FI92411B - Menetelmä polysyklisen eetteriantibiootin valmistamiseksi - Google Patents

Description

924 ; 1

Menetelmä polysyklisen eetteriantibiootin valmistamiseksi

Keksinnön tausta Tämä keksintö koskee menetelmää polysyklisen eet-5 teriantibiootin valmistamiseksi, jolla on kaava OMe / V^Me OMe \-o 10 Me, JL 55e ·»*

MeO ' s f w f S | 1/—n Me J Me I .Η I . -Me ηο,ενΑ/^ο''\λα s—L· X-\"h

1 i H LS 0 U ° HO #! OH

Me Me H H

m 15 jossa Me = CH3 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän ka-tionisen suolan valmistamiseksi. Yhdisteen absoluuttinen stereokemia on esitetyn mukainen. Yhdiste (I) on käyttökelpoinen ravintoaineseoksissa siipikarjaa, karjaa tai si-20 koja varten ja antikokkidiaalisena aineena siipikarjalla, sikojen dysenterian hoidossa tai ehkäisyssä tai kasvua edistävänä aineena karjalla tai sioilla. Keksintö koskee myös Actinomadura sp. -mikro-organismia ATCC 53708, joka tuottaa mainittua antibioottia keksinnön mukaisessa fer-25 mentaatiomenetelmässä.

Yhdiste (I) on happamien polysyklisten eetterien antibioottiryhmän uusi jäsen. Tähän ryhmään kuuluu sellaisia tunnettuja aineita kuin monensiini (The Merck Index, 10. painos, Merck and Co., Inc., Rahway, N. J., 1983, mo-30 nografia nro 6100), nigerisiini (loc. cit., monografia nro 6390), narasiini (loc. cit., monografia nro 6271), lasa-losidi (loc. cit., monografia nro 5204) ja salinomysiini (loc. cit., monografia nro 8193). Aiheesta on esittänyt katsauksen Westley, "Polyether Antibiotics", Adv. Appi. 3 5 Microbiol., voi. 22, ss. 177 - 223 (1977). Nyt kysymykses- 2 g o '" 1 7 L -f ; ! sä olevaa yhdistettä muistuttaa rakenteeltaan lähimmin portmisiini, antibiootti, jonka ovat itsenäisesti esittäneet Hamill et ai., US-patentti 4 582 822, ja Kusakabe et ai., EP-patenttihakemus 158 179; Tetrahedron Letters, 5 voi. 28, ss. 3357 - 3360 (1987); J. Antibiotics, voi. 40, ss. 237 - 238 (1987). Viimeksi mainitussa yhdisteessä on alfa-vety tetrahydrofuraanin B-renkaassa, jossa nyt kysymyksessä olevassa yhdisteessä on alfa-metyyliryhmä. Nämä yhdisteet tunnetaan yleisesti kokkidiostaattisinä aineina, 10 kasvua edistävinä rehun lisäainina ja/tai aineina, jotka ovat hyödyllisiä sikojen dysenteriaa vastaan.

Keksinnön yhteenveto

Kun fermentoidaan mikro-organismin Actinomadura sp, ATCC 53708, viljelmää aerobisissa olosuhteissa vesipitoi-15 sessa ravintoalustassa, se tuottaa uutta hapan polysyklinen eetteriantibioottia, yhdistettä, joka on edellä annetun kaavan (I) mukainen.

Tämä keksintö koskee menetelmää kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän kationi-20 sen suolan valmistamiseksi. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että Actinomadura sp. ATCC 53708:a fermentoidaan vedenalaisissa aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa ravintoalustassa, joka sisältää assimiloituvan hiili- ja typpi- lähteen, kunnes talteen otettavissa 25 oleva määrä mainittua yhdistettä on muodostunut. Antikok-kidiaalisena aineena, sikojen dysenterian ehkäisyssä tai hoidossa ja/tai kasvua edistävänä aineena käyttöä varten yhdistettä (I) ei välttämättä eroteta fermentaatiosta ja eristetä huomattavan puhtaassa muodossa, vaan se käytetään 30 vaihtoehtoisesti raajassa muodossa, joko saostetussa muodossa sekoitettuna huovaston kanssa (otettuna talteen suodattamalla fermentaatioliuos) tai kuiva-aineena, joka on saatu suihku- tai pakastekuivaamalla koko fermentaatioliuos.

Q C 4 'M

y £. *T ; I 3

Mainittuja farmaseuttisesti hyväksyttäviä kationi-sia suoloja ovat, ilmoitettuihin rajoittumatta, natriumin, kaliumin, kalsiumin, ammoniakin, N,N'-dibentsyylieteenidi-amiinin, N-metyyliglukamiinin (meglumiinin) ja dietanoli-5 amiinin suolat. Edullisimpina kationisina suoloina pidetään kalium- ja natriumsuoloja.

Käyttöä varten voidaan muodostaa ravintoaineseok-sia, yhtä karjaa tai sikoja varten, joka seos sisältää kaavan (I) mukaista yhdistettä määränä, joka on tehokas 10 karjan tai sikojen kasvun edistämiseksi ja/tai ravinnon hyödyksikäytön parantamiseksi tai dysenterian ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi sioilla, ja toista siipikarjaa varten, joka seos sisältää kaavan (I) mukaista yhdistettä määränä, joka on tehokas kokkidiaali-infektion torjumisek-15 si siipikarjassa.

Yhdiste (I) on lisäksi käyttökelpoinen menetelmässä kasvun edistämiseksi ja/tai ravinnon hyödyksikäytön tehokkuuden lisäämiseksi sioilla tai karjalla, joka menetelmä käsittää kasvua edistävän tai ravinnon hyödyksikäytön te-20 hokkuutta lisäävän määrän kaavan (I) mukaista yhdistettä antamisen sioille tai karjalle, erityisesti ravintoaine-seoksen muodossa; menetelmässä dysenterian ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi sioilla, joka menetelmä käsittää kaavan (I) mukaisen yhdisteen antamisen sioille määränä, joka on 25 tehokas dysenterian ehkäisemisessä tai hoitamisessa sioil la; ja menetelmässä kokkidiaali-infektioiden torjumiseksi siipikarjaassa, joka menetelmä käsittää antikokkidiaali-sesti tehokkaan määrän kaavan (I) mukaista yhdistettä antamisen siipikarjalle, erityisesti ravintoaineseoksen muo-30 dossa.

Lopuksi tämä keksintö koskee mikro-organismia Ac-tinomadura sp. ATCC 53708 ja sen biologisesti puhdasta viljelmää, joka kykenee tuottamaan kaavan (I) mukaista yhdistettä talteen otettavissa oleva määrä suoritettaessa 35 fermentaatiokasvatus vesipitoisessa ravintoalustassa, joka 4 3 ^ ^ ί 1 sisältää hiilen ja typen assimiloituvia lähteitä; mukaan lukien viljelmä pakastekuivatussa muodossa.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Viljelmälle, joka kykenee tuottamaan kaavan (I) mu-5 kaista polysyklinen eetteri -antibioottia, on annettu nimitys Actinomadura sp., ja se on talletettu kokoelmaan The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, tyyppiviljelmänä talletusnumerolla ATCC 53708. Taataan tämän viljelmätalletuksen pysyvyys kokoelmassa The American 10 Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ja oleminen yleisön helposti saatavissa patentin koko voimassaoloajan siinä tapauksessa, että patentti myönnetään.

Tämä uusi viljelmä on peräisin maanäytteestä, joka on kerättty Tuzlassa, Istanbulissa, Turkissa, ja se on 15 identifioitu toiminimen Pfizer Inc. viljelmäkokoelmassa N777-l:nä. Sen kuvauksen ja luokittelun suoritti tri L. H. Huang. Tämän viljelmän todettiin tuottavan mitoiltaan kapeita sädesienten (actinomycetes) hyyfejä, ilmahuovaston, jonka päälle muodostuu lyhyitä itiöketjuja, ja ei-katko-20 naisen substraattihuovaston. Kokonaisten solujen analyysien tulokset osoittavat lisäksi, että se kuuluu sukuun Actinomadura.

Mikro-organismin vinopintaviljelmä siirrostettiin ATCC 172 -liemeen ja sitä kasvatettiin neljän päivän ajan * 25 28 °C:ssa ravistelijassa. Sitä sentrifugoitiin sitten 20 minuutin ajan, pestiin kolme kertaa steriilillä tislatulla vedellä ja siirrostettiin kasvualustoille, joita käytetään tavallisesti ryhmän Actinomycetales jäsenien identifiointiin.

30 Viljelmiä inkuboitiin 28 °C:ssa ja tulokset luet tiin vaihtelevina aikoina, mutta tavallisimmin neljäntoista päivän kuluttua. Värit kuvattiin käyttäen yleistä terminologiaa, mutta tarkat värit määritettiin vertaamalla teoksen The Color Harmony Manual, neljäs painos, värilius-35 koihin. Kokonaisten solujen aminohappo- ja sokerianalyysi

II

924'i 1 5 menetelmät ovat niitä, jotka on kuvattu julkaisuissa Becker et ai., Appi. Microbiol., voi. 12, ss. 421 - 423 (1964) ja Staneck et ai., Appi. Microbiol, voi. 28, ss. 226 -231 (1974) ja Lechevalier, J. Lab. elin. Med. , 5 voi. 71, ss. 934 -944 (1968), vastaavasti.

Viljelmä identifioitiin seuraavasti: Hiivauute-mallasuuteagar (ISP #2 -elatusaine,

Difco)

Kasvu hyvää, kermanväristä (2 ca) , jossa oli tum-10 manharmaista mustiin olevia (vasemmanpuolinen harmaa sarja 5 ih, 5 ml) pisteitä, kohottunutta, poimuntunutta; ilma-huovastoa ei ollenkaan tai niukasti, väritöntä; kääntöpuoli kermanvärisestä vaalean kellertävään (2 ca, 2 ea) , jossa mustia (vasemmanpuolinen harmaa sarja 5 ml) pisteitä; 15 ei liukenevaa pigmenttiä.

Kaurajauho-agar (ISP #3 -elatusaine, Difco)

Kasvu kohtalaista, kermanväristä (2 ca) , lievästi kohottunutta, sileää; ilmahuovastoa ei ollenkaan tai niukasti, väritöntä; kääntöpuoli kermanväristä (2 ca) ; liu-20 koinen pigmentti kermanväristä (2 ca).

Epäorgaaniset suolat -tärkkelys-agar (ISP #4 -elatusaine, Difco)

Kasvu heikkoa, kermanväristä (2 ca) , ohutta, sileää; ilmahuovastoa ei ollenkaan tai niukasti, väritöntä; 25 kääntöpuoli kermanväristä (2 ca) ; ei liukenevaa pigmenttiä .

Glyseroli -asparagiini-agar (ISP #5 -elatusaine,

Difco)

Kasvu heikosta kohtalaiseen, kermanväristä (2 ca) , 30 ohutta, sileää, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli kermanväristä (2 ca); ei liukenevaa pigmenttiä.

Czapek -sakkaroosi-agar (Waksman, "The Actinomy-cetes", V. 2, elatusaine #1, s. 328, 1961)

Kasvu kohtalaisesta hyvään, kermanväristä (2 ca) , 35 kohtalaisen kohottunutta, sileää, ei ilmahuovastoa; kään- 6 Q O '· -1 y έ η ! töpuoli kermanväristä (2 ca); ei liukenevaa pigmenttiä.

Glukoosi -asparagiini-agar (ibid., elatusaine #2)

Kasvu kohtalaista, kermanväristä (2 ca), ohuesta kohtalaisen kohottuneeseen, sileästä poimuntuneeseen, ei 5 ilmahuovastoa; kääntöpuoli kermanvärinen (2 ca) ; ei liukenevaa pigmenttiä.

Gordonin ja Smithin tyrosiini-agar (Gordon ja Smith, J. Bacteriol. 69: 147 - 150, 1955)

Kasvu kohtalaisesta hyvään, kermanväristä (2 ca) , 10 lievästi kohottuneesta kohtalaisen kohottuneeseen, sileästä poimuntuneeseen, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli kermanvärinen (2 ca) ; liukeneva pigmentti vaalean kellertävää (2 ea) .

Kalsiummalaatti-agar (Waksman, Batriol. Rev. 21, 15 1 - 29, 1957)

Kasvu heikkoa, kermanväristä (2 ca) , ohutta, sileää; ei ilmahuovastoa, kääntöpuoli kermanvärinen (2 ca), ei liukenevaa pigmenttiä.

Kaseiini-agar (Gordon ja Smith, ibid.) 2 0 Kasvu hyvää, kermanväristä (2 ca) , kohottunutta, sileästä poimuntuneeseen, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli vaalean kellertävä (2 ea); kellertävä (2 ga) liukeneva pigmentti.

Bennettin agar (Waksman, loc. cit., elatusaine #30, 25 s. 331)

Kasvu hyvää, kermanväristä (2 ca) , kohottunutta, poimuntunutta, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli kermanväri-sestä kalpean kellertävään (2 ca, 2 ea) ; liukeneva pigmentti vaalean kellertävä (2 ea).

30 Emersonin agar (ibid., elatusaine #28, s. 331)

Kasvu kohtalaista, kermanvärisestä vaalean kellertävään (2 ca, 2ea), kohottunutta, poimuntunutta, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli kellertävä (2 ie) ; ei liukenevaa pigmenttiä.

Il ο Γ' 4 .· Λ '> / ·*. 1 7

Ravinto-agar (ibid., elatusaine #14, s. 330)

Kasvu heikosta kohtalaiseen, kermanväristä (2 ca) , ohuesta lievästi kohollaan olevaan, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli kermanvärinen (2 ca) ; ei liukenevaa pigment-5 tiä.

Gelatiini-agar (Gordon ja Mihm, J. Bacteriol. 73, 15 - 27, 1957)

Kasvu hyvää, kermanväristä (2 ca) , kohottunutta, poimuntunutta, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli kermanväri-10 sestä vaalean kellertävään (2 ca, 2 ea); liukeneva pigmentti vaalean kellertävä (2 ea).

Tärkkelys-agar (ibid.)

Kasvu hyvää, kermanväristä (2 ca) , kohottunutta, poimuntunutta, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli kermanväri-15 sestä vaalean kellertävään oleva (2 ca, 2 ea) ; ei liukenevaa pigmenttiä.

Perunaporkkana-agar (Lechevalier, Lab. Clin. Med., 71, 934 - 944, 1968, mutta käytetty ainoastaan 30 g perunoita, 2,5 g porkkanoita ja 20 g agaria) 20 Kasvu heikosta kohtalaiseen, likaisen valkoista (vasemmanpuoleinen harmaa sarja 2 ba), ohutta, sileää; ilmahuovastoa ei ollenkaan tai niukasti, väritöntä; kääntöpuoli värittömästä kermanväriseen oleva (2 ca); ei liukenevaa pigmenttiä.

25 Vesijohtovesi-agar (2 %)

Kasvu heikkoa, kermanväristä (2 ca) , ohutta, sileää; ilmahuovastoa ei ollenkaan tai niukasti, väritöntä; kääntöpuoli värittömästä kermanväriseen (2 ca) ; ei liukenevaa pigmenttiä.

30 Gauzen kivennäiselatusaine 1 (Gauze et ai., Prob lems in the Classification of Antagonistic Actinomycetes, englantilainen painos, s. 13, 1957)

Kasvu heikosta kohtalaiseen, kermanväristä (2 ca) , ohutta, sileää; ilmahuovastoa ei ollenkaan tai niukasti, 35 väritöntä; kääntöpuoli kermanvärinen (2 ca); ei liukenevaa pigmenttiä.

8 924:1

Gauzen orgaaninen elatusaine 2 (ibid.)

Kasvu hyvää, kermanväristä (2 ca) , kohottunutta, poimuntunutta, ei ilmahuovastoa; kääntöpuoli kermanväri-sestä vaalean kellertävään (2 ca, 2 ea) ; ei liukenevaa 5 pigmenttiä.

Morfologiset ominaisuudet

Morfologisia ominaisuuksia havaittiin kolmen viikon inkuboinnin jälkeen epäorgaaniset suolat/tärkkelys-agaril-la: ilmahuovasto väritön, valkeasta kermanväriseen; itiö-10 ketjut suoria, kaarevia tai koukistuneita, kahdesta yhdek sään itiötä itiöketjua kohden; itiöt pallomaisia, soikeasta elliptiseen, läpimitta 0,8 - 1,4 mikronia tai 1,1 - 1,8 x 0,8 - 1,2 mikronia; sileitä, minkä paljasti pyyhkäisyelektronimikroskopia .

15 Biokemialliset ominaisuudet

Melaniinia ei muodostu; rikkivetyä ei muodostu; gelatiini nesteytyy; ei hydrolysoi tärkkelystä; ei pelkistä nitraattia nitriitiksi; ei kasvua eikä hajotusta Jensenin eikä myöskään Levinen ja Schoenleinin selluloosalie-20 messä; ei maidon koagulointia eikä peptonisointia; kaseiinin hajotus positiivinen; tyrosiinin hajotus negatiivinen; kalsiummalaatin hajotus negatiivinen. Hiilihydraattien käyttö: käyttää glukoosia, arabinoosia, fruktoosia, manni-tolia, ramnoosia, sakkaroosia, ksyloosia, adonitolia, sel-25 lobioosia, glyserolia, maltoosia, riboosia, tärkkelystä ja trehaloosia; ei käytä inositolia, raffinoosia, dulsitolia, erytritolia, galaktoosia, laktoosia, mannoosia, meletsi-toosia, melibioosia, alfa-metyyli-D-glukosidia, salisii-nia, sorbitolia eikä sorboosia.

30 Muita positiivisia testejä olivat asetaatin ja py- ruvaatin hyödyksikäyttö; esuliinin hydrolyysi; ja ksantii-nin ja hypoksantiinin hajotus. Seuraavat testit olivat negatiivisia: bentsoaatin, sitraatin, dekstriinin, laktaa-tin, malaatin, mukaatin, oksalaatin, fenolin, propionaatin 35 ja sukkinaatin käyttö; adeniinin ja tyrosiinin hajotus, ja hippuraatin hydrolyysi.

Il 9 9 2 4 1

Suhtautuminen lämpötilaan 21 °C 28 °C 37 °C 45 °C kasvu kasvu kasvu kasvu hyvää hyvää hyvää hyvää 5

Koko soluja koskevia analyysejä

Kokonaisten solujen hydrolysaatit sisälsivät meso-diaminopimeliinihappoa, glukoosia, galaktoosia, maduroo-sia, mannoosia ja riboosia.

10 Viljelmälle N777-1 on tunnusomaista kermanvärinen substraattihuovasto; lyhyt väritön ilmahuovasto; lyhyet itiöketjut, jotka ovat suoria, kaarevia tai koukistuneita; ja itiöt, joiden pinta on sileä. Se käytti glukoosia, ara-binoosia, fruktoosia, mannitolia, ramnoosia, sakkaroosia, 15 ksyloosia, adonitolia, sellobioosia, glyserolia, maltoo-siä, riboosia, tärkkelystä, trehaloosia, asetaattia ja pyruvaattia. Se hajoitti ksantiinia, hypoksantiinia ja eskuliinia. Kokonaisten solujen hydrolysaatit osoittavat mesodiaminopimeliinihapon ja maduroosin läsnäolon. Viljel-20 mä N777-1 kuuluu siten sukuun Actinomodura, kuten on määritellyt H. Lechevalier.

Tunnettuja Actinomadura-lajeja, joilla esiintyy samankaltainen kermanvärinen substraattihuovasto ja/tai samanlaisia biokemiallisia ominaisuuksia, ovat A. cremea 25 subsp. rifamycini, A. madurae subsp. simaoensis ja A. rou-tienii. Viljelmä N777-1 eroaa A. cremea subsp. rifamycini siten, että omaa sileät itiöt, ei pelkistä nitraattia, ei käytä raffinoosia ja käyttää arabinoosia ja ramnoosia.

Viljelmä N777-1 eroaa A. madurae subsp. simaoensis 30 siten, että omaa pikemminkin kermanvärisen kuin värittömästä oranssinruskeaan olevan substraattihuovaston, pikemminkin värittömän kuin värittömästä vaaleanpuna-valkeaan olevan ilmahuovaston, ei pelkistä nitraattia, ei hajota tyrosiinia ja kykenee hajottamaan ksantiinia. A. rou-35 tieniin verrattuna se eroaa siten, että siltä puuttuvat 10 924':1 pseudoitiöpesäkkeet; se ei hydrolysoi tärkkelystä; se ei koaguloi maitoa ja kykenee käyttämään mannitolia, fruktoosia ja glyserolia.

Viljelmä N777-1 muistuttaa A. alboluteaa useimmissa 5 biokemiallisissa testeissä, mutta eroaa viimeksi mainitusta siten, että ei hydrolysoi tärkkelystä, ei koaguloi maitoa, omaa substraattihuovaston, joka on kermanvärinen pikemmin kuin ruskeasta tummanruskeaan, ja itiöketjut ovat pikemmin lyhyitä kuin pitkiä.

10 Yllä esitettyjen tietojen perusteella viljelmää N777-1 pidetään suvun Actinomadura jäsenenä ja siitä käytetään nimitystä Actinomadura sp. Se on talletettu kokoelmaan The American Type Culture Collection talletusnumerol-la ATCC 53708.

15 Tässä kuvattua polysyklistä eetteriantibioottia I

tuottaa kysymyksessä oleva Actinomadura sp. helposti kasvatettaessa sitä lämpötilassa noin 24 - noin 36 °C vedenalaisissa olosuhteissa sekoittaen ja ilmastaen ravinto-alustoissa, jotka käsittävät sellaisia hiilihydraattien 20 lähteitä kuin esimerkiksi sokereita, tärkkelyksiä, glyserolia, orgaanisia typpiyhdisteitä, kuten esimerkiksi soijajauhoa, kasaminohappoja, hiivauutetta; kasvuaineita, kuten esimerkiksi viljan liukenevia aineita, kalajauhoa, puuvillansiemenjauhoa; kivennäissuoloja, jotka sisältävät 25 sellaisia hivenaineita kuin esimerkiksi rautaa, kobolttia, kuparia, sinkkiä jne., ja kalsiumkarbonaattia tai fosfaatteja puskuriaineina. Sen jälkeen kun kasvatus on suoritettu loppuun, antibiootti otetaan helposti talteen uuttamalla koko kasvuliemi sellaisilla orgaanisilla liuottimilla 30 kuin esimerkiksi n-butanoli, metyyli-isobutyyliketoni tai kloroformi pH-alueilla 4,0 - 8,0; suodattamalla erilleen huovasto, joka sisältää saostuneen antibiootin, jolloin suodos heitetään pois; tai yksinkertaisesti suihkukuivaa-malla tai pakastekuivaamalla koko kasvuliemi. Vaihtoehtoi-35 sesti huovastoa tai koko kuivattua kasvulientä uutetaan

II

11 7 1 4 i 1 jollakin mainituista orgaanisista liuottimista. Puhdistettu antibioottiyhdiste eristetään haluttaessa orgaanisesta uutteesta käyttäen yleisiä konsentroinnin, suolan tai vapaan hapon muodostuksen, kromatografiän, saostamisen ja/-5 tai kiteyttämisen menetelmiä, kuten alla on valaistu esimerkeillä.

Suoritettaessa fermentointi tavanomaisesti valmistetaan ensin siirrostusmateriaali kaapimalla vegetatiivi-sia soluja, jotka kasvavat sopivalla kasvualustalla, vino-10 pintaviljelmistä tai Roux-pulloista, joihin on siirrostet-tu Actinomadura sp. ATCC 53708:a. Tulokseksi saadut vege-tatiiviset solut käytetään vuorostaan sellaisiin ravistus-pulloihin tai siirrostusmateriaalisäiliöihin siirrostami-seen, jotka myös sisältävät sopivaa kasvualustaa. Vaihto-15 ehtoisesti siirrostusmateriaalisäiliöihin siirrostetaan ravistuspulloista. Sopivan kasvatusajan jälkeen (yleensä 12 0 - 144 tuntia ravistuspulloissa ja 168 - 196 tuntia siirrostusmateriaalisäiliöissä), fermentoriin, joka myös sisältää sopivaa kasvualustaa, siirrostetaan aseptisissa 20 olosuhteissa vegetatiivista kasvulientä ravistuspulloista tai siirrostusmateriaalisäiliöistä. Kasvatuksen loppuun suorittamisen jälkeen (yleensä noin 120 - 196 tuntia), antibioottiyhdiste otetaan talteen raa'assa tai puhtaassa muodossa, kuten halutaan, käyttäen jotakin yllä yleisesti 25 kuvatuista menetelmistä tai niitä erityisiä menetelmiä, joita on valaistu alla esimerkeillä.

Kaavan (I) mukaisen yhdisteen in vitro -bakteerin-vastainen aktiivisuus testataan käyttäen yleisiä menetelmiä, joissa mitataan pienimmät estävät konsentraatiot 30 (MIC) , ilmaistuna /ig/ml, yhtä tai useampaa mikro-organis mia vastaan. Yksi sellainen menetelmä on se, jota on suositeltu tutkimuksessa International Collaborative Study on Antibiotic Sensitivity Testing (Ericcson ja Sherris, Acta. Pathologica et Microbiologia Scandinav., Supp. 217, kappa-35 le B: 64 - 68 [1971]) ja jossa käytetään aivo-sydäninfuu- 12 ;· ·'· .: · 1 / c 'T i ! sio (BHI) -agaria ja siirrostusmateriaalientoisintamislai-tetta. Yön ajan kasvatetut putket laimennetaan 100-kertai-sesti käytettäviksi standardi-siirrostusmateriaalina (20000 - 100 000 solua noin 0,002 ml:ssa sijoitetaan agar-5 pinnalle; 20 ml BHI-agaria/malja). Käytetään kahtatoista koeyhdisteen kaksinkertaista laimennosta, jolloin koelää-keaineen alkukonsentraatio on 200 /ig/ml. Yksittäiset pesäkkeet jätetään huomioon ottamatta, kun levyt luetaan 18 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa. Koeorganismin herk-10 kyys (MIC) määritellään pienimpänä yhdisteen konsentraa-tiona, joka kykenee aikaansaamaan kasvun täydellisen estymisen arvosteltuna paljaalla silmällä. Muiden polysyklinen eetteri -antibioottien tavoin tämä kaavan (I) mukainen yhdiste osoittaa tyypillisesti gram-positiivisten baktee-15 rien vastaista aktiivisuutta samoin kuin myös aktiivisuutta lajia Treponema hyodysenteriae vastaan (sian dysenteri-an aiheuttaja), kuten on esitetty taulukossa (I).

Taulukko I

20 Kaavan (I) mukaisen yhdisteen in vitro -bakteerinvastainen aktiivisuus

Organismi Kanta nro MIC, uq/ml

Clostridium perfringens 10A006 0,39 25 10A009 0,20

Actinomyces pyogenes 14D002 0,39 14D008 0,39 14D011 0,39

Treponema hyodysenteriae 94A001 0,20 30 94A002 0,20 94A007 0,20

Tietoja kaavan (I) mukaisen yhdisteen ja sen suolojen tehokkuudesta kokkidiaali-infektioita vastaan kananpo-35 jilla saadaan seuraavan menetelmän avulla. Ryhmille, jois- n J Λ ^ · 1 13 V , 4 , , sa on 3 - 5 kymmenen päivän ikäistä patogeeneistä vapaata valkeaa leghorn-kukonpoikaa, syötetään soseruokavaliota, joka sisältää yhdistettä (I) tai sen natrium- ja/tai ka-liumsuolaa tasaisesti dispergoituna siihen. Sen jälkeen 5 kun kukin kukonpoika on ollut tämän ruoka-annoksen varassa 24 tunnin ajan, siihen istutetaan suun kautta testattavan Eimeia-lajin ookystia. Toisille ryhmille, joissa on 3 - 5 kymmenen päivän ikäistä kukonpoikaa, syötetään samanlaista soseruokavaliota ilman yhdistettä (I) tai sen suoloja. Ne 10 infektoidaan myös 24 tunnin kuluttua ja ne toimivat tartunnan saaneina kontrolleina. Vielä yhdelle toiselle ryhmälle, jossa on 3 - 5 kymmenen päivän ikäistä kukonpoikaa, syötetään samaa soseruokavaliuota ilman antibioottia ja niitä ei infektoida kokkidioilla. Nämä toimivat normaalei-15 na kontrolleina. Käsittelyn tulokset arvioidaan viiden päivän kuluttua E. acervulinan tapauksessa ja kuuden päivän kuluttua kaikkien muiden osalta.

Kriteerit, joita käytetään antikokkidiaalisen aktiivisuuden mittaamiseen, käsittävät vauriopisteet 0-4 20 E. tenellan tapauksessa J. E. Lynchin mukaan, "A New

Method of the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity”, Am. J. Vet. Res., 22, 324 -326, 1961; ja 0 - 3 muiden lajien tapauksessa, käyttäen perustana muunnelmaa arvoste-lujärjestelmästä, jonka ovat suunnitelleet J. Johnson ja 25 W. H. Reid, "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks”, Exp. Parasit., 28, 30 - 36, 1970. Aktiivisuus mitataan jakamalla kunkin käsitellyn ryhmän vauriopistemäärä tartunnan saaneen kontrollin vauriopistemäärällä. Tässä testissä 30 yhdiste (I) ja sen kationiset suolat osoittavat erinomaista aktiivisuutta Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti ja E. necatrix -infektioita vastaan siipikarjassa, kun niitä sisällytetään kananpoikien soseruoka-valioon pitoisuuksina noin 1,0 - 25 miljoonasosaa. Esimer-35 kiksi herkkää E. tenellaa vastaan kaavan (I) mukainen yh- 14 ^24'; 1 diste osoitti vaurioiden 100 % torjuntaa niin alhaisina annoksina kuin 5 miljoonasosaa.

Kysymyksessä oleva kaavan (I) mukainen yhdiste on myös yleensä hyödyllinen yhdistelmänä eräiden muiden tun-5 nettujen antikokkidiaalisten aineiden kanssa, kuten esimerkiksi nikarbatsiinin, 4,4'-dinitrokarbanilidin tai sellaisen naftaleeniamiinin kuin ovat määritelleet Hamill et ai., edellä mainittu US-patentti 4 582 822.

Kokkidioosin ehkäisemiseksi tai torjumiseksi siipi-10 karjassa kaavan (I) mukaista yhdistettä annetaan siipikarjalle suun kautta sopivassa kantaja-aineessa. Sopivasti sisällytetään lääke yksinkertaisesti juomaveteen tai siipikarjan rehuun, niin että terapeuttinen annos ainetta tulee nautituksi päivittäisen veden tai siipikarjan ravin-15 toannoksen mukana. Aine voidaan mitata suoraan juomaveteen, edullisesti nestemäisen konsentraatin muodossa, tai lisätä suoraan rehuun sellaisenaan tai esisekoitteen tai konsentraatin muodossa. Tavallisesti käytetään esisekoi-tetta tai konsentraattia, jossa on terapeuttinen aine kan-20 taja-aineessa, aineen sisällyttämiseen rehuun. Terapeuttinen aine voi olla olennaisesti puhtaassa muodossa (esim. vapaa happo tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola), sellaisessa analysoidussa raajassa muodossa kuin esimerkiksi märkä tai kuiva huovasto tai kuivattu koko kasvulie-’ 25 mi. Sopivat kantaja-aineet ovat nestemäisiä tai kiinteitä, tarpeen mukaan, kuten esimerkiksi vesi, erilaiset jauhot; esimerkiksi soijaöljyjauho, pellavansiemenöljyjauho, mais-sintähkäjauho, ja sellaiset kivennäisseokset, joita yleisesti käytetään siipikarjan rehuissa. Erityisen tehokas 30 kantaja-aine on siipikarjan rehu itse; toisin sanoen pieni osa siipikarjan rehusta. Kantaja-aine helpottaa aktiivisten aineiden tasaista jakautumista valmiiseen rehuun, jonka kanssa esisekoite sekoitetaan. Tämä on tärkeää, koska tarvitaan ainoastaan pieniä osuuksia kysymyksessä olevia 35 tehokkaita aineita. On tärkeää, että yhdiste sekoitetaan

II

15 .924'; 1 perinpohjaisesti esisekoitteeseen ja sen jälkeen rehuun. Tätä varten aine voidaan dispergoida tai liuottaa sellaiseen sopivaan öljymäiseen vehikkeliin kuin esimerkiksi soijaöljy, maissiöljy, puuvillansiemenöljy ja vastaavat 5 tai haihtuvaan orgaaniseen liuottimeen ja sitten sekoittaa kantaja-aineen kanssa. On selvää, että aktiivisen aineen osuudet konsentraatissa voivat vaihdella suuresti, koska aineen määrä valmiissa rehussa voidaan säätää sekoittamalla sopiva osuus esisekoitetta rehun kanssa terapeuttisen 10 aineen halutun tason aikaansaamiseksi.

Suurtehoisia konsentraatteja sekoittaa rehun valmistaja sellaisen proteiinipitoisen kantaja-aineen kanssa kuin esimerkiksi soijaöljyjauho ja muut jauhot, kuten yllä on kuvattu, väkevien täydennysvalmisteiden aikaansaamisek-15 si, jotka ovat sopivia suoraan syötettäviksi siipikarjalle. Sellaisissa tapauksissa siipikarjan annetaan nauttia tavallista ruokavaliuota. Vaihtoehtoisesti sellaisia väkeviä täydennysvalmisteita lisätään suoraan siipikarjan rehuun, niin että aikaansaadaan tasapuolisesti ravitseva 20 valmis rehu, joka sisältää terapeuttisesti tehokkaan pitoisuuden yhtä tai useampaa kaavan (I) mukaista yhdistettä. Seokset sekoitetaan perinpohjaisesti käyttäen yleisiä menetelmiä, kuten esimerkiksi kaksikuorisessa sekoittimes-sa, homogeenisuuden takaamiseksi.

25 Siipikarjalle käytettäessä tässä kuvatun yhdisteen käyttötasot vaihtelevat eri olosuhteissa. Jatkuva matalan tason lääkintä kasvuvaiheen aikana; toisin sanoen ensimmäisen 5-12 viikon aikana kananpojilla, on tehokas ehkäisevä toimenpide. Todettujen infektioiden hoidossa voi-30 daan tarvita suurempia määriä infektion voittamiseksi. Yhdisteen (I) käyttötaso rehussa on yleensä väliltä noin 1,0 - 25 miljoonasosaa, edullisesti väliltä noin 2,5 - 12,5 miljoonasosaa. Juomavedessä annettaessa taso on sellainen, joka aikaansaa saman päivittäisen lääkeannoksen 35 laskettuna keskimääräisen päivittäisen rehunkulutuksen ja 2 L. H , l keskimääräisen päivittäisen vedenkulutuksen painosuhteen avulla.

16

Kaavan (I) mukaisen yhdisteen ja sen suolojen aktiivisuus kasvun edistämisessä ja/tai ravinnon hyödyksi-5 käytön tehokkuuden lisäämisessä sioilla ja karjalla voidaan mitata suoraan syöttämällä eläinten koeryhmille erilaisia yhdisteen (I) tai sen suolan tasoja rehussa. Vaihtoehtoisesti esitetään GB-patenttijulkaisussa 1 197 826 yksityiskohtaisesti in vitro -pötsimenetelmä rehuissa ole-10 vien antibioottien arviointia varten.

Käytettäessä sikojen dysenterian ehkäisyssä tai hoidossa tai kasvun edistämisessä ja/tai ravinnon hyödyk-sikäytön tehokkuuden lisäämisessä karjalla tai sioilla kaavan (I) mukainen yhdiste tai sen suola annetaan edulli-15 sesti rehun lisäaineena. Rehut valmistetaan noudattaen menetelmiä, jotka vastaavat täysin yllä siipikarjan rehun valmistusta varten yksityiskohtaisesti selostettuja menetelmiä, huolehtien samalla tavoin sellaisten rehujen aikaansaamisesta, joissa terapeuttinen aine on tasaisesti 20 dispergoituna. Yhdisteen (I) käyttötaso karjan tai sikojen rehussa on yleensä väliltä noin 0,25 - 25 miljoonasosaa. Märehtijöille voidaan kaavan (I) mukainen yhdiste myös antaa suun kautta suuren pillerin muodossa, joka säilyy rumenoretikulaarisessa pussissa vapauttaen terapeuttista 25 ainetta suurin piirtein muuttumattomalla nopeudella pitki tetyn ajan, esim. 4-8 viikon, kuluessa, tarjoten annoksen, joka vastaa täysin yllä olevaa päivittäistä annosta rehussa, toisin sanoen: 30 keskimääräinen päivittäinen annos milligrammoina = (0,25 - 25) x keskimääräinen päivittäinen rehun miljoonasosaa kulutus kg:ina.

Il 17 i 1.4 i 1

Esimerkki sellaisesta kontrolloidusti vapauttavasta pilleristä on Cardinalin esittämä, ks. US-patentti 4 601 893.

Tätä keksintöä valaistaan seuraavien esimerkkien 5 avulla. Tulisi kuitenkin olla selvää, että keksintö ei rajoitu näiden esimerkkien erityisiin yksityiskohtiin.

Esimerkki 1

Actinoroadura sp. ATCC 53708:n fermentointi

Yhdisteen (I) eristäminen natriumsuolana 10 Lajia Actinomadura sp. kasvatettiin aluksi siirros- tamalla kiinteälle kasvualustalle vinopinnoille tai Roux-pulloihin ATCC 53708 -viljelmää, käyttäen ATCC-ravinto-alustaa nro 172, joka oli valmistettu seuraavasti ja omasi seuraavan koostumuksen.

15 grammaa/1itra glukoosi 10 liukoinen tärkkelys 20 hiivauute 5 kaseiinin entsymaattinen hydro- 1 20 lysaatti kalsiumkarbonaatti 1 tislattu vesi 1000 ml:aan asti; pH 7,0 KOH:n avulla; lisää agar 20 25 Sillä välin valmistettiin ravistuspulloja käyttäen jompaa kumpaa seuraavista ravintoalustoista: 18 iiA : 1 C' grammaa/litra JDYTT grammaa/litra sereloosi 10 sereloosi 10 soijajauho 10 maissitärkkelys 5 maissin fermen- 5 maissinliotus- 5 5 taatiokuiva-aine neste maissitärkkelys 10 kaseiinin entsy- 5 maattinen hydro-lysaatti natriumkloridi 5 kobolttikloridi 0,002 10 kobolttikloridi 0,002 kalsiumkarbonaati 3 kalsiumkarbonaatti 1 100 ml elatusainetta jaettiin 300 ml:n ravistuspul-loihin ja steriloitiin 120 °C:ssa paineessa 15 psi 30 mi-15 nuutin ajan. Jäähdyttämisen jälkeen ravintoalustaan siir-rostettiin vegetatiivinen solususpensio, joka oli kaavittu edellä mainitusta Actinomadura sp. -vinopintaviljelmästä. Pulloja ravistettiin 28 °C:ssa ravistelijassa, jonka siirtymä oli 3,8 - 6,4 cm ja nopeus 150 - 200 kierrosta minuu-20 tissa (CPM),5-7 päivän ajan.

Sillä välin valmistettiin 5 litran fermentointias-tioita, jotka sisälsivät 3 litraa jompaa kumpaa edellä olevista C- tai JDYTT-ravintoalustoista tai seuraavaa ravintoalustaa: 25 UKl-2 grammaa/litra sereloosi 45 soijajauho 10 maissinliotusneste 10 kobolttikloridi 0,002 30 magnesiumsulfaatti 0,10 kalsiumkarbonaatti 3 mangaanisulfaatti 0,10 ferrisulfaatti 0,10

II

19 ,,· : . 1 S il *·* , !

Lisättiin vaahdonestoainetta (polypropeeniglyko-li P2000, joka sisälsi 10 % eteenioksidia painon mukaan, 1 ml) ja astiat suljettiin ja steriloitiin 120 °C:ssa ja paineessa 15 psi .45 minuutin ajan. Astioihin siirrostet-5 tiin sitten yksi ravistuspullollinen (noin 3 % siirrostus-materiaalia), fermentointia suoritettiin 120 - 168 tunnin ajan 30 °C:ssa, sekoittaen nopeudella 1700 kierrosta minu-tissa (RPM) ja käyttäen ilman nopeutta yksi tilavuus ilmaa nesteen tilavuutta kohden minuutissa.

10 Kun fermentointi oli suoritettu loppuun (B. subti- lis ATCC 6633:a vastaan suoritetun antibioottilevykokeen perusteella), fermentorit pysäytettiin ja suodatettiin luonnollisessa pH:ssa piimään avulla. Suodatuskakku sekoitettiin lietteeksi metanoliin, konsentroitiin tyhjössä, 15 laimennettiin 2-3 tilavuudella vettä ja uutettiin sitten 2 X 1/3 - 1/2 tilavuudella joko metyyli-isobutyyliketonia tai n-butanolia. Liuotinkerros erotettiin vesifaasista imun tai sentrifugoinnin avulla, kuplitettiin ja konsentroitiin tyhjössä, jolloin saatiin kaavan (I) mukainen an-20 tibiootti raa'assa muodossa paksuna öljynä.

Kasvuliemen ja myöhempien talteenottovirtojen bio-aktiivisuutta voidaan seurata käyttäen herkkää Bacillus subtilis ATCC 6633- tai Staphylococcus aureus ATCC 6538-kantaa. Kasvuliemessä ja talteenottovirroissa olevat kom-25 ponentit voidaan tehdä silminnähtäviksi käyttämällä

Analtech -piidioksidi GF -levyjä ja eluenttina etyyliasetaattia. Kehitetyt levyt suihkutetaan vanilliinireagens-silla (3 g vanilliinia seoksessa, jossa on 75 ml etanolia ja 25 ml 85 % fosforihappoa) ja kuumennetaan 80 °C:seen.

30 Kaavan (I) mukainen antibioottituote näyttäytyy purppuran-värisenä täplänä. Kehitetty ohutkerroskromatografialevy voidaan myös päällystää agarilla, johon on siirrostettu joko bakteeria S. aureus tai B. subtilis ja johon on lisätty 2,3,5-trifenyyli-2H-tetratsoliumkloridimonohydraat-35 tia, ja inkuboida 37 °C:ssa 16 tunnin ajan antibiootin vi- 20 - · Λ > L *+ . ! sualisoimiseksi (valkeita täpliä vaaleanpunaista taustaa vasten).

Laajentaminen suuriin fermentointiastioihin suoritettiin valmistamalla ravistuspulloja, jotka sisälsivät 5 0,7 litraa C'- tai JDYTT-ravintoalustaa. Ravistuspullo- siirrostusmateriaalia kasvatettiin 5-7 päivän ajan 28 -°C:ssa ja se käytettiin siirrostuksen suorittamiseen 200 tai 6000 litran fermentointiastiaan, joka sisälsi vastaavasti 100 tai 4000 litraa UKl-2-ravintoalustaa. Suunnil-10 leen yksi litra siirrostusmateriaalia käytettiin kuhunkin säiliöön. Sen jälkeen kun fermentoinnit olivat jatkuneet 7 - 10 päivän ajan, ne otettiin talteen.

Pienemmän fermentointierän koko lientä uutettiin 50 litralla metyyli-isobutyyliketonia luonnollisessa pH-15 arvossa. Orgaaninen uute konsentroitiin tyhjössä sykloni-tislauslaitteessa ja kiertohaihduttimessa öljyksi. Tämä öljy kromatografoitiin kaksi kertaa käyttäen 500 g pylväs-laatua olevaa silikageeliä, joka oli lietetty heksaaniin. Ensimmäinen pylväs kehitettiin etyyliasetaatilla ja toinen 20 1:l-seoksella CHC13:asetoni. Tuotetta sisältävät fraktiot identifioitiin ohutkerroskromatografiän avulla käyttäen edellä kuvattua menetelmää. Toisesta silikageelipylväästä saadut aktiiviset fraktiot kromatografoitiin lopuksi käyttäen florisilia ja eluenttina 19:l-seosta CHC13:CH30H. Tuo-25 tetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, niitä ravistettiin laimean H3P04:n kanssa ja sitten dinatriumortofosfaattipus-kuriliuoksen kanssa natriumsuolan muodostamiseksi, kuivattiin Na2S04:n avulla, haihdutettiin ja jäännös kiteytettiin eetteristä kaavan (I) mukaisen yhdisteen natriumsuolan 30 eristämiseksi, 915 mg; sp. 245 - 249 °C, [α]ρ = -19,0° (c = 1, CH3OH) .

Analyysi laskettuna koostumukselle C45H77014Na: C 62,47; H 8,97 Saatu: C 62,89; H 9,22.

35 C13-NMR [kemiallinen siirtymä (miljoonasosia)

II

21 r) 2 H ; 1 CDCl3:ssa ja vetyjen lukumäärä suluissa] 182,8 (O), 110,0 (0) , 106,0 (0), 99,1 (1), 87,2 (1), 86,9 (O), 86,2 (0), 84.8 (1), 83,4 (O), 82,6 (1), 80,2 (1), 78,5 (1), 75,2 (1) , 74,8 (1), 74,6 (1), 66,4 (1), 60,3 (3), 57,9 (3), 5 56,9 (3), 44,5 (1), 39,0 (1), 36,9 (1), 36,8 (2), 35,9 (2) , 35,4 (2), 35,2 (2), 35,1 (1), 35,0 (1), 31,3 (2), 30.9 (2), 30,5 (1), 28,2 (3), 27,1 (2), 26,1 (2), 25,0 (3) , 21,0 (3), 18,3 (3), 16,7 (3), 15,3 (3), 13,4 (3), 13,1 (3), 11,2 (3), 10,7 (3) ja 10,6 (3).

10

Suuren säiliön fermentoinnin koko kasvuliemen jatkokäsittely suoritettiin uuttamalla kaikki suunnilleen 4000 litraa kasvulientä 1800 litralla metyyli-isobutyyli-ketonia, erottamalla liuotin Podbielnack-uuttolaitteen 15 avulla ja konsentroimalla liuotin ohueksi siirapiksi tyhjössä. Konsentraattia hierrettiin 2 kertaa yhtä suuren tilavuuden kanssa laimentamatonta metanolia, erotettiin metanoliin liukenemattomasta öljystä ja metanolijäännös konsentroitiin tyhjössä siirapiksi. Viimeksi mainittua 20 uutettiin 2X heksaanilla ja yhdistettyä heksaania uutettiin asetonitriilillä. Asetonitriili säilytettiin myöhempää talteenottoa varten. Heksaani konsentroitiin sitten tyhjössä ja panoskromatografoitiin sitten käyttäen silika-geeliä. Silikageeliä desorboitiin suodatussuppilossa ensin 25 heksaanilla, sitten metyleenikloridilla, etyyliasetaatilla ja lopuksi asetonilla. Aktiiviset fraktiot, jotka olivat CH2Cl2-ja etyyliasetaattieluaateissa, konsentroitiin, liuotettiin heksaaniin ja pestiin happamalla vedellä ja uutettiin sitten 1 % N-metyyli-D-glukamiinilla vedessä. Vesi-30 faasi suolattiin natriumkloridilla ja uutettiin 2X yhtä suurella tilavuudella etyyliasetaattia. Orgaaniset kerrokset yhdistettiin, käsiteltiin aktiivihiilellä, suodatettiin, pestiin pH-arvon 9,0 omaavalla natriumfosfaattipus-kuriliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatin avulla, kon-35 sentroitiin tyhjössä ja kiteytettiin eetteristä, jolloin 22 ο o 4 ·' 1 S L. "Λ . ! saatiin 50,8 g natriumsuolaa, joka oli identtistä pienemmän mittakaavan fermentoinnin tuotteen kanssa.

Esimerkki 2

Yhdiste (I) vapaan hapon muodossa 5 Kaavan (I) mukaisen antibiootin vapaa happomuoto valmistettiin ravistamalla voimakkaasti natriumsuolan kloroformi liuosta yhtä suuren tilavuuden kanssa kloorivety-happoa pH-arvossa 2 erotussuppilossa. Faasit erotettiin ja kloroformikerros pestiin vedellä ja haihdutettiin sitten 10 tyhjössä, jolloin saatiin vapaa happo: sp. 87 - 90 °C; [^]¾ = “6,9° (c = 1, metanoli).

Analyysi laskettuna koostumukselle C45H780i4.0,5H20: C 63,43; H 9,34

Saatu: C 63,35; H 9,53.

15 Esimerkki 3

Yhdisteen (I) natriumsuola

Edellä olevan esimerkin vapaata happoa (45 mg) liuotettiin 100 ml:aan kloroformia. Liuos, jossa oli natriumkarbonaattia (0,5 g) vedessä (100 ml), lisättiin ja 20 tulokseksi saatu seos pantiin sitten erotussuppiloon ja ravistettiin voimakkaasti usean minuutin ajan. Kloroformi-kerros erotettiin ja vesikerros pestiin uudella kloroformilla. Yhdistetyt kloroformiuutteet kuivattiin natriumsul-faatin avulla, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saa-25 tiin 41 mg natriumsuolaa; sp. 230 - 235 °C.

Analyysi laskettuna koostumukselle C^H^O^Na: C 62,47; H 8,97 Saatu: C 62,20; H 9,14.

Esimerkki 4 30 Yhdisteen (I) rubidiumsuola

Kaavan (I) mukaisen yhdisteen rubidiumsuolan valmistamiseksi vapaata happoa (30 mg) liuotettiin 50 ml:aan kloroformia. Rubidiumkarbonaattia (35 mg 25 ml:ssa vettä) lisättiin kloroformiin ja seosta sekoitettiin 2 tunnin 35 ajan. Orgaaninen faasi erotettiin ja vesikerrosta uutettiin yhtä suurella tilavuudella kloroformia. Yhdistetyt

II

23 924; 1 kloroformiuutteet haihdutettiin, jolloin saatiin valkea kiinteä aine. Rubidiumsuola uudelleenkiteytettiin hitaasti haihduttamalla eetteristä ja tulokseksi saaduille kiteille suoritti röntgensäderakennemäärityksen tri J. Bordner.

5 Esimerkki 5

Yhdisteen (I) kaliumsuola

Kaavan (I) mukaisen antibioottiyhdisteen kalium-suolan valmistamiseksi vapaata happoa liuotettiin 130 mg 100 ml:aan kloroformia. Lisättiin K2C03 (100 mg) 100 ml:ssa 10 H20 ja tulokseksi saatua seosta sekoitettiin usean minuutin ajan ja se pantiin sitten erotussuppiloon ja ravistettiin voimakkaasti usean minuutin ajan. Orgaaninen faasi erotettiin ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin yhdiste (I) valkeana jauheena; sp. 255 - 260 °C, [α]ρ = -19,6° 15 (c = 1, kloroformi).

Analyysi laskettuna koostumukselle C^H^OmK: C 61,34; H 8,81 Saatu: C 60,91; H 8,83.

Claims (5)

1. Menetelmä polysyklisen eetteriantibiootin valmistamiseksi, jolla on kaava

5 OMe / f ζν""' Me I jMe Q \ Me Me MeO ' = .. T u f

10. I IΓ—λ Me f—k Me I—» H J v -Me ho'c\^A^^0,,-%obJ^v X-/, XX Χ-£»·η L lH 0 H °(τ) Γ HO° W OH 15 jossa Me = CH3, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän ka-tionisen suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että Actinomadura sp. ATCC 53708:a fermentoidaan vedenalaisissa aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa ravinto-alustassa, joka sisältää assimiloituvan hiili- ja typpi- 20 lähteen, kunnes talteen otettavissa oleva määrä mainittua yhdistettä on muodostunut.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksessa 1 esitetyn kaavan mukainen yhdiste eristetään natrium- tai ka- 25 liumsuolan muodossa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksessa 1 esitetyn kaavan mukainen yhdiste erotetaan fermentointiliuok-sesta.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksessa 1 esitetyn kaavan mukainen yhdiste otetaan saostetussa muodossa talteen seoksena, joka sisältää huovaston, suodattamalla fermentointiliuos.

5. Actinomadura sp. ATCC 53708. Il:: 25 1