FI74475B - Foerfarande foer framstaellning av nya, ur klebsiella pneumoniae extraherade glykoproteiner. - Google Patents

Description

Menetelmä Klebsiella Pneumoniaesta uutettujen uusien glyko- proteiinin valmistamiseksi χ 74475

Keksintö koskee Klebsiella Pneumoniaesta uutettujen, 5 vesiliukoisten, immuunivastetta stimuloivien, uusien glyko-proteiinien valmistusmenetelmää.

Tietyissä FR-patenteissa on jo kuvattu Klebsiella Pneunomiaesta uutettuja glykoproteiineja, niitä ovat esimerkiksi FR-patentit 2 043 475, 2 088 112 ja 2 171 907.

10 Glykoproteiinien seos tunnetaan FR-patentista 2 171 907, josta esillä oleva keksintö on valintakeksintö, ja koskee tarkemmin määriteltyjen uusien, vesiliukoisten immuunivastetta stimuloivien glykoproteiinien valmistusta, jotka on uutettu Klebsiella Pneumoniaesta ja jotka sisältä-15 vät 20-35 % proteiineja, 50-70 % neutraalimonosakkarideja, 3-8 % glukuronihappoa ja 1,5-3 % monosakkaridien amiineja ja joiden molekyylipaino on yli 100 000 daltonia.

Keksinnön mukaisesti valmistetut glykoproteiinit ovat aktiivisempia kuin FR-patentista 2 171 907 tunnetut ky-20 symyksen ollessa solunsisäisten taudinsiementen aiheuttamista infektioista annettaessa lääkeainetta intraperitoneaali-sesti tai oraalisesti; ne ovat myös aktiivisempia rakkulamaisten makrofagien fagosyyttisolujen aktivointikokeessa sekä aktiviteetin "Natural Killer (NK) " in vivo stimuloinnissa. 25 Neutraalimonosakkarideilla tarkoitetaan etenkin sel laisia neutraaliheksooseja kuten glukoosi, mannoosi tai ga-laktoosi.

Tämän vaatimuksen mukaan valmistettujen glykoproteiinien molekyylipainot on määritetty ultrasentrifugoinnilla; 30 on löytynyt kolme fraktiota, joiden molekyylipaino on yli 100 000 daltonia.

Keksinnön mukaiset glykoproteiinit on voitu uuttaa eri Klebsiella Pneumoniae -lähteistä; kuitenkin aivan erityisesti käytetään sellaisia, jotka ovat peräisin PASTEUR-35 Instituutin tallettamasta kannasta numerolla 52 145.

Glykoproteiinien rakennetutkimukset ovat tehneet 2 74475 mahdolliseksi määritellä niiden koostumuksen käyttämällä erilaisia kemiallisia tekniikoita, etenkin uronihappotäh-teiden pelkistämistä karbodi-imidillä, permetylointia, uronihappojen degradointia, perjodaattihapetusta tai kromi-5 oksidihapetusta.

Parhaat keksinnön mukaan valmistetut glykoproteiinit ovat sellaisia, joissa proteiiniosassa on noin 30 % happamia aminohappoja. Happamat aminohapot tarkoittavat sellaisia aminohappoja kuin asparagiinihappo tai glutamiinihappo.

10 Parhaat keksinnön mukaan valmistetut glykoproteiinit ovat myös sellaisia, joissa polysakkaridiosassa on keskimäärin yksi glukoosimolekyyli, 1-1,5 mannoosimolekyyliä, 1-1,5 glukuronihappomolekyyliä ja 2-2,5 galaktoosimolekyyliä.

Tässä kuvatussa uusien vesiliukoisten glykoproteii-15 nien valmistusmenetelmässä käsitellään kvaternäärisellä am- moniumyhdisteellä glykoproteiiniliuosta, joka on saatu Klebsiella Pneumoniae -viljelmän lysaattiuutetta ultrafilt-roimalla, erotetaan supernatantti poistamalla saatu sakka, käsitellään supernatanttia, joka on glykoproteiinien suola-20 liuos, molekyylipainoltaan pienellä alkoholilla, jolloin saadaan uusi saostuma, joka liuotetaan uudestaan veteen, dialysoidaan tarvittaessa, sitten lyofilisoidaan.

Menetelmän alussa voidaan käyttää erilaisia glyko-proteiiniliuoksia, jotka on saatu ultrasuodattamalla 25 Klebsiella Pneumoniae -viljelmien lysaatteja kalibroiduil la, huokoisilla kalvoilla, jotka pystyvät pidättämään näille kalvoille annetun vakioisen molekyylipainopajän ylittävät molekyylit.

Käytetyt kalvot ovat esimerkiksi kauppanimillä 30 AMICON XM 50, PM30 tai UM2 .myytävät kalvot, mutta parempi on käyttää kalvoja, joiden pidätyskynnys on 100 000 daltonia, kuten esimerkiksi AMICON-yhtiön kaupalliset kalvot merkinnällä XM 100 tai HL P100; kalvot, jotka ovat erityisen suositeltavia, pidättävät molekyylipai-35 noitaan 300 000 daltonia suuremmat molekyylit; tällai- 3 74475 siä on saatavissa kaupallisina kalvoina AMICON ja ROMICON -yhtiöiden valmistamina merkinnällä XM300.

Ultrasuodatuksella on mahdollista valikoida liuoksesta molekyylit, joiden molekyylipaino on tiet-5 tyä molekyylipainoa suurempi, kuten edellä sanottiin, valitsemalla kalvo, jolla on haluttu pidätyskynnys. Asiantuntijalle on selvää, että on aivan mahdollista käyttää ominaisuuksiltaan muita samanlaisia liuoksia, jotka on saatu muilla tavoilla, kuten hydrofiilisellä, 10 polymeroidulla geelikromatografiällä.

Ennen tätä valikointitoimenpidettä lysaatista voidaan hyvin mielellään poistaa lipidit ja nukleiinihapot .

Keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamisolo-15 suhteissa, jotka ovat erityisen suotavia, glykoprote- iinien kantaliuos on saatu menetelmän mukaan, joka on kuvattu toisessa lisäselvityksessä no. 2 171 907 ranskalaisessa patenttihakemuksessa no. 2 043 475.

Tässä lisäselvityksessä glykoproteiinien molekyylipai-20 no on määritetty geeliekskluusiotekniikalla.

Kvaternäärinen ammoniumyhdiste, jota käytetään glykoproteiinien kantaliuoksen käsittelemiseen, voi olla esimerkiksi setyylipyridyyliammoniumkloridi, mutta erityisesti setyylitrimetyyliammoniuirikloridi eli 25 CStavlon.

Kvaternäärisen ammoniumyhdistekäsittelyn jälkeen saatu sakka voidaan erottaa supernatantista klassisilla menetelmillä, kuten dekantoimalla tai suodattamalla, mutta mieluiten erotetaan sentrifugoimalla.

30 Saatua liuosta käsitellään sitten kylmässä noin +4°C käyttämällä molekyylipainoltaan pientä alkoholia, kuten metanolia, etanolia, n-propanolia tai isopropanolia. Mieluiten käytetään etanolia. Mielenkiintoisimmat tulokset on saatu käyttämällä kuusi ti-35 lavuutta etanolia yhtä suolaliuostilavuutta kohti yön yli +4°C:een lämpötilassa.

4 74475

Sakka liuotetaan uudestaan veteen ja dialysoi-daan sen puhdistamiseksi. Dialyysi suoritetaan klassisen, kalvon sulkeman kammion avulla, esimerkiksi kolloidiumista tai selluloosasta valmistetun kalvon 5 läpi. Muistettakoon etenkin kammiot, joiden kalvo on regeneroitua selluloosaa, huokosten läpimitta keskimäärin noin 24 A, jolloin molekyylipainol-taan 12-14 000 daltonia suuremmat molekyylit jäävät kalvon sisäpuolelle. Dialyysikammioiden joukosta mai-10 nittakoon erityisesti VISKING-putket.

Tämän dialyysin avulla voidaan glykoproteiini-liuoksesta poistaa jäljelle jääneet molekyylipainoltaan pienet epäpuhtaudet kuten alkoholijäämät.

Keksinnön, mukaisia glykoproteiineja voidaan tie-15 tysti saada hieman epäpuhtaampina, kun ei suoriteta dialyysivaihetta.

Lyofilisointi tehdään klassisella tavalla, esimerkiksi keskikokoisissa jäädytys-tiivistys-laitteis-sa kuten kaupallisen yhtiön SociätÖ Usifroid'n mal-20 leissa SMU tai SMRG, tai suurikokoisissa lyofilisaat- toreissa kuten esimerkiksi laitteessa, johon kuuluu jää-dyttäjä CAI ja tiivistäjä SMIRS, joita kumpaakin valmistaa kaupallisesti Usifroid. Pienempiä laboratorio-laitteita voidaan myös käyttää, samoin kuin muitten 25 kaupallisten yhtiöiden malleja kuten SSrail'n.

Parhaissa toteuttamistavoissa jäljempänä kuvatussa menetelmässä on olennaista se, että - käytetty kvaternäärinen ammoniumyhdiste on setyyli-trimetyyliammoniumbromidi; 30 - supernatantti erotetaan sentrifugoimalla.

- pienen molekyylipainon omaava alkoholi on etanoli; Tällä menetelmällä saaduilla glykoproteiineilla, joita tämä keksintö koskee, on hyvin mielenkiintoisia farmakologisia ominaisuuksia; ne stimuloivat huomatta-35 vasti immunivastetta ja ovat hyvin tolerantteja.

5 74475 Näitä ominaisuuksia on kuvattu edempänä kokeellisessa osassa.

Nämä ominaisuudet oikeuttavat käyttämään tämän hakemuksen mukaisia glykoproteiineja lääkkeinä.

5 Näillä lääkkeillä on käyttöä esimerkiksi ihmi sellä ja eläimellä bakteerien tai virusten aiheuttamien infektiotautien hoidossa tai torjunnassa, loistautien hoidossa, myrkkyjen aiheuttamissa infektioissa, sairaalainfektioiden ja leikkausinfektioiden hoi-10 dossa.

Tavallinen annos, joka vaihtelee kulloinkin käytetyn tuotteen, hoidettavan kohteen ja vaikutuksen mukaan, voi olla esimerkiksi ihmisellä 1-15 mg päivässä suun kautta nautittuna, 1-15 mg päivässä rektaali-15 sesti ja 0,25-5 mg päivässä parenteraalisesti annostel tuna .

Keksinnön mukaan saatuja glykoproteiineja voidaan siis käyttää farmaseuttisten valmisteiden tekemiseen ne mukaan lukien vaikuttavina aineosina.

20 Tämän hakemuksen mukaisella menetelmällä valmis tettuja glykoproteiineja voidaan lääkkeinä antaa ruuansulatuskanavan kautta, parenteraalisesti tai paikallisesti.

Vastaavat farmaseuttiset valmisteet voivat olla 25 esimerkiksi kiinteitä tai nesteitä tai olla sellaisessa farmaseuttisessa muodossa, jota usein käytetään ihmis-lääketieteessä, kuten esimerkiksi pillereinä, yksinkertaisina tai rakeina, geeleinä, jyväsinä, liuoksina, siirappeina, suppoina, injektoitavina valmisteina 30 lyofilisoituna taiei, soikioina, salvoina, voiteina, liuoksina, tippoina, silmävoiteina, aerosoleina; ne on valmistettu tavanomaisilla menetelmillä. Vaikuttavat (t) aineosa(t) voidaan sekoittaa täyteaineeseen, joita yleisesti käytetään lääkevalmisteissa, kuten talk-35 kiin, arabikumiin, laktoosiin, tärkkelykseen magnesium- , 74475 6 stearaattia, kaakaovoihin, vesiliukoisiin tai liukenemattomiin kantajiin, eläin- tai kasvirasvoihin, parafiinijohdannaisiin, glykoleihin, erilaisiin vaahtoaviin, dispergoi- viin tai emulgoiviin aineisiin, säilytysaineisiin.

5

Nyt annetaan keksinnön toteuttamistavasta esimerkkejä.

Esimerkki 1 20 g FR-patentin 2 171 907 esimerkin 1 mukaan saatua tuotetta liuotetaan kahteen litraan deionisoitua vettä. Li-10 sätään hitaasti noin 1,6 litraa 3-%:ista "Cetavlonia", seosta sekoitetaan yhden tunnin ajan, sitten sentrifugoidaan 10 000 kierrosta/min 15 minuutin ajan. Sakka poistetaan, erotettuun supernatanttiin lisätään sitten 3 litraa 95-%:ista etanolia 15 minuutin aikana. Tunnin sekoituksen jälkeen sent-15 rifugoidaan 10 000 kierrosta/15 min ajan. Näin saatu super-natantti heitetään pois ja sakka liuotetaan 1 litraan vettä ja dialysoidaan 48 tuntia VISKING-putkissa deionisoitua vettä vastaan +4°C:ssa. Tämän dialyysin päätyttyä liuos lyo-filisoidaan. Saadaan 7,12 g haluttuja glykoproteiineja, 20 joiden koostumus on: 57,8 % neutraaleja monosakkarideja, 6,8 % uronihappoja, 1,75% oksamiineja, 25 % aminohappoja.

25 Esimerkki 2 20 g FR-patentin 2 171 907 esimerkin 1 mukaan saatua tuotetta liuotetaan 1 litraan deionisoitua vettä. Lisätään sekoittaen 0,800 litraa 3-%:ista "Cetavlonia". Tunnin sekoituksen jälkeen sentrifugoidaan 10 000 kierrosta/min 15 mi-30 nuutin ajan. Sakka heitetään pois, erotettuun supernatant tiin lisätään 1,5 litraa 95-%:ista etanolia. Tunnin sekoituksen jälkeen sentrifugoidaan 15 minuuttia 10 000 kierrosta/ min. Supernatantti heitetään pois ja sakka liuotetaan 0,500 litraan vettä ja dialysoidaan 48 tuntia Visking-putkissa 35 deionisoitua vettä vastaan +4°C:ssa.

Tämän dialyysin loputtua liuos lyofilisoidaan ja saa- 7 74475 daan 6 g haluttuja glykoproteiineja, joiden koostumus on: 59,2 % neutraaleja monosakkarideja, 4.1 % uronihappoja, 2.2 % oksamiineja, 5 28 % aminohappoja.

Farmakologinen tutkimus 10 A) Immuunivastetta stimuloiva ja mitogeeninen vaikutus 10:lie hiirelle injektoitiin jalkapohjiin 40^ug tutkittavaa tuotetta ja 40^,ug naudan albumiinia eläintä kohti. Kuusi päivää myöhemmin niihin ruiskutetaan laski-15 monsisäisesti sellainen annos seerumin albumiinia, joka ei tapa eikä aiheuta shokkia (lOO^ug eläintä kohti). Kontrollieläimet eivät saa kuin seerumin albumiinia injektiosta lähtien.

Immuunivastetta stimuloiva vaikutus mitataan vasteen 20 lisääntymisenä seerumin albumiinin aiheuttamassa anafylak-tisessa shokissa ja mitogeeninen vaikutus injektiokohtaan muodostuvien solmukkeiden painon lisääntymisenä.

1 - Immuunivastetta stimuloiva vaikutus 25

Lasketaan niiden eläinten lukumäärä, joilla on shokkitila (hengenahdistusta, johon liittyy kuonon sinisyyttä, joka johtaa takaruumiin halvaantumiseen, kouristuksiin ja kuolemaan), samoin kuolleisuus kaksi tuntia 3Q laskimonsisäisen seerumin albumiiniruiskeen antamisesta.

8 74475

Tulokset i

Tuote esimerkistä no. % shokin saaneita eläimiä % kuolleita 1 50 20 2 50 30 5 Kontrolli 0 0 2 - Mitogeeninen vaikutus

Kuusi tuntia laskimonsisäisen albumiiniruis-keen jälkeen uhrataan eloonjääneet, poistetaan solmukkeet, jotka ovat muodostuneet pistoskohtaan tai sen 10 käpälän taipeeseen, johon ruiske on annettu, ja pun nitaan ne.

Mitogeeninen vaikutus ilmaistaan indeksin avulla, joka ilmaisee tutkitulla tuotteella käsiteltyjen eläinten solmukkeiden keskimääräisen painon suhteen 15 sellaisten kontrollieläinten solmukkeiden painoihin, jotka eivät ole saaneet kuin seerumin albumiinia.

Tulokset;

Tuote esimerkistä no. Indeksi 20 1 6'2 2 5,6

Esimerkkien 1 ja 2 tuotteet osoittavat hyvin suurta immuunivastetta stimuloivaa ja mitogeenistä vaikutusta.

25 B) - Epäspesifisten puolustusmekanismien stimulaatio: Tätä stimulaatiota on tutkittu hiilen ’Cearance’-kokeella hiirillä käyttämällä hyväksi HALPERNin aloittamaa tekniikkaa, jossa injektoidaan eläimen silmä-kuoppaan kolloidinen hiilisuspensio, ja määritetään 30 ajan funktiona hiilen häviämisen kinetiikka verestä mittaamalla optista tiheyttä.

Tuotteet annetaan eläimelle vatsaontelon kautta kaksikymmentäneljä tai neljäkymmentäkahdeksan tuntia ennen koetta. Tulokset ilmaistaan prosentteina hiili-35 partikkelien poistumisessa verrattuna kontrolleihin, jotka ovat saaneet vain kolloidisen hiili-injektion ja 9 74475 joiden hiilipartikkelien lukumäärä on 100 %.

_ , , ' % vaikutuksesta kontrolleihin

Tuote Annokset ,, , . .verrattuna esimerkistä -—- no. 8 minuuttia injek- 30 minuuttia in- tion jälkeen jektion jäl- 5 _____keen____ 1 0,25 mg/kg 50 % 70 % 2 0,25 mg/kg 60 % 70 % Näiden tulosten tarkastelun perusteella voidaan huomioida näiden kahden tuotteen aiheuttama voimakas 10 stimulaatio organismin puolustusmekanismeihin.

C) - Akuutti myrkyllisyys 50 %:sti tappava annos (LD50) vatsaontelon kautta annettuna on määritetty hiirille BEHRENSin ja KARBERin mukaan.

15 Se on 50 mg/kg esimerkkien 1 ja 2 mukaisille glykoproteiineille.

D) - Toleranssi 0,2 ml esimerkkien 1 ja 2 mukaisia glykoprote-iineja ihonsisäisenä pistoksena 1000 J^/kg hiirellä ei 20 aiheuta paikallista eikä yleistä toleranssia.

Claims (5)

10 74475

1. Menetelmä uusien vesiliukoisten, immuunivastetta stimuloivien glykoproteiinien valmistamiseksi uuttamalla

5 Klebsiella Pneumoniaesta glykoproteiinit, jotka sisältävät 20-35% proteiineja, 50-70% neutraalimonosakkarideja, 3-8% glukuronihappoja, 1,5-3% monosakkaridien amiineja ja joiden molekyylipaino on yli 100 000 daltonia, tunnettu siitä, että käsitellään kvaternäärisellä ammoniumyhdistellä 10 glykoproteiiniliuosta, joka on saatu ultrasuodattamalla Klebsiella Pneumoniae-viljelmän lysaattiuute, supernatantti erotetaan poistamalla saatu sakka ja supernatanttia, joka on glykoproteiinien suolaliuos, käsitellään kylmällä pieni-molekulaarisella alkoholilla uuden saostuman saamiseksi, 15 joka liuotetaan uudestaan veteen, dialysoidaan tarvittaessa ja lyofilisoidaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että - käytetty kvaternäärinen ammoniumyhdiste on setyylitri-20 metyyliammoniumbromidi, - supernatantti erotetaan sentrifugoimalla, - pienimolekulaarinen alkoholi on etanoli.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glykoproteiinit on uutettu

25 PASTEUR-Instituutin numerolla 52 145 tallettamasta kannasta.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiiniosassa on noin 30% happamia aminohappoja.

5. Patenttivaatimuksen 1, 2, 3 tai 4 mukainen mene-30 telmä, tunnettu siitä, että polysakkaridiosassa on suunnilleen 1 glukoosimolekyyliä kohti 1-1,5 mannoosi-molekyyliä, 1-1,5 glukuronihappomolekyyliä ja 2-2,5 galak-toosimolekyyliä.