FI92714C - Kahden uuden hybridooman tuottamia apolipoproteiini-B-spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita - Google Patents

Description

! 92714

Kahden uuden hybridooman tuottamia apolipoproteiini-B-spesifisia monoklonaalisia vasta-aineita

Esilla oleva keksinto koskee yleisesti uusia hybridoomia ja erityisemmin hybridoomia, jotka tuottavat reseptorimolekyyle-ja, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini B-100:n kanssa, siten tuotettuja reseptorimolekyyleja, kuin myos diagnostisia menetelmia ja systeemeja, joissa kaytetaan reseptorimolekyyle ja .

Lipoproteiinit ovat plasman kolesterolin ja triglyseridien primaarisia kuljettajia. Ne ovat misellaarisia lipidi-proteiinikomplekseja, jotka sisaltavat proteiinia (nimitettyna apoproteiiniksi) ja polaarisia lipideja jarjestaytyneina pinta-kalvossa, joka ymparoi neutraalilipidiydinta (triglyseridi ja kolesteryyliesteri). Lipoproteiineja identifioitiin alunperin perustuen niiden ominaispainoihin mitattuna ultrasentrifugoimal-la. Sen mukaisesti tunnetaan nelja paatiheysluokkaa: kylomikro-nit, hyvin pienitiheydelliset lipoproteiinit (VLDL), pieniti-heydelliset lipoproteiinit (LDL), ja suuritiheydelliset lipoproteiinit (HDL).

Rinnan ultrasentrifugaalisten erotusten teknologian edistymisen kanssa on LDL- ja HDL-tiheysluokat jaettu edelleen lisaksi neljaan homogeenisuudeltaan suurempaan alaluokkaan. LDL voidaan esimerkiksi jakaa keskitiheydelliseksi lipoproteiini (IDL)-ja LDL2~alaluokiksi. Namakin alaluokat koostuvat kuitenkin toiminnallisesti heterogeenisista lipoproteiinipartikkelien populaatioista, johtuen niiden vaihtelevasta apoproteiini-pitoisuudesta.

Kahdeksan paaapoproteiinia, A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, ja E, on eristetty, ja vahaisempien aooproteiinien ryhmasta, joita voidaan ottaa talteen suurempina maarina tietyista tiheysluokista, useimpia voidaan myos tavata muista tiheysluokista. Nain olien useimmat LDL-partikkelit sisaltavat 2 9271 4 ainoastaan apo B:ta, joidenkin partikkelien sisaltaessa kuitenkin myos muita apoproteiineja, ja tama selittaa ne pienet rnaarat apo C-I:ta, apo C-II:ta, C-III:a ja apo E:ta, jotka ovat lasna tassa tiheysluokassa.

Joissakin tapauksissa tiettyja toimintoja on katsottu kuulu-vaksi tietyille apoproteiineille. Esimerkiksi, erasta apo B-lajia, joka syntetisoituu maksassa, nimelta apo B-lOO, tunnis-tavat ja sitovat solun LDL-reseptorit. Sitomalla apo B-lOO:aa nama reseptorit sitovat LDL-partikkeleita ja vetavat niita pois plasmasta. LDL joutuu siina yhteydessa solujen sisaan ja hajo-tetaan, jolloin se luovuttaa kolesterolinsa kunkin solun tarpei-ta vårten. Apo B-LDL-reseptori-vuorovaikutuksella on siten huomattava osa LDL-kolesterolin poistamisessa veresta.

LDL-reseptori ei tunnista toista apo B-lajia, nimelta apo B-48. Tata apo B-lajia, jonka koko apo B-100:aan nahden on vain 48 %, syntetisoituu ihmisissa vain suolessa. Liooproteiinit, jotka sisaltavat apo B-48:aa, kuten esimerkiksi kylomikronit ja kylomikronijaanteet, eivat sitoudu LDL-reseotoriin.

Vaikkakin nama kaksi apo B-lajia nayttavat olevan geneettises-ti erillisesti saadeltyja (on kuvattu yksittaista potilasta, jonka ruumiissa kehittyy apo B-48:aa, mutta ei aoo B-100:aa), immunologiset tutkimukset ovat osoittaneet, etta apoproteii-neilla B-100 ja B-48 on yhtenevaiset antigeeniset paikat (determinantit). Vahintaan kolme tutkimusryhmaa on raportoi-nut kaikkiaan seitseman eri monoklonaalisen vasta-aineen kehit-tamisesta, jotka sitoutuvat joko apo B-100:aan tai apo B-48:aan. Noiden tutkijoiden raportoimista tuloksista voidaan selvasti paatella, etta apo B-48 ja apo B-100 ovat rakenteeltaan saman-tapaisia; so. etta apo B-48 voi vastata osaa apo B-100-proteii-nista. On esitetty myos aineistoa, jonka mukaan apo B-48;aa ja apo B-lOO:aa ei tavata samassa lipoproteiinipartikkelissa, mika osoittaa, etta on olemassa erillisia apo B-partikkeleita.

II

3 92714

Useat tutkijat ovat viime aikoina esittåneet, etta plasman apo B-tasot voivat antaa paremmin viitteitå sepelvaltimotauti-riskistå (coronary artery disease, CAD) kuin plasman LDL-koles-terolitasot. Sniderman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 604-608 (1980). Koska valtimonkovetustauti ja siihen liittyvat komplikaatiot ovat edelleen suurin syy kuolemaan ja heikkouteen lånsimaissa, on laaketieteellinen teollisuus pitkaan tuntenut tarvetta loytaa maarityssysteemeja, joilla kyetaan toteamaan CAD:n riskihenkilot.

Monentyyppisista plasman apoproteiini B:n immunomåårityksista on raportoitu, joissa kaytetaan hyvaksi soesifisia antibodeja sisaltåvia antiseerumeita, mukaanlukien kompetitiiviset neste-ja kiinteafaasiset radioimmunomaaritykset (RIA), entsyymi-kytkeiset immunosorbenttimååritykset (ELISA), radiaaliset immunodiffuusiomaaritykset ja muut måaritykset. Ongelmia, jotka rajoittavat naiden apo B-immunomaaritysten laajalle levin-nytta kayttoa, ovat olleet toistettavuus ja kaytettyjen anti-seerumien laatu ja spesifisyys. Kokooma-artikkeleita metodolo-gisista ongelmista, koskien kutakin erityyppista apo B-maaritys-ta, ovat kirjoittaneet Currey et al., Clin. Chem. 24, 280-286 (1978) ja Rosseneu et al., Clin. Chem. 28, 427-433 (1983).

Useat tutkijat ovat raportoineet paneelien kehittamisesta, jotka sisaltavat monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen apo B:ta vastaan, kaytettavaksi taman antigeenisen rakenteen ja lipo-proteiinimetabolisen merkityksen tutkimiseen. Lisaksi on esiin-tynyt raportteja koskien monoklonaalisten anti-apo B-vasta-aineiden kayttamista plasman apo B-tasojen mittaamiseen neste-faasisissa RIA-maarityksissa. Patton et al., Clin. Chem. 29, 1898-1903 (1983) ja Maynard et al., Clin. Chem. 30, 1620-1624 (1984). Yksi ryhma on lisaksi raportoinut monoklonaalisten anti-apo B-vasta-aineiden seoksen kaytosta plasman apo B:n radiaalisessa immunodiffuusiomaarityksessa. Marconvina et al. Clin. Chim. Acta 147, 117-125 (1985). Naita maaritysmenetelmia haittaavat kuitenkin tarve pitkiin inkubointeihin, toistuvaan 4 92714 sentrifugointiin tai radioaktiivisten aineiden kåyttoon.

Monoklonaalisten vasta-aineiden kåytto reagensseina, mååritet-taessa apo B-100:n låsnåoloa ihmisen ruumiinnestenåytteisså on houkuttelevaa, koska sellaisia reagensseja voidaan tuottaa niiden aikaan saamisen jalkeen suhteellisen suurissa måårisså tasalaatuisesti. On olemassa kuitenkin joukko tekijoita, jotka ovat erityisen monoklonaalisen vasta-aineen kåyttoå vastaan sen ollessa komponenttina apo B-100-maårityssysteemisså.

Ensiksi, tieteen mukaan on tunnettua, etta monoklonaalinen vasta-aine voi olla liian immunospesifinen ollakseen kayttokel-poinen kohdeantigeenin antigeenisesta heterogeenisyydesta joh-tuen. Tavanomaisten polyklonaalisia vasta-aineita sisaltåvien antiseerumien spesifisyys riippuu satojen tuhansien erilaisten vasta-aineiden samasuuntaisuudesta, jotka sitoutuvat antigeeni-siin determinantteihin ja kattavat suurimman osan tai kaiken antigeenisen proteiinin. Taman seurauksena, pienet muutokset an-tigeenin rakenteessa, johtuen geneettisesta monimuotoisuudesta, heterogeenisyydesta glykosylaatiossa tai lievasta denaturoitu-misesta, vaikuttavat tavallisesti hyvin vahan polyklonaalisen vasta-aineen sitoutumiseen. Samalla tavalla, vaihtelevan suu-ruinen vasta-aineiden alajoukko polyklonaalisista antiseerumeis-ta sitoo antigeeneja, joita on modifioitu tai denaturoitu.

Vastakohtana, monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat tavallisesti antigeenimolekyylilla olevaan yhteen antigeeniseen deter-minanttiin (epitooppi). Jos, syysta tai toisesta, sita deter-minanttia muutetaan, antibodi voi tai ei voi jatkaa sitoutumis-ta. Se, onko tama ongelma vai etu, riippuu yksittaisista olo-suhteista. Jos, kuten esilla olevassa tapauksessa, monoklonaa-lista vasta-ainetta on tarkoitus kayttaa apoproteiinin diagnos-tisessa maarityksessa, voisi vahainen antigeeninen muunnos tuossa proteiinissa aiheuttaa selvia virheita.

Apoproteiini B-lOO:n antigeeninen heterogeenisyys on hyvin T dokumentoitu. Esimerkiksi apo B:n epitoopin ilmenemisen on

II

5 9271 4 todettu vaihtelevan sen mukaan mika on (1) yhteen liittyneiden lipidien koostumus, (2) immunoreaktion lampotila, (3) LDL:n eriståmisaste sen luonnollisesta ympåristosta, ja (4) yksiloi-den valinen geneettinen ilmeneminen.

Toiseksi, ainutlaatuisen spesifisyytensa johdosta monoklonaali-sen vasta-aineen (MoAb) menestyksellinen kåytto on usein riippu-vaista sen affiniteetista kohdeantigeenia kohtaan. Esimerkiksi, vaikka MoAbrn affiniteetti saattaa olla riittåva ollakseen hyo-dyksi sidottaessa neste- ja kiinteafaasista antigeeniå, samalla kun MoAb itse on nestefaasissa, sama vasta-aine ei ehka ole kayttokelpoinen kiinteåna kiinnitettynå vasta-aineena, joka on kayttokelpoinen antigeenin sitomisessa ja "poisvetamisessa" liuoksesta.

Edella olevat ongelmat ovat tunnusomaisia monoklonaalisten vasta-aineiden kaytolle. Alaa tuntevat ovat sen vuoksi havain-neet, etta on valttamatonta testata ja karakterisoida monoklonaa-liset vasta-aineet jokaisessa maarityssysteemissa, jossa niita on tarkoitus kayttaa. Katso Goding, James W.( Monoclonal Antibodies: "Principles and Practice." Sivut 40-46, Academic

Press, New York (1983).

Yhdelta nakokannalta tassa keksinnossa tarkastellaan hybridoomaa, jolla on merkinta HL130C2.3C5, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746. Tahan hybridoomaan ja sen reseptorimolekyyleihin viitataan tassa myos merkinnalla MB47.

Toiselta nakokannalta tassa keksinnossa tarkastellaan reseptori-molekyyleja, jotka immunoreagoivat aooproteiini B-lOO:n kanssa, ja joita erittaa hybridooma ATCC HB 8746.

Viela toiselta nakokannalta tassa keksinnossa tarkastellaan hybridoomaa, jolla on merkinta V82A6.1G4, jonka ATCC-talletus-numero on HB 8742. Tahan hybridoomaan ja sen reseDtorimolekyy-leihin viitataan tassa myos merkinnalla MB24.

6 92714

Viela toiselta nakokannalta tåsså keksinnosså tarkastellaan reseptorimolekyyleja, jotka immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, ja joita erittaa hybridooma ATCC HB 8742.

Toiselta nakokannalta taman keksinnon mukaisesti tarkastellaan soluviljelmaa, joka kasittaa (a) taman keksinnon mukaisen hybri-dooman; (b) mainitun hybridooman erittåmiå reseptorimolekyyleja, jotka immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa; ja (c) vilje-lyalustan hybridoomalle.

Eraalta lisanakokannalta taman keksinnon mukaisesti tarkastellaan menetelmaa apoproteiini B-lOO:n lasnaolon maarittamiseksi ruumiinnestenaytteestå, joka menetelma kasittaa vaiheet: (a) otetaan maaritettavaksi tarkoitettu ruumiinnestenayte; (b) tuotetaan reseptorimolekyyleja biologisesti aktiivisessa muodossa, jotka (i) immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, ja (ii) joita erittaa joko hybridooma HB 8746 tai HB 8742; (c) sekoitetaan ruumiinnestenayte reseptorimolekyylien kanssa: (d) pidetaan seosta biologisissa mååritysolosuhteissa ennalta maaråtty aika, joka reseptorimolekyylien kannalta on riittava sitomaan immunologisesti naytteessa lasna olevaa apoproteiini B-100:aa immunoreaktantin muodostamiseksi; ja (e) maaritetaan muodostuneen immunoreaktantin maara.

· Toisessa nakokohdassa taman keksinnon mukaisesti tarkastellaan menetelmaa apoproteiini B-100:n maarittamiseksi ruumiinnestenaytteesta, joka menetelma kasittaa vaiheet: (a) otetaan maaritettavaksi tarkoitettu ruumiinnestenayte; (b) tuotetaan kiintea kantaja, joka kasittaa kiintean matrii-sin, johon on kiinnittyneena ensimmainen reseptori biologisesti aktiivisessa muodossa, joka reseptori immunoreagoi apoproteiini B-100:n kanssa, ja jota erittaa hybridooma, jonka ATCC-talletus-numero on HB 8746; (c) tuotetaan biologisesti aktiivista toista reseptoria, joka immunoreagoi apoproteiini B-lOO:n kanssa, ja jota erittaa hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742, mainitun 11 9271 4 7 toisen reseptorin ollessa liittynyt leimana toimivaan entsyymiin, jonka avulla on mahdollista ilmaista mainitun toisen reseptorin lasnaolo immunoreaktantissa; (d) sekoitetaan oleellisesti samanaikaisesti: (i) mainittu ruumiista otettu nayte; (ii) ensimmåinen reseptori; ja (iii) leimattu toinen reseptori kiinteå/nestefaasisen immuno-reaktioseoksen muodostamiseksi; (e) pidetåån seosta biologisissa mååritvsolosuhteissa ennalta maaratty aika, joka aika on ensimmaisen reseptorin ja leimatun toisen reseptorin kannalta riittåvå sitomaan immunologisesti naytteessa lasna oleva apoproteiini B-100 kiinteafaasisen, kerroksellisen immunoreaktantin muodostamiseksi; (f) erotetaan mainittu kiinteafaasinen, kerroksellinen immuno-reaktantti nestefaasista; ja (g) maaritetaan muodostuneessa kiinteafaasisessa, kerrokselli-sessa immunoreaktantissa sidottuna olevan leimatun toisen reseptorin maara.

Toiselta nakokannalta taman keksinnon mukaisesti tarkastellaan kompetitiivista menetelmaa apoproteiini B-100:n maarittamiseksi ruumiinnestenaytteesta, joka menetelma kasittaa vaiheet: (a) otetaan maaritettavaksi ruumiinnestenayte; (b) tuotetaan kiintea kantaja, joka kasittaa kiinteån matrii-sin, johon on kiinnittyneena ennalta maaratty maara reagenssia apoproteiini B-100; (c) oleellisesti samanaikaisesti sekoitetaan (i) nayte ruumiista; (ii) kiintea kantaja; ja (iii) ennalta maaratty maara reseptorimolekyvleja, jotka reagoi-vat immunologisesti apoproteiini B-100:n kanssa, joka on eritty-nyt joko hybridoomasta, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746 tai hybridoomasta, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742, kiintea/nestef aasisen seoksen muodostamiseksi; 9271 4 8 (d) pidetaan seosta biologisissa maåritysolosuhteissa se aika, joka reseptorimolekyylien kannalta on riittava sitoutumaan immunologisesti kiintealla kantajalla oleviin apoproteiini B-100-molekyyleihin, ja ruumiinnestenaytteessa låsnå oleviin apoproteiini B-100-molekyyleihin ja muodostamaan kiinteafaasinen immunoreaktantti ja nestefaasinen immunoreaktantti; (e) erotetaan kiinteafaasinen immunoreaktantti mainitusta nestefaasista; (f) sekoitetaan kiinteafaasinen immunoreaktantti biologisesti aktiivisen toisen reseptorin kanssa, joka immunoreagoi ensim-maisen reseptorin kanssa toisen kiintea/nestefaasisen immunoreak-tioseoksen muodostamiseksi, toisen reseptorin ollessa liittynyt leimana toimivaan entsyymiin, jonka avulla pystytaan ilmaisemaan mainitun toisen reseptorin lasnaolo immunoreaktantissa; (g) pidetaan mainittua toista seosta biologisissa maaritysolosuhteissa se aika, joka leimatun toisen reseptorin kannalta on riittava sitoutumaan immunologisesti ensimmaiseen reseptoriin, joka on lasna kiinteafaasisena immunoreaktanttina, kiinteafaasisen kerroksellisen immunoreaktantin muodostamiseksi; (h) erotetaan kiinteafaasinen, kerroksellinen immunoreaktantti nestefaasista; ja (i) maaritetaan leimatun toisen reseptorin maara, joka on si-toutunut mainittuun kiinteafaasiseen, kerrokselliseen immuno-reaktanttiin.

Toisessa nakokohdassa, taman keksinnon mukaisesti tarkastel-laan soluviljelmaa, joka kasittaa: (a) hybridooman, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746; (b) hybridooman erittamia reseptorimolekyyleja, jotka reagoi-vat immunologisesti apoproteiini B-100:n kanssa; ja (c) viljelyalustan hybridoomalle.

Toisessa nakokohdassa, taman keksinnon mukaisesti tarkastel-laan koostumusta, joka kasittaa: (a) hybridooman, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742;

II

92714 9 (b) hybridooman erittamiå reseptorimolekyyleja, jotka reagoi-vat immunologisesti apoproteiini B-lOO:n kanssa; ja (c) viljelyalustan hybridoomalle.

Toisessa nåkokohdassa, taman keksinnon mukaisesti tarkastel-laan diagnostista systeemiå apo B-lOO:n mååran måårittåmiseksi ruumiinnåytteestå, joka systeemi kåsittåå: (a) biologisesti aktiivisen ensimmåisen spesifisen sitovan aineen, joka kasittaa reseptorimolekyyleja, jotka (i) immunorea-goivat apoproteiini B-100:n kanssa; ja (ii) ovat joko reseptori-molekyylejå, joita erittåå hybridooma ATCC HB 8746, tai reseptorimolekyyle ja, joita erittaa hybridooma ATCC HB 8742; ja (b) biologisesti aktiivisen, leimatun toisen spesifisen sitovan aineen ilmaisemaan ensimmaisen sitovan aineen immunoreaktio-ta apo B-lOO:n kanssa.

Kiintea matriisiaffiniteettisorbentti, joka kasittaa kiintea-faasisen matriisin kiinnitettyna bioloqisesti aktiivisiin re-septorimolekyyleihin, jotka immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, ja jotka valitaan ryhmåstå, joka kasittaa: (a) reseptorimolekyyleja, joita erittaa hybridooma HB 8746; (b) reseptorimolekyyleja, joita erittaa hybridooma ATCC HB 8742; ja (c) seoksen, joka sisaltaa reseptorimolekyyleja kohdista ( a) ja (b).

Esilla oleva keksinto antaa kayttoon useita hyotyja ja etuja.

Eras esilla olevan keksinnon mukainen etu on se, etta voidaan kayttaa esilla olevan keksinnon mukaisia hybridoomia tuotettaes-sa suhteellisen suurina maarina tasalaatuisia reseptoreja, jotka immunoreagoivat apo B-100:n kanssa.

Toinen esilla olevan keksinnon mukainen etu on se, etta taman keksinnon mukaiset reseptorit ovat kayttokelpoisia, muun muassa 9271 4 10 maåritettaesså kolesterolia kuljettavan apo B-100:n maaraa ruumiinnestenaytteesta.

Eras esilla olevan keksinnon mukainen hyoty on se, etta taman keksinnon mukaisia reseptoreita voidaan kayttaa apo B-l00:n entsyymikytkeisisså immunosorbenttimåårityksissa formaateissa, joissa ei tarvlta sentrifugointeja.

Toinen hyoty on se, etta taman keksinnon mukaiset maaritysmene-telmat voidaan saattaa paatokseen suhteellisen lyhyisså aika-jaksoissa.

Esilla olevan keksinnon mukaiset muut edut ja hyodyt kayvat selviksi niille, jotka tuntevat alaa, seuraavasta keksintoa koskevasta kuvailusta, piirroksista ja liitteena olevista pa-tenttivaatimuksista.

Piirrosten lyhyt kuvailu

Kuvio 1 esittaa valokuvaa Western Blot-maarityksen autoradio-grammista, jossa on osoitettu MB47- ja MB24-reseptorimolekyvlien kyky immunoreagoida apo B-100:n ja apo B-48:n kanssa, jotka on saatu lipidivapaista kylomikroneista ja VLDLrsta. VLDL ja kylomikronit delipidoitiin ja saatettiin SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesiin (SDS-PAGE) kayttaen 3-6 prosentin gradient-tigeeleja. Kuusikymmenta mikrogrammaa (^ug) VLDL-proteiinia ja 20 ^ug kylomikroniproteiinia ajettiin geelin vuorottaisilla kaistoilla, erottaen siten kunkin valmisteen proteiinit koon mukaan. Proteiinijuovia sisaltavan elektroforeesiliuskan visualisointi, varjaamalla geeli 0,1 prosenttisella Coomassie Blue-varilla, toi esille apo B-100- ja apo B-48-juovat kylomikro-neissa ja VLDL:ssa. Proteiinia sisaltavat juovat kiinnitettiin sen jalkeen elektroforeettisen siirtamisen avulla nitroselluloo-sapaperille kiintean alustan jarjestamiseksi. Kiintealle alus-talle kiinnitettyjen apoproteiiniantigeenien annettiin sitten erikseen immunoreagoida immunopuhdistettujen MB47- ja MB24-resep-torimolekyylien kanssa. Monoklonaaliset MB47 ja monoklonaaliset MB24 reseptorimolekyylit, jotka olivat immunologisesti sitoutuneet 9271 4 11 kiinteåån faasiin kiinnitettyyn antigeeniin, ilmaistiin kayt- 125 ....

tåmålla J-leimattua vuohi anti-huri-Ig: ta 3a autoradio- grafiaa.

Paneeli A kuvaa, etta monoklonaalinen MB24 immunoreagoi apo B-100:n ja apo B-48:n kanssa VLDL: stå (V) ja kylomikroneista (C). Paneeli B kuvaa, etta monoklonaalinen MB47 immunoreagoi apo B-IOO:n kanssa V:sta ja C:stå, mutta ei apo B-48:n kanssa joko V:sta tai C:stå. Paneeli C on negatiivinen kontrolli, joka osoittaa, etta lampaan punasoluille spesifinen monoklonaalinen vasta-aine ei immunoreagoi minkaan lasna olevan antigeenin kanssa. Paneeli D on toinen negatiivinen kontrolli, joka osoittaa, etta immunopuhdistettu polyklonaalinen antiseerumi fenyyli-beeta-O-glukosidille ei tunnista mitåån lasna olevaa antigeeniå. Paneeli E on positiivinen kontrolli, joka osoittaa, etta immunopuhdistettu kanin polyklonaalinen antiseerumi ihmisen LDL-apopro-teiinia vastaan tunnistaa seka apo B-100:n etta apo B-48:n seka V:ssa etta C:sså.

125

Kuviossa 2 on kåyra, joka osoittaa sitoutuneiden J-leimattu-jen LDL-partikkelien prosenttimaaran (ordinaatta) monoklonaalisen vasta-aineen MB47 kasvavan molaarisen konsentraation suhteen /abskissa; Ab-konsentraatio (MoAb_)_/ nestefaasisessa radioimmuno-maarityksessa (RIA).

LDL valmistettiin lo henkilosta yhteenkeratysta plasmasta (----) tai yhdesta normaalirasvaverisesta henkilosta (_).

Plasma saatiin henkiloiden plasmafaresian avulla suunnilleen kaksitoistatuntisen paastojakson jalkeen.

Kuviossa 3 on pylvasdiagrammi, joka osoittaa inhibitioastetta, jonka vasta-aine MB47 (tyhjat pylvaat: MB47) ja ylimaara ihmisen leimaamatonta LDL:aa (viivoitetut pylvaat: LDL) aiheuttavat 125 ihmisen J-LDL:n sitoutumiselle, sisaanmenolle ja hajoamiselle ihmisen viljellyilla fibroblasteilla. Fibroblastien yksisolu-kerroksia viljeltiin 35 millimetrin kuopissa DMErssa, joka sisalsi 10 prosenttia vasikan sikion seerumia.

9271 4 12

Fibroblastien LDL-reseptoreita stimuloitiin suunnilleen 24 tuntia keståvålla fibroblastien esi-inkuboinnilla kasvualustassa, joka sisalsi 2,5 milligrammaa per millilitra (mg/ml) lipoproteiinis- ta vapaata seerumia (LDS) (DME-LDS). DME-LDS:aa, joka sisalsi 12 5 2,5 mikrogrammaa per millilitra ^ug/ml) J-LDL:aa ja joko 20 prosenttia MB47 hybridooman viljelysupernatanttia (v/v) tai 200-kertainen ylimaara leimaamatonta LDL:aa (loppukonsentraa-tio, 500 ^ug/ml), sekoitettiin ja pidettiin (inkuboitiin) noin 16 tuntia 4°C:ssa ennen lisååmistå fibroblastien yksisolukerros-ten paaile.

Sitoutumisen, sisaankuljettamisen ja hajottamisen maårittaminen suoritettiin kolmena rinnakkaismaarityksina, ja ne ilmaistaan prosenttimaarina kontrol1 iarvoista, jotka maaritettiin monoklo-naalisen reseptorin MB47 poissa ollessa. Monoklonaalisen re-septorin MB47 aiheuttama inhibitio spesifiseen sitoutumiseen, sisaankuljetukseen ja hajotukseen oli verrattavissa siihen, minka 200-kertainen ylimaara leimaamatonta LDL:aa tuottaa.

Kuvio 4 sisaltaa kaksi kayraa, jotka osoittavat monoklonaalisen vasta-aineen MB47 monovalenttisten Fab-kappaleiden kyvyn inhiboi-125 da lhmisen J-LDL:n sitoutumista ja hajoamista lhmisen fibro- blasteilla. Yksittaiset alustat, jotka sisalsivat kasvavia 12 5 maaria MB47-Fab-kappaleita ja vakiomaaran J-LDL:aa (2,5 ^ug/ml) sekoitettiin keskenaan, ja niita pidettiin (inkuboitiin) noin 15 tunnin ajan 4°C:ssa ennen lisaamista fibroblastien yksi-solukerrosten paaile. Fab-konsentraatio ilmaistaan molaarisena Fab/LDL-suhteena, joka on lasna kussakin alustassa (olettaen Fab:n molekyylipainon (MW) olevan 40 000 daltonia, ja apo B:n molekyylipainon olevan 550 000 daltonia).

Sitoutumista ja hajoamista ilmaistaan prosenttimaarina kontrolli-arvoista MB47-Fab-kappaleiden poissa ollessa. Kaikki maarityk-set suoritettiin rinnakkaismaarityksina. Ylimaara leimaamatonta LDL:aa (loppukonsentraatio, 500 ,ug/ml) tuotti enemmman kuin 95 % inhibition J-LDL:n sitoutumisessa (paneeli A) ja hajo- 11.

* t 13 92714 tuksessa (paneeli B). Samanlaisia tuloksia saavutettiin kolmes-sa tutkimuksessa monoklonaalisen reseptorin MB47 erilaisten Fab-valmisteiden kanssa.

Kuvio 5 sisåltåå kaksi graafista esitystå. Esitys A kuvaa pipar-juuriperoksidaasileimattujen MB47 (HRPO-MB47) reseptorien, joita on tunnettu, vakiomaårå, kykya immunoreagoida kiinteaan faasiin kiinnitetyn reagenssi apo B-100:n kanssa MB24 reseptorimolekyy-lien låsnåollessa, joiden maara on kasvava. Ordinaatta on suhteellisina optisen tiheyden yksikkoina, kun taas abskissa on yksikkoina mikrogrammaa/millilitra leimatonta vasta-aineproteii-neja lisåttynå (^.ug/ml) kilpaili jaksi.

Vakioinen maara (20 ^ug) HRPOrhon liitettyja MB47 reseptoreja sekoitettiin olennaisesti samanaikaisesti kasvavien maarien kanssa leimaamattomia MB47 (·) tai leimaamattomia MB24 (A ) reseptoreja ja kiinteaan faasiin kiinnitetyn reagenssi apo B-l00:n (LDL) kanssa. Seoksia pidettiin 3 tuntia 25°C:ssa antamalla siten reseptorien sitoa immunologisesti reagenssi apo B-100:aa ja muodostaa kiinteafaasinen immunoreaktantti. Kiinteaan faasiin sidotun leimatun MB47:n maara maaritettiin sen jalkeen kuten kompetitiivisessa ELISA:ssa, jota kuvataan Materiaalit ja menetelmat osassa.

Graafinen esitys A kuvastaa sita, etta leimaamattomien MB47-reseptorien maarien kasvaessa immunoreaktioseoksessa, alenee vastaavasti leimattujen MB47-reseptorien maara, joka on sidottu-na kiinteafaasisena immunoreaktanttina. Leimaamaton MB47 kilpailee nain olien leimatun MB47:n kanssa LDLrsta.

Graafinen esitys A kuvastaa toisaalta myos sita, etta leimaamattomien MB24-reseptorien maaran kasvaessa, leimatun MB47:n måara ei merkittåvåsti alene, joka on sitoutuneena kiinteåfaa-sisena immunoreaktanttina. Leimaamaton MB24 ei nain olien kilpaile leimatun MB47:n kanssa sitoutumisesta LDL:åån.

^ · · 9271 4 14

Graafinen esitys B kuvastaa sita, etta samanlaisia tuloksia saadaan kayttamalla HRPO-leimattuja MB24-reseptoreja ja leimaa-mattomia MB47-reseptoreja. MB47- ja MB24-reseptorit sitoutuvat sen vuoksi eri epitooppeihin, jotka ovat riittavan erillaan apo B-100:n pinnalla, jotta molempien reseptorien sitoutuminen olisi mahdollista yhteen ainoaan apo B-lOO-molekyyliin ilman steerista kilpailua ja sitoutumisen estymistå.

Kuvio 6 sisaltåå kaksi graafista esitystå. Esityksessa A esite-12 5 taan J-leimatun B-47:n sitoutumista LDL:åån nestefaasisessa RIA:ssa. Ordinaatta on esitetty yksikkoina femtomoolia (fmoolia) sitoutunutta, kun taas abskissa on yksikkoina nano-moolia (nM) vasta-ainetta sekoitettuna.

Immunologisesti puhdistettua monoklonaalista vasta-ainetta MB47 125 . .

jodattiin J:n kanssa kayttaen Iodogen-tekniikkaa spesifiseen aktiivisuuteen 3000 impulssia minuuttia kohti nanogrammaa kohti (cpm/ng). Perusteellisen dialysoinnin jalkeen fosfaattipuskuroi- tua saliinia (PBS) vastaan, yli 95 prosenttia radioaktiivisuu- desta oli saostettavissa 10 prosenttisella trikloorietikkahapol- la (TCA). Yli 98 prosenttia 125J-MB47:stå sitoutui LDL-kolon- niin. Maaritykset suoritettiin kolminkertaisina 10 x 75 milli- 125 metrin (mm) silikonipaallysteisissa lasiputkissa. J-MB47:aa lisattiin kasvavina konsentraatioina 0,1 ml:ssa naudan seerumin albumiini-barbitaali (BSA-barbitaali)-puskurissa (pH-arvo 8,0) lOO ng:aan yhteen kerattya, normaalilipidemista ihmisen LDL:aa laimennettuna 0,2 ml:ssa BSA-barbitaalipuskuria. Jokainen putki sisalsi 182 fmoolia LDL apo B:ta (olettaen apo B:n mole'kyy-lipainoksi 550 000 daltonia).

16 tunnin inkuboinnin (sekoittaminen ja seisottaminen) jalkeen 4°C:ssa, LDL saostettiin kvantitatiivisesti lipoproteiinivapaan kanin antiseerumin avulla, joka oli spesifinen ihmisen LDLrlle. /Vain sita kanin antiseerumin fraktiota, jonka tiheys (d) oli enemman kuin 1,21 g/ml, kaytettiin koska monoklonaali-nen vasta-aine MB47 sitoo kanin apoliproteiini Brta^/ 9271 4 15

Esitutkimukset osoittivat kanin delipidoidun antiseerumin oi- toisuuden, joka saosti enemman kuin 98 prosenttia 100 ng:sta 125 ihmisen J-LDL:aa. Kanin antiseerumin lisaamisen jalkeen, putkia inkuboitiin noin 16 tunnin ajan 4°C:ssa.

Supernatantit poistettiin, ja pelletit pestiin kahdesti 2 ml:lla jaakylmåa barbitaalipuskuria (pH-arvo 8,0). Epaspesifinen si-toutuminen ja saostuminen maaritettiin kahdessa rinnakkaisputki-erassa. Ensimmaisessa erassa ei lisåtty yhtaan ihmisen LDL:aa alkuinkubointiin, vaan sama måara kanin toista vasta-ainetta lisåttiin. Toisessa putkiryhmåsså, kanin ei-immuuni seerumi (fraktio, jossa d on suurempi kuin 1,21 mg/ml) korvasi kanin immuunin seerumin vasta-aineen.

Molemmilla menetelmilla saatiin oleellisesti samanlaisia arvo- ja ei-spesifiselle sitoutumiselle, joka oli lineaarista 125 J-MB47 monoklonaalisen vasta-aineen konsentraatioiden lisaan- tyessa, ja se oli kaikissa tapaksissa alle 1 prosenttia lisa- 125 tyista kokonaismaarista. J-MB47:n spesifinen sitoutuminen LDL:aan saatiin vahentamalla ei-spesifinen sitoutuminen koko-naissitoutumisesta. Sitoutumistulokset analysoitiin kayttamalla hyvaksi ligandisitoutumissysteemeissa kaytettavan Scatchard-analyysin lineaarista regressio-ohjelmaa, mika antoi estimaatin vasta-aineen affiniteettivakiolle (Ka) ja reseptorin tai epitoo-pin konsentraatiolle.

^^J-MB47:n Ka LDL:lle oli siten maaritettyna 3,82 x 10^M Suoran ekstrapolointi vastaamaan olosuhteita vasta-aineen aarettomassa ylimaarassa antoi estimaatin, jossa 182 fmoolia (100 ng) LDLraa oli sitonut 212 fmoolia (35 ng) ^^J-MB47:aa, silloin kun apo B:n molekyylipainon oletetaan olevan 550 000 daltonia. Nama tulokset esitetaan taman kuvion graafisessa esi-tyksessa B, jossa ordinaatta on esitetty sidotun (B) ja vapaan (F) vasta-aineen suhteena (B/F), kun taas abskissa on esitetty sidotun vasta-aineen (fmoolia MB47:aa) fmooliyksikkoina.

• 16 92714

Kuvio 7 kuvaa korrelaatiota valilla mg LDL-kolesterolia desilit-rassa (dl) naytettå maaritettyna Lipid Research Clinic Procedures, HEW Julkaisun n:o 75-628 (NIH) sisaltamån menetelman mukaan, 2. painos, Wash., D.C. Goc. Print Off. (1974), ja mg apo B-100:aa navtedesilitrassa maaritettyna kayttamalla ei-kompetitiivista ELISA-menetelmåå, jota on kuvattu Materiaalit ja menetelmat j aksossa.

Korrelaatiokerroin, r = 0,89, maaritettyna Spearman Rank Correlation-testilla parametrittomia tuloksia vårten /Sokal et al., Biometry, 2. painos, W.H. Freeman Co., San Fransisco, CA, 561-616 (19812/, osoittaa merkitsevaa korrelaatiota apo B-100 maarien, maaritettyna tassa yhteydessa kuvattavan ei-kompeti-tiivisen ELISA:n avulla, ja LDL-kolesterolimaarien valilla 60 ihmisen plasmanaytteessa.

Kuvio 8 on samanlainen kuin kuvio 7, ja kuvaa merkitsevaa korrelaatiota, r = 0,92, apo B-100 maarien, maaritettyna taman kek-sinnon mukaisella kompetitiivisella ELISA-menetelmalla, ja LDL-kolesterolimaarien valilla samoista 60 ihmisnaytteesta.

Kuvio 9 kuvaa merkitsevaa korrelaatiota, r = 0,92, maaritettyna Spearman Rank Correlation-testilla, ei-kompetitiivista ELISA’.aa (ordinaatta) kayttaen saatujen tulosten ja kompetitiivista ; ELISA:aa kayttaen saatujen tulosten valilla (abskissa) samoilla 60 ihmisnaytteella, joita on kaytetty kuvioissa 7 ja 8.

I. Yleist£ A. Maaritelmia

Ilmaisu "vasta-aine" viittaa reseptorimolekyyliin, joka on jasenena glykosyloitujen proteiinien perheessa, joita kutsutaan immunoglobuliineiksi, jotka voivat liittya spesifisesti yhteen antigeenin kanssa.

"Vasta-aineen liittymispaikka" on se rakenteellinen osa vasta-ainemolekyylista, joka kasittaa raskaan ja kevyen ketjun muun-tuvia ja hypermuuntuvia alueita, jotka sitovat antigeenin spesifisesti .

II

17 9271 4

Sanaa "antigeeni" on kåytetty kautta aikojen merkitsemaan koko-naisuutta, jonka vasta-aine sitoo, ja merkitsemaan myos koko-naisuutta, joka indusoi vasta-aineen tuotannon. Nykyisempi kåytånto rajoittaa antigeenin tarkoituksen siksi kokonaisuudeksi, jonka vasta-aine sitoo, kun taas Sanaa "immunogeeni" kaytetaan tarkoittamaan sita kokonaisuutta, joka indusoi vasta-aineen tuotannon. Silloin kun tassa yhteydessa kåytetty kokonaisuus on seka immunogeeninen etta antigeeninen, sita nimitetaan ylei-sesti antigeeniksi.

"Antigeeninen determinantti” viittaa siihen varsinaiseen raken-teeliiseen osaan antigeenia, joka sitoutuu immunologisesti vasta-aineen sitoutumispaikkaan. Ilmaisua kaytetaan myos vaihtovuo-roisesti "epitoopin" kanssa.

Ilmaisu "biologisesti aktiivinen" viittaa ainakin kykyyn sitoa spesifisesti ligandi tai spesifisesti sitoutuva aine, vaikkakin muita yleisia tai tehostavia ominaisuuksia voi myos olla lasna.

Sana "kompleksi", kaytettyna tassa yhteydessa, viittaa tuottee-seen, joka on muodostunut, kun spesifisesti sitova aine sitoo kohdeligandin. Tyypillisia komplekseja ovat immunoreaktantit, proteiini A sitoutuneena vasta-aineeseen, ja vastaavat.

"ELISA" viittaa entsyymikytkennåiseen immunosorbenttimaari-tykseen, jossa kaytetaan vasta-ainetta tai antigeenia sidottuna kiinteaan faasiin, ja entsyymi-antigeeni- tai entsyymi-vasta-ainekonjugaattia ilmaisemaan ja kvantitoimaan naytteessa olervan antigeenin tai vasta-aineen maaraa. ELISA-tekniikan kuvaile-minen on loydettavissa luvusta 22 teoksen Basic and Clinical Immunology 4. painoksesta, kirjoittajina D.P. Sites et al., julkaisijana Lange Medical Publications of Los Altos, CA vuonna 1982, ja US-patenttijulkaisuista 3 654 090; 3 850 752; ja 4 016 043, jotka kaikki on sisallytetty tassa viitteina.

"Entsyymi" viittaa proteiiniin, joka kykenee kiihdyttamaan tai tuottamaan katalyyttisen vaikutuksen avulla jonkin muutoksen substraatissa, jolle se usein on spesifinen.

9271 4 18 "Epitooppi" viittaa siihen osaan molekyyliå, jonka vasta-aineen sitoutumispaikka spesifisesti tunnistaa. Siita kaytetaan myos nimitystå determinantti tai antigeeninen determinantti.

"Idiotoopit" eli "idiotyyppiset determinantit" ovat antigeenisia determinantteja, jotka sijaitsevat vasta-ainemolekyylin muuntu-villa ja hypermuuntuvilla osilla, joita muiden vasta-aineiden yhteen liittavå paikka voi tunnistaa. Idiotoopit jaetaan tavalli-sesti kahteen tyyppiin, niihin, jotka ovat sitovia, paikkasidon-naisia determinantteja, ja niihin ,jotka ovat ei-sitovia, paikka-sidonnaisia. Vasta-ainemolekyylilla olevien idiotooppien joukko muodostaa sen idiotyypin. Otaksutaan, etta hybridooman tuottama vasta-aineen sitova paikka sisaltaa yksinkertaisen, erikoisen idiotooppien joukon; so. vasta-aineen erikoisen sidospaikka idiotyypin.

"Immunoreaktantti", kaytettyna tassa yhteydessa, viittaa immunologisen reaktion tuotteeseen; so. siihen kokonaisuuteen, joka muodostuu, kun reseptorimolekyyli on immunologisesti sitonut ligandin. Immunoreaktantti on tietyn tyyppinen "kompleksi".

Sana "erillinen", kaytettyna tassa yhteydessa reseptorimole-kyylien suhteen, tarkoittaa sitå, etta olennaisesti vain yksi : laji vasta-aineen sidontapaikkaa on lasna.

Ilmaisut "leimausvaliaine", "osoittava ryhma" tai "leima" ovat tassa yhteydessa kaytossa vaihtovuoroisesti ja sisaltavat yksin-kertaisia atomeja ja molekyyleja, jotka osallistuvat joko suoraan tai epasuorasti ilmaistavan signaalin tuottamiseen immunoreaktantin lasnaolon osoittamiseksi. Mika tahansa leimausvaliaine voidaan liittaa tai sisallyttaa reseptoriin tai kayttaa erikseen, ja niita atomeja tai molekyyleja voidaan kayttaa yksin tai yhdessa muiden reagenssien kanssa. Sellaiset osoittavat ryhmat tai leimat ovat itsessaan hyvin tunnettuja immunokemiassa, ja ne muodostavat osan tata keksintoa ainoastaan sikali kun niita kaytetaan muutoin uusien reseptorien, menetel-mien ja/tai systeemien kanssa.

19 92714 "Ligandi" viittaa molekyyliin, joka sisaltåa rakenteellisen osan, jonka tietty reseptori sitoo, esim. antigeeniin, jonka reseptori sitoo.

Ilmaisu "reseptori" on tassa yhteydessa kaytossa osoittamaan biologisesti aktiivista molekyylia, joka sitoutuu immunologisesti antigeeniin (tai sen kanssa). Sellaista sitoutumista tapahtuu tyypillisesti affiniteetin ollessa noin 10 - noin 10^° litraa moolia kohti (M~^), ja se on antigeenin epitoopin spesifista vuorovaikutusta reseptorin vasta-aineelle ominaisen sidontapaikan kanssa.

Esilla olevan keksinnon mukainen reseptorimolekyyli on mika tahansa kasittelematon vasta-aine, olennaisesti kasittelematon vasta-aine tai vasta-aineen sisaltaman vasta-aineelle ominaisen sidontapaikan idiotyyppisisåltoinen polypeptidiosa (esim. Fab-kappale), sellaisia kuin vatsaontelonesteessa tai kudosviljely-supernatantissa.

Sanaa "reseptori" kaytetaan tassa yhteydessa myos solun pin-noilla olevista molekyyleista, jotka sitovat muita molekyyleja. Solun pintareseptoreja nimitetaan tassa yhteydessa aina sidotun kokonaisuuden nimella edeltaen sanaa "reseptori" epaselvyyden valttamiseksi. Tyypillinen solun pinta"reseptori" on aikaisem-; min kuvattu LDL-reseptori .

Reseptorimolekyylin biologinen aktiivisuus tulee nakyviin reseptorin immunologisessa reaktiossa antigeenisen ligandinsa kanssa sekoitettaessa niita keskenaan vesipitoiseen alustaan immunoreaktantin muodostamiseksi, ainakin fysiologisissa pH-arvoissa ja ionivahvuuksissa. Biologinen aktiiviåuus tulee esiin edullisesti biologisissa maaritysolosuhteissa: so. niissa olosuhteissa, joissa taman keksinnon mukaiset reseptorimole-kyylit sitoutuvat antigeeniseen ligandiin pH-arvojen rajoissa noin 5 - noin 9, ionivahvuuksissa, jotka vaihtelevat tislatun veden ionivahvuudesta noin yksimolaarisen natriumkloridin ioni- « · 20 9271 4 vahvuuteen, ja lampotiloissa noin 4°C - noin 45°C. Kaikki tassa yhteydessa kuvatut reseptorimolekyylit olivat biologisesti aktiivisia.

Vasta-aineiden vasta-ainesidospaikan idiotyypin sisaltamat poly-peptidiosat (vasta-aineen sidontapaikat) ovat niita vasta-aine-molekyylien osia, jotka sisaltavat sidontapaikkaidiotooppeja ja sitoutuvat ligandiin, ja sisaltavat vasta-aineiden Fab-,

Fab', F(ab')2- ja F(ab 1)2-osia. Vasta-aineiden sisaltamat Fab- ja F(ab')2-osat ovat alalla hyvin tunnettuja, ja niita valmistetaan papaiinin ja pepsiinin proteolyyttisella reaktiolla, tassa jårjestyksesså, olennaisesti koskemattomien vasta-aineiden kanssa menetelmilla, jotka tunnetaan hyvin. Katso esimerkiksi US-patenttijulkaisu 4 342 566 Theofilopolousille ja Dixonille.

Fab1-vasta-aineosat tunnetaan myos hyvin, ja niita tuotetaan F(ab 1 )2~osista siten, etta pelkistetaan disulfidisidokset, jotka yhdistavat kahta raskasketjuosaa esim. merkaptoetanolilla, ja alkyloidaan sen jalkeen muodostunut proteiini merkaptaani reagenssilla kuten esim. jodoasetamidi. Kasittelemattomat vasta-aineet ovat edullisia, ja niita kaytetaan yhdessa Fab-osien kanssa kuvaamaan tamån keksinndn mukaisia monoklonaalisia reseptorimolekyylejå.

Sanoja "erittaa" ja "tuottaa" kaytetaan usein vaihtovuoroisesti . alalla koskien soluja, joista vasta-ainemolekyyleja saadaan.

Solut, jotka tuottavat vasta-aineita, eivat ehka kuitenkaan erita noita molekyyleja ymparistoonsa. Tassa yhteydessa kiin-nostuksen kohteena olevat hybridoomasolut erittavat monoklonarali-sia vasta-aineita ymparistoonsa. Siita huolimatta sellaisia soluja nimitetaan usein tassa yhteydessa "vasta-aineita tuotta-viksi" soluiksi, ja niiden vasta-aineiden sanotaan tulevan "tuotetuiksi", pysytellen alalla kaytetyssa ilmaisussa.

Ilmaisu "spesifinen sitoutuva aine", kaytettyna tassa yhteydessa, viittaa molekyylikokonaisuuteen, joka pystyy selektiivi-sesti sitomaan ligandin. Tyypillisia spesifisesti sitoutuvia .. aineita ovat reseptorit, komolementtikappaleet, proteiini A

ja niiden kaltaiset.

II

2i 92714

Ilmaisu "olennaisesti puhdas", kåytettynå tassa yhteydessa resep-torimolekyylien suhteen, tarkoittaa sita, etta ilmaistavissa olevien rajojen puitteissa, vain yhta vasta-ainesidontapaikkaa on lasna tehokkaana apo B-lOO:aa sitovana aineena. Nain olien vaikkakin olennaisesti puhdas reseptorimolekyylivalmiste vox sisaltaa enemmån kuin yhden vasta-ainesidontapaikkalajin, sellai-nen valmiste tuo nakyviin yhden ainoan apo B-100:aa sitovan affiniteetin. Esimerkiksi kudosviljelysupernatantit, joita taman keksinon mukainen hybridooma tuottaa, sisaltaa tyypillisesti myeloomaproteiineja kuin myos taman keksinnon mukaisia resepto-reja. Olennaisesti puhtaassa muodossa olevaa reseptorimolekyy-lia nimitetåån tyypillisesti "monoklonaaliseksi vasta-aineeksi" niiden toimesta, jotka tuntevat alaa, koska sellaisia koostumuk-sia tuotetaan kayttaen monoklonaalisia hybridoomaviljelmia.

Ilmaisu "oleellisesti samanaikaisesti", kaytettyna tassa yhteydessa 3 tai useamman antigeeni- ja reseptorikomponentin sekoit-tamisen suhteen immunoreaktioseoksen muodostamiseksi tarkoittaa sita, etta kaikki komponentit ovat lasna ja sekoitetaan keske-naan yhtena ainoana seoksena noin 15 minuutin sisalla ja edulli-sesti noin 5 minuutin sisalla minka tahansa 2 komponentin seoksena .

B. Hybridoomat ja monoklonaaliset reseptorit . Esilla olevassa keksinnossa tarkastellaan hybridoomaa, jonka laboratoriomerkinta on HL130C2,3C5, joka tuottaa reseptori-molekyyleja, jotka: (a) immunoreagoivat apoproteiini B-100:n pinnalla olevan kon-servoituneen antigeenisen determinantin kanssa; (b) inhiboivat kompetitiivisesti apoproteiini B-lOO:n sitoutumis-ta LDL-reseptoriin; ja 9 _ i (c) sisaltavat affiniteettivakion 3,82 x 10 M LDL:n suhteen nestefaasisessa kompetitiivisessa tasapainoradioimmuno-maarityksessa (RIA). Naista reseptorimolekyyleista kaytetaan tavallisesti nimitysta MB47.

Esilla olevan keksinnon mukaisesti tarkastellaan myos hybridoomaa, jonka laboratoriotunnusmerkinta on V82A6,1G4, joka 22 9 2 7 1 4 tuottaa reseptorimolekyyleja, jotka immunoreagoivat apoproteiini B-lOO:n antigeenisen determinantin kanssa, ja jotka sisåltåvåt 9 -1 af f miteettivakion noin 3,0 x 10 M LDL:n suhteen kiintea-faasisessa kompetitiivisessa tasapaino-RIA:ssa. Nåista resep-torimolekyyleista kaytetaan tavallisesti nimitysta MB24.

Hybridoomat HL130C2,3C5 ja V82A6,1G4 talletettiin American Type Culture Collection'iin (ATCC), Rockville, MD maaliskuun 6. påivanå 1985 seuraavilla ATCC:n talletusnumeroilla:

Hybridooma Reseptori ATCC talletusnumero _ Merkinta ___ V82A6,1G4 MB24 HB 8742 HL130C2,3C5 MB47 HB 8746

Edella olevat ATCC-talletukset tehtiin Budapestin sopimuksen mukaisesti (the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure ).

Esilla olevan keksinndn mukaiset hybridoomat muodostettiin sulauttamalla yhteen vasta-ainetta tuottava solu ja myelooma-solulinja. Sellaisia reseptoreja tuottavia soluja kuvasivat en-sin Kohler ja Milstein, Nature, 256, 495 (1975), joka kuvaus on tassa yhteydessa sisallytetty viitteena. Reseptoreja saa-daan tyypillisesti hybridoomasoluviljelmien supernatanteista, edullisesti monoklonaalisista soluviljelmista, tai vaihtoehtoi-sesti vatsaontelonesteesta tai muusta ruumiinnesteesta saatuna ei-humaaneista, lamminverisista isantaelaimista, edullisesti sellaisista, jotka ovat histologisesti yhteensopivia tai immuno-logisesti sopivia, joihin hybridoomasolut siirrettiin ja vil-jeltiin.

Esilla olevan keksinnon mukaisessa toisessa suoritusmuodossa tarkastellaan nain olien soluviljelmaa, joka kasittaa (a) taman keksinnon mukaisen hybridooman; (b) reseptorimolekyyleja, joita hybridooma erittaa, jotka molekyylit reagoivat immunologisesti

II

• « 9271 4 23 apoproteiini B-lOO:n kanssa; ja (c) viljelyalustan hybridoomaa vårten. Alustat, jotka ovat hyodyllisiå naiden koostumusten valmistamiseen, ovat sekå hyvin tunnettuja alalla etta kaupalli-sesti saatavissa, ja niihin kuuluvat synteettiset alustat, kasvatetut hiiret ja vastaavat. Tyypillinen synteettinen alus-ta on Dulbeccon minimaalialusta /DNEM; Dulbecco et al., Virol. 8, 396 (1959jy, johon on lisatty 4,5 g/1 glukoosia, 20 mg glutamii-nia, ja 20 % vasikan sikion seerumia. Tyypillinen kasvatettu (jalostettu) hiirikanta on Balb/c.

Viela toisessa suoritusmuodossaan esilla olevan keksinnon mukai-sesti tarkastellaan reseptoreja, jotka on merkitty MB47 ja MB24, joita tuottavat hybridoomat, joita on merkitty HB 8746 ja HB 8742, vastaavasti ja jotka immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa. Taman keksinnon mukaista reseptoria voidaan nain olien valmistaa viljelemållå sopivassa alustassa taman keksinnon mukaista sopivaa hybridoomaa, ja ottamalla reseptori talteen alus-tasta.

Curtiss et al,, J. Biol. Chem., 257, 15213 (1982) raportoivat aikaisemmin 11 apo B:lle spesifisen reseptorimolekyylin tuotta-misesta ja karakterisoinnista, mukaanlukien MB24:lla merkitty reseotorimolekyyli, jota tuottaa hybridooma HB 8742. Hybridooma HB 8742 saatiin, kuten on kuvattu yksityiskohtaisemmin Materiaalit • ja menetelmat jaksossa, sulauttamalla yhteen ihmisen VLDL:lla immunisoitujen hiirten pernasoluja.

Vatsaontelonestetta sisaltava MB24:n IgG-fraktio, joka oli muodostunut HB 8742:n vatsaontelonsisaisesta kasvusta, karakte-risoitiin isoelektrisella fokusoinnilla (IEF). Kuten Curtiss et al., supra, ovat todenneet, yhteensulauttaminen suoritettiin P3x63Ag8 myeloomasolujen kanssa, jotka erittavat IgG^k-immunoglobuliinia. IEF:n yhteydessa todettiin sen vuoksi erikoinen, moninaisia proteiinijuovia sisaltava jakaumakuvio, jossa esiintyi umoimahkaisesti sekoittuneina raskas- ja kevyt-ketjusisaltoisia immunoglobuliinimolekyyleja P3x63Ag8 myelooma ·· IgG^k vasta-aineen ja MB24-reseptorin lisaksi.

9271 4 24

Hybridooma HB 8746 tuottaa MB47-reseptorimolekyyleja, ja se muodostettiin sulauttamalla yhteen LDL:11a ja P3x63Ag8,653,1 myeloomasoluilla immunisoitujen hiirten pernasoluja. Tama myeloomakantamuodon muunnos ei eritå myeloomaproteiinia.

HB 8746:n vatsaonteloneste tuo nakyviin erikoisen proteiini-juovia sisaltavån jakaumakuvion, tuoden esiin IgG2a raskas- ja kappa-kevytketjuja. Molemmat taman keksinnon mukaiset hybridoo-mat voidaan nain olien karakterisoida osaksi niiden tuottamien reseptorimolekyylien IEF-tyypin perusteella.

Vaikkakin taman keksinnon mukainen V82A6,1G4 hybridooma tuottaa enemman kuin yhta reseptorimolekyylityyppiå, taman keksinnon mukaiset reseptorimolekyylit voidaan helposti identifioida ja eristaa niiden yksilollisten kykyjen perusteella immunoreagoida apo B-100 antigeenisten determinanttien kanssa. MB24:n ja MB47:n antigeenisia spesifisyyksiå tutkittiin maarittamalla niiden yk-silolliset kyvyt immunoreagoida apoproteiinien kanssa, joita saa-tiin kylomikroneista, VLDL: stå, LDL:sta ja HDL:sta, Western blot-maarityksessa, jota on kuvattu jaljempana.

Siten saadut tulokset osoittivat, etta MB47 ja MB24 immuno-reagoivat LDLrsta, VLDL:sta ja kylomikroneista saadun apo B-lOO:n kanssa, mutta ei apo B-48:n kanssa VLDL:sta tai kylomikroneista. Seka MB47:n etta MB24:n kyky immunoreagoida yksilolli- • sesti apo B-lOO:n kanssa kylomikroneista ja VLDLrsta esitetaan kuviossa 1.

1. MB47:n immunologisesti sitoman apo B-lOO:n antigeenisen determinantin karakterisointi_

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet apo B-100:n olevan anti- geenisesti heterogeenista. Se tarkoittaa sita, etta jotkut apo B-100:n epitoopit eivat ilmenny kaikista LDL-partikkeleista.

Sekoittaminen ylimaaran kanssa tiettyja monoklonaalisia vasta- aineita nestefaasisessa RIArssa ei nain olien johda kaikkien 12 5 radioaktiivisesti leimattujen LDL-( J-LDL)partikkeleiden immunologiseen sitoutumiseen.

• « 11 25 9 2 7 1 4

Sen måårittåmiseksi, oliko MB47 reseptorimolekyylien tunnistama epitooppi tasaisesti kaiken LDL:n ilmentama, MB47:n kykya sitou- .125 tua immunologisesti ' J-LDL:aan nestefaasisessa RIA:ssa tutkit-tiin. LDL, joka oli eristetty 10 normaalin yksilon yhteenkera-tysta plasmasta ja yhden normaaliyksilon plasmasta, radioleimat-tiin kuten on kuvattu jåljempånå, ja sekoitettiin biologisesti aktiivisten MB47 reseptorimolekyylien kanssa immunoreaktioseok-sen muodostamiseksi. Seosta pidettiin biologisissa maaritysolo-suhteissa ennalta måaråtty ajanjakso, joka MB47 reseptorimolekyylien kannalta riittaa sitoutumaan immunologisesti apo B:hen kussakin naytteessa ja muodostamaan immunoreaktiotuotteen {immunoreaktantti) .

........ 125

Ylimaaran MB47 reseptorimolekyyleja sitoma maksimimaara J- LDLtaa maaritettiin saostamalla kaikki reseptorimolekyylit

IgSORBrn avulla (The Enzyme Co., Boston, MA), ja kvantitoimalla 125 J-LDL:aan liittyvat imoulssit saostumassa gammalaskijassa.

Tulokset, ilmaistuina trikloorietikkahapon (TCA) avulla saostu- 125 . .......... .. , neen J-LDL:n prosenttisena maarana 3a esitettyna kuviossa 2, 125 osoittavat, etta vasta-aine sitoi oleellisesti kaiken J-LDL:n; mika osoittaa, etta kaikki LDL-partikkelit ilmentavat epitoo-pin, jonka MB47 on tunnistanut ja sitonut.

2. Apo B-100:n sitoutumisen kompetitiivinen inhiboituminen i' LDL-reseptoriin MB47:n vaikutuksesta_

Apoproteiini B-100 on tarkein apoproteiini ihmisen ja muiden nisakkaiden LDLrssa, ja se valittaa LDL:n sitoutumista fibro-blastin LDL-reseptoriin. Aikaisemmissa tutkimuksissa on kuvattu LDL-reseptorin keskeista roolia nisakkaan lipoproteiini-aineenvaihdunnassa. Se tosiseikka, etta monesta eri elainla-jista eristetvt LDL-partikkelit sitoutuvat spesifisesti ihmisen LDL:n reseptoria sitovaan alueeseen merkitsee sita, etta apo B-100 molekyylilla olevan kiinnittymispaikan on oltava lajinkehityksellisesti sailynyt ja nain olien LDL-partikkelei-den ilmentama kaikista elainlajeista.

• · 26 9271 4

Sen tutkimiseksi, immunoreagoivatko MB47 reseptorimolekyylit antigeenisen determinantin kanssa, joka sijaitsee ihmisen aoo B-100:n LDL-reseptoria sitovalla alueella, MB47:n kykya inhiboida 125 J-LDL:n sitoutumista solun LDL-reseptorlin tutkittim. Tama toteutettiin sekoittamalla MB47 reseptorimolekyyleja, kokonais- 125 ten vasta-ainemolekyylien muodossa, J-LDL:n kanssa immunoreak- tioseoksen muodostamiseksi. Immunoreaktioseosta pidettiin sen jalkeen biologisissa maaritysolosuhteissa ennalta maaratty ajan- jakso, joka MB47 reseptorimolekyylien kannalta riittaa immunolo- 125 gisestx sitoutumaan lasna olevaan J-LDL:aan ja muodostamaan immunoreaktantin.

Myohemmin immunoreaktantin sisåltavå immunoreaktioseos levitet- tiin kerroksena ihmisen fibroblastien paaile, jotka ilmentåvåt fibroblastin LDL-reseptoreja. Viljelmia pidettiin sen jalkeen ennalta maaratty ajanjakso, joka fibroblastin LDL-reseptorien kannalta riittaa spesifisesti sitomaan kaikki LDL:n reseptoria 125 sitovat paikat, jotka ovat saatavilla J-LDL-MB47 immunoreaktio-tuotteessa. Otaksutaan, etta sellainen solun reseptori-LDL-vuorovaikutus inhiboituu, jos reseptorimolekyylit, kuten MB47 valaisee esimerkkinå, immunoreagoivat apo B-lOO antigeenisen determinantin kanssa, jonka rakenne on osallisena myos LDL-resep-torin sitomisessa.

Taman tutkimuksen tulokset, jotka on esitetty kuviossa 3, osoittavat, etta MB47 reseptorimolekyylit inhiboivat ihmisen 125 .....

J-LDL:n solun reseptorivalitteista sitoutumista, sisaan- kuljetusta ja hajottamista ihmisen fibroblastien toimesta siina maarin, joka on verrattavissa siihen, minka tuottaa 200- kertainen ylimaara leimaamatonta LDL:aa.

Sen mahdollisuuden tutkimiseksi, etta MB47 reseptorit sitoutu-vat epitooppiin, joka sijaitsee apo B:n reseptorialueen vie-ressa, ja niiden koosta johtuen, estavat steerisesti apo B:n sitoutumisen LDL-reseptoriin, MB47 vasta-ainemolekyylien Fab-kappaleiden kykya inhiboida ihmisen LDL:n sisaankuljetusta ·. ja hajotusta tutkittiin myos edella kuvatussa fibroblastimaari- tyksessa.

π: 27 9271 4

Kuten on esitetty kuviossa 4, MB47-Fab-kappaleet estivåt mer- kittavåsti LDL:n spesifista solutason sitoutumista ja hajotusta.

Koska MB47-Fab-kappaleet ovat huomattavasti pienempia kuin kos- kemattomat MB47 vasta-ainemolekyylit, uskotaan, etta epitooppi, jonka MB47 vasta-aineen kiinnittymispaikka tunnistaa, sisåltyy LDL apo B-100:n pinnalla olevaan LDL-reseptorin sitoutumis- alueeseen. Vasta-aine MB24:lla ei ole vasta-aineen MB47 omi- . 125 naisuuksia, eika se mhiboi J-LDL:n sitoutumista 3a hajotusta viljeltyjen fibroblastien toimesta.

3. Steerinen inhibiitio

Joidenkin taman keksinnon mukaisen mååritysmenetelmån suoritus-muotojen suhteen, ensimmaisen ja toisen reseptorin on sitoudut-tava apo B-100-molekyylin eri epitooppeihin, ja niiden epitoop-pien on oltava riittavasti erillaan niin, etta yhden reseptorin sitoutuminen ei steerisesti esta toisen reseptorin sitoutumista. Sen vuoksi tutkittiin MB47:n ja MB24:n kykya kompetitiivisesti inhiboida toistensa immunologista sitoutumista kiinteaan faa-siin kiinnitettyyn apo B-lOO-reagenssiin.

Tuon tutkimuksen tulokset, jotka on esitetty kuviossa 5, osoitta-vat, etta 70-kertainen ylimaara leimaamatonta MB24:aa ei merkit-tavasti inhiboinut peroksidaasileimatun MB47:n sitoutumista apo B-lOO-reagenssiin. Vastaavasti, 70-kertainen ylimaara leimaamatonta MB-47:aa ei merkittavasti inhiboinut peroksidaasileimat-tua MB24:aa sitoutumasta apo B-lOO-reagenssiin. MB24 ja MB47 sitoutuvat nain olien eri epitooppeihin apo B-100:n pinnalla, ja ne epitoopit ovat riittavasti erillaan niin, etta MB24 ja MB47 eivat koskemattomina vasta-aineina inhiboi toistensa sitoutumista yhteen ainoaan apo B-100-molekyyliin.

4. MB47:n apo B-100:aan sitoutumisen stokiometria ja affiniteetti_

Antigeenisten determinanttipaikkojen lukumaaran maarittamiseksi LDL:lla olevaa apo B-lOO-molekyylia kohti, jotka MB47-reseptori-molekyylit tunnistivat, vasta-aineleimattua RIA:ta kaytettiin. Tassa maarityksessa MB47 reseptorimolekyyleja puhdistettiin 28 9271 4 • 12 5 (eristettiin) vatsaontelonesteestå, ja radioleimattiin ( J-MB47) hyvin tunnetuilla menetelmilla, joita kuvataan yksityiskoh-taisemmin Materiaalit ja menetelmåt jaksossa.

........125 . ..

Kuten on esitetty kuviossa 6A, kasvavia maaria J-MB47:aa sekoitettiin kiinteån maaran kanssa apo B-lOO:aa LDL:n muodossa erillisissa reaktioseoksissa. Seoksia pidettiin biologisissa 125 måaritysolosuhteissa ennalta mååratty ajanjakso, joka J-MB47 reseptorimolekyylien kannalta riittåå sitoutumaan immunologisesti apo B-lOO:aan (LDL) ja muodostamaan immunoreaktantin. Immunoreak-

tantin lasnaolo maaritettiin sen jalkeen saostamalla LDL

(sidottu ja vapaa) kvantitatiivisesti kayttaen kanin antiseeru- mia, joka on spesifinen ihmisen LDL:lle, ja ilmaisemalla immuno- 125 ......

reaktanttina lasnaolevan J-MB47:n måara gammalaskennalla.

12 5 J-MB47 reseptorimolekyylien spesifinen immunologinen sitoutu-minen oli kyllåstettavisså, kuten on esitetty kuviossa 6A. Naissa tutkimuksissa saatujen sitoutumistulosten Scatchard-kayrå oli lisaksi lineaarinen (kuvio 6B) , mika viittasi LDL-partikkeleilla olevien MB47:n sitoutumispaikkojen tasalaatuisuuteen.

Lisaksi, MB47:n naennaisen affiniteettivakion (Ka) ihmisen apo B-100:n suhteen LDL:n muodossa maaritettyna vasta-aineleimatul- 9 -1 la RIA:lla todettim olevan 3,82x10 M . Scatchard-analyysis- 125 så tuli myos nakyviin, etta maksimaalisesti 212 fmoolia J-MB47 vasta-ainetta sitoutui 182 fmooliin LDL:aa, mika osoitti, etta vain yksi MB47-molekyyli sitoutuu kuhunkin apo B-100-molekyyliin. Se tarkoittaa sita, etta MB47 sitoutuu yhteen ainoaan, erikoiseen apo B-l00:n antigeeniseen determinanttiin.

MB47:n keskimaarainen affiniteettivakio apo B-l00:n suhteen maaritettiin myos edella kuvatussa antigeenileimatussa RIArssa.

Tassa kompetitiivisessa tasapainoisessa nestefaasisessa RIA:ssa, LDL:na låsnå oleva leimaamaton apo B-100 aiheutti 125 J-LDL:n tayden syrjayttåmisen. MB47 reseptorimolekyylien laskettu affiniteettivakio LDL:n suhteen, jotka olivat lasna 9 —1 kokonaisena, koskemattomana vasta-aineena, oli 4x10 M , mika

II

9271 4 29 oli hyvassa soousoinnussa sen Ka:n kanssa, joka oli maaritetty tata ennen kuvatulla vasta-aineleimatulla maarityksella.

C. Maaritysmenetelmat

Esilla olevan keksinnon mukaiset reseptorimolekyylit ovat eri-tyisen hyodyllisia apoproteiini B-lOO:n lasnaolon ja maaran maarittamiseksi ruumiinnestenaytteesta kuten veri, seerumi tai plasma.

Yhdessa suoritusmuodossa, esilla olevan keksinnon mukaisesti tarkastellaan menetelmaa apoproteiini B-100:n maaran maarittamiseksi ruumiinnestenaytteesta, joka menetelma kasittaa seu-raavat vaiheet: (a) Tuotetaan nayte kehosta maaritettavaksi. Sellainen nayte otetaan tavallisesti mitattuna maarana tai tunnettuna maarana verta, ja edullisemmin plasmana tai seerumina. Menetelmat veri-, plasma- ja seeruminaytteiden ottamiseksi ovat hyvin tunnettuja alalia eika niita kasitella tassa yhteydessa enempaa.

(b) Tuotetaan reseptorimolekyyleja biologisesti aktiivisessa muodossa, jotka (i) immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa ja (ii) joita erittavat joko hybridooma, jonka ATCC-talletus-numero on HB8746 tai hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742, ja joita on lasna tehokkaana maarana maarityksen suo-rittamista vårten.

Edullisissa suoritusmuodoissa reseptori on koskematon vasta-aine tai Fab-kappale.

Tehokas maara reseptorimolekyyleja voi olla erilainen, muun muassa tietyn maaritysmenetelman mukaan, jota kaytetaan, kuten hyvin tiedetaan. Hyvin tunnettu on myos se helppous, jolla tehokas maara voidaan maarittaa kayttaen standardia laboratorio-tekniikkaa alaa tuntevan toimesta.

(c) Sekoitetaan yhteen ruumiinnestenayte vaiheen (b) reseptori- ‘ molekyylien kanssa immunoreaktioseoksen muodostamiseksi.

30 92714 (d) Seosta pidetaan biologisissa maaritysolosuhteissa ennalta maaratty ajanjakso minuuteista tunteihin, kuten esimerkiksi noin 10 minuutista biologisissa maaritysolosuhteissa ennalta maarattyyn aikaan noin 16-20 tuntia, joka on reseptorimolekyylien vasta-aineen kiinnitymispaikkojen kannalta riittava sitomaan immunologisesti apoproteiini B-100:aa kehonnaytteesta ja immuno-reaktantin (ensimmainen kompleksi) muodostamiseksi. Biologiset maaritysolosuhteet ovat sellaiset, jotka yllapitavat taman keksinnon mukaisten reseptorimolekyylien biologista aktiivisuut-ta, ja joille on ominaista lampotila-alue noin 4°C - noin 45°C, pH-arvoalue noin 5 - noin 9, ja ionivahvuuden vaihtelu tislatun veden ionivahvuudesta noin yksimolaarisen natriumkloridin vastaa-vaan. Alalia tunnetaan hyvin menetelmat sellaisten olosuhteiden optimoimiseksi.

(e) Måaritetaan kaiken muodostuneen immunoreaktantin maara ja siten mainitussa naytteessa låsna olevan apo B-100:n maara.

Edullisissa suoritusmuodoissa, vaiheen (a) ruumiinnestenaytettå preparoidaan edelleen maaritysta vårten vaiheen (e) mukaisesti seuraavien vaiheiden kautta: (f) Tuotetaan biologisesti aktiivisia toisia reseptorimolekyy-leja, joita erittaa vaiheen (b) kummankin hybridooman jaanteet; (g) Sekoitetaan ennalta maaratty maara toisia reseptorimolekyy-leja ruumiinnestenaytteen kanssa immunoreaktioseoksen muodostamiseksi .

(h) Pidetaan toisen reseptorin/ruumiinnestenaytteen seosta, joka siten muodostui, samanlaisella tavalla kuin mita kuvattiin vaiheessa (d) kerroksellisen immunoreaktantin (toinen kompleksi) muodostamiseksi, joka sisaltaa yhden MB47-molekyylin ja yhden MB24-molekyylin sitoutuneina immunologisesti yhteen apo B-100-molekyyliin.

Edella kuvatut yleiset maaritysmenetelmat voidaan suorittaa, kuten alalia hyvin tiedetaan, kayttaen monia erilaisia formaatteja.

II

31 9271 4 Nåin olien, sita vastoin kuin jåljempånå kuvattavissa spesifi-semmisså mååritysmenetelmisså kåytetaån kiinteafaasisia formaat-teja, keksinto ei ole niin rajoitettu.

Kiinteafaasiset måaritysformaatit voidaan toteuttaa kayttaen joko reseptorimolekyyleja tai antigeenia kiinnitettyna kiinteaan mat-riisiin kiintean kantajan muodostamiseksi. Niissa suoritusmuodois-sa, joissa kiintea kantaja sisaltaa reseptorin vaiheesta (b), seos vaiheesta (c) on kiinteå/nestefaasinen seos, ja immunoreak-tantti vaiheesta (d) on kiinteafaasinen immunoreaktantti, joka sisaltaa ruumiinnaytteen apo B-100:n.

Niissa suoritusmuodoissa, joissa kiintea kantaja sisaltaa apo B-lOO reagenssia, seos vaiheesta (c) on myos kiinteå/nesteseos, mutta ruumiinnaytteen apo B-lOO:aa sisaltava immunoreaktantti vaiheesta (d) on nestefaasinen immunoreaktantti. Reagenssi apo B-lOO on biologisesti aktiivista; so. antigeenista, apo B-100, joka toimitetaan muusta lahteesta kuin mika on tutkimuk-sessa, tyypillisesti eristetyn LDL:n muodossa.

Apo B-lOO:n maaran maarittaminen, joka on sidottuna immunoreak-tanttina vaiheessa (d), voidaan toteuttaa,suoraan tai epasuorasti, maaritysmenetelmilla, jotka tunnetaan hyvin alalla. Esimerkiksi homogeenisia maarityssysteemeja, kuten ne, joita on kuvattu US-patenttijulkaisuissa 4 536 479, 4 233 401, 4 233 402 ja 3 996 345, jotka kaikki on sisallytetty tassa viitteena, voidaan kayttaa.

Edullisissa kiinteafaasisissa suoritusmuodoissa, ruumiinnestetta preparoidaan edelleen maaritysta vårten kayttaen leimattua soe-sifista sitovaa ainetta. Leimatun spesifisen sitovan aineen tyyppi ja spesifisyys riippuvat, kuten alalla hyvin tiedetaan, kaytettavasta menetelmasta ja formaatista.

Edullisissa kiinteafaasisissa suoritusmuodoissa, joissa kiintea kantaja sisaltaa reseptorin vaiheesta (b); se tarkoittaa taman keksinnon mukaista reseptoria, kiinteaan faasiin sidotun apo B-100:n maara preparoidaan maaritysta vårten seuraavien vaihei-den kautta: 9271 4 32 (i) Tuotetaan biologisesti aktiivisia leimattuja toisia resep-torimolekyyleja, jotka sitoutuvat ruumiinnaytteessa lasna olevaan apoproteiini B-lOO:aan, jolloin muodostuu immunoreak-tanttia. Leimatun toisen reseptorin leima kykenee ilmaisemaan immunoreaktantissa olevan leimatun toisen reseptorin lasnaolon.

Erityisen edullisissa suoritusmuodoissa leimatut toiset resepto-rimolekyylit reagoivat immunologisesti toisen apo B-lOO-epitoo-pin kanssa, joka on erilainen kuin se epitooppi, jonka kanssa kiinteafaasiset reseptorimolekyylit reagoivat, eivatka ne huomattavasti inhiboi kiinteafaasisia reseptorimolekyyleja reagoimasta apo B-lOO:n kanssa. Leimatut toiset reseptorimolekyylit ovat niita, joita ovat erittaneet jaanteet kummas-takin hybridoomasta vaiheesta (b); so. luetellut reseptorimolekyylit, joita ei valittu ensimmåisiksi reseptorimolekyy-leiksi .

Menetelmat sen måårittåmiseksi inhiboiko (hairitseeko) reseptori-molekyyli toisen reseptorimolekyylin sitoutumista samaan antigee-niin tunnetaan alalla hyvin, ja niita kuvataan yksityiskoh-taisemmin jåljempånå.

(j) Sekoitetaan ennalta maaratty maara leimattuja toisia reseptorimolekyyleja ruumiinnestenaytteen kanssa immunoreaktio-seoksen muodostamiseksi.

Siten muodostunut seos voi olla nestemainen seos, kuten silloin kun vaihe (i) toteutetaan ennen edella olevaa vaihetta (b), tai se voi olla kiintea/nestemainen seos, kun leimattu toinen reseptori sekoitetaan oleellisesti samanaikaisesti vaiheen (b) kanssa tai sen jalkeen. Kun vaihe (i) suoritetaan ennen tai oleellisesti samanaikaisesti vaiheen (b) kanssa, leimatut toiset reseptorimolekyylit immunoreagoivat toisen apo B-100-epitoopin kanssa, joka on eri kuin se epitooppi, jonka kanssa kiinteafaa-siset reseptorimolekyylit reagoivat, eivatka ne oleellisesti inhiboi kiinteaan faasiin sidottuja reseptorimolekyyleja immuno-reagoimasta apo B-100:n kanssa.

li 33 92714

Edullisissa suoritusmuodoissa vaihe (i) suoritetaan oleellises-ti samanaikaisesti vaiheen (b) kanssa tai jålkeen vaiheen (c).

(k) Leimatun toisen reseptorin/ruumiinnestenåytteen seosta, joka siten muodostui, inkuboidaan samalla tavalla kuin vaiheessa (d) kuvattua immunoreaktantin muodostamiseksi.

Kiinteaan faasiin sidotut reseptorimolekyylit ja toiset resepto-rimolekyylit sitoutuvat siten immunologisesti ruumiinnestenayt-teessa lasnå olevaan apo B-100:aan, muodostaen siten kiinteaan faasiin sidotun kerroksellisen immunoreaktantin, joka sisaltaa leiman sidottuna osaan siitå. Se tarkoittaa sita, etta kiinteå-faasinen kerroksellinen immunoreaktantti, joka sisaltaa leiman, muodostuu kun yksi molekyyli apo B-lOO.-aa immunoreagoi seka kiinteaan faasiin sidotun reseptorimolekyylin kanssa etta leimatun toisen reseptorimolekyylin kanssa. Edullisissa suoritusmuodoissa, kaikki leimatut toiset reseptorimolekyylit, jotka eivat muodosta osaa kiinteaan faasiin sidotusta immunoreaktantista (so. ne, jotka eivat ole immunologisesti sitoutuneet apo B-100:aan, joka itse on sitoutunut kiinteafaasisiin reseptorimolekyyleihin) erotetaan immunoreaktantista, edullisesti pesemalla ennen immuno-reaktantissa lasna olevan leimatun toisen reseptorin maaran maarittamista.

Vaiheen (e) mukaisesti muodostuneen immunoreaktantin maaran maarittaminen toteutetaan osana immunoreaktanttiin sidottuna olevan leimatun toisen reseptorin maaran maarittamisella, joka immunoreaktantti sisaltaa apo B-100:n. Tama antaa kayttoon suoran maarityksen naytteen sisaltaman apo B-100:n maaralle.

Tuo maara voi olla nolla, osoittaen siten, ettei naytteessa ole lasna yhtaan apo B:ta, niiden rajojen puitteissa, jotka voidaan ilmaista. Menetelmat leimatun toisen reseptorin maaran maarittamiseksi riippuvat kaytettavasta leimasta, sellaisten leimojen ja maaritysmenetelmien ollessa hyvin tunnettuja alalia.

Edullisissa kiinteafaasisissa suoritusmuodoissa, joissa kiintea kantaja sisaltaa apo B-100-reagenssia, vaiheessa (d) muodostu- „ 92714 34 neen immunoreaktantin maåra preparoidaan maåritysta vårten seuraavien vaiheiden kautta: (l) Sekoitetaan biologisesti aktiivista leimattua spesifisesti sitoutuvaa ainetta, edullisesti reseptorimolekyyli, joka sitou-t\m mihin tahansa reseptorimolekyyliin, joita kaytettiin vaihees-sa (b), joita on lasna kiinteafaasisena immunoreaktanttina, kompleksin muodostamiseksi, edullisesti toisen immunoreaktantin. Leimatun spesifisen sitoutuvan aineen leima kvkenee ilmaisemaan kompleksissa olevan leimatun spesifisen sitoutuvan aineen lasna-olon. Naiden mååritystyyppien edullisissa suoritusmuodoissa vaiheet (i)-(k) suoritetaan vaiheen (d) jålkeen.

(m) Sekoitetaan ennalta maaratty maara leimattua spesifista sitoutuvaa ainetta ruumiinnestenaytteen kanssa reaktioseoksen, edullisesti immunoreaktioseoksen, muodostamiseksi.

(n) Siten muodostunutta leimatun spesifisen sitoutuvan aineen/ ensimmaisen immunoreaktantin seosta inkuboidaan samalla tavalla kuin kuvattiin vaiheessa (d) kompleksin muodostamiseksi.

Nain muodostunut kiinteafaasinen kompleksi sisaltaa leiman sidottuna osaksi sita. Edullisissa suoritusmuodoissa, kaikki leimattu spesifinen sitoutuva aine, joka ei ole sitoutunut osaksi kiinteafaasista kompleksia, erotetaan kompleksista, edullisesti pesemalla, ennen kiinteaan faasiin sidotun leiman lasnaolon maarittamista.

Vaiheen (e) mukaisesti muodostuneen immunoreaktantin maaran maarittaminen toteutetaan maarittamalla osana kompleksia låsna olevan leiman maara. Tama antaa kayttoon epasuoran maarityksen naytteessa lasna olevan apo B-lOO:n maaralle.

Proteiinisten antigeenien ja spesifisten sitoutuvien aineiden leimaaminen tunnetaan hyvin alalia. Hybridoomien tuottamia reseptoreja voidaan esimerkiksi leimata radioisotooppia sisal-tavia aminohappoja metabolisesti liittamalla, jotka on toimi-

II

9271 4 35 tettu komponenttina kudosviljelyalustaan. Katso esimerkiksi Galfré et al., Meth. Enzymol. 73, 3-46 (1981).

Aktiivisten funktionaalisten ryhmien vålityksella tapahtuvat proteiinien konjugointi tai kytkentamenetelmat ovat erityisen kayttokelpoisia, ja johtavat siihen, etta leima tulee kovalentti-sesti kytketyksi antigeeniin tai spesifiseen sitoutuvaan ainee-seen. Katso esimerkiksi Aurameas, et al., Scand. J. Immunol.

Vol. 8, Suppl. 7, 7-23 (1978) ja US-patenttijulkaisu 4 493 795, mika on sisallytettyna tassa viitteenå. Lisaksi paikkakohdis-tettu liittamisreaktio voidaan suorittaa siten, etta leima ei olennaisesti håiritse antigeenin tai reseptorin biologista aktiivisuutta, esimerkiksi Rodwell et al., Biotech. 3, 889-894 (1985 ) .

Leimaava valiaine voi olla fluoresoiva leimaava aine, joka si-toutuu kemiallisesti vasta-aineisiin tai antigeeneihin denatu-roimatta niita, jolloin muodostuu fluorokromia (vari), joka on hyodyllinen immunofluoresoiva merkkiaine. Sopivia fluoresoivia leima-aineita ovat fluorokromit kuten esimerkiksi fluoreskeiini isosyanaatti (FIC), fluoreskeiini isotiosyanaatti (FITC), 5-dimetyyliamiini-l-naftaleenisulfonyylikloridi (DANSC), tetra-metyylirodamiini isotiosyanaatti (TRITC), lissamiini, rodamiini 8200 sulfonyylikloridi (RB 200 SC) ja vastaavat. Immunofluore-senssianalyysimenetelmien kuvailu loytyy teoksesta DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", Antibody As A Tool, Marchalonis et al., edit. J. Wiley & Sons, Ltd., s. 189-231, 1982, joka on sisallytetty tassa viitteena.

Edullisissa suoritusmuodoissa osoittava ryhma on entsyymi, kuten esimerkiksi piparjuuren peroksidaasi (HRPO), glykoosioksidaasi tai niiden kaltaiset. Silloin kun paaasiallinen osoittava ryhma on entsyymi kuten HRPO tai glukoosioksidaasi, lisareagensseja tarvitaan sen tosiasian visualisoimiseksi, etta reseptori-ligandikompleksi (immunoreaktantti) on muodostunut. Sellaisiin lisareagensseihin HRP0:ta vårten kuuluvat vetyperoksidi ja ,s 9271 4 ό Ο hapettavan varin prekursori kuten diaminobentsidiini. Glukoosi-oksidaasin kanssa hyodyllinen lisareagenssi on 2,2'-atsino-di-(3-etyyli-bentstiatsoliini-G-sulfonihappo) (ABTS).

Radioaktiiviset alkuaineet ovat myos hyodyllisia leimaavia aineita, ja niita katyetaan valaisevasti tassa yhteydessa.

Tyypillinen radioleima-aine on radioaktiivinen alkuaine, joka tuottaa gammasade-emissioita. Alkuaineet, jotka itse emittoivat

, . · , ... 124 T 12 5 128 131 T 132T

gammasateita, kuten esimerkiksi J, J, j, J, J

ja ^Cr, edustavat yhta luokkaa gammasade-emissiota tuottavista radioaktiivisen alkuaineen sisaltavista osoittavista ryhmista.

125

Erityisen edullinen on J. toinen ryhma hyodyllisia osoittavia ryhmia sisaltaa niita alkuaineita, kuten ^C, ^F, ^0 ja N, jotka itse emittoivat positroneja. Siten emittoidut positronit tuottavat gammasateita kohdatessaan elainruumiissa lasnaolevia elektroneja. Myoskin hyodyllinen on beetaemittoija kuten 111.

indium.

Esilla olevan keksinnon mukaisissa maaritysmenetelmissa ja systeemeissa voidaan nain olien kayttaa hyvaksi tai ne voivat kasittaa taman keksinnon mukaisen reseptorin kiinnitettyna kiinteaan matriisiin kiintean kantajan muodostamiseksi.

Antigeeni tai reseptori kiinnitetaan tyypillisesti kiinteaan matriisiin adsorption avulla vesipitoisesta alustasta, vaikkakin useita adsorptiotapoja, kuin myos muita kiinnittamistapoja, joita alaa tuntevat hyvin tuntevat, voidaan kayttaa. Tyypillisia sel-laisia tapoja ovat reseptorin tai antigeenin reaktio reaktiivi-sen karboksyylisen toiminnallisuuden kanssa, joka on muodostunut syanogeenibromidin reaktiossa glukoosia sisaltavien matriisien kanssa kuten esim. ristisidottu dekstroosi tai selluloosa, glutaraldehydi liittajana, kuten on kasitelty jaljempana lateksi-partikkelien yhteydessa ja vastaavien.

Hyodylliset kiinteat matriisit tunnetaan hyvin alalla. Sellai-;· siin materiaaleihin kuuluvat ristisidottu dekstraani, jota on

II

37 92714 saatavissa kauppanimellå Sephadex Pharmacia Fine Chemicals'ilta (Piscataway, NJ); agaroosi; polystyreenipalloset, halkaisijalta noin 1 - noin 5 mm, saatavana Abbott Laboratories of North

Chicago'lta, IL; polyvinyylikloridi, polystyreeni, ristisidottu polyakryyliamidi, nitroselluloosa tai nailonpohjaiset kudokset kuten arkit, liuskat tai tangot; tai putket, levyt tai mikro-tiitterilevyn kuopat, kuten ne, jotka on tehty polystyreenista tai polyvinyylikloridista.

Lateksipartikkelit, jotka ovat hyodyllisia agglutinaatiotyyppi-sissa måårityksissa, ovat myos hyodyllisia kiinteita matriiseja. Sellaisia materiaaleja toimittaa the Japan Synthetic Rubber Company of Tokyo, Japan, ja niita kuvataan karboksifunktionaali-sina partikkeleina dispergoituna anioniseen saippuaan. Sellais-ten partikkeleiden tyypillisten erien keskimaarainen halkaisija on 0,308 mikronia ( ,u), ja ne sisaltavat keskimaaraisen karboksi- / 2 funktionaalisen ryhman jakaantuman noin 15 - noin 30 Angstrom karboksiryhmaa kohti.

Ennen kayttoa partikkelien annetaan reagoida diamiinin kanssa kuten 1,3-diamino-2-propanoli, jotta muodostuisi suuri maara amidisidoksia partikkelin karboksiryhmien kanssa jattaen samalla amiiniryhmat vapaiksi. Vapaiden amiinien annetaan sen jalkeen reagoida dialdehydin kanssa kuten glutaraldehydi ja reseptorin tai antigeenin kanssa Schiff'in emaksen reaktiotuotteiden muo-dostamiseksi. Schiff'in emaksen reaktiotuotteet pelkistetaan sen jalkeen vesiliukoisella pelkistajalla kuten natriumboro-hydridi hyodyllisen kiintean kantajan tuottamiseksi.

Ne, jotka tuntevat alaa ymmartavat, ettå on olemassa lukuisia menetelmia kiinteafaasisille immunomaarityksille, joita voidaan kayttaa tassa yhteydessa. Tyypillisiin, hyodyllisiin kiintea-faasisiin maarityksiin kuuluvat moninkertaiset entsyymi-immunomaaritysmenetelmat (EMIT) ja fluoresenssi-immunomaari-tykset (FIA), erityisesti kasiteltyjen RIA- ja ELISA-maaritys-ten lisaksi. Kuitenkin, mika tahansa menetelma, joka johtaa apo-proteiini B-100:n ilmaistavaan reaktioon taman keksinnon mukaisten 9271 4 38 reseptorimolekyylien kanssa, pidetaan osana tata keksintoa. Kussa-kin noista maaritysmenetelmista voidaan kayttaa yksinkertaista tai kaksinkertaista vasta-ainetekniikkaa, joissa kaytetaan osoit-tavaa valiainetta immunoreaktion ilmaisemiseksi, ja siten kaiken taman keksinnon mukaisen reseptorin kanssa maaritettavan apo-proteiini B-lOO:n sitoutumisen ilmaisemiseksi. Tyypillisia menetelmiå voi loytaa selostettuina teoksessa Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, OH (1981); ja Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, NY (1980).

Yksi spesifisen menetelman suoritusmuoto apo B-100:n maaritta-miseksi ruumiinnestenaytteesta kayttaen taman keksinnon mukaista kiinteaan faasiin kiinnitettya reseptoria, on ei-kompetitiivinen ELISA, jolle on tunnusomaista, etta immunoreaktiot suoritetaan perattaisesti. Sellaisessa maarityksessa tasaerainen maara MB47-reseptoreja, esim. yleensa noin 1 - noin 500 yUg, kiinnite-taan mikrotiitterikuopan sisaseinamiin kiintean kantajan muodos-tamiseksi.

Kaiken otetussa kehonaytteessa lasna olevan apo B-100:n annetaan sitten immunoreagoida kiinteaan faasiin kiinnitettyjen resepto-rien kanssa. Tama toteutetaan sekoittamalla tunnettu maara, esim. noin 10 - noin 200 mikrolitraa (yUl) naytetta (joka voidaan esilaimentaa), kuten seerumi tai plasma, mikrotiitterikuopassa kiinteaan faasiin kiinnitettyjen reseptorien kanssa kiintean/neste-faasisen seoksen muodostamiseksi. Seosta pidetaan biologisissa maaritysolosuhteissa ennalta maaratty ajanjakso, joka kaiken naytteessa lasna olevan apo B-l00:n kannalta riittaa sitoutu-maan immunologisesti reseptorimolekyvleihin ja muodostamaan kiinteafaasisen immunoreaktantin. Kiintea ja nestemainen faasi erotetaan sen jalkeen toisistaan, ja kiintea faasi huuhdellaan tyypillisesti ei-spesifisesti sitoutuneiden materiaalien pois-tamisen varmistamisen helpottamiseksi.

Apo B-100:n, joka on lasna kiinteafaasisena immunoreaktanttina ” (so. apo B-100 sidottuna kiinteaan faasiin kiinnitettyihin

II

39 9 2 7 1 4 MB47-reseptoreihin) annetaan sitten immunoreagoida entsyymilei-mattujen toisten reseptorimolekyylien kanssa. Tama toteutetaan sekoittamalla ennalta maåråtty maarå, esim. noin 0,1 - noin 10 Iug entsyymileimattuja toisia reseptorimolekyyleja vedelliseen puskuriliuokseen, edullisesti piparjuuriperoksidaasi (HRPO)-leimattuja MB24-reseptoreja, toisen kiintean/nestemaisen seoksen muodostamiseksi. Toista seosta inkuboidaan kuten edella on ku-vattu, muodostaen nain kiinteafaasisen immunoreaktantti "sandwich"'in, joka sisaltaa MB47-reseptorin, apo B-100:n ja entsyymileimattuja MB24-reseptoreja.

Nestefaasin erottamisen jalkeen kiinteasta faasista edella kuvatulla tavalla, tasamåårå kromogeenista substraattia, kuten o-fenyleenidiamiinia (OPD) HRPO:lle, sekoitetaan mikrotiitteri-kuoppaan, joka sisaltaa kiinteafaasisen immunoreaktantin, kol-mannen kiintean/nestemaisen seoksen muodostamiseksi. Tata seosta pidetaan biologisen måarityksen olosuhteissa ennalta maarat-ty ajanjakso, joka kaiken immunoreaktanttina lasna olevan entsyy-min kannalta riittaa muuttamaan vastaavan maaran substraattia varilliseksi tuotteeksi. Muodostuneen varillisen liuoksen opti-nen tiheys mitataan sen jalkeen, ja sita verrataan tuloksiin, jotka on saatu kayttaen liuoksia, jotka sisaltavat tunnettuja maaria apo B-100-reagenssia.

Ei-kompetitiivisen, jaksottaisen ELISAn kykya, jota edella on kuvattu ja kuvataan yksityiskohtaisemmin Materiaalit ja mene-telmat jaksossa, ilmaista ruumiinnestenaytteen sisaltama apo B-100, tutkittiin. Niissa tutkimuksissa tasamaarat ihmisen lipo-proteiinivapaata plasmaa (LPD), johon sekoitettiin tunnettuja maaria apo B-100-reagenssia, toimi ruumiinnestenaytekontrollina.

Tuon tutkimuksen tulokset, esitettyna taulukossa 1 jaljempana, osoittavat, etta edella kuvatulla menetelmalla voidaan tarkkaan maarittaa ruumiinnestenaytteessa lasna olevan apo B-lOO:n kliinisesti merkityksellisia maaria.

• 9271 4 40

Taulukko 1

Ihmisen plasman sisaltåman apo B-lOO:n ei-kompetitiivisia, jaksottaisia ELlSA-tutkimuksia___

Nayte1 Todelli- Ref.1 MB47/MB242 MB24/B183 nen2 _ _ B alhainen 40 32+44,3 42,6+5,0 31,7 B normaali 80 71+103 82,3+11,8 54,7 B korkea 150 126+180 149+24,7 119 T alhainen 22,3 12,6+17 16,2+0,62 15,4;9,0 T normaali 44,8 25,4+49,2 36,1+9,4 22,9;19,7 T korkea 89,5 64,0+101 77,4_+7,4 34,9:36,3 A 73 82,9+11,7 66,4 AM 76 67,1+8,1 46,8;61,0 B 86,5 69,8+4,6 68,5;90,5 C 145 129+3,8 147,173 D 109 81,0+7,4 76,3:98,2 K 95 98,4+16,5 77,5;88,9 r 60 64,2+7,5 51,3;52,9

Keraily 81,3 78,5+6,8 54,7;65,9

Cl 40,1 47,9+6,7 47,0;68,7 C2 74,8 88,6+13,2 81,3;98,2 C3 70,4 64,5+4,8 64,5;82,9 C4 39,9 56,7+6,6 48,5;58,0 ^ Kliinisesti alhaisen, normaalin ja korkean apoproteiini B-100:n sisaltamia kontrolliliuoksia saatiin Johnson & Johnson Biotechnology Center Inc.'lta, La Jolla, CA (B) ja Tago Inc.'lta, Burlingame, CA (T). Plasmanaytteet saatiin kliinisesti normaa-leista yksiloistå (yhden tai kahden kirjaimen merkinnat ja C1-C4), ja keraily edustaa 10 sellaisen naytteen seosta.

2 ...

Todellinen apoproteiini B-100-konsentraatio maaritettynå naytteeseen lisatyn kokonaisproteiinin avulla. Kaikki taulukossa esitetyt konsentraatiot ovat mg/dl yksikoissa.

li Λ ...

2

Apoproteiini B-lOO:n konsentraatio maaritettyna siten, etta 3 kaytetaan vertailumaaritysta (ref), jota taman jalkeen on ku-Vattu. Arvot annetaan kolmen standardipoikkeaman alueella.

4 9271 4 41

Apoproteiini B-lOO-konsentraatioita (keskiarvo + 3 standardi-poikkeamat), jotka on saatu kayttaen kiinteaan faasiin kiinni-tettyja MB47-reseptoreja ja HRPO-leimattuja MB24-reseptoreja ei kompetitiivisessa jaksollisessa ELISAssa kuten tata ennen on kuvattu.

Apoproteiini B-lOO-konsentraatioita (esitetty toistoarvot silloin kun ne on tehty), jotka on saatu kayttaen kiinteaan faasiin kiinnitettyja MB24-reseptoreja ja HRPO-leimattuja B18-reseptore ja /Curtiss et al. , J. Biol. Chem., 257:15213-15221 (1982J7 ei-kompetitiivisessa ELISAssa, jossa immunoreaktiot suoritettiin perattaisesti kiinteafaasisen immunoreaktantin tultua ensin muodostetuksi.

Toinen spesifisen menetelman suoritusmuoto apo B-lOO:n maaritta-miseksi ruumiinnestenaytteesta on ei-kompetitiivinen ELISA, jolle on tunnusomaista, etta immunoreaktiot suoritetaan oleellisesti samanaikaisesti . Edella kuvattuun mikrotiitterikuoppaan, joka sisaltaa kiinteaan faasiin kiinnitettyja MB47-reseptoreja, sekoi-tetaan oleellisesti samanaikaisesti otettu kehonayte ja entsyymi-leimattuja toisia reseptoreja, jotka immunoreagoivat toisen apo B-lOO-epitoopin kanssa, eivatka oleellisesti inhiboi MB47-resep-torien sitoutumista apo B-lOO:aan. Sellaiset entsyymileimatut toiset reseptorit ovat edullisesti MB24-reseptoreita.

Muodostunutta kiinteata/nestemaista seosta inkuboidaan sen jålkeen, seoksen faasit erotetaan, ja entsyymin maara, joka on lasna osana kiinteaan faasiin sidottua immunoreaktantti-"sandwich"'ia, maaritetaan kuten aikaisemmin on kuvattu.

Edella kuvattua ei-kompetitiivista ELISA:aa kaytettiin plasmo-jen apo B-lOO-pitoisuuksien tutkimiseksi 20 potilaasta, joilla oli sepelvaltimotauti (CAD), 20 potilaasta, joilla oli tavallinen perheittain esiintyva hyperkolesterolemia ja 20 normaalista yksilosta. Kuten on esitetty taulukossa 2 jaljempana, keski-maaraiseksi plasman apo B-100-tasoksi normaaleilla yksiloilla maaritettiin 85 milligrammaa/desilitra (mg/dl) 2 standardipoikkeama- 9271 4 42 alueella + 21 mg/dl. Tama arvo on hyvin sopusoinnussa apo B-IOO-arvojen normaalialueen kanssa, joista raportoivat Curry et al., Clin. Chem. 24^, 280-286 (1987), ja Rosseneu et al., Clin. Chem. 28, 427-433 (1983), joista kumpikin kaytti eri immunomåarityksiå.

Edelleen plasman apo B-100-tasot potilailla, joilla oli CAD ja hyperkolesterolemia olivat korkeampia kuin normaaleilla tavattu 2 standardipoikkeama-alueen ylaraja. Samanlaisia tuloksia, kayttaen muita menetelmia CAD- ja hyperkolesterolemiapotilaille, ovat raportoineet Sniderman et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 77, ja Lipid Research Council, JAMA 251, 351-364 (1984).

Taulukko 2

Ihmisen plasman sisaltaman apo B-lOO:n simultaani-ELISA-kokeita 1 .2 ... 3

Yksilot Lipoprotennitasot_ Apoprotenni B-tasot___

Kokon.3 HDL4 LDL1 2 Kompet® Ei- η RID8 RID9 kol. kol. kol. ELISA kompet #1 #2 _____ __ ___ _____ ELISA _____ ____

Normaali 186 60 111 85 82 102 69 +SD 37 16 30 21 22 20 19 CAD 205 37 133 109 104 138 84 +SD 35 7 37 24 23 20 24 FH 331 37 270 196 204 211 136 +SD 90 11 96 40 49 64 44

Yksiloihin lukeutuu 20 normaalilipidiverista, tervetta kontrollia (normaali); 20 yksiloa, joilla on sepelvaltimotauti måariteltynå sydamen katetroinnilla (CAD); ja 20 yksiloa, joilla on tavalli-nen hyperkolesterolemia (FH).

2 . . .

Annetut arvot ovat keskiarvoja +2 standardipoikkeamaa keskiar- vosta; (+SD) yksikoissa mg/dl.

3

Kokonaiskolesteroli.

4 . ....

Kolesteroli, joka on lasna HDL:na.

I! 2

Kolesteroli, joka on lasna LDL:na.

„ 92714 4 3 ^ Apo B-100-taso maaritettyna kompetitiivisella ELISA-(kompet.) menetelmålla, jota on kuvattu Materiaalit ja menetelmat jaksossa.

7

Apo B-100-taso, maaritettyna ei-kompetitiivisella (Ei-kompet.) ELISA:lla, kayttaen kiinteaan faasiin kiinnitettyja MB47-reseoto-reja ja HRPO-leimattuja MB24-reseptoreja, jossa yhteydesså nayte ja reseptorit sekoitettiin oleellisesti samanaikaisesti.

8

Apo B-taso, maaritettyna kayttaen såteittåista immunodiffuusio-kittimallia Diffu-gen RID, saatavissa Tago Inc.'lta, Burlingame, CA .

9 .........

Apo B-taso, maaritettyna kayttaen sateittaista immunodiffuusio- kittimallia M-Partigen RIA, saatavissa Calbiochem-Behring'1 ta,

La Jolla, CA.

Ruumiinnestenaytteen laimentamisen vaikutusta, ennen apo B-l00:n måarittamista siita ei-kompetitiivisella simultaanilla ELISA-menetelmalla, tutkittiin myos. Nuo tulokset, esitettyna taulu-kossa 3 jaljempana, osoittavat, ettei apo B-100-tasoissa ollut merkitsevaa eroa maaritettyna 5-kertaisella alueella plasma-laimennuksia, so. 1:1000-1:5000.

Taulukko 3

Apo B-tasojen simultaani-ELISA-tutkimuksia maaritettyna plasman eri laimennuksista_

Plasmalaimennus Plasma 1^ Plasma 2^ Plasma 3^ 1:1000 54,4 136,6 199,0 1:2500 57,5 142,5 194,2 1:5000 53,0 126,0 178,0

Keskiarvo2 55,0 135,0 190,0 S.D.3 1,88 6,83 8,98 % C.V.4 3,4 5,0 4,7 3 Plasman apo B-100-konsentraatio yksikoissa mg/dl.

2

Keskimaarainen plasman apo B-lOO-konsentraatio kaikille 3 laimennukselle.

44 9 2 7 1 4 3

Yksi standardipoikkeama.

4 Varianssikerroin prosentti tulosten valilla saatuna erilai-sille laimennuksille.

Kuviossa 7 on esitetty korrelaatio LDL-kolesterolin ja plasman apo B-100-tasojen valilla, måaritettynå ei-kompetitiivisella ELISA:lla normaaleille ja potilasnåytteille, joita edellå on kuvattu. Korrelaatiokerroin 0,89 on samanlainen kuin se, mita raportoivat Albers et al., Metabolism 24, 1339-1351 (1975) ja Slater et al., Clin. Chem. 31, 841-845 (1985).

Taman keksinnon mukaisten maaritysmenetelmien suoritusmuotoja kayttaen kiinteaa kantajaa, joka sisaltaa apo B-100-reagenssia kiinnitettyna kiinteaan kantajaan, suoritetaan kayttaen seuraa-via vaiheita: (a) Ruumiinnestenayte, joka sisaltaa apo B-lOO:aa, otetaan kuten on kuvattu tata ennen.

(b) Sekoitetaan oleellisesti samanaikaisesti (1) nestenayte; (2) ennalta maaratty maara joko MB24- tai MB47-reseptorimole-kyyleja; ja (3) ennalta maaratty maara kiinteaan faasiin kiinnitettya · apo B-100-reagenssia, neste/kiinteafaasisen immunoreaktioseok- sen muodostamiseksi.

Seosta pidetaan biologisissa maaritysolosuhteissa ajanjakso, joka reseotorimolekyylien vasta-ainesidontapaikkojen kannalta on riittava immunoreagoimaan (immunologisesti sitoutumaan) joko apo B-100-reagenssiin tai kaikkeen siihen apo B-lOO:aan, jota on lasna ruumiinnestenaytteessa. Reseptorimolekyylit, jotka sitovat immunologisesti apo B-lOO:aa, jota on lasna ruumiinnestenay tteessa , muodostavat nestefaasisen immunoreaktantin, ja ne, jotka sitovat kiinteaan faasiin kiinnitettya apo B-100-reagenssia, muodostavat kiinteafaasisen immunoreaktantin.

II:.

* „ 92714 4 5 (c) Kiinteaan faasiin kiinnitetyn immunoreaktantin lasnaolo maaritetaan sen jalkeen, ja naytteessa lasna olevan apo B-lOO:n maara maaritetaan siten vertaamalla sitoutumisen måaråå, jota esiintyy, kun tunnettu maara MB47:aa tai MB24:åå sekoitetaan samanlaiseen kiinteaan faasiin kiinnitettyyn apo B-lOO:aan, kuten taman jalkeen on kasitelty. Immunoreaktanttimaaritys suoritetaan edullisesti sen jalkeen kun nestefaasinen ja kiinteå-faasinen immunoreaktantti vaiheesta (b) on erotettu toisistaan, esim. pesemalla. Naytteen sisaltaman apo B-lOO:n maara, joka on sidottuna nestefaasisena immunoreaktanttina, voidaan maarittaa kuten kayttamalla leimattuja vasta-aineita, jotka immunoreagoi-vat taman keksinnon mukaisten reseptorimolekyylien kanssa, kuten peroksidaasiin liitetty vuohen anti-hiiri Ig, tai kuten muutoin tassa on kuvattu.

Kompetitiivisen maarityksen erityisen edullisessa suoritusmuo-dossa, noin 1 ^ug - noin lo ^ug apo B-100-reagenssia kiinnite-taan kiinteaan matriisiin, edullisesti mikrotiitterikuopan seinamiin, kiintean kantajan muodostamiseksi. Kaikki ei-spesifiset sitoutumispaikat kiintealla kantajalla estetaan tyypillisesti proteiinin avulla, kuten BSA tai vastaavat.

Ennalta maaratyn maaran taman keksinnon mukaisia reseptori-molekyyleja, esim. yleensa noin 0,1 ^,ug - noin 10 ^ug, annetaan oleellisesti samanaikaisesti immunoreagoida kiinteaan faasiin kiinnitetyn apo B-100-reagenssin ja kaiken ruumiinnestenayt-teessa lasna olevan apo B-lOO:n kanssa (joka nayte voidaan laimentaa), kuten seerumi tai plasma. Tama toteutetaan sekoit-tamalla oleellisesti samanaikaisesti tasamaara naytetta ja reseptorimolekyyleja mikrotiitterikuopassa, joka sisaltaa kiinteaan faasiin kiinnitettya apo B-100-reagenssia.

Siten muodostunutta kiinteaa/nestemåista seosta pidetaan biolo-gisissa maaritysolosuhteissa ajanjakso, joka lasna olevien reseptorimolekyylien kannalta on riittava sitomaan immunologisesti lasna olevaa apo B-l00:aa. Kiintea ja nestemainen faasi ; erotetaan sen jalkeen edullisesti toisistaan esim. pesemalla, 46 9 2 7 1 4 τ— ja kiinteaa faasia huuhdellaan tyypillisesti ei-spesifisesti si-toutuneiden materiaalien poistamisen varmistamisen helDOtta-miseksi.

Kiinteaan faasiin kiinnitettyjen immunoreaktanttien lasnaolo måaritetaan sen jalkeen tyypillisesti kåyttåmållå leimattuja vasta-aineita, jotka sitovat immunologisesti taman keksinnon mukaisia reseptorimolekyyleja, kuten peroksidaasileimattua vuohen anti-hiiri IgG.

Komoetitiivisessa ELISA:ssa, potilasnaytteessa lasna oleva apo B-100 kilpailee vakioisen tunnetun maaran kanssa apo B-100-reagenssia vakioisesta tunnetusta maarasta reseptorimolekyylin vasta-ainekiinnityspaikkoja immunoreaktioseoksessa. Kilpailu, jonka nåytteen sisåltåmå apo B-100 tuo tullessaan, johtaa ilmais-tavan kiinteaan faasiin sidotun immunoreaktantin vahenemiseen; mita suurempi våhenemå, sitå suurempi tutkimuksessa olevassa kehonaytteessa lasna olevan apo B-lOO:n maara.

Jotta saataisiin potilasplasmoissa lasna olevan apo B-100:n suhteellisia tnaaria, verrattiin tuloksia, jotka saatiin kayt-taen kilpailevia standardeja, jotka sisalsivat tunnettuja maaria apo B-100-reagenssia. Standardikayra valmistettiin, kayttaen LDL-konsentraatioita, jotka vaihtelivat alueella .. 32 mg/ml-0,25 mg/ml (320 mg/dl - 2,5 mg/dl).

Edella kuvattua kompetitiivista E LIS A : a a kaytettiin tutkit-taessa samoja normaaleja ja potilasnaytteita, joita arvostel-tiin ei-kompetitiivisella ELISA:lla. Nuo tulokset, jotka myos on esitetty taulukossa 2 tata ennen, ovat hyvin sopusoinnussa tulosten kanssa, jotka saatiin ei-kompetitiivisessa maarityk-sessa.

Ruumiinnestenaytteen laimentamisen vaikutusta ennen apo B:n maarittamista siita edella kuvatussa kompetitiivisessa ELISA:ssa tutkittiin. Ne tulokset, esitettyna taulukossa 4 jaljempana, osoittavat, ettei merkittavia eroja ollut apo B- 47 9271 4 tasoissa maaritettyna 4-kertaisella plasmalaimennusalueella; so. 1:100-1:400.

Taulukko 4

Apo B-tasojen tutkimuksia kompetitiivisella ELISA:lla maaritettyna eri plasmalaimennuksista_

Piasmalaimennus Plasma 1^ Plasma 2 Plasma 3 1:100 32,8 63,3 175,8 1:200 30,0 58,5 183,2 1:300 31,8 64,8 190,9 1:400 33,8 62,6 190,0

Keskiarvo2 32,1 62,3 185,0 S.D.3 1,6 2,7 7,0 % C.V.4 5,0 4,3 3,8 ^ Plasman apo B-100-konsentraatio yksikoissa mg/dl.

2

Keskimaarainen plasman apo B-100-konsentraatio kaikille 3 laimennukselle.

3

Yksi standardipoikkeama.

4

Varianssikerrom prosentti tulosten valilla, jotka saatun eri laimennuksille.

LDL-kolesterolin ja plasman apo B-tasojen valinen korrelaatio maaritettyna kompetitiivisella ELISA:lla normaaleilla ja poti-lasnaytteilla, joita edella on kuvattu, on esitetty kuviossa 8. Korrelaatiokerroin 0,92 on samanlainen kuin Albersin et al. ilmoittama, Metabolism 2j4, 1339-1351 (1975 ), ja Slaterin et al. ilmoittama, Clin. Chem., 31_, 841-845 (1985), osoittaen taten, etta kompetitiivinen ELISA ennustaa tarkkaan kiertavan LDL-kolesterolin tasot.

Apo B-100-tasojen korreloimista, saatuna kayttaen kompetitii-vista ja ei-kompetitiivista ELISA:aa, tutkittiin. Kuten kuviossa 9 on esitetty, kussakin maarityksessa saatujen tulosten 9271 4 48 valillå oli suuri korrelaatio (r = 0,92).

Diagnostinen systeemi, edullisesti kitin muodossa, joka on hyo-dyllinen suoritettaessa edellisia maåritysmenetelmiå, sisaltaa, erillisissa pakkauksissa, (a) ensimmåisen spesifisen sitoutuvan aineen, jossa mainittu aine on (i) reseptori, joka immunoreagoi apo B-100:n kanssa, ja on valikoitu reseptoreista, joita erit-taa hybridooma HB 8746 (MB47) tai hybridooman HB 8742 eritta-mista reseptoreista (MB24) ja (b) leimatun toisen spesifisen sitoutuvan aineen mainitun ensimmåisen sitoutuvan aineen immuno-reaktion apo B-100:n kanssa ilmaisemiseksi. Leimattu spesifi-nen sitoutuva aine on edullisesti reseptori, joka on kytketty entsyymiin. Edullisemmin leimattu aine on jaanne kummastakin edellå olevan kohdan (a) reseptorista, kytkettyna entsyymiin.

Systeemi sisaltaa edelleen edullisissa suoritusmuodoissa toisen reagenssi apo B-lOO-sailion kaytettavaksi kontrollina ja/tai kohdeantigeenina. Edullisia ovat myos suoritusmuodot, joille on tunnusomaista, ettå systeemi sisaltaa kiintean matriisin, johon ensimmainen spesifinen sitoutuva aine tai apo B-100-reagenssi on kiinnitetty kiintean kantajan muodostamiseksi. Hyodyllisia kiinteita matriiseja on jo kuvattu. Edullisesti kuitenkin kiintea matriisi on mikrotiitterilevyn kuoppa.

Tunnettuja maaria spesifisia sitoutuvia aineita toimitetaan.

Ne maarat riittavat vahintaan yhden maarityksen suorittamiseen. Kayttoon tulevat spesifiset sitoutuvat aineet toimitetaan tyypil1 ises ti muodossa ja maarana, joka on suunniteltu laimen-nettavaksi maarattyyn volyymiin vetta, saliinia tai puskuria, kuten fosfaattipuskuroitu saliini pHrssa 7,3-7,5.

Myos muita pakkauksia voi olla mukana systeemissa. Sellaiset pakkaukset voivat sisaltaa (i) puskurisuoloja kuivassa tai nes-temaisessa muodossa, (ii) entsyymisubstraatteja kuten o-fenylee-nidiamiini, ja sen kaltaiset.

li „ 92714

Tyypillisiin pakkauksiin kuuluu lasisia ja muovisia kuten poly-etyleeni ja polypropyleeni pulloja tai astioita; muovisia, muovimetallisia laminaatteja, muovimetallisia laminaatti-paperisia kuoria ja vastaavia. Spesifiset sitoutuvat aineet voidaan pakata vedellisesså nestemuodossa kuten vatsaontelo-nesteessa tai puskurissa, mutta ne toimitetaan edullisesti kui-vatussa muodossa kuten sellaisessa, joka toimitetaan lyofili-soi tuna.

D . Affiniteettisorbentit

Esilla olevassa keksinnosså tarkastellaan myos affiniteetti-sorbenttia, edullisesti steriiliå, joka kåsittaå taman keksin-non mukaisen biologisesti aktiivisen reseptorin kiinnitettyna kiinteaan matriisiin kiintean kantajan muodostamiseksi.Kiintea matriisi on edullisesti partikkelimuodossa. Sellaiset affini-teettisorbentit ovat hyodyllisiå apoproteiini B-100:aa sisålta-van lipoproteiinin (VLDL ja LDL) spesifiseksi poistamiseksi immunoadsorptiolla potilaiden plasmasta, jotka kårsivåt hyper-kolesterolemiasta.

Kiintea kantaja voi koostua laajasta joukosta materiaaleja, kuten esimerkiksi ristisidottu dekstraani, esim. Sephadex G-25, -50, -lOO, -200 ja vastaavat, joita on saatavissa Pharmacia Fine Chemicals’ilta, Piscataway, N.J., agaroosi ja ristisidottu .y agaroosi, esim. Sepharose 6B, CL6B, 4B, CL4B ja vastaavat, myos saatavissa Pharmacia Fine Chemicals'il ta, tai Bio-Gel A-0,5M, A-1,5M, A-50M ja vastaavat, saatavissa Bio-Rad Labora-tories'ilta Richmon, CA, tai polyakryyliamidipalloset, esim.' Bio-Gel P-2, P-30, P-100, P-300 ja vastaavat, myos saatavissa Bio-Rad Laboratories’ilta. Agaroosi ja ristisidotut agaroosi-materiaalit ovat edullisia tassa yhteydessa niiden suuren huokoisuuden ja alhaisten ei-spesifisten sitomisominaisuuksien johdosta, ja niita tullaan kayttamaan valaisevasti kiinteana matriisina.

Reseptorien ja kiintean matriisin sterilointi suoritetaan ·· tavallisesti ennen liittamista. Biologisen aktiivisuuden so 92714 sailyttamiseksi, reseptorit steriloidaan tavallisesti suodatta-malla, esimerkiksi vetåmalla låpi 0,22 mikronin nitroselluloosa-suotimen. Matriisin sterilointi riippuu, kuten hyvin tiede-taan, matriisityypista. Esimerkiksi Sepharosea ei voi steriloi-da autoklavoimalla, mutta se voidaan steriloida kemiallisesti, esimerkiksi kåsittelemållå dietyylipyrokarbonaatin kanssa. Toisaalta, ristisidottu Sepharose voidaan steriloida autoklavoimalla pH-arvossa 7, 120°C 20 minuutin ajan.

Sephadex tai Sepharose aktivoidaan tyypillisesti li.ittamista vårten kayttaen syanogeenibromidia menetelmilla, jotka alalia tunnetaan hyvin. Aktivoitu matriisi pestaan sen jalkeen ja liitetaan reseptoreihin, jotka immunoreagoivat apo B-l00:n kanssa, ja joita erittaa hybridooma HB 8746 tai hybridooma HB 8742. Matriisiin liitetty reseptori pestaan sen jalkeen, ja se on valmis kayttoon. Kantajalla olevien reagoimattomien reak-tiivisten ryhmien voidaan antaa reagoida amiinin kanssa, kuten etanoliamiini tai Tris, niin haluttaessa.

Affiniteettisorbenttia voidaan kayttaa irtonaisessa tilassa, mutta se rajataan edullisesti kolonniin. Potilaan plasma, joka sisaltaa apo B-100:aa, sekoitetaan sen jalkeen affiniteet-tisorbentin kanssa immunoreaktioseoksen muodostamiseksi. Seosta pidetaan biologisissa maaritysolosuhteissa ajanjakso, joka kiinteaan matriisiin kiinnitettyjen reseptorien kannalta on riittava sitomaan immunologisesti plasmassa lasna olevaa apo B-100:aa, ja muodostamaan kiintea matriisiin kiinnitetty immuno-reaktantti. Plasma erotetaan sen jalkeen kiinteaan matriisiin kiinnitetysta immunoreaktantista. Apo B-100- (LDL ja VLDL)-vapaa plasma, joka nain syntyi, voidaan sen jalkeen siirtaa potilaa-seen, josta se alunperin saatiin.

Affiniteettisorbentin valmistamista ja sen kayttoa apolipo-proteiini B:ta sisaltavien lipoproteiinien poistamiseen plas-masta kuvaavat Stoffel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 611-615 (1981), joka tassa sisallytetaan viitteena. Affiniteetti-.1 adsorbenttikolonnin, joka valmistettiin liittamalla oleellises- ti puhtaita MB47-reseptoreja CNB4-aktivoituun Sepharose 4B:hen, ii 9271 4 51 todettiin immunoadsorboivan (sitovan) 3 mg LDL:åå per ml kiin-teaa kantajaa.

II. Materiaalit ja menetelmat A. Ihmisen lipoprotelinien valmistaminen

Ihmisen lipoproteiinifraktioita eristettiin sentrifugoimalla seuraavissa tiheyksisså: VLDL, tiheys (d) alle 1,006 g/ml; LDL, d yhta kuin 1,025-1,050 g/ml; HDL, d yhta kuin 1,070-1,21 g/ml, ja LDS, d yhta kuin 1,21 g/ml. Joissakin tapauksissa ihmisen LDL eristettiin myos d:n ollessa 1,019-1,063 g/ml tai 1,045-1,065 g/ml. Plasman ja kunkin fraktion proteiinipitoisuus maaritettiin Lowryn menetelmålla _/Lowry et al., J. Biol. Chem.

19 3, 265-275, (1951J_7 siten kuin modifioivat Markwell et al., Anal. Biochem. 8_7, 206-210 (1978), kayttaen BSA-standardia.

Kutakin LDL- ja VLDL-fraktiota vårten estimoitiin myos apo B-konsentraatio sen jalkeen kun apo B oli saostettu tetrametyyli-urealla (TMU) kayttaen Kane'n et al. tekniikkaa, J. Clin. Invest., 5_6, 1622-1634, (1975 ) tai isopropyylialkoholilla

Equsan et al. oppien mukaan, J. Lipid Res., 2_4, 1261-1267 (1983) .

Tuoretta, paastonneen ihmisen plasmaa saatiin normaaleista terveista antajista plasmaforeesin avulla, ja se saådettiin 0,1 prosenttiseksi EDTA:n suhteen (s/v). Kolmesta tai useam-masta antajasta kokoon saatua kokoomanaytetta kåytettiin, ellei toisin mainita. Lipoproteiinit eristettiin plasman jaksottaisella ultrasentrifugoinnilla kayttaen kiinteaa KBr:aa tiheyden (d) saatoon. Lipoproteiinifraktioihin kuuluivat VLDL, d alle 1,006 g/ml; IDL, d = 1,006-1,019 g/ml; LDL, d = 1,019-1,063; ja HDL, d = 1,063-1,25 g/ml.

Pohjafraktio, joka sisalsi lipoproteiinivapaata seerumia (d suurempi kuin 1,25 g/ml), otettiin myos talteen.

Fraktioita dialysoitiin perusteellisesti lipoproteiinipuskuria vastaan, joka sisalsi 0,15 M NaCl:a, 0,3 mM EDTArta, 0,0005 52 9 2 7 1 4 prosenttia alfa-tokoferolia pH-arvossa 7,4.

Kylomikronifraktio erotettiin VLDL-fraktiosta ei-paastotusta yhteenkeråtystå plasmasta laskettamalla kylomikronit lipoproteii-nipuskurin lapi ultrasentrifugaatiolla 120 000 x g 40 minuuttia 4°C:ssa.

Kaikki lipoproteiinit suodinsteriloitiin, ja såilytettiin 4° korkeintaan 20 påivåå. Lipoproteiinien proteiinipitoisuus analysoitiin Lowryn menetelmån modifikaation mukaan, J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951), kåyttåen BSA-standardia. Kaikki lipo-proteiinikonsentraatiot ilmaistaan perustuen proteiiniin.

Kunkin lipoproteiiniluokan apoproteiinikoostumus mååritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Kylomikronit sisålsivåt havaittavia maaria apoproteiineja B, E ja C, kun taas VLDL sisålsi apoproteiineja B, E, C ja våhåisiå mååriå apoproteiini A-I:tå.

IDL sisålsi apoproteiineja B, E ja C, kun taas LDL sisålsi vain apoproteiinia B. HDL sisålsi apoproteiineja AI, All ja C.

Nåiden tutkimusten aikana lipoproteiinivalmisteilla nåytti olevan tasalaatuinen apoproteiinikoostumus. Apoproteiinien mahdollisen proteolyysin kontrolloimiseksi, valikoituja plasma-kokoomanåytteitå eristettiin ja sailytettiin 1 mg/ml genta-mysiinisulfaatin, 0,2 prosenttisen natriumatsidin, ja 1 mM bentsamidiinin, 10 mM di-isopropyylifluorifosfaatin, 10 ^ug/ml soijapavun trypsiini-inhibiittorin låsnåollessa.

Nåiden lipoproteiinien SDS-PAGE apoproteiini-vårjåysmallien vertailu, kuin myos niiden, jotka eristettiin ilman antibioot-teja ja proteiini-inhibiittoreita ultrasentrifugoinnin jålkeen ja såilytyksen jålkeen 3 viikkoon saakka, ei osoittanut mitåån merkkejå proteolyysista. Kaikki valmisteet, joita kåytettiin, olivat steriileja.

• · ·

II

92714 53 B. Hybridoomatuotanto ja -viljely Kåsittelemåttomiå natiiveja lipoproteiineja, jotka oli eris-tetty kokoomaplasmasta, kaytettiin immunisointiin. Neljåstå viiteen viikkoa vanhoja Balb/c-hiiriå immunisoitiin vatsaontelon-sisåisesti 50 mikrogrammalla lipoproteiinia taydellisessa Freundin apuaineessa. Sekundååriset laskimonsisåiset ruiskeet, jotka sisalsivat 50 ^,ug lipoproteiinia lipoproteiinipuskurissa, annettiin paivien 28 ja 33 vålisså. Pernat poistettiin immunisoi-duista hiirista 72 tuntia viimeisen ruiskeen jalkeen, ja yksi-solususpensioita preparoitiin HT-alustaan. Veri otettiin myos talteen, ja seerumia kaytettiin positiivisena kontrollina kuhun-kin immunomååritykseen.

Hiiren myeloomasolulinjoja pidettiin log-vaiheen kasvussa stationååriviljelmisså taydellisessa HT-alustassa /Kennet et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 77-91 (1978), joka tassa sisallytetaan viitteena/, joka sisalsi 0,1 mM atsaguaniinia. Yhteensulauttamiset suoritettiin 30 prosenttisen (v/v) polyety-leeniglykolin lOOO lasna ollessa (Sigma, St. Louis, MO) suhtees-sa immuunit pernasolut - P3x63Ag8 10:1. Kolme paivaa fuusion jalkeen, solut siirrostettiin 96-kuoppaisille kudosviljely- 5 pitoisuudessa 1x10 elavaa solua/kuoppa HT-alustassa, joka sisalsi 0,1 mM aminopteriinia.

• Soluille annettiin 7 paivaa fuusion jalkeen HT-alustaa, ja suunnilleen 4-5 paivan valein sen jalkeen tarvittaessa.

Kasvua seurattiin mikroskooppisesti, ja viljelmien supernatan-tit otettiin talteen paivan 14 kohdalla antigeeni-spesifisen ' vasta-aineen tuotannon maaritysta vårten kiinteafaasisella RIA:lla. Spesifiset vasta-ainetta tuottavat hybridoomat kloo-nattiin 19-47 paivaa fuusion jalkeen rajoittavalla laimentami-sella Balb/c pernan syottosolujen lasna ollessa, ja kuopissa ole-vat hybridoomat, jotka sisalsivat yksinkertaisia pesakkeita, seulottiin vasta-aineen tuotannon osalta kiinteafaasisella RIArlla 10 paivan kuluttua. Kloonattuja hybridoomia viljeltiin alustassa, joka sisålsi 10 prosenttia vasikan seerumia, ja niitå såilytettiin jåådytettyinå nestetypesså.

54 9271 4 C. LDL:n sitoutumisen, sisaankuljetuksen ja hajotuksen inhibointi 125

Anti-apo B-lOO-reseptorien kyky mhiboxda J-LDL:n sitoutumis- ta, sisaankuljetusta ja hajotusta ihmisen fibroblasteilla måå- 125 ritettiin seuraavalla tavalla. LDL jodattun J:n kanssa (spesifinen aktiivisuus 200 cpm/ng) kåyttåen jodimonokloridi-tekniikkaa Bilheimerin et al. mukaan, J. Clin. Invest., 56, 1420-1430 (1975).

Vasta-aine-LDL-vuorovaikutuksen aikaansaamiseksi, 0,1 ml kuta- kin hybridooma-supernatanttia inkuboitiin (sekoitettiin ja 125 såilytettiin) J-LDL:n kanssa (loppukonsentraatio 2,5 mg/ml) 0,4 ml:ssa Dulbecco'n minimaalialustaa (DME), joka sisalsi 2,5 mg/ml lipoproteiinivapaata seerumia (LDS) 12 tunnin ajan 4°C:ssa. Sen jalkeen yksittaisesti inkuboidut seokset siirret-tiin ihmisen esinahan fibroblastien monokerrosviljelmiin, jotka olivat kasvaneet DME:ssa mukana 10 prosenttia vasikan sikion seerumia (FCS) 10 mm halkaisijan kuopissa. Nåiden solujen LDL-reseptorit olivat maksimaalisesti ilmentyneet noiden solujen esi-inkuboinnissa 24 tunnin ajanjakson aikana DME:sså, joka sisalsi 2,5 mg/ml LDS:aa.

Supernatantin ja fibroblastisolujen yksittåisten inkubointien jalkeen 6 tunnin ajan 37°C:ssa, ^^J-LDL hajoaminen soluissa maaritettiin Drevon1 in et al. menetelman mukaisesti, J. Lipid res., 22_, 37-46 ( 1981 ). Kontrollivil jelmilla oli 0,4 ml 12 5 DME:ta, joka sisalsi J-LDL:aa ja yhta seuraavista: a) 0,1 ml tuoretta hybridooma-alustaa, joka sisalsi 20 prosenttia vasikan sikion seerumia; tai b) 0,1 ml hybridooma-alustaa hybridoo-mapesakkeiden kuopista, jotka olivat negatiivisia apo B-spesi-fisen vasta-aineen tuotannon suhteen; c) 0,1 ml DMErta, joka sisalsi 2,5 mg/ml LDS:aa; tai d) 0,1 ml leimaamatonta LDL:aa (saattaen lopullinen leimaamattoman LDL:n konsentraatio alustas-sa tasolle 500 ^ug/ml).

Il 9271 4 55 D. Anti-LDL immunoglobuliinin eristaminen

Vatsaontelonesteet, jotka sisålsivåt taman keksinnon mukaisia reseptoreita, saatiin 10 viikkoisista Balb/c-hiirista, joita oli esikasitelty 0,3 ml:lla mineraalioljyå, ja joihin oli ruiskutettu vatsaontelonsisåisesti 3-50 x 10^ hybridoomasolua. Keskimåaråinen aika askiteksen kehittymiseen oli 12 påivåå. Kirkastamisen jalkeen sentrifugoinnin avulla 15 OOOxg 1 tunnin ajan 4°C:ssa, vatsaontelonesteet keråttiin yhteen, ja niita sailytettiin jåådytettyinå -20°C:ssa.

Eristettya vasta-ainetta MB47 valmistettiin kromatografoimalla monoklonaalisen hybridooman vatsaontelonesteita proteiini A-Sepharose 4B-kolonnissa (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey). Vasta-aine eluoitiin kolonnista 0,1 molaarisella (M) etikkahapolla.

Eristettyjå reseptoreja valmistettiin myos proteiinien nopealla nestekromatografialla (FPLC) kasitellen monoklonaalisen hybridooman vatsaontelonestetta Pharmacian Mono Q HR 5/5 anionin-vaihtokolonnissa Pharmacian FPLC-System’issa kayttaen 0-0,5 M NaCl-gradienttia 10 mM Trisrssa, pH 8,0, ja noudattamalla kolonnin mukana toimitettuja ohjeita.

E. Hybridoman vasta-aineiden karakterisointi .. Jokaisen vatsaontelonesteen kokoomanaytteen kokonais-gammaglobu- liini (Ig)-pitoisuus saatiin elektroforesoimalla 1-3 ml nayttei-ta selluloosa-asetaattiliuskoilla 75 mM veronaalipuskurissa, pH-arvossa 8,6 45 minuuttia kentassa 200 millivolttia (mV).

Kokonaisproteiinin prosenttimaara, joka oli Ig:ta, kvantitoi-tiin Ponceau S-varjattyjen geelien densitometrisella skannauk-sella, ja kokonaisproteiini maaritettiin muunnetulla Lowryn menetelmalla kuten aikaisemmin on kasitelty.

Hiiren Ig:n raskaat ja kevyet ketjut identifioitiin kaksois-diffuusiolla 0,9 prosenttisessa agaroosissa. Kymmenen mikro-litran sopivaa vatsaontelonestelaimennusta annettiin reagoida .I. yhta suuren tilavuuden kanssa sopivasti laimennettua kanin 56 9271 4 anti-hiiri raskas- ja kevytketjuspesifistå antiseerumia (Litton Bionetics). Noin 15 tuntia 20°C:ssa kestaneen diffuusion ja pesun jalkeen, presipitiiniviivat identifioitiin varjaamalla 0,5 pro-senttisen Coomassie briljanttisinisellå R-250.

Kunkin monoklonaalisen vasta-aineen isoelektriset profiilit saatiin fokusoimalla isoelektrisesti 0,01 ml:n naytteitå vatsa-ontelonestettå 0,8 prosenttisessa agaroosissa (EF 802-300 LKB), joka sisalsi 10 prosenttia sorbitolia, 2 prosenttia amfoliinia pH-arvoalueella 5-8 (LKB) 150 minuutin ajan 3 watin vakiovirras-sa. Fiksoinnin ja kuivauksen jalkeen geelit vårjattiin Coomassien briljanttisinisella ja valokuvattiin.

1. Western blottaus

Apoproteiinit erotettiin lipoproteiinien natriumdodekyyli-sulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (SDS-PAGE) pystysuorassa slab(liuska)geelilaitteella (14x12x0,15 cm) (Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Geeleja preparoitiin kayttamalla 25 mM Tris-glysiini-puskuria pH-arvossa 8,6. Ylempi paallysgeeli sisalsi 1 prosenttia SDS:aa, 3 prosenttia akryyliamidia, ja alempi ajogeelin gradientti poly-akryyliamidia, joka sisalsi 1 prosenttia SDS:aa, oli joko 3-20 prosenttia tai 3-6 prosenttia. Lipoproteiinien lipidi poistettiin keittamållå 3 minuuttia elektroforeesinaytepusku-rissa, joka sisalsi 1 prosenttia natriumdodekyylisulfaattia, 10 mM Tris:a ja 0,24 mM EDTA:ta. Molekyylipainomarkkerit ja niiden vastaavat nåennåiset suhteelliset molekyylimassat olivat: fibrinogeeni, 340 000; IgG, 140 000; albumiini, 69 000; ovalbumiini, 43 000; soijapavun trypsiini-inhibiittori, 20 500; ja lysotsyymi, 14 300. Geeleja elektroforesoitiin suunnilleen 18 tuntia 13,5 milliampeerin (mA) vakiovirrassa.

Geeleja pestiin tislatussa vedessa 10 minuuttia ja sen jalkeen 10 minuuttia 25 mM Tris-puskurissa, 192 mM glysiinissa, pH 8,3, joka sisalsi 20 prosenttia (v/v) metanolia. Siirto nitroselluloosalle (0,45 mikronia, Millipore Corp.) toteutettiin ·· elektroforesoimalla 1 tunti 400 mA. Jaljelle jaaneet aktiiviset u 57 9271 4 sidontapaikat nitroselluloosalla kyllåstettiin uittamalla yli yon PBSrssa, joka sisalsi 3 prosenttia BSA:ta, 3 prosenttia normaalia vuohen seerumia, 0,01 prosenttia natriumatsidia (esto-liuos).

Fiksattuja geelejå tai nitroselluloosasiirtogeeleja inkuboitiin 18 tuntia 4°C:ssa joko immuunin hiiren seerumin kanssa tai vatsaontelonesteen kanssa, joka oli sopivasti laimennettu PBSråån, joka sisalsi 3 prosenttia BSArta, 3 prosenttia vuohen normaalia seerumia, 0,05 prosenttia Tween-20:tå (polyoksi-etyleeni(20 monolauraatti). Toistuvien pesujen jalkeen, vasta-aineen sitoutuminen havaittiin toisessa 4 tunnin inkubaatiossa 4°C:ssa 3J-vuohi anti-immuuni Ig:n kanssa (0,5 mikroCi/ml) samassa puskurissa, jota taas seurasi perusteellinen peseminen.

Epaspesifinen sitoutuminen nitroselluloosaan aleni merkittavas-ti pesemalla inkuboinnin jalkeen seka ensimmaisella etta toisella vasta-aineella PBSrssa, joka sisalsi 3 prosenttia BSArta, 0,05 prosenttia Tween-20:ta ja sen jlkeeen 0,5 M LiClrssa, joka sisalsi 0,1 prosenttia SDSraa.

Geelit tai nitroselluloosasiirtokalvot kuivattiin ja analysoi-tiin autoradiografian avulla (X-Omat; Eastman Kodak) -20°C:ssa. Tarvittaessa geelit vårjåttiin joko 0,1 prosenttisella Coomassien briljanttisinisella R-250 50 prosenttisessa trikloo-rietikkahapossa tai hopeavarilla (Bio-Rad), kuten ovat kuvan-neet Merril et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7_6, 4335-4339 (1979).

F. Fab-kappaleiden valmistaminen

Eristettyjen reseptorimolekyylien vasta-aineen Fab-kappaleita muodostettiin liuottamalla papaiinin kanssa. Vasta-aineen Fc-osat ja liukenemattomat vasta-aineet poistettiin ajamalla proteiini A-Sepharose-4B-kolonnilla. Fab-kappaleiden SDS-PAGE toi nakyviin kaksi erillista juovaa, 25 000 ja 40 000 daltonia. Fab-kappaleiden immunoreaktiivisuus vahvistettiin spesifisella .. sitoutumisella LDLraan kiinteafaasisessa RIArssa (Milne et al.,

Arteriosclerosis 3^, 23-30 (1983)).

58 9271 4 G. Radioimmunomåaritykset (RIA) 125

1. Nestefaasinen J-leimattu antigeeni RIA

125

Sen J-LDL partikkelien fraktion, jota MB47 ja MB24 sitovat, maarittamiseksi kaytettiin nestefaasista RIAraa /Curtiss ja

Edgington, J. Biol. Chem., 25, 15213-15221 ( 1982_)_/. Kahta erilaista LDL (d = 1,019-1,063 g/ml) valmistetta tutkittiin, toinen eristettyna 10 normaalin yksilon kokoomaplasmasta ja 125

toinen eristettyna yhden normaalin yksildn plasmasta. J-LDL

(2000 cpm/ng), joka oli valmistettu kayttaen Iodogen-tekniikkaa (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), oli 90 prosenttisesti trikloorietikkahapolla saostettavissa (TCA). Se laimennettiin 9 prosenttiseen naudan seerumin albumiiniin (BSA) (Sigma, St.

Louis, MO), ja sita sentrifugoitiin 30 OOOxg 15 minuuttia ennen kutakin maaritysta kompleksisen materiaalin poistamiseksi.

Maaritykset suoritettiin 12x75 mm lasiputkissa kolminkertaisina 55 raM natriumbarbitaalipuskurissa, pH-arvossa 8, joka sisalsi 150 mM NaClria, 0,02 prosenttia natriumatsidia, 3 prosenttia 125 . .

BSA:ta, ja 1,5 mM natrium-EDTA:ta. 0,1 ml:aan J-LDL:aa (joka sisalsi 20 ng LDL-proteiinia) lisattiin 0,1 ml puskuria tai kilpailevaa antigeenia 0,1 ml eristettyja MB47-reseptoreja kasvavina konsentraatioina laimennettuna BSA-barbitaali-puskuriin. 18 tunnin kuluttua 4°C:ssa, 0,1 ml IgSorb’ia (The Enzyme Co., Boston, MA) sekoitettiin joukkoon. Kahden tunnin yllapitoajan jalkeen, 2 ml BSA-vapaata barbitaalipuskuria lisattiin, ja putket sentrifugoitiin valittomasti 1500xg 60 minuuttia. Saostumia pestiin kahdesti barbitaalipuskurin kanssa. Maksimaalinen saostuva radioaktiivisuus maaritettiin korvaa- malla IgSorb 100 prosenttisella TCA:lla. Minimi saostuva 125 radioakt iviisuus maaritettiin liman MB47-reseptoreja. J-LDL:n sitoutumisprosentti laskettiin sen jalkeen.

125

2 . Nestef aasinen_J-leimattu resepton RIA

Koskemattomia vasta-aine MB47-reseptoreja, jotka oli eristetty . . 125 immunopuhdistuksella, jodattun J:n kanssa kayttaen Iodogen-tekniikkaa (spesifinen aktiivisuus 3000 cpm/ng) (Pierce). Perusteellisesta dialysoinnista PBS:aa vastaan seurasi se, ettå yli 95 prosenttia radioaktiivisuudesta oli saostettavissa 10 II ; 59 9271 4

12 S

prosenttisella TCA:lla. Enemman kuin 98 prosenttia J-MB47:stå sitoutui ihmisen LDL affiniteetti-kolonniin. Mååritykset suo- ritettiin kolminkertaisina 10x75 mm silikonipaållysteisisså 125 .........

lasiputkissa. J-MB47:aa lisattun kasvavina konsentraatioi- na 0,1 ml:ssa BSA-barbitaalipuskuria 100 ng:aan koottua normaa-lia ihmisen LDL:aa laimennettuna 0,2 ml:aan BSA-barbitaalipuskuria. Kukin putki sisalsi 182 fmoolia LDL apo B:ta (olettaen apo B:n molekyylipainoksi 550 000 daltonia). 16 tunnin inkuboin-nin jalkeen 4°C:ssa, LDL saostettiin kvantitatiivisesti lipo-proteiinivapaan kanin antiseerumin avulla, joka oli spesifista ihmisen LDLrlle. (Ainoastaan tiheytta, joka on suurempi kuin 1,21 g/ml kanin antiseerumifraktiossa, kåytettiin, koska vasta-aine MB47 sitoo kanin apo B:tå).

Esitutkimuksissa osoitettiin lipidivapaan kanin antiseerumin . 125 konsentraatio, joka saosti 97 prosenttia lOO ng:sta J-ihmisen LDL:aa. Kanin vasta-aineen sekoittamisen jalkeen putkia inkuboi-tiin 16 tuntia 4°C:ssa, ja sentrifugoitiin sen jalkeen 1500xg 50 minuuttia 4°C:ssa. Supernatantit poistettiin, ja pelletit pestiin kahdesti 2 ml:lla jaakylmaa barbitaalipuskuria. Epa-spesifinen sitoutuminen ja saostuminen maaritettiin kahdessa erassa rinnakkaisputkia.

Ensimmaisessa erassa, yhtaan ihmisen LDL:aa ei lisatty esi-inkubointiin, mutta sama maara kanin toista vasta-ainetta lisat-tiin. Toisessa putkieråssa ei-immuunin kanin seerumi (fraktio, jonka tiheys on suurempi kuin tai yhta suuri kuin 1,21 g/ml) korvattiin immuunin kanin seerumin vasta-aineella.

Molemmilla menetelmilla saatiin identtiset arvot epaspesifi- selle sitoutumiselle, joka oli lineaarista konsentraatioiden 125 .

kasvaessa J-MB47 vasta-ameella, ja kaikissa tapauksissa se oli alle 1 prosentti kaikesta lisatysta aktiivisuudesta.

125 J-MB47:n spesifinen sitoutuminen LDLraan saatiin våhenta-malla epaspesifinen sitoutuminen kokonaissitoutumisesta. Sitoutumistulokset analysoitiin kayttaen lineaarista regressio-ohjelmaa Scatchard-analyysissa ligandin sitoutumissysteemeissa, βο 9271 4 mikå antoi estimaatin vasta-aineen affiniteettivakiolle (Ka) ja reseptorin tai epitoopin konsentraatiolle (Munson et al., Anal. Biochem., 107, 220-239 (1980)).

3. Kiinteaan faasiin kiinnitetyn antigeenin RIA Seulontamååritys sen maarittamiseksi, tuottiko hybridoomaviljel-ma taman keksinnon mukaisia reseptoreja, suoritettiin jousta-villa pydreapohjaisilla polyvinyylikloridisilla mikrotiitteri-levyilla (Dynatech, Inc., Alexandria, VA), jotka toimivat kiin-teana matriisina. Lipoproteiiniantigeenit (reagenssi apo B-100) kiinnitettiin (sidottiin) mikrotiitterilevyn kuoppien sisasei-namiin, sekoittamalla 0,05 ml lipoproteiinia lipoproteiinipusku-riin, ja inkuboimalla levyja huoneen lampotilassa 3 tuntia vakioisen lopullisen sitoutuneen antigeenin konsentraation ja kiintean kantajan tuottamiseksi. Alustavat suoran sitoutumisen tutkimukset, kayttaen radiojodattuja lipoproteiineja, osoitti-vat, etta oli olemassa merkittavia eroja tehokkuuksissa, joilla kukin lipoproteiineista sitoutui muovisiin mikrotiitterikuop-piin. Sen vuoksi, jotta saavutettaisiin lopullinen sitoutuneen antigeenin konsentraatio 50 ng proteiinia/kuoppa, VLDL:aa kaytettiin pitoisuudessa 50 ^ug/ml, IDL:aa 6,2 ^ug/ml, LDL:aa 4,4 ^ug/ml ja HDL:aa 24 ^ug/ml. Epaspesifiset sitoutumispaikat estettiin sen jalkeen sekoittamalla 0,25 ml estoliuosta kuhun-kin kuoppaan, inkuboimalla seosta yksi tunti, ja erottamalla sitten estoliuos kuopista, muodostaen talla tavalla kiintean kantajan, jonka epaspesifinen sitoutumiskapasiteetti on alhai-nen .

Maaritysta vårten, 0,050 ml antiseerumia, viljelmasupernatant-tia, tai vatsaontelonestetta laimennettuna PBSraan, joka sisal-taa 3 prosenttia BSA:ta, 3 prosenttia normaalia vuohen seeru-mia, ja 0,05 prosenttia Tween-20:ta /polyoksietyleeni (20) sorbitaanimonolauraatti^/ sekoitettiin keskenaan kuopissa kiintea/nestefaasisten immunoreaktioseosten muodostamiseksi. Seoksia pidettiin (annettiin immunoreagoida) sen jalkeen 18 tuntia 4°C:ssa.

• » ll 61 9271 4

Kuoppien pesemisen jalkeen PBS:lla, joka sisalsi 3 prosenttia BSA:ta ja 0,05 prosenttia Tween-20:ta, sitoutumattoman materiaa-lin poistamiseksi, kiinteaan faasiin sidottuja reseptoreja prepa-roitiin suoraa ilmaisua vårten sekoittamalla 10 ng immunokemialli-sesti puhdistettua ja radiojodattua vuohen anti-hiiri Ig:tå ku-hunkin kuoppaan toisen kiintea/nestefaasisen seoksen muodostami-seksi. Tata seosta pidettiin 4 tuntia 4°C:ssa sen sallimisek-si, etta leimatut toiset reseptorit voisivat sitoa kiinteaan faasiin sidottuja ensimmåisiå reseptoreja ja muodostaa kerrok-sellisen immunoreaktantin.

Loppupesun jalkeen, sitoutumattomien leimattujen reseptorien poistamiseksi, yksittåiset kuopat poistettiin, ja niista lasket-. . . 125 _ . , ... 125 _ ...... , .

tnn J, ilmaistun J:n maaran ollessa suorassa suhteessa kiinteåfaasisena immunoreaktanttina sitoutuneiden ensimmåisten reseptorien maaraan.

Immunokemiallisesti puhdistettua toista vasta-ainetta radio-jodattiin entsymaattisesti kayttaen immobilisoitua laktoperoksi-daasia ja glukoosioksidaasia (Enzymobeads, Bio-Rad Burlingame, CA) spesifisiin aktiivisuuksiin 3-4 mikroCi/mikrogramma.

4. Kompetitiivinen kiinteaan faasiin kiinnitetyn reseptorin RIA _

Kompetitiivisia kiinteåfaasisia radioimmunomaarityksia (RIAt) ih-misen apo Brlle suoritettiin kayttaen vasta-ainetta MB47. Poly-vinyylikloridikuopat paallystettiin 0,5 ml:lla ihmisen LDLraa (apo B-100-reagenssi) laimennettuna 10 ^ug/ml PBS:aan, pH 7,35, ja pidettiin 2 tuntia 37°C:ssa. Epaspesifiset sitoutumis-paikat estettiin paallystamalla 5 prosenttisella BSA:lla PBSrssa 30 minuuttia huoneen lampotilassa. Levyt pestiin sen jalkeen PBS-pesupuskurilla, joka lisaksi sisalsi 0,1 prosenttia BSA:ta, 0,01 prosenttia natriumatsidia ja 0,05 prosenttia Tween-20:ta.

Tuoretta ihmisen LDL:aa, joka oli valmistettu kootusta normaa-lista plasmasta, kaytettiin apo B-100-reagenssina standardikayraa vårten laimennuksina alueella 0,4 ^ug/ml - 97,2 ^ug/ml. Kaikki 62 9 2 7 1 4 laimennukset tehtiin PBS-puskuriin, joka sisalsi 3 prosent-tia BSA:ta, 0,01 prosenttia natriumatsidia ja 0,05 prosent-tia Tween-20:tå. Standardia LDL:aa tai kilpailijoita (0,025 ml) sekoitettiin LDL-paållysteisiin kuoppiin, jonka jalkeen lisat-tiin 0,025 ml puskuria, joka sisalsi kiinteån ja rajoittavan maaran monoklonaalista vasta-ainetta (vatsaonteloneste). Optimaalinen lopullinen vasta-ainekonsentraatio maåritettiin alustavista vasta-aineen laimennustutkimuksista, ja valittiin mååråksi vasta-ainetta, joka johtaa 50 prosenttiseen sitoutu-miseen maksimaalisesta.

Levyjå inkuboitiin noin 18 tunnin ajanjakso 4°C:ssa, pestiin sen jalkeen PBS-pesupuskurilla. Hiiren vasta-aineen sitoutu-minen kvantitoitiin sen jalkeen sekoittamalla 0,05 ml J-immunopuhdistettua vuohen anti-hiiri Ig:ta (450 ng/kuoppa, 8000 cpm/ng). Nel jan tunnin yllåpitoajan jalkeen 4°C:ssa levyt pestiin ja yksittåisten kuoppien laskenta suoritettiin.

H. Entsyymikytkeinen immunosorbenttimååritys (ELISA)

I. Ei-kompetitiivinen ELISA

Eristettyja MB47-reseptoreja kiinnitettiin polystyreenisten mikrotiitterilevyn kuoppien seinamille (Nunc-Immuno Plate I) sekoittamalla 0,15 ml natriumbikarbonaattipuskuria pH 9,0, joka sisalsi l^ug/ml reseptoriproteiinia, kuhunkin kuoppaan. Kuop-pia inkuboitiin 16 tuntia 4°C:ssa, ja pestiin sen jalkeen 3 kertaa PBSrlla, joka sisålsi 0,1 prosenttia BSA:ta ja 0,05 prosenttia Tweeniå. Jåljelle jååneet epåspesifiset sitoutumis-paikat estettiin sen jalkeen sekoittamalla kuhunkin kuopoaan .

0,2 ml BSA:ta PBS:sså, inkuboimalla seosta 1 tunti 23°C:ssa, ja pesemallå sen jalkeen kuten edellå on kuvattu. Siten pre-paroituja kuoppia (kiinteåt kantajat) voidaan kåyttåå noin yhteen kuukauteen saakka preparoinnin jalkeen, kun niitå såilytetaån kosteutetussa kammiossa.

Apo B-100-reagenssia (ihmisen LDL) laimennettiin PBS:åån pitoi-suuksiin, jotka vaihtelivat alueella 2,0-0,062^ug/ml kåytettå-. våksi standardikontrolliliuoksina. Plasmanåytteet laimennettiin 1:2000 PBS:åån.

II : „ 92714

Viisikymmentå mikrolitraa standardia tai naytetta sekoitettiin kuoppiin kolminkertaisina. Noin vilden minuutin sisalla sen jalkeen, 50 ^ul PBS:aå, joka sisalsi mg/ml HRPO-leimattuja MB24-reseptoreja, sekoitettiin kuhunkin kuoppaan. Immunoreaktio-seoksia pidettiin 30 minuuttia 25°C:ssa. Sitoutumaton mate-riaali erotettiin sen jalkeen kuopista pesemallå kuten edella on kuvattu.

Kiinteaan faasiin kiinnitetyn kerroksellisen immunoreaktantin maara, joka sisalsi HRPO-leiman, maaritettiin sen jalkeen sekoit-tamalla 0,1 ml vasta valmistettua substraattiliuosta (tislattu vesi, joka sisaltaa 3 prosenttia H202:ta ja 0,67 mg/ml o-fenylee-nidiamiinia (OPD)) kuhunkin kuoppaan. Varin annettiin kehittva 30 minuuttia 25°C:ssa. Substraatin konversioreaktio pysåy-tettiin sen jalkeen sekoittamalla kuhunkin kuoppaan 0,05 ml 4N H2o2:ta. Liuosten optinen tiheys (O.D.) maaritettiin 490 nano-metrin (nm) aallonpituudessa kayttaen Dynatechin MR600 (Dynatech, Alexandria, VA) mikrotiitterilevylukijaa.

2. Kompetitiivinen ELISA

Apo B-100-reagenssia kiinnitettiin joustavan polyvinyylikloridi-sen mikrotiitterilevyn kuoppien seinamille (Microtest III,

Falcon Labware, Becton, Dickinson & Co, Oxnard, CA) kiinteana matriisina, sekoittamalla 0,2 ml PBS:aa, joka sisaltaa 5 ^ug/ml eristettya ihmisen LDLraa, kuhunkin kuoppaan. Kuoppia pidettiin 16 tuntia 4°C:ssa, ja ne pestiin sen jalkeen 3 kertaa 0,2 ml:lla PBS:aa, joka sisalsi 1 prosentin BSArta, 0,5 prosenttia Tweenia ja 0,02 prosenttia aprotiniinia (Sigma Chemical Co.). Jaljelle jaaneet epaspesifisesti sitovat paikat estettiin kuten on kuvattu ei-kompetitiivisessa ELISArssa.

Standardikayraa vårten, joka kuului jokaiselle levylle, reagens-sia apo B-100 laimennettiin PBSraan, joka sisalsi 0,5 prosenttia lipoproteiinivapaata plasmaa (LPDP), jotta saataisiin konsentraatioita, jotka vaihtelevat alueella 32 mg/ml - 0,25 mg/ml.

9271 4 64

Plasmanåytteet laimennettiin 1:200 PBS:åån, joka sisålsi 0,5 prosenttia LPDPrtå. Viisikymmentå mikrolitraa standardeja tai nåytteitå sekoitettiin kolminkertaisina kuoppiin. Noin 5 minuutin sisållå sen jålkeen, 50 ^ul PBS:åå, joka sisålsi 3 prosenttia BSA:ta ja noin 4 ^,ug/ml MB24-reseptoreja sekoitettiin kuhunkin kuoppaan. Siten muodostuneita seoksia pidettiin noin 18 tuntia 4°C:ssa. Sitoutumaton materiaali erotettiin sen jålkeen kiinteåån faasiin kiinnitetyistå MB24-reagenssi apo B-100 immunoreaktiotuotteista pesemållå kuten edellå on kuvattu.

Kiinteåfaasisia immunoreaktantteja preparoitiin mååritystå vårten sekoittamalla 0,1 ml PBS:åå, joka sisålsi 1 prosentin BSArta ja tehokas måårå HRPO-leimattua vuohen anti-hiiri IgGrtå kuhunkin kuoppaan. Tåtå toista immunoreaktioseosta pidettiin noin 1 tunti 24°C:ssa, ja pestiin sen jålkeen kuten edellå on kuvattu kerroksellisen immunoreaktantin muodostamiseksi.

Kiinteåån faasiin kiinnitetyn kerroksellisen immunoreaktantin, joka sisålsi HRPO-leiman, måårå mååritettiin kuten on kuvattu kompetitiivisessa ELISA:ssa.

I. Plasmanåytteet ja lipoproteiinin kvantitointi Plasmanåytteet saatiin 20 potilaalta, joilla oli sepelvaltimo-tauti sydånkatetrialalaboratiosta San Diegon, VA sairaalasta, ja 20 ootilaalta, joilla oli tavallinen hyperkolesterolemia Kalifornian yliopistosta, San Diegon klinikalta. Plasmaa saatiin lisåksi 20 normaalilta yksiloltå.

Verta keråttiin putkiin, jotka sisålsivåt 1,5 mg/ml etyleeni-diamiinitetra-asetaattia (EDTA), ja plasma erotettiin vålitto-måsti sentrifugoimalla 4°C:ssa.

Plasman kokonaiskolesteroli ja triglyseridit mitattiin tuoreista plasmanåytteista standardoidussa kliinisesså laboratoriossa kåyttåen Abbot ABA-200 bikromaattista analysaattoria, ja Boehringer-Mannheimin suuritehoista kolesterolireagenssia 236691 ja Abbot Laboratories'in triglyseridit A-gent. LDL-

II

92714 6 5 ja HDL-kolesteroli mitattiin kayttaen tekniikkaa, jota on kuvat-tu julkaisussa Lipid Research Clinic Procedures, HEW Pub. No. 75-628 (NIH), 2 p.,Washington, D.C., Gov. Print. Off., (1974 ). Apoproteiini B-tasot maaritettiin kayttaen kahta kaupallisesti saatavilla olevaa såteittåisimmunodiffuusiokittia: Diffu-gen RID (Tago, Inc., Burlingame, CA), jota tassa nimitetaan RID #1, ja M-Partigen RID, (Calbiochem- Behring, La Jolla, CA), jota nimitetaan RID #2 tassa.

J. LDL:n sitoutuminen MB47-Sepharose-4B-kolonniin 50 milligrammaa oleellisesti puhtaita MB47-reseptoreita, saatuna proteiini A kolonnikromatografialla, liitettiin 12 ml:aan syanogeenibromidilla aktivoituun Sepharose 4B:hen (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.Y.), valmistajan ohjeiden mukai-sesti. Jålkeenpåin lisattiin 10 mg LDL:aa kolonniin, ja sita inkuboitiin yli yon (noin 16 tuntia) 4°C:ssa. Sitoutumaton LDL eluoitiin sen jalkeen, ja siita maaritettiin LDL-proteiini kuten aikaisemmin on kuvattu.

Edella oleva patenttihakemus, mukaanlukien spesifiset suoritus-muodot, on tarkoitettu esillå olevaa keksintoa valaisevaksi, eika sita tule pitaa rajoittavana. Lukuisia muita variaatioi-ta ja modifikaatioita voidaan toteuttaa poikkeamatta keksinnon mukaisten uusien kasitteiden todellisesta hengesta ja alueesta.

Claims (19)

9271 4

1. Hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746.

2. Reseptori, tunnettu siita, etta se (a) immuno-reagoi apoproteiini B-100:n kanssa, ja jota (b) erittaa hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen reseptori, tunnettu siita, etta se on koskematon vasta-aine.

4. Hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742.

5. Reseptori, tunnettu siita, etta se (a) immunorea-goi apoproteiini B-100:n kanssa, ja jota (b) erittaa hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen reseptori, tunnettu siita, etta se on koskematon vasta-aine.

7. Menetelma apoproteiini B-100:n maaran maarittamiseksi ruumiinnestenaytteestå, tunnettu siita, etta mene-telmaan kuuluvat seuraavat vaiheet: (a) otetaan maaritettavaksi tarkoitettu ruumiinnestenayte; (b) tuotetaan reseptorimolekyyleja biologisesti aktiivisessa ·· muodossa, jotka (i) immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, ja joita (ii) erittaa hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746 tai hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742; (c) sekoitetaan tunnettu maara mainittua ruumiinnestenaytetta ennalta maaratyn maaran kanssa mainittuja reseptorimolekyyleja immunoreaktioseoksen muodostamiseksi; (d) pidetaan mainittua seosta biologisissa maaritysolosuhteissa ennalta maaratty aika, joka seoksessa låsnå olevien reseptori-molekyylien kannalta on riittava sitomaan immunologisesti nayt-teessa lasna olevaa apoproteiini B-100:aa, jolloin muodostuu immunoreaktanttia; ja (e) maaritetaan mainitussa seoksessa muodostuneen immunoreak-tantin maara. II 92714

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta mainittu ruumiinnestenayte on joko plasma tai see-rumi .

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta mainittu reseptori on koskematon vasta-aine.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta ruumiinnestenaytetta preparoidaan lisaksi maaritysta vårten sisallyttamalla seuraavat lisavaiheet: (f) tuotetaan biologisesti aktiivisia toisia reseptorimole-kyylejå, jotka immunoreagoivat mainitussa ruumiinnestenaytteesså lasna olevan apoproteiini B-100:n kanssa, ja jotka ovat jåån-noksia kummastakin reseptorimolekyylierasta, joita erittavat hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746 tai hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742; ja (g) sekoitetaan ennalta maaratty maara mainittuja toisia resep-torimolekyylejå mainitun ruumiinnestenaytteen kanssa, jolloin muodostuu immunoreaktioseos; (h) pidetaan mainittua immunoreaktioseosta biologisissa mååri-tysolosuhteissa ennalta maaratty aika, joka seoksessa lasna ole-vien reseptorimolekyylien kannalta on riittava sitomaan immunologisesti naytteessa lasna olevaa apoproteiini B-100:aa, jolloin muodostuu kerroksellista immunoreaktanttia.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta mainittu reseptori on koskematon vasta-aine.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta ensin mainittu reseptori kiinnitetaan kiinteaan mat-riisiin kiintean kantajan muodostamiseksi; mainittu toinen reseptori sisaltaa leiman, jonka avulla voidaan ilmaista immunoreak-tantin sisaltaman mainitun toisen reseptorin lasnaolo; ja vai-heessa (e) maaritetty immunoreaktantti on kiinteafaasinen, ker-roksellinen immunoreaktantti, joka sisaltaa mainitun leiman. 9271 4

13. Diagnostinen systeemi ruumiinnåytteesså olevan apo-B-100:n måarån måårittåmistå vårten, tunnettu siita, etta se kasittaa: (a) ensimmaisen biologisesti aktiivisen, spesifisesti sitoutu-van aineen, joka kasittaa reseptorimolekyyleja, jotka (i) immu-noreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, ja (ii) ovat joko hyb-ridooman ATCC HB 8746 erittamia reseptorimolekyyleja tai hybri-dooman ATCC HB 8742 erittamia reseptorimolekyyleja; ja (b) biologisesti aktiivisen, leimatun, toisen spesifisesti si-toutuvan aineen, sen immunoreaktion ilmaisemiseksi, johon mai-nittu ensimmainen sitoutuva aine osallistuu apo B-100:n kanssa.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen maarityssysteemi, tunnettu siita, etta leimattu, toinen spesifisesti sitoutuva aine kasittaa toisia reseptorimolekyyleja joko reseptoreista, joita erittaa hybridooma ATCC HB 8746 tai reseptoreista, joita erittaa hybridooma ATCC HB 8742.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen maarityssysteemi, tunnettu siita, etta leima on entsyymi.

16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen maarityssysteemi, tunnettu siita, etta mainittu ensimmainen spesifisesti sitova aine on kiinnittynyt kiinteaan matriisiin, jolloin muodostuu ;; kiintea kantaja.

17. Steriili affiniteettisorbentti, jonka muodostavat biologisesti aktiiviset reseptorimolekyylit, jotka immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa ja valikoidaan ryhmåstå, johon kuu-luvat: (a) hybridooman HB 8746 erittamat reseptorimolekyylit; (b) hybridooman HB 8742 erittamat reseptorimolekyylit; ja (c) kohtien (a) ja (b) sisaltamien reseptorimolekyylien seos; tunnettu siita, etta mainitut reseptorimolekyylit ovat kiinnittyneet kiinteaan matriisiin, jolloin muodostuu kiintea kantaja. « · · II 9271 4

18. Menetelma ruumiinnestenåytteen sisaltaman apoproteiini B-100:n maarittamiseksi, tunnettu siita, etta se kasit-taa seuraavat vaiheet: (a) otetaan maaritettavaksi tarkoitettu ruumiinnestenåyte; (b) tuotetaan kiintea kantaja, joka on muodostunut kiinteasta matriisista, johon on kiinnittyneena sen lisaksi biologisesti aktiivisessa muodossa ensimmainen reseptori, joka reagoi immunologisesti apoproteiini B-100:n kanssa, ja jota erittaa hybri-dooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746; (c) tuotetaan toinen biologisesti aktiivinen reseptori, joka immunoreagoi apoproteiini B-100:n kanssa, ja jota erittaa hybri-dooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742, mainitun toisen reseptorin ollessa liittyneena leimaentsyymiin, jonka avulla pystytaan ilmaisemaan mainitun toisen reseptorin lasnaolo im-munoreaktantissa; (d) sekoitetaan olennaisesti samanaikaisesti: (i) mainittu ruumiinnayte; (ii) mainittu kiintea kantaja; ja (iii) mainittu leimattu toinen reseptori kiintea/nestefaasisen immunoreaktioseoksen muodostamiseksi; (e) pidetaan mainittua seosta biologisissa maaritysolosuhteissa ennalta maaratty ajanjakso, joka on mainitun ensimmaisen reseptorin ja mainitun toisen leimatun reseptorin kannalta riittava sitomaan immunologisesti naytteessa lasna olevaa apoproteiini ; B-100:aa, jolloin muodostuu kiinteafaasinen kerroksellinen im- munoreaktantti ja nestefaasi; (f) erotetaan mainittu kiinteafaasinen kerroksellinen immuno-reaktantti mainitusta nestefaasista; ja (g) maaritetaan leimatun toisen reseptorin maara, joka on si-toutunut kiinteafaasiseen kerrokselliseen immunoreaktanttiin.

19. Kompetitiivinen menetelma ruumiinnestenaytteen sisaltaman apoproteiini B-100:n maarittamiseksi, tunnettu siita, etta siihen kuuluvat seuraavat vaiheet: (a) otetaan maaritettavaksi tarkoitettu ruumiinnestenåyte; (b) tuotetaan kiintea kantaja, joka kasittaa kiintean matriisin, johon on sen lisaksi kiinnittyneena ennalta maaratty maara rea-genssia apoproteiini B-100; 70 9271 4 (c) sekoitetaan olennaisesti samanaikaisesti: (i) mainittu ruumiinnayte; (i i) mainittu kiintea kantaja; ja (iii) ennalta maaratty maara reseptorimolekyyleja, jotka immuno-reagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, erittyneina joko hybri-doomasta, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746 tai hybridoomasta, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742, jolloin muodostuu kiintea/ nestefaasiseos; (d) pidetaan mainittua seosta biologisissa maaritysolosuhteissa ajanjakso, joka reseptorimolekyylien kannalta riittaa sitoutumaan immunologisesti kiintean kantajan sisåltamiin apoproteiini B-100-molekyyleihin ja ruumiinnestenaytteessa lasna oleviin apoproteiini B-100-molekyyleihin ja muodostamaan kiinteafaasisen immunoreak-tantin ja nestefaasisen immunoreaktantin; ja (e) erotetaan mainittu kiinteafaasinen immunoreaktantti maini-tusta nestefaasista; (f) sekoitetaan lisååmålla mainittuun kiinteafaasiseen immuno-reaktanttiin biologisesti aktiivista toista reseotoria, joka immunoreagoi mainitun ensimmaisen reseptorin kanssa, jolloin muodostuu toinen kiintea/nestefaasinen immunoreaktioseos, jossa mainittu entsyymileimaan kytketty toinen reseptori pystyy ilmai-semaan immunoreaktantin sisaltaman mainitun toisen reseptorin lasnaolon; (g) yllapidetaan mainittua toista seosta aika, joka leimatun toisen reseptorin kannalta on riittava sitomaan immunologisesti kaikki ensimmainen reseptori, joka on lasna kiinteafaasisena immunoreaktanttina, jolloin muodostuu kiinteafaasinen kerroksel-linen immunoreaktantti; (h) erotetaan mainittu kiintean faasin kerroksellinen immunoreaktantti mainitusta nestefaasista; ja (i) maaritetaan leimatun toisen reseptorin maara, joka on si-toutunut mainittuun kiinteafaasiseen kerrokselliseen immunoreak-tanttii n. « · II 71 9271 4