FI94262C - Menetelmä loiseläinten vastaisen makrolidin valmistamiseksi - Google Patents

Description

94262

Menetelmä loiseläinten vastaisen makrolidin valmistamiseksi Tämä keksintö liittyy uuteen loiseläinten vastai-5 seen aineeseen ja erityisesti uuden milbemysiineihin kuuluvan makrolidin eli 22-hydroksi-23-deoksi-LL-F28249a-an-tibiootin valmistusmenetelmään.

Milbemysiinit muodostavat tärkeän laajakirjoisen loiseläinten vastaisten aineiden ryhmän, jolla on matoja, 10 ulkoloisia, hyönteisiä, bakteereja ja sieniä tuhoavaa ja kasvua edistävää aktiivisuutta ja joilla on käyttöä eläinten ja ihmisten terveydenhuollossa, maanviljelyksessä ja puutarhanhoidossa. Niitä tuotetaan fermentoimalla tiettyjä Streptomyces -suvun mikro-organismeja aerobisissa olo-15 suhteissa nestemäisellä tai kiinteällä ravintoalustalla, joka sisältää epäorgaanisia suoloja sekä assimiloitavassa muodossa olevia hiilen ja typen lähteitä. Esimerkiksi GB-patenttijulkaisussa 1 390 336 kuvattu Streptomyces hygroscopicus spp aureolacrimosus B-41-146 -mikro-organis-20 min fermentaatio tuottaa yhteisellä nimellä B-41 -yhdisteinä tunnetun milbemysiiniperheen. Toisena esimerkkinä on EP-patenttijulkaisussa EP-A-0 170 006 kuvattu Streptomyces cyaneogriseus spp noncyanogenus -mikro-organismin fermentaatio, joka tuottaa yhteisellä nimellä LL-F28249 ’ 25 -yhdisteinä tunnetun toisen milbemysiiniperheen.

Milbemysiineihin liittyvät yhdisteet on kuvattu patenttijulkaisussa EP-A-0 254 583. Niitä saadaan fermentoimalla Streptomyces E225:nä ja Streptomyces E225B:nä tunnettuja Streptomyces -mikro-organismeja.

30 Tässä keksinnössä on löydetty UK-86956:ksi nimetty uusi makrolidi, jota voidaan tuottaa viljelemällä uutta Streptomyces griseochromogenes N859-124 -mikro-organismia alla kuvatulla tavalla. Erittäin aktiivinen yhdiste UK-86956 omaa laajan vaikutuskirjon ihmisiä ja eläimiä « 2 94262 vaivaavia tuhohyönteisiä, punkkeja, vapaana eläviä sukkulamatoja ja sisä- ja ulkoloisia vastaan.

Täten tämän keksintö koskee menetelmää 22-hydroksi-23-deoksi-LL-F28249a-antibiootin valmistamiseksi, jolla on 5 kaaVa (I): ΗΟνίίν l! o- n 10 i v (i)

CpL

on 15 Mainittu yhdiste eli UK 86956 eroaa patenttijulkaisussa EP-A-0 170 006 kuvatusta yhdisteestä LL-F28249ot siinä, että sillä on hydroksisubstituentti C-22 -asemassa eikä C-23 -asemassa. Se eroaa myös patenttijulkaisussa EP-A-0 254 583 esitetyistä yhdisteistä siinä, että sillä on 20 1,3-dimetyyli-l-butenyyliradikaali asemassa 25 1-metyyli- 1-propenyyliradikaalin sijasta.

UK 86956:tta voidaan tuottaa Itohin kaupungista, Shizuokan prefektuurista, Japanista, kerätystä maaperä-näytteestä eristetyn mikro-organismin aerobisella pin-25 nanalaisella fermentaatiolla vesipitoisessa ravintoliuok sessa tai fermentoimalla kiinteällä agarilla aerobisissa olosuhteissa. Tämä mikro-organismi on talletettu talletuslaitokseen American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, hakunume-30 rolla ATCC 53928 29. kesäkuuta 1989. Se on nimetty tässä hakemuksessa viljelmäksi N859-124. Se on luonnehdittu seuraavalla tavalla:

Viljelmä N859-124 ympättiin vinopintaviljelmästä ATCC #172 -lihaliemeen ja sitä kasvatettiin neljän päivän 35 ajan 28 °C:n lämpötilassa ravistelijalla. Tämän jälkeen 3 94262 se sentrifugoitiin 20 minuutin ajan, pestiin kolme kertaa steriilillä vedellä ja ympättiin Actinomycetales -lahkon jäsenten tunnistukseen yleisesti käytetylle alustalle.

Viljelmää inkuboitiin 28 °C:n lämpötilassa ja tu-5 lokset luettiin vaihtelevina aikoina, mutta yleisimmin 14 päivän kuluttua. Värit kuvattiin yleisen terminologian mukaisesti, mutta tarkat värit määritettiin vertaamalla teoksesta Color Harmony Manual, neljäs painos, saatuihin väriliuskoihin. Kokonaisten solujen aminohappo- ja soke-10 rianalyysimenetelmät on kuvattu julkaisuissa Becker, B.

et ai., (1964) Appi. Microbiol., 12, 421 - 423 ja Lecheva-lier, M.P., (1968) J. Lab. Clin. Med., 71 934 - 944. Ver-tailutarkoituksiin hankittiin talletuslaitoksesta American Type Culture Collectionista, Rockville, Maryland, tyyp-15 pikannat Streptomyces griseochromogenes ATCC 14511 ja S. durhamensis ATCC 23194.

Viljelmien luonnehtimiseen käytetyt tunnistusalus-tat ja viitteet niiden koostumukseen olivat seuraavat: I. Tryptone-Yeast Extract Broth - (ISP #1 -liuos, Difco).

20 2. Yeast Extract-Malt Extract Agar - (ISP #2 -alusta,

Difco).

3. Oatmeal Agar - (ISP #3 -alusta, Difco).

4. Inorganic Salts-Starch Agar - (ISP #4 -alusta, Difco).

5. Glycerol-Asparagine Agar - (ISP #5 liuos, Difco).

’ 25 6. Peptone-Yeast Extract Iron Agar - (ISP #6 -alusta,

Difco).

7. Czapek-Sucrose Agar - S.A. Waksman, (1961) The Actino-mycetes, osa. 2, alusta no. 2, s. 328.

8. Glucose-Asparagine Agar - Ibid, alusta no. 2, s. 328.

30 9. Bennett's Agar - Ibid, alusta no. 30, s. 331.

10. Emerson's Agar - Ibid, alusta no. 28, s. 331.

II. Nutrient Agar - Ibid, alusta no. 14, s. 330.

12. Gordon and Smith's Tyrosine Agar - R.E. Gordon ja M.M. Smith, (1955) J. Bacteriol. 69, 147 - 150.

35 13. Casein Agar - Ibid.

4 94262 14. Calsium Malate Agar - S.A. Waksman, (1957) Bacteriol. Rev. 21, 1 - 29.

15. Gelatin - R.E. Gordon ja J.M. Mihm, (1957) J. Bacteriol. 73, 15 - 27.

5 16. Starch - Ibid.

17. Organic Nitrate Broth - Ibid.

18. Dextrose Nitrate Broth - S.A. Waksman, (1961) The Actinomycetes, osa 2, liuos no. 1, s. 328, jossa 3 g dekstroosia on korvattu 30 g:lla sakkaroosia ja agar on 10 jätetty pois.

19. Potato Carrot Agar - M.P. Lechevalier, (1968) J. Lab. and Clinical Med. 71, 934 - 944, mutta käytetään vain 30 g perunaa, 2,5 g porkkanaa ja 20 g agaria.

20. 2-%:sta vesijohtoveteen tehtyä agaria.

15 21. Skim Milk - Difco.

22. Selluloosan käyttökyky a) H.L. Jensen, (1930) Proc. Linn. Soc. N.S.W 55, 231 - 248.

b) M. Levine ja H.W. Schoenlein, (1930) A Compilation 20 of Culture Media, alusta no. 2511.

23. Hiilihydraattien käyttökyky - ISP #9 -liuos, Difco.

24. Lämpötila-alueen testaus - ISP #2 -liuos plus 50 ml kookosmaitoa litraa kohti.

Yeast Extract-Malt Extract Agar - Kasvu hyvä, väriltään • 25 valkoisesta vaalean harmaaseen (lähellä harmaan sarjoja 2 ba, 3 ba), koholla oleva, sileä pinnan yläpuolella oleva rihmasto sama kuin pinnalla, esiintyy värivaihtelua kellertävästä kellanruskeaan (2 le, 3 ie), liukeneva pigmentti väriltään kellertävää (2 le).

30 Oatmeal Agar - Kasvu keskinkertaista, väriltään harmaa, tumman harmaasta vaaleanpunertavaan harmaaseen (lähellä harmaan sarjoja 3 dc, 3 fe, 5 fe, 5 ih, 4 ig), vähäisestä keskinkertaiseen koholla oleva, sileä, pinnan yläpuolella oleva rihmasto sama kuin pinnalla, esiintyy värivaihtelua 35 kellertävän harmaaseen (1 1/2 gc, 1 1/2 ie), liukeneva 5 94262 pigmentti väriltään värittömästä kermanväriseen (1 1/2 ca).

Inorganic Salts-Starch Agar - Kasvu hyvä, väriltään vaalean harmaa, harmaasta tumman harmaaseen (lähellä harmaan 5 sarjoja 3 dc, 3 f e, 3 ih), koholla oleva, sileä pinnan yläpuolella oleva rihmasto sama kuin pinnalla, esiintyy värivaihtelua vaalean kellertävään (2 ca, 2 ea), liukeneva pigmentti kermanväristä (2 ca).

Glycerol-Asparagine Agar - Kasvu vaihtelee heikosta kes-10 kinkertaiseen, väriltään vaikeahkosta vaalean kellertävään (s ca, 2 ea), hieman koholla oleva, sileä tai eristyneinä pesäkkeinä esiintyvä pinnan yläpuolella oleva rihmasto vaikeahko, esiintyy värivaihtelua vaalean kellertävään (2 ea, 2 ca), ei liukenevaa pigmenttiä.

15 Czapek-Sucrose Agar - Kasvu keskinkertaista, kermanväristä, jossa vaaleita vaikeahkon harmaita osia sisältävä pinnan yläpuolella oleva rihmasto, ohut, sileä, esiintyy värivaihtelua värittömästä kermanväriseen (2 ca), ei liukenevaa pigmenttiä.

20 Glucose-Asparagine Agar - Kasvu hyvä, väriltään valkoinen vaalean harmaasta harmaaseen (lähellä harmaan sarjoja 3 dc, 3 fe, 3 cb), koholla oleva, sileä pinnan yläpuolella oleva rihmasto sama kuin pinnalla, esiintyy värivaihtelua kellertävään (2 ga, 2 ia, 2 le), liukeneva pigmentti vä-* 25 riltään vaalean kellertävää (2 ea).

Gordon and Smith's Tyrosine Agar - Kasvu keskinkertaista, tumman ruskea (3 nl) hieman koholla oleva, sileästä rakeiseen vaihteleva ei pinnan yläpuolella olevaa rihmastoa, esiintyy värivaihtelua tummanruskeaan (3 nl), liukeneva 30 pigmentti väriltään tummanruskeaa (3 nl).

Casein Agar - Kasvu hyvä, väriltään kellanharmaasta orans-sinharmaaseen (2 ie, 2 lg, 4 ie), jonkin verran valkoista pinnan yläpuolella olevaa rihmastoa pyyhkäisyjäljen loppu-päätä kohti, keskinkertaisesti koholla oleva, ryppyinen, « 6 94262 esiintyy värivaihtelua kellertävään (2 le), liukeneva pigmentti väriltään tumman ruskeaa (3 ni) .

Bennett's Agar - Kasvu hyvä, väriltään valkoisesta vaalean harmaaseen (lähellä harmaan sarjoja 3 cb, 3 dc) , koholla 5 oleva, sileä, mutta saattaa olla ryppyinen reunaa kohti, hyaliinia tihkunut, pinnan yläpuolella oleva rihmasto sama kuin pinnalla, esiintyy värivaihtelua tumman ruskeaan (3 li), liukeneva pigmentti väriltään ruskeaa (3 ng). Emerson's Agar - kasvu hyvä, väriltään kellertävän har-10 maasta harmaaseen (2 ni, 2 li) , koholla oleva, ryppyinen, ei pinnan yläpuolella olevaa rihmastoa, esiintyy värivaihtelua tumman ruskeaan (3 ni, 3 li), liukeneva pigmentti tumman ruskeaa (3 nl, 3 pn).

Nutrient Agar - Kasvu vaihtelee huonosta keskinkertaiseen, 15 ruskea (3 lg) , vaihtelee ohuesta hieman koholla olevaan, sileä tai esiintyy eristyneinä pesäkkeinä, ei pinnan yläpuolella olevaa rihmastoa, esiintyy värivaihtelua ruskeaan (3 ie, 3 lg), liukeneva pigmentti kellertävän ruskeaa (3 ie, 3 le).

20 Calcium Malate Agar - Kasvu keskinkertaista, väriltään harmaasta tumman harmaaseen (lähellä harmaan sarjoja 3 fe, 3 ih) , hieman koholla oleva, sileä, pinnan yläpuolella oleva rihmasto sama kuin pinnalla, esiintyy värivaihtelua vaalean harmaasta harmaaseen (lähellä harmaan sarjoja • 25 3 dc, 3 fe), ei liukenevaa pigmenttiä.

Gelatin Agar - Kasvu vaihtelee keskinkertaisesta hyvään, väriltään valkoisesta kellanruskeaan (3 ec), keskinkertaisesti koholla oleva, vaihtelee sileästä ryppyiseen, ei pinnan yläpuolella olevaa rihmastoa, esiintyy värivaihte-30 lua kellertävään (2 ga, 2 ie), liukeneva pigmentti tumman kellertävä (2 ne).

Starch Agar - Kasvu vaihtelee keskinkertaisesta hyvään, tumman kellertävän vihreä (1 1/2 ie, 1 1/2 le), keskinkertaisesti koholla oleva, vaihtelee sileästä ryppyiseen, ei 35 pinnan yläpuolella olevaa rihmastoa, esiintyy värivaihte- 7 94262 lua kellertävään (2 ie), liukeneva pigmentti kellertävän ruskea (3 pe).

Potato Carrot Agar - Kasvu vaihtelee heikosta keskinkertaiseen, väriltään valkoinen kermanvärisestä vaalean har-5 maaseen (2 ca, lähellä harmaan sarjoja 3 cb, 3 dc) ohut, sileä, väriltään valkoisesta vaalean harmaaseen olevaa pinnan yläpuolella olevaa rihmastoa, esiintyy värivaihte-lua värittömästä kermanväriseen (2 ca), ei liukenevaa pigmenttiä .

10 Vesijohtoveteen tehty agar - Kasvu heikkoa, vaalean harmaa (lähellä harmaan sarjoja 3 cb, 3 dc), ohut, sileä, pinnan yläpuolella oleva rihmasto vaalean harmaa, esiintyy väri-vaihtelua värittömästä vaalean harmaaseen (lähellä harmaan sarjoja 3 cb, 3 dc), ei liukenevaa pigmenttiä.

15 Morfologiset ominaisuudet - Morfologiset tarkastelut suoritettiin kaurajauhoagarilla 14 päivän inkuboinnin jälkeen: itiöiden massa harmaaväriasteikolla, itiöketjut sektiospiraaleissa, tiukasti tai hieman avoimesti kiertyneinä 7 kierrokseen saakka, 10 - 50 itiötä itiöketjua 20 kohden, sporoforit monopodiaalisesti haaroittuneita, harvoin kiehkuraisesti haaroittuneita, itiöt pallomaisia, muoto vaihtelee ovaalista elliptiseen, läpimitta 0,9 - 1,3 pm tai 1,2 - 1,8 x 0,9 - 1,3 pm, piikikkäitä määritettynä pyyhkäisyelektronimikroskopialla.

• 25 Biokemialliset ominaisuudet - Tuotti melaniinia, ei tuot- tanut rikkivetyä, gelatiini nesteytyi, tärkkelys hydrolysoitui, dekstroosinitraatti pelkistyi nitraatiksi, orgaaninen nitraatti ei pelkistynyt, heikko kasvu Jensenin sel-luloosalihaliemellä mutta ei kasvua Levinin ja Schoenlei-30 nin selluloosalihaliemellä, ei hajotusta kummallakaan sel-luloosalihaliemellä, kirkastumista mutta ei koaguloitumista eikä peptonisoitumista maidolla, kaseiinin pilkkoutuminen positiivinen, tyrosiinin hajotus negatiivinen, kal-siummalaatin pilkkoutuminen negatiivinen. Hiilihydraatin 35 käyttökyky: Glukoosin, arabinoosin, fruktoosin, inosito- • 94262 δ

Iin, mannitolin, raffinoosin, sakkaroosin ja ksyloosin käyttökyky, ei ramnoosin käyttökykyä.

Kasvun suhtautuminen lämpötilaan 5 21 °C 28 °C 37 °C 45 °C

Keskinkertainen Hyvä Hyvä Ei kasvu kasvu kasvu kasvua 10 Soluseinämän analyysi - kokonaisten solujen hydrolysaatit sisälsivät LL-diaminopimeliinihappoa ja glukoosia.

Viljelmälle N859-124 on ominaista harmaat itiöt massassa, positiivinen melaniinireaktio, kierteiset itiö-ketjut ja piikikkäät itiöt. Kokonaisten solujen hydroly-15 saatit viittaavat siihen, että LL-diaminopimeliinihappoa esiintyy ja diagnostiset sokerit puuttuvat. Havaittiin glukoosin, arabinoosin, fruktoosin, inositolin, mannitolin, raffinoosin, sakkaroosin ja ksyloosin mutta ei ramnoosin käyttöä. Tämän perusteella viljelmä kuuluu Strep-20 tomyces -sukuun.

Verrattaessa kuvattuihin Streptomyces -lajeihin, viljelmä N859-124 muistuttaa läheisesti S. durhamensistä ATCC 23194 ja S. griseochromogenestä ATCC 14511 viljelyominaisuuksiensa sekä morfologisten että ja biokemial-25 listen ominaisuuksiensa perusteella. Tämän mukaisesti näitä kolmea viljelmää verrattiin rinnan niiden sukulaisuussuhteiden varmistamiseksi.

Viljelmän N859-124 biokemialliset ominaisuudet olivat suurimmaksi osaksi samat kuin S. durhamensiksen. 30 Edellinen eroaa kuitenkin jälkimmäisestä siinä, että se ei kykene tuottamaan rikkivetyä, kykenee pelkistämään dekstroosinitraatin nitriitiksi, ei kykene koaguloimaan ja 9 94262 peptonisoimaan maitoa eikä kykene kasvamaan 45 °C:n lämpötilassa. Joitakin eroavuuksia huomattiin viljelyominaisuuksissa. Esimerkiksi kaurajauhoagarilla, epäorgaanisia suoloja ja tärkkelystä sisältävällä agarilla ja glukoosi-5 asparagiiniagarilla viljelmän N859-124 pesäkkeet olivat tummemman harmaan sävyisiä. Lisäksi glyseroli-asparagiini-agarilla ja Czapek -sakkaroosiagarilla viljelmä N859-124 tuotti mutta S. durhamensis -viljelmä ei tuottanut valkoista ja vaaleanharmaata rihmastoa tässä järjestyksessä 10 mainittuna.

Viljelmä N859-124 oli identtinen S. griseochromo-geneksen kanssa melaniinin tuoton, gelatiinin nesteytymisen, tärkkelyksen hydrolyysin, nitraatin pelkistämisen, maitoon reagoinnin, kasvun lämpötila-alueen ja hiilihyd-15 raattien käyttöominaisuuksian suhteen. S. griseochromo- genes tuotti vähäisen määrän rikkivetyä, mutta N859-124 ei tuottanut. Vaikka kummallakin viljelmällä oli samankaltaiset morfologiset ominaisuudet ja viljelyominaisuudet, huomattiin viljelyominaisuuksissa muutamia pieniä eroja. 20 Orgaanisia suoloja ja tärkkelystä sisältävällä agarilla ja glukoosi-asparagiiniagarilla viljelmän N859-124 pesäkkeet olivat itiöiden muodostumisesta johtuen pikemminkin harmaita kuin valkoisia. Viljelmässä N859-124 Czapek-sakka-roosiagarilla muodostui enemmän väriltään valkoisesta vaa-• 25 leanharmaaseen pinnan yläpuolella olevia rihmastoja. Vil- jelmän N859-124 pesäkkeet olivat hiivauute-mallasuuteaga-rilla pikemminkin sileitä kuin ryppyisiä ja Czapek -sakkaroosiagarilla ne levittäytyivät vähemmän kuin S. griseo-chromogeneksen pesäkkeet.

30 Tulosten perusteella viljelmän N859-124 katso taan olevan uusi Streptomyces griseochromogenes Fukunaga -kanta.

10 94262

Viljely ja makrolidin UK-86956 eristäminen voidaan suorittaa olosuhteissa, jotka ovat samanlaiset kuin mitä yleisesti käytetään antibioottien tuotantoon fermentaa-tiolla. Viljely voi tapahtua vesipitoisessa sopivia hii-5 li-, typpi ja hivenainelähteitä sisältävässä ravintoliuoksessa usean päivän jakson ajan aerobisissa olosuhteissa 24 - 36 °C:n lämpötilassa. Kuten useimmissa fermentaati-oissa on laita, tulee UK-86956:n määrä vaihtelemaan muuttuvien fermentaatio-olosuhteiden, erityisesti ravintoai-10 neiden, happiolosuhteiden ja pH:n mukaan. Tämän jälkeen rihmastotuote otetaan talteen sentrifugoimalla tai suodattamalla ja uuttamalla asetonilla tai metanolilla. Uutto-liuos konsentroidaan ja halutut tuotteet uutetaan veteen sekoittumattomaan orgaaniseen liuottimeen, kuten metylee-15 nikloridiin, etyyliasetaattiin, kloroformiin, butanoliin tai metyyli-isobutyyliketoniin. Uuttoliuos väkevöidään ja raakatuote puhdistetaan edelleen tarpeen vaatiessa kroma-tografiällä. UK-86956:n lopullinen puhdistus voidaan suorittaa käyttäen toistuvaa kolonnikromatografiaa tai käyt-20 täen menetelmää, kuten korkean erotuskyvyn käänteisfaasi-nestekromatografiaa (HPLC) tai preparatiivista ohutlevy-kromatograf iaa.

Vaihtoehtoisesti viljely voi tapahtua sopivan alustan sisältävillä agarmaljoilla aerobisissa olosuhteissa ’25 24 - 36 °C:n lämpötilassa usean päivän ajan. Agar rih- mastokasvustoineen uutetaan orgaanisella liuottimena, kuten metanolilla, suodatetaan ja suodos väkevöidään. UK-86956:n jatkorikastus ja erottaminen suoritetaan yllä esitetyllä tavalla.

30 Täten tämä keksintö tarjoaa menetelmän UK-86956:ksi nimetyn yhdisteen valmistamiseksi, joka käsittää sen, että mainitun yhdisteen tuottamiseen kykenevää N859-124-mikro- 11 94262 organismia tai sen jälkeläistä viljellään hiilen, typen ja epäorgaanisten suolojen assimiloituvassa muodossa olevia lähteitä sisältävässä vesipitoisessa nestemäisessä pinnanalaisessa ravintoliuoksessa tai kiinteällä agar -vil-5 jelyalustalla aerobisissa fermentaatio-olosuhteissa kunnes saadaan talteenotettavissa oleva määrä mainittua ainetta ja yhdiste otetaan talteen, eristetään ja puhdistetaan.

Kuten aikaisemmin mainittiin, tämän keksinnön mukaisesti valmistettu yhdiste on hyvin aktiivinen laajakir-10 joinen loiseläinten vastainen aine, joka on erityisen käyttökelpoinen matolääkkeenä, ulkoloismyrkkynä, hyönteismyrkkynä, punkkimyrkkynä ja eläinten kasvua edistävänä aineena.

Täten UK-86956 on tehokas erilaisten sisäloisten 15 aiheuttamien sairaustilojen hoidossa, mukaanlukien erityisesti useimmiten sukkulamatoina tunnetun loismatojen ryhmän aiheuttama matosairaus, joka voi aiheuttaa vakavia taloudellisia tappioita sikojen, lampaiden, hevosten ja nautakarjan hoidossa, ja joka vaivaa sekä kotieläimiä että 20 siipikarjaa. Yhdiste on tehokas myös toisia eri eläinlajeja vaivaavia sukkulamatoja vastaan, mukaanlukien esimerkiksi Dilofilaria koirilla ja monet erilaiset loiset, jotka voivat tarttua ihmiseen, mukaanlukien mahalaukun ja suoliston loiset, kuten Ancylostoma, Necator, Ascaris, ·1 25 Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Entero-bius ja veressä tai muissa kudoksissa ja elimissä esiintyvät loiset, kuten rihmamadot ja Strongyloideksen ja Tri-chinellan suolen ulkopuolisten vaiheiden muodot.

Tämä yhdiste on myös hyödyllinen ulkoloisten ai-30 heuttamien infektioiden hoidossa mukaanlukien erityisesti eläinten ja lintujen niveljalkaiset ulkoloiset, kuten punkit, täit, kirput, lihakärpäset, purevat hyönteiset ja 12 94262 kaksisiipisten vaeltavat toukat, jotka voivat vaivata nautakarjaa ja hevosia.

Tämä yhdiste toimii myös hyönteismyrkkynä kotitalouksien loisia, kuten torakoita, vaatekoita, mattokuori-5 aisia ja kärpäsiä vastaan, sekä on hyödyllinen varastoidun viljan ja maanviljelyksessä käytettävien taimien tuhohyönteisiä, kuten punkkihämähäkkejä, kirvoja ja hyönteistoukkia vastaan ja vaeltavia suorasiipisiä, kuten heinäsirkkoja vastaan.

10 Yhdiste UK-86956 voidaan antaa formulaatiossa, joka on tarkoituksenmukainen ottaen huomioon tuleva käyttötarkoitus ja hoidettava isäntäeläinlaji sekä sairauteen liittyvä loinen tai hyönteinen. Käytettäessä matolääkkeenä yhdiste annetaan edullisimmin joko ihonalaisena tai lihak-15 sensisäisenä ruiskeena, vaihtoehtoisesti se voidaan antaa pinnalle levitettävänä tai suun kautta kapselina, annoksena, tablettina tai nestemäisenä pakkolääkkeenä, tai se voidaan antaa siirteenä. Levitettävät ja ruiskeena annettavat lääkkeet valmistetaan tavanomaisesti normaalien 20 eläinlääketieteen työtapojen mukaan. Kapselit, annokset tai tabletit voidaan valmistaa sekoittamalla aktiivinen ainesosa sopivan hienojakoisen liuottimen tai kantaja-aineen kanssa, joka lisäksi sisältää hajoamista edistävää ainetta ja/tai sidosainetta, kuten tärkkelystä, laktoosia, 25 talkkia tai magnesiumstearaattia. Pakkosyöttöformulaatio voidaan valmistaa dispergoimalla aktiivinen ainesosa vesipitoiseen liuokseen yhdessä dispergoivien tai kosteuttavien aineiden kanssa ja injektoitavat formulaatiot voidaan valmistaa steriilin liuoksen tai emulsion muotoon. Nämä 30 formulaatiot vaihtelevat ottaen huomioon aktiivisen yhdisteen painon, joka riippuu hoidettavasta eläinlajista, in-fektiotyypin vakavuudesta ja vastaanottajan ruumiinpainosta. Yleensä suun kautta annosteltuna riittävä annos on noin 0,001 - 10 mg eläimen painokiloa kohden annettuna 35 yhtenä annoksena tai jaettuna 1-5 päivän aikana annet- 1 I % 13 94262 tuina annoksina, mutta tietenkin vastaan voi tulla tilanteita, joissa tarvitaan suurempia tai pienempiä annosrajoja, ja ne kuuluvat tämän keksinnön suojapiiriin.

Vaihtoehtoisesti yhdiste voidaan antaa yhdessä 5 eläinten rehun kanssa ja tähän tarkoitukseen voidaan valmistaa eläimen normaaliin rehuun sekoitettava konsentroitu rehun lisäaine tai ennalta sekoitettu aine.

Hyönteismyrkkynä ja tuhohyönteisten torjuntaan käytettäessä yhdistettä käytetään ruiskutteina, pölytteinä, 10 levitettävinä formulaatioina, emulsioina ja näitä vastaavina muotoina normaalien maanviljelykseen kuuluvien työtapojen mukaan.

Käytettäessä kasvua edistävänä aineena tai parantamaan maatilojen eläinten tai kotieläinten rasvattoman li-15 hän ja rasvan suhdetta yhdiste voidaan antaa yhdessä eläinten rehun tai juomaveden yhteydessä. Vaihtoehtoisesti se voidaan antaa suun kautta kapselin, annoksen, tabletin tai nestemäisen pakkosyötteen muodossa, tai ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti ruiskeena tai siirtenä. Tällai-20 set formulaatiot valmistetaan tavanomaisesti eläinlääketieteeseen kuuluvien tavallisten menetelmien mukaan.

Ihmisille tarkoitettua käyttöä varten yhdiste annetaan farmaseuttisesti hyväksyttävässä formulaatiossa lääketieteeseen kuuluvien tavallisten menetelmien mukaisesti.

. 25 Tätä keksintöä valaisevat seuraavat esimerkit, joista esimerkki 1 kuvaa UK-86956:n valmistuksen, eristämisen ja tunnistamisen, esimerkki 2 kuvaa UK86956:n mato-lääkevaikutuksen ja esimerkki 3 kuvaa UK86956:n hyönteis-myrkkyvaikutuksen.

30 Esimerkin 1 kyseessäollessa käytetyt Oxoid peptone ja Oxoid Lab Lemco saatiin yhtiöstä Oxoid Limited, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, U.K.

Ultraviolettispektrit otettiin talteen käyttäen Hewlett Packard 8452A -diodirivispektrofotometriä.

14 94262

Elektronin törmäysmassaspektroskopia suoritettiin käyttäen VG:n mallin 7070F massaspektrometriä.

Fast atom bombardment -spektroskopia suoritettiin käyttäen VG:n mallin 7070E massaspektrometriä. Näytteet 5 vietiin sisään käyttäen matriisia, joka koostui glyserolista, tioglyserolista, natriumkloridista ja vedestä.

Optinen rotaatio määritettiin Perkin Elmer 141 -polarimetrillä.

Ydinmagneettisen resonanssin spektrien määritystu-10 lokset saatiin käyttäen General Electric GN500 -spektrometriä.

Esimerkki 1

Mikro-organismia Streptomyces griseochromogenes N859-124 (ATCC 53928) kasvatettiin 28 °C:n lämpötilassa 15 seuraavan koostumuksen omaavalla agarvinopintaviljelmällä: tärkkelystä 20 g/1, glukoosia 10 g/1, Bacto-casitonea (saatu yhtiöstä Difco Co., Detroit, USA) 5 g/1, Difco Yeast Extractia 5 g/1, kalsiumkarbonaattia 1 g/1, agaria 20 g/1, pH säädetty 7,l:een. Seitsemän päivän kasvun jäl-20 keen pinnan yläpuolella olevaa kasvustoa käytettiin ymppäämään kuusi 500 ml:n Erlenmeyer -pulloa, joista kukin sisälsi 100 ml seuraavan koostumuksen omaavaa liuosta: tärkkelystä 24 g/1, Oxoid Peptonea 5 g/1, Oxoid Yeast Ex-tractia 5 g/1, kalsiumkarbonaattia 4 g/1, Lab Lemcoa 3 g/1 . 25 ja glukoosia 1 g/1. Näitä pulloja inkuboitiin 28 °C:n lämpötilassa 200 kierr/min nopeudella toimivalla pyörivällä ravistelijalla 4 päivän ajan. 5 ml tätä ymppiä lisättiin kunkin 117 agarmaljan pinnalle, jotka kukin sisälsivät 250 ml liuosta, jonka koostumus oli soijapapujauhoja 30 10 g/1, cerelose -valmistetta 10 g/1, tärkkelystä 10 g/1,

Distillers solubles -valmistetta 5 g/1, natriumkloridia 5 g/1, kalsiumkarbonaattia 1 g/1, kobolttikloridia 10 mg/1 ja agaria 20 g/1 ja jonka pH oli säädetty 7,2:een. Näitä maljoja inkuboitiin 28 °C:n lämpötilassa 5-7 päivän ajan 35 ennen koko materiaalin uuttoa metanolilla (30 1). Tulok- » 15 94262 sena ollut suspensio suodatettiin ja väkevöitiin tyhjiössä, jotta saatiin 1 litra vesipitoista liuosta. Tämä uutettiin kolme kertaa 1 1:11a etyyliasetaattia ja orgaaninen liuos väkevöitiin kuivaksi asti. Tähän jäännökseen 5 lisättiin 10 ml metanolia ja liuos vietiin Sephadex LH 20 -kolonniin (4 x 85 cm) ja eluoitiin 2 1:11a metanolia. Liuotin haihdutettiin tyhjiössä ja jäännökselle suoritettiin kromatografia silikapylväässä (Kieselgel 60, seulakoko 70 - 230, Merck) (4,5 x 30 cm) eluoimalla aluksi klo-10 roformilla (500 ml) ja lopuksi kloroformi-etyyliasetaatti 20:1 -seoksella. Fraktiot, joiden oli ohutlevykromatogra-fialla määritetty sisältävän UK86956:tta, väkevöitiin tyhjiössä kuiviksi. Lopullinen puhdistus suoritettiin prepa-ratiivisella silikalevykromatografiällä kehittäen kloro-15 formi-etyyliasetaatti 3:1 -seoksella, jotta saatiin 64 mg puhdasta UK-86956:tta.

Tällä tavoin saadulla puhtaalla UK-86956-näytteellä on seuraavat luonteenomaiset fysikaaliset ja spektroskooppiset ominaisuudet: 20 a) Spesifinen optinen rotaatio [a)25 + 95,0° (c = 0,16, asetoni) b) Ultravioletin absorptiospektri 238 ( = 24600) maksimi 244 ( = 27000) 252(sh) ( = 17500) ” 25 c) Pääasialliset ionit elektronin törmäysmassaspektrissä « .

612 (M+) , 594 (M-H20) , 576 (M-2HzO) + , 466, 151.

d) FAB-massaspektri 635 (M + Na+) (teoreettinen 635) e) Protonin magneettisen resonanssin osittainen spektri (CDClj): hyvin erottuvat signaalit δ = 5,79 (dm, J = 11,4, 30 1H) , 5,73 (dd, J = 13,8, 11,4, 1H) , 5,41 (bs, 1H) , 5,12 (d, J = 8,1, 1H), 4,69 (dd, J = 14,3, 2,1, 1H), 4,65 (dd, J = 14,3, 2,1, 1H), 4,29 (m, 1H) , 3,95 (d, J = 6,2, 1H) , 3,36 (d, J = 10,2, 1H) , 3,26 (m, J = 2,3, 1H) , 2,56 (m, 1H) , 1,87 (bs, 3H) , 1,57 (bs, 3H) , 1,54 (bs, 2H) , 1,40 « 16 94262 (q, J = 12, 1H) , 1,03 (d, J = 6,6, 3H) , 1,00 (d, J = 6,6, 3H), 0,93 (d, J = 6,7, 3H), 0,70 (d, J = 6,6, 3H).

Ydinmagneettisen resonanssin tulosten yksityiskohtaisen analyysin perusteella saadun yhdisteen uskotaan 5 olevan seuraavan stereokemiallisen kaavan: I ho. , 10 w ί_Γχ (ii)

mukainen. °H

Esimerkki 2 15 Esimerkissä 1 kuvatulla tavalla saadun yhdisteen UK-86596 matolääkevaikutus arvioitiin Caenorhabditis ele-gansia vastaan käyttäen julkaisussa K.G. Simpkin ja G.L. Coles, (1979) Parasitology 79, 19 kuvattua in vitro -seu-lontatestiä. Yhdiste tappoi 100 % madoista kuopassa ole-20 van pitoisuuden ollessa 0,01 ppm.

Esimerkki 3 UK-86956:n hyönteismyrkkyvaikutus arvioitiin Luci-lia cuprina -lihakärpäsen (Q-kanta) toukkavaihetta vastaan käyttäen vakiomenetelmää, jossa ensimmäisen muodonvaihdos-' 25 asteen toukkia pidetään kosketuksessa testattavalla yhdis-teellä käsitellyn suodatinpaperin kanssa. Ensin testattava yhdiste imeytetään paperille asetoniliuoksena. Tämän jälkeen käsitelty suodatinpaperi asetetaan putkeen, joka sisältää 1 ml vastasyntyneen vasikan seerumia ja ensimmäi-30 sen muodonvaihdosasteen toukat lisätään putkeen. UK-86956 tappoi 100% toukista, kun sitä lisättiin suodatinpaperille 10 mg neliömetriä kohti.

Claims (4)

94262

1. Menetelmä 22-hydroksi-23-deoksi-LL-F28249a-antibiootin valmistamiseksi, jolla on kaava 5 Il o o 10 cxi a) OH 15 tunnettu siitä, että mainitun yhdisteen tuottamiseen kykenevää Streptomyces griseochromogenes ATCC 53928 -mikro-organismia tai sen jälkeläistä viljellään hiilen, typen ja epäorgaanisten suolojen assimiloituvassa muodossa olevia lähteitä sisältävässä vesipitoisessa pinnanalaises-20 sa ravintoliuoksessa tai kiinteällä agar-viljelyalustalla aerobisissa fermentaatio-olosuhteissa, kunnes talteenotet-tavissa oleva määrä mainittua yhdistettä saadaan aikaan, ja yhdiste otetaan talteen, eristetään ja puhdistetaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, •25 tunnettu siitä, että valmistetaan sellainen kaavan I mukainen antibioottinen yhdiste, jossa suhteellinen ste-reokemia on kaavan (II) I ΗΟ,/ν.· 30 0 (Γ * 35 mukainen. (II) 94262

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä Streptomyces griseo-chromogenes ATCC 53928 -mikro-organismia tai sen jälkeläistä fermentoimalla valmistetaan yhdiste, jolle on tun- 5 nusomaista seuraavat fysikaaliset ja spektroskooppiset ominaisuudet: a) Spesifinen optinen rotaatio [a]25 + 95,0° (c = 0,16, asetoni) b) Ultraviolettiabsorptiospektri 238 (e = 24600) 10 maksimi 244 (e = 27000) 252(sh) (e = 17500) c) Pääasialliset ionit elektronin törmäysmassaspektrissä 612 (M+) , 594 (M-H20) , 576 (M-2H20) + , 4 6 6, 151. d) FAB-massaspektri 635 (M + Na+) (teoreettinen 635) 15 e) Protonin magneettisen resonanssin osittainen spektri (CDC13) : hyvin erottuvat signaalit δ = 5,79 (dm, J = 11,4, 1H) , 5,73 (dd, J = 13,8, 11,4, 1H) , 5,41 (bs, 1H) , 5,12 (d, J = 8,1, 1H), 4,69 (dd, J = 14,3, 2,1, 1H), 4,65 (dd, J = 14,3, 2,1, 1H) , 4,29 (m, 1H) , 3,95 (d, J = 6,2, 1H) , 20 3,36 (d, J = 10,2, 1H), 3,26 (m, J = 2,3, 1H), 2,56 (m, 1H), 1,87 (bs, 3H), 1,57 (bs, 3H), 1,54 (bs, 2H), 1,40 (q, J = 12, 1H) , 1,03 (d, J = 6,6, 3H), 1,00 (d, J = 6,6, 3H), 0,93 (d, J = 6,7, 3H), 0,70 (d, J = 6,6, 3H).

4. Streptomyces griseochromogenes ATCC 53928 tai 25 sen jälkeläinen. 94262