FI96620C - Hiivapromoottori - Google Patents

Description

96620

Hiivapromoottori Tämä keksintö koskee rekombinaatio-DNA-tekniikkaa. Se koskee 5 erikoisesti uutta hiivapromoottoria.

Rekombinaatio-DNA-tekniikan avulla on mahdollista tuottaa heterologisia geenituotteita Saccharomyces cerevisiaessa.

Tämä saadaan aikaan konstruoimalla geenifuusioita sopivien 10 ei-koodaavien, säätelevien DNA-sekvenssien ja DNA-sekvenssin väliin, joka koodaa ekspressoitavan proteiinin rakennetta.

Tässä suhteessa on käytetty S. cerevisiaen fosfoglyseraatti-kinaasin (PGK) geenin 5' ja 3' ei-koodaavia alueita konstruoimaan ekspressiovektoreita, joiden avulla voidaan synteti-15 soida kaupallisesti tärkeitä polypeptidejä hiivassa (Tuite et ai, 1982; Kingsman & Kingsman 1982; Mellor et ai, 1983) . Mutta vaikka nämä vektorit pystyvät ohjaamaan huomattavien hete-rologisten polypeptidien määrien synteesiä hiivassa, ne ovat samojen fysiologisten tekijöiden alaisia, jotka vaikuttavat 20 luonnollisen hiivaproteiinin ekspressioon.

Siten esimerkiksi, kun soluja kasvatetaan väliaineessa, jota on täydennetty fermentoivalla hiililähteellä kuten glukoosilla, PGK-promoottorin ohjaama ekspressio on 20-30 kertaa kor-25 keampi kuin on havaittu silloin, kun soluja kasvatetaan väli-; aineessa, joka sisältää ei-fermentoituvan hiililähteen (Tuite et ai, 1982).

Tätä geeniekspression säätelyä tapahtuu DNA-transkriptiota-30 solia (Holland & Holland, 1978) ja se voidaan laskea johtuvaksi PGK-geenin 5' ei-koodaavan alueen ominaisuuksista.

: Tämä 5' ei-koodaava alue voidaan jakaa funktionaalisiksi alu eiksi, joilla on samanlaisia ominaisuuksia kuin on havaittu muissa hiivageenien 5' ei-koodaavissa alueissa. Erikoisesti 35 eräs DNA-sekvenssi nukleotidien -324 ja -445 välillä on tunnistettu sellaiseksi, joka kykenee aktivoimaan DNA-transkriptiota, kun se sijaitsee hiivan 5' ei-koodaavan alueen ylävirran puolella (Kingsman & Kingsman, 1984). Tämä DNA-sek- 2 96620 venssi, jota nimitetään PGK ylävirran puoleiseksi aktivoin-tisekvenssiksi (UAS) on olennaisen tärkeä PGK-geenin tran-skriptioaktivoinnille (Kingsman & Kingsman, 1984).

5 Muiden hiivageenien aktivoinnissa vallitsee analoginen tilanne. Esimerkiksi S. cerevisiaen GAL 1 ja GAL 10 aktivoituvat UAS:llä, joka suorittaa geenitranskription galaktoo-sisäätelyä (Guarente et ai, 1982; Johnston & Davis, 1984).

Tätä UAS:ää tullaan nimittämään GAL 10 UAS:ksi. GAL 10 UAS 10 voidaan myös paikallistaa muiden hiivageenin 5'ei-koodaavien alueiden ylävirran puolella, jossa se suorittaa galaktoosi-säätelyä DNA-transkriptiossa (Guarente et ai, 1982).

PGK 5' ei-koodaavan alueen katsotaan tavallisesti olevan 15 äärettömän voimakas hiivapromoottori, joka pystyy välittämään hyvin runsasta geeniekspressiota optimaalisissa fysiologisissa olosuhteissa, so. kun soluja kasvatetaan fer-mentoituvan hiililähteen läsnäollessa. Vaikka PGK-ekspressiota voidaan säädellä hiililähteen oikean valinnan avulla, 20 ekspressiota ei voida kontrolloida absoluuttisesti, koska geenitranskriptiota tapahtuu huomattavassa määrin ei-fermen-toituvien substraattien läsnäollessa. PGK-promoottoria ei siis voida käyttää tehokkaaseen hiivan heterologisen geeni-ekspression säätelyyn.

25 ; PGK-promoottori on lisäksi epäsopiva käytettäväksi yhdenmu kaisesti EP-hakemuksen 86303039.1, julkaistu numerolla 0201239, kanssa. Tämä hakemus koskee etanolin ja heterologisen proteiinin tai peptidin tuottamista fermentoimalla hii-30 lihydraatin vesiliuosta sisältävää väliainetta hiivan, kuten panimohiivan, kanssa, jota on geneettisesti muunneltu niin, • että se pystyy ekspressoimaan heterologista proteiinia tai peptidiä sellaisissa olosuhteissa, että hiiva monistuu, mutta ei tapahdu proteiinin tai peptidin ekspressiota, ja näin 35 muodostunut etanoli otetaan talteen, indusoidaan proteiinin tai peptidin ekspressiota hiivan avulla ja saadaan proteiinia tai peptidiä. Tässä tapauksessa on erikoisen hyödyllistä <1 : - MB l.l I M , .

3 96620 heterologisen geenin ekspression säätely galaktoosilla, koska se väliaine, jossa hiivaa kasvatetaan, panimon vierre, ei normaalisti sisällä riittävästi galaktoosia indusoimaan transkription aktivoimista ja siis galaktoosin säätelemää 5 geenien ekspressiota. Geeneillä, joita tavallisesti säädellään galaktoosilla, esiintyy korkea-asteinen indusoitava säätely. Esimerkiksi silloin kun solut joko uudelleensuspen-doidaan ja/tai kasvatetaan väliaineessa, johon on lisätty galaktoosia, on galaktoosilla säädelty transkriptio noin 10 1000 kertaa suurempi kuin on havaittu galaktoosin puuttuessa (Hopper et ai, 1978, St. John & Davis, 1979). Tämä korkea indusoimisaste on vastakohtana aikaisemmin selostetulle PGK-promoottorin ohjaamalle ekspressiolle, jota voidaan indusoida vain 20-30 kertaiseksi. Mutta vaikka galaktoosisäädellyn 15 geeniekspression avulla on mahdollista indusoida korkea-as-teinen geenisäätely, ei tuloksena ole välttämättä samanaikaisesti korkea-asteinen geeniekspressio täysin indusoiduissa olosuhteissa.

20 EP-164 556 koskee yleisesti glykolyyttisten entsyymien promoottoreita, mutta on huomattava, että EP-julkaisun sivulla 5, jossa on annettu esimerkkejä sellaisista glykolyyttisistä entsyymipromoottoreista, PGK:ta ei mainita. Siinä on selvästi lueteltu kaikki glykolyyttiset entsyymipromoottorit, joi- 25 hin voitaisiin soveltaa EP-julkaisun selityksen tekniikkaa, * ja PGK on jätetty pois. Siten huolimatta siitä, että PGK on glykolyyttinen entsyymi, ei ole prima facie ilmeistä soveltaa em. julkaisun opetuksia PGK-promoottoriin Alan ammattimies ei olisi kyennyt vuonna 1986 soveltamaan em. EP-jul- 30 kaisun esimerkkejä esillä olevan keksinnön suorittamiseksi.

• EP-julkaisussa 164 556 ei mainita PGK:ta, sen tuotteet eivät tosiasiassa ole käyttökelpoisia eikä alan ammattimies olisi ottanut sitä lähtökohdaksi jatkokehitykselle. Vaikka alan 35 ammattimies olisi pyrkinyt parantamaan EP-julkaisun työtä, siinä ei ole mitään, mikä johdattaisi esillä olevaan keksintöön.

4 96620 WO-julkaisun 84/04757 keksintö suoritettiin kahden samanlaisen promoottorin kanssa eikä sen tuloksia voida ekstrapoloida muihin promoottoreihin.

5 Keksintö tarjoaa nyt hiivan hybridipromoottorin, joka sisältää komponentteja PGK-geenin 5' ei-koodaavasta alueesta ja säätelykomponentteja GAL 10 UAS:stä. Sen etuna on, että se suorittaa geenitranskription galaktoosisäätelyn luonnostaan-kin tehokkaasti tuotetun PGK-hiivageenin muunnellun 5'ei-koo-10 daavan alueen kautta. Tästä on tuloksena hybridipromoottorin muodostuminen, joka antaa korkea-asteisen transkriptioaktii-visuuden galaktoosin läsnäollessa, so. täysin indusoiduissa olosuhteissa, mutta alhaisen (tuskin havaittavan) aktiivisuuden galaktoosin puuttuessa. Täten hybridipromoottorilla on 15 PGK-geenin transkriptioimisaktiivisuus ja galaktoosilla säädellyn geenin säätelyominaisuudet.

Uusi hybridipromoottori sisältää GAL 10 UAS:n fuusioituna muunnelun PGK-geenin 5' ei-koodaavaan sekvenssiin ja se ei 20 sisällä endogeenistä PGK UAS:ä. Pidetään parempana, että GAL 10 UAS on PGK UAS:n deleetiokohdalla. GAL 10 UAS voi olla molemmissa orientaatioissa läsnä.

Hybridipromoottoria voidaan valmistaa insertoimalla GAL 10 25 UAS sopivaan kohtaan PGK-geenin 5' ei-koodaavassa alueessa.

. Voidaan insertoida GAL 1 - GAL 10 promoottorista johdetun 144 emäsparin Rsa I - Alu I DNA-fragmentti.

Hiivan ekspressiovektorit, tyypillisesti plasmidit, sisältä-30 vät hybridipromoottorin säätelemään heterologisten tai homologisten proteiinien tai peptidien ekspressiota. Voidaan : ekspressoida hyvin laaja joukko heterologisia proteiineja tai peptidejä. Esimerkiksi voidaan mainita entsyymit kuten beeta- laktamaasi, beeta-glukanaasi ja beeta-galaktosidaasi. Mui-35 ta käyttökelpoisia heterologisia proteiineja ja peptidejä ovat aineet, jotka ovat ihmisestä peräisin ja/tai terapiaan soveltuvia kuten ihmisen seerumialbumiini ja immunoglobulii-nit.

il ; «U i llli I I < Al i 5 96620

Ekspressiovektori voidaan konstruoida insertoimalla hybridi-promoottorin sisältävään vektoriin geeni, joka koodaa sitä proteiinia tai peptidiä, jota halutaan tuottaa. Geeni voidaan insertoida restriktiokohtaan, joka on olemassa alavir-5 taan translationaalisesta aloituskodonista, jota säätelee hybridipromoottori. Geeni on insertoitava oikeaan translaa-tiolukemakehykseen. Fuusiotuotetta, joka sisältää haluttua proteiinia tai peptidiä voidaan sitten ekspressoida. Vaihtoehtoisesti voi geeni itse olla varustettu translationaali-10 sella aloituskodonilla, jota seuraa välittömästi DNA-sek-venssi, joka koodaa haluttua proteiinia tai peptidiä. Tällainen geeni voidaan insertoida vektoriin, joka sisältää hybridipromoottorin, mutta joka ei sisällä translationaalis-ta aloituskodonia. Tällaisessa vektorissa on restriktiokohta 15 sellainen, että geeni voidaan insertoida oikeaan lukemake-hykseen ja sellainen, että sen translationaalinen aloitus-kodoni sijaitsee oikein suhteessa hybridipromoottoriin.

Ekspressiovektorissa on transkriptiolopetussekvenssi. Tämä 20 voi olla PGK-lopetussekvenssi.

Ekspressiovektoreita voidaan käyttää ohjaamaan geenien ga-laktoosisäädeltyä korkea-asteista valmistusta transformant -tihiivassa. Vektoreita voidaan käyttää muuntamaan Saccaro-25 myces cerevisiaen laboratoriokantoja. Niitä voidaan käyttää • muuntamaan Saccharomyces cerevisiaen teollisuuskantoja kuten pintaoluthiivoja (S. cerevisiae) ja lagerolutpohjahiivoja (S. uvarum tai S. carlsbergensis). Ekspressiovektorit ovat erikoisen hyödyllisiä panimohiivan transformointiin ja niitä 30 voidaan käyttää galaktoosisäätelyyn heterologisten proteiinien ja peptidien valmistusmenetelmässä Eurooppa-patenttiha-kemuksen 86303039.1 mukaisesti, kuten edellä on selostettu.

Peptidiä tai proteiinia voidaan saada transformoidusta hii-35 vasta kasvattamalla ja/tai panemalla hiiva galaktoosia sisältävään väliaineeseen, jolloin käynnistyy korkea-asteinen peptidin tai proteiinin ekspressio. Peptidiä tai proteiinia .· voidaan siis valmistaa kasvattamalla ja/tai panemalla galak- 6 96620 toosia sisältävään väliaineeseen hiivaa, jota on transformoitu hiivan tuotantovektorilla, jossa mainitun peptidin tai proteiinin ekspressiota säädetään keksinnön mukaisen hybri-dipromoottorin avulla ja saadaan tällä tavoin ekspressoitua 5 mainittua peptidiä tai proteiinia.

Keksinnön oleelliset tunnuspiirteet on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

10 Seuraava esimerkki valaisee keksintöä. Liitteenä olevissa piirroksissa:

Kuvio 1 esittää GAL 10 UAS:n insertioiden sijaintia 5' ei-koodaavalla PGK-geenin alueella; 15 kuvio 2 on kaavamainen esitys S. cerevisiaen eri suuntiin suuntautuvasta GAL 1 - GAL 10 promoottorialueesta; kuvio 3 esittää plasmidien pDBl ja pDB2:n konstruktiota; kuvio 4 esittää pDB4:n Bal 31 deleetiosarjoja; kuvio 5 esittää pDB4:n 5' ei-koodaavan alueen ja hybridi-20 PGK-GAL UAS -promoottorin konstruktiota.

Esimerkki

Materiaalit ia menetelmät Kannat, väliaineet ia transformaatiot 25 Käytetyt kannat olivat E. coli AKEC 28 (C600, thrC, leuB6, • thyA, trpC117, hsdRk, hsdMk) ja S. cerevisiae DBY745 (a, ura3-52, adel-100, leu2-3, leu2-112).

E. coli-viljelyitä kasvatettiin LB-väliaineessa (Miller, 30 1972), jota oli täydennetty, silloin kun se sopi, antibioot ti ampisilliinin kanssa (Sigma Chemical Co. Ltd., Poole,

Dorset, Englanti) lopullisen konsentraation ollessa 50 μg/- ml. Hiivaa kasvatettiin 30°C:ssa synteettisessä täydellisessä väliaineessa (SC) (0,67 % paino/tilavuus hiivan typpiemäs 35 ilman aminohappoja), jota täydennettiin hiililähteellä ja aminohapoilla, milloin se sopi.

!l : Iitit lii M 1:11:0» I : I

7 96620 E. coli transformoitiin käyttäen standardimenetelmiä (Mä-niatis et ai., 1982). Hiiva transformoitiin kuten ovat selostaneet Hinnen et ai., (1978).

5 Rekombinaatio-DNA-tekniikka Käytettiin standardimenetelmiä restriktio-endonukleaasiliuo-tukseen ja plasmidi-DNA:n konstruktioon (Maniatis et ai., 1982). Kaikki entsyymit saatiin Bethesda Research Laborato-riesista (Paisley, Skotlanti) ja niitä käytettiin valmistalo jien suositusten mukaan. Eksonukleaasi Bal31 käytettiin DNA-sekvenssien in vitro -deleetioon, kuten ovat selostaneet Dobson et ai., (1982). Deleetioiden päätepisteet määrättiin DNA-sekvensoinnin avulla (Sanger et ai. 1977; Maxam & Gilbert, 1980). Bgl II synteettiset oligonukleotidi-linkkerit 15 saatiin: Collaborative Research Inc. (Lexington, Massachu setts, USA) .

DNA:n ~ia RNA:n eristäminen

Plasmidi-DNA eristettiin E. colista menetelmien mukaan, 20 joita ovat selostaneet Chinault ja Carbon (1979) ja Birnboim ja Doly (1979). Holmes & Quigley'n (1981) menetelmää käytettiin plasmidi DNA:n nopeaan analyysiin. Kokonaishiiva-DNA valmistettiin Cryer et ai. (1975) mukaan. Kokonais-RNA valmistettiin hiivasoluista, joita oli kasvatettu tiheyteen 4 x 25 106 solua ml-1 kuten on edellä esitetty (Dobson et ai., 1982).

Hybridisoiminen ia DNA-koettimet

Suoritettiin pohjois- ja eteläsiirrot (Northern and Southern 30 transfers) käyttäen standardimenetelmiä (Maniatis et ai., 1982) . 32PdTTP-aukkoon translatoitujen (Amersham International Ltd., Amersham), (Rigby et ai., 1977) DNA-koettimien hybridisoiminen suoritettiin Thomasin mukaan (1980). PGK-(Mellor et ai., 1983), Ty-(Dobson et ai., 1984) ja rDNA-35 (Petes et ai., 1978) DNA-koettimet merkittiin radioaktiivi-sesti spesifiseen aktiivisuuteen 4-6 x 107 cpm//zg DNA aga-roosigeelistä puhdistamisen jälkeen (Tabak & Flavell, 1978).

• 8 96620

Plasmidin kopioluvun määrääminen ia RNA-analyysi Kokonaishiiva-DNA liuotettiin restriktio-endonukleaasin EcoRI kanssa ja erotettiin elektroforeesin avulla 1 % pai-no/tilavuus agaroosigeelissä. DNA-fragmentit siirrettiin 5 nitroselluloosaan ja hybridisoitiin radioaktiivisesti leimattuihin PGK- ja rDNA-spesifisiin DNA-koettimiin plasmidin kopionumeron laskemista varten. DNA-homologia-alueita valaistiin autoradiografiän avulla. Vertaamalla rDNA- ja PGK-spesifisten homologia-alueiden suhteellista voimakkuutta oli 10 mahdollista laskea PGK-spesifisen DNA-sekvenssin kopioiden lukumäärä. Tätä helpotti tieto, että on olemassa suunnilleen 100-140 genomisen rDNA:n toistoa per haploidigenomi (Petes et ai., 1978). Tätä menetelmää plasmidin kopiolukumäärän määräämiseksi voidaan tavallisesti soveltaa sillä edellytyk-15 sellä, että käytetään sopivaa plasmidi DNA-koetintä kokeessa.

RNA kokonaisuudessaan eristettiin elektroforeesin avulla 1 % paino/tilavuus agaroosissa, joka sisälsi 6 % paino/ti-20 lavuus formaldehydiä. RNA siirrettiin nitroselluloosasuodat-timiin, kuten edellä on esitetty ja hybridisoitiin nick-translatoitujen DNA-koettimien kanssa. Käytettiin 5700 nukleotidin transposoni Ty mRNA -lajia tai 1800 nukleotidin ri-bosomaali DNA-koetinta sisäisenä (loading) pakkaussäätelynä 25 hybridisoinneissa, jotta voitiin verrata suoraan eri trans-formanttien välillä.

Tulokset PGK-geenin 5' ei-koodaavan alueen analyysi 30 Konstruoitiin sarja deleetio"ikkunoita" hiivan PGK-geenin 5' ei-koodaavassa alueessa (kuvio 1). Nämä saatiin ligatoi-malla DNA-fragmenttien yhdistelmä, joissa oli deleetioita PGK-geenin 5' ei-koodaavaan alueeseen sekä 5' että 3' suunnilta. 5' ja 3' deleetiot saatiin plasmidi pMA27:n johdan-35 naisessa (Mellor et ai., 1983), jossa Cla I-kohta asennossa -800 PGK 5' ei-koodaavassa alueessa oli ensiksi muutettu yhdeksi ainoaksi Xho I restriktiokohdaksi käyttäen synteet- •

Il IIH 1114 I I i il t - i 9 96620 tistä oligonukleotidi-linkkeriä. Tämä pMA27-johdannainen pilkottiin sitten Xho I:n kanssa ja liuotettiin Bal 31 eksonuk-leaasin kanssa. Plasmidit resirkularisoitiin ligaation avulla Bam HI synteettisten oligonukleotidi-linkkereiden läsnäolles-5 sa ja muutettiin E. coliksi. Plasmidi-DNA eristettiin ja 3' deleetio-päätekohdat karakterisoitiin DNA-sekvensointi s en avulla. 3' ja 5' deleetiot saatiin plasmidi pMA22a:ssa (Dobson et ai. 1982), lohkaisun jälkeen ainoassa Bam HI kohdassa ja Bal 31 eksonukleaasiliuotuksen jälkeen. Plasmidit resirku-10 larisoitiin ligaation kautta Bam HI synteettisten oligonukle-otidi-linkkereitten läsnäollessa ja muutettiin E. coliksi.

Plasmidi DNA eristettiin ja 5' deleetio päätekohtien sijainnit karakterisoitiin samalla tavoin DNA-sekvensoimisen avulla. Plasmidit pDB3, pDB4 ja pDB5 (kuvio 1) konstruoitiin sit-15 ten Bam HI-Pst I fragmenttien ligaation avulla, jotka sisälsivät sopivia 5' ja 3' deleetiojohdannaisten yhdistelmiä.

Näin saatiin 3' päätekohtien alavirtaan DNA-sekvenssejä 5' deleetiojohdannaisista, kun taas 5' päätekohtien ylävirtaan saatiin DNA- sekvenssejä 3' deleetiojohdannaisista.

20

Plasmideissa pDB3 ja pDB5 on deleetioita, joiden sijainti on vastaavasti 5' ja 3' PGK UAS, kun taas pDB4:llä on deleetio koordinaattien -423 ja -470 välissä, joihin kuuluu itse PGK UAS (ks. kuvioita 1 ja 5). Kukin edellä mainituista plasmi-25 deista konstruoitiin siten, että ainoa Bam HI -restriktiokoh-ta rajoitti deleetion päätekohtia. Tämä helpottaa seuraavia DNA-insertioita.

Plasmideilla pMA27, pDB3 ja pDB5 transformoitu hiiva tuottaa 30 huomattavia määriä PGK-mRNA:a, kun sitä kasvatetaan SC:ssä, jota on täydennetty erilaisilla hiililähteillä, kun taas hiiva, jossa on plasmidi pDB4:ää tuottaa PGK mRNA:a sellaisia määriä, jotka ovat ekvivalentteja transformoimattoman hiivan tuottamien kanssa. Tämä osoittaa, että PGK UAS on olennaisen 35 tärkeä PGK-mRNA:n synteesille.

10 96620

Galaktoosin avulla indusoitavan PGK:n perustuvan geenin konstruoiminen

Kuviossa 2 on esitetty kaavamaisesti hiivan GAL1-GAL10 poikkeavan promoottorin järjestys. UAS:n funktionaalinen 5 alue on paikallistettu (West et al.f 1984) ja sen kohta on ilmoitettu yhdessä sivuilla olevien restriktiokohtien kanssa (kuvio 2). 365 emäsparin DNA-fragmentti on löydettävissä plasmidi pLGSD5:ssä (Guarante et ai., 1982), jossa on GAL10 UAS. 144 emäsparin Rsa I - Alu I DNA-fragmentti GAL1-GAL10 10 promoottorialueelta pLGSD5:ssä puhdistettiin polyakryyliami-digeelistä ja liitettiin tasaiseen päähän ainoaan Sma I kohtaan pUC8:ssa (kuvio 3). Sitten muutettiin pDBl:n ainoa EcoRI kohta (kuvio 3) Bgl II kohdaksi synteettisen Bgl II oligonukleotidi-linkkerin insertion avulla. Täten 144 emäs-15 parin GAL10 UAS voitiin eristää ainoalla Bgl II - Bam HI DNA -fragmentilla, joka oli plasmidi pDB2:ssa (kuvio 3).

Tämä fragmentti kloonattiin sitten ainoaan Bam HI -kohtaan kussakin kolmessa PGK-deleetiovektorissa pDB3, pDB4 ja pDB5; GAL10 UAS -insertiot saatiin kussakin orientoinnissa plasmi-20 dien johtamiseksi, joita merkittiin pKV4i-pKV46 (kuvio l).

Plasmidit pKV43, pKV44, pMA27 ja pDB4 transformoitiin kantaan DBY745 ja PGK-spesifisen mRNA:n määrät määriteltiin hiililähteenä joko glukoosia tai galaktoosia sisältävän vä-25 liaineen eksponentiaalisen kasvun aikana. Tulokset ilmoitti -• vat, että pKV43:n ja pKV44:n tapauksessa PGK-spesifistä mRNArta voitiin indusoida hyvin korkeisiin määriin galaktoosin läsnäollessa, kun taas kasvu glukoosin kanssa antoi tulokseksi PGK-spesifisen mRNArn kromosomaalisia määriä. Plas-30 midi pMA27:ää sisältävät transformantit osoittivat korkeita PGK-spesifisen mRNArn määriä kun niitä kasvatettiin sekä glukoosi- että galaktoosiväliaineessa, mutta pDB4 ei osoittanut mitään aktiivisuutta kuminassakaan hiililähteessä. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että PGK UAS:n korvaaminen 35 GAL10 UASrllä kummassakin orientoinnissa saa aikaan korkea-asteisen galaktoosin säätelemän DNA-transkription PGK-pro-moottorilla. Transformantit, joissa oli plasmidi pDB3 ja pDB5, ylläpitivät korkeita PGK-spesifisen mRNArn tasoja < : · I I i «l . .

96520 11 sekä glukoosi- että galaktoosiväliaineessa, jotka olivat verrattavissa plasmidi pMA27:n vastaavaan. Kun kyseessä ovat plasmidit pKV41, pKV42, pKV45 ja pKV46, pidetään yllä korkeita PGK-spesifisen mRNA:n tasoja molemmilla hiililähteillä.

5 Nämä tulokset osoittavat, että ei riitä, jos insertoidaan GAL UAS mihin tahansa 5' kohtaan PGK:n transkription aloitusse-kvenssiin, jotta saataisiin transkription galaktoosisäätely, vaan on välttämätöntä sekä insertoida GAL UAS että poistaa PGK UAS. Siten pKV43:n ja pKV44:n tapauksessa PGK UAS on de-10 letoitu ja tilalle on pantu GAL UAS.

Galaktoosin avulla säädellyn PGK:n ekspressiovektorin konstruoiminen

Plasmidi pDB4:ää katkaistiin ainoassa Bgl II kohdassa, joka 15 sijaitsi PGK-rakennegeenin 3' alueella ja lineaarinen molekyyli liuotettiin Bal 31 eksonukleaasin kanssa (kuvio 4).

DNA-fragmentteja pantiin sisään ja ligatoitiin uudelleen Bgl II synteettisten oligonukleotidilinkkereiden ylimäärän läsnäollessa; näin muodostuneet plasmidit tutkittiin geeli-20 elektroforeesin ja DNA-sekvensointi s en avulla täsmällisen de-leetion "päätekohdan" määräämistä varten. Saatiin sarja de-leetiojohdannaisia, jotka poikkesivat nukleotidisekvenssin puolesta välittömästi Bgl II linkkerin 5'-kohdassa. Saatiin deleetiojohdannaisia, joiden "päätekohdat" olivat asennoissa 25 -8 (pKV47), +4 (pKV51), +5 (pKV52) ja +6 (pKV53) (kuvio 4).

Deleetiojohdannaisia muunneltiin edelleen kiinnittämällä PGK geenin 3' transkriptioterminaattorisekvenssi. Tämä suoritettiin pilkkomalla kukin plasmidi restriktioendonukle-30 aaseilla Bgl II ja Pst I ja ligatoimalla näin muodostettu suuri fragmentti pienen Bam HI - Pst I fragmentin kanssa, : joka sisälsi plasmidi pMA91:stä johdetun PGK-geenin 3'-tran- skriptioterminaattorisekvenssin (Mellor et ai., 1983).

35 Näin muodostettuja plasmideja muunneltiin sitten edelleen in-sertoimalla ainoaan Bam HI -kohtaan PGK geenin muunnellus- 12 96620 sa 5' ei-koodaavassa alueessa Bgl II - Bam HI -fragmentti, joka sisälsi GAL10 - UAS:n pDB2:sta (kuvio 3). GAL10 - UAS:n insertion orientoituminen määrättiin sitten restriktioent-syymipilkkomisanalyysin avulla, jolloin saatiin kuviossa 5 5 ilmoitettuja plasmideja.

Tällä tavoin saatiin sarja galaktoosilla säädeltyjä PGK-ekspressiovektoreita, joissa PGK - UAS oli korvattu GAL10 UAS:llä. DNA-sekvenssi, joka ympäröi kaikkien näiden vekto-10 reiden PGK-koodaavan alueen kohtaa l, on esitetty kuviossa 4. Muunnellun PGK 5' ei-koodaavan alueen DNA-sekvenssi, johon on insertoitu GAL10 UAS, on sen sijaan esitetty kuviossa 5.

15 Ekspressiovektoreita pKV49 ja pKV50 (kuviot 4 ja 5) voidaan käyttää välittämään heterologisten ja homologisten geenien ekspressiota, joissa 5' translationaalinen aloitussignaali (ATG) on korvattu halutulla geenillä. Olosuhteissa, joissa ekspressoitavalla geenillä ei ole 5' translationaalista 20 aloitussignaalia (ATG), voidaan käyttää translationaalisia fuusiovektoreita. Tässä suhteessa deleetiot PGK koodaussek-venssissä, joka päättyy kohtiin +4, +5 ja +6 (kuvio 4) helpottavat ekspressoitavan geenin fuusiota kuhunkin kolmeen mahdolliseen lukemakehykseen. Näitä deleetiojohdannaisia 25 on käytetty ekspressiovektoreiden pKV61-66 konstruoimiseen.

Plasmidit pKV61 ja pKV62, pKV63 ja pKV64, pKV65 ja pKV66 ovat analogisia pKV49:n ja pKV50:n kanssa GAL10 UAS:n orientoimisen suhteen (kuvio 5).

30 Ihmisen seerumialbumiinin tuottaminen hiivassa cDNA-klooni, joka koodaa ihmisen seerumiproteiinia albumiinia (HSA) eristettiin 1,84 kiloemäsparin BamHI DNA -fragmentista plasmidista pEK113 (selostettu EP-julkaisussa 0201239 A, Delta Biotechnology Ltd.) ja subkloonattiin ainoaan Bglll 35 kohtaan ekspressiovektoreissa pKV49 ja pKV50 (kuviot 4 ja 5) plasmidien pKV59 ja pKV60 ekspressoimista varten (kuvio 6).

Tätä HSA:ta koodaavaa DNA-sekvenssiä oli aikaisemmin manipu-loitu, niin että se sisälsi 5' translationaalisen aloitus- >t Mil MB l i J M : 13 96620 signaalin välittömästi valmiin HSA:a koodaavan sekvenssin ensimmäisen kodonin vieressä (EP-julkaisu 0201239 A) . DNA-sekvenssi HSA-geenin ja pKV49:n ja pKV50:n 5' liittymäkohdassa on esitetty kuviossa 7.

5

Plasmidit pKV59 ja pKV60 transformoitiin laboratoriohiiva-kantaan DBY745 standardimenetelmin. Transformantteja kasvatettiin sitten SCrssä, jota oli täydennetty adeniinilla ja urasiilillä plus joko glukoosilla (1 % paino/tilavuus) ja 10 galaktoosilla (l % paino/tilavuus) tai galaktoosilla (1 % paino/tilavuus), jotka edustivat vastaavasti ehkäiseviä ja indusoivia hiililähteitä. Viljelyistä korjattiin tulos solu-tiheydellä 4-6 x 106 per ml ja käytettiin kokonais DNA-, kokonais RNA- ja proteiiniuutteiden valmistamiseen. Kuviossa 15 8 esitetyt tulokset osoittavat selvästi, että galaktoosi in dusoi HSA-spesifisen mRNA:n synteesiä, kun taas glukoosin läsnäollessa voidaan havaita vähän tai ei lainkaan HSA-spesifistä mRNA:a. Solu-uutteista tutkittiin myös HSA-proteiini SDSrpolyakryyliamidigeeli-elektroforeesin ja "Western blot-20 ting"-menetelmän avulla (EP-julkaisu 0201239 A). Tulokset näistä geeleistä olivat yhtäpitäviä edellä selostettujen mRNA-analyysien kanssa, sillä voitiin havaita huomattavia määriä HSA:a hiivassa, jota kasvatettiin galaktoosin läsnäollessa, kun taas hiiva, jota kasvatettiin glukoosin läsnä-25 ollessa, tuotti paljon vähemmän mutta havaittavissa olevia : määriä HSA:a. Kun proteiininauhat saatiin näkyviin SDS:poly- • · akryyliamidigeeleissä coomassie-sinivärjäyksellä, huomattava osa kokonaissoluproteiinista muodostui HSA-proteiinista galaktoosilla indusoiduissa viljelyissä, kun taas HSA-nauhaa 30 ei voitu silmillä havaita viljelyissä, jotka kasvatettiin glukoosin läsnäollessa.

14 96620

Kirjallisuusviitteet

Birnboim, A.C. & Doly, J. (1979), Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523.

Chinault, A.C. & Carbon, J.A. (1979), Gene, 5, 111-126.

5 Dobson, M.J. et. ai. (1982), Nucleic Acids Research, 10, 2625-2637.

Dobson, M.J. et. ai. (1984), EMBO Journal, 3, 1115-1121. Guarente, L. (1984), Cell, 36, 799-800.

Guarente, L. et. ai. (1982), Proceedings of the National 10 Academy of Sciences, USA, 79, 7410-7414.

Guarente, L. Mason, T. (1983), Cell, 32, 1279-1286.

Hinnen, A. et. ai. (1978), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 75, 1929-1933.

Holland, M.J. & Holland, J.P. (1978), Biochemistry, 17, 15 4900-4907.

Holmes, D.S. & Quigley. F.A. (1981), Annals of Biochemistry, 114, 193-197.

Johnston, M. & Davis, R.W. (1984), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 75, 2878-2882.

20 Hopper, J.E. et. ai. (1978), Molecular and Cellular Biology, 4, 1440-1448.

Kingsman, A.J. & Kingsman, S.M. (1982), EP-hakemus nro 82304460.7.

Kingsman, A.J. & Kingsman, S.M. (1984), PCT-hakemus nro 25 PCT/GB84/00189(W0 84/04757).

: Maniatis T. et. ai. (1982), Molecular Cloning. A laboratory > ·

Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY.

Maxam, A.M. & Gilbert, W. (1980), Methods in Enzymology, 65, 30 499-560.

Mellor, J. et.al. (1983), Gene, 24, 1-14.

Miller, J.H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY.

Petes, T.D. et. al. Journal of Bacteriology, 134, 295-305.

35 Rigby, P.J.W. et al. (1972), Journal of Molecular Biology, 113, 237-251.

Sanger, F. et. al. (1977), Proceedings of the National Aca-demy of Sciences. USA, 74, 5463-5467.

96620 15 Särökin, L. & Carlson, M. (1984), Molecular and Cellular Biology, 5, 2521-2526.

St. John, T & Davis, R. (1979), Cell, 16, 443-452.

Struhl, K. (1982), Proceedings of the National Academy of 5 Sciences, USA, 79, 7385-7389.

Struhl, K. (1984), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81, 7865-7869.

Tabak, H.F. & Flavell, R.A. (1978), Nucleic Acids Research, 5, 2321-2332.

10 Thomas, P. (1980), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 5201-5202.

Tuite, M.F. et. ai. (1982), EMBO Journal, 1. 603-608.

West, R.W. et. ai. (1984), Molecular and Cellular Biology, 4, 2467-2478.

• >

Claims (11)

96620

1. Hiivan hybridipromoottori, joka käsittää, ylävirran ak-tivointisekvenssinä, Saccharomyces cerevisiaen GAL10-geenin ylävirran aktivointisekvenssin ja, alavirtaosana, S. cerevi- 5 siaen promoottorin alavirtaosan, joka on tehokas promotoi-maan alavirtaan siitä asetettujen koodaussekvenssien transkriptiota, tunnettu siitä, että mainittu S. cerevisiae -promoottori on PGK-geenin promoottori ja hybridipromoottori ei sisällä luonnollisessa PGK-promoottorissa nukleotidikoor-10 dinaattien -423 ja -470 välissä olevaa endogeenista PGK-ylä-virta-aktivointisekvenssiä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivan hybridipromoottori, tunnettu siitä, että GAL10 ylävirranpuoleinen aktivoin- 15 tisekvenssi sijoitetaan kohtaan, josta PGK ylävirran puoleinen aktivointisekvenssi on deletoitu.

3. Hiivan ekspressiovektori, tunnettu siitä, että se sisältää hybridipromoottorin, joka on jommankumman edellisen pa- 20 tenttivaatimuksen mukainen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen hiivan ekspressiovektori, tunnettu siitä, että siinä on restriktiokohta ala-virtaan translationaalisesta aloituskodonista, jota säätelee hiivan 25 hybridipromoottori, joka tekee mahdolliseksi insertoida sii- ; hen geeni, jota halutaan ilmentää, oikeisiin translationaa- , * lisiin lukukehyksiin.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen hiivan ekspressiovektori, 30 tunnettu siitä, että a) siinä ei ole mitään translationaalista aloituskodonia translationaalisella aloituspaikalla, jota säätelee hiivan hybridipromoottori, mutta b) siinä on restriktiokohta, johon geeni, jota halutaan 35 ilmentää ja jossa on translationaalinen aloituskodoni, voidaan insertoida siten, että geenin translationaalinen aloituskodoni on oikeassa kohdassa hiivan hybridipromoottoriin nähden. I iti I ill, I i i a» . 96620

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen hiivan ekspressiovektori, tunnettu siitä, että siinä on homologinen geeni, jota halutaan ilmentää, hiivan hybridipromoottorin säätelyn alaisena.

7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen hiivan ekspressiovektori, tunnettu siitä, että siinä on heterologinen geeni, jota halutaan ilmentää, hiivan hybridipromoottorin säätelyn alaisena.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen hiivan ekspressiovektori, tunnettu siitä, että siinä heterologinen geeni koodaa ihmisen seerumialbumiinia.

9. Hiiva, tunnettu siitä, että se on transformoitu minkä 15 tahansa patenttivaatimuksen 3-8 mukaisen vektorin avulla.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että se on transformoitu panimohiiva.

11. Menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa peptidiä tai proteiinia, siten että menetelmässä pidetään galaktoosia sisältävässä väliaineessa hiivaa, joka on transformoitu hiivan ekspressiovektorin avulla, tunnettu siitä, että mainitun peptidin tai proteiinin tuotantoa säätelee patenttivaatimuk-25 sen 1 tai 2 mukainen hybridipromoottori, ja saadaan näin ; valmistettua peptidiä tai proteiinia. * 9662C