DK176223B1 - Apparat til detektion af mikroorganismer - Google Patents

Description

DK 176223 B1

Opfindelsen har relation til fremgangsmåder og apparater til detektion af bakte-5 riel dyrkning i en prøve. Opfindelsen angår især et elektronisk apparat til detektion af dyrkning af mikroorganismer i en prøve ved overvågning af et indikatorelement, der udsættes for prøven under dyrkningen.

Mikrobiel forurening i en klinisk prøve bestemmes konventionelt ved at dyrke 10 prøven under tilstedeværelse af næringssubstrater og ved detektion af mikrobiel aktivitet gennem ændringer i prøven eller i atmosfæren over prøven efter en tidsperiode. Ifølge US patent nr. 4.182.656, er prøven f.eks. anbragt i en beholder med et dyrkningsmedium omfattende et carbon 13 gæringsdygtigt substrat.

Efter forsegling af beholderen, og efter at prøven er blevet udsat for forhold, der 15 fører til biologisk aktivitet, er forholdet mellem carbon 13 og kendt carbon 12 i gasatmosfæren over prøven bestemt og sammenlignet med begyndelsesforholdet. US patent nr. 4.152.213 angår en fremgangsmåde, ved hvilken tilstedeværelsen af oxygenforbrugende bakterier i en prøve bestemmes i en forseglet beholder ved at detektere en reduktion i oxygenmængden i atmosfæren over 20 prøven gennem en overvågning af gassen i beholderen. US patent nr. 4.073.691 anviser en metode til bestemmelse af tilstedeværelsen af biologisk aktive midler omfattende bakterier i en forseglet beholder indeholdende et dyrkningsmedium ved måling af ændringer i karakteren af den gasfomnige atmosfære over prøven efter en tidsperiode.

25

En metode til ikke-indtrængende detektion af C02-ændringer i den gasformige atmosfære er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 83106468.6. Metoderne og apparaterne beskrevet i disse publikationer kræver hver især en radiometrisk metode eller indtrængning i den forseglede beholder til måling af 30 ændringer i gasatmosfæren efter dyrkning eller kræver, at beholderen fremstilles af specielle materialer, der muliggør en uhindret passage af infrarødt lys.

2 DK 176223 B1 EP-A-0301699 referer til detektion af mikrobiel vækst i en prøve i konventionelle mikrotiterplader. Detektionen af metabolisk aktivitet er baseret på måling af farveændringer eller andre egenskaber, der påvirker reflektansen af prøven i selve 5 prøven.

US-A-4.456.380 angår en fremgangsmåde til identifikation af bakterier i en prøve i konventionelle kulturplader baseret på specifikke farvereaktioner af bakterierne med reagenser indeholdt i enkeltcellerne af pladerne. Metoden producerer 10 ikke et kvantitativt signal.

Andre kendte metoder til måling af mikrobiel forurening af en prøve, især blodkulturer, indbefatter en måling af små ændringer i temperatur, pH, uklarhed, farve, bioluminescens og impedans. Generelt bestemmer disse metoder den mi-15 krobiologiske forurening ved detektion af bakterielle metaboliske biprodukter. Mikrobiel forurening kan også vurderes ved subkulturdannelse og/eller farve-bejdsning. Af disse metoder giver kun impedans radiometri og infrarød spek-trometri mulighed for automatiseret behandling af en klinisk prøve. Bortset fra impedans- og infrarøde målinger kræver disse metoder også, at man trænger 20 ind i beholderen for at udføre en måling på væskeprøven eller den gasformige atmosfære over prøven.

Ud over sandsynligheden for forurening og, at der opstår mulighed for ændring af sammensætningen af atmosfæren over prøven, hver gang der foretages en 25 bestemmelse, muliggør disse metoder ikke, at der kontinuerligt eller på enkel måde udføres målinger over korte tidsintervaller inden for en udvidet tidsperiode. Dette er en væsentlig ulempe, idet væksthastighederne af forurenende organismer er forskellige afhængigt af organismen og antallet af organismer i den oprindelige prøve således, at det ikke kan forudsiges, hvornår der i en forurenet 30 prøve vil kunne vises detekterbare ændringer i atmosfæren eller fluidumprøven.

Hvis forureningen bestemmes ud fra ændringer i pH-værdien i væskeprøven, vil forskellige metaboliske produkter desuden kunne påvirke pH-værdien af prøven 3 DK 176223 B1 forskelligt. For eksempel vil produktionen af ammoniak hæve pH-værdien, medens produktionen af C02 vil sænke denne. Forskellige dyrkningshastigheder af forskellige forurenende mekanismer kan resultere i en forøgelse af pH-værdien 5 til et tidspunkt og en sænkning af pH-værdien til et andet tidspunkt. Denne variable hævning/sænkning vil ikke blive detekteret, hvis pH-værdien måles ved vidt adskilte intervaller. En anden kilde til fej! under detektion af ændringer ved pH målinger i hele blodprøver, især når en indikator er midlet til pH-bestemmelse, er sandsynligheden for, at tilstedeværelsen af indikatoren kan 10 påvirkes eller tilsløres af tilstedeværelsen af blodceller. Kolorimetriske indikatorer vil kun kunne udnyttes effektivt, hvis fejl forårsaget af naturen af prøven ikke vil kunne påvirke forekomsten af farvestoffet.

Formålet med opfindelsen er at tilvejebringe et apparat for kontinuerlig over-15 vågning af ændringer i pH- eller C02-niveauerne i en prøve indeholdende en kultur for mikrobiel dyrkning. Det er især tilsigtet at tilvejebringe et apparat for overvågning af pH- eller C02-ændringer i en prøve i en forseglet beholder, uden at trænge ind i prøven under overvågningsprocessen.

20 Det er desuden tilsigtet at tilvejebringe en pH og/eller C02-indikator, der tilvejebringer en kontinuerlig indikation af pH- eller C02-niveauerne og er upåvirket af tilstedeværelsen affarvede bestanddele i dyrkningsmediet.

Det et yderligere tilsigtet at anvise en analyse af variansen i pH og/eller C02 på 25 en kontinuerligt overvåget basis.

Det er yderligere tilsigtet at overvåge både den absolutte pH-værdi og ændringshastigheden af pH-værdien. Disse formål er ifølge opfindelsen opnået ved, at tilvejebringe et apparat til overvågning af mikrobial vækst i en prøve om-30 fattende en forseglelig steriliserbar beholder med et indre kammer, i hvilken prøven dyrkes i et sterilt kulturmedium, hvilken beholder har i det mindste én transparent sektion, steriliserbart indikatororgan lokaliseret i beholderen i området af den transparente sektion, hvilket indikatororgan udviser en målelig æn- 4 DK 176223 B1 dring i afhængighed af en pH ændring i dets omgivelser, og som kan detekteres via den transparente sektion ved udsættelse for metabolitter af mikrobial vækst, hvorved ændringer i indikatororganet kan overvåges fra det ydre af beholderen gennem den transparente sektion for derved at overvåge mikrobial vækst uden 5 indtrængning i beholderen efter forsegling, et emitterorgan for emission af et emittersignal, der vekselvirker med i hvert fald én målelig egenskab af indikatororganet, hvorved der tilvejebringes et indikatorsignal, hvilket emitterorgan er positioneret i forhold til indikatororganet, således at emittersignalet rammer indikatororganet via den transparente sektion, et detektororgan anbragt i forhold til 10 indikatororganet for modtagelse af indikatorsignalet fra indikatororganet via den transparente sektion for frembringelse af et dertil svarende detektorsignal, signalbehandlingsorganer for modtagelse af detektorsignalet og signalbehandling af dette for at evaluere størrelsen af den målelige egenskab af indikatororganet til et givet tidspunkt og sammenligne størrelsen af signalet med størrelsen til et 15 andet tidspunkt og derigennem overvåge mikrobial vækst i den forseglelige beholder efter at denne er blevet forseglet.

Tilstedeværelsen af mikroorganismer bestemmes ved en detektion eller måling af ændringer i pH-værdien af prøven og/eller produktionen af CO2 i prøven un-20 der anvendelse af en til rådighed stående indikator fastgjort til indersiden af beholderen. Ifølge opfindelsen kan mikroorganismer detekteres under tilstedeværelse af vekselvirkende materialer, såsom store koncentrationer af røde blodceller gennem ikke-radiometriske og ikke-indtrængende organer. Når niveauet af pH og/eller CO2 i prøven ændres, vil lysreflekterende og/eller absorberende ka-25 rakteristikker af den disponible føler blive ændret tilsvarende. Kvantiteten af ændringen af refleksionsegenskaberne af indikatoren detekteres ved hjælp af en emissions- og modtagemekanisme, som tilfører signaler til en anordning for overvågning af kvantiteten af synlig refleksion/absorption og ændringshastigheden. Hastigheden og kvantiteten er derefter analyseret til forudsigelse og be-30 stemmelse af tilstedeværelsen af mikrobiel dyrkning i prøven. Indikatoren kan eksempleres og/eller overvåges kontinuerligt eller med hyppige tidsintervaller, 5 DK 176223 B1 der muliggør en opsamling af en detaljeret karakteristik af kvantiteten og ændringshastigheden af indikatoren.

Opfindelsen kan nærmere forklares i det følgende under henvisning til tegnin-5 gen, hvor fig. 1 viser et tværsnit gennem prøveglas- og fotodetektorarrangementet, fig. 2 en graf, der illustrerer relationen mellem refleksion af føleren og pH-10 værd ien af p røven, fig. 3 en graf, der illustrerer en karakteristik, som er et eksempel på pH og CO2-ændringerne i en prøve forårsaget af dyrkningen af E. coli bakterier.

15 fig. 4 en graf, der illustrerer ændringen i refleksion af forskellige mikroorganismer i tid målt ved hjælp af den foreliggende opfindelse, fig, 5 en graf, der illustrerer tærskelværdi-hastighedsgenerationsniveauet vs. overvågningsdetektionsmetoder med konstant hældning, 20 fig. 6 et blokdiagram, der illustrerer hovedkomponenterne af analyseapparatet ifølge opfindelsen og fig. 7 en udførelsesform for opfindelsen, der illustrerer otte samtidigt overvåge-25 de prøver, set i perspektiv.

Apparatet ifølge opfindelsen tilvejebringer et ikke-indtrængende organ for detek-tion af mikroorganismer i en klinisk prøve såsom blodprøver eller andre legemsvæsker ved at måle en forøgelse af de af mikroorganismerne frembragte 30 metaboliske produkter. En prøve tilsættes til et specielt formuleret medium, der øger produktionen af visse mikrobielle metaboliske produkter. Som vist i fig. 1 6 DK 176223 B1 er prøven og det formulerede medium 3 indeholdt i en kulturflaske eller beholder 1 for inkubation. Beholderen 1 er tætnet ved hjælp af et ikke vist topstykke.

5 En indikator 2 er anbragt i beholderen 1 mod en indervæg af denne, Indikatoren 2 omfatter en fast sammensætning eller membran, der omtales som fastgørelses- eler bæremediet, og et indikatormedium monteret på eller i bæremediet.

På denne måde er indikataoren 2 anbragt flugtende mod indersiden af en beholder 1 således, at indikatormediet er synligt ude fra og er tætnet over for cel-10 ler, proteiner og andre faste stoffer eller uiggenskinnelige eller farvede komponenter af prøven eller mediet, der derved ikke kan trænge ind mellem indikatoren 2 og beholderens 1 overflade. Derved undgås, at eventuelle objekter trænger ind mellem indikatoren 2 og detektormekanismen 4 og 5. I visse udførelsesformer er indikatoren 2 adskilt fra prøven og dettes dyrkningsmedium 3 ved 15 hjælp af en membran eller et fast lag, der muliggør passage af gasmolekyler, men forhindrer passage af ioner. På denne måde vil indikatoren 2 efter ønske blive udsat for ændringer i pH eller CO2, uden at blive direkte udsat for mediet 3.

20 Prøver af legemsvæsker såsom blod indeholdende så lidt som én organisme per mm kan detekteres under anvendelse af opfindelsen. Sådanne prøver kræver op til syv dages inkubationstid inden populationen af organismer når et kritisk niveau, eller en forøgelse i metaboliske produkter kan måles. Det har vist sig gennem anvendelse af den foreliggende opfindelse, at en koncentration på 25 106 CFU/ml for visse typer af organismer tilvejebragte målelige niveauer i pH el ler C02. Alle organismer udviste målelige resultater ved koncentrationer på 107 til 108 CFU/ml.

Opfindelsen er fordelagtig i flere henseender: (1) De mikrobielle metaboliske produkter måles snarere i den flydende fase af kulturflasken end i atmosfæren over prøven, 30 7 DK 176223 B1 (2) som følge af, at indikatoren 2 fastgøres til indersiden af flasken 1, kan der foretages målinger fra ydersiden af den transparente væg af flasken 1, uden at ødelægge integriteten af beholderen 1, 5 (3) eksterne målinger kan foretages ved en visuel inspektion eller ved hjælp af et instrument, der måler refleksionen af indikatoren 2, (4) uigennemskinnelige eller farvede komponenter i prøven 3 påvirker ikke føle-10 rens 2 evne til at detektere og indikere ændringer i pH eller C02 niveauerne og (5) en høj koncentration af indikatormolekyler opretholdes i et lille volumen, dvs. på membranen således, at en farveændring let vil kunne observeres, 15 (6) en observation af indikatoren 2 kan påvirkes essentielt kontinuerligt gennem prøveudtagning over tætliggende tidsintervaller, eftersom der ikke kræves nogen indtrængende prøveudtagning eller kammermanipulation, (7) en karakteristisk repræsentation af det absolutte niveau og ændringshastig-20 heden af pH eller C02 kan udvikles ud fra den kontinuerlige overvågning.

Næringsmiddelkomponenterne, der danner et komplekst mikrobielt medium, påvirker de metaboliske veje, der anvendes af mikroorganismer. Organiske syrer, baser og forskellige gasser frembringes i forhold, der afhænger af de til rå-25 dighed værende næringsmidler. Disse produkter varierer også fra prøve til prøve af mikroorganismer. Tilstedeværelsen af disse produkter i det flydende medium kan ændre dettes pH-værdi. Følere anvendt i forbindelse med opfindelsen indeholder pH følsomme indikatorer, der giver en målelig ændring i afhængighed af en pH-ændring i omgivelserne. I udførelsesformen, i hvilken pH føleren 30 er dækket af en gaspemneabel, ionuigennemtrængelig membran, måles tilstedeværelsen af gasser, der påvirker pH-værdien af indikatoren såsom C02 eller 8 DK 176223 B1 ammoniak. Den mikrobielle dyrkning kan således detekteres enten ud fra ændringer i pH af det flydende kulturmedium eller ved måling af gasser opløst i et medium frembragt ved hjælp af mikroorganismer. Carbondioxid er en universel metabolit frembragt ved hjælp af alle organismer og er derfor den foretrukne 5 metabilit for detektion af mikrobiel dyrkning.

C02 og pH indikatorer, som er foreslået i nærværende opfindelse, deler to fælles komponenter, en molekylær art, der kan tjene som pH-indikator, og et fast-gørelses/bæremedium. pH-indikatoren kan fastgøres enten kovalent eller ikke-10 kovalent til bæremediet. Alternativt kan indikatoren indkapsles i en polymer-matriks, der er gaspermeabel, såsom en pH indikator emulgeret i en polymer-matriks inden hærdning. C02-føleren har en tredje komponent, en semipermeabel substans, der fuldstændigt adskiller indikatormembranen fra prøven og dyrkningsmediet. Disse følere er fikseret i et egnet transparent kammer 1 ved 15 hjælp af klæbemiddel.

Forskellige fluorescente og synlige pH indikatorer kan anvendes som aktive molekylære prøver i pH eller C02 indikatorerne. Generelt er de eneste begrænsninger på valget af indikatorer, at de skal have acceptable dynamiske pH-20 områder og udvise bølgelængdeændringer, der let vil kunne detekteres ved hjælp af eksisterende forsidefluorescens eller reflektant teknologier.

Indikataorer for detektion af pH ændringer i kulturmediet ifølge opfindelsen skal udvise en ændring i fluorescensintensitet eller synlig farve over et pH område 25 på omkring 5,0 til omkring 8,0,

Indikatorer for en C02 føler skal udvise en ændring i fluorescensintensitet eller synlig farve i et pH område mellem omkring 10,0 og 6,0 for at kunne detektere ændringer i C02 koncentrationer.

DK 176223 B1 9

Kun visse pH indikatormoleky 1 er kan bindes kovalent eller 5 ikke-kovalent til et bæremedium og bibeholde deres pH indika toregenskaber. Indikatorer hørende til xanthen, phenolphthale-in og pheno 1 su 1 f onphtha 1 ei n grupperne har vist sig at være nyttige.

10 Fastgøre 1ses/bæremed i et kan være en substans såsom cellulose, hvortil en pH indikator vil kunne fastgøres kovalent under anvendelse af organiske reaktioner. Ikke-kovalent fastgørelse af pH indikatorer kan opnås ved hjælp af ioniske bærematerialer, såsom ny1onmebraner, der har et positivt eller negativt zeta-15 potentiale. Andre ioniske bærematerialer, der kan anvendes, er positivt eller negativt ladede ioniske harpikser, såsom diethyl am inoethy 1 (DEAE) harpiks eller (DEAE) cellulose. Forbehandling af bærematerialet med protein kan være nødvendigt, hvis i ndikatormembranen kommer i direkte kontakt med det mi-20 krobielle dyrkningsmedium.

pH-indikatorfø1 erne foretager en direkte detektion af pH ændringer som følge af pH-værdien af omgivelserne til det mikrobielle dyrkningsmedium. Disse følere kan imidlertid fremstil-25 les til selektivt at reagere på gasser (dvs. carbondioxid eller ammoniak) i det flydende dyrkningsmedium ved at dække dem med en selektivt semipermeabel komposition eller mebran, såsom silicium (eng: silicon), latex, teflon eller forskellige plastmaterialer karakteriseret ved deres evne til selektivt at 30 muliggøre diffusion af gasser samtidigt med, at en passage af ioner og væske er forhindret. For følere omfattende en indikator indkapslet i en po1ymermatriks kan polymeren, der danner matricen, virke som en semipermeabel barriere, der muliggør en passage af gasser men ikke af ioner.

I den indkapslede indikatorudformning udgøres C02-føleren af en visuel eller fluoroscent pH indikator, som er reaktiv i pH

35 10 DK 176223 B1 området mellem 5 og 10, et natriumhydroxid eller en ækvivalent base, der opretholder et optimalt pH miljø for detektion af CO2» en glycerol eller ækvivalent emulgator, der kan frembringe miceller af indikatoropløsning emulgeret i den uhærdede po-5 lymer og en uhærdet polymer såsom rumtemperatur RTV hvid silicone, der opretholder de rette omgivelser for indikatoren. Der kan anvendes enhver polymer, der ikke påvirker den kemiske aktivitet af indikatoren enten fra dets eget kemikalie eller fysiske egenskaber eller dets krav til hærdning, så længe det er 10 permeabelt for gasser, men ikke over for ioner og ikke får disse egenskaber ændret, når det udsættes for sterilisering ved autoklav hærdning.

En emulsion er fremstillet af de ovennævnte fire komponenter, 15 og polymeren er hærdet til dannelse af en semipermeabel ma- triks omkring micellerne af pH indikatoren, som muliggør en selektiv diffusion af CO2 og andre gasser fra det flydende mikrobielle dyrkningsmedium, hvilket resulterer i en målelig eksponering af indikatoren til tilvejebringelse af en målelig 20 visuel ændring i indikatorfarven. Føleren 2 kan præpareres separat og klæbes til indersiden af kulturflasken. Alternativt kan føleren 2 formes på bunden af flasken og hærdes på stedet. Efter hærdning er flasken med føleren steriliseret, eksempelvis ved autoklav hærdning. Eksempler på pH og CO2 følere er 25 angivet i en verserende US patentansøgning 07/168.291, indleveret den 15. marts 1988, hvilken ansøgning indgår som reference. Specifikke pH og CO2 indikatorer er ikke beskrevet mere detaljeret end ovenfor. Følerne må tilvejebringe visuelle de-tekterbare indikationer af pH og/eller CO2-ændringer til op-30 nåelse af en passende vekselvirkning med instrumentet og udstyret, som vil blive beskrevet i det følgende.

Tilsvarende er kulturmediumformuleringer beskrevet i den verserende ansøgning nr. 07/168.291, og er derfor ikke beskrevet 35 i detaljer heri.

Fig. 1 viser et tværsnit af en kulturbeholder 1 med en prøve, og et medium 3 deri og en føler 2 fastgjort til bunden. Behol 11 DK 176223 B1 deren 1 er anbragt på en platform 7, der har en åbning 8, i hvilken der er indført en fotodetektor 5, og åbning 9, i hvilken der er indført en emitter 4.

5 Både emitteren 4 og detektoren 5 er forbundet til analyseappa-ratet 6, der er illustreret mere detaljeret i fig. 6.

Beholdere 1 er i almindelighed cylindriske i form som vist i fig. 7 og passer i åbninger 10 i den øvre overflade af sub-10 stratet 7. Beholderne 1 holdes pænt i åbningerne 10 ved hjælp af elastisk pakningsmateriale 12. Det indre af åbningerne 10 er foret med pakningsmateriale 12, som elastisk presser mod sidevæggene af beholderen 1, når denne er indpasset i åbningerne. Denne pakning er indrettet til at forhindre, at behol -15 derne 1 falder ud af åbningerne 10 ved en bevægelse af sub stratet 7 som ovenfor beskrevet. Emitteren 4 og detektoren 5 er monteret med en relativ vinkel a til tilvejebringelse af en optimal modtagelse af reflekteret lys fra indikatoren 2. Vinklen α er i den viste foretrukne udførelsesform 45°. Andre re-20 lative vinkler i nærheden af 45“ giver imidlertid også acceptable resultater. Et foretrukket område fra 30 til 60“ har vist sig at være optimalt til opnåelse af den bedste reflek-ti onsvirkningsgrad.

25 Emitteren 4 og detektoren 5 må være anbragt ved en passende relativ vinkel og ved en passende vinkel i forhold til indikatoren 2 således, at lyset ikke reflekteres fra ydersiden af beholderen 1, men derimod når indikatoren 2 for at blive reflekteret derfra. Endvidere må detektoren 5 være afskærmet fra 30 direkte belysning fra emitteren 4 for at forhindre en unøjagtig aflæsning.

Fig. 7 illustrerer den samlede konfiguration af en eksempelvis udførelsesform for opfindelsen. Som det fremgår af fig. 7, har 35 basisdelen 7 et antal cylindriske slidshuller 10 til optagelse af prøveflaskerne 1. Et vilkårligt antal flasker 1 kan anbringes i slidserne 10 i substratet eller basen 7. Basen 7 er mon- DK 176223 B1 12 teret på en sådan måde, at den kan rystes ved hjælp af en rystemotor 26 og en dertil fastgjort rystemekanisme 28. Rystebevægelsen er nødvendig for at opretholde en passende omrøring af blandingen i flaskerne for derigennem at fremme den rette 5 mikrobakterielle dyrkning. Basen er også opvarmet ved hjælp af varmeelementer 30, der er fastgjort til basen eller ved en total indeslutning af basen i et styret inkubationsapparat. Hver af slidserne 10 indeholder en emitter og en detektor for passende belysning af følerne og detektion af den reflekterede 10 luminescens.

Som det vil blive beskrevet detaljeret i det følgende kan hver af flaskerne 1 være uafhængigt overvåget gennem udvalgte aflæsninger af udgangene af detektorene i forbindelse med slid-15 serne, i hvilke hver af flaskerne kan være indført. På denne måde kan en computer 20 overvåge flere prøver samtidigt, idet der udtages en prøveudlæsning af hver prøve efter ønske med en forudbestemt ønsket prøveudtagningshastighed, og idet der udføres en evaluering af den mikrobakterielle dyrkning af hver 20 prøve således, som det vil blive beskrevet detaljeret i det fø1gende.

Et kredsløbsdiagram, der er vist i fig. 6, illustrerer signalmodtagelses- og signalbehandlingsdelen af signalanalyseanord-25 ningen 6 i fig. 1 og 7. De lyemitterende dioder Dll - D18 energi forsynes ved hjælp af en zenerstab i 1 i seret konstantstrømskilde 14. Strømkilden indeholder en transistor Ql operationsforstærker opl7 og en zenerdiode 09. Strømkilden 14 tilvejebringer en stabil belysning for de 1 ysemitterende dioder 30 11 - 18, der belyser diodemodtagerne Dl - 08.

De lysemitterende dioder D10 - D18 er repræsentative for lys-emitteren 4, der er vist i fig. 1, og fotodioderne Dl - D8 er illustrative for lysdetektoren 5, der er illustreret i fig. 1.

I fig. 6 og 7 er otte dioder monteret på substratet 7. Kun fire af disse er imidlertid vist. Den eksempelvise udførelses- 35 13 DK 176223 B1 form illustrerer otte lysemittere, otte detektorer og otte parallelle kreds 1øbsveje, Dette er kun eksempelvise angivelser, og ethvert antal af emittere og detektorpar vil kunne anvendes i afhængighed af antallet af prøver, der skal evalueres ved 5 hjælp af et enkelt signalbehandlingsapparat 6.

De viste fotodioder Dl - D8 kan f.eks. være VTP 5051 fotodioder fra EGG Vactech i St. Louis, Missouri. Enhver sammenlignelig fotodiode, der kan foretage en følsom detektion i et givet 10 område af spektret, vil kunne anvendes. Andre fotodioder, der er i stand til at detektere i andre områder af det elektromagnetiske spektrum, kan anvendes, hvis fotoem itterne 4 er udformet til at emittere i denne del af spektret, og føleren 2 er udformet til at udvise reflekti onsegenskaber i denne anden del 15 af spektret i afhængighed af ændringer i pH eller CO2 produktionen.

Udgangssignalet af hver diode er forstærket ved hjælp af et par operationsforstærkere med lille drift, og som er anbragt i 20 en inverterende konfiguration med lav drift. Denne konfiguration er illustreret ved hjælp af denne del af kredsløbet 16 i f i g . 6 .

Udgangene af operationsforstærkerne multiplekses til multi-25 plekseren MUX08 på separate indgangsΊedere 18. På denne måde kan udgangen af hver af dioderne Dl - D8 udvælges for overvågning og/eller analyse. Gennem tilvejebringelse af en adresse på tre bit, og som er tilvejebragt på adresselederne AO - A2, kan computeren 20 vælge den ønskede diodeudgang, der skal ud-30 læses på DRN lederen 8 fra mu 11i pi ekse ren MUX08. Udgangssignalet fra multiplekseren er derefter filtreret ved hjælp af et passivt lavpasfilter og forstærket og tilvejebragt som et analogt udgangssignal for computeren 20. Dette analoge signal ved udgangsterminalen 22 kan først omsættes til et digitalt signal 35 og derefter overføres til indgangsterminalen 24 af computeren eller føres direkte til computeren som et analogt signal.

14 DK 176223 B1 I computeren 2 0 er udgangssignalerne af de forskellige d e t e k -torer oversat, og kurverne, der er karakteristiske for kvantiteten og ændringshastigheden af pH eller ' CO2 koncentrationen af de forskellige prøver og er illustreret i fig. 5, er udvik-5 let. ‘Computeren 20 foretager desuden analyser til eva luering af de udviklede karakteristikker og til bestemmelse af tilstedeværelsen eller den manglende tilstedeværelse af udviklende mikrobielle kulturer således, som det vil blive beskrevet i det følgende.

10

Under henvisning til graferne i fig. 5 vil fordelene ved analyseteknikken ifølge opfindelsen i forhold til de analyseteknikker, der hidtil har været til rådighed, eller gennem visuel inspektion nu blive beskrevet i det følgende.

15 I den første graf I i fig. 5 er det absolutte niveau af CO2 afbildet som funktion af tiden sammen med et CO2 tærskelniveau, som kan anvendes til at fastslå, om der var mikrobiel forurening. Den absolutte CO2 koncentration af opløsningen er 20 bestemt ved analyse af farveændringen af indikatoren 2 i beholderen 1. Det skal bemærkes, at legemsvæsker såsom blod demonstrerer en selvstændig produktion af CO2, der ses i de stadigt stigende niveauer i alle tre kurver. Størrelsen af denne baggrundsproduktion varierer meget blandt prøverne. Karakteri-25 stikkerne A, B og C repræsenterer eksempler på mikrobielle dyrkninger. Karakteristikken A illustrerer et højt niveau af baggrundsprodukt i on, men ikke nogen mikrobiel dyrkning. Den skærer tærskelværdien og er derfor anset for at være positiv under kendte analyseteknikker, men vil være falsk positiv. Ka-30 rakteristikken B illustrerer et moderat baggrundsniveau og stærk synlig dyrkning. Eftersom karakteristikken B også skærer tærskel niveauet, vil den blive detekteret som sand positiv. Disse kan detekteres ved hjælp af periodiske prøveudtagningsteknikker med et signifikant tidsforløb mellem prøveudtagnin-35 ger som følge af, at CO2 niveauet forbliver over tærskelværdien i en betydelig tidsperiode. Karakteristikken C illustrerer en kombi nation af lav baggrundsproduktion og ringe vækst, 15 DK 176223 B1 hvilket resulterer i et falsk negativt signal ved de kendte detektionsanalyser.

Den anden graf II illustrerer den først udledte af dataene i 5 den første graf eller hastigheden af CO2 produktionen. Det ses, at hastigheden af A er høj men konstant aftagende; af den af B we moderat med en forøgelse til tidspunktet for mikrobiel dyrkning; og at den af C er lav men igen med en forøgelse ved tidspunktet for mikrobiel dyrkning.

10

Den tredje graf III illustrerer den anden afledte eller dyrkningsaccelerationen af .dataene i den første graf. Her illustrerer karakteristikken A en konstant negativ acceleration, medens B og C viser perioder af stærk positiv acceleration.

15 Ved en sammenligning af graferne ses, at selv om C02“værdien af prøven A stiger over en tærskelværdi i grafen I, udviser den ikke en signifikant hældningsændring i grafen II og derfor ikke nogen acceleration i grafen III. Det ses at i grafen III udviser de to sande positive prøver B og C, der udviser posi-20 tive karakteristikker, der ikke er til stede i prøven A.

Karakteristikken C illustrerer en mikrobiel dyrkning, der udviser en langsommere CO2 genereringshastighed, der kan skyldes flere forskellige faktorer. I dette eksempel kan ved hjælp af 25 de kendte prøveudtagningsteknikker eller gennem en visuel inspektion af indikatoren 2 ifølge opfindelsen denne prøve bestemmes til at være negativ, hvilket vil være falsk negativ. Dette skyldes, at den absolutte CO2 værdi af prøven C aldrig over stiger en tærskelværdi, der er nødvendig for at indikere 30 en positiv aflæsning. Hvis prøveudtagnings-analyse- og evalueringsteknikken ifølge opfindelsen, som vil blive beskrevet i det følgende, tages i brug, vil den aktuelle mikrobakteriel le dyrkning, selv om den ikke er tilstrækkelig til at hæve CO2 af prøven over tærskel niveauet i graf I, blive detekteret som en 35 positiv bakteriel tilstedeværelse og derfor sand positiv.

Computeren 20 kan ifølge opfindelsen indstilles til at aflæse den indikerede C02~værdi ved ethvert givet interval. Eks'empel- 16 DK 176223 B1 vis ved anvendelse af et prøveudtagningsinterval på 10 min imellem aflæsningerne, vil computeren instruere multiplekseren MUX08 om at afgive en aflæsning fra den respektive følerindgang med intervaller på 10 min. Aflæsningen vil blive aflæst 5 og registreret ved hjælp af computeren. Computeren tager derefter en anden aflæsning efter 10 min og registrerer værdien.

Efter forstærkning af seks intervaller tages et syvende interval, og det første interval droppes.Computeren 20 fortsætter med 10 at opdatere på denne måde ved at udelade den ældste prøveudtagning og tilføje den nyeste således, at computeren hele tiden har data svarende til en periode på en time ved hånden.

Computeren 20 anvender disse prøveudtagninger til kontinuer-15 ligt at bestemme hældningen af kurven, der forbinder hvert nærliggende par af pH aflæsninger og derfor etablerer en "øjeblikkelig" hældningsværdi mellem hvert par af nærliggende aflæsninger med intervaller på 10 min. Denne hældning sammenlignes med den tidligere interva1 hældning og med hældningerne af 20 de forudgående intervaller, der går tilbage til i alt seks intervaller eller en time. Derved forsynes computeren med hastigheds- og accelerationsværdier repræsenteret i graferne II og III.

25 Hældningen af den foreliggende 10 min. eksemp1 er ingsperi ode kan ene og alene sammenlignes med hældningen af den sidste periode eller sammenlignes med hældningen af de sidste fem perioder på vægtet basis. Computeren søger efter positive accelerationer såsom de, der er vist ved hjælp af kurverne B og C 30 af grafen III i fig. 5. Varigheden af den positive acceleration overvåges, og accelerationen må forblive positiv fra en periode, der er fem gange større end den, der kan tilskrives i nstrumentf1uktuati oner eller anden baggrunds interferens. For eksempel er tidsperioden tj i grafen III utilstrækkelig, me-35 dens tidsperioden t2 er tilstrækkelig.

Denne analysemetode er fordelagtig derved, at begge eksempler B og C, som er positive bakterielle dyrkninger, vil blive de- 17 DK 176223 B1 tekteret ved hjælp af den foreliggende opfindelse. Dette analyseskema er ikke afhængigt af den absolutte værdi af det CO2» der udvikles i prøven, men afhænger kun af en ændring i hastigheden af CO2 forøgelsen, som har vist sig at være en mere 5 pålidelig indikator af positive biologiske prøver end skæringen af en tærskelværdi med den absolutte C02~værdi.

Denne analysemetode er kun opnåelig gennem apparatet og læren ifølge opfindelsen, der muliggør en kontinuerlig overvågning 10 og tætliggende prøveudtagninger, og som giver en indikator 2 af tilstrækkelig følsomhed, der gør det muligt at opnå CO2 aflæsninger med stor præcision.

Følerne overvåget ved hjælp af dette instrument indeholder in-15 dikatorer, der ændrer farve, når voksende eller metabolise- rende mikrober er til stede og genererer enten en pH eller en C02-ændring. Selv om farveændringerne vil kunne ses med det blotte øje, så giver brugen af instrumentet 6 fordelen ved objektivitet, følsomhed og kontinuerlig måling. I den foretrukne 20 udførelsesform er der for hver føler tilvejebragt en lysemitter og -detektor. Der findes imidlertid alternative muligheder for at foretage en kontinuerlig overvågning af alle prøverne. Disse alternativer omfatter brugen af organer til at føre hver prøveflaske forbi en eller flere stationære detektorer eller 25 føre en eller flere detektorer forbi de stationære flasker.

I den ovenfor beskrevne foretrukne udførelsesform er der anvendt faststof1yski1 der og -detektorer. Hvidglødende lampekil-30 der og buelampekilder til belysning kan imidlertid også anvendes, og spejle, linser, optiske fibre og andre organer til at rette lyset mod indikatoren i flasken for reflektion til et dektionsorgan kan også anvendes således, som det vil være nærliggende for en fagmand, efter at have studeret beskrivelsen 35 af nærværende opfindelse.

Claims (24)

1. Apparat til overvågning af mikrobial vækst i en prøve omfattende en for--seglelig steriliserbar beholder (1) med et indre kammer, i hvilken prøven dyrkes 5. et sterilt kulturmedium, hvilken beholder (1) har i det mindste én transparent sektion, et steriliserbart indikatororgan (2) lokaliseret i beholderen (1) i området af den transparente sektion, hvilket indikatororgan (2) udviser en målelig ændring i afhængighed afen pH ændring i dets omgivelser, og som kan detekteres via den transparente sektion ved udsættelse for metabolitter af mikrobial vækst, 10 hvorved ændringer i indikatororganet (2) kan overvåges fra det ydre af beholderen (1) gennem den transparente sektion for derved at overvåge mikrobial vækst uden indtrængning i beholderen (1) efter forsegling, et emitterorgan (5) for emission af et emittersignal, der vekselvirker med i hvert fald én målelig egenskab af indikatororganet, hvorved der tilvejebringes et indikatorsignal, hvil-15 ket emitterorgan (5) er positioneret i forhold til indikatororganet (2), således at emittersignalet rammer indikatororganet via den transparente sektion, et detektororgan (5) anbragt i forhold til indikatororganet (2) for modtagelse af indikatorsignalet fra indikatororganet (2) via den transparente sektion for frem-20 bringelse af et dertil svarende detektorsignal, signalbehandlingsorganer (6) for modtagelse af detektorsignalet og signalbehandling af dette for at evaluere størrelsen af den målelige egenskab af indikatororganet (2) til et givet tidspunkt og sammenligne størrelsen af signalet med 25 størrelsen til et andet tidspunkt og derigennem overvåge mikrobial vækst i den forseglelige beholder efter at denne er blevet forseglet.

2. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at signalbehandlingsorganerne (6) for modtagelse af detektorsignalet er et kredsløbsorgan. 30

3. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at emitterorganet (5) omfatter en lysemitterende diode. 19 DK 176223 B1

4. Apparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at detektororganet (5) omfatter en fotodiode, der kan modtage refleksioner af emissionen fra den lysemitterende diodé?

5. Apparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at signalbehandlingsorganerne (6) for modtagelse af detektorsignalet omfatter en stabiliseret strømkilde for den lysemitterende diode.

6. Apparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at kredsløbsorganet omfatter be-10 regningsorganer (20) for modtagelse af detektorsignalet ved udvalgte tidsintervaller og for sammenligning af evt. ændringer i karakteristikkerne af detektorsignalet under hvert tidsinterval.

7. Apparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at kredsløbsorganet omfatter be-15 regningsorganer (20) for periodisk eksemplering af detektorsignalet, og sammenligning af eksempleringerne for beregning af ændringshastigheden af ek-sempleringerne.

8. Apparat ifølge krav 1og som desuden omfatter organer for detektion af 20 ændringshastigheden af detektorsignalet og måling af varigheden af ændringshastigheden.

9. Fremgangsmåde til detektion af mikrobial vækst i en prøve omfattende følgende trin: 25 tilvejebringelse af en steriliserbar beholder (1), idet beholderen har i hvert fald én transparent sektion i en væg deraf og et indikatororgan, der udviser en målelig ændring i afhængighed af en ændring af pH-værdien i dens omgivelser, anbragt i beholderen i området af den transparente sektion, 30 20 DK 176223 B1 tilvejebringelse af et emitterorgan for emission af et emittersignal, der vekselvirker med i hvert fald én målelig egenskab af indikatorsignalet, hvorved der tilve-jebririges"et^iridikafdreighairiwilket'Wnitterorgan er placeretTforboldlinncIiRa-tororganet, således at emittersignalet rammer indikatororganet via den transpa-5 rente sektion, tilvejebringelse af et detektororgan placeret i forhold til indikatororganet for modtagelse af indikatorsignaler fra indikatororganet og tilvejebringelse af et dertil svarende detektorsignal, 10 tilvejebringelse af et signalbehandlingsorgan (6) for modtagelse af detektorsignalet og for signalbehandling af detektorsignalet til vurdering af størrelsen af den målelige egenskab af indikatororganet, 15 indføring af prøven under sterile forhold i beholderen (1), inkubering af prøven i beholderen (1), og detektion af en evt. ændring i eller størrelsen af detektorsignalet for derved at 20 detektere mikrobial vækst i den forseglelige beholder efter dennes forsegling.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9 omfattende følgende yderligere trin, modtagelse af detektorsignalet ved valgte tidsintervaller, og 25 sammenligning af evt. ændringer i karakteristikkerne af detektorsignalet under de nævnte tidsintervaller.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9 omfattende yderligere trin af 30 eksemplering af detektorsignalet, 21 DK 176223 B1 sammenligning af successive eksempleringer af detektorsignalet og beregning af ændringshastigheden af ændringer mellem successive eksempleringer.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 9 omfattende en detektion af en forøgelse i 5 den målelige egenskab, og måling af varigheden af den målelige egenskab ved det hævede niveau.

13. Fremgangsmåde til fastslåelse af tilstdeværelse af mikrober i en prøve om-10 fattende trinene af tilvejebringelse af apparatet ifølge krav 1, indføring af prøven i den sterile beholder (1), 15 inkubering afprøven i beholderen, overvågning af en ændring i en målelig egenskab af indikatororganet med detektororganet ved i hvert fald ét tidsinterval, 20 beregning af ændringshastigheden af den målelige egenskab, hvorved en første afledet af målingen af egenskaber bestemmes, og analysering af størrelsen af den første afledede af den målelige egenskab til 25 fastslåelse af tilstedeværelse af mikrober i prøven.

14. Fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelse af mikrober i prøven omfattende følgende trin: 30 tilvejebringelse af apparatet ifølge krav 1, indføring af prøven i den sterile beholder (1), 22 DK 176223 B1 inkubering af prøven i beholderen, —overvågning^af ændringer i en målelig egenskab'af indikatororganet ved hjælp af detektororganet ved i hvert fald ét tidsinterval, 5 måling af størrelsen af den målelige egenskaber til fastslåelse af tidstedeværel-se af mikrober i prøven.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 13 omfattende yderligere trin af 10 beregning af den anden afledede af målingen af den målelige egenskab og analysering af størrelsen af den anden aflede af den målelige egenskab, hvorved tilstedeværelser af mikrober i prøven vil kunne fastslås.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15 omfattende en måling af varigheden af den anden aflede ved en vis værdi.

17. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at indikatororganet omfatter en membran og et indikatormedium, idet indikatormediet udviser en detekterbar 20 ændring i afhængighed af en pH-ændring i dets omgivelser.

18. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at membranen er forseglet til en indervæg af beholderen (1).

18 DK 176223 B1

19. Apparat ifølge krav 17, kendetegnet ved, at indikatormediet er anbragt mod en indervæg af beholderen (1), og at membranen og indikatororganet adskiller indikatormediet fra kulturmediet.

20. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at metabolitten er CO2 30

21. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at indikatormediet er kemisk følsomt overfor pH. 23 DK 176223 B1

22. Apparat ifølge krav 1, og som desuden omfatter organer til detektion af en ændring i ændringshastigheden.

23. Apparat ifølge krav 22, og som desuden måler varigheden af ændringen i 5 ændringshastigheden.

24. Apparat ifølge krav 1, og som endvidere måler den tid, hvor detektorsignalet er ved en given værdi.