FI97548C - Laite mikro-organismien toteamiseksi - Google Patents

Description

- 97548

Laite mikro-organismien toteamiseksi

Keksinnön tausta

Esillä oleva keksintö liittyy näytteen bakteerikas-5 vun toteamisen menetelmiin ja laitteisiin. Erityisemmin esillä oleva keksintö liittyy elektroniseen laitteeseen näytteen mikro-organismien kasvun toteamiseksi tarkkailemalla näytteen kasvulle altistettua indikointielementtiä.

Mikrobisen epäpuhtauden läsnäolo kliinisessä näyt-10 teessä on perinteisesti määritetty viljelemällä näytettä ravintoaineiden läsnäollessa ja toteamalla mikrobinen aktiviteetti näytteen tai ympäröivän ilmakehän muutosten kautta ajanjakson kuluttua. Esimerkiksi Ahnel et ai. US-patenttijulkaisussa 4 182 656 näyte sijoitetaan astiaan 15 elatusaineen, joka käsittää käymiskykyisen hiili-13-subst-raatin, kanssa. Sen jälkeen kun astia on suljettu ja näyte altistettu olosuhteille, jotka vaikuttavat biologiseen aktiviteettiin, määritetään hiili-13-suhde tunnettuun hii-li-12:een nähden näytettä ympäröivässä kaasumaisessa ilma-20 kehässä ja suhdetta verrataan alkuperäiseen suhteeseen. US-patenttijulkaisussa 4 152 213 on esitetty patenttivaatimus, jonka mukaan happea kuluttavan bakteerin läsnäolo näytteessä määritetään suljetussa astiassa toteamalla hapen määrän vähentyminen näytettä ympäröivässä ilmakehässä 25 tarkkailemalla astiassa olevaa kaasua. US-patenttijulkaisu 4 073 691 tarjoaa menetelmän biologisesti aktiivisten aineiden määrittämiseksi, mukaanlukien bakteerit suljetussa astiassa, joka käsittää elatusaineen, mittaamalla muutoksia kaasumaisen näytettä ympäröivän ilmakehän ominai-30 suuksissa tietyn ajanjakson jälkeen.

Menetelmän ulkopuolelta tapahtuvaa C02-muutosten määrittämistä varten opettavat Suppman et ai., kuten EPO-hakemuksessa 83 108 468.6 on tuotu esiin, julkaistu 4. huhtikuuta 1984. Näissä ja muissa julkaisuissa kuvatut 35 menetelmät ja laitteet edellyttävät kaikki joko radiomet- - 97548 2 risiä menetelmiä tai tunkeutumista suljettuun astiaan kaasumaisen Ilmakehän muutosten mittaamiseksi viljelyn jälkeen, tai edellyttävät, että astia on valmistettava erityisistä materiaaleista, jotka sallivat infrapunavalon 5 häiriytymättömän kulun.

Muut tunnetut menetelmät näytteen mikrobisten epäpuhtauksien mittaamiseksi, erityisesti veriviljelmien, käsittävät lämpötilan, pH:n, sameuden, värin, bioluminesens-sin ja impedanssin pienten muutosten mittaamisen. Tavalli-10 sesti nämä menetelmät määrittävät mikrobisen epäpuhtauden havaitsemalla bakteeriset metaboliset sivutuotteet. Mikro-binen epäpuhtaus voidaan myös arvioida lisäviljelyllä ja/ tai värjäämällä. Näistä menetelmistä ainoastaan impedanssi, radiometria ja infrapunaspektroskopia tarjoavat mah-15 dollisuuden kliinisten näytteiden automatisoituun käsitte lyyn. Impedanssi- ja infrapunamittauksia lukuunottamatta nämä menetelmät edellyttävät myös astiaan sisälle menemistä, jotta voidaan tehdä mittauksia nestemäisestä näytteestä tai näytettä ympäröivästä kaasumaisesta ilmakehästä.

20 Sen lisäksi, että on epäpuhtauksien todennäköisyys ja että luodaan todennäköisyys näytettä ympäröivän ilmakehän koostumuksen muutokseen joka kerta, kun määritys tehdään, nämä menetelmät eivät salli mittausten suorittamista jatkuvasti tai helposti lyhyitten ajanjaksojen välein pit-25 kän aikaa. Tämä on merkittävä haitta kun saastuttavien organismien kasvunopeus on erilainen alkuperäisen näytteen organismista ja organismien määrästä riippuen siten, että sitä ei voi ennustaa silloin, kun havaittavia muutoksia ilmakehässä tai nestenäytteessä esiintyy epäpuhtaasta 30 näytteestä johtuen.

Vastaavassa ongelmassa, kun epäpuhtaus määritetään pH-muutoksen avulla nestemäisestä näytteestä, erilaiset metaboliset tuotteet vaikuttavat näytteen pH:hon erilailla. Esimerkiksi ammoniakin syntyminen nostaa pH:ta, kun 35 taas C02:n syntyminen alentaa sitä. Erilaisten saastutta-

II

3 - 97548 vien organismien erilaiset kasvunopeudet voivat johtaa pH:n kasvuun toisella kertaa ja pienenemiseen toisella kertaa. Tähän vaihtelevaan kasvuun-pienentymiseen ei vaikutettaisi, jos pH mitattaisiin pitkin välein sijoitetuin 5 aikavälein. Toinen virhelähde, kun muutoksia mitataan pH-mittauksin kokoverinäytteistä erityisesti, kun indikaattori on keino pH:n määrittämiseen, on todennäköisyys, että indikaattoriin voi vaikuttaa tai sen voi peittää verisolujen läsnäolo. Kolorimetrisiä indikaattoreita voidaan 10 käyttää tehokkaasti ainoastaan, jos näytteen luonteesta johtuvien virheiden vaikutus värin esiintymiseen voidaan estää.

Keksinnön yhteenveto

Esillä olevan keksinnön kohde on tarjota laite 15 pH-muutosten tai C02-tasojen jatkuvaan tarkkailuun näyt teessä, joka sisältää elatusainetta mikrobiseen kasvuun.

Esillä olevan keksinnön eräs kohde on tarjota laite pH- ja C02-muutosten tarkkailuun suljetun astian sisällä olevasta näytteestä ilman, että mennään astian sisälle 20 tarkkailuprosessin aikana.

Edelleen eräs esillä olevan keksinnön kohde on tarjota pH- tai C02-indikaattori, joka tarjoaa pH- ja C02-ta-sojen jatkuvan osoituksen ja johon ei vaikuta värikompo-nenttien läsnäolo kasvatusväliaineessa.

25 Eräs esillä olevan keksinnön kohde on tarjota ana lyysi pH:n ja/tai C02:n muutoksista jatkuvan tarkkailun pohjalta.

Edelleen eräs esillä olevan keksinnön kohde on tarkkailla sekä pH:n absoluuttista arvoa ja pH-muutoksen 30 nopeutta. Nämä ja muut esillä olevan keksinnön kohteet toteutetaan tarjoamalla laite mikro-organismien läsnäolon tarkkailemiseen kliinisestä näytteestä, kuten verestä tai muista kehon nesteistä, viljelemällä näytettä steriilillä elatusaineella läpinäkyvässä, suljetussa, steriilissä as-35 tiassa. Mikro-organismien läsnäolo määritetään toteamalla 4 - 97548 tai mittaamalla näytteen pH-muutoksia tai C02:n syntymistä näytteessä käyttäen kertakäyttöisiä antureita astian sisäpintaan kiinnitettynä. Tämän keksinnön mukaan mikro-organismit voidaan havaita häiritsevien materiaalien, kuten 5 suurten punaverisolukonsentraatioiden, läsnäollessa ilman radiometrisiä tai sisäpuolelle meneviä keinoja. Silloin kun pH- ja/tai C02-taso näytteessä muuttuu, niin kertakäyttöisen anturin valonheijastus- ja/tai absorboimisominai-suudet muuttuvat vastaavanlaisesti. Anturin heijastusomi-10 naisuuksien muutoksen määrä havaitaan emissiolla ja vas-taanottomekanismilla, joka tuottaa signaaleja laitteeseen näkyvän heijastuksen/absorption määrän ja nopeuden muutoksen tarkkailuun. Nopeus ja määrä analysoidaan sitten mik-robisen kasvun ennustamiseksi ja määrittämiseksi näytekap-15 paleesta tai näytteestä. Anturista voidaan ottaa näyte ja/tai sitä voidaan tarkkailla jatkuvasti tai toistuvasti aikavälein, joka sallii anturin muutosten määrän ja nopeuden yksityiskohtaisten ominaisuuksien keräämisen.

Keksinnön täydellisempi arviointi ja siihen liitty-20 vät monet edut havaitaan selvästi samalla kun ne ymmärretään paremmin seuraavaan yksityiskohtaiseen kuvaukseen viitaten, kun sitä tarkastellaan seuraavien kuvioiden yhteydessä .

Kuvioiden lyhyt kuvaus 25 Kuviossa 1 on poikkileikkaus näyteastiasta ja valo- k detektorij ärj estelystä.

Kuviossa 2 on käyrä, joka esittää ominaista suhdetta anturin heijastuvuuden ja näytteen pH:n välillä.

Kuviossa 3 on käyrä, joka kuvaa ominaisuutta, joka 30 on esimerkinomainen näytteen pH- ja C02-muutoksista, joita E. coli bakteerin kasvu aiheuttaa.

Kuviossa 4 on käyrä, joka kuvaa lukuisten mikro-organismien heijastuvuuden muutosta ajanjakson aikana keksinnön avulla mitattuna.

97548 5

Kuvion 5 käyrä esittää kynnysnopeuden syntymistasoa vakiokaltevuuden funktiona, joka tarkkailee havaitsemisme-netelmiä.

Kuviossa 6 on kaaviomainen lohkokaavio, joka kuvaa 5 esillä olevan keksinnön analyysilaitteen pääkomponentteja.

Kuviossa 7 on perspektiivikuva esillä olevan keksinnön suoritusmuodosta, joka kuvaa kahdeksaa samanaikaisesti tarkkailtua näytettä.

Esimerkinomaisten suoritusmuotojen kuvaus 10 Keksinnön laite ja mekanismi tarjoavat tunkeutumat- tomat keinot mikro-organismien läsnäolon havaitsemiseksi kliinisestä näytteestä, kuten mikro-organismien synnyttämistä metabolisista tuotteista. Näyte laitetaan erityisesti valmistettuun väliaineeseen, joka lisää tiettyjen mik-15 rohisten metabolisten tuotteiden syntymistä. Kuten kuvioissa 1 on kuvattu, asetetaan näyte ja valmistettu väliaine 3 viljelypulloon tai astiaan 1 inkubointia varten.

Astia 1 suljetaan yläosalla, jota ei ole kuvattu.

Ainutlaatuinen kertakäyttöinen anturi tai indikaat-20 tori 2 sijaitsee pullossa 1 sijoitettuna sen sisäseinää vasten. Anturi 2 käsittää kiinteän rakenteen tai membraa-nin, johon viitataan kiinnitys- tai kannatinväliaineena, ja indikaattoriväliaineen kiinnitettynä kannatinväliainee-seen tai sen sisälle. Tällä tavoin anturi 2 sijoitetaan 25 tasaisesti astian 1 sisäpintaa vastaan siten, että indikaattori väliaine on näkyvissä ulkopuolelta ja vahvistettu näytteen soluja, proteiineja tai muita kiinteitä tai läpinäkyviä tai värillisiä komponentteja tai väliainetta vastaan etteivät ne joudu indikaattorin 2 ja astian 1 pinnan 30 väliin. Tämä estää minkä tahansa kohteen tulemisen indikaattorin 2 ja detektorimekanismin 4 ja 5 väliin. Tietyissä suoritusmuodoissa indikaattori 2 erotetaan näytteestä ja sen elatusaine 3 membraanilla tai kiinteällä kerroksella, joka sallii kaasumolekyylien kulun, mutta estää ionien 35 kulun. Tällä tavoin indikaattori 2 altistetaan pH:n tai 97548 6 C02:n muutoksille, kuten haluttiin, mutta ei altisteta suoraan väliaineelle 3.

Kehonestenäytteet, kuten veri, jotka sisältävät niinkin vähän kuin yhden organismin millilitraa kohti, 5 voidaan havaita tätä menetelmää käyttäen. Tällainen näyte edellyttää jopa seitsemän päivän inkubointia ennenkuin organismimiehitys tavoittaa kriittisen tason tai metabo-listen tuotteiden kasvu voidaan mitata. Esillä olevan keksinnön toiminnan kautta on todettu, että 106 CFU/ml kon-10 sentraatio tietyn tyyppisille organismeille tarjoaa mitattavissa olevia pH- ja C02-tasoja. Kaikki organismit osoittivat mitattavissa olevia tuloksia 107 - 10® CFU/ml kon-sentraationa.

Keksintö on ainutlaatuinen ja hyödyllinen monissa 15 suhteissa: (1) mikrobiset metaboliset tuotteet mitataan mieluummin elatusainepullon nestefaasista kuin näytettä ympäröivästä ilmakehästä, (2) ainutlaatuinen kertakäyttöinen anturi 2 kiinni- 20 tetään pullon 1 sisäpinnalle, mittaukset voidaan tehdä pullon 1 läpinäkyvän seinän ulkopuolelta vahingoittamatta pullon 1 eheyttä, (3) ulkoisia mittauksia voidaan tehdä visuaalisella tarkastelulla tai välineellä, joka mittaa mittaamalla an- 25 turin 2 heijastuvuutta, (4) näytteen 3 läpikuultavat tai värilliset komponentit eivät häiritse anturin 2 kykyä havaita ja indikoida muutoksia pH- ja C02-tasoissa, ja ( 5) indikaattorimolekyylien suurta konsentraatiota 30 ylläpidetään pienessä tilavuudessa ts. membraanissa siten, että värimuutos voidaan havaita helposti, (6) anturin 2 havainnointiin voidaan olennaisesti vaikuttaa jatkuvan näytteenoton kautta tiheästi sijoitetuin aikavälein, koska sisään tunkeutuvaa näytteenottoa ei 35 ole eikä astian manipulointia edellytetä, t! 97548 7 (7) pH:n ja C02:n absoluuttisen tason ja muutoksen nopeuden tyypillinen edustaja voidaan johtaa jatkuvasta tarkkailusta.

Ravinnekomponentit, jotka muodostavat kompleksisen 5 mikrobisen väliaineen, vaikuttavat mikro-organismien käyttämään metaboliseen reittiin. Orgaaniset hapot, emäkset ja erilaiset kaasut tuotetaan suhteessa, joka on riippuvainen saatavissa olevista ravinteista. Nämä tuotteet vaihtelevat mikro-organismilajista lajiin. Näitten tuotteiden läsnäolo 10 nestemäisessä väliaineessa voi muuttaa sen pH:n. Keksinnössä käytettävät anturit sisältävät pH-herkkiä indikaattoreita, jotka antavat mitattavissa olevan muutoksen ympäristön pH-muutosta vastaten. Suoritusmuodossa, jossa pH-anturi on suojattu kaasua läpäisevällä, ioniläpäise-15 mättömällä membraanilla, mitataan kaasujen, jotka vaikuttavat indikaattorin pH:hon, kuten C02 tai ammoniakki, läsnäolo. Siten mikrobinen kasvu voidaan havaita joko nestemäisen elatusaineliuoksen pH-muutoksina tai mittaamalla väliaineeseen liuenneita mikro-organismien tuottamia kaa-20 suja. Hiilidioksidi on yleismaailmallinen metaboliitti, jota kaikki organismit tuottavat ja siksi edullinen metaboliitti mikrobisen kasvun havaitsemiseen.

C02- ja pH-antureilla sellaisina kuin ne ajatellaan esillä olevassa keksinnössä on kaksi yhteistä, tavallista 25 komponenttia, molekulaarinen laji, joka on käyttökelpoinen pH-indikaattorina ja kiinnitys-/kannatinväliaine. pH-indikaattori voidaan kiinnittää joko kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti kannatinvällaineeseen. Vaihtoehtoisesti indikaattori voidaan kapseloida polymeerimatriisin sisään, 30 joka läpäisee kaasua, kuten polymeerimatriisin sisään ennen kovetusta emulsifioitu pH-indikaattori. C02-anturilla on kolmas komponentti, puoliläpäisevä aine, joka erottaa indikaattorimembraanin täydellisesti näytteestä ja kasvu-väliaineesta. Nämä anturit on kiinnitetty sopivan läpinä-35 kyvän astian 1 sisälle sopivalla liimalla.

97548 8

Lukuisia erilaisia fluoresoivia ja näkyviä pH-indi-kaattoreita voidaan käyttää aktiivisena molekulaarisena lajina pH- tai C02-antureissa. Tavallisesti ainoat rajoitukset indikaattoreiden valinnassa ovat vaatimukset, että 5 niillä on hyväksyttävän dynaamiset pH-alueet ja antavat aallonpituusmuutoksia jotka ovat selvästi havaittavia olemassa olevilla vastakkaisten pintojen fluoresenssi- tai heijastumissuhdeteknologioilla.

Elatusaineliuosten pH-muutosten havaitsemiseen ole-10 vien keksinnön mukaisten antureiden tulisi antaa fluoresenssi-intensiteetin tai näkyvä värinmuutos noin 5,0 -8,0 pH-alueella.

C02-anturien indikaattorien tulisi antaa fluoresenssi-intensiteetin tai näkyvä värinmuutos noin 10,0 -15 6,0 pH-alueella C02-konsentraatioiden havaitsemiseksi.

Vain tietyt pH-indikaattorimolekyylit voivat sitoutua kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti kannatinväliai-neeseen ja säilyttää pH:ta osoittavat ominaisuutensa. Löysimme käyttökelpoisia indikaattoreita, jotka kuuluvat 20 ksanteeni-, fenoliftaleiini- ja fenolisulfoniftaleiiniryh-miin, jotka ovat hyödyllisiä.

Kiinnitys-/kannatinväliaine voi olla sellainen aine, kuten selluloosa, johon pH-indikaattori voidaan kiinnittää kovalenttisesti orgaanisia reaktioita käyttäen.

25 pH-indikaattorien ei-kovalenttinen kiinnitys voidaan aikaansaada käyttäen ionisia kannatinmateriaaleja, kuten nailonmembraaneja, joilla on positiivinen tai negatiivinen zeta-potentiaali. Muita ionisia kannatinmateriaaleja, joita voidaan käyttää, ovat positiivisesti tai negatiivisesti 30 varatut ioniset hartsit, kuten dietyyliaminoetyylihartsit (DEAE) tai (DEAE) -selluloosa. Kannatinmateriaalin esikäsittelyä proteiinilla saatetaan tarvita, jos indikaattori-membraanin on oltava suoraan kontaktissa mikrobisen ela-tusaineen kanssa.

97548 9 pH-indikaattorianturit havaitsevat suoraan pH-muu-toksia mikrobisen elatusaineen pH-ympäristöstä johtuen.

Nämä anturit voidaan kuitenkin tehdä kaasuille (esim. hiilidioksidille tai ammoniakille) nestemäisessä elatusai-5 neessa valinnaisesti reagoiviksi päällystämällä ne valinnaisesti puoliläpäisevällä yhdisteellä tai mebraanilla, kuten silikonilla, lateksilla, teflonilla tai erilaisilla muoveilla, joita luonnehtii kapasiteetti, joka sallii samalla kaasun diffuusion valikoivasti, kun ionien ja nes-10 teen kulku estetään. Antureissa, jotka käsittävät polymee-rimatriisiin kapseloidun indikaattorin, matriisin muodostava polymeeri voi toimia puoliläpäisevänä vallina, joka sallii kaasujen kulun, mutta ei ionien.

Kapseloidussa indikaattorisuoritusmuodossa C02-antu-15 ri koostuu visuaalisesta tai fluoresoivasta pH-indikaattorista, joka on reaktiivinen pH-alueella 6 pH - 10 pH, nat-riumhydroksidissa tai samanarvoisessa emäksessä, joka ylläpitää optimaalisen pH-ympäristön C02:n havaitsemiseksi, glyserolista tai samanarvoisesta emulgoimisaineesta, joka 20 voi tuottaa indikaattoriliuoksen, joka on emulsifioitu kovettamattoman polymeerin sisälle tai kovettamattoman polymeerin, kuten huoneenlämpötilan RTV valkoisen siliko-nin sisälle, joka ylläpitää sopivan ympäristön indikaattorille, misellejä. Mitä tahansa polymeeriä, joka ei vaikuta 25 indikaattorin kemialliseen aktiivisuuteen, voidaan käyt tää, johtuen joko sen omista kemiallisista tai fysikaalisista ominaisuuksista tai sen edellytyksistä kovettami-seen, niin kauan kuin se on kaasuja läpäisevä, mutta ei ioneja läpäisevä eivätkä nämä sen ominaisuudet muutu, kun 30 se altistetaan steriloimiselle autoklaavikäsittelyssä.

Valmistetaan emulsio neljästä ylläolevasta komponentista ja polymeeri kovetetaan puoliläpäisevän matriisin, joka sallii valinnaisen C02:n ja muiden kaasujen diffuusion nestemäisestä mikrobisestä elatusaineesta, muodos-35 tamiseksi pH-indikaattorin misellien ympärille, joka joh- 97548 10 taa Indikaattorin mitattavaan altistukseen mitattavan visuaalisen muutoksen antamiseksi indikaattori väri in. Anturi 2 voidaan valmistaa erikseen ja liimata elatusainepullon sisäpintaan tai vaihtoehtoisesti anturi 2 voidaan muodos-5 taa pullon pohjalle ja kovettaa paikan päällä. Kovettami-sen jälkeen anturilla varustettu pullo steriloidaan esimerkiksi autoklaavikäsittelyllä. Lukuisia ominaisia esimerkkejä pH- ja C02-antureista on annettu rinnakkaishake-muksessa US-patenttijulkaisussa 07/168 291, jätetty maa-10 liskuun 15, 1988, joiden määrittely on sisällytetty tähän viittein. Spesifisiä pH- ja C02-indikaattoreita ei ole tässä kerrottu yksityiskohtaisesti yllä olevaa kuvausta enempää. Antureiden on annettava visuaalisesti havaittava viite pH-tai C02-muutoksista, jotta ne vuorovaikuttavat kun-15 nolla alla kuvatun välineen tai laitteen kanssa.

Vastaavasti elatusainekaavioinnit on kuvattu rin-nakkaishakemuksessa nro 07/168 291 ja siksi sitä ei kuvata tässä yksityiskohtaisemmin.

Kuvio 1 kuvaa elatusaineastian 1 poikkileikkausta 20 näytteen ja väliaineen 3 ollessa sisällä ja anturin 2 kiinnitettynä sen pöhjapintaan. Astia 1 on kuvattu sijoitettuna korokkeelle 7, jossa on aukko 8, jonne valodetek-tori 5 on sijoitettu, ja aukko 9, jonne emitter! 4 on sijoitettu.

25 Sekä emitteri 4 että detektori 5 on kytketty ana- lyysilaitteeseen 6, joka on kuvattu yksityiskohtaisemmin kuviossa 6.

Astiat 1 ovat tavallisesti muodoltaan sylinterimäi-siä, kuten kuviossa 7 on esitetty, ja mahtuvat substraatin 30 7 yläpinnan aukkoihin 10. Astiat 1 säilytetään suojaisasti aukkojen 10 sisällä käyttäen elastista pakkausmateriaalia 12. Aukkojen 10 sisäosat on vuorattu pakkausmateriaalilla 12, joka painautuu elastisesti astian 1 sisäseiniä vastaan, kun se sovitetaan aukkoihin. Tämä tiivistys on tar-35 koitettu estämään astiaa 1 putoamasta aukoista 10 subs- 97548 11 traatln 7 liikkeen aikana, kuten alla on kuvattu. Emitteri 4 ja detektori 5 on kiinnitetty suhteelliseen kulmaan a antamaan indikaattorilta 2 heijastuneen valon optimaalisen vastaanoton. Kuvatussa edullisessa suoritusmuodossa kulma 5 a on 45 astetta, kuitenkin muut suhteelliset kulmat lähellä 45 astetta antavat hyväksyttäviä tuloksia. Edullisen alueen 30 - 60 asteeseen on todettu olevan optimaalinen antamaan parhaimman heijastuvuustehokkuuden.

Emitteri 4 ja detektori 5 täytyy sijoittaa sopivaan 10 suhteelliseen kulmaan ja sopivaan kulmaan suhteessa indikaattoriin 2 siten, että valo ei heijastu pois astian 1 ulkopuolelta, mutta saavuttaa indikaattorin 2 heijastuakseen siitä. Detektori 5 on edelleen suojattava suoralta emitterin 4 säteilytykseltä epätarkkojen lukemien estä-15 miseksi.

Kuvio 7 kuvaa esillä olevan keksinnön yhtä esimerkinomaisen suoritusmuodon kokonaisrakennetta. Kuten kuviosta 7 voidaan nähdä, on perusosassa 7 sylinterimäisiä rakoja 10 näytepullojen 1 majoittamiseksi. Eri määrä pul-20 loja 1 voidaan sijoittaa rakoihin 10 substraatissa tai perustassa 7. Perusta 7 on kiinnitetty sellaisella tavalla, että sitä voidaan heiluttaa heilutusmoottorilla 26 ja siihen kiinnitetyllä heilutusmekanismilla 28. Heilutus on välttämätöntä seoksen täristämiseksi kunnolla ja sekoitta-25 miseksi pulloissa 1 kunnollisen mikrobakteerisen kasvun edistämiseksi. Perustaa lämmitetään myös kuumentimilla 30, jotka on kiinnitetty perustaan, tai sulkemalla perusta kokonaan kontrolloidussa inkubointilaitteessa. Kukin raoista 11 käsittää emitterin ja detektorin anturien 30 valottamiseksi sopivasti ja heijastuneen luminesenssin havaitsemiseksi.

Kuten alla on yksityiskohtaisesti selitetty, kutakin pulloa 1 voidaan tarkkailla toisistaan riippumatta rakoihin, johon kuhunkin kukin pullo on laitettu, liitet-35 tyjen detektorien valittujen ulostulolukemien avulla. Täi- 97548 12 lä tavalla tietokone 20 voi tarkkailla lukuisia näytteitä samanaikaisesti ottamalla näytelukema kustakin näytteestä, kuten toivotaan ennalta määritetyllä halutulla näytteenottotaajuudella ja arvioimalla kunkin näytteen mikrobaktee-5 rista kasvun edistymistä, kuten tässä alla kerrotaan yksityiskohtaisemmin.

Kuviossa 6 on kytkentäkaavio, joka kuvaa signaalin vastaanottoa ja kuvioissa 1 ja 7 kuvatun signaalianalyysi-laitteen 6 käsittelyosuutta. LED'it Dll -D18 on tehoistet-10 tu Zener-stabiloidulla vakiovirtalähteellä 14. Virtalähde käsittää transistorin Q1 operationaalisen amp opi 7 ja Zener-diodin D9. Virtalähde 14 tarjoaa vakaan valotuksen LED'eille 11 - 18 säteilytysdiodin vastaanottimen Dl - D8 kautta.

15 LED'it D10 - D18 ovat kuviossa 1 kuvatun valoemit- terin 4 edustajia ja kuviossa 1 kuvatun valodetektorin 5 edustaja.

Kuvioissa 6 ja 7 on kahdeksan substraattiin 7 kiinnitettyä diodia, joista on kuvattu neljä. Esimerkinomainen 20 suoritusmuoto kuvaa kahdeksaa valoemitteriä, kahdeksaa detektoria ja kahdeksaa samansuuntaista kytkentäpolkua, tämä on ainoastaan esimerkinomaista tarkoitusta varten ja mitä tahansa emitterien ja detektorien parien määrää voidaan käyttää arvioitavien näytteiden lukumäärästä riippu-25 matta yksittäiskäsittelylaitteella 6.

Kuvatut valodiodit Dl - D8 voivat esimerkiksi olla VTP 5051 valodiodeja EGG Vactech'iltä, St. Louis, Missouri. Mitä tahansa vastaavaa valodiodia, joka kykenee herkkään havaitsemiseen tietyllä spektrialueella, voidaan 30 käyttää. Muita valodiodeja, jotka kykenevät havaitsemaan sähkömagneettisen spektrialueen muilla alueilla, voidaan käyttää, jos valoemitterit 4 on suunniteltu siten emittoimaan sillä spektrin alueella ja anturi 2 on suunniteltu antamaan heijastuvuusominaisuuksia tällä spektrin eri 35 alueella vastaten pH- ja C02-tuotannon muutoksia.

97548 13

Kunkin diodin ulostulo vahvistetaan matalan offsetin omaavalla operaatiovahvistinparilla, joka on järjestetty aliohjaavaan (low drive) kääntävään rakenteeseen.

Tämä rakenne on kuvattu piirin osuudella, joka on merkitty 5 16 kuviossa 6.

Operaatiovahvistimien ulostulot moninkertaistetaan limittimellä (multiplexer) MUX08 yksittäisillä ulostulo-linjoilla 18. Tällä tavalla minkä tahansa yksittäisen diodin Dl - D8 ulostulo voidaan valita tarkkailtavaksi tai 10 analyysiä varten. Kolmen bitin osoitteen antaman osoite-linjan AO - A2 kautta tietokone 20 voi valita halutun diodin ulostulon luettavaksi DRN-linjalla 8 limittimeltä MUX08. Limittimestä tuleva signaali alipäästösuodatetaan sitten passiivisesti ja vahvistetaan ja annetaan analogi-15 signaalin ulostulona tietokoneelle 20. Tämä ulostulo- päätteen 22 analogisignaali voidaan ensin muuntaa digitaaliseksi signaaliksi ja sitten kuljettaa tietokoneen sisäänmenopäätteeseen 24 tai se voidaan kuljettaa suoraan tietokoneelle analogisignaalina.

20 Tietokoneessa 20 kootaan erilaisten detektorien ulostulot, ja kehitetään kuviossa 5 esitettyjen erilaisten näytteiden pH- ja C02-konsentraatioiden muutosten määrän ja nopeuden ominaiset käyrät. Tietokone suorittaa myös tarvittavat analyysit syntyneiden ominaisuuksien analysoi-25 miseksi ja syntyvän mikrobisten elatusaineiden läsnäolon tai puuttumisen määrittämiseksi, kuten tässä alla kuvataan.

Alla kuvataan kuvion 5 käyrään viitaten esillä olevan keksinnön analyysitekniikan edut verrattuna saatavilla 30 oleviin tekniikan tason analyysitekniikkoihin tai visuaaliseen tarkasteluun.

Kuvion 5 ensimmäisessä käyrässä C02:n absoluuttitaso on kuvattu ajan funktiona mukaanlukien C02:n kynnysenergia-taso, jota voitaisiin käyttää määrittämään oliko mikrobis-35 ta epäpuhtautta läsnä. Liuoksen absoluuttinen C02-konsen- 97548 14 traation arvo määritetään indikaattorin 2 värin muutoksena analyysin avulla astian 1 sisällä. Olisi huomattava, että kehon nesteet, kuten veri, osoittavat oman C02-tuottonsa, joka nähdään tasaisesti nousevina tasoina kaikissa kolmes-5 sa käyrässä. Tämän taustatuotteen suuruus vaihtelee suuresti näytekohtaisesti. Tunnukset A, B ja C edustavat esimerkinomaisia mikrobisia kasvuja. Tunnus A kuvaa tausta-tuotteen suurta tasoa, mutta ei mikrobista kasvua. Se ylittää kynnyksen ja siksi sitä pidettäisiin positiivisena 10 tekniikan tason analyysitekniikassa, mutta se olisi virheellisesti positiivinen. Tunnus B kuvaa keskinkertaista taustatasoa ja voimakkaasti näkyvää kasvua. Koska myös tunnus B ylittää kynnystason, sitä pidettäisiin todellisesti positiivisena. Nämä voidaan havaita jaksollisilla 15 näytteenottotekniikoilla, joissa on merkittävä aikaviive näytteenoton välillä, koska C02-taso jää kynnystason yläpuolelle merkittäväksi ajaksi. Tunnus C kuvaa alhaisen taustatuotannon ja huonon kasvun yhdistelmää, mikä johtaa virheellisesti negatiiviseen tekniikan havaintoanalyy-20 seissä.

Toinen käyrä II kuvaa ensimmäisen käyrän datan derivaattaa tai COz-tuotannon nopeutta. Voidaan havaita, että nopeus A on suuri, mutta alituisesti laskeva; että B:n keskinkertainen, joka kasvaa mikrobisen kasvun hetkellä; 25 ja C alhainen, mutta jälleen kasvaa mikrobisen kasvun hetkellä.

Kolmas käyrä III kuvaa ensimmäisen käyrän datan toista derivaattaa ja kasvun kiihtymistä. Tässä tunnus A kuvaa alituisesti negatiivista kiihtymistä, jossa B ja C 30 osoittavat voimakkaasti postiivisen kiihtymisen jaksoja. Käyrien vertailussa voidaan havaita, että vaikka näytteen A C02-arvo nousee kynnysarvon yläpuolelle käyrässä I, se ei omaa merkittävää kaltevuuden muutosta käyrässä II ja siksi ei kiihtyvyyttä käyrässä III. Voidaan havaita, että käy-35 rässä III kaksi todellista positiivista näytettä B ja C

11 97548 15 osoittavat positiivisia ominaisuuksia, joita näytteessä A ei ole.

Tunnus C kuvaa mikrobista kasvua, joka ilmaisee hitaampaa C02:n syntymisnopeutta, mikä voi johtua lukuisis-5 ta tekijöistä. Tällä hetkellä tekniikan tason näytteenot-totekniikoiden tai esillä olevan keksinnön indikaattorin 2 visuaalisen tarkastelun kautta tämä näyte määritettäisiin negatiiviseksi, mikä saattaisi olla virheellisesti negatiivinen. Tämä johtuu tosiasiasta, että näytteen C abso-10 luuttinen C02-arvo ei koskaan nouse kynnysarvon yläpuolelle, joka tarvitaan osoittamaan positiivista lukemaa. Jos alla kuvatun esillä olevan keksinnön näytteenottoa, analyysia ja arviointitekniikkaa kuitenkin hyödynnetään, tämä todellinen mikrobakteerinen kasvu, vaikka ei riittävä nos-15 tamaan näytteen C02 käyrän I kynnystason yli, havaittaisiin positiiviseksi bakteeriseksi läsnäoloksi ja siksi todella positiiviseksi.

Esillä olevan keksinnön tietokone 20 voidaan asettaa lukemaan osoitettua C02-arvoa minkä tahansa annetun 20 ajanjakson välein. Kun esimerkiksi käytetään kymmenen minuutin näytteenottoväliä lukemien välillä, niin tietokone ohjaa limittäjää MUX08 antamaan lukemia sopivasta anturin ulostulosta kymmenen minuutin välein. Tietokone lukee ja nauhoittaa lukeman. Tietokone ottaa toisen lukeman kymme-25 nen minuutin jälkeen ja nauhoittaa arvon.

Sen jälkeen kun kuusi ajanjaksoa on saavutettu, otetaan seitsemäs aika ja sen jälkeen ensimmäinen aika poistetaan. Tietokone jatkaa päivittämistä tällä tavalla pudottaen vanhimman näytteen ja lisäten uusimman siten, 30 että joka kerta tietokoneessa on yhden tunnin jakso dataa käsillä.

Tietokone 20 käyttää näitä näytteitä jatkuvaan kunkin vierekkäisen pH-lukemaparin yhdistävän käyrän kaltevuuden määrittämiseen ja siksi osoittaa "hetkellisen" kal-35 tevuuden arvon kunkin vierekkäisen kymmenen minuutin ajan 97548 16 lukeman välissä. Tätä käyrää verrataan edellisen ajan käyrään ja edeltävien aikojen käyriin, jotka muodostavat kokonaisuudessaan kuusi ajanjaksoa tai tunnin. Tämä varustaa tietokoneen käyrissä II tai III esitetyillä nopeuden ja 5 kiihtyvyyden arvoilla.

Käyrää esillä olevasta kymmenminuuttisesta näyt-teen-ottoajasta voidaan verrata yksistään viimeisen ajan käyrään tai sitä voidaan verrata viimeisen viiden ajan käyriä vasten painotetulta pohjalta. Tietokone etsii posi-10 tiivistä kiihtyvyyttä, kuten kuvion 5 piirroksen III kuvaamiin käyriin B ja C. Positiivisen kiihtyvyyden ajankes-toa tarkkaillaan ja kiihtyvyyden on pysyttävä positiivisena pitemmän aikaa kuin mitä voitaisiin lukea laitteiston virtausten tai muun taustan sekaantumisen ansioksi. Esi-15 merkiksi ajanjakso tx käyrässä III on riittämätön, kun taas ajanjakso t2 on riittävä.

Tämä analyysimetodi on edullinen siinä, että molemmat näytteet B ja C, jotka ovat positiivisia bakteeriselta kasvultaan, havaitaan esillä olevalla keksinnöllä. Tämä 20 analyysikaavio ei ole riippuvainen näytteeseen syntyneen C02 absoluuttisesta arvosta, vaan on riippuvainen ainoastaan C02 kasvun nopeuden muutoksesta, jonka on todettu olevan biologisten näytteiden luotettavamman indikaattorin kuin kynnysarvon ylittäminen C02 absoluuttisella arvol-25 la.

Tämä analyysimetodi on ainoastaan saavutettavissa laitteen ja esillä olevan keksinnön opetuksen kautta, mikä sallii jatkuvan tarkkailun ja lähekkäin sijoitetun näytteenoton ja tarjoaa riittävän herkän indikaattorin 2 sal-30 liakseen suuren tarkkuuden C02-lukemien havaitsemisen.

Tällä laitteella tarkkaillut anturit sisältävät indikaattoreita, jotka muuttavat väriään, kun läsnä on kasvua ja metabolisoivia mikrobeja, ja synnyttävät joko pH- tai C02-muutoksen. Vaikka värimuutokset voivat olla 35 ilmeisiä paljain silmin, tarjoaa laitteiston 6 käyttö mit- il 97548 17 tausten objektiivisuuden, herkkyyden tai jatkuvuuden etuja. Edullisessa suoritusmuodossa valoemitteri ja detektori varustetaan kuhunkin anturiin. Muita vaihtoehtoja on kuitenkin saatavana kaikkien näytteiden jatkuvan tarkkailun 5 sallimiseksi. Nämä vaihtoehdot käsittävät hyödyntäviä keinoja kunkin näytepullon muuttamiseksi yhden tai useamman stationaarisen detektorin ohi tai yhden tai useamman detektorin muuttamiseksi stationaaristen pullojen ohi.

Yllä kuvatussa edullisessa suoritusmuodossa hyödyn-10 netään kiinteitä valolähteitä ja detektoreita; kuitenkin voitaisiin myös käyttää valkohehku- tai kaarilamppusätei-lylähteitä, ja peilejä, linssejä, optisia kuituja ja muita keinoja valon ohjaamiseen indikaattorille pullon sisälle heijastusta varten havaintokeinoina, mikä olisi ilmeistä 15 alaa taitaville esillä olevan keksinnön osoittamisen jälkeen.

Claims (28)

97548 Patentt ivaat inukset

1. Väline mikrobisen kasvun tarkkailemiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että se käsittää: 5 suljettavan, steriloitavissa olevan astian, jossa on sisäinen kammio, jossa näytettä viljellään steriilissä elatusaineessa, ja astiassa on vähintään yksi läpinäkyvä osa; steriloitavissa olevan astian läpinäkyvässä osassa 10 sijaitsevan indikaattorin, indikaattori välineen osoittaessa muutoksen sen mitattavissa olevissa ominaisuuksissa, jotka ovat havaittavissa läpinäkyvän osan kautta altistettaessa mikrobisen kasvun metaboliiteille, jolloin indi-kaattorivälineen muutoksia voidaan tarkkailla astian ulko-15 puolelta läpinäkyvän osan kautta tarkkaillen täten mikrobista kasvua ilman, että mennään astian sisään sulkemisen jälkeen; emitterivälineen emitterisignaalin, joka on vuorovaikutuksessa vähintään yhden indikaattorivälineen mitat-20 tavissa olevan ominaisuuden kanssa, emittoimiseen, jolloin syntyy indikaattorisignaali ja joka emitteriväline on sijoitettu indikaattorivälineen suhteen siten, että emitte-risignaali osuu indikaattorivälineeseen läpinäkyvän osan kautta; 25 detektorivälineen indikaattorivälineen suhteen si joitettuna indikaattorisignaalin vastaanottamiseksi indi-kaattorivälineestä läpinäkyvän osan kautta ja sitä vastaavan detektorisignaalin tuottamiseksi; käsittelyvälineen detektorisignaalin vastaanottami-30 seksi ja detektorisignaalin käsittelemiseksi indikaattorin mitattavien ominaisuuksien muutosten tai suuruuden arvioimiseksi ja siten mikrobisen kasvun tarkkailemiseksi suljetussa astiassa sen jälkeen kun astia on suljettu. 97548

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että käsittelyväline detektorisignaalin vastaanottamiseksi on piiriväline.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, t u n -5 n e t t u siitä, että emitteriväline käsittää valoa emittoivan diodin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen väline, tunnettu siitä, että detektoriväline käsittää valoa emittoivan diodin emission aikaansaaman indikaattorisig- 10 naalin vastaanottavan valodiodin.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen väline, tunnettu siitä, että käsittelyväline detektorisignaalin vastaanottamiseksi käsittää stabiloidun virtalähteen valoa emittoivaa diodia varten.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen väline, tun nettu siitä, että piiriväline käsittää: tietokonevälineen detektorisignaalin vastaanottamiseksi valittujen ajanjaksojen välein ja detektorisignaalin ominaisuuksien mahdollisten muutosten vertailemiseksi ku- 20 nakin ajanjaksona.

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen väline, tunnettu siitä, että piiriväline käsittää tietokonevälineen detektorisignaalin jaksolliseen näytteenottoon, detektorisignaalin näytteiden vertailemiseksi ja näytteiden 25 muutosasteen laskemiseksi.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että se käsittää välineet mainitun in-dikaattorivälineen mitattavissa olevien ominaisuuksien muutosasteen havaitsemiseksi ja mainitun muutosasteen kes- 30 toajan mittaamiseksi.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että indikaattoriväline käsittää mem-braanin ja indikaattoriväliaineen indikaattoriväliaineen osoittaessa havaittavissa olevan muutoksen mikrobisille 35 metaboliiteille altistettaessa. 97548

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen väline, tunnettu siitä, että membraani on suljettu astian sisäseinälle.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, t u n -5 n e t t u siitä, että indikaattoriväline asetetaan astian sisäseinää vasten ja indikaattoriväline käsittää membraa-nin, joka erottaa indikaattorivälineen elatusaineesta.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että metaboliitti on C02.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tun nettu siitä, että indikaattoriväline käsittää pHihon reagoivan kemiallisen aineen.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnettu siitä, että mitattavissa oleva ominaisuus vali- 15 taan ryhmästä, joka koostuu valon absorbanssi-, fosfore-senssi-, valonsironta-, heijastuvuus-, fluoresenssi- ja valon heijastuskykyominaisuuksista.

15. Patenttivaatimuksen 8 mukainen väline, tunnettu siitä, että se edelleen käsittää välineen indi- 20 kaattorivälineen mitattavissa olevan ominaisuuden muutok-. sen kiihtyvyyden havaitsemiseksi.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen väline, tunnettu siitä, että se mittaa myös kiihtyvyyden keston.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, t u n - 25. e t t u siitä, että se edelleen käsittää välineen de- tektorisignaalin suuruuden keston mittaamiseksi.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen väline, tunnettu siitä, että se mittaa myös detektorisignaalin suuruuden keston.

19. Menetelmä mikrobisen kasvun havaitsemiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: otetaan steriloitavissa oleva astia, jossa on vähintään yksi läpinäkyvä osa sen seinässä ja indikaattori- 35 väline, joka muuttuu, kun se altistetaan mikrobisen kasvun metaboliiteille astiassa läpinäkyvän osan alueella; u 97548 otetaan emitteriväline emitterisignaalin, joka on vuorovaikutuksessa indikaattorivälineen ainakin yhden mitattavissa olevan ominaisuuden kanssa, emittoimiseksi, jolloin syntyy indikaattorisignaali, ja joka emitteriväli-5 ne sijoitetaan indikaattorivälineen suhteen siten, että emitterisignaali osuu indikaattoriin läpinäkyvän osan kautta; otetaan detektoriväline, joka sijoitetaan indikaattorivälineen suhteen indikaattorisignaalin vastaanottami-10 seksi indikaattorivälineestä ja vastaavan detektorisignaa- lin tuottamiseksi siitä; otetaan käsittelyväline detektorisignaalin vastaanottamiseksi ja detektorisignaalin käsittelemiseksi indikaattorivälineen mitattavien ominaisuuksien muutoksen tai 15 suuruuden arvioimiseksi; näyte asetetaan steriileissä olosuhteissa astiaan; näyte inkuboidaan astiassa; ja havaitaan detektorisignaalin muutos tai suuruus, täten havaiten mikrobinen kasvu suljettavassa pullossa sen 20 jälkeen, kun astia on suljettu.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: vastaanotetaan detektorisignaali valittujen ajanjaksojen välein; ja 25 verrataan detektorisignaalin ominaisuuksien muutok sia aikavälien aikana.

21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: otetaan detektorisignaalinäytteitä; 30 verrataan detektorisignaalin peräkkäisiä näyttei tä; ja lasketaan peräkkäisten näytteiden muutosasteen kasvunopeus . 97548

22. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen seuraa-vat vaiheet, joissa: havaitaan detektorisignaalin muutosaste; ja 5 mitataan asteen kesto.

23. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mitattavissa oleva ominaisuus valitaan ryhmästä, joka koostuu valon absorbanssi-, fosforesenssi-, valonsironta-, heijastuvuus-, fluoresens- 10 si- ja valon heijastuskykyominaisuuksista.

24. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se edelleen käsittää vaiheet, joissa tarkkaillaan muutosta indikaattorivälineen mitatta-15 vissa olevissa ominaisuuksissa detektorivälineellä vähin tään yhdellä ajanvälillä; lasketaan mitattavissa olevan ominaisuuden muutosaste, jonka avulla ominaisuuden ensimmäinen derivaatta määritetään; ja 20 analysoidaan mitattavan ominaisuuden ensimmäisen derivaatan suuruus mikrobien läsnäolon osoittamiseksi näytteestä.

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se edelleen käsittää vaiheet, 25 joissa: lasketaan mitattavissa olevan ominaisuuden toinen derivaatta; ja analysoidaan mitattavissa olevan ominaisuuden toisen derivaatan suuruus, täten varmistaen mikrobien läsnä-30 olo näytteessä.

26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää edelleen vaiheet, joissa: mitataan toisen derivaatan kesto tietyllä suuruus-35 tasolla. ti 97548

27. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mitattavissa oleva ominaisuus valitaan ryhmästä, joka koostuu valon absorbanssi-, fosforesenssi-, valonsironta-, heijastuvuus-, fluoresens- 5 si- ja valon heijastuskykyominaisuuksista.

28. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheen, jossa mitataan mitattavissa olevan ominaisuuden suuruus mikrobien läsnäolon osoittamiseksi näytteestä. 97548