FI90353C - Plasmid for expression of human manganese superoxide dismutase in bacteria and method for producing and recovering enzymatically active human manganese superoxide dismutase - Google Patents

Description

1 903531 90353

Plasmidi humaani mangaanisuperoksididismutaasin ilmentåmisek-si bakteereissa sekå menetelmå entsymaattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tuottamiseksi ja tal-teenottamiseksiPlasmid for expression of human manganese superoxide dismutase in bacteria and a method for producing and recovering enzymatically active human manganese superoxide dismutase

Esillå olevassa hakemuksessa viitataan erilaisiin julkaisui-hin arabialaisin numeroin, jotka ovat suluissa. Tåydellisiå lainauksia nåistå viitteistå voidaan loytåå patenttihakemuk-sen lopusta vålittomåsti ennen patenttivaatimuksia. Nåmå jul-kaisut kokonaisuudessaan on tåsså yhteydesså sisållytetty viitteinå esillå olevaan hakemukseen kyseisen tutkimusalan tunnetun alueen kuvaamiseksi tåydellisemmin henkildille, jotka ovat aiheeseen perehtyneet, sellaisena kuin kyseinen tut-kimusalue tunnetaan esillå olevan keksinnon ja patenttivaati-musten esitysajankohtana.The present application refers to various publications in Arabic numerals in parentheses. Complete citations of these references can be found at the end of the patent application immediately before the claims. These publications in their entirety are incorporated herein by reference in the present application to more fully describe the known field of research to those skilled in the art, as known at the time of filing of the present invention and claims.

McCord ja Fridovich (1) loysivåt vuonna 1968 superoksididis-mutaasin (SOD) sekå vapaiden happiradikaalien (02—) ilmene-misen. Superoksidiradikaaleja sekå muita erittåin reaktiivi-sia happilajeja valmistuu jokaisessa hengittåvåsså solussa sivutuotteina oksidatiivisessa hajoamisessa moniksi erilai-siksi makromolekyyleiksi ja solunkomponenteiksi (selonteon suhteen katso 2, 3). Metalloproteiinien ryhmå, joka tunnetaan superoksididismutaaseina, katalysoi hapetus-pelkistysreak-tiota 202~ + 2H+ -* H202 + 02 ja antaa tåten kåyttddn torjun-tamekanismin hapen myrkyllisyyttå vastaan.In 1968, McCord and Fridovich (1) lysed superoxide dismutase (SOD) and the expression of free oxygen radicals (02—). Superoxide radicals as well as other highly reactive oxygen species are produced in each respirable cell as by-products of oxidative degradation to a variety of macromolecules and cellular components (see 2, 3 for a description). A group of metalloproteins known as superoxide dismutases catalyzes the oxidation-reduction reaction of 202 ~ + 2H + - * H2O2 + O2 and thus provides a control mechanism against oxygen toxicity.

On olemassa useita tunnettuja SOD:n muotoja, jotka sisåltåvåt erilaisia metalleja ja erilaisia proteiineja. SOD:sså låsnå oleviin metalleihin kuuluvat rauta, mangaani, kupari sekå sinkki. SOD:n tunnetuista muodoista kaikki katalysoivat samaa reaktiota. Nåmå entsyymit esiintyvåt monissa kehitysryhmisså. Superoksididismutaaseja, jotka sisåltåvåt rautaa, on ensisi-jaisesti prokaryoottisissa soluissa. Superoksididismutaaseja, joissa on kuparia ja sinkkiå, on loydetty oleellisesti kaikista eukaryoottisista organismeista (4). Superoksidi- dismutaaseja, jotka sisaltavat mangaania, on loydetty organis- meista, jotka ulottuvat mikro-organismeista ihmiseen saakka.There are several known forms of SOD that contain different metals and different proteins. The metals present in SOD include iron, manganese, copper and zinc. Of the known forms of SOD, all catalyze the same reaction. These enzymes are present in many developmental groups. Superoxide dismutases containing iron are predominant in prokaryotic cells. Superoxide dismutases with copper and zinc have been found in essentially all eukaryotic organisms (4). Superoxide dismutases containing manganese have been found in organisms ranging from microorganisms to humans.

9035390353

Koska jokainen biologinen makromolekyyli voi toimia voimakkaan superoksidiradikaalin tuhoavan toiminnan kohteena, on kehittynyt mielenkiintoa SOD:n terapeuttisia mahdollisuuksia kohtaan. Tie-teellinen kirjallisuus esittaa, etta SOD saattaa olla kaytto-kelpoinen kliinisten sovellutusten laajalla alueella. Nåihin kuuluvat kasvaimen synnyn ja kasvun estaminen seka syovanvastais-ten laakkeiden (10) sytotoksisten ja sydantoksisten vaikutusten våhentaminen, verettomien kudosten suojaus (12) seka siittioiden suojaus (13). Lisaksi esiintyy mielenkiintoa tutkia SOD vaikutuk-sia vanhenemistapahtumaan (14).Because each biological macromolecule can serve as a target for the destructive action of a potent superoxide radical, interest has developed in the therapeutic potential of SOD. The scientific literature suggests that SOD may be useful in a wide range of clinical applications. These include the prevention of tumorigenesis and growth, as well as the reduction of the cytotoxic and cardiotoxic effects of anticancer drugs (10), the protection of bloodless tissues (12) and the protection of sperm (13). In addition, there is interest in studying the effects of SOD on the aging event (14).

Humaani SOD:n terapeuttisten mahdollisuuksien tutkimus on ollut rajoitettua, mika johtuu sen rajoitetusta saannista.Research into the therapeutic potential of human SOD has been limited due to its limited intake.

Superoksididismutaasilla on myos mielenkiintoa sen tulehduksen-vastaisten ominaisuuksien vuoksi (11). Harastå saadulla superoksididismutaasilla (orgoteiinilla) on havaittu tulehduksenvastai-sia ominaisuuksia, ja sita myydaan talla hetkella Euroopan osissa ihmislaakkeena. Sita myydaan myos Yhdysvalloissa elainlaakinta-valmisteena, erityisesti hevosten tulehtuneiden janteiden hoitoa vårten. Kuitenkin orgoteiinin saanti on rajoitettua. Aiemmilla tekniikoilla, joihin kuuluu orgoteiinin saanti haran- tai muista elainsoluista, on vakavia rajoituksia, ja nain saatu orgoteiini saattaa saada aikaan ihmisessa allergisia reaktioita, koska se ei ole peraisin ihmisesta.Superoxide dismutase is also of interest due to its anti-inflammatory properties (11). Superoxide dismutase (orgotein) obtained from Harasta has been shown to have anti-inflammatory properties and is currently sold in parts of Europe as a human medicine. Sita is also sold in the United States as an animal medicine, especially for the treatment of inflamed tendons in horses. However, the intake of orgotein is limited. Prior techniques involving the uptake of orgotein from prickly or other living cells have severe limitations, and the orgotein thus obtained may cause allergic reactions in humans because it is not of human origin.

Kuparisinkkisuperoksididismutaasi (CuZn SOD) on superoksidi-dismutaasin erilaisista muodoista eniten tutkittu ja parhaiten karakterisoitu.Copper zinc superoxide dismutase (CuZn SOD) is the most studied and best characterized of the various forms of superoxide dismutase.

Humaani CuZn SOD on dimeerinen metalliproteiini, joka koostuu identtisista, ei kovalenttisesti kytketyista alayksikoista, jois-ta kullakin molekyylipaino on 16 OOO daltonia ja jotka sisaltavat yhden atomin kuparia ja yhden sinkkia (5). Kukin alayksikko koostuu 153 aminohaposta, joiden sekvenssi on maaritetty (6, 7).Human CuZn SOD is a dimeric metal protein composed of identical, non-covalently linked subunits, each with a molecular weight of 16,000 daltons, containing one atom of copper and one zinc (5). Each subunit consists of 153 amino acids with a defined sequence (6, 7).

3 903533 90353

Humaani CuZn-superoksididismutaasia koodittava cDNA on kloonat-tu (8). Kloonatun DNA : n taydellinen sekvenssi on myos rnaari-tetty (9). Ennen kaikkea on kuvattu (24, 25) ilmentymisvekto-reita, jotka sisaltavat DNA:a koodittavaa superoksididismutaasia superoksididismutaasin valmistamiseksi bakteereissa seka erista-miseksi niista. Superoksididismutaasi-DNA:n ilmentyminen seka SOD:n valmistus hiivassa on myos julkaistu (26).The cDNA encoding human CuZn superoxide dismutase has been cloned (8). The complete sequence of the cloned DNA has also been sequenced (9). In particular, expression vectors containing DNA-encoding superoxide dismutase for the production of and isolation of superoxide dismutase in bacteria have been described (24, 25). Expression of superoxide dismutase DNA as well as the production of SOD in yeast has also been reported (26).

Askettain on karakterisoitu CuZn SOD-geenilokus humaani kromo-somilla 21 (27), ja viimeaikaiset kehitystulokset, jotka koske-vat CuZn superoksididismutaasia , on esitetty yhteenvetona (28).The Su gene locus of CuZn has been characterized ascetically by human chromosome 21 (27), and recent developments concerning CuZn superoxide dismutase are summarized (28).

Huomattavasti vahemman tiedetaan mangaanisuperoksididismutaasista (MnSOD).E. coli K-12:n MnSOD on askettain kloonattu ja kartoi-tettu (22). Barra et al. julkaisevat 196 aminohapon mittaisen aminohapposekvenssin MnSOD-polypeptidille, joka on eristetty humaani maksasoluista (19). Aiemmat julkaisut eroavat kuitenkin sen seikan suhteen, mita tulee MnSOD-molekyylin rakenteeseen, onko siina kaksi tax nelja identtista polypeptidialayksikkoa (19, 23). On kuitenkin selvaa, etta MnSOD-polypeptidi ja CuZn SOD-polypeptidi eivat ole homologisia (19). Eri lahteista saatujen MnSOD:den ja FeSOD:den aminohapposekvenssien homologioi-ta on myos verrattu (18).Much less is known about manganese superoxide dismutase (MnSOD) .E. The MnSOD of coli K-12 has been stepwise cloned and mapped (22). Barra et al. disclose a 196 amino acid amino acid sequence for an MnSOD polypeptide isolated from human liver cells (19). However, previous publications differ in the structure of the MnSOD molecule as to whether it is two tax four identical polypeptide subunits (19, 23). However, it is clear that the MnSOD polypeptide and the CuZn SOD polypeptide are not homologous (19). The homology of the amino acid sequences of MnSODs and FeSODs from different sources has also been compared (18).

Baret et al. julkaisevat, etta rotalla humaani MnSOD:n puoliin-tumisaika on oleellisesti pitempi kuin humaani Cu SOD:n puoliin-tumisaika; he julkaisevat myos, etta rotalla humaani MnSOD ja rotan Cu SOD eivat ole tehokkaita tulehduksenvastaisina aineina, kun taas haran Cu SOD ja humaani Cu SOD ovat taysin aktiivisia (20).Baret et al. disclose that the half-life of human MnSOD in rats is substantially longer than the half-life of human Cu SOD; they also report that rat MnSOD and rat Cu SOD are not effective as anti-inflammatory agents, whereas haran Cu SOD and human Cu SOD are fully active (20).

McCord et al. julkaisevat tiedon, jonka mukaan luonnossa esiin-tyva humaani mangaanisuperoksididismutaasi suojaa ihmisen fagosy-. . toivia liuskatumaisia ( PMN) leukosyytte ja superoksidin vapailta radikaaleilta paremmin kuin haran tai sian CuZn superoksidi-dismutaasi "in vitro"-kokeissa (21).McCord et al. publish information that naturally occurring human manganese superoxide dismutase protects human phagosy. . desire stripe-like (PMN) leukocyte and superoxide free radicals better than branch or porcine CuZn superoxide dismutase in in vitro experiments (21).

4 SO 3534 SO 353

Keksinnosså on kyse humaani mangaanisuperoksididismutaasin polypeptidianalogista, joka kåsittåå 199 aminohappoa, jonka sekvenssisså on metioniini N-pååsså ja jolla on kuviossa 1 annettu mååråtty sekvenssi. Barra et al., J. Biol. Chem., 259: 12595-12601, (1984) toisaalta esittåå sivun 12596 ku viossa 1 196 aminohappoa kåsittåvån mangaanisuperoksididismutaasin, jonka N-påå on lysiini. Edelleen Barra et al. ei esi-tå tai edes ehdota, ettå mangaanisuperoksididismutaasi, jolla on kolme lisåaminohappoa, voisi olla aktiivinen entsyymi. On huomattava, ettå lukuunottamatta esillå olevan polypeptidin N-påån lisåmetioniinia, kaksi muuta lisåaminohappoa, Gly-Trp, sijaitsevat molekyylin keskellå.The invention provides a polypeptide analog of human manganese superoxide dismutase comprising 199 amino acids having a methionine at the N-terminus and having the predetermined sequence given in Figure 1. Barra et al., J. Biol. Chem., 259: 12595-12601, (1984), on the other hand, shows a manganese superoxide dismutase comprising 1,196 amino acids at the N-terminus of lysine in the figure of page 12596. Further, Barra et al. does not suggest or even suggest that a manganese superoxide dismutase having three additional amino acids could be an active enzyme. It should be noted that, with the exception of the additional N-terminal methionine of the present polypeptide, the other two additional amino acids, Gly-Trp, are located in the center of the molecule.

Esillå olevan polypeptidin ja viitteen Barra et al. mukaisen polypeptidin vålillå on kolme eroavuutta siinå, ettå esillå olevassa polypeptidisså kolmessa paikassa on glutaamihappo-tåhde (Glu), joissa kohdissa Barra et al. esittåå glutamiini-tåhteen (Gin). Siten on kuusi pååeroa esillå olevan polypeptidin ja viitteen Barra et al. mukaisen polypeptidin vålillå (nimittåin kolme lisåaminohappoa ja kolme erilaista aminohappoa) .The present polypeptide and reference Barra et al. There are three differences between the polypeptide of the present invention in that the present polypeptide has a glutamic acid residue (Glu) at three sites, where Barra et al. represents a glutamine residue (Gin). Thus, there are six main differences between the present polypeptide and the reference by Barra et al. (namely three additional amino acids and three different amino acids).

Viite Barra et al. ei esitå nyt esitettyå erityistå aminohap-posekvenssiå eikå se myoskåån ehdota, ettå se voitaisiin il-mentåå bakteereissa, eikå varmasti ollut ilmeistå, ettå siten ilmennettynå se olisi ollut entsymaattisesti aktiivinen. To-siasiassa Barra et al. ei edes keskustele 196 aminohappoa kåsittåvån mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattisesta aktiivisuudesta. Siten alan ammattimiehelle ei olisi ollut ilmeistå, ettå esillå oleva keksint6, erityisesti superoksi-didismutaasin erityinen polypeptidianalogi, joka kåsittåå 199 aminohappoa, olisi entsymaattisesti aktiivinen.Reference Barra et al. does not disclose the particular amino acid sequence now presented, nor does it suggest that it could be expressed in bacteria, and it was certainly not obvious that, when so expressed, it would have been enzymatically active. In fact, Barra et al. does not even discuss the enzymatic activity of the 196 amino acid manganese superoxide dismutase. Thus, it would not have been apparent to one skilled in the art that the present invention, in particular a specific polypeptide analog of superoxide didismutase comprising 199 amino acids, is enzymatically active.

Viitteen Barra et al. sivulla 12598 våitetåån, ettå "kaikissa mangaanisuperoksididismutaaseissa on 7 glysiinitåhdettå ase-missa 76, 77, 94, 101, 112, 130 ja 132 ja 3 proliinitåhdettå asemissa 5, 165 ja 170. Kaikkien tåhteiden pitåisi olla oleellisia sekundåårisen rakenteen yllåpitåmiseksi." Haluamme 5 90353 painottaa, ettå esillå olevassa polypeptidisså låsnå olevat kaksi lisåaminohappoa sijaitsevat kohdissa 122 ja 123, jotka sijaitsevat viitteesså Barra et al. viitatun kriittisen alu-een keskellå. Toinen nåistå kahdesta lisåaminohaposta on gly-siinitåhde ja Barra et al. tunnustaa, ettå glysiinitåhteet ovat tårkeitå sekundåårisen rakenteen yllåpitåmiseksi. Viit-teen Barra et al. mukaisessa sekvenssisså ei ole nåitå lisåglys iinitåhtei tå.Reference Barra et al. on page 12598 it is claimed that "all manganese superoxide dismutases have 7 glycine residues at positions 76, 77, 94, 101, 112, 130 and 132 and 3 proline residues at positions 5, 165 and 170. All residues should be essential to maintain the secondary structure". We would like to emphasize that the two additional amino acids present in the present polypeptide are located at positions 122 and 123, which are located in Barra et al. in the middle of the referenced critical area. One of these two additional amino acids is the glycine residue and Barra et al. recognizes that glycine residues are important for maintaining the secondary structure. Reference is made to Barra et al. In the sequence according to the invention there is no such additional glycine residue.

Lisåksi haluaitime painottaa, ettå kaksi glutamiinihapon muu-tosta glutamiiniksi ovat myos molekyylin keskellå (tåhteet 88 ja 109) ja nåmå muutokset aminohapposekvenssisså vaikuttavat molekyylivaraukseen, mikå vaikuttaisi myos polypeptidin las-kostumiseen ja siten polypeptidin aktiivisuuteen.In addition, it is desirable to emphasize that the two changes of glutamic acid to glutamine are also in the middle of the molecule (residues 88 and 109) and that these changes in amino acid sequence affect the molecular charge, which would also affect the folding of the polypeptide and thus the activity of the polypeptide.

On hyvin tunnettua tekniikan tasossa, ettå entsymaattisesti aktiivinen polypeptidi on oikean primåårisen, sekundåårisen tai tertiåårisen rakenteen tulos. Jos joko primåårinen, se-kundåårinen tai tertiåårinen rakenne muuttuu, entsymaattinen aktiivisuus voi muuttua.It is well known in the art that an enzymatically active polypeptide is the result of the correct primary, secondary or tertiary structure. If either the primary, secondary or tertiary structure changes, the enzymatic activity may change.

Siten kuusi muutosta esillå olevan polypeptidin aminohappo-jårjestyksesså tai "primåårisesså" rakenteessa (joista neljå ovat molekyylin keskellå) voisi vaikuttaa sekundååriseen ja tertiååriseen (konformationaaliseen) polypeptidin rakentee-seen. Siten polypeptidin entsymaattinen aktiivisuus voisi muuttua. Kuten edellå on esitetty, jopa viite Barra et al. ehdottaa, ettå aminohappotåhteiden, jotka muodostavat luon-nollisesti esiintyvån hMbnSOD:n primåårisen rakenteen, pitåi-si olla relevantteja sekundåårisen rakenteen yllåpitåmiseksi.Thus, six changes in the amino acid sequence or "primary" structure (four of which are in the middle of the molecule) of the present polypeptide could affect the secondary and tertiary (conformational) structure of the polypeptide. Thus, the enzymatic activity of the polypeptide could be altered. As discussed above, even reference Barra et al. suggests that amino acid residues that form the primary structure of naturally occurring hMbnSOD should be relevant for maintaining the secondary structure.

EP-hakemusjulkaisussa 138 111 esitetåån humaani Cu-Zn-supe-. . roksididismutaasin kloonaus ja ilmentåminen E. colissa ja hiivassa. Kuitenkin Cu-Zn-superoksididismutaasi ei ole sukua MnSOD:lle eikå nåiden kahden entsyymin vålillå ole sekvens-sihomologiaa (katso Barra et al., sivu 12597). Siten Cu-Zn- 90 353 entsyymin kloonaus ja ilmentåminen ei millåån tavoin opeta tai ehdota miten kloonataan tai ilmennetåån entsymaattisesti aktiivista MnSOD:tå.EP-A-138 111 discloses a human Cu-Zn super-. . cloning and expression of roxide dismutase in E. coli and yeast. However, Cu-Zn superoxide dismutase is not related to MnSOD and there is no sequence homology between the two enzymes (see Barra et al., Page 12597). Thus, cloning and expression of the Cu-Zn-90 353 enzyme in no way teaches or suggests how to clone or express enzymatically active MnSOD.

Esillå oleva keksinto koskee plasmidia humaani mangaanisuper-oksididismutaasin analogin ilmentåmiseksi prokaryoottisessa isåntåsolussa.The present invention relates to a plasmid for expressing a human manganese superoxide dismutase analog in a prokaryotic host cell.

Esillå oleva keksinto antaa edelleen kåyttoon menetelmån entsymaattisesti aktiivisen humaani MnSOD:n valmistusmenetelmån bakteereissa sekå menetelmån tållaisen entsymaattisesti aktiivisen humaani MnSOD:n talteenottamiseksi sekå puhdistami- seksi.The present invention further provides a method of producing enzymatically active human MnSOD in bacteria, as well as a method of recovering and purifying such enzymatically active human MnSOD.

Esillå oleva menetelmå koskee myds humaani mangaanisuperoksi-didismutaasin tai sen analogien tai mutanttien kåyttoå kata-lysoimaan superoksidiradikaaleja vetyperoksidiksi ja molekyy-limuodossa esiintyvåksi hapeksi. Erityisesti esillå oleva keksinto koskee bakteereiden avulla valmistetun MnSOD:n tai sen analogien tai mutanttien kåyttoå våhentåmåån paikallista verettomyyttå seuraavan uudelleenperfuusion aiheuttamaa vau-riota sekå pidentåmåån leikattujen, eristettyjen elinten elinaikaa.The present method relates to the use of myds human manganese superoxide didismutase or analogs or mutants thereof to catalyze superoxide radicals to hydrogen peroxide and oxygen in molecular form. In particular, the present invention relates to the use of bacterial MnSOD or analogs or mutants thereof to reduce local anemia following reperfusion injury and to prolong the lifespan of cut, isolated organs.

DNA-molekyyli, joka sisåltåå cDNA:n, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaaspolypeptidiå tai sen analogia tai mutanttia, on eristetty humaani T-solukirjastosta. On saatu selville kaksisåikeisen DNA-molekyylin nukleotidisekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiå tai sen analogia tai mutanttia. Yhden såikeen sekvenssi, joka koodittaa polypeptidiå tai sen analogia, esitetåån kuvassa 1, nukleotidista 115 geenin alapuolelle nukleotidiin 708 saakka, viimeksi mainittu mukaan lukien. Muut sekvenssit, jotka koodit-tavat analogia tai mutanttia, saattavat olla suurin piirtein samanlaisia kuin såie, joka koodittaa polypeptidiå. Kaksisåikeisen DNA-molekyylin yhden såikeen nukleotidisekvenssi, joka 7 90353 koodittaa 24 aminohapon mittaista esipeptidia nukleotideista numero 43-114, mainitut nukleotidit mukaanlukien, esitetaån myos kuvassa 1.A DNA molecule containing a cDNA encoding a human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog or mutant thereof has been isolated from a human T cell library. The nucleotide sequence of a double-stranded DNA molecule encoding a human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog or mutant thereof has been found. The sequence of a single strand encoding a polypeptide or analog thereof is shown in Figure 1, from nucleotide 115 below the gene to nucleotide 708, inclusive. Other sequences encoding an analog or mutant may be approximately similar to the strand encoding the polypeptide. The nucleotide sequence of a single strand of a double-stranded DNA molecule, which encodes a 24 amino acid prepeptide from nucleotides 43-114, including said nucleotides, is also shown in Figure 1.

Kaksisaikeinen cDNA tai jokin muu kaksisaikeinen DNA-molekyyli, joka sisåltaa nukleotidisåikeen, jossa on sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidia tai sen analogia tai mutanttia, saatetaan sisallyttaa kloonausvehikkeliin, kuten esimerkiksi plasmidiin tai virukseen. Kumpikin DNA-molekyyli saatetaan vieda sisaan soluun, joko prokaryoottiseen, esimerkiksi bakteerisoluun, tai eukaryoottiseen soluun, esimerkiksi hiiva- tai nisåkåssoluun, tunnettuja menetelmia kåyttåmållå, mukaanluettuina menetelmat, mutta ei niihin rajoittuen, joihin sisaltyvat kloonausvehikkelit, jotka sisaltavat jomman kumman molekyylin.A double-stranded cDNA or other double-stranded DNA molecule containing a nucleotide strand having a sequence encoding a human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog or mutant thereof may be included in a cloning vehicle such as a plasmid or virus. Each DNA molecule may be introduced into a cell, either a prokaryotic cell, e.g., a bacterial cell, or a eukaryotic cell, e.g., a yeast or mammalian cell, using known methods, including, but not limited to, methods involving cloning vehicles containing any of the following.

Mieluummin cDNA tai DNA, joka koodittaa humaani mangaanisuper-oksididismutaasipolypeptidia tai sen analogia tai mutanttia, liitetåan plasmidiin, esim. pMSE-4:aan tai pMSARB4:aan, ja sitten se viedaan sopivaan isantåsoluun, jossa DNA voi ilmentya ja humaani mangaanisuperoksididismutaasi-, (hMnSOD)-polypeptidi : : : tai sen analogi tai mutantti voidaan valmistaa. Edullisiin isantasoluihin kuuluvat Escherichia coli, erityisesti E. coli A4255 seka E. coli A1645. Plasmidi pMSE-4, E. colin kannassa .: A4255, on tallennettu the American Type Culture Collectioniin ATCC-tulonumerolla 53250. Plasmidi pMSARB4 voidaan saada kuvassa 4 esitetylla tavalla ja kuten kuvataan kuvia koskevassa ku-vauksessa.Preferably, the cDNA or DNA encoding the human manganese superoxide dismutase polypeptide or analog or mutant thereof is ligated into a plasmid, e.g., pMSE-4 or pMSARB4, and then introduced into a suitable host cell where the DNA can be expressed and the human manganese superoxide ) polypeptide::: or an analog or mutant thereof can be prepared. Preferred host cells include Escherichia coli, especially E. coli A4255 and E. coli A1645. Plasmid pMSE-4, E. coli strain: A4255, is deposited in the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 53250. Plasmid pMSARB4 can be obtained as shown in Figure 4 and as described in the image description.

Soluja, joihin sellaisia DNA-molekyyleja on viety sisaan, voidaan viljella tai kasvattaa aiheeseen perehtyneelle tutuin menetelmin, sopivissa olosuhteissa, jotka sallivat DNA:n trans-kription mRNA:aan seka mRNA:n ilmentymisen proteiinina. Synty-va mangaanisuperoksididismutaasiproteiini voidaan sitten ottaa talteen.Cells into which such DNA molecules have been introduced may be cultured or grown by methods known to those skilled in the art, under appropriate conditions which allow transcription of the DNA into the mRNA as well as expression of the mRNA as a protein. The resulting manganese superoxide dismutase protein can then be recovered.

8 903538 90353

Voidaan rayos valmistaa elåinlååketieteellisiå ja farmaseutti-sia koostumuksia, jotka sisåltåvåt humaani MnSOD:a tai sen ana-logeja tai mutantteja seka sopivia kantaja-aineita. Tata humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja tai mutantteja voidaan kayttaa katalysoimaan seuraavaa reaktiota: 20 *· + 2H+ -> H202 -i- 02 ja tåten voidaan vahentaa solun tulehdusta, jonka superoksidira-dikaalit ovat aiheuttaneet.Rayos can be used to prepare veterinary and pharmaceutical compositions containing human MnSOD or analogs or mutants thereof, as well as suitable carriers. Tata human manganese superoxide dismutase or its analogs or mutants can be used to catalyze the following reaction: 20 * · + 2H + -> H 2 O 2 -O 2 and thus can reduce cell inflammation caused by superoxide radicals.

Tarkemmin sanottuna, naitå entsyymeja tai niiden analogeja tai mutantteja saatetaan kayttaa våhentåmåån tulehdusta, jonka aiheuttaa paikallista verettomyytta seuraava uudelleenperfuusio, leikattujen, eristettyjen elinten elinajan lisaamiseen tai tuleh-dusten hoitoon.More specifically, these enzymes, or analogs or mutants thereof, may be used to reduce inflammation caused by reperfusion following local anemia, to increase the lifespan of cut, isolated organs, or to treat inflammation.

Kyseessa oleva keksinto koskee menetelmaa entsymaattisesti aktii-visen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin valmistamiseksi bakteerisolussa. Bakteerisolu si-saltaa DNA-sekvenssin ja pystyy ilmentamaan DNA-sekvenssia, joka koodittaa mangaanisuperokskdidismutaasia tai sen analogia tai mutanttia. Menetelmaan sisaltyy bakteerisolun yllapitaminen sopivissa olosuhteissa seka sopivassa valmistuselatusaineessa. Valmistukseen kaytettavaa elatusainetta taydennetaan Mn++:n sellaisella maaralla, etta Mn++:n konsentraatio, joka on solun saatavilla elatusaineessa, on suurempi kuin 2 miljoonasosaa.The present invention relates to a process for the preparation of enzymatically active human manganese superoxide dismutase or an analogue or mutant thereof in a bacterial cell. The bacterial cell contains a DNA sequence and is capable of expressing a DNA sequence encoding manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof. The method involves maintaining the bacterial cell under suitable conditions as well as in a suitable preparation medium. The medium used for the preparation is supplemented with an amount of Mn ++ such that the concentration of Mn ++ available to the cell in the medium is greater than 2 ppm.

Kyseessa olevan keksinnon edullisessa patenti.nsuoritusmuodossa bakteerisolu on Eschericia coli, joka sisaltaa plasmidin, joka sisaltaa DNA-sekvenssin, joka koodittaa humaani mangaanisuper-oksididismutaasipolypeptidia, esimerkiksi pMSE-4 tai pMS RB4 E. colin kannassa A4255. Mn++:n konsentraatio valmistukseen kaytettavassa elatusaineessa on noin 50-1500 mi 1joonasosaa, siten etta konsentraatiot 150-750 miljoonasosaa ovat edulliset.In a preferred embodiment of the present invention, the bacterial cell is an Escherichia coli comprising a plasmid containing a DNA sequence encoding a human manganese superoxide dismutase polypeptide, for example pMSE-4 or pMS RB4 in E. coli strain A4255. The concentration of Mn ++ in the medium used for the preparation is about 50-1500 ml 1 ppm, so that concentrations of 150-750 ppm are preferred.

9 903539 90353

Kyseessa oleva keksinto koskee menetelmaa mangaanisuperoksidi-dismutaasin tai sen analogin takaisin saamiseksi bakteerisoluis-ta, jotka sisaltåvåt mainitun entsyymin. Soluja kasitellaan ensin, jotta saadaan takaisin proteiinijae, joka sisaltaa proteii-neja, joita solxaissa on lasna, humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasi tai sen analogi tai mutantti mukaan luettuna, ja sitten proteiinijaetta kasitellaan humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasin tai sen analogin tai mutantin takaisin saamiseksi. Kyseessa olevan patentin edullisessa suoritusmuodossa soluja kasitellaan ensin liukoisten proteiinien erottamiseksi liukene-mattomista proteiineista seka solunseinåman pirstaleista, ja liukoiset proteiinit otetaan talteen. Sitten liukoisia proteii-neja kasitellaan liukoisten proteiinien erottamiseksi, esim. saostamalla liukoisten proteiinien jae, joka sisaltaa hMnSODrn tai sen analogin tai mutantin, seka jae, joka sisaltaa hMnSOD:n tai sen analogin tai mutantin,saadaan takaisin. Liukoisten proteiinien takaisin saatua jaetta kasitellaan sitten, siten etta humaani mangaanisuperoksididismutaasi tai sen analogi saadaan talteen.The present invention relates to a method for recovering manganese superoxide dismutase or an analogue thereof from bacterial cells containing said enzyme. The cells are first treated to recover a protein fraction containing proteins present in the solxa, including human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof, and then the protein fraction is treated to recover human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof. In a preferred embodiment of the present patent, the cells are first treated to separate soluble proteins from insoluble proteins as well as fragments of the cell wall, and the soluble proteins are recovered. The soluble proteins are then treated to separate soluble proteins, e.g., by precipitating a fraction of soluble proteins containing hMnSOD or an analog or mutant thereof, as well as a fraction containing hMnSOD or an analog or mutant thereof. The recovered fraction of soluble proteins is then treated to recover human manganese superoxide dismutase or an analog thereof.

Kyseessa olevan keksinnon edullisempi patentinsuoritusmuoto koskee menetelmaa humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin saamiseksi bakteerisoluista, jotka sisaltavat humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin. Menetelmaan sisåltyy ensin bakteerisolujen eris-taminen valmistukseen kåytetystå elatusaineesta seka niiden sus-pensointi sopivaan liuokseen, jonka pH on noin 7,0-8,0. Sitten solut pirstotaan ja sentrifugoidaan ja syntyvåå supernatanttia kuumennetaan noin 30-120 minuutin ajan 55-65°C:n låmpotilassa, mieluummin 45-75 minuuttia 58-62°C:ssa ja viela mieluummin noin yhden tunnin ajan 60°C:ssa, ja sitten se jaahdytetaan alle 10°C:een, mieluummin 4°C:een. Jokainen muodostuva saostuma on poistettava sentrifugoiden, ja jaahdytetty supernatantti dialysoidaan sopivaa puskuria vastaan, esimerkiksi 2 mM kalium-fosfaattipuskuria vastaan, jonka pH on noin 7,8. Dialyysi suoritetaan mieluummin ultrafi 1traat ion avulla kayttamalla suodatinmembraania, joka on pienempi kuin 30K. Samanaikaisesti 10 90353 dialyysin kanssa tai sen jålkeen jååhdytetty supernatantti saatetaan valinnaisesti konsentroida sopivaan tilavuuteen, esimerkiksi 0,03:een sen alkuperåisestå tilavuudesta. Pidåt-tynyt aines eluoidaan sitten anionikromatografiapylvååsså sopivasti puskuroidun liuoksen avulla, esimerkiksi liuoksel-la, joka on ainakin 20-millimolaarinen kaliumfosfaatin suh-teen ja jonka pH on noin 7,8. Kootaan eluentin jakeet, jotka sisåltåvåt superoksididismutaasin, ne yhdistetåån ja dialy-soidaan noin 40-millimolaarista kaliumasetaattia, jonka pH on 5,5, vastaan. Dialysoidut, yhdistetyt jakeet eluoidaan sitten kationinvaihtokromatografiapylvåån kautta kåyttåen lineaaris-ta gradienttia, joka on noin 40-200-millimolaarinen kalium-asetaatin suhteen ja jonka pH on noin 5,5. Kootaan huippuja-keet, jotka sisåltåvåt superoksididismutaasin, ja ne yhdistetåån. Yhdistetyt huippujakeet saatetaan sitten valinnaisesti dialysoida sopivaa liuosta, esim. vettå tai puskuriliuosta vastaan, joka on noin 10-millimolaarinen kaliumfosfaatin suhteen ja jonka pH on noin 7,8.A more preferred embodiment of the present invention relates to a method for obtaining human manganese superoxide dismutase or an analogue or mutant thereof from bacterial cells containing human manganese superoxide dismutase or an analogue or mutant thereof. The method first involves isolating the bacterial cells from the medium used for preparation and suspending them in a suitable solution having a pH of about 7.0-8.0. The cells are then disrupted and centrifuged, and the resulting supernatant is heated for about 30-120 minutes at 55-65 ° C, preferably 45-75 minutes at 58-62 ° C, and even more preferably for about one hour at 60 ° C, and then it is cooled to below 10 ° C, preferably to 4 ° C. Any precipitate formed must be removed by centrifugation, and the cooled supernatant is dialyzed against a suitable buffer, for example 2 mM potassium phosphate buffer, at a pH of about 7.8. Dialysis is preferably performed by ultrafiltration using a filter membrane smaller than 30K. The supernatant cooled at the same time as or after dialysis may optionally be concentrated to a suitable volume, for example 0.03 of its original volume. The retained material is then eluted on an anion chromatography column with a suitably buffered solution, for example a solution of at least 20 millimolar relative to potassium phosphate and having a pH of about 7.8. Fractions of eluent containing superoxide dismutase are collected, combined and dialyzed against about 40 mM potassium acetate at pH 5.5. The dialyzed combined fractions are then eluted through a cation exchange chromatography column using a linear gradient of about 40-200 millimolar to potassium acetate at a pH of about 5.5. Peak crystals containing superoxide dismutase are collected and combined. The combined peak fractions may then optionally be dialyzed against a suitable solution, e.g., water or a buffer solution, of about 10 millimolar relative to potassium phosphate and having a pH of about 7.8.

Esillå oleva keksintå koskee my6s puhdistettua, entsymaatti-sesti aktiivista humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja, esim. met-hMnSOD:a, tai sen mutantteja, jotka on valmistettu esillå olevan keksinnon mukaisin menetelmin.The present invention also relates to purified, enzymatically active human manganese superoxide dismutase or analogs thereof, e.g. met-hMnSOD, or mutants thereof prepared by the methods of the present invention.

Keksinndn oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa pa-tenttivaatimuksissa.The essential features of the invention are set out in the appended claims.

Kuva 1. Humaani MnSQD-CDNA:n sekvenssiFigure 1. Sequence of human MnSQD CDNA

Kuva 1 esittåå kaksisåikeisen DNA-molekyylin yhden såikeen nukleotidisekvenssiå, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia sekå humaani MnSOD:n 198 aminohapon mittaista sekvenssiå, joka vastaa mainittua DNA-sekvenssiå. Kuva 1 esittåå myds kaksisåikeisen DNA-molekyylin yhtå såiettå, joka koodittaa kypsåå humaani MnSOD:a edeltåvåå peptidiå, joka koostuu 24 aminohaposta, sekå aminohapposekvenssiå, joka vastaa tåtå DNA-sekvenssiå. Kuvassa esitetåån myås 5'- ja 3'-sekvenssit, joille ei translaatiota suoriteta.Figure 1 shows the nucleotide sequence of a single strand of a double-stranded DNA molecule encoding human manganese superoxide dismutase and the 198 amino acid sequence of human MnSOD corresponding to said DNA sequence. Figure 1 shows a single strand of a myds double-stranded DNA molecule encoding a mature human amino acid MnSOD-preceding peptide of 24 amino acids and an amino acid sequence corresponding to that DNA sequence. The figure also shows the 5 'and 3' sequences that are not translated.

11 9035311 90353

Kuva 2. pMSE-4:n rakenne: humaani MnSOD:n ekspressioplasmidi Plasmidi pMS8-4, joka sisalsi MnSODrn EcoRI (R-^)-insertilla, pilkottiin tåydellisesti Ndel- ja Narl-restriktioentsyymien avul-la. Suuri fragmentti eristettiin ja sidottiin synteettisen oli-gomeerin kanssa, kuten kuvataan kuvassa 2. Syntyva plasmidi, pMS8-NN sisaltaa koodittavan alueen kypsalle MnSODrlle, jota koodittavaa aluetta edeltaa ATG-aloituskodoni. Ylla esitetty plasmidi pilkottiin EcoRI:lla, paatteet tåydennettiin polyme-raasi I:n Klenow-fragmentilla ja pilkottiin edelleen Ndelrlla. Pieni fragmentti, joka sisalsi MnSOD-geenin, liitettiin pSODit,13 : een , jota kasiteltiin Ndelrlla ja Stulrllå. pSODet-13 saatetaan saada, kuten on kuvattu kasittelyn alaisena olevas-sa US-patenttihakemuksessa 644 245 ja joka tahan yhteyteen liitetaan viitteena. Tama tuotti plasmidin pMSE-4:n, joka sisalsi MnSODra koodittavan alueen, jota edelsi ribosomien sitou-tumiskohta cll ja joka oli promoottorin kPL saatelyn alainen. Plasmidi pMSE-4 on tallennettu the American Type Culture Collectioniin ATCC-tulonumerolla 53250.Figure 2. Structure of pMSE-4: human MnSOD expression plasmid Plasmid pMS8-4, which contained MnSOD with the EcoRI (R -) insert, was digested completely with NdeI and NarI restriction enzymes. The large fragment was isolated and ligated with a synthetic oligomer as described in Figure 2. The resulting plasmid, pMS8-NN, contains a coding region for mature MnSODr preceded by an ATG start codon. The above plasmid was digested with EcoRI, the pellets were complemented with a Klenow fragment of polymerase I, and further digested with NdeI. A small fragment containing the MnSOD gene was ligated into pSODs, 13, which were treated with Ndel and Stulr. pSODet-13 may be obtained as described in the pending U.S. Patent Application 644,245 and is incorporated herein by reference. This produced plasmid pMSE-4, which contained the MnSODra coding region, preceded by the ribosome binding site cll, and which was under the promoter kPL saately. Plasmid pMSE-4 is deposited in the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 53250.

Kuva 3. Mn++:n konsentraation vaikutus E. colissa valmistetun S0D:n aktiivisuuteen_Figure 3. Effect of Mn ++ concentration on the activity of SOD produced in E. coli_

Kuvassa 3 esitetty kartta ilmaisee korrelaation, joka vallitsee E. colin kannan A 4255, joka sisaltaa plasmidin pMSE-4, valmista- man liukoisen rekombinantti-MnSOD:n spesifisen aktiivisuuden, ilmaistuna yksikoina/mg seka ei-induktio- (32°C) etta induktio-(42°C) olosuhteissa, ja elatusaineen Mn++:n konsentraation valilla.The map in Figure 3 shows the correlation between the specific activity of soluble recombinant MnSOD produced by E. coli strain A 4255, which contains plasmid pMSE-4, expressed in units / mg as well as non-induction (32 ° C) and under induction (42 ° C) conditions, and between the Mn ++ concentration of the medium.

‘ ‘ Kuva 4. pMSARB4:n rakenne: humaani MnS0D:n ilmentymisplasmidi‘‘ Figure 4. Structure of pMSARB4: human MnSO 4 expression plasmid

Tet ekspressiovektori , pARB, valmistettiin pSODd-^T-ll:sta taydellisen EcoRI-kasittelyn avulla, jonka jalkeen sita pilkottiin osittain BamHI-restriktioentsyymien avulla. pSOD/i^T-ll on tallennettu the American Type Culture Collectioniin (ATCC) tulonumerolla 53468. Uutettu plasmidi kytkettiin seuraavan synteettisen oligomeerin kanssa -·- 5 1 - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3' V 3'- GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5' 12 90 353 jolloin tuloksena oli pARB, joka sisaltaa ΐ1 P^-promoot tor in .The Tet expression vector, pARB, was prepared from pSODd-T T-11 by complete EcoRI treatment, followed by partial digestion with BamHI restriction enzymes. pSOD / i ^ T-11 is deposited in the American Type Culture Collection (ATCC) under accession number 53468. The extracted plasmid was ligated with the following synthetic oligomer - · - 5 1 - AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3 'V 3'- GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5' 12 90 353 resulting in was pARB containing the ΐ1 P ^ promoter Tor in.

MnSODrn ekspressioplasmidin pMSE-4:n EcoRI-fragmentti, joka sisaltaa ribosomin sitoutumispaikan cll seka kypsaa entsyymia koodittavan taydellisen sekvenssin, vietiin pARB:n ainoaan EcoRI-kohtaan. Syntyva plasmidi. pMSARB4 sisaltaa MnSOD-geenin, joka on ^P :n sååtelyn alainen, seka cll RBS: n ja antaa resis-tenssin tetrasykliinille.The EcoRI fragment of the MnSODr expression plasmid pMSE-4, which contains the ribosome binding site cll and the complete sequence encoding the mature enzyme, was inserted into the single EcoRI site of pARB. The resulting plasmid. pMSARB4 contains the MnSOD gene, which is regulated by ^ P, as well as cll RBS and confers resistance to tetracycline.

Kaksisaikeinen DNA-molekyyli, joka sisaltaa cDNA:n, joka koodit-taa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiå tai sen analogia tai mutanttia, on eristetty humaani T-solu DNA-kirjas-tosta. Kaksisaikeisen DNA-molekyylin nukleotidisekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidia tai sen analogia tai mutanttia, on keksitty. DNA-molekyylin yhden saikeen sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuper-oksididismutaasipolypeptidia tai sen analogia, esitetaan kuvas-sa 1, ja se sisaltaa nukleotidinumerot 115-708, mainitut nukleo-tidit mukaanluettuina. Yhden saikeen sekvenssi, joka koodittaa hMnSOD-analogia tai mutanttia, on suurin piirtein samankaltainen kuin saie, joka koodittaa hMnSOD-polypeptidia. Kuvassa 1 esitetaan myos humaani mangaanisuperoksididismutaasia edeltava pepti-di. Nukleotidit numerot 43-114, mainitut nukleotidit mukaan luettuina, koodittavat tata peptidia.A double-stranded DNA molecule containing a cDNA encoding a human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog or mutant thereof has been isolated from a human T cell DNA library. A nucleotide sequence of a double-stranded DNA molecule encoding a human manganese superoxide dismutase polypeptide or an analog or mutant thereof has been invented. The sequence of a single strand of a DNA molecule encoding a human manganese superoxide dismutase polypeptide or analog thereof is shown in Figure 1 and includes nucleotide numbers 115-708, including said nucleotides. The sequence of a single strand encoding an hMnSOD analog or mutant is approximately similar to a strand encoding an hMnSOD polypeptide. Figure 1 also shows the peptide preceding human manganese superoxide dismutase. Nucleotides numbers 43-114, including said nucleotides, encode this peptide.

Menetelmat cDNArn valmistamiseksi seka DNA:n sekvenssin maaritta-miseksi, joka sekvenssi koodittaa humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasipolypeptidia, sen analogia tai mutanttia, ovat tutki-mustyohon perehtyneiden tuntemia, ja niita kuvataan yksityis-kohtaisemmin tassa yhteydessa myohemmin. Ennen kaikkea, nyt on loydetty DNA-sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia, ja tunnettuja synteesimenetelmia voidaan kayttaa taman sekvenssin osia sisaltavien DNA-molekyylien valmistamiseksi .Methods for preparing cDNA and determining the sequence of DNA encoding a human manganese superoxide dismutase polypeptide, analog, or mutant thereof are known to those skilled in the art and will be described in more detail herein. Above all, a DNA sequence encoding human manganese superoxide dismutase has now been found, and known synthetic methods can be used to prepare DNA molecules containing portions of this sequence.

Tavanomaiset kloonausvehikkelit, kuten esimerkiksi plasmidit, esimerkiksi pBR322, virukset tai bakteriofaagit, esim. , voidaan 13 90353 muuntaa tai rakentaa tunnettuja menetelmiå kåyttåmålla uusien kloonausvehikkeleiden valmistamiseksi, jotka vehikkelit sisaltavat cDNA:n, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaa-sipolypeptidiå tai sen analogeja tai mutantteja. Samalla tavalla voidaan sellaisia kloonausvehikkeleita muuntaa tai rakentaa, siten etta ne sisaltavat DNA-molekyyleja, joiden yhteen saikee-seen sisåltyy segmentti, jolla on kuvassa 1 esitetty sekvenssi humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiå vårten tai segmentteja, jotka ovat oleellisesti sen kaltaisia. DNA-molekyyli, joka on sijoitettu valiin, voidaan valmistaa erilaisin menetel-min, joihin kuuluu entsymaattinen tai kemiallinen synteesi.Conventional cloning vehicles, such as plasmids, e.g. pBR322, viruses or bacteriophages, e.g. Similarly, such cloning vehicles can be modified or constructed to include DNA molecules having in one strand a segment having the sequence shown in Figure 1 for human manganese superoxide dismutase polypeptide or segments substantially similar thereto. A DNA molecule placed in a valence can be prepared by a variety of methods, including enzymatic or chemical synthesis.

Tuloksena saadut kloonausvehikkelit ovat kemiallisia kokonaisuuk-sia, joita ei esiinny luonnossa ja jotka voidaan luoda uudenai-kaisella tekniikalla, jota kuvataan yhdistelmå-DNA-tekniikkana. Kloonausvehikkeli on mieluummin plasmidi, esimerkiksi pMSE-4 tai pMS RB4. Nåma kloonausvehikkelit saatetaan vieda sisaan soluihin, joko prokaryoottisiin, esimerkiksi bakteerisoluihin (Escherichia coli, B. subtilis, jne.), tai eukaryoottisiin soluihin, eismerkiksi hiiva- tai nisåkåssoluihin, kåyttåmålla tutkimustyosså tunnettuja menetelmiå, kuten esimerkiksi trans-formaatiota, transfektiota yms. Solut, joihin kloonausvehikkelit viedaan sisaan, sisaltavat tåten cDNA:n, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidiå tai sen mutanttia tai analogia, jos cDNA oli lasna kloonausvehikkelissa, tai solut sisaltavat DNA:n, joka sisaltaa saikeen, jolla koko-naan tai jonka osalla on sekvenssi kuvassa esitettya humaani MnSOD-polypeptidiå vårten tai samankaltainen sekvenssi, jos sellainen DNA oli lasna kloonausvehikkelissa.The resulting cloning vehicles are chemical entities that do not occur in nature and can be created by a modern technique described as recombinant DNA technology. The cloning vehicle is preferably a plasmid, for example pMSE-4 or pMS RB4. These cloning vehicles may be introduced into cells, either prokaryotic, e.g. bacterial cells (Escherichia coli, B. subtilis, etc.), or eukaryotic cells, e.g. yeast or mammalian cells, using methods known in the art, such as trans transformation. into which the cloning vehicles are introduced thus comprise a cDNA encoding a human manganese superoxide dismutase polypeptide or a mutant or analog thereof, if the cDNA was present in the cloning vehicle, or the cells contain DNA comprising a strand having a whole or a portion of human The MnSOD polypeptide or similar sequence if such DNA was present in the cloning vehicle.

Escherichia colin solut ovat edullisia isantasoluja kyseessa olevan keksinnon mukaisia kloonausvehikkeleita vårten. Talla hetkella edullinen E. colin auksotroofinen kanta on A1645, joka on tallennettu the American Type Culture Collectioniin Rockvillessa, Marylandissa, USA, ja joka sisaltaa plasmidin pApoE-Ex2, ATCC-talletusnumerolla 39787. Kaikki the American 14 90353Escherichia coli cells are preferred host cells for the cloning vehicles of the present invention. Currently, the preferred auxotrophic strain of E. coli is A1645, stored in the American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, and containing plasmid pApoE-Ex2, ATCC Accession No. 39787. All of the American 14 90353

Type Culture Collectioniin tehdyt tallennukset, joihin tassa hakemuksessa viitataan, suoritettiin Budapestin sopimuksen mukai-sesti perustuen sopimustekstiin "the International Recognition of the Deposit of Microorganisms".The recordings in the Type Culture Collection referred to in this application were made in accordance with the Budapest Treaty, based on the text of the Treaty "the International Recognition of the Deposit of Microorganisms".

A1645 saatiin Al637:sta valitsemalla Gal+:n suhteen (kyky kayt-taa galaktoosia) seka tetrasykliiniresistenssin haviamisen suhteen. Se sisaltaa vielå faagi λ:η aineosia. Sen fenotyyppi on C600 r~m+ gal+ thr- leu- lacZ- bl (λοΙ857ΔΗ1ABamHl N+).A1645 was obtained from Al637 by selection for Gal + (ability to use galactose) as well as for the detection of tetracycline resistance. It still contains phage λ: η components. Its phenotype is C600 r ~ m + gal + thr- leulacZ- bl (λοΙ857ΔΗ1ABamHl N +).

A1637 saatiin C600:sta siirtamalla (insertoimalla) genomin osa, joka sisalsi geenin tetrasykliiniresistenssia vårten, galaktoosi-operoniin seka faagi λ:η elementteihin, jotka sisaltavat aine-osat cl-repressorin synteesia vårten. C600 on saatavissa the American Type Culture Collectionista, ATCC-talletusnumerolla 23724.A1637 was obtained from C600 by transferring (inserting) a portion of the genome containing the gene for tetracycline resistance into the galactose operon and phage λ: η elements containing components for cl-repressor synthesis. C600 is available from the American Type Culture Collection, ATCC Accession No. 23724.

Escherichia colin fototrooppiset kannat, jotka tekevat mahdolli-seksi polypeptidiekspression korkean tason vielapå, kun niita on kasvatettu minimaalisessa elatusaineessa, ovat vielapa isantina edullisempia ekspressoitaessa geeneja, jotka koodittavat mangaani-superoksididismutaasia. Nykyisin eras edullinen kanta on A4255. Kanta A4255, joka sisaltaa plasmidin pMSE-4, on tallen-nettu the American Type Culture Collectioniin talletusnumerolla 53250.Phototropic strains of Escherichia coli, which allow high levels of polypeptide expression even when grown in minimal medium, are even more preferred as hosts for the expression of genes encoding manganese superoxide dismutase. Today, one preferred strain is A4255. Strain A4255, which contains plasmid pMSE-4, is deposited in the American Type Culture Collection under accession number 53250.

Syntyvia soluja, joihin DNA, joka koodittaa humaani mangaani-superoksididismutaasipolypeptidia tai sen analogia tai mutant-tia, on viety sisaan, saatetaan kasitella, kun niita on kasvatettu tai viljelty tarkoituksenmukaisesti sopivissa olosuhteissa, jotka ovat aiheeseen perehtyneille tuttuja, niin etta DNA ohjaa DNA:n koodittaman geneettisen informaation ilmentymista, esimerkiksi, niin etta se ohjaa hMnSOD-polypeptidin tai sen analugin tai mutantin ilmentymista, ja solu ilmentaa hMnSOD-polypeptidia tai sen analogia tai mutanttia, joka voidaan sitten saada takaisin.Emerging cells into which DNA encoding a human manganese superoxide dismutase polypeptide or analog or mutant thereof has been introduced may be processed when appropriately grown or cultured under appropriate conditions known to those skilled in the art so that the DNA directs the DNA. the expression of the genetic information encoded by the hMnSOD polypeptide, e.g., so as to direct the expression of the hMnSOD polypeptide or an analog or mutant thereof, and the cell expresses the hMnSOD polypeptide or an analog or mutant thereof, which can then be recovered.

is 90 3 53is 90 3 53

Koko tassa hakemuksessa kåytetty termi "superoksididismutaasi" (SOD tarkoittaa entsyymia tai polypeptidia, joka toimii super-oksidi- tai hapettomien radikaalien reseptorina tai joka kata-lysoi seuraavan dismutaatioreaktion: 20 2~ + 2H+ ------> 02 + H202Throughout this application, the term "superoxide dismutase" (SOD) refers to an enzyme or polypeptide that acts as a receptor for superoxide or anoxic radicals or that catalyzes the following dismutation reaction: 20 2 ~ + 2H + ------> 02 + H 2 O 2

Termi "manqaaaisuperoksididismutaasi" (MnSOD) tassa yhteydessa kaytettyna tarkoittaa alkuaine mangaania kaikissa sen kemialli-sissa muodoissa.The term "manganese peroxide dismutase" (MnSOD) as used herein means the element manganese in all its chemical forms.

Termi "humaani mangaanisuperoksididismutaasipolyDeptidi" kyseesså olevan hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoittaa polypeptidia, jossa on 198 aminohappoa, ja jonka aminohapposekvenssin osa esitetaan kuvassa 1: sekvenssin N-paate on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 115-1.17, ja sekvenssin COOH-paate on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 706-708.The term "human manganese superoxide dismutase polypeptide" as used in the present application means a polypeptide of 198 amino acids, part of the amino acid sequence of which is shown in Figure 1: the N-terminus of the sequence is lysine encoded by nucleotides 115-1.17 of Figure 1, and the sequence of C encoded by nucleotides 706-708 of Figure 1.

Termi "polynukleotidimangaanikompleksi" kyseesså olevan hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoittaa molekyylia, johon sisaltyy humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidi kompleksina mangaanin kanssa, joka on misså tahansa kemiallisessa muodossa, jolla molekyylilla on luonnossa esiintyvan humaani mangaani-superoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.The term "polynucleotide manganese complex" as used in the context of the present application means a molecule comprising a human manganese superoxide dismutase polypeptide complexed with manganese in any chemical form having the activity of a naturally occurring human manganese superoxide dismutase mutase.

Termi "humaani mangaanisuperoksididismutaasi" kyseesså olevan hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoittaa molekyylia, johon sisaltyy ainakin kaksi humaani mangaanisuperoksididismutaasi-polypeptidiå kompleksina mangaanin kanssa, joka on misså tahansa kemiallisessa muodossaan, ja jolla polypeptidillå on luonnossa esiintyvån humaani mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.The term "human manganese superoxide dismutase" as used in the context of the present application means a molecule comprising at least two human manganese superoxide dismutase polypeptides complexed with manganese in any of its chemical forms and having a polypeptide having a naturally occurring human manganese superoxide.

Termi "humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidin analogi" kyseesså olevan hakemuksen yhteydesså kåytettynå tarkoittaa polyoeptidiå, johon sisåltyy humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasipolypeptidi, jonka joko molempiin tai toiseen pååhån on kiinnittynyt yksi tai useampia lisåksi tulevia aminohappoja.The term "human manganese superoxide dismutase polypeptide analog" as used in the context of the present application means a polyoeptide comprising a human manganese superoxide dismutase polypeptide having one or more additional amino acids attached to either or both ends.

16 9035316 90353

Termilla "polypeptidimangaanikompleksin analogi" kyseessa ole-van hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoitetaan molekyylia, johon sisaltyy polypeptidimangaanikompleksi, jonka polypeptidi-osaan sisaltyy yksi tai useampia lisaksi tulevia aminohappoja, jotka ovat kiinnittyneet jompaan kumpaan tai molempiin paihin.The term "polypeptide manganese complex analog" as used in the context of the present application means a molecule comprising a polypeptide manganese complex having a polypeptide moiety comprising one or more additional amino acids attached at either or both sites.

Termilla "humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogi" kyseessa olevan hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoitetaan molekyylia, johon sisaltyy ainakin kaksi polypeptidia, joista ainakin yksi on humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidin analogi, kompleksina mangaanin kanssa, joka on missa tahansa kemialli-sista muodoistaan, ja jonka polypeptidin analogilla on luonnos-sa esiintyvan humaani mangaanisuperoksididismutaasin entsymaat-tista aktiivisuutta.The term "human manganese superoxide dismutase analog" as used in connection with the present application means a molecule comprising at least two polypeptides, at least one of which is an analog of a human manganese superoxide dismutase polypeptide, complexed with manganese present in any of its chemical forms and having a polypeptide enzymatic activity of human manganese superoxide dismutase.

Termilla "humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidin mutantti" kyseessa olevan hakemuksen yhteydessa tarkoitetaan polypeptidia, jonka aminohapposekvenssi on suurin piirtein yhtalai-nen humaani mangaanisuperoksididismutaasipolypeptidin kanssa, mutfca joka eroaa siita yhden tai useamman aminohapon suhteen.The term "mutant of a human manganese superoxide dismutase polypeptide" in the context of the present application means a polypeptide having an amino acid sequence that is substantially identical to a human manganese superoxide dismutase polypeptide, but which differs therefrom by one or more amino acids.

Termilla "polypeptidimangaanikompleksin mutantti" tarkoitetaan molekyylia, johon sisaltyy humaani mangaanisuperoksididismutaa-sipolypeptidin mutantti kompleksina mangaanin kanssa, joka on jos-sain kemiallisista muodoistaan, ja jolla kompleksilla on mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.The term "polypeptide manganese complex mutant" refers to a molecule comprising a mutant complex of a human manganese superoxide dismutase polypeptide with manganese, which is in some of its chemical forms, and which complex has the enzymatic activity of manganese superoxide dismutase.

Termilla "humaani mangaanisuperoksididismutaasin mutantti" kyseessa olevan hakemuksen yhteydessa kaytettyna tarkoitetaan molekyylia, johon sisaltyy ainakin kaksi polypeptidia, joista polypeptideista ainakin yksi on humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasipolypeptidin mutantti kompleksina mangaanin kanssa, joka on jossain kemiallisista muodoista,ja jolla peptidilla on luonnossa esiintyvan humaani mangaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta.The term "human manganese superoxide dismutase mutant" as used in the context of the present application means a molecule comprising at least two polypeptides, at least one of which is a mutant complex of human manganese superoxide dismutase polypeptide .

17 90353 hMnSOD-polypeptidin ja hMnSODrn mutantteja, jotka on sisållytetty kyseessa olevan keksinnon osana, voidaan valmistaa suoritta-malla kuvan 1 mukaisen DNA-sekvenssin mutaatio, jonka sekvenssin N-påate on lysiini, jota nukleotidit 115-117 koodittavat, ja jonka sekvenssin COOH-paåtettå koodittavat nukleotidit 706-708.17,35353 mutants of the hMnSOD polypeptide and hMnSODr included in the present invention can be prepared by mutating the DNA sequence of Figure 1, the N-terminus of which is lysine encoded by nucleotides 115-117, and the sequence of COOH. nucleotides 706-708 encoding the terminal.

DNA:n mutaatio voidaan suorittaa menetelmin, jotka ovat aihee-seen perehtyneelle tuttuja, esimerkiksi menetelmån avulla, jonka Bauer et al. ovat esittåneet julkaisussa Gene 37:73-81 (1985). Sekvenssi, jolle mutaatio on suoritettu, voidaan sijoittaa valiin (insertoida) sopiviin ekspressiovektoreihin kyseessa olevassa hakemuksessa kuvatulla tavalla, jotka vektorit sitten viedaån soluihin, joita sitten kasitellaan, niin etta DNA, jolle mutaatio on suoritettu, ohjaa hMnSOD-polypeptidimutanttien ja hMnSOD-mutanttien ilmentymista.Mutation of DNA can be performed by methods known to those skilled in the art, for example, the method described by Bauer et al. have reported in Gene 37: 73-81 (1985). The mutated sequence can be inserted into suitable expression vectors as described in the present application, which vectors are then introduced into the cells to be treated, so that the mutated DNA is driven by the expression of hMnSOD polypeptide mutants and hMnSOD mutants.

Humaani mangaanisuperoksididismutaasin oletetaan olevan proteii-nin, jolla on ainakin kaksi, mahdollisesti nelja yhtalaista ala-yksikkoa, joista kullakin on noin 198 aminohappoa sekvenssisså, joka on esitetty kuvassa 1 humaani mangaanisuperoksididismutaa-sille ja jonka N-paassa on lysiini, joka on kuvan 1 mukaisten nukleotidien 115-117 koodittama, ja jonka sekvenssin COOH-paate on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 706-708.Human manganese superoxide dismutase is assumed to be a protein having at least two, possibly four identical subunits, each of which is about 198 amino acids in the sequence shown in Figure 1 for human manganese superoxide dismutase and having a lysine at the N-terminus of encoded by nucleotides 115-117, and the COOH terminus of the sequence is lysine encoded by nucleotides 706-708 of Figure 1.

Humaani MnS0D:a tai sen analogeja tai mutantteja saatetaan valmistaa soluista, joihin on viety sisaan DNA:a tai cDNA:a, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja tai mutantteja. Tata humaani MnS0D:a tai sen analogeja tai mutantteja saatetaan kayttaa katalysoimaan superoksidianionin dismutaatio tai yksivalenssinen pelkistyminen protonien lasna-ollessa, jotta muodostuu vetyperoksidia seuraavan yhtalon mu-kai sesti : , 0Li+ humaani MnSOD „ Λ 20^i + 2H -> H202 + 02Human MnSO 4 or analogs or mutants thereof may be prepared from cells into which DNA or cDNA encoding human manganese superoxide dismutase or analogs or mutants thereof has been introduced. Tata human MnSO 4 or analogs or mutants thereof may be used to catalyze the dismutation or monovalent reduction of a superoxide anion in the presence of protons to form hydrogen peroxide according to the following equation: .0Li + human MnSO 4 + 20 H 2 + 2H -> H

Voidaan myos valmistaa elainlaaketieteellisia ja farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisaltavat tehokkaita maaria hMnS0D:a 18 90 353 tai yhtå tai useampaa hMnSOD-analogia tai mutanttia seka sopi-vaa kantaja-ainetta. Sellaiset kantaja-aineet ovat aiheeseen perehtyneiden hyvin tuntemia. hMnSODra tai sen analogia tai mutanttia saatetaan annostella suoraan tai koostumuksen muodossa elåimelle tai ihmiselle, esimerkiksi, jotta voidaan hoitaa tuleh-duksia tai vahentaa vauriota, jonka hapettomat radikaalit aiheuttavat uudelleenperfuusiossa, joka seuraa verettomyytta tai elinsiirtoa. hMnSODra tai sen analogia tai mutanttia saatetaan myos lisata suoraan tai koostumuksen muodossa eriste-tyn elimen perfuusiovåliaineeseen, jotta vahennetaan eristetyn elimen vaurioitumista, jonka aiheuttavat hapettomat radikaalit elimen irrottamista seuraavan perfuusion aikana, taten pidenne-tåån elimen elinaikaa. Lisaksi hMnSODra tai sen analogia tai mutanttia saatetaan kayttaa neurologisen vaurion vahentamiseksi verettomyytta seuraavan uudelleenperfuusion aikana seka keuhko-putken ja keuhkojen kasvuhairion hoitamiseksi.Veterinary and pharmaceutical compositions containing effective Marie hMnSO 4 or one or more hMnSO analogs or mutants and a suitable carrier may also be prepared. Such carriers are well known to those skilled in the art. hMnSODra or an analogue or mutant thereof may be administered directly or in the form of a composition to an animal or human, for example, to treat inflammation or to reduce damage caused by oxygen-free radicals in reperfusion following anemia or transplantation. hMnSODra or an analog or mutant thereof may also be added directly or in the form of a composition to the perfusion medium of an isolated organ to reduce damage to the isolated organ caused by oxygen-free radicals during perfusion following organ detachment, thereby extending the life of the organ. In addition, hMnSODra or an analog or mutant thereof may be used to reduce neurological damage during post-anemic reperfusion as well as to treat bronchial tube and lung growth disorder.

On myos keksitty menetelma entsymaattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin val-mistamiseksi bakteerisolussa. Bakteerisolu sisaltaa DNA-sekvens-sin seka pystyy ilmentamaan DNA-sekvenssia, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia. Menetelmaan sisaltyy bakteerisolun yllapitaminen sopivissa olosuhteissa seka sopivassa tuotantovaliaineessa.There is also provided a method for producing enzymatically active human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof in a bacterial cell. The bacterial cell contains a DNA sequence and is capable of expressing a DNA sequence encoding human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof. The method involves maintaining the bacterial cell under suitable conditions and in a suitable production medium.

Valmistukseen kaytettavaa valiainetta taydennetaan sellaisella 11 X.L.The preparation used for the preparation is supplemented with 11 X.L.

Mn :n maaralla, etta Mn :n konsentraatio elatusaineessa on suurempi kuin 2 miljoonasosaa.Mn states that the concentration of Mn in the medium is greater than 2 ppm.

Bakteerisolu voi olla mika tahansa bakteeri, jossa DNA-sekvenssi, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismutaasia on viety sisaan yhdistelma-DNA-tekniikoin. Bakteerin pitaa pystya ilmentamaan DNA-sekvenssia seka valmistamaan proteiinituotetta.The bacterial cell can be any bacterium in which the DNA sequence encoding human manganese superoxide dismutase has been introduced by recombinant DNA techniques. The bacterium must be able to express the DNA sequence as well as produce a protein product.

Sopivat olosuhteet ja valmistukseen kaytettava elatusaine vaih-t elevat: bakteeri 1 aji n ja kannan mukaan.Suitable conditions and the medium used for the preparation change according to: bacterium 1 species and strain.

19 9035319 90353

Bakteerisolu saattaa sisaltaa DNA-sekvenssin, joka koodittaa superoksididismutaasia tai analogia, vektori-DNA-molekyylin, kuten esimerkiksi plasmidin, sisalla. Vektori tai plasmidi kons-truoidaan yhdistelma-DNA-tekniikoin, jotta saadaan sekvenssi, joka koodittaa molekyylin sopivaan kohtaan sisaan liitettyå SOD: a.The bacterial cell may contain a DNA sequence encoding a superoxide dismutase or analog within a vector DNA molecule, such as a plasmid. The vector or plasmid is constructed by recombinant DNA techniques to obtain a sequence encoding SOD inserted at an appropriate site in the molecule.

Kyseessa olevan keksinnon edullisessa suoritusmuodossa bakteerisolu on Escherichia coli-solu. Edullinen E. colin auksotrofinen kanta on A1645. Edullinen E. colin prototrofinen kanta on A4255. Kyseessa olevan keksinnon mukaisen E. colin solu sisaltaa plasmidin, joka koodittaa humaani mangaanisuperoksididismu-taasia tai sen analogia tai mutanttia.In a preferred embodiment of the present invention, the bacterial cell is an Escherichia coli cell. The preferred auxotrophic strain of E. coli is A1645. The preferred prototrophic strain of E. coli is A4255. The E. coli cell of the present invention contains a plasmid encoding human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof.

Kyseessa olevan keksinnon edullisessa suoritusmuodossa bakteerisolu sisaltaa plasmidi pMSE-4:n. Menetelmå taman plasmidin konstruoimiseksi kuvataan kuvien selityksissa, ja plasmidia itseaan kuvataan esimerkissa 2. Tama plasmidi on tallennettu ATCC-talletusnumerolla 43250.In a preferred embodiment of the present invention, the bacterial cell comprises plasmid pMSE-4. A method for constructing this plasmid is described in the descriptions of the figures, and the plasmid itself is described in Example 2. This plasmid is deposited under ATCC Accession No. 43250.

Kyseessa olevan keksinnon eraassa toisessa edullisessa suoritusmuodossa bakteerisolu sisaltaa plasmidin pMSARB4. Menetelmaå taman plasmidin konstruoimiseksi kuvataan kuvien selityksissa, ; ja plasmidia itseaan kuvataan esimerkissa 5. Tama plasmidi saat- ' taa olla konstruoitu pSOD/^T-11: stå, joka on tallennettu theIn another preferred embodiment of the present invention, the bacterial cell comprises the plasmid pMSARB4. The method for constructing this plasmid is described in the legends of the figures; and the plasmid itself is described in Example 5. This plasmid may be constructed from pSOD / T-11 stored in the

American Type Culture Collectioniin talletusnumerolla 53468.To the American Type Culture Collection under deposit number 53468.

Kyseessa olevan keksinnon spesifisissa suoritusmuodoissa entsy-maattisesti aktiivisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogin valmistaa E. colin kannan A4255 solu, joka sisaltaa plasmidin pMSE-4, seka E. colin kannan A4255 solu, joka sisaltaa plasmidin pMSARB4.In specific embodiments of the present invention, the enzymatically active human manganese superoxide dismutase analog is prepared by an E. coli strain A4255 cell containing plasmid pMSE-4 and an E. coli strain A4255 cell containing plasmid pMSARB4.

Sopiva valmistukseen kaytettava elatusaine bakteerisolua vårten voi olla hyvaksyttavan elatusaineen mika tahansa tyyppi, kuten esimerkiksi kaseiinihydrolysaatti- tai LB (Luria Broth)-elatusaine, joista viimeksi mainittu on edullinen. Sopivat 20 90353 kasvatusolosuhteet vaihtelevat E. colin kannan ja sen sisåltå-man plasmidin mukaisesti, esimerkiksi E. coli A4255, joka sisaltaa plasmidin pMSE-4, indusoidaan 42°C:ssa ja sitå pidetaan ylla mainitussa lampotilassa noin 1-5 tunnin ajan. Sopivat låmpotila-, aika-, ravistelu- ja ilmastusolosuhteet ympin kasva-tusta seka viljelman kasvatusta vårten sopivaan tiheyteen ennen tuotantovaihetta seka viljelman yllåpitåmiseksi tuotantovaiheen aikana, saattavat vaihdella ja ne ovat tuttuja aiheeseen pereh-tyneille.A suitable culture medium for the bacterial cell may be any type of acceptable medium, such as casein hydrolyzate or LB (Luria Broth) medium, the latter being preferred. Suitable growth conditions vary according to the E. coli strain and the plasmid contained therein, for example E. coli A4255 containing plasmid pMSE-4 is induced at 42 ° C and maintained at said temperature for about 1-5 hours. Suitable temperature, time, shaking, and aeration conditions for inoculation as well as for growing the culture to a suitable density prior to the production step and for maintaining the culture during the production step may vary and are familiar to those skilled in the art.

Elatusaineen Mn++-ionikonsentraatio, joka tarvitaan entsymaatti-sesti aktiivisen MnSODrn valmistamiseksi, vaihtelee kåytetyn elatusaineen tyypin mukaisesti.The Mn ++ ion concentration of the medium required to prepare the enzymatically active MnSOD varies depending on the type of medium used.

LB-tyyppisessa elatusaineessa Hn++-ionikonsentraation, joka on 150-750 miljoonasosaa, on havaittu olevan tehokkaan. On edullis-ta, ettå yhdistelmatyyppisissa elatusaineissa Mn++:n konsentraa-tio on noin 50-1500 miljoonasosaa.In the LB-type medium, an Hn ++ ion concentration of 150 to 750 parts per million has been found to be effective. It is preferred that the concentration of Mn ++ in the combination type media be about 50-1500 ppm.

Sopivien varastointi-, viljely-, ymppays- seka tuotantoelatus-aineiden spesifiset aineosat saattavat vaihdella, ja ne ovat tuttuja aiheeseen perehtyneelle.The specific ingredients of suitable storage, culture, seeding and production media may vary and will be familiar to those skilled in the art.

Kyseessa oleva keksinto koskee myos menetelmaa humaani mangaani-superoksididismutaasin tai sen analogin tai mutantin saamiseksi takaisin bakteerisoluista, jotka sisaltavat mainitun entsyymin. Ensin soluja kasitellaan, jotta saadaan proteiinijae, joka sisaltaa soluissa lasnaolevat proteiinit, humaani mangaanisuper-oksididismutaasi tai sen analogi tai mutantti mukaanluettuina, ja sitten proteiinijaetta kasitellaan humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasin tai sen analogin tai mutantin saamiseksi.The present invention also relates to a method for recovering human manganese superoxide dismutase or an analogue or mutant thereof from bacterial cells containing said enzyme. The cells are first treated to obtain a protein fraction containing the proteins present in the cells, including human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof, and then the protein fraction is treated to obtain human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof.

Kyseessa olevan keksinnon edullisessa suoritusmuodossa soluja kasitellaan ensin liukoisten proteiinien erottamiseksi ensin liu-kenemattomista proteiineista seka solunpirstaleista, ja sitten liukoiset proteiinit saadaan takaisin. Nain saatuja liukoisia proteiineja kasitellaan sitten liukoisten proteiinien jakeen, 21 90353 joka sisaltåå humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia, erottamiseksi, esimerkiksi saostami-seksi, ja jae otetaan talteen. Sitten jaetta kasitellaån erik-seen, jotta saadaan talteen humaani mangaanisuperoksididismu-taasi tai sen analogi tai mutantti.In a preferred embodiment of the present invention, the cells are first treated to first separate the soluble proteins from the non-soluble proteins as well as the cell fragments, and then the soluble proteins are recovered. The soluble proteins thus obtained are then treated to separate a fraction of soluble proteins, 21 90353 containing human manganese superoxide dismutase or an analogue or mutant thereof, for example by precipitation, and the fraction is collected. The fraction is then treated with Erik to recover human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof.

Seuraavassa kuvataan kyseesså olevan keksinnon edullisempaa suoritusmuotoa. Ensin bakteerisolut eristetaan tuotantoela-tusaineesta, ja ne lietetaan sopivaan liuokseen, jonka pH on noin 7,0 tai 8,0. Sitten solut pirstotaan ja sentrifugoidaan. Syntyvaå supernatanttia kuumennetaan noin 30-120 minuutin ajan lampotilassa, joka on noin 55-65°C, mieluummin 45-75 minuutin ajan 58-62°C:ssa ja viela edullisemmin yhden tunnin ajan 60° C:ssar sitten se jååhdytetåan alle 10°C, mieluummin noin 4°C:een. Jaahdyttamisen aikana muodostuva saostuma poistetaan, esim. sentrifugoiden, ja sitten jaahdytetty supernatantti dialysoi-daan sopivaa puskuria vastaan. Jaahdytetty supernatantti dialy-soidaan mieluummin ultrasuodatuksen avulla, kåyttåen suodatin-membraania, joka on pienempi kuin 30K, mieluiten 10K. Sopiviin puskureihin sisåltyy 2-millimolaarinen kaliumfosfaattipuskuri, jonka pH on noin 7,8. Samanaikaisesti tåmån dialyysin kanssa tai dialyysin jålkeen jaahdytetty supernatantti saatetaan valinnaisesti konsentroida sopivaan tilavuuteen, esimerkiksi - 0,03 supernatantin alkuperaisesta tilavuudesta on havaittu sopi- vaksi. Pidattyva liuos eluoidaan sitten anioninvaihtokromatogra-; fiapylvaassa sopivasti puskuroidulla liuoksella, esimerkiksi liuoksella, jossa on vahintaan 20 millimoolia kaliumfosfaatti-: puskuria, jonka pH on noin 7,8. Jakeet, jotka sisaltavat super- oksididismutaasin, kootaan, yhdistetaan seka dialysoidaan noin 40-millimolaarista kaliumasetaattia vastaan, jonka pH on 5,5. Dialysoidut, yhdistetyt jakeet eluoidaan sitten kationinvaihto-kromatografiapylvaan lapi, jossa on kaliumasetaatin (KOAC) lineaarinen gradientti noin 40 millimoolista noin 200 millimoo-liin kaliumasetaatti ja pH on 5,5. Huippujakeet, jotka sisalsi-] vat superoksididismutaasia, kootaan ja yhdistetaan. Valinnaisesti saatetaan yhdistetyt huippujakeet sitten dialysoida sopivaa 22 90353 liuosta, esimerkiksi puskuriliuosta vastaan, joka on noin lQ_ millimolaarinen kaliumfosfaatin suhteen ja jonka pH on noin 7,8.A more preferred embodiment of the present invention is described below. First, the bacterial cells are isolated from the production medium and slurried in a suitable solution having a pH of about 7.0 or 8.0. The cells are then fragmented and centrifuged. The resulting supernatant is heated for about 30-120 minutes at a temperature of about 55-65 ° C, preferably for 45-75 minutes at 58-62 ° C, and even more preferably for one hour at 60 ° C, then cooled to below 10 ° C. C, preferably to about 4 ° C. The precipitate formed during cooling is removed, e.g. by centrifugation, and then the cooled supernatant is dialyzed against a suitable buffer. The cooled supernatant is preferably dialyzed by ultrafiltration using a filter membrane smaller than 30K, preferably 10K. Suitable buffers include 2 mM potassium phosphate buffer at a pH of about 7.8. Simultaneously with this dialysis or after dialysis, the cooled supernatant may optionally be concentrated to a suitable volume, for example - 0.03 of the original volume of supernatant has been found suitable. The retained solution is then eluted by anion exchange chromatography; in a column with a suitably buffered solution, for example a solution of at least 20 millimoles of potassium phosphate: buffer having a pH of about 7.8. Fractions containing superoxide dismutase are pooled, pooled and dialyzed against about 40 mM potassium acetate at pH 5.5. The dialyzed combined fractions are then eluted through a cation exchange chromatography column with a linear gradient of potassium acetate (KOAC) from about 40 mmol to about 200 mmol of potassium acetate and a pH of 5.5. The peak fractions containing superoxide dismutase are pooled and pooled. Optionally, the combined peak fractions may then be dialyzed against a suitable solution, for example, a buffer solution of about 10 millimolar relative to potassium phosphate and having a pH of about 7.8.

Kyseessa oleva keksinto koskee myos puhdistettua, esimerkiksi sellaista, jossa ei oleellisesti ole muita ihmisperaisiå aine-osia, humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogeja tai mutantteja, jotka on valmistettu kyseessa olevan keksinnon mukaisin menetelmin. Erityisesti kyseessa oleva keksinto koskee humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia, jonka polypep-tideillå on kuvassa 1 esitetty aminohapposekvenssi, jonka N-paate on lysiini, jota kuvan 1 nukleotidit 115-117 koodittavat, ja jonka sekvenssin COOH-paate on lysiini, jota koodittavat kuvan 1 nukleotidit 706-708, ja jossa sekvenssissa on ylimaå-rainen metioniinitåhde N-paåsså (Met-hMnSOD). Kyseessa olevan keksinnon edullinen patentinsuoritusmuoto koskee puhdistettua Met-hMnSOD: a, jonka spesifinen aktiivisuus on 3500 yksikkoa/mg.The present invention also relates to a purified, e.g., substantially free of, other human constituents, human manganese superoxide dismutase, or analogs or mutants thereof, prepared by the methods of the present invention. In particular, the present invention relates to an analog of human manganese superoxide dismutase, the polypeptides of which have the amino acid sequence shown in Figure 1, the N-terminus of which is lysine encoded by nucleotides 115-117 of Figure 1, and the COOH base of which comprises lysine encoded by nucleotides 70 of Figure 1. -708, and in which the sequence has an excess methionine residue at the N-terminus (Met-hMnSOD). A preferred embodiment of the present invention relates to purified Met-hMnSOD having a specific activity of 3500 units / mg.

Esimerkkejafor example

Esimerkkien, joita seuraavassa esitetaan kyseessa olevan keksinnon ymmartamiseksi, tarkoituksena ei ole rajoittaa keksinnon piiria eika niiden tulisi olla siten laadittuja. Kyseessa olevat esimerkit eivat sisalla yksityiskohtia tavanomaisista menetelmis-ta, joita kaytetaan vektoreiden konstruointiin, polypeptideita koodittavien geenien vientiin (insertioon) sellaisiin vektorei-h i π tai syntyvien plasmidien si i r tami.sessa i santasol ui hi n . Esimerkkeihin ei myoskaan sisally yksityiskohtaista kuvausta tavanomaisista menetelmista, joita kaytetaan maaritettaessa polypeptide ja, joita sellaiset isantavektorijarjestelmat val-mistavat tai joita kaytetaan sellaisten polypeptidien identitee-tin maarittamiseksi isoelektristen fokusointigeelien (IEF) aktii-visen varjayksen avulla. Sellaiset menetelmat ovat aiheeseen perehtyneiden hyvin tuntemia, ja niita kuvataan useissa jul-kaisuissa, esimerkiksi seuraavat julkaisut mukaan luettuina: T. Maniatis, E.F. Fritsch ja J. Sombrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982) .The following examples are not intended to limit the scope of the invention and should not be construed as such. The present examples do not include details of conventional methods used to construct vectors, to export (insert) genes encoding polypeptides into such vector h-π, or to transfer the resulting plasmids into santasol ui hi n. The examples also do not include a detailed description of conventional methods used to determine a polypeptide prepared by such host vector systems or used to determine the identity of such polypeptides by active shielding of isoelectric focusing gels (IEFs). Such methods are well known to those skilled in the art and are described in several publications, including, for example, T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sombrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982).

23 90353 J.M. McCord ja I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244:6049-55 (1969).23 90353 J.M. McCord and I. Fridovich, J. Biol. Chem. 244: 6049-55 (1969).

C. Beauchamp ja I. Fridovich, Anal. Biochem. 44:276-87 (1971).C. Beauchamp and I. Fridovich, Anal. Biochem. 44: 276-87 (1971).

Esimerkki 1Example 1

MnSOD-cDNA-kloonien identifioimiseksi syntetisoitiin seos-oligomeerikoettimia julkaistun aminohapposekvenssin mukaisesti (18, 19).To identify MnSOD cDNA clones, mixed oligomer probes were synthesized according to the published amino acid sequence (18, 19).

5'-koetin - 30 mer sekvenssi AA, _ - aa„, (18, 19) - Ib 24 5 ' 3 '5 'probe - 30 mer sequence AA, _ - aa „, (18, 19) - Ib 24 5' 3 '

TTGCATAATTTGTGCCTTAATGTGTGGTTCTTGCATAATTTGTGCCTTAATGTGTGGTTC

T G T GT G T G

G GG G

31-koetin - 32 mer sekvenssi AA179 - AAlgg (18) 5' 3 '31 probe - 32 mer sequence AA179 - AAlgg (18) 5 '3'

TCTGTTACGTTTTCCCAGTTTATTACGTTCCA G G G GTCTGTTACGTTTTCCCAGTTTATTACGTTCCA G G G G

5'-koetin, joka koostuu 30 nukleotidista, vastaa kypsan MnSODrn aminohappoja 15-24. 3'-koetin, joka koostuu 32 nukleotidista, vastaa kypsan MnSOD:n aminohappoja 179-189. 5'-koetin on seos- koetin, joka koostuu 36 eri sekvenssista, kuten ylla on osoitet-tu. 3'-koetin on seoskoetin, joka koostuu 16 eri sekvenssista, kuten ylla on osoitettu. (Kun useampia kuin yksi nukleotidi on merkitty tiettyyn asemaan, DNA-saie syntetisoitiin kåyttaen ekvimolaarisia maaria kutakin merkittya nukleotidiå, jolloin syntyi seoskoetin.) 5'-koetinta kaytettiin seulottaessa ^gt-lO-vektoriin kloonatun T-solun cDNA-kirjaston 300 000 plakkia. Hybridisointi faagi-plakkikopioille (phage plaque replicas), jotka oli tehty liik-kumattomiksi nitroselluloosasuodattimilla, suoritettiin standar-dimenetelmin (Maniatis et al. supra) paitsi, etta hybridisointi suoritettiin 50°C:ssa, 8xSSC:ssa, 16 tunnin ajan. Sitten suodattimia pestiin 50°C:ssa 5xSSC:lla ja 0,1 /É:isella SDS:llå 90353 24The 5 'probe, consisting of 30 nucleotides, corresponds to amino acids 15-24 of mature MnSOD. The 3 'probe, consisting of 32 nucleotides, corresponds to amino acids 179-189 of mature MnSOD. The 5 'probe is a mixed probe consisting of 36 different sequences, as indicated above. The 3 'probe is a mixture probe consisting of 16 different sequences, as indicated above. (When more than one nucleotide is labeled at a particular position, the DNA band was synthesized using equimolar Maari for each labeled nucleotide to generate a mixture probe.) The 5 'probe was used to screen 300,000 plaques from a T cell cDNA library cloned into the ^ gt-10 vector. Hybridization to phage plaque replicas immobilized with nitrocellulose filters was performed by standard methods (Maniatis et al. Supra) except that hybridization was performed at 50 ° C, 8xSSC, for 16 hours. The filters were then washed at 50 ° C with 5xSSC and 0.1 / S SDS 90353 24

Kolme positiivista plakkia eristettiin, ja ne nimitettiin Phi MS8:ksi, Phi MSl:ksi ja Phi MSlJ:ksi.Three positive plaques were isolated and designated Phi MS8, Phi MS1, and Phi MS1J.

EcoRI:n avulla Phi MS8:sta ja Phi MSl:sta saadut DNA:n pilkkou-tumistuotteet ilmaisivat, etta niilla molemmilla on cDNA-insert-tejå, jotka ovat noin 800 emasparin mittaisia ja jotka hybridi-soituvat sekå 5'- etta 3'-oligonukleotidikoettimiin. Phi MSlJrssa oli ainoastaan 450 emasparin mittainen cDNA-insertti, joka hybri-disoitui ainoastaan 5'-paatteiseen koettimeen.DNA digestion products from Phi MS8 and Phi MS1 using EcoRI indicated that they both have cDNA inserts of about 800 base pairs in length that hybridize to both the 5 'and 3' pairs. oligonucleotide probes. Phi MS1J had only a 450 bp cDNA insert that hybridized only to the 5 'probe.

Kolmen faagikloonin EcoRI-insertit alakloonattiin pBR322:n EcoRI-kohtaan, mikå vastaavasti tuotti pMS8-4:n, pMSl-4:n seka pMSlJ:n. Restriktioanalyysi ja hybridisointi 5'- ja 3'-oligo-nukleotidikoettimiin osoitti, etta seka pMS8-4:lla etta pMSl-4:llå on samanlaiset kaavat. Molemmille plasmideille on johdettu seuraava restriktiokartta, joka ilmaisee 5' - > 3’- suuntauksen.The EcoRI inserts of the three phage clones were subcloned into the EcoRI site of pBR322 to produce pMS8-4, pMS1-4, and pMS1J, respectively. Restriction analysis and hybridization to the 5 'and 3' oligonucleotide probes showed that both pMS8-4 and pMS1-4 have similar formulas. The following restriction map is derived for both plasmids, showing the 5 '-> 3' orientation.

5 ’ RI PvuII PvuII Seal Baml Stul Ri 1 i l i II l5 'RI PvuII PvuII Seal Baml Stul Ri 1 i l i II l

±1 -.....1 -» I II "Ί - ~-----L± 1 -..... 1 - »I II" Ί - ~ ----- L

100 200 300 400 500 600 700 800 pMS8-4:n cDNA-insertin sekvenssi esitetaan kuvassa 1. Ennustet- tu aminohapposekvenssi eroaa julkaistusta aminohapposekvenssista (19) siina, etta Glu on havaittavissa Gln:n tilalla kolmessa (3) asemassa ( AA 42, 88, 108) ja valilla AA,0_, on kaksi * 123-124 ylimaaraista aminohappoa Gly ja Trp. pMSl-4:n ja pMSlJ:n sekvenssianalyysi ilmaisi, etta riippumattomasti oli johdettu kolme MnSOD-kloonia, ja varmisti nama erot julkaistuun amino-happosekvenssiin nahden.The sequence of the cDNA insert of pMS8-4 100 200 300 400 500 600 700 800 is shown in Figure 1. The predicted amino acid sequence differs from the published amino acid sequence (19) in that Glu is detectable in place of Gln at three (3) positions (AA 42, 88, 108) and between AA, 0_, there are two * 123-124 excess amino acids Gly and Trp. Sequence analysis of pMS1-4 and pMS1J revealed that three MnSOD clones had been independently derived and confirmed these differences from the published amino acid sequence.

Valmiin MnS0D:n N-terminaalisen lysiinin ylapuolella sijaitseva sekvenssi johtaa 24 aminohapon mittaiseen esipeptidisekvenssiin.The sequence above the N-terminal lysine of the mature MnSOD results in a 24 amino acid prepeptide sequence.

25 9035325 90353

Esimerkki 2Example 2

DD

pMSE-4:n rakenne: Amp humaani MnSODrn ekspressioplasmidiStructure of pMSE-4: Amp human MnSODr expression plasmid

Lahtdkohta pMSE-4:n rakenteelle on plasmidi pMS8-4, joka on saatu esimerkissa 1 kuvatulla tavalla. Plasmidi pMS8-4, joka sisåltaa humaani MnSODrn cDNA:n EcoRI-insertillå, pilkottiin tay-dellisesti Ndel- ja Narl-restriktioentsyymeilla. Suuri fragment-ti eristettiin ja sidottiin synteettisen oligomeerin kanssa kuvassa 2 esitetylla tavalla. Syntyva plasmidi, pMS8~NN sisaltaa kypsaa MnSODra koodittavan alueen, jota edeltaa ATG-aloitus-kodoni. Mainittu plasmidi pilkottiin EcoRIrllå, paat tayden-nettiin polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla, ja pilkottiin edel-leen Ndelrllå. Pieni fragmentti, joka sisalsi MnSOD-geenin, vie-tiin pSOD 13:een (suoritettiin insertio), jota oli kasitelty Ndelrllå jaStuIrlla. pSOD 13 saatetaan saada, kuten on kuvattu kasittelyn alaisessa US-patenttihakemuksessa 644 245 ja joka tahan yhteyteen on sisallytetty viitteena. Tata muodostettua plasmi-dia pMSE-4, joka sisalsi MnSODra koodittavan alueen, edelsi ribosomien sitoutumispaikka ell ja se oli /'-p -promoottorin kontrol-lin alainen. Plasmidi pMSE-4 on tallennettu the American Type Culture Collectioniin ATCC-talletusnumerolla 53250. Kaikki ylla esitetyissa valmistuksissa kaytetyt menetelmat olivat Maniatisin, supra, kuvaamia menetelmia.The starting point for the structure of pMSE-4 is plasmid pMS8-4, obtained as described in Example 1. Plasmid pMS8-4, which contains human MnSODr cDNA with an EcoRI insert, was completely digested with NdeI and NarI restriction enzymes. The large fragment was isolated and ligated with the synthetic oligomer as shown in Figure 2. The resulting plasmid, pMS8 ~ NN, contains the mature MnSODra coding region preceded by the ATG start codon. Said plasmid was digested with EcoRI, complemented with a Klenow fragment of polymerase I, and further digested with NdeI. A small fragment containing the MnSOD gene was inserted into pSOD 13 (insertion was performed) treated with NdeI and StuI. pSOD 13 may be obtained as described in the pending U.S. Patent Application 644,245 and is incorporated herein by reference. The resulting plasmid pMSE-4, which contained the MnSODra coding region, was preceded by the ribosome binding site ell and was under the control of the / '- p promoter. Plasmid pMSE-4 is deposited in the American Type Culture Collection under ATCC Accession No. 53250. All methods used in the above preparations were those described by Maniatis, supra.

Esimerkki 3Example 3

Yhdistelma humaani MnSODrn ilmentyminenCombination of human MnSOD expression

Plasmidi pMSE-4 vietiin sisaan Escherichia colin kantaan A4255 tunnettuja menetelmia kayttamalla. Sitten E. colin kantaa 4255, joka sisalsi pMSE-4rn, kasvatettiin 32°C:ssa, Luria-lihaliemi-elatusaineessa (LB), joka sisalsi ampisilliinia 100 g/ml, optiseen tiheyteen (OD) 0,7, 600 nmrsså mitattuna. Naytteille, jotka oli otettu eri aikavalein, suoritettiin elektroforeettinen :-. erotus natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyiiamidigeeleilla (SDS-PAGE). Geelit osoittivat lisaantymista humaani MnSOD-tasoissa aina 120 minuutin jalki-induktioon saakka, jossa vaiheessa yhdistelma-MnSOD-proteiini kasitti 27 % solun kokonais-proteiineista Coomassie-bluella varjatyn geelin seulonnalla 26 90 353 måaritettynå. Naytteiden 90 sekunnin mittainen aanikasittely W-375-åånikåsittelylaitteessa seka proteiinien jakaminen liukoi-siin (s) ja liukenemattomiin jakeisiin (p) sentrifugoimalla 10 OOO x g 5 minuutin ajan ilmaisi, ettå suurin osa valmistetus-ta yhdistelma-MnSOD:sta oli liukenematonta. Indusoitu, liukoi-nen proteiinijae sisalsi vain vahan enemmån SOD-aktiivisuutta kuin indusoitu vastinosa, standardimenetelmin suoritetun maari-tyksen perusteella. Katso McCord et al., supra. Nahtavasti MnSOD:n osa, joka on liukoisessa jakeessa, on inaktiivista.Plasmid pMSE-4 was introduced into Escherichia coli strain A4255 using known methods. E. coli strain 4255 containing pMSE-4 was then grown at 32 ° C in Luria broth medium (LB) containing ampicillin 100 g / ml to an optical density (OD) of 0.7 at 600 nm. Samples taken at different time intervals were subjected to electrophoretic:. separation on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels (SDS-PAGE). The gels showed an increase in human MnSOD levels up to a 120 minute foot induction, at which point recombinant MnSOD protein accounted for 27% of the total cellular proteins by screening the Coomassie blue-coated gel at 26,905,33 assays. 90 seconds of sonication of the samples in a W-375 sonicator and separation of proteins into soluble (s) and insoluble fractions (p) by centrifugation at 10,000 x g for 5 minutes indicated that most of the recombinant MnSOD prepared was insoluble. The induced, soluble protein fraction contained only slightly more SOD activity than the induced counterpart, as determined by standard methods. See McCord et al., Supra. Apparently, the portion of MnSOD present in the soluble fraction is inactive.

Tama antaa aiheen olettaa, etta suurin osa humaani MnSODista, joka on valmistettu tassa esimerkissa kuvatuissa olosuhteissa, on vaikutukseltaan tehotonta.This suggests that most of the human MnSOD prepared under the conditions described in this example is ineffective.

Esimerkki 4 +4-Example 4 + 4-

Elatusaineeseen sisåltyvån Mn :n vaikutus MnSOD:n liukoisuuteen ja aktiivisuuteen_Effect of Mn in the medium on the solubility and activity of MnSOD_

Mn++:n lisayksella, joka suoritettiin lisaantyvina konsentraatioi-na aina 450 miljoonasosaan saakka, E. coli A4255:n elatusaineeseen, joka sisalsi pMSE-4:a, ennen 2 tunnin mittaista induktiota 42°C:ssa, ei ollut mitaan haitallista vaikutusta humaani MnSODtn kokonaissaantoon. Liukoisten (s) seka liukenemattomien,(p), aanikasiteltyjen proteiinijakeiden analyysi, joka suoritettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla (SDS-PAGE), osoitti yhdistelmaproteiinin lisaantynytta liukoisuutta Mn++:n konsentraatioiden lisaantyessa (taulukko 1). S0D:n aktiivisuuden maarittaminen (katso McCord et al., supra) antaa aihetta olettaa, etta vallitsee korrelaatio elatusaineen lisaantyvien Mn++:n konsentraatioiden ja MnSOD:n lisåantyneen liukoisuuden valilla, elatusaineen selvan optimikonsentraation Mn++:n ollessa 150 miljoonasosaa (kuva 3). Lisaksi, lisaånty-neet Mn++:n konsentraatiot aktivoivat aiemmin inaktiivista liukoista entsyymia. Naita Mn++:n konsentraatioita kayttaen kasvatettujen, indusoitujen viljelmien liukoiset proteiinijakeet osoittavat aina 60-kertaista lisaantymista SOD:n aktiivisuudessa verrattuna liukoisiin proteiinijakeisiin, jotka on saatu indu-soimattomista viljelmista, joita on kasvatettu nailla Mn++:n 27 90353 konsentraatioilla. Isoelektrisen fokusoinnin geelien (IEF) aktiivisuusvårjåys (katso Beaucham et al., supra) ilmaisi, ettå yhdistelma MnSODrn multimuodot olivat yhtålaisia luonnon-mukaisen humaani MnSODrn multimuotojen kanssa.The addition of Mn ++, performed at increasing concentrations up to 450 ppm, to E. coli A4255 medium containing pMSE-4 before induction for 2 hours at 42 ° C had no adverse effect on human MnSOD. the overall yield. Analysis of soluble (s) as well as insoluble, (p), heat-treated protein fractions by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showed increased solubility of the recombinant protein with increasing concentrations of Mn ++. Determining the activity of SOD (see McCord et al., Supra) suggests that there is a correlation between increasing concentrations of Mn ++ in the medium and increased solubility of MnSOD, with a Mn ++ image of the optimum concentration of Selva in the medium being 3 ppm. In addition, increased concentrations of Mn ++ previously activated an inactive soluble enzyme. Soluble protein fractions of induced cultures grown using Naita Mn ++ concentrations always show a 60-fold increase in SOD activity compared to soluble protein fractions obtained from uninduced cultures grown with these concentrations of Mn ++ 27,90353. The activity staining of the isoelectric focusing gels (IEF) (see Beaucham et al., Supra) indicated that the multimodes of the combination MnSOD were similar to the multimodes of wild-type human MnSOD.

Tulokset, jotka on saatu humaani MnSOD:n valmistuksen suhteen E. coli A1645:n avulla, ovat samankaltaisia kuin ylla esite-tyt tulokset.The results obtained for the preparation of human MnSOD by E. coli A1645 are similar to the results presented above.

Taulukko 1table 1

Mn+ Prosentteja Prosentteja Spesifinen ak- (miljoo- liukoista hu- liukoista hu- tiivisuus yksi- nasosia) maani MnSOD:a maani MnSODra koitå/mg liu- indusoidusta liukoisista koisia proteii- kokonais- bakteeriperai- neja humaani sistå proteii-Mn + Percent Percent Specific ak- (million soluble soluble solubility monoparticles) my country MnSOD my country MnSODra / mg of solubilized soluble protein total bacterial protein human human protein

MnSOD:sta neistå O 30,6 7,2 30 50 72,7 15,4 241 100 78,0 16,9 356 150 82,9 18,8 606 200 82,0 20,8 338 250 79,2 20,4 380 300 80,8 20,3 381 450 89,2 22,4 323Of MnSOD of which O 30.6 7.2 30 50 72.7 15.4 241 100 78.0 16.9 356 150 82.9 18.8 606 200 82.0 20.8 338 250 79.2 20, 4,380,300 80.8 20.3,381,450 89.2 22.4,323

Esimerkki 5 pMSARB4;n rakenne: Tet humaani MnS0D:n ekspressioplasmidiExample 5 Structure of pMSARB4: Tet human MnSO 4 expression plasmid

Tet ekspressioplasmidi pARB valmistettiin pSOD^T-11:sta pilk-komalla taydellisesti EcoRIrlla, jonka jalkeen suoritettiin osit-tainen pilkkominen BamHI-restriktioentsyymeilla. pSOD^T-11 on tallennettu the American Type Culture Collectioniin talletus-numerolla 53468. Pilkottu plasmidi sidottiin synteettisen oligo-meerin kanssa, jolla oli seuraava rakenne: 5’- AATTCCCGGGTCTAGATCT - 3’ 3’- GGGCCCAGATCTAGACTAG - 5’ jolloin saatiin pARB, joka sisalsi ^P^-promoottorin.The Tet expression plasmid pARB was prepared from pSOD ^ T-11 by complete digestion with EcoRI, followed by partial digestion with BamHI restriction enzymes. pSOD ^ T-11 is deposited in the American Type Culture Collection under accession number 53468. The digested plasmid was ligated with a synthetic oligomer having the following structure: 5'-AATTCCCGGGTCTAGATCT-3 '3'-GGGCCCAGATCTAGACTAG-5' to give pARB, which contained the ^ P ^ promoter.

28 9 0 35328 9 0 353

MnSOD:n ekspressioplasmidi pMSE-4:n EcoRI-fragmentti, joka sisalsi cll ribosomien sitoutumispaikan seka kypsan entsyymin taydellisen koodaussekvenssin , vietiin (insertoitiin) pARB:n ainoaan EcoRI-kohtaan. Syntyvå plasmidi pMSARB4 sisaltaa MnSOD-geenin, joka on λ-Ρ :n saatelyn alainen, seka cll RBS:n ja antaa resistenssin tetrasykliinille (kuva 4).The MnSOD expression plasmid The EcoRI fragment of pMSE-4, which contained the cll ribosome binding site as well as the complete coding sequence of the mature enzyme, was inserted (inserted) into the only EcoRI site of pARB. The resulting plasmid pMSARB4 contains the MnSOD gene, which is subordinate to λ-Ρ, as well as cll RBS and confers resistance to tetracycline (Figure 4).

Esimerkki 6Example 6

Humaani MnSQD:n ekspressio ρΜΕΔRB 4:staExpression of human MnSQD from ρΜΕΔRB 4

Plasmidi pMSARB4 vietiin Escherichia colin kantaan A4255 tun-nettuja menetelmia kayttaen. Viljelmia kasvatettiin 32°C:ssa, Luria-lihaliemessa (LB), joka sisalsi erilaisia konsentraatioi-ta Mn++:a, kunnes 600 nm:ssa saavutettiin optinen tiheys (OD) 6,7. Induktio suoritettiin 42°C:ssa. Naytteille, jotka oli otettu eri aikavalein, suoritettiin elektroforeesi SDS-PAGE:1la. hMnSOD-tasoa nostettiin aina 120 minuutin mittaisen induktioajan avulla, jolloin hMnSOD muodosti noin 15 % solun kokonaisproteii-neista, Coomassie Bluella varjatyn geelin seulonnan avulla maaritettyna.Plasmid pMSARB4 was introduced into Escherichia coli strain A4255 using known methods. Cultures were grown at 32 ° C in Luria broth (LB) containing various concentrations of Mn ++ until an optical density (OD) of 6.7 was reached at 600 nm. Induction was performed at 42 ° C. Samples taken at different time intervals were electrophoresed by SDS-PAGE. The level of hMnSOD was always increased by an induction time of 120 minutes, at which time hMnSOD accounted for about 15% of the total cellular proteins, as determined by screening on a Coomassie Blue-hidden gel.

Indusoitu MnSOD oli liukoinen elatusaineen Mn++-konsentraatios-ta riippumatta. Tama on vastakohta Amp plasmidi pMSE-4:lla saaduille havainnoille. (Katso esimerkki 4.) SOD:n suurin aktiivisuus ja ekspressiotaso riippuivat kuitenkin Mn++:n lisayksesta (taulukko 2).The induced MnSOD was soluble regardless of the Mn ++ concentration of the medium. This is in contrast to the findings obtained with the Amp plasmid pMSE-4. (See Example 4.) However, the maximum activity and expression level of SOD depended on the addition of Mn ++ (Table 2).

29 9035329 90353

Taulukko 2Table 2

MnSOD:n ekspressio E. coli A4255:ssa (pMSÅRB4)Expression of MnSOD in E. coli A4255 (pMSÅRB4)

Miljoonas- Prosenttia liu- Spesifinen aktiivisuus osaa koista hMnSODra yksikoitå/mg liukoisiaMillion- Percent sol- Specific activity may occur hMnSODra units / mg soluble

Mn++:aa liukoisista bak- proteiineja teeriperaisista proteiineista 42° 32° 42° O 10,9 8,0 23 50 19,8 8,0 227 100 16,0 8,0 241 200 17,0 10,0 278 300 16,0 9,3 238Mn ++ soluble bacterial proteins from tera-derived proteins 42 ° 32 ° 42 ° O 10.9 8.0 23 50 19.8 8.0 227 100 16.0 8.0 241 200 17.0 10.0 278 300 16, 0 9.3 238

Esimerkki 7Example 7

Entsymaattisesti aktiivisen yhdistelmå humaani MnS0D:n puhdistaminen_ E. colin kantaa A4255, jossa oli plasmidi pMSARB4, fermentoi-tiin LB:ssa, jota oli taydennetty 750 miljoonasosalla Mn++:a, 32°C:ssa, 17,0:n suuruiseen absorbanssin arvoon 600 nmrsså. Humaani MnS0D:n ekspression induktio saatiin aikaan nostamalla låmpotila 42°C:een 2 tunniksi, jolloin viljelmå saavutti A600:n arvon 43,0. Solut koottiin sentrifugoiden ja ne lietettiin uudelleen 0,2:een alkuperaista tilavuutta 50-millimolaarisessa kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,8, joka sisalsi 250 millimoolia NaCl. Bakteerit pirstottiin, siten etta ne lapåisivat kaksi kertaa Dynomillin, ne sentrifugoitiin ja solupirstaleet heitet-tiin pois. Supernatanttia kuumennettiin yhden tunnin ajan 60°C:ssa, se jåahdytettiin 4°C:een, ja kirkastettu superna-tantti vakevoitiin 0,O3:een alkuperaisesta tilavuudesta ja dialy-soitiin 2-millimolaarista kaliumfosfaattipuskuria vastaan, jonka pH oli 7,8, Pelicon ultrasuodatuslaitteessa, joka oli varustettu membraanilla 10K. Raaka entsyymivalmiste pantiin DE52-pylvaaseen, jota pestiin perusteellisesti 2-millimolaari-sella kaliumfosfaattipuskurilla, pH 7,8, ja eluoitiin 20-milli-molaarisella kaliumfosfaattipuskurilla, pH 7,8. Yhdistetyt jakeet, jotka sisalsivat entsyymin, dialysoitiin 40-millimolaa- 30 90 353 rista kaliumasetaattia, pH 5,5, vastaan, ne pantiin CM52-pylvåå-seen ja niita eluoitiin 40-200-millimolaarisen kaliumasetaatin, pH 5,5, lineaarisella gradientilla. Huippujakeet, jotka sisalsi-vat: humaani MnSODra, yhdistettiin, niita dialysoitiin Η£θ:3 vastaan, palautettiin 10-millimolaariseen kaliumfosfaattipusku-riin, pH 7,8, seka jaadytettiin -20°C:ssa.Purification of Enzymatically Active Combination of Human MnSOD_ E. coli strain A4255 with plasmid pMSARB4 was fermented in LB supplemented with 750 ppm Mn ++ at 32 ° C to an absorbance of 600 at 600.0. nmrsså. Induction of human MnSOD expression was achieved by raising the temperature to 42 ° C for 2 hours, when the culture reached an A600 of 43.0. Cells were harvested by centrifugation and resuspended in 0.2 original volumes in 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.8, containing 250 mM NaCl. The bacteria were disrupted to shovel Dynomill twice, centrifuged, and the cell fragments discarded. The supernatant was heated for one hour at 60 ° C, cooled to 4 ° C, and the clarified supernatant was stabilized at 0.03 of the original volume and dialyzed against 2 mM potassium phosphate buffer pH 7.8, Pelicon in an ultrafiltration apparatus equipped with a 10K membrane. The crude enzyme preparation was applied to a DE52 column, which was washed thoroughly with 2 mM potassium phosphate buffer, pH 7.8, and eluted with 20 mM potassium phosphate buffer, pH 7.8. The combined fractions containing the enzyme were dialyzed against 40 mM potassium acetate, pH 5.5, applied to a CM52 column and eluted with a linear gradient of 40-200 mM potassium acetate, pH 5.5. Peak fractions containing: human MnSODra were pooled, dialyzed against Η £ θ: 3, returned to 10 mM potassium phosphate buffer, pH 7.8, and frozen at -20 ° C.

Saatu yhdistelma humaan MnSOD oli enemman kuin 99 %:sesti puhdas, sen spesifinen aktiivisuus oli noin 3500 yksikkoa/mg. Puhdis-tusmenetelman kokonaissaanto oli noin 30 % (taulukko 3).The resulting combination of human MnSOD was more than 99% pure, with a specific activity of about 3500 units / mg. The overall yield of the purification process was about 30% (Table 3).

Puhdistetun entsyymin sekvensointi ilmaisee 1isametioniinin lasnaolon N-terminaalisessa aminohapossa verrattuna tunnettuun humaani MnS0D:een (19).Sequencing of the purified enzyme indicates the presence of isamethionine at the N-terminal amino acid compared to the known human MnSOD (19).

Metallipitoisuuden analyysi, joka suoritettiin atomiabsorption avulla, antoi noin 0,77 Mn-atomia entsyymialayksikkoa kohti.Analysis of the metal content by atomic absorption gave about 0.77 Mn atoms per enzyme subunit.

Tama on so'pusoinnussa julkaistujen tietojen kanssa (23).This is in line with published data (23).

90353 31 O’90353 31 O ’

EE

•h :ra H P>• h: ra H P>

4-J -H4-J -H

λ: :0 ro x r~ r~- o cm oλ:: 0 ro x r ~ r ~ - o cm o

-H i—i <J\ uo ro O-H i — i <J \ uo ro O

c ni ih ro lo (D Χί rH i—i oh ro C >1c ni ih ro lo (D Χί rH i — i oh ro C> 1

<H<H

μη cn •h 3 tn 3 ·Ό <i) tn ί-1 α -η w CO > :Π3 S-i Q) tnμη cn • h 3 tn 3 · Ό <i) tn ί-1 α -η w CO>: Π3 S-i Q) tn

•H•B

EE

>< :ra O σι O O ro - , - .. - ro ^ O oo o co m p O lo lo ro tn> <: ra O σι O O ro -, - .. - ro ^ O oo o co m p O lo lo ro tn

O Ή <DO Ή <D

pi topi to

C -HC -H

co a pco a p

(OOCTlCM U1 Γ~ CM P(OOCTlCM U1 Γ ~ CM P

coco * « ' » · 3 m i—i oo in ^34 p p Di ή w P>coco * «'» · 3 m i — i oo in ^ 34 p p Di ή w P>

tn Ctn C

•H CO• H CO

Ti 3Ti 3

CC

P 'HP 'H

α pi ήα pi ή

•H•B

ro C C id • -H r-tro C C id • -H r

O Q -HO Q -H

o o> Po o> P

ϋ W PJ pi 3 C O O O O ro cm pi rH Σ P ~ ~ φ p \ Q. Di O O r~ 'tf p! m tn o rvj cm tnϋ W PJ pi 3 C O O O O ro cm pi rH Σ P ~ ~ φ p \ Q. Di O O r ~ 'tf p! m tn o rvj cm tn

E-ι ·ίι -Η rH *HE-ι · ίι -Η rH * H

•H rO• H rO

C C -CC C -C

(BO P(BO P

to λ: α E o p x. c .c oto λ: α E o p x. c .c o

:r0 tB: r0 tB

ε ϋε ϋ

r—I *(H Or — I * (H O

(D pi -ro pi pi cn c i p> •H fB >1 tB >1 4)(D pi -ro pi pi cn c i p> • H fB> 1 tB> 1 4)

Ti pi pi Ti C rHTi pi pi Ti C rH

SZ Λ H O >1 ΉSZ Λ H O> 1 Ή

Sh c Φ 3 PI -HSh c Φ 3 PI -H

sh pi tn p1 Esh pi tn p1 E

tlJ Ή *H tB tfO ·Η ·Η α μη iiB pjpj >i 3 :tB pi pi -h pi pi cn tn j* c «η α tB tB p>tlJ Ή * H tB tfO · Η · Η α μη iiB pjpj> i 3: tB pi pi -h pi pi cn tn j * c «η α tB tB p>

I tB p tB tB CI tB p tB tB C

rH to pi I to 3 3 0)rH to pi I to 3 3 0)

: rH tn (B C tn rH rH: rH tn (B C tn rH rH

<D -Htncototua) pi .C E ·· P O <D W I I o -η ouid-hcoocncn > to cocirH^pinin p > >>03 Q) 3 ·Η W Σ < QLOtnOjPrHQU * 32 90 353<D -Htncototua) pi .C E ·· P O <D W I I o -η ouid-hcoocncn> to cocirH ^ pinin p> >> 03 Q) 3 · Η W Σ <QLOtnOjPrHQU * 32 90 353

Kir jailisuusviit teet 1. McCord, J.M. ja Fridovich, I., J. Biol. Chem. 244: 6049-55 (1969).Literature Suite Tea 1. McCord, J.M. and Fridovich, I., J. Biol. Chem. 244: 6049-55 (1969).

2. Fridovich, I. julkaisussa Advances in Inorganic Biochemistry, toimittajat Eichhorn, G.L. ja Marzilli, L.G.2. Fridovich, I. in Advances in Inorganic Biochemistry, editors Eichhorn, G.L. and Marzilli, L.G.

(Elsevier/North Holland, New York), ss. 67-90 (1979).(Elsevier / North Holland, New York), ss. 67-90 (1979).

3. Freeman, B.A. ja Crapo, J.D., Laboratory Investion 47:412-26 (1982).3. Freeman, B.A. and Crapo, J.D., Laboratory Investion 47: 412-26 (1982).

4. Steinman, H.M. julkaisussa Superoxide Dismutase, toimit-taja Oberley, L.W. (CRC Press, Florida), ss. 11-68 (1982).4. Steinman, H.M. in Superoxide Dismutase, edited by Oberley, L.W. (CRC Press, Florida), ss. 11-68 (1982).

5. Hartz, J.W. ja Deutsch, H.F., J. Biol. Chem. 247:7043-50 (1972 ) .5. Hartz, J.W. and Deutsch, H.F., J. Biol. Chem. 247: 7043-50 (1972).

6. Jabusch, J.R., Farb, D.L., Kerschensteiner, D. A. ja Deutsch, H.F., Biochemistry 19:2310-16 (1980).6. Jabusch, J.R., Farb, D.L., Kerschensteiner, D.A. and Deutsch, H.F., Biochemistry 19: 2310-16 (1980).

7. Barra, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, M.W., Rotilio, W.H., Bannister, W.H. ja Bossa, F., FEBS Letters 120:53-56 (1980).7. Barra, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, M.W., Rotilio, W.H., Bannister, W.H. and Bossa, F., FEBS Letters 120: 53-56 (1980).

8. Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. ja Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2808-11 (1982).8. Lieman-Hurwitz, J., Daphne, N., Lavie, V., and Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2808-11 (1982).

9. Sherman, L., Dafni, N., Lieman-Hurwitz, J. ja Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:5465-69 (1983).9. Sherman, L., Dafni, N., Lieman-Hurwitz, J. and Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5465-69 (1983).

10. Oberley, L.W. ja Buettner, G.R., Cancer Research 39:1141-49 (1979).10. Oberley, L.W. and Buettner, G.R., Cancer Research 39: 1141-49 (1979).

11. Huber, W ja Menander-Huber, K.B., Clinics in Rheum. Dis. 6:465-98 (1980).11. Huber, W, and Menander-Huber, K.B., Clinics in Rheum. Dis. 6: 465-98 (1980).

12. McCord, J.M. ja Roy, R.S., Can. J. Physiol. Pharma. 60:1346-52 (1982).12. McCord, J.M. and Roy, R.S., Can. J. Physiol. Pharma. 60: 1346-52 (1982).

33 SO 355 13. Alvarez, J.G. ja Storey, B.T., Biol. Reprod. 28:1129-36 (1983) .33 SO 355 13. Alvarez, J.G. and Storey, B.T., Biol. Reprod. 28: 1129-36 (1983).

14. Talmasoff, J.M., Ono, T. ja Cutler, R.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2777-81 (1980).14. Talmasoff, J.M., Ono, T., and Cutler, R.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2777-81 (1980).

15. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. ja Randall, R.J., J. Biol. Chem. 193:265-75 (1951).15. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. and Randall, R.J., J. Biol. Chem. 193: 265-75 (1951).

16. Weser, U. ja Hartmann, H.J., FEBS Letters 17:78-80 (1971).16. Weser, U. and Hartmann, H.J., FEBS Letters 17: 78-80 (1971).

17. Jewett, S.LO., Latrenta, G.S. ja Beck, C.M., Arc. Biochem. Biophys. 215:116-128 (1982).17. Jewett, S.LO., Latrenta, G.S. and Beck, C.M., Arc. Biochem. Biophys. 215: 116-128 (1982).

18. Harris, J.I. ja Steinman, H.M., Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson, A.M., McCord, J.M. ja Fridovich, I. toimittajat, Academic Press, London, ss. 225-230 (1977).18. Harris, J.I. and Steinman, H.M., Superoxide and Superoxide Dismutase, Michelson, A.M., McCord, J.M. and Fridovich, I. editors, Academic Press, London, p. 225-230 (1977).

19. Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M., Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G ja Bossa, F., J. Biol. Chem. 259:12595-601 (lokakuun 25. paivana 1984).19. Barra, D., Schinina, M.E., Simmaco, M., Bannister, J.V., Bannister, W.H., Rotilio, G and Bossa, F., J. Biol. Chem. 259: 12595-601 (October 25, 1984).

20. Baret, A., Jadot, G., ja Michelson, A.M., Biochemical Pharmacology 33:2755-60 (syyskuun 1.paivana 1984).20. Baret, A., Jadot, G., and Michelson, A.M., Biochemical Pharmacology 33: 2755-60 (September 1, 1984).

21. McCord, J.M. ja Salin, M.L., Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes, Ross, A., Patriarca, P.L., Romeo, D. (toimittajat) ss. 257-264 (1977).21. McCord, J.M. and Salin, M.L., Movement, Metabolism and Bactericidal Mechanisms of Phagocytes, Ross, A., Patriarca, P.L., Romeo, D. (eds.) p. 257-264 (1977).

22. Touati, D., Journal of Bacteriology 155:1078-87 (1983).22. Touati, D., Journal of Bacteriology 155: 1078-87 (1983).

23. McCord, J.M., Boyle, J.A., Day, Jr., E.D., Rizzolo, L.J. ja Salin, M.L., Superoxide and Superoxide Dismutase,23. McCord, J.M., Boyle, J.A., Day, Jr., E.D., Rizzolo, L.J. and Salin, M.L., Superoxide and Superoxide Dismutase,

Michaelson, A.M., McCord, J.M., ja Fridovich, I. (toimittajat) Academic Press, London ss. 129-138 (1977).Michaelson, A.M., McCord, J.M., and Fridovich, I. (eds.) Academic Press, London p. 129-138 (1977).

24. Eurooppalainen patenttijulkaisu 0131843 A1, julkaistu tammikuun 23. paivana, 1985, vastaten eurooppalaista patenttihakemusta 84107717.5, joka on jatetty heinakuun 3. paivana 1984, joka esittaa prioriteettivaatimuksia US-sarjanumeron 514 188 suhteen, joka on jatetty heinakuun 15. paivana 1983.24. European Patent Publication 0131843 A1, issued January 23, 1985, corresponding to European Patent Application 84107717.5, filed July 3, 1984, which claims priority to U.S. Serial No. 514,188, filed July 15, 1983.

34 90 3 53 25. Hallewell, et al., Nucleic Acids Res. 5, (1985).34 90 3 53 25. Hallewell, et al., Nucleic Acids Res. 5, (1985).

26. Eurooppalainen patenttijulkaisu 0138111 A1, joka on jul-kaistu huhtikuun 24. paivåna 1985, vastaten eurooppalais-ta patenttihakemusta 84111416.8, joka on jatetty syyskuun 25. paivana 1984, joka esittaa prioriteettivaatimuksia US sarjanumeron 538 607 suhteen, joka on jatetty loka-kuun 3. paivana 1983, seka US sarjanumeron 609 412 suhteen, joka on jatetty toukokuun 11. paivana 1984.European Patent Publication 0138111 A1, published April 24, 1985, corresponding to European Patent Application 84111416.8, filed September 25, 1984, which claims priority to U.S. Serial No. 538,607, filed October 3, 1985. on 1983, as well as U.S. Serial No. 609,412, filed May 11, 1984.

27. EMBO Journal, osa 4, No. 1, ss. 77-84 (tammikuu 1985).27. EMBO Journal, Part 4, no. 1, ss. 77-84 (January 1985).

28. Abstracts of the Fourth International Conference on Superoxide and Superoxide Dismutase, Rome, Italy, syyskuun 1.-6. paivina 1985.28. Abstracts of the Fourth International Conference on Superoxide and Superoxide Dismutase, Rome, Italy, September 1-6. days 1985.

Claims (21)

90353 35 Patenttivaatxmukset90353 35 Claims 1. Plasmidi humaani mangaanisuperoksididismutaasianalogin ilmentåmiseksi sopivassa prokarioottisessa isåntåsolussa, jolla analogilla on luonnollisesti esiintyvån humaani man-gaanisuperoksididismutaasin entsymaattista aktiivisuutta, tunnettu siitå, ettå analogi koostuu kahdesta tai neljåstå ei-kovalenttisesti liittyneestå polypeptidistå kunkin sel-laisen polypeptidin kåsittåesså 199 aminohappoa, kussakin sellaisen polypeptidin sekvenssisså on metioniini N-pååsså vålittomåsti lysiinin vieresså, jota lysiiniå koodaavat ku-vion 1 nukleotidit 115-117, ja jatkuen lysiiniin, jota koodaavat kuvion 1 nukleotidit 706-708 ja joka on polypeptidin COOH-pååsså ja ettå plasmidi kåsittåå DNA:n, joka koodaa sellaista polypeptidiå, ja sopivat sååtelyelementit jårjes-tettynå plasmidin sisåån siten, ettå sallitaan polypeptidin ilmentyminen ja humaani mangaanisuperoksididismutaasianalo-gin muodostuminen isåntåsolussa.A plasmid for expressing a human manganese superoxide dismutase analog in a suitable prokaryotic host cell, the analog having the enzymatic activity of a naturally occurring polypeptide of a human manganese superoxide dismutase in a polypeptide, characterized in that the analog consists of two or four non-covalently selected methionine at the N-terminus immediately adjacent to lysine encoded by nucleotides 115-117 of Figure 1 and continuing to lysine encoded by nucleotides 706-708 of Figure 1 at the COOH terminus of the polypeptide and that the plasmid comprises DNA comprising: polypeptide, and appropriate regulatory elements arranged within the plasmid to allow expression of the polypeptide and formation of a human manganese superoxide dismutase analog in the host cell. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitå, ettå se on pMSE-4, joka on talletettu Escherichia coli -kannassa A4255 ATCC-numerolla 53250.Plasmid according to Claim 1, characterized in that it is pMSE-4 deposited in Escherichia coli strain A4255 under ATCC number 53250. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitå, ettå se on pMSARB4.Plasmid according to Claim 1, characterized in that it is pMSARB4. 4. Prokarioottinen isåntåsolu, tunnettu siitå, ettå siihen on liitetty patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi.A prokaryotic host cell, characterized in that a plasmid according to claim 1 is fused thereto. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen isåntåsolu, tunnettu siitå, ettå se on Escherichia coli -kannan A4255 solu, joka sisåltåå pMSE-4 -plasmidin ja joka on talletettu ATCC-numerolla 53250.Host cell according to claim 4, characterized in that it is an Escherichia coli strain A4255 cell containing the plasmid pMSE-4 and deposited under ATCC No. 53250. 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen isåntåsolu, tunnettu siitå, ettå se on Escherichia coli -solu, joka sisåltåå pMSARB4 -plasmidin.Host cell according to Claim 4, characterized in that it is an Escherichia coli cell containing the plasmid pMSARB4. 36 S035336 S0353 7. Menetelmå humaani mangaanisuperoksididismutaasianalogin tuottamiseksi, tunnettu siitå, ettå kasvatetaan patenttivaa-timuksen 4 mukaista isåntåplasmidisysteemiå olosuhteissa, jotka sallivat humaani mangaanisuperoksididismutaasianalogin tuottamisen ja otetaan siten tuotettu analogi talteen.A process for the production of a human manganese superoxide dismutase analogue, characterized in that the host plasmid system according to claim 4 is grown under conditions which allow the production of a human manganese superoxide dismutase analogue and recover the analog thus produced. 8. Menetelmå entsymaattisesti aktiivisen rekombinanttisen humaani mangaanisuperoksididismutaasin tuottamiseksi kuvion 1 mukaisella DNA-sekvenssillå sisaltåen nukleotidit 115-708, jolla on sama aminohapposekvenssi ja sama biologinen aktii-visuus kuin luonnollisesti esiintyvållå humaani mangaani-superoksididismutaasilla tai sen analogilla tai mutantilla, tunnettu siitå, ettå kasvatetaan bakteerisolujen viljelmåå tuottoalustassa, jossa on ei kasvua rajoittava Mn++-måårå siten, ettå Mn++-konsentraatio alustassa on suurempi kuin 2 ppm, kun bakteerisolut kasvavat, mainittujen bakteerisolujen sisåltåesså plasmidin, joka sisåltåå DNA:n, joka koodaa humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia, ja solut ky-kenevåt ilmentåmåån DNA:ta, joka koodaa humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia ja jossa mainittua viljelmåå kasvatetaan sellaisissa sopivissa olosuhteissa, ettå DNA ilmentyy ja humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogia tuotetaan bakteerisoluissa, ja otetaan talteen siten tuotettu entsymaattisesti aktiivinen humaani mangaanisuperoksididismutaasin analogi tai mutantti.A method for producing an enzymatically active recombinant human manganese superoxide dismutase in the DNA sequence of Figure 1, comprising nucleotides 115-708 having the same amino acid sequence and the same biological activity as known mutants or naturally occurring analogs of human manganese superoxide. culture in a production medium having a non-growth-limiting amount of Mn ++ such that the Mn ++ concentration in the medium is greater than 2 ppm when the bacterial cells grow, said bacterial cells containing a plasmid containing DNA encoding a human manganese superoxide dismutase analogue expressing DNA encoding a human manganese superoxide dismutase analog and wherein said culture is grown under suitable conditions such that the DNA is expressed and the human manganese superoxide dismutase analog is produced in bacterial cells, and recovering the enzymatically active human manganese superoxide dismutase analog or mutant thus produced. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå bakteerisolut kåsittåvåt Escherichia coli -solut.The method of claim 8, characterized in that the bacterial cells comprise Escherichia coli cells. 10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmå, tunnettu si-tå, ettå plasmidi sisåltåå DNA:n, joka koodaa humaani man-gaanisuperoksididismutaasianalogia, joka analogi kåsittåå kaksi tai neljå ei-kovalenttisesti liittynyttå identtistå polypeptidiå kunkin sellaisen polypeptidin kåsittåesså 199 aminohappoa ja kussakin sellaisen polypeptidin sekvenssisså on metioniini N-pååsså vålittomåsti lysiinin vieresså, jota lysiiniå koodaavat kuvion 1 nukleotidit 115-117 ja jatkuen 37 30 353 lysiiniin, jota koodaavat kuvion 1 nukleotidit 706-708 ja joka on polypeptidin COOH-pååsså.The method of claim 8, characterized in that the plasmid contains DNA encoding a human manganese superoxide dismutase analog, an analog comprising two or four non-covalently linked identical polypeptides, each polypeptide comprising 199 amino acids, and each such polypeptide comprises 199 amino acids. methionine at the N-terminus immediately adjacent to lysine, which is encoded by nucleotides 115-117 of Figure 1 and extending to 37 lysine, encoded by nucleotides 706-708 of Figure 1, which is at the COOH terminus of the polypeptide. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå plasmidi on pMSE-4 ja se on talletettu Escherichia coli -kannassa A4255 ATCC-talletusnumerolla 53250.The method according to claim 10, characterized in that the plasmid is pMSE-4 and is deposited in Escherichia coli strain A4255 under ATCC Accession No. 53250. 12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå plasmidi on pMSARB4.The method of claim 10, wherein the plasmid is pMSARB4. 13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå Mn++-konsentraatio on 50-1500 ppm.Process according to Claim 8, characterized in that the Mn ++ concentration is from 50 to 1500 ppm. 14. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå Escherichia coli -solut ovat Escherichia coli -kan-taa A4255, joka sisåltåå plasmidin pMSE-4 ja joka on talletettu ATCC-talletusnumerolla 53250.The method according to claim 9, characterized in that the Escherichia coli cells are Escherichia coli strain A4255, which contains the plasmid pMSE-4 and is deposited under ATCC Accession No. 53250. 15. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå Escherichia coli -solut ovat Escherichia coli -kan-taa A4255, joka sisåltåå plasmidin pMSARB4.The method according to claim 9, characterized in that the Escherichia coli cells are Escherichia coli strain A4255, which contains the plasmid pMSARB4. 16. Menetelmå seuraavan reaktion katalysoimiseksi: 202 + 2H+ -* H202 + 02 tunnettu siitå, ettå saatetaan reagenssit kosketuksiin sopi-vissa olosuhteissa patenttivaatimuksen 1 mukaisella plasmi-dilla ilmennetyn humaani mangaanisuperoksididismutaasin tai sen analogin kanssa.A process for catalyzing the following reaction: 202 + 2H + - * H 2 O 2 + O 2, characterized in that the reagents are contacted under suitable conditions with human manganese superoxide dismutase or an analog thereof expressed on the plasmid according to claim 1. 17. Menetelmå solujen vaurioiden pienentåmiseksi in vitro, .. . jotka vauriot ovat aiheuttaneet superoksidiradikaalit, tun nettu siitå, ettå katalysoidaan superoksidiradikaalien pel-kistystå patenttivaatimuksen 16 mukaisesti.17. A method for reducing cell damage in vitro, ... which damage is caused by superoxide radicals, characterized in that it is catalyzed by the reduction of superoxide radicals according to claim 16. 18. Menetelmå poistettujen ja eristettyjen elinten selviy-tymisajan pidentåmiseksi, tunnettu siitå, ettå lisåtåån te- 38 90353 hokas måårå patenttivaatimuksen 1 mukaisella plasmidilla tuotettua humaani mangaanisuperoksididismutaasia perfuusio-våliaineeseen.A method for prolonging the survival time of removed and isolated organs, characterized in that an effective amount of human manganese superoxide dismutase produced by the plasmid of claim 1 is added to the perfusion medium. 19. Menetelmå rekombinanttisen humaani mangaanisuperoksidi-dismutaasin, jolla on kuvion 1 mukainen DNA-sekvenssi sisål-tåen nukleotidit 115-708, tai sen analogin tai mutantin tal-teenottamiseksi bakteerisoluista, jotka sisåltåvåt humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutant-tia, tunnettu siitå, ettå (a) kåsitellåån bakteerisoluja siten, ettå saadaan talteen proteiinifraktiot, jotka sisåltåvåt proteiineja, jotka ovat låsnå soluissa mukaanlukien humaani mangaanisuperoksididis-mutaasi tai sen analogi tai mutantti; ja (b) kåsitellåån proteiinifraktiota siten, ettå saadaan talteen humaani mangaanisuperoksididismutaasi tai sen analogi tai mutantti.A method for recovering a recombinant human manganese superoxide dismutase having the DNA sequence of Figure 1, including nucleotides 115-708, or an analog or mutant thereof, from bacterial cells comprising a known human manganese superoxide dismutase, or an analog or mutant thereof. that (a) treating the bacterial cells to recover protein fractions containing proteins present in the cells, including human manganese superoxide disase or an analog or mutant thereof; and (b) treating the protein fraction to recover human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof. 20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå (a) kåsitellåån soluja, jotta erotetaan liukoiset proteiinit liukenemattomista proteiineista ja solunseinåmån jåånnoksis-tå; (b) otetaan talteen liukoiset proteiinit; (c) kåsitellåån siten talteenotettuja liukoisia proteiineja, jotta erotetaan liukoisten proteiinien fraktio, joka sisål-tåå humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia; (d) otetaan talteen liukoisten proteiinien fraktio, joka sisåltåå humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia; ja (e) kåsitellåån liukoisten proteiinien fraktiota, joka sisåltåå humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia, jotta saadaan talteen erillisesti humaani mangaanisuperoksididismutaasi tax sen analogi tai mutantti. 39 90353The method of claim 19, characterized in that (a) the cells are treated to separate soluble proteins from insoluble proteins and cell wall sequences; (b) recovering soluble proteins; (c) treating the soluble proteins thus recovered to separate a fraction of soluble proteins containing human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof; (d) recovering a fraction of soluble proteins containing human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof; and (e) treating a fraction of soluble proteins containing human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof to separately recover the human manganese superoxide dismutase tax analog or mutant thereof. 39 90353 21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmå, t--iinnaht-.ii siitå, ettå (a) eristetåån bakteerisolut tuottoalustasta; (b) suspendoidaan eristetyt bakteerisolut sopivaan liuok-seen, jonka pH on 7,0 - 8,0; (c) hajotetaan suspendoidut bakteerisolut; (d) sentrifugoidaan hajotetut bakteerisolut; (e) kuumennetaan syntynyttå supernatanttia ajan, joka vaih-telee 30 minuutista 120 minuuttiin låmpotilassa, joka vaih-telee 55°C:sta 65°C:een; (f) jååhdytetåån kuumennettu supernatantti alle l0°C:een; (g) poistetaan mahdollinen saostuma jååhdytetystå superna-tantista; (h) dialysoidaan jååhtynyt supernatantti sopivaa puskuria vastaan; (i) eluoidaan jåljelle jåånyt aine anioninvaihtokromatogra-fiakolonnilla sopivalla puskuroidulla liuoksella; (j) keråtåån ja yhdistetåån eluaattifraktiot, jotka sisåltå-våt humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia; (k) dialysoidaan yhdistetyt fraktiot 40 mM kaliumasetaattia, pH 5,5, vastaan; (l) eluoidaan dialysoidut yhdistetyt fraktiot kationinvaih-tokromatografiakolonnin låpi lineaarisella 40 - 200 mM kaliumasetaatin gradientilla, pH 5,5; ja (m) keråtåån ja yhdistetåån eluentin piikkifraktiot, jotka sisåltåvåt humaani mangaanisuperoksididismutaasia tai sen analogia tai mutanttia. 40 9 0 3 53The method of claim 19, wherein (a) the bacterial cells are isolated from the production medium; (b) suspending the isolated bacterial cells in a suitable solution having a pH of 7.0 to 8.0; (c) lysing the suspended bacterial cells; (d) centrifuging the lysed bacterial cells; (e) heating the resulting supernatant for a period of time ranging from 30 minutes to 120 minutes at a temperature ranging from 55 ° C to 65 ° C; (f) cooling the heated supernatant to below 10 ° C; (g) removing any precipitate from the cooled supernatant; (h) dialyzing the cooled supernatant against a suitable buffer; (i) eluting the residue on an anion exchange chromatography column with a suitable buffered solution; (j) collecting and pooling eluate fractions containing human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof; (k) dialyzing the combined fractions against 40 mM potassium acetate, pH 5.5; (l) eluting the dialyzed combined fractions through a cation exchange chromatography column with a linear gradient of 40 to 200 mM potassium acetate, pH 5.5; and (m) collecting and pooling eluent peak fractions containing human manganese superoxide dismutase or an analog or mutant thereof. 40 9 0 3 53