käsittää tyypin II endoglykosidaasin yksinään tai yhdessä disulfi-dinkatkaisureagenssin, toisen entsyymin ja/tai pinta-ak-tiivisen puhdistusaineen kanssa.

98929 36

Tyypin II endoglykosidaasi voidaan myös formuloida koostumukseen, jolla poistetaan glykosidia sisältäviä aineita ja/tai mikro-organismeja, mukaan luettuina hiiva, sienet, levät ja bakteerit, "biologisilta pinnoilta", ku-5 ten ihon, ihohuokosten, hiusten, karvatuppien ja kudoksen pinnoilta. Niinpä shamppookoostumusten, hoitoainekoostu-musten ja saippuakoostumusten alojen ammattimiehet voivat vaivatta soveltaa edeltävää puhdistusaineformulaatioita koskevaa kuvausta tyypin II endoglykosidaasien käyttämi-10 seksi tällaisissa sovelluksissa. Näin formuloituina täl laiset koostumukset ovat hyödyllisiä sellaisten glykosidia sisältävien aineiden poistamiseksi, jotka voivat tarttua tällaisiin pintoihin.

Tyypin II endoglykosidaasi voidaan myös formuloida 15 koostumukseen, jolla poistetaan glykosidia sisältäviä ai neita ja/tai mikro-organismeja, erityisesti hiivaa ja sientä, kasvien, kuten hedelmien ja vihannesten, pinnoilta. Tällaisiin koostumuksiin sisältyy edullisesti ei-ioni-nen pinta-aktiivinen aine.

20 Lisäksi tyypin II endoglykosidaasi voidaan formu loida deodoranttikoostumuksiin sinänsä tunnetulla tavalla, jotta saataisiin käytettäväksi endoglykosidaasiaktiivi-suutta ei-toivottavista hajuista vastuussa olevien glykosidia sisältävien aineiden ja/tai mikro-organismien pois-25 tamiseksi. Tällaiset deodoranttiformulaatiot, joissa käy tetään tyypin II endoglykosidaasia, voivat olla muunnelmia ammattimiesten tuntemista formulaatioista puikko-, voide-ja aerosolideodorantteja varten.

Käytettäessä piilolinssin käsittelyyn tyypin II en-'· 30 doglykosidaasia lisätään puhdistuskoostumuksiin soveliaas ti pitoisuus noin 0,1 - 20 pg/ml ja toisen entsyymin, kuten proteaasin, pitoisuus on samoissa rajoissa, jos tällaisia toisia entsyymejä käytetään. Käsittelyajat voivat vaihdella noin viidestä minuutista noin 15 tuntiin, mutta - 98929 37 normaali sopiva puhdistusaika on yön yli, niin että käyttäjä voi antaa linssien olla liossa nukkuessaan. Monet eri menettelyohjeet ovat sopivia, mutta erityisen edullista on käyttää yhtä liuosta, joka sisältää tyypin II endoglykosi-5 daasia ja toista entsyymiä (jos käytetään), 10 minuutista kahteen tuntiin tai yli yön huoneenlämpötilassa tai 10 minuutista kahteen tuntiin esiliotus tyypin II endoglyko-sidaasin liuoksen ollessa läsnä ja sen jälkeen samanlainen yli yön käsittely toista entsyymiä sisältävän liuoksen 10 kanssa.

Edullisiin yleiskäyttöisiin toisiin entsyymeihin piilolinssiformulaatiota varten kuuluvat proteaasit, kuten papaiini, pankreatiini ja subtilisiini. Edullinen tyypin II endoglykosidaasientsyymi on Streptomyces plicatuksen 15 endo-H. Yksittäistä proteaasia voidaan käyttää toisena entsyyminä tai koostumus voi sisältää seoksen toisia entsyymejä.

Lisäksi piilolinssikoostumukset voivat sisältää vielä muita komponentteja, jotka auttavat entsymaattista 20 kokonaishajotusta. Erityisen hyödyllisiä näiden joukossa ovat disulfidinkatkaisureagenssit, kuten 2-merkaptoetano-li, kysteiinihydrokloridi, ditiotreitoli, ditioerytritoli, natriumvetysulfaatti, natriummetavetysulfiitti, tiourea ja näiden kaltaiset, yleensä edullisesti pitoisuutena noin 25 0,01 - 5 paino-%, edullisesti 0,05 - 1 paino-%. Lisäksi koostumukseen voidaan sisällyttää detergenttejä auttamaan linssin kostumista entsyymiä sisältävällä liuoksella. Sopivia detergenttejä ovat natriumdodekyylisulfaatti, natri-ummonolauraatti, ionittomat pinta-aktiiviset aineet, kuten " 30 alkoholietoksylaatit (esim. polyetoksietanoli), anioniset pinta-aktiiviset aineet, kuten eetterisulfonaatit, lineaariset alkyylibentseenisulfonaatit, natriumlauryylisulfaatti ja näiden kaltaiset.

98929 38

Piilolinssien puhdistukseen sopivia puskureita ja stabilointiaineita voidaan myös käyttää ja niitä ovat natrium- ja kaliumsitraatti, sitruunahappo, boorihappo, nat-rium-EDTA, erilaiset seosfosfaattipuskurit ja NaHC03.

5 Yleensä puskureita ja stabilointiaineita voidaan käyttää määriä noin 0,001 - 2,5 paino-% ja edullisesti noin 0,1 -1 paino-%. Tulisi ymmärtää, että edeltävä kuvaus eri yhdisteiden määristä, joita tässä keksinnössä voidaan käyttää piilolinssien puhdistukseen, on ilmaistu ainesosien 10 prosenttimäärinä liuoksessa (paino/tilavuus). Formulaatio voi myös olla yhden tai useamman sellaisen tavanomaisen kiinteän annosmuodon muodossa kuten tablettien, jotka sopivat käytettäviksi mitatussa määrässä soveliasta liuotinta, kuten vettä. Kiinteiden annosmuotojen prosenttinen 15 koostumus on sellainen, että liuotettaessa ne tiettyyn vesimäärään liuoksella on selityksessä esitetyissä rajoissa oleva prosenttinen koostumus. Jos kiinteitä annosmuoto-ja käytetään, formulaatioon voi sisältyä tavanomaisia liu-kuaineita, sideaineita ja apuaineita, joihin kuuluvat gly-20 seroli, sorbitoli, boorihappo, propyleeniglykoli, polyety- leeniglykolit, dekstraani, metyyliselluloosa, hydroksi-etyyliselluloosa, karboksimetyyliselluloosan vesiliukoiset suolat tai luonnossa esiintyvät hydrofiiliset aineet, kuten gelatiini, alginaatit, tragantti, pektiini, akaasia ja 25 liukoiset tärkkelykset.

Tyypillisiin piilolinssinpuhdistuksessa hyödyllisiin koostumuksiin ja menettelyohjeisiin kuuluvat seuraa-vat: 1. Koostumus sisältää 1 - 100 pg/ml tyypin II endo- ·. 30 glykosidaasia. Linssit poistetaan ja saatetaan kosketuk seen liuoksen kanssa 12 tunnin ajaksi 22 °C:ssa. Linssit poistetaan puhdistusliuoksesta ja huuhdellaan.

2. Liuos A sisältää 10 pg/ml tyypin II endoglykosi-daasia; liuos B sisältää 5 pg/ml subtilisiinia. Linssejä - 98929 39 liotetaan liuoksessa A 30 minuuttia 25 °C:ssa, otetaan pois ja upotetaan liuokseen B 10 tunniksi 25 °C:ssa.

3. Puhdistusliuos sisältää 10 pg/ml pepsiiniprote-aasia ja 10 pg/ml tyypin II endoglykosidaasia. Linssejä 5 liotetaan tässä liuoksessa 5 tuntia 20 °C:ssa.

4. Puhdistusliuos sisältää 5 pg/ml subtilisiinia, 5 pg/ml tyypin II endoglykosidaasia ja 10 mM 2-merkapto-etanolia. Linssit upotetaan tähän liuokseen 5 tunniksi 30 °C:ssa.

10 5. Puhdistusliuos sisältää 7 pg/ml subtilisiinia, 3 pg/ml tyypin II endoglykosidaasia, 10 mM 2-merkaptoeta-nolia ja 2 % natriumdodekyylisulfaattia (SDS). Linssejä liotetaan tässä liuoksessa 3 tuntia 20 °C:ssa.

6. Puhdistusliuos sisältää 4 pg/ml subtilisiinia, 15 2 pg/ml trypsiiniä, 10 pg/ml tyypin II endoglykosidaasia ja 2 % SDS:ä. Linssejä liotetaan tässä liuoksessa 7 tuntia 20 °C:ssa.

7. Liuos A sisältää 4 pg/ml subtilisiinia ja 2 pg/ml trypsiiniä 2 % SDS:ssä. Liuos B sisältää 10 pg/ml 20 tyypin II endoglykosidaasia ja 10 mM 2-merkaptoetanolia.

Linssit upotetaan liuokseen B 20 minuutiksi 30 °C:ssa ja sitten liuokseen A 6 tunniksi 25 °C:ssa.

Kaikissa edeltävissä esimerkeissä linssit huuhdel-.. laan perusteellisesti suolaliuoksessa ennen kuin ne pan- 25 naan takaisin käyttäjän silmiin.

Tässä olevat koostumukset voidaan formuloida erilaisiin fysikaalisiin muotoihin mukaan luettuina nesteet, geelit, tahtaat ja kiinteät partikkelit, kuten jauheet ja rakeet. Koostumukset voidaan formuloida pyykinpesuaineik-’· 30 si, kuten US-patenteissa 4 507 219, 4 318 818, 4 605 509 ja 4 412 934 esitettyjen mukaisiksi; astianpesuaineiksi, kuten US-patenteissa 4 714 562, 3 630 923, 4 133 779, 4 316 824 ja 4 555 360 esitettyjen mukaisiksi; kovien pintojen puhdistusaineiksi, kuten US-patenteissa 4 414 128, • - 98929 40 3 679 608, 3 985 668 ja 4 005 027 esitettyjen mukaisiksi; kankaiden pehmittimiksi, kuten US-patenteissa 3 944 694, 4 073 996, 4 424 134 ja 4 661 269 esitettyjen mukaisiksi; palasaippuoiksi, kuten US-patenteissa 3 993 722 ja 5 3 070 547 esitettyjen mukaisiksi; shamppoiksi, kuten US-patenteissa 4 345 080, 4 704 272 ja 4 741 855 esitettyjen mukaisiksi; antiperspiranteiksi, kuten US-patentissa 4 725 432 esitettyjen mukaisiksi; ja suuhun käytettäviksi koostumuksiksi, kuten US-patentissa 4 684 518 esitettyjen 10 mukaisiksi. Edellä olevat patentit liitetään viitteinä tähän.

Koostumuksilla on edullisesti pH noin 4 - 10, edullisemmin noin 5-8, entsyymin hyvän suorituskyvyn takia.

Mikro-organismien poistoa koskeva laboratoriotyö on 15 osoittanut, että tehokkaan poistamisen saavuttamiseksi mikro-organismia sisältävän pinnan liottaminen vaatii joissakin tilantessa fysikaalista tai kemiallista toimintaa mikro-organismien poistamiseksi. Testattuja mikro-organismeja olivat: 20 Escherichia coli mukaan luettuina tyyppi 1- ja tyyppi 3 -fimbriallisia

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Serratia marcescens 25 Streptococcus mutans

Streptococcus sanguis Bacillus sp.

Candida sp.

Aspergillus sp.

'· 30 Siinä tapauksessa, että poistetaan bakteereja, ku ten esimerkiksi E. colia, pintaan sitoutuneita mikro-organismeja voidaan käsitellä endo-H:lla ja sitten poistaa kemiallisesti, kuten käsittelemällä antimikrobisella aineella, tai fysikaalisesti, kuten huuhtomalla vedellä tai « 98929 41 pyyhkimällä kädellä. Neste- ja palasaippuoille, hammas-kiilteen puhdistusaineille, antiperspiranteille ja hajuja estäville kankaan pehmittimille on edullista, että koostumus sisältää antimikrobista ainetta, kuten IrgasaninR-5 tuotetta (Ciga-Geigy) tai klooriheksidiiniä, endo-H:n li säksi. Antimikrobista ainetta ei tarvita koostumuksessa (esimerkiksi kovien pintojen puhdistusaineessa), kun fysikaalinen toimita, kuten huuhtelu vedellä tai pyyhkiminen kädellä, tullaan tekemään.

10 Edullisia tässä ovat pesuainepuhdistuskoostumukset, erityisesti rakeiset ja nestemäiset pyykinpesuainekoostu-mukset. Nämä pesuainepuhdistuskoostumukset käsittävät edullisesti 1-90 paino-%, edullisemmin noin 5-50 pai-no-%, pinta-aktiivisia pesuaineita, edullisimmin noin 15 10 - 40 paino-%.

Tässä kuvatuissa pesuainekoostumuksissa käyttökelpoisiin pinta-aktiivisiin aineisiin kuuluvat tunnetut synteettiset anioniset, ionittomat, amfoteeriset ja kahtais-ioniset pinta-aktiiviset aineet. Näistä tyypillisiä ovat 20 alkyylibentseenisulfonaatit, alkyyli- ja alkyylieetteri- sulfaatit, parafiinisulfonaatit, olefiinisulfonaatit, al-koksyloidut (erityisesti etoksyloidut) alkoholit ja alkyy-lifenolit, amiinioksidit, rasvahappojen ja rasvahappoeste-reiden alfasulfonaatit, alkyylibetaiinit ja näiden kaltai-25 set, jotka ovat hyvin tunnettuja pesuainealalla. Yleensä tällaiset puhdistavat pinta-aktiiviset aineet sisältävät C9-Ci8-alkyyliryhmän. Anionisia puhdistavia pinta-aktiivisia aineita voidaan käyttää niiden natrium-, kalium- tai tri etanoliammoniumsuolojen muodossa ja ionittomat pinta-ak-’ 30 tiiviset aineet sisältävät yleensä noin 5-17 etyleeniok- sidiryhmää. Cu-C16-alkyylibentseenisulfonaatit, C12-C18-para-fiinisulfonaatit ja alkyylisulfaatit ovat erityisen edullisia esillä olevan tyyppisissä koostumuksissa.

• 98929 42

Yksityiskohtainen luettelo näihin koostumuksiin soveliaista pinta-aktiivisista aineista voidaan löytää US-patentista 3 936 537, Baskerville, julkaistu 3. helmikuuta 1976, joka liitetään tähän viitteenä. Tällaisten pinta-5 aktiivisten aineiden kaupallisia lähteitä voidaan löytää

McCutcheonin Emulsifiers and Detergents -teoksesta, North American Edition, 1984, McCutcheon Division, MC Publishing Company, joka myös liitetään tähän viitteenä.

Käyttökelpoisia pesuaineen rakenneaineita tässä 10 kuvattuja pesuainekoostumuksia varten ovat mitkä tahansa tavanomaiset epäorgaaniset ja orgaaniset vesiliukoiset rakenneainesuolat sekä myös erilaiset veteen liukenemattomat ja niin sanotut "siemenkiteelliset" ("seeded") raken-neaineet. Käyttövalmiit pyykinpesuainekoostumukset käsit-15 tävät noin 1-75 paino-%, edullisemmin noin 5-40 paino- %, edullisimmin noin 10 - 20 paino-% pesuaineen rakenneaineita. Näillä koostumuksilla on edullisesti pH noin 6 - 10.

Ei-rajoittavia esimerkkejä soveliaista vesiliukoi-20 sista epäorgaanisista emäksisistä pesuaineiden rakenneai- nesuoloista ovat alkalimetallikarbonaatit, -boraatit, -fosfaatit, -polyfosfaatit, -tripolyfosfaatit, -vetykar-bonaatit, -silikaatit ja -sulfaatit. Spesifisiä esimerkkejä tällaisista suoloista ovat natrium- ja kaliumtetrabo-25 raatit, -vetykarbonaatit, -karbonaatit, -tripolyfosfaatit, -pyrofosfaatit ja -heksametafosfaatit.

Esimerkkejä soveliaista orgaanisista aikalisistä pesuaineen rakenneainesuoloista ovat: (1) vesiliukoiset aminopolyasetaatit, esim. natrium- ja kaliumetyleenidi-'· 30 amiinitetra-asetaatit, nitrilotriasetaatit ja N-(2-hydrok- sietyyli)nitrilodiasetaatit; (2) fytiinihapon vesiliukoi set suolat, esim. natrium- ja kaliumfytaatit; (3) vesiliukoiset polyfosfonaatit, mukaan luettuina etaani-l-hyd-roksi-1,1-difosfonihapon natrium-, kalium- ja litiumsuo- « - 98929 43 lat, metyleenidifosfonihapon natrium-, kalium- ja litium-suolat sekä näiden kaltaiset.

Siemenkiteellisiin rakenneaineisiin kuuluvat sellaiset aineet kuin natriumkarbonaatti tai natriumsilikaat-5 ti, kalsiumkarbonaatti ja bariumsulfaatti siemenkiteinä.

Hydratoitu natriumzeoliitti A, jolla on partikkelikoko alle 5 pm, on erityisen toivottava.

Yksityiskohtainen luettelo soveliaista pesuaineen rakenneaineista voidaan löytää US-patentista 3 936 537, 10 joka liitetään tähän viitteenä. Edullisia rakenneaineita ovat rasvahapot, polykarboksylaatit, polyfosfaatit ja näiden seokset.

Valinnaisia pesuainekoostumuksen komponentteja ovat entsyymit (esim. proteaasit ja amylaasit), peroksidival-15 kaisuaineet ja valkaisuaineiden aktivoijat, halogeenival- kaisuaineet (esim. natrium- ja kaliumdikloori-isosyanuraa-tit) , lianirrotusaineet (esim. metyyliselluloosa), likaa suspendoivat aineet (esim. natriumkarboksimetyyliselluloo-sa) , kankaiden kirkasteet, entsyymien stabilointiaineet, 20 väritäplät, vaahdontehostajat tai vaahdonestäjät, kor- roosionestoaineet, väriaineet, täyteaineet, mikrobeja tappavat aineet, pH:n säätöaineet, alkalisuuden lähteet, jotka eivät ole rakenneaineita, ja näiden kaltaiset.

EndoglykosIdaasi antimikrobisten aineiden kanssa 25 Tyypin II endoglykosidaaseista endo-B-N-asetyyli- glukosaminidaasi H, D, F ja/tai PNGaasi F ovat edullisia antimikrobisten koostumusten formuloimiseen ja käyttöön tässä olevissa antimikrobisissa menetelmissä. Endo-H on edullisin.

'· 30 Kun tyypin II endoglykosidaasia käytetään yksin, se formuloidaan niin, että sen pitoisuus tuottaa antimikrobi-sen vaikutuksen. Kun antimikrobinen koostumus käsittää ainakin kaksi eri komponenttia, ts. tyypin II endoglykosi-daasin ja yhden tai useampia antimikrobisia aineita, kuta- - 98929 44 kin komponenttia on mukana pitoisuus, joka riittää tuottamaan antimikrobisen vaikutuksen. Ainakin yhden komponentin määrä kyseisissä koostumuksissa on yleensä vähemmän kuin tältä komponentilta siihen vaadittava määrä, että se tuot-5 taisi saman antimikrobisen vaikutuksen, jos sitä käytet täisiin yksin samankaltaisessa koostumuksessa.

Tässä käytettynä termiin "antimikrobinen vaikutus" kuuluu mikro-organismin poistaminen, tappaminen, kasvun estäminen, muutos yleisessä morfologiassa, protoplastien 10 muodostuminen ja/tai soluseinän hajotus, kun mikro-orga nismi saatetaan kosketukseen tyypin II endoglykosidaasin kanssa yksin tai yhdessä toisen komponentin kanssa, joka käsittää antimikrobisen aineen.

Tässä käytettynä termi "antimikrobinen menetelmä" 15 viittaa menetelmään, joka tuottaa antimikrobisen vaikutuk sen. Keksinnön eräältä puolelta antimikrobinen menetelmä tappaa mikro-organismeja, estää mikro-organismien kasvua ja/tai muuttaa mikro-organismien yleistä morfologiaa. Keksinnön toiselta puolelta antimikrobinen menetelmä irrottaa 20 mikro-organismeja pinnalta. Niissä antimikrobisissa mene telmissä, joissa irrotetaan mikro-organismeja pinnoilta, on edullista, että pintaa käsitellään antimikrobisella aineella ja tyypin II endoglykosidaasilla samanaikaisesti ennemmin kuin käsiteltäisiin lisätyllä antimikrobisella 25 aineella välittömästi tyypin II endoglykosidaasilla käsit telyn jälkeen. Joissakin antimikrobisten menetelmien sovellutuksissa voi aiheutua yhdistetty antimikrobinen vaikutus, esim. tappaminen ja/tai kasvun estyminen voi esiintyä yhdessä mikro-organismin pinnalta irtoamisen kanssa.

*· 30 Tässä käytettynä termi "antimikrobinen koostumus" viittaa koostumukseen, joka sisältää ainakin kaksi eri komponenttia: tyypin II endoglykosidaasin ja toisen, erilaisen komponentin, joka käsittää antimikrobisen aineen. Tällaisilla antimikrobisilla koostumuksilla on vaihtelevia - 98929 45 antimikrobisia vaikutuksia riippuen tyypin II endoglykosi-daasin ja antimikrobisen aineen määrästä ja valinnasta. Havaittuihin antimikrobisiin vaikutuksiin kuuluvat mikro-organismien tappaminen ja/tai mikro-organismien kasvun 5 esto, mikro-organismien poistaminen pinnalta ja mikro-or ganismin pintoihin kiinnittymisen ehkäisy.

Tässä käytettynä termi tyypin II endoglykosidaasin "antimikrobisesti tehokas pitoisuus" viittaa yleensä sellaiseen tyypin II endoglykosidaasin lopulliseen pitoisuu-10 teen, jota käytetään yksinään mikro-organismin kanssa yh teyteen saatettavaksi, jotta tuotettaisiin antimikrobinen vaikutus.

Tässä käytettynä termi "antimikrobinen aine" on antimikrobisen koostumuksen toinen, erilainen komponentti.

15 Tällaiset antimikrobiset aineet ovat yleensä antibiootte ja, ja niihin kuuluu aineita, jotka tappavat mikro-organismeja, ja sellaisia, jotka estävät mikro-organismien kasvua. Esimerkkeihin tällaisista antimikrobisista aineista kuuluvat bakterisidit, fungisidit ja algisidit, jotka 20 vastaavasti pystyvät tappamaan bakteereita, sieniä tai leviä tai estämään niiden kasvua. Bakterisideihin kuuluu sellaisia yhdisteitä kuin klooriheksidiini, 2,4,4'-tri-kloori-2'-hydroksidifenyylieetteri, Triclocarban®, penisilliinit, tetrasykliini ja Bacitracin®. Fungisideihin kuulu-25 vat Nystatin®, Amphotericin B®, Benomyl®, Captan® ja

Dichloran®. Muita esimerkkejä antimikrobisista aineista ovat pinta-aktiivisten aineiden läsnäollessa stabiilit antimikrobiset entsyymit, kuten pinta-aktiivisten aineiden läsnäollessa stabiilit β-l,3-glukanaasit, lysotsyymit, * 30 proteaasit ja kitinaasit sekä puhdistavat pinta-aktiiviset aineet, kuten ammattimiesten tuntemat anioniset, ei-ioni-set, kahtaisioniset, amfolyyttiset ja kationiset pinta-aktiiviset aineet. Viimeksi mainittuja pitäisi käyttää riittävä määrä antimikrobisen vaikutuksen tuottamiseksi.

- 98929 46

Edeltävät geneerisellä nimellä tai tavaramerkillä yksilöidyt antimikrobiset aineet ovat koostumuksia teoksessa Merck Index, 10th Ed. (1983), Merck & Co., Inc., Rahway,

New Jersey, yksilöidyn mukaisesti.

5 Antimikrobisten koostumusten ensimmäisestä kompo nentista eroavia tyypin II endoglykosidaaseja voidaan myös käyttää antimikrobisena aineena. Siten siinä määrin kuin tyypin II endoglykosidaasit ovat itse antimikrobisia aineita (esim. pystyvät tuottamaan antimikrobisen vaikutuk-10 sen, kuten morfologisia muutoksia tai protoplastien muo dostumisen) , niitä voidaan yhdistää toisen tyypin II endo-glykosidaasin kanssa antimikrobisen koostumuksen muodostamiseksi. Siksi antimikrobiset koostumukset voivat käsittää yhden tai useampia erilaisia tyypin II endoglykosidaaseja 15 yhden tai useamman sellaisen antimikrobisen aineen kanssa, jotka eivät käsitä tyypin II endoglykosidaaseja, tai ilman niitä.

Edullisia antimikrobisia aineita tässä käytettäviksi ovat klooriheksidiini, 2,4,4'-trikloori-2'-hydroksidi-20 fenyylieetteri, Triclocarban®, Nystatin®, Amphotericin B® antibiootti, anioniset ja ei-ioniset puhdistavat pinta-aktiiviset aineet. Pinta-aktiivisten aineiden läsnäollessa stabiili antimikrobinen lysotsyymi esitetään US-patentti-numero 5 041 236 otsikoltaan Methods and Compositions Em-25 ploying Certain Lysozymes and Endoglycosidases, joka on

Richard S. Carpenterin ja Ann M. Wolffin nimissä, jätetty samana päivänä tämän hakemuksen kanssa. Muita lysotsyyme-jä, esim. kananmunanvalkuaisen lysotsyymiä, on käytetty tuottamaan antimikrobisia vaikutuksia joskin vähemmässä "· 30 määrin ja vaihtelevin tuloksin.

Keksinnön mukaiset antimikrobiset koostumukset ja menetelmät voivat tuottaa antimikrobisen vaikutuksen laajaa joukkoa mikro-organismeja kohtaan, mukaan luettuina Gram-positiiviset ja -negatiiviset bakteerit, sienet ja 47 - 96929 levät. Tällaisiin bakteerihin kuuluvat Escherichia coli, Streptococcus mutans, Staphylococcus epidermidis ja Staphylococcus aureus. Tällaisiin sieniin kuuluvat hiivat, kuten Candida ja Saccharomyces, ja rihmasienten, kuten 5 Aspergilluksen, Sporobolomyceksen, Basidioboluksen ja En- tomophthoran lajit.

Spesifinen etu tyypin II endoglykosidaasin (esim. endo-H:n, -D:n, -F:n ja/tai PNGaasi F:n) yhdistämisestä antimikrobisen aineen kanssa on se, että antimikrobista 10 ainetta voidaan käyttää vähemmän antimikrobisen vaikutuk sen tuottamiseksi. Joissakin keksinnön puolissa antimikro-binen aine käytettäessä tyypin II endoglykosidaasin kanssa tuottaa antimikrobisen vaikutuksen, joka käsittää pintoihin kiinnittyneiden mikro-organismien poistamisen tai nii-15 den tällaisiin pintoihin kiinnittymisen ehkäisyn. Toisissa puolissa tavataan negatiivinen vaikutus mikro-organismien elinkyvylle tai mikro-organismien morfologialle.

Pintakäsittelyiltä) tyypin II endoglykosidaasilla ja antimikrobisella aineella voidaan suorittaa ajoittain, 20 jotta estettäisiin mikro-organismien uusi kasvu tai kiin nittyminen tai tarttuminen käsittelyn kohteena oleville pinnoille.

Tyypin II endoglykosidaaseista endo-H, -D, -F ja/tai PNGaasi F ovat edullisia. Näistä endo-H on edulli-25 sin. Yleensä tyypin II endoglykosidaasien antimikrobisesti tehokas määrä antimikrobisten aineiden kanssa yhdessä käytettäväksi on noin 1-1 200 miljoonasosaa endo-H:ta, -D:tä, F:ä ja/tai PNGaasi F:ä, edullisesti noin 1-1 200 miljoonasosaa endo-H:ta, edullisemmin noin 20-1 000 mil-’* 30 joonasosaa endo-H:ta, edullisimmin noin 50 - 400 miljoo nasosaa endo-H:ta. Käytettävä määrä riippuu käsittelyn tyypistä ja käsiteltävän pinnan tai mikro-organismin esilläolon määrästä. Yleensä tehokas määrä antimikrobista ainetta, joka riippuu siitä, mitä ainetta käytetään, on noin - 98929 48 0,5-1 200 miljoonasosaa, edullisesti 2-1 200 miljoonasosaa, edullisimmin noin 5 - 350 miljoonasosaa kloori-heksidiiniä tai 2,4,4'-trikloori-2'-hydroksiditenyylieet-teriä tai 0,5 - 100 miljoonasosaa Nystatinia®.

5 Kun tyypin II endoglykosidaasia käytetään yksinään tappamaan ja/tai inhiboimaan mikro-organismeja, yleensä vaaditaan käytettäväksi olennaisesti enemmän tyypin II endoglykosidaasia. Esimerkiksi noin 100 - 1 000 miljoonasosan endo-H:ta on osoitettu vähentävän olennaisesti täl-10 laisille pitoisuuksille altistettujen hiivasolujen elinky- kyisyyttä. Kun hiiva altistetaan alle 100 miljoonasosalle endo-H:ta, ei ole kuitenkaan havaittu merkitsevää elinkyvyn vähentymistä. Vaikka alarajaa, joka tarvitaan vaikuttamaan hiivan elinkyvyn vastaisesti, ei ole vielä määri-15 tetty endo-H:lle, sen antimikrobisesti tehokkaan pitoisuu den alarajan uskotaan olevan 10 ja 100 miljoonasosan välillä. Vastaavien määrien endo-H:ta uskotaan olevan hyödyllisiä tappamaan ja/tai inhiboimaan muita mikro-organismeja, kuten leviä ja sieniä. Endo-H:n ja muiden tyypin II 20 endoglykosidaasien tarkkaa vaikutusta näihin eliöihin ja muihin, esim. bakteereihin, kun niitä käytetään yhdessä antimikrobisten aineiden kanssa, ei ole vielä määritetty. Tyypin II endoglykosidaasin antimikrobisesti tehokkaiden pitoisuuksien alue tällaisia eliöitä vastaan käytettäessä 25 voidaan kuitenkin määrittää rutiininomaisesti.

Keksinnön mukaisia antimikrobisia menetelmiä ja koostumuksia voidaan soveltaa laajasti ja niitä ovat esim. antimikrobiset menetelmät henkilökohtaista hygieniaa sekä koti- ja teollisuussiivousta varten. Niinpä tällaisia me-'· 30 netelmiä ja koostumuksia voidaan käyttää antimikrobisen suuveden, hammas- tai tekohammaspuhdisteen sekä myös antimikrobisten nestemäisten tai kiinteiden käsi- tai varta-losaippuoiden, deodorantin, shamppoon ja kasvovoiteiden sekä haavojen puhdistamista varten olevien koostumusten - 98929 49 formuloimiseksi ja käyttämiseksi. Tyypillisiin kotitalous-sovelluksiin kuuluvat antimikrobiset puhdistustuotteet, kuten nestesaippua, kovien pintojen puhdistusaineet sekä nestemäiset ja rakeiset pyykinpesuaineet. Myös raskaaseen 5 käyttöön tarkoitettuja antimikrobisia puhdistusainekoostu- muksia voidaan formuloida teollisuuskäyttöön.

Klooriheksidiini on tehokas suun antibakteriaalinen aine, ja se on edullinen käytettäväksi hammassovelluksis-sa. 2,4,4'-trikloori-2'-hydroksidifenyylietteri on saata-10 vana nimellä Irgasan® DP 300 Ciba-Ceigyltä, ja se on laaja- kirjoinen antimikrobinen aine, joka on tehokas henkilökohtaisen hygienian sovelluksissa ja pyykinpesusovelluksissa. Triclocarban® Monsantolta on palasaippuoissa hyödyllinen bakteristaatti. Myös perinteisiä antibiootteja voidaan 15 käyttää tässä lisättävänä antimikrobisena aineena. Lopuk si, pinta-aktiivisten aineiden läsnäollessa stabiileja antimikrobisia entsyymejä voidaan käyttää hammassovelluk-sissa sekä shamppoiden ja muiden pinta-aktiivisia aineita sisältävien formulaatioiden säilöntään. Edullinen pinta-20 aktiivisten aineiden läsnäollessa stabiili antimikrobinen entsyymi on edellä yksilöidyssä, samaan aikaan vireillä olevassa, Carpenterin ja Wolffin nimissä olevassa patenttihakemuksessa esitetty lysotsyymi. Antimikrobisten ent-·. syymien stabiilisuutta pinta-aktiivisten aineiden ollessa 25 läsnä voidaan arvioida tässä sen aktiivisuuden perusteel la, joka on jäljellä edustavien määrien esimerkiksi alkyy-lieetterisulfaattia tai lineaarista alkyylibentseenisul-faattia ollessa läsnä.

Antimikrobinen koostumus voidaan formuloida anti-• 30 mikrobiseksi suuvedeksi, hammas- tai tekohammaspuhdisteek- si. Mikro-organismien käsittelylle antimikrobisen vaikutuksen tuottamiseksi (esim. mikro-organismien kiinnittymisen irrottamiseksi tai estämiseksi suuontelon luonnollisilla tai synteettisillä pehmeillä ja/tai kovilla pinnoil- 50 - 95929 la tai mikro-organismien tappamiseksi tai niiden kasvun estämiseksi suuontelossa) on siis olennaisesti tunnusomaista se, että huuhdellaan antimikrobisella suuvedellä, puhdistetaan hampaat antimikrobisella hammasjauheella tai 5 -tahnalla ja/tai puhdistetaan tekohampaat antimikrobisella tekohampaiden puhdisteella. Tässä kuvatut antimikrobinen suuvesi, hammasjauhe- tai tahna ja tekohammaspuhdisteet käsittävät edullisesti endo-H:n sekä klooriheksidiinin ja/tai pinta-aktiivisten aineiden läsnä ollessa stabiilin 10 antimikrobisen entsyymin antimikrobisena aineena. Silloin, kun klooriheksidiiniä käytetään, antimikrobinen suuvesi, hammasjauhe- tai tahna tai tekohammaspuhdiste käsittää edullisesti noin 50-1 200 miljoonasosaa endo-H:ta ja noin 50 - 350 miljoonasosaa klooriheksidiiniä. Silloin, 15 kun pinta-aktiivisten aineiden läsnä ollessa stabiilia an- timikrobista entsyymiä käytetään, antimikrobinen suuvesi, hammasjauhe- tai tahna tai tekohammaspuhdiste käsittää edullisesti noin 50 - 150 miljoonasosaa endo-H:ta ja noin 50-1 000 miljoonasosaa pinta-aktiivisten aineden läsnä-20 ollessa stabiilia antimikrobista entsyymiä.

Antimikrobinen koostumus voidaan myös formuloida antimikrobisiksi henkilökohtaisen hygienian tuotteiksi tai kotitalouden puhdistustuotteiksi. Tällaisissa tuotteissa endo-H:ta käytetään edullisesti pitoisuudessa noin 1 -25 1 200 miljoonasosaa. Näissä tuotteissa käytettävä antimik robinen aine on edullisesti klooriheksidiini, edullisimmin pitoisuudessa noin 150 - 1 200 miljoonasosaa, tai 2,4,4 * — trikloori-2'-hydroksidifenyylietteri, edullisimmin pitoisuudessa noin 2 - 500 miljoonasosaa. Edulliset henkilökoh-’· 30 täisen hygienian tuotteet tai kotitalouden puhdistustuot- teet ovat nestemäisiä käsisaippuoita, kovien pintojen puhdistusaineita, pyykinpesuaineita ja shamppoota (kuvataan edempänä).

9 c ί \ Ο Γ\ oy ly 51

Edullinen antimikrobinen nestemäinen käsisaippua käsittää noin 50 - 400 miljoonasosaa endo-H:ta, noin 5 - 100 miljoonasosaa 2,4,4 '-trikloori-2 ' -hydroksiditenyy-lieetteriä ja edullisesti noin 1-40 paino-% puhdistavaa 5 pinta-aktiivista ainetta. Edullisesti käytetään noin 2-20 paino-%, edullisimmin 3-10 paino-% puhdistavaa pinta-aktiivista ainetta, edullisesti valittuna ryhmästä, jonka muodostavat anioniset, ei-ioniset, kahtaisioniset, amfolyyttiset ja kationiset pinta-aktiiviset aineet. Nes-10 temäinen käsisaippua voi lisäksi sisältää pehmitinainetta (30 paino-%:in asti) ja pieniä määriä hajustetta, väriainetta, liuotinta ja läpinäkymättömäksi tekevää ainetta.

Tässä kuvatut antimikrobiset kovien pintojen puhdistusaineet voivat olla lasin puhdistusaineita, hiovia 15 kovien pintojen puhdistusaineita, hankaavia puhdistusai neita tai WC-altaan puhdistusaineita. Näitten pitäisi olla olennaisesti vailla hypokloriittia tuottavia valkaisuaineita ja muita endoglykosidaasien kanssa yhteensopimattomia ainesosia. Edullinen kovien pintojen puhdistusaine 20 käsittää noin 100 - 1 000 miljoonasosaa endo-H:ta ja anti- mikrobisen aineen sekä noin 0,1 - 20 paino-% puhdistavaa pinta-aktiivista ainetta. Noin 2-10 paino-% puhdistavaa pinta-aktiivista ainetta on edullisinta, valittuna edulli-·. sesti ryhmästä, jonka muodostavat anioniset, ei-ioniset, 25 kahtaisioniset, amfolyyttiset ja kationiset pinta-aktiivi set aineet. Tässä olevat antimikrobiset kovien pintojen puhdistusaineet mahdollisesti käsittävät lisäksi hionta-ainetta, apuainetta, laimennusainetta, liuotinta, suspen-sointiainetta (kuten savea, karboksimetyyliselluloosaa ja * 30 polyakrylaattia), hajustetta ja/tai väriainetta.

Tässä kuvattu antimikrobinen pyykinpesuaine käsittää tyypin II endoglykosidaasin ja antimikrobisen aineen lisäksi edullisesti 1-99 paino-%, edullisemmin 5-60 paino-%, edullisimmin 10 - 40 paino-% puhdistavaa pinta- • 98929 52 aktiivista ainetta, valittuna edullisesti ryhmästä, jonka muodostavat anioniset, ei-ioniset, kahtaisioniset, amfo-lyyttiset ja kationiset pinta-aktiiviset aineet. Edullinen nestemäinen tai rakeinen antimikrobinen pyykinpesuaine 5 käsittää noin 2 - 250 miljoonasosaa endo-H:ta, noin 2,5 - 40 miljoonasosaa 2,4,4'-trikloori-2'-hydroksidi-fenyylietteriä ja noin 1-99 paino-%, edullisesti noin 5-60 paino-% puhdistavaa pinta-aktiivista ainetta. Tässä kuvatut antimikrobiset pyykinpesuaineet sisältävät lisäksi 10 mahdollisesti apuainetta, hajustetta, valkaisuainetta, laimennusainetta, vaahdonestoainetta, väriainetta, kirkastetta, liankantajaa, lian takaisin tarttumisen estäjiä, pehmittimiä ja/tai lianirrotusaineita.

Tässä käytettäväksi tarkoitettu antimikrobinen 15 shamppoo käsittää edullisesti endo-H:n, antimikrobisen aineen ja noin 5-60 paino-% puhdistavaa pinta-aktiivista ainetta, valittuna edullisesti ryhmästä, jonka muodostavat lauryylisulfaatti, isoetionaatti, asyyliamidobetaiini, alkyyliglyseryylieetterisulfonaatti ja alkyylieetterisul-20 fonaatti. Valinnaisia ainesosia ovat vaahdontehostaja, hoitoaine, värjäysaine, väriaine, hajuste ja/tai hilseen-estoaine.

Esillä olevat antimikrobiset koostumukset voivat olla myös kasvipintojen käsittelyyn tarkoitetun säilöntä-25 aineen tai mikro-organismien torjunta-aineen muodossa.

Edullisia ovat säilöntäaine hedelmien tai vihannesten pinnoille tai antimikrobinen tuote, jota käytettäisiin viljelykasveille mikro-organismien torjumiseksi. Viimemainittu on edullisesti sellaisen liuoksen muodossa, jota sumutet-- 30 täisiin viljelykasveille, kuten maissille, sitrushedelmä- '‘ puille, vehnälle, tupakalle, soijapavuille, tomaateille ja mansikoille mikro-organismien kasvun torjumiseksi ja ehkäisemiseksi .

- 98929 53

Seuraava esitetään vain esimerkkinä, eikä sitä pidä tulkita keksinnön suoja-alaa rajoittavaksi.

Esimerkki 1

Veren ja ulosteen poisto kankaasta 5 Erillisiä verellä ja ulosteella tahrattuja (puuvil- lakankaisia) tilkkuja pestiin kaupallisilla pesuaineilla automaattipesukoneessa käyttäen lämmintä (noin 37 °C) pesuohjelmaa. Sitten tilkut huuhdottiin ja ilmakuivattiin. Niitä inkuboitiin eri endoglykosidaasimäärien ja -tyyppien 10 [(0,005 U endo-D:tä (Boehringer Mannheim Biochemical) tai endo-H:ta (Boehringer Mannheim Biochemical, S. griseukses-ta, luettelonumero 752 967) tai 0,25 U N-glykanaasia (PNG-aasi F eli peptidiendoglykosidaasi F) Genzyme, Boston, Massachussetts] kanssa 0,75 ml:ssa 50 mM Tris-HCl-pusku-15 ria, pH 7,0, 37 °C:ssa 30 minuuttia koeputkessa. Kontrol

lissa oli puskuri mutta ei endoglykosidaasia. Inkubaatio-ajan lopuksi kontrolliin ja entsyymiä sisältäviin näytteisiin lisättiin 0,25 ml pesuaineliuosta (1:125 laimennus kaupallisesta pesuaineliuoksesta, joka ei sisältänyt väri-20 aineita, hajusteita, entsyymeitä eikä kirkasteita, 1 M

Tris-HCl-puskurissa, pH 7,5), joka sisälsi subtilisiini BPN':a 80 pg/ml, ja inkuboitiin vielä 20 minuuttia. Tämän käsittelyn lopuksi putket sentrifugoitiin ja supernatant-. tien proteiinipitoisuus määritettiin mittaamalla absor- 25 banssi aallonpituudella 280 nm. Joka käsittelylle valmis tettiin reagenssinollanäyte, joka ei sisältänyt tilkkua määrityksen aikana. Nollanäytteiden arvot vähennettiin käsiteltyjen näytteiden absorbanssista aallonpituudella, jotta määritettäisiin, kuinka paljon 280 nm absorboivaa 30 materiaalia irtosi inkubaation aikana. Korkeampi absor- banssi edustaa lisääntynyttä proteiinin irtoamista kuiduista. Tulokset esitetään taulukossa III.

« - 96929 54

Taulukko III

Käsittely Absorbanssi aallonpituudella 280 nm

Veritahra Ulostetahra 5 Kontrolli 0,79 2,07

Endo-D 0,84 2,14

Endo-H 0,83 2,12 N-glykanaasi 0,78 2,10 10 Nämä tulokset viittaavat siihen, että endoglykosi- daasit endo-D ja endo-H yhdessä toisen entsyymin subtili-siinin kanssa lisäsivät aallonpituudella 280 nm absorboivan materiaalin irtoamista verellä tahratuista tilkuista verrattuna kontrolliin. Lisäksi endo-D, endo-H ja N-gly-15 kanaasi kaikki osoittivat lisäystä aallonpituudella 280 nm absorboivan materiaalin irtoamisessa ulosteella tahratuista tilkuista.

Esimerkki 2

Endo-H:n vaikutus ulostetahran poistoon 20 Tämä esimerkki on samankaltainen kuin esimerkki 1, mutta se suoritettiin käyttäen nailonkankaasta tehtyjä ulostetahrattuja tilkkuja. Tilkut pestiin pesuaineliuok-sessa, huuhdottiin ja kuivattiin. Pesuaine koostui kaupal-; lisesta nestemäisestä pesuaineesta, joka ei sisältänyt 25 entsyymeitä, kirkasteita, väriaineita eikä hajusteita.

Yksi erä tilkkuja pidettiin syrjässä, ja siihen viitataan "käsittelemättömänä kontrollina". Nämä tilkut käsiteltiin samoin kuin näytetilkut, paitsi että niitä ei käsitelty endo-H:lla. Näytetilkut inkuboitiin 0,01 U:n endo-H:ta : 30 kanssa (Boehringer Mannheim Biochemical, luettelonumero 752 967) puskurissa (10 mM Na-asetaatti, pH 6,0) 37 °C:ssa 15 minuuttia. Sitten lisättiin 0,25 ml pesuaineliuosta (1:125 laimennus 1,0 M Tris-HCl-puskurissa, pH 7,5), ja inkuboitiin vielä 15 minuuttia. Lopuksi putket sentrifu- 98929 55 goitiin ja supernatantit poistettiin imulla. Tilkut ilma-kuivattiin. Tilkuista otettuja kuituja tarkasteltiin pyyhkäisyelektronimikroskopialla kriittisen pisteen kuivauksen jälkeen. Elektronimikroskooppikuva pesuaineella pestystä 5 ulosteella tahratusta tilkusta esitetään kuviossa 6A. Ku ten voidaan nähdä, sauvamaisia bakteereita ja pieniä hiukkasia esiintyy kankaan pinnalla. Kuvio 6B esittää endo-H:lla ja pesuaineella käsiteltyä tilkkua. Tässä kuviossa nähdään sileä, puhdas kangas, mikä osoittaa, että endo-H 10 ja pesuaineet helpottavat pienten hiukkasten ja bakteeri- jätteiden irrottamista.

Esimerkki 3

Endo-F:n vaikutus ulostetahraan

Ulosteella tahrattuja tilkkuja (2,5 cm halkaisijal-15 taan) pestiin pesuaineliuoksella, huuhdottiin ja kuivat tiin. Tilkut leikattiin neljänneksiksi ja käytettiin seu-raavissa kokeissa.

A. Tilkkuja inkuboitiin 1 mlrssa 10 mM natriumase-taattipuskuria, pH 5,5, endo-F:n (Boehringer Mannheim Bio- 20 Chemical) kanssa (0,15 yksikköä) tai ilman sitä 30 minuut tia 37 °C:ssa. Sitten putkia sentrifugoitiin kahdeksan minuuttia. Supernatantit poistettiin ja jokaisen absor-banssi mitattiin aaltopituudella 280 nm. A280:n muutos • määritettiin vähentämällä asianmukaiset nollanäytteet (ks.

25 esimerkki 1). Korkeampaan absorbanssiin liittyy tilkuista vapautuneen proteiiniaineksen tai aaltopituudella 280 nm absorboivan aineksen määrän lisääntyminen. Kontrolleilla keskimääräinen A280:n muutos oli 0,93. Endo-F:llä käsiteltyjen tilkkujen keskimääräinen muutos oli 1,05. Tämä : 30 osoitti endo-F:n lisäävän ulostetahrojen poistotehoa.

B. Tilkkuja inkuboitiin 0,75 mlrssa 10 mM natri-umasetaattipuskuria, pH 5,5, endo-F:n kanssa (0,15 yksikköä) tai ilman sitä 15 minuuttia 37 °C:ssa. Tämän käsittelyn lopussa lisättiin 0,25 ml pesuaineliuosta (0,1 M Tri s- 56 . 98929 HCl-puskurissa, pH 7,5), joka sisälsi 10 pg proteaasia subtilisiini BPN', ja putkia inkuboitiin 37 °C:ssa toiset 15 minuuttia. Lopuksi putket sentrifugoitiin, supernatan-tit poistettiin, ja absorbanssi aallonpituudella 280 nm 5 mitattiin. Kontrollin kohdalla (ei endo-F:ä) A280:n keski määräinen muutos oli 1,08, kun taas endo-F:llä käsitellyllä näytteellä nähtiin A280:n muutos 1,36. Tämä ilmaisi, että endo-F:n vaikutus tehostui pesuaineen läsnäolosta.

C. Samankaltainen koe kuin B suoritettiin, paitsi 10 että pesuaineliuos sisälsi 10 mM 2-merkaptoetanolia subti- lisiinin sijasta. Kontrollille keskimääräinen A280:n muutos oli 1,05, kun taas endo-F:llä käsitelty näyte tuotti A280:n muutoksen 1,24. Nämä tulokset osoittavat endo-F:n kyvyn poistaa ulostetahroja disulfidinkatkaisureagenssien 15 ollessa läsnä.

D. Samankaltainen koe kuin B suoritettiin, paitsi että pesuaineliuos sisälsi 10 mM 2-merkaptoetanolia ja 10 pg subtilisiini BPN':a. Kontrollille keskimääräinen A280:n muutos oli 1,14, kun taas endo-F:llä käsitellyllä näyttel- 20 lä A280:n muutos oli 1,29. Nämä tulokset osoittavat, että endo-F kykenee poistamaan ulostetta pesuaineen, proteaasin ja disulfidinkatkaisureagenssin (2-merkaptoetanolin) ollessa läsnä.

Esimerkki 4 25 Endo-H:n vertailu muiden entsyymien kanssa

Esimerkin 3 osassa B kuvattujen kanssa samankaltaisia kokeita toistettiin endo-H:lla (Boehringer Mannheim Biochemical luettelonumero 100 119) ja muilla karbohydraa-sientsyymeillä, paitsi ettei mitään proteaasia, kuten sub-: 30 tilisiinia, käytetty. Muutoksia A280:ssä seurattiin ja kuituja tarkasteltiin pyyhkäisyelektronimikroskopialla. Hiukkas- ja bakteerijätteiden irtoaminen kankaasta nähtiin endo-H:lla ja "Lysing Enzymes" -seoksella (Sigma Chemical Companyltä saatu proteaasi- ja glykanaasiseos). Kuitenkin . 96929 57 entsyymeillä lysotsyymi, α-glukosidaasi, β-glukosidaasi ja β-glukuronidaasi nähtiin vähän tai ei lainkaan hyötyä. (Tuloksia ei esitetä.) Tämän kokeen elektronimikroskopian tulokset käsittelyistä edellä mainituilla entsyymeillä tai 5 ilman niitä esitetään kuvioissa 7A - 7H. Kuvio 7A on kont rolli, jota ei käsitelty endoglykosidaasilla. Kuvio 7B on elektronimikroskooppikuva lysotsyymilla käsitellystä tilkusta; kuvio 7C on endo-H:lla käsitelty tilkku; kuvio 7D on α-glukosidaasilla käsitelty tilkku; kuvio 7E on β-glu-10 kosidaasilla käsitelty tilkku; kuvio 7F on elektronimikro skooppikuva "Lysing Enzymes" -seoksella käsitellystä kuidusta; kuvio 7G on elektronimikroskooppikuva β-glukuroni-daasilla käsitellystä tilkusta; ja kuvio 7H on elektronimikroskooppikuva kitinaasilla käsitellystä tilkusta. Kuten 15 voidaan nähdä, endo-H:lla käsitelty tilkku (kuvio 7C) on perusteellisesti puhdistunut ulostetahrasta. Samankaltaisia tuloksia saatiin "Lysing Enzymes" -seoksella käsitellyillä tilkuilla, kuten kuviossa 7F näkyy.

Esimerkki 5 20 Bakteerien poistaminen kiinteältä pinnalta

Endo-H:n vaikutuksen testaamiseksi bakteerien poistamisessa kiinteiltä pinnoilta (lasilta), seuraavaa menettelyohjetta käytettiin. Trypticase-soijaliemeen (TSB) ; (10 ml) siirrostettiin mikrobilajeja (Staphylococcus au- 25 reus ATCC-viljelmä nro 6 538 tai Escherichia coli ATCC- viljelmä nro 10 536) varastovinopintaviljelmästä ja inku-boitiin yli yön 37 °C:ssa. Valmistettiin suspensio, jossa oli noin 108 solua/ml TSB:tä, ja 100 μΐ tätä suspensiota pantiin aluslasille uurretun ympyrän sisäpuolelle. Kutakin : 30 lasia inkuboitiin 5 minuuttia 37 °C:ssa kuivassa inkubaat- toriuunissa, minkä jälkeen ylimääräinen mikrobiliuos kopautettiin pois. Sitten lasit huuhdottiin 100 pl:lla steriiliä tislattua vettä. Ylimääräinen liuos ja irtonaiset eliöt kopautettiin sitten pois.

- 98929 58

Sen jälkeen, kun bakteerien oli annettu tarttua aluslaseihin (ainakin 2 tuntia 37 °C:ssa), 100 μΐ seuraa-via liuoksia pantiin erillisille laseille: (a) 10 mM ase-taattipuskuri, pH 5,5, (b) 10 mM asetaattipuskuri, pH 5,5 5 +1 miljoonasosa endo-H:ta (Boehringer Mannheim Biochemi cal luettelonumero 100 119), (c) pesuaineliuos, (d) pesu-aineliuos + 1 miljoonasosa endo-H:ta. Erä laseja pidettiin syrjässä käsittelemättöminä kontrolleina eikä niitä käsitelty millään liuoksilla. Sitten muita kuin kontrollilase-10 ja inkuboitiin 15 minuuttia 37 °C:ssa. Inkubaation lopussa liuokset kopautettiin pois. Sitten lasit huuhdottiin 100 pl:lla steriiliä tislattua vettä ja ilmakuivattiin huoneenlämpötilassa. Bakteerit, jotka jäivät jäljelle tämän käsittelyn jälkeen lämpökiinnitettiin ja värjättiin nor-15 maalilla Gram-värjäysmenetelmällä. Sitten laseja tarkas teltiin valomikroskoopilla (kirkaskenttävalaistus, 125X suurennos), ja eliöiden määrä/näkökenttä määritettiin. 20 näkökenttää laskettiin joka lasilta, joista laskettiin keskiarvo eliötä/näkökenttä.

20 Saatiin seuraavat tulokset: A. Staphylococcus aureukselle: i) Ei käsittelyä >100 eliötä/näkökenttä ii) Puskuri >100 eliötä/näkökenttä • iii) Puskuri + endo-H < 10 eliötä/näkökenttä 25 iv) Pesuaineliuos >100 eliötä/näkökenttä v) Pesuaineliuos + endo-H < 10 eliötä/näkökenttä Nämä tulokset osoittavat, että endo-H yksin puskurissa tai yhdessä pesuaineen kanssa vähensi aluslaseille tarttuneiden S. aureus -bakteereiden määrää kymmenkertai-: 30 sesti verrattuna käsittelyyn pelkällä pesuaineella.

. 96929 59 B. Escherichia colille i) Ei käsittelyä >100 eliötä/näkökenttä ii) Puskuri >100 eliötä/näkökenttä iii) Puskuri + endo-H >100 eliötä/näkökenttä 5 iv) Pesuaineliuos >100 eliötä/näkökenttä v) Pesuaineliuos + endo-H < 10 eliötä/näkökenttä Nämä tulokset osoittavat, että endo-H yhdessä pesuaineen kanssa vähensi aluslaseille tarttuneiden E. colien määrää kymmenkertaisesti verrattuna käsittelyyn pelkällä 10 pesuaineella.

Esimerkki 6

Bakteerien poistaminen kiinteältä pinnalta

Samankaltainen koe kuin esimerkki 5 suoritettiin kahdella limaa tuottavalla Staphylococcus aureus -viljel-15 mällä (määritettynä niiden polystyreeniputkiinsitoutumis- kyvyn perusteella). Mikroskooppialuslaseja muunnettiin tekemällä kaksi ympyrää (halkaisijaltaan n. 1,7 cm) kynsi-lakalla. Eliöiden yli yön kasvatettuja viljelmiä laimennettiin 1:10 1 % peptoniliuoksella. Laimennettua viljelmää 20 (100 μΐ) pantiin ympyröihin. Lasit pantiin 150 mm petri- maljoille ja inkuboitiin 37 °C:ssa. Kahden tunnin inkubaa-tion jälkeen lasit huuhdottiin tislatulla vedellä ja käsiteltiin kolmissa eri olosuhteissa (A. Na-asetaattipuskuri, ; B. pesuaine ja C. pesuaine ja 1 pg endo-H:ta/ml) kuten 25 esimerkissä 5. Endo-H saatiin E. colista, joka oli trans formoitu tuottamaan S. plicatuksen endo-H:ta. 15 minuutin kuluttua inkubaatiolasit huuhdottiin tislatulla vedellä ja Gram-värjättiin. Bakteerien lukumäärä laskettiin mikroskoopissa 100X näkökenttää kohti 20 kentästä. Tulokset il-*: 30 maistaan solujen keskimääräisenä lukumääränä näkökenttää kohti.

Olosuhteet Viljelmä I Viljelmä II

A. Kontrolli 23 202 B. Pesuaine 9 58 35 C. Pesuaine + endo-H 2 33 96929 60

Esimerkki 7

Bakteerien poisto kangaspinnalta

Endo-H:n vaikutuksen testaamiseksi bakteerien poistamiseen kangaspinnalta käytettiin seuraavaa menettelyoh-5 jetta. Staphylococcus aureusta (ATCC 6 538) ja Staphylo coccus epidermidistä (ATCC 155) viljeltiin erikseen 5 mlrssa Lurian lientä ja annettiin kasvaa 37 °C:ssa 12 tuntia. Sitten viljelmät lisättiin 30 ml:an 0,2 M Na-sitraat-tipuskuria, pH 5,5, tiheyteen noin 103 solua/ml, kahteen 10 ravistelijan 100 ml:n pulloon. Myös kaksitoista kangas- tilkkua (1,3 x 1,3 cm puuvillatilkkuja) lisättiin pulloihin siirrostamisen jälkeen. Kahden tunnin 37 °C:ssa varovaisessa pyörittelyssä (150 rpm) inkubaation jälkeen tilkut siirrettiin steriileihin putkiin ja pestiin kolmesti 15 200 mM Na-sitraattipuskurilla, pH 5,5, joka oli edeltä steriloitu 0,22 pm suodatuksella. Kuusi tilkkua pantiin sitten ravistelijan pulloon, jossa oli 0,5 mg/ml endo-H:ta 30 ml:ssa sitraattipuskuria, ja kuusi tilkkua lisättiin kontrollina ravistelijan pulloon, jossa oli vain sitraat-20 tipuskuria. Endo-H saatiin S. plicatuksen endo-H:ta tuot tavasta E. colista. 1,5 tunnin 37 °C:ssa, varovaisessa pyörityksessä (100 rpm) inkubaation jälkeen tilkut siirrettiin steriileihin putkiin ja pestiin kuten edellä on kuvattu. Sitten tilkut maljattiin varovasti trypticase-25 soija-agarmaljoille ja niiden päälle pantiin riittävästi nestemäistä trypticase-soija-agaria tilkkujen peittämiseksi. Maljojen kuivuttua niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 18 tuntia, ja Staphylococcus aureus - ja Staphylococcus epider-midis -pesäkkeet kankaan pinnalla laskettiin preparointi-: 30 mikroskooppia käyttäen.

Saatiin seuraavat tulokset: - 98929 61 A. Staphylococcus aureukselle

Kontrolli 103 ± 24 pesäkettä tilkkua kohti

Endo-H 53 ± 18 pesäkettä tilkkua kohti 49 %:n bakteeripesäkkeiden väheneminen endo-H-kä-5 sittelyllä.

B. Staphylococcus epidermidikselle

Kontrolli 57 ± 11 pesäkettä tilkkua kohti

Endo-H 16 ± 10 pesäkettä tilkkua kohti 72 %:n bakteeripesäkkeiden väheneminen endo-H-kä-10 sittelyllä.

Nämä tulokset osoittavat, että endo-H-käsittely vähentää merkitsevästi kangaspintaan tarttuneiden bakteerien lukumäärää.

Esimerkki 8 15 Endo-H:n sitoutuminen bakteereihin

Seuraava koe suoritettiin sen määrittämiseksi, onko tyypin II endoglykosidaasi endo-H vuorovaikutuksessa bakteerien Staphylococcus aureus ja Streptococcus mutans jonkin pintakomponentin kanssa. Tällainen vuorovaikutus ha-20 valttiin. Vaikka sitä ei tässä karakterisoida täydellises ti, tätä vuorovaikutusta ei aikaisemmin tunnettu, ja se voi muodostaa perustan edellä kuvatulle endo-H:n kyvylle poistaa tällaisia bakteereita pinnalta.

• Transformoidusta E. colista saatu endo-H, joka oli 25 puhdistettu muuntamalla menetelmiä, jotka ovat kuvanneet

Trumbly, R. J. ym. (1985) , J. Biol. Chem., 260, 5683 - 5690, leimattiin biotiinilla sen menetelmän mukaisesti, jonka ovat kuvanneet Updyke, T. V. ja Nicolson, G. L.

(1986), Methods in Enzymology, 121, 717 - 725. Tällaisen ·: 30 leimauksen jälkeen endo-H säilytti suurimman osan reaktii visuudestaan ovalbumiini-glykoproteiinia kohtaan.

Lurian liemessä yli yön kasvatetut viljelmät Staphylococcus aureusta (ATCC 6 538) ja Difcon aivo-sydän -infuusiomediumissa kasvatettua Streptococcus mutansia - 98929 62 (ATCC 27 607) sentrifugoitiin ja pestiin kolmesti 200 mM Na-sitraattipuskurilla, pH 5,5, ja suspensoitiin samaan puskuriin pitoisuuteen noin 109 solua/ml. 0,5 ml:n näytteet pantiin kolmeen 1,5 ml:n Eppendorf-putkeen, ja niitä inku-5 boitiin eri olosuhteissa eri aikoja.

0,2 M Inkubaa-

Biotiny- Na-sit- tioaika loitu raatti (minuut-

Putki Soluja 2 % BSA endo-H pH 5,5 tia) 10 1 0,5 ml 5 μΐ - 0,5 ml 30 2 0,5 ml - 5 μΐ 0,5 ml 2 3 0,5 ml - 5 μΐ 0,5 ml 30 15 Inkubaatio tehtiin huoneenlämmössä hidasta heilut tajaa käyttäen joko 2 tai 30 minuuttia. BSA:ta (naudan seerumin albumiinia) laimennettuna Tris-puskuroituun suolaliuokseen käytettiin kontrolliliuoksena mahdollisen epäspesifisen proteiinien soluihin sitoutumisen estämiseksi.

20 Inkubaation jälkeen putket sentrifugoitiin, ja supernatan- tit heitettiin pois. Solut pestiin kahdesti 2 % BSA-liuok-sella lisäämällä 1,0 ml BSA:ta soluihin, vortex-sekoitta-malla hyvin, sentrifugoimalla ja heittämällä pois superna-tantti. Pestyihin soluihin käytettiin 0,5 ml streptavidii-25 ni-HRP:tä (streptavidiinileimattu piparjuuren peroksidaa- si, Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) ja inkuboi-tiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Putket sentrifugoitiin taas ja pestiin kuten edellä on kuvattu. Bakteeri-soluihin sitoutuva endo-H määritettiin havaitsemalla HRP-• 30 steptavidiini, joka sitoutuu hyvin tiukasti soluihin si toutuneeseen biotinyloituun endo-H:hon. HRP havaittiin lisäämällä 0,5 ml HRP-substraattia 0PD:tä (o-fenyleenidi-amiinia), joka oli laimennettu vetyperoksidia sisältävään sitraatti-fosfaatti -puskuriliuokseen. Kromogeenin muodos- 96929 63 tuminen lopetettiin 2 M H2S04:lla minuutti OPD:n lisäyksen jälkeen. Solut sentrifugoitiin ja supernatantti mitattiin aallonpituudella 490 nm.

Saatiin seuraavat tulokset: 5 Staphylococcus aureukselle

Absorbanssi 490 nm Kontrolli 0,13

Endo-H, 2 minuuttia 1,89

Endo-H, 30 minuuttia 1,90 10 Streptococcus mutansille

Absorbanssi 490 nm Kontrolli 0,18

Endo-H, 2 minuuttia 3,76

Endo-H, 30 minuuttia 3,80 15 Nämä tulokset viittaavat siihen, että endo-H sitou tuu bakteereihin Staphylococcus aureus ja Streptococcus mutans. Tulokset osoittavat, että suurin osa sitoutuvasta endo-H:sta sitoutuu ensimmäisen kahden minuutin tai vähemmän aikana sen jälkeen, kun se on saatettu yhteyteen solu-20 jen kanssa. Streptococcus mutansilla saatu korkeampi ab sorbanssi saattaa viitata korkeampaan endo-H:n sitoutumis-tasoon.

Esimerkki 9 ; Tämän keksinnön mukainen raskaaseen käyttöön tar- 25 koitettu nestemäinen pyykinpesuainekoostumus on seuraavan lainen :

Aktiivinen

Komponentti paino-%

Lineaarinen C13-alkyylibentseenisulfonihappo 8,00 . 30 C14_15-alkyylipolyetoksylaatti (2,25)-sulfonihappo 12,00 1,2-propaanidioli 3,50

Natriumdietyleenitriamiinipenta-asetaatti 0,30

Monoetanoliamiini 2,00

Ci2-i3-alkoholipolyetoksylaatti (6,5)* 5,00 35 Etanoli 8,50 64 - 9 6 y 2 9

Kaliumhydroksidi 1,80

Natriumhydroksidi 3,85

Ci2-i4-rasvahappo 10,00

Sitruunahappo 4,00 5 Kalsiumformiaatti 0,12

Natriumformiaatti 0,86 C12-alkyylitrimetyyliammoniumkloridi 0,50

Tetraetyleenipenta-amiinietoksylaatti (15-18) 2,00

Vesi 35,12 10 Väriaine 0,08

Hajuste 0,25

Proteaasi** 0,125

Endoglykosidaasi H 2000 mil- j oonasosaa 15 Huomautuksia: (*) Alkoholi ja monoetoksyloitu alkoholi poistettu.

(**) mg aktiivista entsyymiä/g (kantaseoksesta 34 mg aktiivista entsyymiä/g)

Edellä luetellut ainesosat lisätään yhdellä sekoit-20 timella varustettuun sekoitustankkiin siinä järjestyksessä kuin ne esiintyvät. Ennen kuin proteaasientsyymi, väriaine ja hajuste lisätään, seoksen pH säädetään niin, että 10-painoprosenttisella vesiliuoksella 20 °C:ssa on pH noin ; 8,5.

25 Tällä koostumuksella saadaan hiilihydraattia sisäl tävät tahrat puhdistumaan paremmin, jopa verrattuna prote-aasia ja/tai amylaasia sisältäviin pesuaineisiin.

Esimerkki 10 Tämän keksinnön mukainen raskaaseen käyttöön tar-i 30 koitettu nestemäinen pyykinpesuainekoostumus on seuraavan lainen: 96929 65

Aktiivinen

Komponentti paino-%

Lineaarinen C13-alkyylibentseenisulfonihappo 8,00

Ci4_i5-alkyylipolyetoksylaatti (2,25) -sulfonihappo 12,00 5 1,2-propaanidioli 3,50

Natriumdietyleenitriamiinipenta-asetaatti 0,30

Monoetanoliamiini 2,00 C12-i3-alkoholipolyetoksylaatti (6,5)* 5,00

Etanoli 8,50 10 Kaliumhydroksidi 1,80

Natriumhydroksidi 3,85

Ci2-i4-rasvahappo 10,00

Sitruunahappo 4,00

Kalsiumformiaatti 0,12 15 Natriumformiaatti 0,86 C12-alkyylitrimetyyliammoniumkloridi 0,50

Tetraetyleenipenta-amiinietoksylaatti (15-18) 2,00

Vesi 37,12 Väriaine 0,08 20 Hajuste 0,25

Proteaasi** 0,125

Endoglykosidaasi H 125 miljoonasosaa (*) Alkoholi ja monoetoksyloitu alkoholi poistettu.

(**) mg aktiivista entsyymiä/g (kantaseoksesta 34 mg ak-25 tiivistä entsyymiä/g)

Edellä luetellut ainesosat lisätään yhdellä sekoit-timella varustettuun sekoitustankkiin siinä järjestyksessä kuin ne esiintyvät. Ennen kuin proteaasientsyymi, väriaine ja hajuste lisätään, seoksen pH säädetään niin, että 10-·> 30 painoprosenttisella vesiliuoksella 20 °C:ssa on pH noin 8,5.

Tällä koostumuksella saadaan hiilihydraattia sisältävät tahrat puhdistumaan paremmin, erityisesti ulostetah-rat.

- 98929 66

Muita tämän keksinnön mukaisia koostumuksia saadaan, kun endo-H-taso lasketaan arvoon 0,40 mg/ml, vesi lasketaan 35,72:en, ja lisätään 1 % Irgasania (Ciba-Geigyn antibakteriaalinen aine).

5 Esimerkki 11 Tämän keksinnön mukainen nestesaippuakoostumus on seuraavanlainen:

Aktiivinen

Komponentti paino-% 10 Ammoniumlauryylisulfaatti 6,0

Natriumlauryylisarkosinaatti 5,7

Kokamidopropyylibetaiini 6,3

Kookospähkinän rasvahappo 1,0

Kvaternaarinen amiini 0,3 15 Etyleenidiamiinitetraetikkahappo 0,2

Ammoniumsulfaatti 0,4

Hajuste 0,25

Kathon 5 miljoo nasosaa 20 Vesi 72,0

Endoglykosidaasi H 1000 miljoo nasosaa

Triclocarban 1,50 25 Edellä luetellut ainesosat lisätään yhdellä sekoit- timella varustettuun sekoitustankkiin siinä järjestyksessä kuin ne esiintyvät.

Tämä koostumus tarjoaa antibakteriaalisen vaikutuksen normaalin ihon flooran poistamiseksi, jopa verrattuna . 30 glykosidaasia sisältämättömiin antibakteriaalisiin saippu- ‘ oihin.

Esimerkki 12 Tämän keksinnön mukainen kovien pintojen hankaus-puhdistusaine on seuraavanlainen: 67 - 95929

Komponentti Paino-% "False body" -nestefaasi (ominaispaino 1,1) 93,5

Barasum NAS-100 (natriumsaponiittisavi) 4,25

Tetrakaliumpyrofosfaatti 6,00 5 Trikaliumfosfaatti 2,00

Natriumhypokloriittivalkaisuaine 0,90

Natriumlauryylialkyylisulfaatti 0,25

Pinta-aktiivinen aine Väriaine ja hajuste 0,26 10 Endoglykosidaasi H 1000 miljoo nasosaa

Pehmeä vesi 78,86

Hankausaine (expanded Perlite, ominaispaino 2,0, keskimääräinen partikkelihalkaisija 50 pm) 5,0 15 Hercoflat 135 -täyteaine (jauhettu polypropyleeni, ominaispaino 0,9, keskimääräinen partikkelihalkaisija 35 pm) 1,50

Keskimääräisten partikkelihalkaisijoiden suhde hankausaine/täyteaine = 1,43:1 20 Koostumus valmistetaan sekoittamalla tetrakaliumpy rofosfaatti, trikaliumfosfaatti, natriumsaponiittisavi, väriaine, hajuste ja deionisoitu vesi käyttäen suhteellisen korkean leikkaavan voiman alaista sekoitusta siinä määrin kuin on tarpeen "false body" -nestefaasin muodosta-25 miseksi. Sitten pinta-aktiivinen alkyylisulfaatti sekoite taan tähän seokseen ja sen jälkeen polypropyleenitäyte-ainemateriaali. Natriumhypokloriitista ja Perlite-hankaus-aineesta valmistetaan erillinen vesipohjainen vetelä massa, ja sitten se sekoitetaan "false body" -nestefaasiin 30 kohtuullisen leikkaavan voiman alaisessa sekoituksessa.

Saatu hankauskoostumus on "false bodied", ts. geelimäinen lepotilassa, mutta nesteytyy helposti leikkaavan voiman alaisena. Tällainen koostumus on erityisen tehokas tahrojen ja lian poistamiseksi kovilta pinnoilta.

68 . 95929

Esimerkki 13 Tämän keksinnön mukainen shamppookoostumus on seuraavanlainen :

Komponentti Määrä 5 Ammoniumalkyylisulfaatti (29 % vesiliuos) 55,25 % US-patentin 4 345 080 esimerkin I mukaisia sinkkipyridiinitionikiteitä 2,0

Kookospähkinän monoetanoliamidi 3,0

Etyleeniglykolidistearaatti 5,0 10 Natriumsitraatti 0,5

Sitruunahappo 0,2 Väriliuos 0,1

Hajuste 0,5

Endoglykosidaasi H 1000 miljoo- 15 nasosaa

Vettä q.s. 100,00 %asti

Esimerkki 14 Tämän keksinnön mukainen antiperspiranttipuikko tehdään käyttäen seuraavia komponentteja: 20 Komponentti Määrä

Syklometikoni 42,55

Nestemäinen AP 4,99

Stearyylialkoholi 11,49

Hydrattu risiiniöljy 4,99 25 Talkki 6,99

Zirkonium/aluminium/glysiini -kompleksi 26,67

Hajunpeittäjä 0,80 C20-alkoholi 0,12

Pyridoksaalifosfaatti 1,00 30 Endoglykosidaasi H 500 miljoo nasosaa • 98929 69

Esimerkki 15 Tämän keksinnön mukainen nestesaippuakoostumus on seuraavanlainen:

Aktiivinen 5 Komponentti paino-%

Ammoniumlauryylisulfaatti 6,0

Natriumalkyylisarkosinaatti 5,7

Kokamidopropyylibetaiini 6,3

Kookospähkinän rasvahappo 1,0 10 Etyleenidiamiinitetraetikkahappo 0,2

Ammoniumsulfaatti 0,4

Hajuste 0,25 Väriaine 5 miljoo nasosaa 15 Vesi 80,15

Endo-H 50 miljoo nasosaa 2,4,4'-trikloori-2'-hydroksidifenyylietteri 100 miljoonasosaa 20 Edellä luetellut ainesosat lisätään yhdellä sekoit- timella varustettuun sekoitustankkiin siinä järjestyksessä kuin ne esiintyvät edellä. Ennen kuin väriaine ja hajuste lisätään, seoksen pH säädetään niin, että 10-painoprosent-tisella vesiliuoksella 20 °C:ssa on pH noin 6,5.

25 Tämä koostumus tarjoaa antibakteriaalisen vaikutuk sen normaalin ihon flooran poistamiseksi.

Esimerkki 16 Tämän keksinnön mukainen kovien pintojen puhdistusaine on seuraavanlainen: 30 Aktiivinen . '· Komponentti paino-%

Natriumlauryylialkyylisulfaatti 0,5

Natriumalkyylisulfaatti 0,5

Butyylikarbitoli 4,0 35 Natriumvetykarbonaatti 0,5 70 - 9 S > 2 9

Sitruunahappo 0,04

Formaldehydi 0,03

Hajuste 0,05

Tartraattimono-/disukkinaatti 5,0 5 Endo-H 1000 miljoo nasosaa

Vesi 88,4

Edellä luetellut ainesosat lisätään yhdellä sekoit-timella varustettuun sekoitustankkiin siinä järjestyksessä 10 kuin ne esiintyvät edellä. Ennen kuin hajuste lisätään, seoksen pH säädetään niin, että 10-painoprosenttisella vesiliuoksella 20 °C:ssa on pH noin 7.

Koostumus on tehokas saippuavaahdon ja homeen irrottamiseen kovilta pinnoilta, ja se on tehokkaampi kuin 15 puhdistusaine, jossa ei ole endoglykosidaasia.

Esimerkki 17

Kokonaisten hedelmien, vihannesten tai muiden kas-vipintojen puhdistamiseen ja/tai säilyttämiseen käytetty koostumus on seuraavanlainen: 20

Aktiivinen

Komponentti paino-%

Vesi 196,4 C12-i3-alkoholipolyetoksylaatti (6,5) 0,1 • 25 Endo-H 3500 miljoo nasosaa Tämä koostumus valmistetaan sekoittamalla vastaavat määrät alkoholipolyetoksylaattia ja endo-H:ta veteen ja säätämällä lopullinen pH välille 6-7. Lopullinen koos-30 tumus sumutettuna kasvipinnoille, kuten kokonaisille he delmille ja vihanneksille, on hyödyllinen mikrobien kasvun estämiseksi kyseisillä pinnoilla.

. 98929 71

Esimerkki 18

Antimikrobisen aineen bakterisidisen tehon voimistuminen endo-H:n vaikutuksesta

Yli yön kasvatettu viljelmä Escherichia colia lai-5 mennettiin tuoreeseen ravintoliemeen, ja sitä kasvatettiin neljä tuntia 37 °C:ssa. Solut eristettiin sentrifugoimalla ja pestiin 0,2 M sitraattipuskurissa (SCB), pH 5,5. Sent-rifugoinnin jälkeen solut suspensoitiin uudelleen SCB:hen. Seuraavat putket (kahtena rinnakkaisena) valmistettiin: 10 5000 mil- 1000 mil- joonasosaa joonasosaa kloorihek-

Olosuhteet endo-H:ta sidiiniä SCB Vesi 15 Kontrolli 0 μΐ 0 μΐ 200 μΐ 10 μΐ

Klooriheksidiini 0 μΐ 10 μΐ 200 μΐ 10 μΐ

Endo-H 200 μΐ 0 μΐ 0 μΐ 10 μΐ

Endo-H + klooriheksidiini 200 μΐ 10 μΐ 0 μΐ 0 μΐ 20 Endo-H oli S. plicatuksen endo-H:ta tuottavasta E.

colista. Kuhunkin putkeen lisättiin 790 μΐ solususpensiota (lopullinen tilavuus nyt 1 ml), ja 10 μΐ näytteet otettiin 0 minuutin kontrollina. Putkia inkuboitiin 37 °C:ssa pyörittävässä ravistelijassa, ja 10 μΐ näytteet otettiin 1 ja 25 3 tunnin kohdalla. Nämä 10 μΐ erät sekoitettiin 990 μ1:η PBS:ä (fosfaattipuskuroitua suolaliuosta) kanssa (laimennus 10'2) ja laimennettiin eteenpäin sarjalaimennuksena (1-PBS:än (100 μΐ 900 pl:ssa PBS:ä). 10 μΐ kutakin laimennettua liuosta maljättiin Lurian-Bertanin agarmaljoille. Mal-30 joja inkuboitiin 37 °C:ssa yli yön, ja pesäkkeet lasket tiin. Pesäkkeitä muodostavien bakteerien määrä putkissa laskettiin tehtyjen laimennusten perusteella, ja tämän lukumäärän logaritmia käytettiin vielä tehtäviin käyriin ja laskuihin.

5 . 98929 72 1 tunti 3 tuntia O minuutin (logaritminen (logaritminen Olosuhteet kontrolli tappo) tappo)

Kontrolli 8,62 8,57 (0,05) 8,53 (0,09) ^ 200 miljoonasosaa endo-H:ta 8,64 8,55 (0,09) 8,55 (0,09) 50 miljoonasosaa kloori- heksidiiniä 8,60 4,42 (4,15) 2,44 (6,59) 200 miljoonasosaa endo-H:ta + 15 klooriheksidiinii 8,61 2,40 (6,17) 2,00 (>6,53) 20 Näistä tuloksista on piirretty kuvaaja kuviossa 8.

Kuten voidaan nähdä, 200 miljoonasosaa endo-H:ta tehostaa 50 miljoonasosan klooriheksidiiniä bakterisidistä vaikutusta .

Samankaltaisia tuloksia saatiin hieman erilaisilla 25 klooriheksidiinin ja endo-H:n pitoisuuksilla yhden tunnin ajalla mitattuna. Nämä tulokset esitetään kuviossa 9. Kuten voidaan nähdä, 140 miljoonasosaa endo-H:ta tehostaa 40 miljoonasosan klooriheksidiiniä tehokkuutta.

Tämän vaikutuksen tutkimiseksi edelleen tehtiin sa-30 mankaltainen koe käyttäen 20 miljoonasosaa klooriheksidii niä (lopullinen pitoisuus) vaihtelevien endo-H-pitoisuuk-sien kanssa. Tulokset esitetään kuvioissa 10A ja 10B. Nämä kuvaajat edustavat pesäkkeen muodostavien yksiköiden (CFU) logaritmin muutosta. Kuten voidaan nähdä, lisätyn endo-H:n 35 määrä vaikuttaa suhteellisen lineaarisesti noin 280 mil joonasosaan endo-H:ta asti. Endo-H-pitoisuuden lisäykset vielä tästä tehostavat haittavaikutusta bakteerien elinkyvylle ainakin 1000 miljoonasosaan endo-H:ta asti yhdessä 20 miljoonasosan klooriheksidiiniä kanssa.

73 95. 29

Esimerkki 19

Endo-H:n vaikutus sienten elinkykyisyyteen yksin ja yhdessä antimikrobisen aineen kanssa

Logaritmisen kasvun vaiheessa olevaa Candida albi-5 cans -viljelmää kasvatettiin, laimennettiin tuoreeseen elatusaineeseen ja käsiteltiin 0, 1, 10, 100 ja 1 000 miljoonasosalla endo-H:ta (lopullinen pitoisuus) 4 tunnin ajan inkuboiden sekoituksessa 37 °C:ssa. Endo-H oli Bacillus subtiliksesta, joka oli transformoitu tuottamaan 10 plicatuksen endo-H:ta. Yksi-, kymmen- ja satakertaiset laimennokset tehtiin ja maljattiin elinkykyisten solujen lukumäärien saamiseksi. Nollasta kymmeneen miljoonasosaan endo-H:ta ei vähentänyt merkitsevästi solujen elinkykyi-syyttä, vaikka yhdessä tapauksessa 10 miljoonasosaa endo-15 H:ta vähensi elinkykyisyyttä noin 36 %:lla 18 tunnin inku- baation jälkeen. Kuitenkin 100 - 1 000 miljoonasosaa endo-H:ta vähensi talteen saatujen elinkykyisten solujen lukumäärää vastaavasti 50 - 88 %:lla, verrattuna kontrolliin, jota ei käsitelty endo-H:lla käsiteltäessä 4 tuntia.

20 Erillisessä kokeessa Candida albicansin viljelmä kasvatettiin, laimennettiin tuoreeseen elatusaineeseen, ja sitä käsiteltiin 2,5 pg/ml Nystatinilla® yhdessä 0, 1, 10, 100 tai 1 000 miljoonasosan (lopullinen pitoisuus) endo-H:ta kanssa 18 tuntia inkuboiden sekoituksessa 37 °C:ssa.

25 Yksi-, kymmen-, sata- ja tuhatkertaiset laimennokset teh tiin ja maljattiin elinkykyisten solujen lukumäärien saamiseksi. Endo-H vähensi talteen saatujen elinkykyisten solujen määrää seuraavasti, verrattuna Nystatinilla® yksin saatuun: 30 Miljoonasosaa endo-H:ta Vähentymis-% 0 0 % 1 69 % 10 93 % 100 99 % 96929 74

Kuten voidaan nähdä, niinkin vähän kuin 1 miljoonasosa endo-H:ta tehostaa merkitsevästi Nystatinin® myko-sidista tehoa, kun taas 10 miljoonasosaa ja 100 miljoonasosaa endo-H:ta tappaa lähes kaikki pelkästä Nystatin®-kä-5 sittelystä selviävät sienet.

Samankaltainen koe suoritettiin käyttäen Amphotericin B:tä® pitoisuudessa 0,5 pg/ml kolmen tunnin ajan. Tulokset olivat seuraavat:

Miljoonasosaa endo-H:ta Elinkykyisyyden vähentymis-% 10 0 0 % 1 17 % 10 5 % 100 96 % 1 000 94 % 15 Kuten voidaan nähdä, 100 miljoonasosaa endo-H:ta tehostaa Amphotericin B:n® mykosidista tehoa.

Esimerkki 20

Endo-H:n antimikrobinen teho yksin tai yhdessä ly- sotsyymin kanssa

20 48 tuntia kasvatettua jatkoviljelmää E. colia (ATCC

31 617) käytettiin testaamaan lysotsyymi mutanolysiinin (Sigma Chemical Co.) vaikutusta yksin tai yhdessä puhdistusaineen ja/tai endo-H:n kanssa. Endo-H oli E. colista, joka oli transformoitu tuottamaan S. plicatuksen endo-25 H:ta. Seuraava menettelykuvaus ja tulokset saatiin kahden tunnin 37 °C:ssa käsittelyn jälkeen: 96929 75

Muta- noly- Endo- sii- Na- Na- Tide, H, ni, sit- sit- 200 200 5 mil- raat- raat- mil- miljöö- ti, ti, joo- joo- nas- pH pH nas- nas- osaa 5,5 7,0 osaa osaa Tulokset 10 1 Kont- Fimbrioita, tiivis rolli soluseinä 2 200 + Fimbrioita, tiivis soluseinä 15 3 200 + Fimbrioita, tiivis soluseinä 4 200 + + Fimbrioita, tiivis 20 soluseinä 5 200 + + Fimbrioita, solujen kondensoituminen 25 6 200 + + Fimbrioiden menetys 7 200 + + Vähän soluja, hieman solujäänteitä, solu-seinän hajoaminen 30 8 200 + + + Joitakin fimbrioita 9 200 + + + Solut huonossa kun nossa (kondensoitu- 35 neita), mutta vielä läsnä

Kuten voidaan nähdä, endo-H:lle ja mutanolysiinil-le, joko ilman puhdistusainetta tai sen kanssa, eri 40 pH:issa altistettujen bakteerien yleinen morfologia muut tui merkitsevästi. Dramaattisimmat vaikutukset olivat pH:ssa 7, kun endo-H:ta käytettiin yksin tai yhdessä puhdistusaineen kanssa. Solujen elinkykyisyyteen ei kuitenkaan ollut näkyvää vaikutusta. Endo-H ja mutanolysiini 45 eivät vähentäneet maljauskokeessa saatujen pesäkkeiden lukumäärää verrattuna puskurikontrolliin.

98929 76

Esimerkki 21

Bakteerien poisto lasipinnoilta endo-H:lla ja PNGaasi F:llä

Escherichia colia (ATCC 31 617) ja Staphylococcus 5 epidermidistä (ATCC 155) käytettiin aluslaseille siirros- tamiseen. Kussakin lasissa oli kaksi kaiverrettua ympyrää, ja kuhunkin siirrostettiin E. colia tai S. epidermidistä. Bakteerien annettiin inkuboitua 37 °C:ssa kaksi tuntia.

Tislatulla vedellä huuhtelun jälkeen lasit käsitel-10 tiin joko 1) PBS-puskurilla, 2) endo-H:lla (100 miljoonas osaa) PBS-puskurissa tai 3) PNGaasi F:llä (100 miljoonasosaa) PBS-puskurissa. Endo-H oli peräisin S. plicatuksen endo-H:ta tuottavasta E. colista. 30 minuutin kuluttua 37 °C:ssa lasit huuhdottiin tislatussa vedessä. Gram-värjäyk-15 sen jälkeen lasit tutkittiin valomikroskoopin kirkaskent- täoptiikalla.

Puskurikontrollin tapauksessa lasilla pysyvien bakteerien lukumäärä oli suurempi kuin 100 näkökenttää kohti. Endo-H:11a käsitellyt lasit sisälsivät paljon vähemmän 20 bakteereita. S. epidermidiksen tapauksessa vain noin 1-3 bakteeria havaittiin näkökenttää kohti. E. colin tapauksessa noin 5-10 havaittiin näkökenttää kohti. Niillä laseilla, jotka oli käsitelty PNGaasi F:llä, havaittiin kohtalaisia määriä bakteereita sekä S. epidermidiksellä ; 25 että E. colilla (noin 20 näkökenttää kohti).

Nämä tulokset viittaavat siihen, että PNGaasi F kykenee poistamaan bakteereita lasipinnoilta, vaikkakaan ei yhtä tehokkaasti kuin endo-H.

Esimerkki 22 30 Endo-H: ta sisältävä tekohampaiden puhdistus tabletti

Natriumvetykarbonaatti, natriumperboraatin monohyd-raatti, viinihappo, natriumtripolyfosfaatti, sulfaamihap-po, polyetyleeniglykoli (molekyylipaino 20 000) ja ety-leenidiamiinitetra-asetaatti granuloidaan erikseen nes-35 teyttämällä kuumailmahauteessa 60 - 65 °C:ssa 30 minuut- - 98929 77 tia. Sitten nämä granulaatit pyöritellään sekaisin muiden ainesosien kanssa "ensimmäisen kerroksen" ja "toisen kerroksen" seosten aikaansaamiseksi, joista "ensimmäisen kerroksen" seoksella on seuraava koostumus: 5 Paino-%

Natriumvetykarbonaatti 30,00

Viinihappo 23,00

Kaliummonopersulfaatti 16,00

Sulfaamihappo 11,00 10 Dinatriumpyrofosfaatti 8,20

Natriumkarbonaatti 3,90

Polyetyleeniglykoli 12,60

Natriumsulfaatti 2,00

Piparminttujauhe 2,50 15 Piidioksidi 1,30

Natriumdodekyylibentseenisulfonaatti 0,50 ja "toisen kerroksen" seoksella on seuraava koostumus:

Paino-%

Natriumperboraatin monohydraatti 30,00 20 Kaliummonopersulfaatti 28,00

Natriumvetykarbonaatti 13,34

Natriumtripolyfosfaatti 10,00

Natriumvetykarbonaatti/väri 4,00

Trilon B 3,00 * 25 Natriumkarbonaatti 3,00

Polyetyleeniglykoli 2,50

Piidioksidi 2,00

Piparminttujauhe 1,50

Wasag-esteri 7 0,70 30 Wasag-esteri 15 0,70 . Kovetetut triglyseridit 0,50

Natriumdodekyylibentseenisulfonaatti 0,40

Sukkinaattidetergentti 0,30

Blue Lake No. 1 0,06 35 Endo-H 100 miljoo nasosaa - 96929 78

Tabletti valmistetaan HORN-rotaatiotablettikonees-sa, jossa on 39 paininta. Puristaminen on kaksivaiheinen: Aluksi "toisen kerroksen" sininen seos puristetaan sullomalla hyvin alhaisella paineella (10 kN/tabletti). Sitten 5 "ensimmäisen kerroksen" valkoinen seos johdetaan sisään ja puristetaan paineella 70 kN/tabletti. Tällä tavalla tuotetaan 4 gramman tabletti, joka on 2,7 grammaa sinistä ja 1,3 grammaa valkoista.

Kuluttaja liuottaa tabletit veteen puhdistaakseen 10 veteen pannut tekohampaat.

Esimerkki 23

Endo-H:ta sisältävä kevyt emulsiovoide Öljy-vesi -auringonsuojaemulsiopohja tehdään seu-raavista ainesosista, jotka ilmaistaan niiden kemiallisil-15 la nimillä tai Cosmetic, Toiletry and Fragrance Associa tionin (CTFA:n) nimien suomalaisilla vastineilla:

Ainesosa Paino-%

Vesifaasi:

Metyyliparabeeni (säilöntäaine) 0,20 20 Pantetiini (kosteutt.aja) 0,10

Carbomer 934 (sakeutusaine) 0,08

Natriumhydroksidi, 10 % (neutralointiaine) 1,00

Endo-H 100 miljoo nasosaa '. 25 Puhdistettu vesi q. s. 100 % asti Öljyfaasi:

Raskas mineraaliöljy 4,00 kahdesti puristettu steariinihappo (anioninen emulsiointiaine) 3,00 30 Kolesteroli (apuemulsiointiaine) 1,00 .. Setyylialkoholi (apuemulsiointiaine) 1,80

Risiiniöljy (pehmennysaine) 1,00

Setyylipalmitaatti (pehmennysaine) 1,20

Oktyylidimetyyli-PABA (LJV-absorboija) 1,40 35 Propyyliparabeeni (säilöntäaine) 0,10 - 98929 79

Vesi ja muut vesifaasin ainesosat paitsi natrium-hydroksidi ja endo-H:n vesiliuos lisätään mekaanisella sekoittimella varustettuun sekoitusastiaan, ja niitä sekoitetaan kuumentaen noin 75-80 °C:seen tasa-aineisen 5 vesidispersion muodostamiseksi. Sitten natriumhydroksidi- liuos lisätään ja sekoitetaan vesifaasiin happaman Carbo-mer-sakeutusaineen neutraloimiseksi.

Mineraaliöljy ja öljyfaasin ainesosat lisätään erilliseen sekoitusastiaan, ja niitä sekoitetaan kuumenta-10 en noin 80 - 82 °C:seen tasa-aineisen öljyfaasin muodosta miseksi. Kuuma öljyfaasi lisätään hitaasti kuumaan vesi-faasiin käyttäen suurinopeuksisia mekaanisia dispersointi-välineitä. Sekoitusta jatketaan, kunnes saadaan homogeeninen öljy/vesi-emulsio. Emulsio jäähdytetään huoneenläm-15 pöön. Jos niin halutaan, valinnaisia väriaineita, kuten vesiliukoisia väriaineita, sekoitetaan edullisesti emulsioon noin 45 - 50 °C:ssa, ja tuoksuvia öljyjä lisätään edullisesti noin 35 - 40 °C:ssa. Endo-H sekoitetaan emulsioon noin 35 - 40 °C:ssa.

20 Esimerkki 24 S. aureuksen poistaminen sian nahasta Sian nahka infektoitiin S. aureuksella (1,2 x 107 pesäkettä/ml) levittämällä 0,1 ml viljelmää nahan pinnalle. Eliöiden annettiin asettua nahalle kaksi tuntia huo-. 25 neenlämpötilassa. Kaksi rinnakkaista näytettä nahan pa loista käsiteltiin sitten 30 sekunnin ajan: 1) käsittelemätön kontrolli 2) pelkällä vedellä 3) 10 % saippualiuoksella 30 4) kohdalla 3 + endo-H:lla (20 miljoonasosaa) , ; 5) 20 miljoonasosalla endo-H:ta puskurissa

Endo-H saatiin S. plicatuksen endo-H:ta tuottamaan transformoidusta E. colista. Käsittelyn jälkeen näytteet huuhdottiin tislatulla vedellä ja pantiin 2 % osmiumtet-35 roksidiin, ja sen jälkeen kiinnitettiin Ryterin-Kellenber- 98929 80 gerin kiinnitteessä. Sitten näytteitä käsiteltiin peräkkäin osmiumissa ja tiosemikarbatsonissa. Kriittisen pisteen kuivauksen jälkeen kaikkia näytteitä tarkasteltiin SEM:illä. Mikroskooppivalokuvia otettiin.

5 S. aureus -pesäkkeitä tavattiin runsaasti käsitte lemättömissä, vesikäsitellyissä ja pelkällä saippualla käsitellyissä näytteissä. Ks. esim. kuviota 11, joka osoittaa nestemäisellä käsisaippualla käsittelyn tehon. Endo-H-käsitellyissä näytteissä nähtiin merkitsevä eliöi-10 den väheneminen. Ks. esim. kuviota 12, joka osoittaa S.

aureuksen poistuvan sian nahasta käsiteltäessä yhdessä nestemäisellä käsisaippualla ja endo-H:lla.

Esimerkki 25

Homeen poisto suihkuverhosta 15 Muovinen suihkuverho kostutettiin hanavedellä ja pantiin pimeään kolmeksi viikoksi. Tämän ajan kuluttua pieni näyte verhosta, joka oli homeen peitossa, käsiteltiin : 1) tislatulla vedellä 20 2) + 2 000 miljoonasosalla Joy-pesuainetta 3) + 1 000 miljoonasosalla endo-H:ta 4) ei käsitelty

Endo-H saatiin S. plicatuksen endo-H:ta tuottamaan transformoidusta E. colista. Käsittelyt kestivät 10 - 15 . 25 sekuntia huoneenlämmössä. Suihkuverhoa pyyhittiin käsitte lyn jälkeen pumpulitupolla.

Kuvio 13 kuvaa saatuja tuloksia. Käsittelemättömässä kontrollissa (alaoikea valokuva - keskivalokuvan alaoi-kea neljännes) nähtiin runsaasti home- ja härmähiukkasia 30 sekä makro- että mikroskooppisesti.

Tislatulla vedellä käsitellyssä kontrollissa (yläoikea valokuva - keskivalokuvan yläoikea neljännes) nähtiin vähemmän eliöitä, vaikka hiukkasia oli vielä jäljellä ja tummuminen oli selvä.

98929 81

Joy-käsitellyssä kontrollissa (alavasen valokuva -keskivalokuvan alavasen neljännes) nähtiin vähemmän eliöitä kuin vesikäsitellyssä näytteessä, mutta tummuminen oli vielä selvä.

5 Endo-H käsitellyssä näytteessä (ylävasen valokuva - keskivalokuvan ylävasen neljännes) ei ollut eliöitä eikä lainkaan tummumia.

Esimerkki 26

Bakteerien poisto kankaasta 10 Kangastilkkuja leikattiin petrimaljan kokoisiksi.

Lisää kangasta (jota ei infektoitu) lisättiin 5 %:n kan-gaskuormitukseen pääsemiseksi. Tilkut steriloitiin autoklaavissa 15 minuuttia 1 atm:n ylipaineessa 121 °C:ssa.

Yksi kangaskuormituserä tarvittiin kuhunkin käsittelyyn.

15 Lasihelmiä (40 g) ja 100 ml 0,2 M sitraattipuskuria pH 7,0 pantiin 250 ml Erlenmeyer-pulloihin. Pullot suljettiin kumitulpilla ja alumiinifoliolla ja steriloitiin autoklaavissa. E. colia jatkoviljeltiin tuoreeseen ravintoliemeen ja inkuboitiin 48 tuntia 37 °C:ssa. Puolivahvuisia trypti-20 case-soija-agarmaljoja (10 g/500 ml) valmistettiin ja ste riloitiin. Jäähdyttämisen jälkeen lisättiin tetratsoliumia (1 ml/litra) .

Agarmaljoille siirrostettiin seuraavasti: 1) sarjalaimennukset 48 tunnin viljelmästä tehtiin • 25 (1:10 ja 10-kertaiset laimennukset vielä kolmen putken kautta peptonivedessä); 2) Sen jälkeen jokaiselle tilkulle siirrostettiin 2 ml viimeistä laimennusta (104) .

3) Sitten tilkkuja inkuboitiin 37 °C:ssa kaksi tun- 30 tia (kaksi tilkkua/käsittely).

, : Inkubaation jälkeen tilkut pestiin seuraavasti:

Pesu 100 ml steriiliä 0,2 M sitraattipuskuria, pH 7,0 + 40 g lasihelmiä + kuviossa 14 kuvattu käsittely (jossa AWA 35 on endo-H S. plicatuksen endo-H:ta tuottamaan transfor- - 98929 82 moidusta E. colista) 250 ml:n Erlenmeyer-pullossa (steriili) . Kaksi siirrostettua tilkkua ja steriiliä kangasta 5 %:n kangaskuormitukseen asti pestiin 35 °C:ssa 12 minuuttia ravistellen.

5 Huuhtelu

Pesun jälkeen tilkut huuhdeltiin lisäämällä 100 ml steriiliä kahdesti tislattua/deionisoitua vettä ja 40 g lasihelmiä 250 ml:n Erlenmeyer-pulloon (steriili) huoneenlämmössä ravistellen.

10 Sitten kangastilkut pantiin petrimaljoille, ja nii den päälle kaadettiin 3 ml puolivahvuista trypticase-soi-ja-agaria, jossa oli tetratsoliumia. 48 tunnin inkubaation jälkeen pesäkkeet laskettiin.

Tulokset esitetään kuviossa 15. Nämä tulokset il-15 maisevat, että 2 % Irgasan yhdessä neste-Tiden kanssa joh tavat kahden logaritmiyksikön vähenemiseen bakteerikasvussa verrattuna pelkkään Tideen. Kuitenkin 40 miljoonasosan endo-H:ta lisääminen vähentää bakteerikasvua vielä yhden logaritmiyksikön.

20 Esimerkki 27

Endo-H:n vaikutus hiivaan

Candida albicansin ja Saccharomyces cerevisiaen liemiviljelmiä (18 tuntia) käsiteltiin: 1) 0,2 M sitraattipuskurilla, pH 5,5 . 25 2) kohdalla 1 + 200 miljoonasosalla endo-H:ta (S.

plicatuksen endo-H:ta tuottavasta E. colista) Käsittelyt kestivät 2 tuntia 37 °C:ssa.

Käsittelyn jälkeen pieni erä kumpaakin pantiin formvar-pinnoitetulle 200 mesh kupariverkolle ja tarkas-30 teltiin TEM:llä. Tutkittavista otettiin mikroskooppivalo- ; kuvia, ja ne esitetään kuvioissa 15 ja 16.

Kuten kuviossa 15A voidaan nähdä, pelkällä puskurilla käsitelty Candida oli morfologialtaan hyvässä kunnossa. Kuten kuvasta 15B ilmenee, endo-H:lla käsitellystä 35 Candidasta vuoti nopeasti ulos materiaalia, ja se menetti rakenteellisen eheytensä.

• 98929 83

Pelkällä puskurilla käsitelty Saccharomyces oli morfologialtaan hyvässä kunnossa, kuten voidaan nähdä kuviossa 16A. Käsiteltäessä endo-H:lla kuitenkin jäi jäljelle vain hyvin rajoitettuja kalvomateriaalin kappaleita.

5 Ks. kuvio 16B.

Esimerkki 28

Endo-H:n ja lysotsyymin vaikutus E. colin elinky-kyisyyteen

Yli yön Laurien liemessä (LB) kasvatettu E. coli 10 K12:n viljelmä laimennettiin 1:1 000 LB:hen ja kasvatet tiin uudestaan 4 tuntia 37 °C:ssa. Solut sentrifugoitiin, pestiin ja suspensoitiin uudelleen 0,1 M Na-asetaattipus-kuriin, pH 5,5 (NA). Kahdeksan putkea järjestettiin seuraavasti : 15 Putken numero 1,2 3,4 5,6 7,8 μΐ soluja 800 800 800 800 μΐ NA-puskuria 200 - - 200 μΐ endo-H:ta (1 mg/ml) - 200 200

Endo-H oli S. plicatuksen endo-H:ta tuottamaan 20 transformoidusta B. subtiliksesta. Putkia inkuboitiin tun nin ajan 37 °C:ssa. Putket sentrifugoitiin, pestiin ja suspensoitiin uudelleen 8,00 pl:an 0,1 M Na-fosfaattipus-kuria, pH 7,2 (NP), joka sisälsi 0,1 M EDTA:n. Puskuria tai kananmunanvalkuaisen lysotsyymia lisättiin putkiin . 25 seuraavasti:

Putken numero 1,2 3,4 5,6 7,8 μΐ NP-puskuria 200 200 μΐ lysotsyymiä (1 mg/ml) - - 200 200

Pienet näytteet otettiin tässä vaiheessa pesäkkeitä 30 muodostavien yksiköiden (CFU) määrittämiseksi (palsta A).

: Tunnin 37 °C:ssa inkubaation jälkeen CFU:t määritettiin pienistä näytteistä (palsta B) . Pesäkkeitä muodostavien yksiköiden logaritmit laskettiin. Väheneminen CFU:n loga-ritmeissä määritettiin vähentämällä B A:sta. Tulokset esi-35 tetään seuraavassa: 98929 84

Log(CFU) Log(CFU):n

Olosuhteet A B muutos

Kontrolli 7,89 7,90 +0,01

Endo-H (200 miljoonasosaa) 8,21 7,92 -0,29 5 Lysotsyymi (200 milj.osaa) 7,87 7,68 -0,19

Endo-H + lysotsyymi 8,17 7,53 -0,64 Nämä tulokset viittaavat siihen, että endo-H:n ja lysotsyymin yhdistelmä vähentää E. colin elinkykyisyyttä verrattuna pelkään endo-H:hon tai lysotsyymiin.

10 Esimerkki 29

Endo-H:n vertailu T-4:n tai kananmunanvalkuaisen lysotsyymin kanssa E. colin elinkykyisyyden suhteen E. coli-soluja pestiin ja suspensoitiin 0,1 M Na-asetaattipuskuriin, pH 5,5. Solut jaettiin (10 ml) kahteen 15 putkeen. Toiseen putkeen lisättiin pelkkää puskuria (kont rolli) ja toiseen lisättiin endo-H:ta (käsitelty). Endo-H oli S. plicatuksen endo-H:ta tuottamaan transformoidusta B. subtiliksesta. Soluja inkuboitiin tunnin ajan 37 °C:ssa. Putket sentrifugoitiin, pestiin ja suspensoi-20 tiin uudelleen 0,1 M Na-fosfaattipuskuriin, pH 7,2. Solut jaettiin tasan ja käsiteltiin joko puskurilla tai lysot-syymilla. Kananmunanvalkuaisen (HL) ja T-4:n (TL) lysot-syymeja verrattiin tässä kokeessa. Putkia inkuboitiin 1,5 tuntia. Näytteet laimennettiin ja maljattiin CFU-määritys-• 25 tä varten inkubaatiota ennen (A) ja sen jälkeen (B) .

CFU:iden logaritmit määritettiin. Saatiin seuraavat tulokset: 85 - 96929

Inkubaatio-olosuhteet Log(CFU) Log(CFU):n

Ensimmäinen Toinen A B muutos

Inkubaatio-olosuhteet Log(CFU) Log(CFU):n

Ensimmäinen Toinen A B muutos

Endo-H (300 miljoonasosaa) 7,60 7,23 -0,37 HL (445 mil- 10 joonasosaa) 6,69 6,73 -0,23

Endo-H (300 HL (445 mil- mil joonasosaa) joonasosaa) 7,41 6,81 -0,60 TL (445 miljoonasosaa) 4,98 4,53 -0,45 15 Endo-H (300 TL (445 mil- mil joonasosaa) joonasosaa) 5,27 4,30 -0,93 Nämä tulokset viittaavat siihen, että myös T-4:n 20 lysotsyymi on tehokas vähentämään E. colin elinkykyisyyttä yhdessä endo-H:n kanssa.

Esimerkki 30

Likaantuneen vaippamateriaalin käsittely endo-H:11a

Saatiin näytteitä likaantuneesta vaipasta. Kukin näyte ·’ 25 jaettiin kahtia. Vasen puoli näytteestä pestiin 2 000 mil joonasosalla Tidea ja yhdellä miljoonasosalla BPN':a (Bacillus amyloliquifaciensin subtilisiiniproteaasia) . Oikea puoli pestiin 2 000 miljoonasosalla Tidea, yhdellä miljoonasosalla BPN':a ja 40 miljoonasosalla Endo-H:ta (Boehrin-30 ger Mannheim Biochemical luettelonumero 100 119) . Kumpaa- .· kin näytettä pestiin 12 minuuttia 35 °C:ssa. Kahden kokeen tulokset esitetään kuvioissa 17 ja 18. Kuten voidaan nähdä, kuvioiden 17 ja 18 oikeanpuoleinen vaippamateriaali sisältää olennaisesti vähemmän ulostetahroja verrattuna 35 kuvioiden 17 ja 18 vasemmalla puolella esitettyyn Tidella ja proteaasilla käsiteltyyn vaippaan.

- 98929 86

Kun esillä olevan keksinnön edulliset suoritusmuodot on nyt kuvattu, ammattimiehet huomaavat, että voidaan tehdä erilaisia muunnoksia ja että tällaiset muunnokset on tarkoitettu tämän keksinnön suoja-piiriin kuuluviksi. Mui-5 ta tämän keksinnön mukaisia koostumuksia saadaan, kun esi merkeissä endo-H korvataan endo-D:llä tai -F:llä tai PNGaasi F:llä.

Kaikki tässä mainitut viitejulkaisut liitetään nimenomaisesti viitteinä mukaan.

Claims (10)

1. Menetelmä pinnan puhdistamiseksi mikro-organismeista irrottamalla ainakin osa mikro-organismista pinnas- 5 ta, johon se on sitoutunut ainakin osaksi tyyppi II-endo- glykosidaasireaktiivisella sidoksella, tunnettu siitä, että mikro-organismi, jossa on tyyppi II -endogly-kosidaasireaktiivinen sidos, saatetaan kosketukseen tyypin II endoglykosidaasin kanssa ainakin osan mikro-organismia 10 irrottamiseksi pinnasta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismi on prokaryootti, edullisesti bakteeri.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n - 15. e t t u siitä, että mikro-organismi on eukaryootti, edullisesti sieni.

4. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pinnasta irrotettu mikro-organismin osa saatetaan kosketukseen pe- 20 suliuoksen kanssa mainitun osan poistamiseksi pinnalta mainitussa pesuliuoksessa.

5. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pinnasta irrotettu mikro-organismin osa saatetaan kosketukseen puh- ; 25 distusainetta sisältävän nesteen kanssa mainitun osan poistamiseksi pinnalta mainitussa nesteessä.

6. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tyypin II endoglykosidaasi on endo-B-N-asetyyliglukoosiaminidaa- 30 si, endo-a-N-asetyyligalaktoosiaminidaasi tai endo-B-ga- . laktosidaasi.

7. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tyypin II endoglykosidaasi on endo-B-N-asetyyliglukoosiaminidaasi

35 D, H, L, Cj, CIT, Gal-tyyppinen F tai F tai glykopeptidaasi F. 98929

8. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tyypin II endoglykosidaasi on endo-h-N-asetyyliglukoosiaminidaasi H.

9. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismin pinta lisäksi saatetaan kosketukseen toisen entsyymin kanssa, joka ei käsitä tyypin II endoglykosidaa-sia.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen entsyymi on pro-teaasi. - 96929