FI71767B - Testkomposition och testanordning foer bestaemning av glukos iett prov av vaetskeform samt foerfarande foer semikvantit atv bestaemning av glukos i urin - Google Patents

Description

1 71767

Testivalmiste ja testiväline glukoosin esiintymisen määrittämiseksi nestemäisestä näytteestä sekä menetelmä glukoosin puolikvantitatiiviseksi määrittämiseksi virtsasta 5 Tämä keksintö koskee testivalmistetta glukoosin esiintymisen määrittämiseksi nestemäisestä näytteestä, jolloin mainittu valmiste sisältää glukoosioksidaasia, peroksidia hajottavaa ainetta ja yhtä tai useampaa vetyperoksidin kanssa reagoivaa kromogeenia, testivälinettä 10 glukoosin esiintymisen määärittämiseksi nestemäisestä näytteestä sekä menetelmää glukoosin puolikvantitatiiviseksi määrittämiseksi virtsasta.

Glukoosin määrittäminen kehon nesteistä, kuten virtsasta tai verestä, ei ole tärkeätä vain diabeetikoiden ta-15 pauksessa, joiden täytyy tarkkailla sokerin käyttöään, vaan myös silloin, kun taudin toteaminen kansanterveyden mittana vaatii suuren ihmismäärän virtsan tai veren tutkimista. Koska varhainen taudin määritys ja jatkuva seuranta ovat hyvin tärkeitä sokeritaudissa, glukoosikokeen täytyy, jotta 20 se olisi mahdollisimman arvokas lääkärille taudin määrityksessä ja taudin seurannassa, olla sopivan nopea, kyllin yksinkertainen palvellakseen kliinikon tarpeita sekä kyllin herkkä paljastaakseen merkitsevät muutokset virtsan tai veren sokerissa.

25 Glukoosioksidaasin, jokaom peroksidia tuottava aine, ja kromogeenin, joka hapettuu vetyperoksidin vaikutuksesta peroksidatiivisesti aktiivisen aineen ollessa läsnä, käyttö glukoosin toteamisessa on tunnettua. Menetelmä sisältää vetyperoksidin muodostumisen glukoosioksidaasin vaikuttaes-30 sa glukoosiin:

Glukoosi--giai??osloksldaasl > H202 ja sitä seuraavan kromogeenin (Cr) hapettumisen (hapettunut tila Cr*), joka on visuaalisesti havaittavissa värin muuttumisesta : 35 H202 * Cr -peroksidaasi-ψ ^ + Cr,

Edellä esitettyä koetta voidaan käyttää monien sellaisten aineiden määrittämisessä, jotka reagoivat hapen ja 2 71767 oksidaasin kanssa vetyperoksidia muodostaen. Siten menetelmä on käyttökelpoinen piilevän veren toteamiseksi erilaisista kehon kudoksista, sillä hemoglobiini on sellainen aine. Useiden eri kromogeenien on selostettu olevan 5 käyttökelpoisia käsiteltävänä olevassa määritysmenetelmässä. US-patenttijulkaisu 3012976 tuo esiin o-tolidiinin, o-toluidiinin, p-toluidiinin, ol-fenyleenidiamiinin, N,N'-dimetyyli-p-fenyleenidiamiinin, N,N'-dietyyli-p-fenyleeni-diamiinin, bentsidiinin, p-anisidiinin, o-katekolin ja 10 pyrogallolin käyttämisen mainitun kaltaisessa piilevän veren tutkimisessa. US-patenttijulkaisu 3335069 sisältää virtsahappokokeen ja esittelee o-anisidiinin ja p-anisidiinin käyttöä kromogeeneina.

Harvoja käyttökelpoisina esiin tuotuja kromogeeneja 15 on itse asiassa käytännössä käytetty. Bentsidiini oli edullinen kromogeeni, mutta se menetti suosionsa paljastuttuaan mahdolliseksi karsinogeeniksi. Sen keksiminen, että 3,31,5,5'-tetra-alkyylibentsidiinit eivät ole karsinogeeneja, ja tämän keksinnön julkaiseminen antoivat il-20 meisen viitteen käyttää jotakin näistä yhdisteistä kro-mogeenina edellä esitetyn kaltaisessa menetelmässä. Sellainen esitetään GB-patenttijulkaisussa 1464359. Tämän julkaisun sivulla 5 tuodaan esiin havaitut tulokset käytettäessä kromogeenina o-tolidiinia, tetrametyylibentsidii-25 niä ja tetraetyylibentsidiiniä tutkittavan nesteen sisältäessä glukoosia 0, 50, 100, 250, 500 ja 1000 mg/dl. Kukin näistä aineista muuttuu keltaisesta kirkkaan vihreäksi glukoosipitoisuuden noustessa 0 mg/dl:sta 50 mg/dl:aan. Glukoosipitoisuuden noustessa hapettuneen kromogeenin vä-30 ri tummuu niin, että havaitut värit olivat oliivin musta, musta ja voimakkaan vihreä, vastaavasti. Tämä havainto tuo esiin glukoosin puolikvantitatiiviseen määrittämiseen vesipitoisista nesteistä liittyvän ongelman, koska korkeammilla pitoisuuksilla tunnetut kromogeenit ovat mustia tai 35 hyvin tumman vihreitä, mikä rajoittaa niiden käyttökelpoisuutta kromogeeneina puolikvantitatiivisissa mittauslaitteissa. Puolikvantitatiivinen glukoosimääritys virtsasta *» 3 71767 glukoosipitoisuuden ollessa korkea, so. 2000-5000 mg/dl, on erityisen tärkeätä, koska diabeetikoilla glukoospi-toisuus virtsassa voi olla jopa 5 % tai korkeampikin. Kvantitatiivinen virtsan glukoosin arviointi 5 %:n pi-5 toisuuksiin asti on tärkeätä ainakin kahdesta syystä: (a) Korkeat glukoosipitoisuudet virtsassa liittyvät todennäköisesti diabeteskoomaan. Hätätilanteissa on tärkeätä määrittää, onko tajuttomuustila diabeteskooma. Kuvatun kaltainen tilan selvittämiskoe osoittaessaan kor-10 keata glukoosipitoisuutta virtsassa viittaisi siten diabeteskoomaan. (b) Virtsan glukoosipitoisuudet kohoavat, jos on annettu riittämätön määrä insuliinia. Koe, jolla voidaan arvioida korkeampia virtsan glukoosipitoisuuksia, on siksi käyttökelpoisempi insuliinitarpeiden terapeuttisessa seu-15 rannassa.

m-anisidiinin käytöstä kromogeenina peroksideja ja peroksidaasia sisältävissä reaktioissa ei ole kerrottu kirjallisuudessa. Kaksi viitettä kertoo m-anisidiinin käytöstä systeemeissä, jotka sisältävät peroksidia ja 20 pieniä määriä CU++:a. Ne ovat:

Dolmanova I.F. et ai. "Mechanism of the Catalytic Action of Copper in teh Oxidation of a Series of Organic Compounds by Hydrogen Peroxide", Vestn. Mosk. Univ., Khim., 11 (1970), 5, 573.

25 Krause F., "Organic Inhibitors Which are Converted into Active Redox Catalysts by Trace Amounts of Cu++", Österr. Chem. Ztg. 68 (1967) 2, 54.

Olisi toivottavaa, ja tämän keksinnön tarkoitus on tarjota parannettu menetelmä glukoosin toteamiseksi vesi-30 pitoisista nesteistä glukoosioksidaasia ja peroksidatii-visesti aktiivista ainetta sisältävää systeemiä käyttäen, joka menetelmä on käyttökelpoinen glukoosin puolikvanti-tatiivisessä määrittämisessä pitoisuuksien ollessa 2000-500 mg/dl.

35 Tämä keksintö kohdistuu siten parannettuun testi- valmisteeseen glukoosin esiintymisen määrittämiseksi nestemäisestä näytteestä, joka valmiste sisältää glukoo- 4 71767 sioksidaasia, peroksidia hajottavaa ainetta ja yhtä tai useampaa vetyperoksidin kanssa reagoivaa kromogeenia, ja tälle parannetulle testivalmisteelle on tunnusomaista, että kromogeenina käytetään m-anisidiinia.

5 Tässä hakemuksessa sanalla neste tarkoitetaan kehon nesteitä, kuten veren seerumia, veriplasmaa, virtsaa, selkäydinnesteitä, sekä lisäksi urean vesiliuoksia· Vaikka testivälineiden ja tämän keksinnön mukaisen menetelmän edullisin sovellutus liittyy kehon nesteisiin, kuten ve-10 reen ja virtsaan, on ymmärrettävä, että esitettyjä testi-välineitä ja menetelmää voidaa soveltaa yhtä hyvin teollisuuden nesteisiin.

Keksinnön mukainen glukoosi-indikaattori voi olla imeytetyn paperin, pullotetun reagenssin tai hauraan kap-15 selin muodossa, joka sisältää indikaattorin reagenssimuo-dossa, pillerinä tai tablettina, joka voidaan pudottaa veteen tai alkoholiin tai nesteeseen, josta glukoosia tutkitaan, tai reagenssin sisältävänä kiinteänä alkoholigee-linä. Pillerin tai tabletin muodossa indikaattori voi si-20 sältää lämpöä kehittävää ainetta, kuten 1itiumkloridia, joka veteen laitettaessa kehittää lämpöä kiihdyttäen siten reaktiota.

Edullinen glukoosi-indikaattori valmistetaan käsittelemällä soveltuvaa kantajamatriisia nestemäisenä reagens-25 sinä olevalla glukoosi-indikaattorivalmisteella. Ilmaisu kantajamatriisi viittaa joko imukykyisiin tai ei-imeviin matriiseihin, jotka eivät liukene veteen tai muihin fysiologisiin nesteisiin, ja jotka säilyttävät rakenteensa niissä. Soveltuvia imukykyisiä matriiseja, joita voidaan 30 käyttää, ovat paperi, selluloosa, puu, synteettinen hartsi-villa, kudottu ja kuitukangas, ja muut vastaavan kaltaiset. Ei-imeviin matriiseihin kuuluvat lasikuitu ja orgaaniset muoviaineet, kuten polypropyleeni ja vastaavat. Kantaja-matriisi voidaan kastella, suihkuttaa tai painaa neste-35 mäistä reagenssivalmistetta käyttäen tai upottaa siihen, ja sen jälkeen kantajamatriisi voidaan kuivata soveltuvalla tavalla, kuten ympäröivää ilmaa tai paineilmaa käyttäen, jolloin 5 71767 saadaan kuiva reagenssi-matriisi-yhdistelmä. Matriisi voidaan edullisesti kiinnittää liukenemattomalle tuelle, kuten orgaaniselle muoviliuskalle, esim. polystyreenille, soveltuvalla tavalla, kuten kaksipuolista teippiä käyttäen, käy-5 tön helpottamiseksi.

Tyypillinen nestemäinen reagenssikoostumus käsittää 1000-1600 kansainvälistä yksikköä (ky) glukoosioksidaasia millilitrassa, 600-1300 ky piparjuuriperoksidaasia milli-litrassa ja 10-15 mg/ml m-anisidiinia kromogeenina. Edul-10 lisessa sovellutuksessa käytetään pientä määrää, 0,5-1,0 mgML

jotakin toista indikaattoria, jolla on korkea ekstinktioker-roin. Näin siksi, että käsiteltävänä olevan kaltaisilla määritysmenetelmillä, joissa käytetään kromogeenina m-anisidiinia, saadaan puolikvantitatiivisia lukemia alueella 15 250 - 5000 mg/dl värimuutosten esiintyessä suunnilleen koh dissa 250, 500, 1000, 2000 ja 5000 mg/dl. Lisättäessä pieni määrä toista kromogeenia, jolla on korkea ekstinktio-kerroin, saadaan systeemi, jolla voidaan todeta glukoosin esiintyminen pienempinä pitoisuuksina, esim. 100 mg/dl, 20 säilyttäen samalla kyky tehdä ero pitoisuuksien 2000 ja 5000 mg/dl välillä, jotka tavallisesti ovat vaikeita, ellei mahdottomia, erottaa.

Toisen kromogeenin molaarinen ekstinktiokerroin (mo-laarinen absorptiokyky) on edullisesti yli 10 000, edulli-25 semmin 15 030 - 65 000.

Soveltuvia aineita käytettäväksi toisena kromogeenina ovat o-tolidiini, bentsidiini, syringaldatsiini, di-aminoftuoreeni ja tetrametyylibentsidiini. Edullisesti lisätään tetrametyylibentsidiiniä puolikvantitatiivisen herkkyyden 30 saavuttamiseksi alhaisissa glukoosipitoisuuksissa. Koska glukoosimääritys toimii parhaiten pH-alueella 5,0 - 7,0, koostumukseen lisätään tavallisesti puskuria halutun pH:n säilyttämiseksi.

Tässä keksinnössä käyttökelpoiset peroksidatiivisesti ak-35 tiiviset aineet voidaan valita erilaisista orgaanisista ja epäorgaanisista lähteistä. Voidaan käyttää kasviperoksidaa-seja, kuten piparjuuri- tai perunaperoksidaasia. Epäorgaanisiin, peroksidaasivaikutuksen omaaviin yhdisteisiin kuuluu 6 71767 jodideja, kuten natrium- ja ammoniumjodidi, ja molyb-daatteja, kuten kalium- ja ammoniummolybdaatti. Lisäksi voidaan käyttää urohemiiniä ja muutamia muita porfyriiniai-neita, jotka pystyvät hajottamaan peroksideja. Muita 5 entsyymeihin kuulumattomia aineita, joilla kuitenkin on peroksideja hajottava vaikutus, ovat sellaiset yhdisteet kuin rautatiosyanaatti, rautatannaatti, rauta(II)ferro-syanidi, kaliumkromisulfaatti ja vastaavat.

Keksintöä valaistaan lisäksi seuraavin esimerkein: 10 Esimerkki 1

Suoritettiin koe pitoisuuksien määrittämisessä saavutetun parannuksen osoittamiseksi, kun edellä esitetyssä määritysvälineessä käytettiin indikaattorina m-ani.sidii-nia. Koe rajoitettiin osoittamaan parannus glukoosipitoi-15 suuksilla 2000 - 5000 mg/dl. Liuskat valmistettiin koe- liuoksista kyllästämällä Whatman 31 ET-paperi nestemäisellä reagenssikoostumuksella ja kuivaamalla käsiteltyä paperia 50°C:ssa 15 minuutin ajan.

Valmistettiin useita koeliuoksia käyttäen seuraavaa 20 yleiskaavaa:

Sitraattipuskuria, 2,0 M, pH 5,5 1,0 ml

Peroksidaasia (piparjuuri), 50 mg/ml 2,0 ml

Glukoosioksidaasia (500 ky/ml) 3,0 ml

Polyvinyylipyrrolidonia (15 % etanolissa) 1,9 ml 25 Emulphor ON-870, 10 % etanolissa 0,5 ml

Indikaattoria 0,001 mol

Tetrahydrofuraania 1,6 ml

Kokonaistilavuus 10,0 ml

Joidenkin indikaattorien kanssa käytettiin pienempiä määriä 30 glukoosioksidaasia. Näissä tapauksissa lisättiin vettä, jotta kokonaistilavuudeksi saatiin 10 ml.

Emulphor ON-870 on ei-ioninen detergentti. Sen tarkoituksena on saada aikaan liuskan parempi kostuvuus, joka vuorostaan johtaa tasaisempaan värin kehittymiseen.

35 Lisättyä glukoosioksidaasiyksiköiden määrää vaihdel tiin kunkin indikaattorin tarpeita vastaavasti. Saatujen 7 71767 liuskojen inkubointiajät vaihtelivat siksi ainoastaan 60:sta 90:een sekuntiin. Glukoosioksidaasimääriä vaihdeltiin, jotta kukin systeemi saattoi kehittää suunnilleen yhtä voimakkaan värin inkuboinnin aikana. Siksi ne sys-5 teemit, joissa käytettiin alhaisemman molaarisen ekstinktio- kertoimen omaavia indikaattoreita, sisälsivät vastaavasti korkeampia glukoosioksidaasipitoisuuksia. Näin tehdään tavallisesti optimoitaessa määräsuhteita testiliuskan koostumuksessa. Jos glukoosioksidaasipitoisuus pidetään indi-10 kaattorista riippumatta samana, liuskojen, joissa on käy tetty korkeamman ekstinktiokertoimen omaavia indikaattoreita, väri saattaa kehittyä niin tummaksi 2-prosenttisen glukoosin vaikutuksesta, ettei 2 %:n ja 5 %:n glukoosipitoi-suutta voida erottaa toisistaan.

15 Heijastusmittaukset suoritettiin kunkin indikaattorin edullisimmalla aallonpituudella, sen jälkeen kun liuskat oli kastettu virtsaan, jossa glukoosipitoisuus oli 2000 tai 5000 mg/dl. Kumpaakin glukoosipitoisuutta vastaavat prosentuaaliset heijastusarvot muutettiin K/S-arvoiksi. Heijas-20 tusmittaukset voidaan muuttaa K/S-arvoiksi seuraavan kaavan avulla: K/s= _!i 25 jossa K on näytteen absorptiokerroin, S on matriisin valon- sidontakerroin ja R on se osa tulevasta valosta, joka heijastuu reagenssikerroksesta. Tämä on Kubelka-Munk-yhtälön yksinkertaistettu muunnelma. K/S-arvot liittyvät heijastus-mittauksiin samalla tavalla kuin absorbanssi transmittanssi-30 mittauksiin. Nämä kuvaajat (K/S glukoosiprosentin funktiona) mahdollistavat totuudenmukaisemman vertailun indikaattoreiden kesken, joilla on erilainen molaarinen ekstinktiokerroin.

Kuvaajasta K/S glukoosipitoisuuden funktiona saadaan pitoisuuksia 2000 ja 5000 mg/dl vastaavat kulmakertoimen 35 arvot, joita voidaan käyttää kunkin indikaattorin kvantita tiivisiin määrityksiin soveltuvuuden mittana. Seuraavassa 8 71767 taulukossa on lueteltu saatujen kulmakertoimien lasketut ja vakioidut arvot.

Indikaattori Kulmakerroin Vakioitu arvo m-Anisidiini 0,233 100 5 o-Anisidiini 0,057 24 p-Anisidiini 0,110 47 p-Aminosalisylaatti 0,123 53 p-Bromianiliini 0,100 43 4-Aminoantipyreeni ja indoli 0,113 49 10 Kulmakertoimet vakioitiin, jotta m-anisidiinin kulma- kertoimelle saatiin arvoksi 100 %. Muille indikaattoreille saadut kulmakertoimet taulukoitiin sen jälkeen prosentteina m-anisidiinin kulmakertoimesta. Jyrkemmät kulmakertoimet vastaavat parempaa pitoisuuksien erottamiskykyä. Taulukkoon 15 kootut tulokset osoittavat, että 2 %:n ja 5 %:n glukoosipi-toisuuden aiheuttama värin voimakkuuden ero on m-anisidiinia käytettäessä huomattavasti selvempi kuin muita indikaattoreita käytettäessä. Tuloksista käy ilmi, että m-anisidii-nille saatu kulmakerroin on ainakin kaksi kertaa niin suuri 20 kuin useille rakenteeltaan saman kaltaisille ja rakenteeltaan erilaisille hapetus-pelkistys-indikaattoreille saadut kulmakertoimet .

Esimerkki 2

Esimerkin 1 mukaisesti valmistettiin optimoitu malli, 25 joka sisälsi pienen pitoisuuden tetrametyylibentsidiiniä ja m-anisidiiniä, käyttäen testiliuskoihin kiinnitettävän liuoksen muodostamiseen seuraavia aineosia:

Sitraattipuskuria, 2,0 M, pH 5,5 1,0 ml

Peroksidaasia, 50 mg/ml 2,0 30 Glukoosioksidaasia, 5000 ky/ml 3,0

Polyvinyylipyrrolidonia, 15 % etanolissa 1,9

Emulphor ON-87Q, 10 % etanolissa 0,5 m-Anisidiinia 0,112

Tetrametyylibentsidiiniä, 0,05 M tetrahydro-35 furaanissa 0,5

Tetrahydrofuraania 1,0

Kokonaistilavuus 10,0 ml S 71767 Näiden liuskojen toimivuutta arvioitiin 56 kliinisen virtsanäytteen avulla. Näytteissä esiintyneen glukoosin vaikutuksesta koeliuskoihin kehittyneitä värejä verrattiin standardiväritaulukkoon, jonka värikuviot vastasivat glu-5 koosipitoisuuksia 0,0, 100, 250, 500, 1Q00, 2000 ja 5000 mg/dl. Koeliuskat pystyivät helposti erottamaan kaikki nämä pitoisuudet. Vastaavuuskäyrästä, joka vertaa näitä tuloksia heksokinaasia käyttävään referenssimenetelmään, saatiin lineaarinen riippuvuus y = 1,07 X + 0,08 ja kor-10 jauskertoimeksi 0,93.

Claims (10)

10 71 767

1. Testivalmiste glukoosin esiintymisen määrittämiseksi nestemäisestä näytteestä, jolloin mainittu valmis- 5 te sisältää glukoosioksidaasia, peroksidia hajottavaa ainetta ja yhtä tai useampaa vetyperoksidin kanssa reagoivaa kromogeenia, tunnettu siitä, että kromogeenina käytetään m-anisidiinia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testivalmiste, 10 tunnettu siitä, että se on nestemäisenä liuoksena, joka sisältää 1000 - 1600 kansainvälistä yksikköä glukoosioksidaasia millilitrassa, 600 - 1300 kansainvälistä yksikköä piparjuuriperoksidaasia millilitrassa ja 10 - 15 mg m-anisiidinia millilitrassa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen testivalmiste, tunnettu siitä, että se sisältää toista kromogeenia, jolla on korkea ekstinktiokerroin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen testivalmiste, tunnettu siitä, että toisen kromogeenin molaarinen 20 ekstinktiokerroin on yli 10 000, edullisesti 15 000 - 65 000.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen testivalmiste, tunnettu siitä, että se sisältää toista kromogeenia 0,5 - 1,0 mg/ml.

6. Patenttivaatimusten 3-5 mukainen testivalmiste, 25 tunnettu siitä, että toinen kromogeeni on bentsidii- ni, syringaldatsiini, diaminofluoreeni, o-tolidiini tai tetrametyylibentsidiini.

7. Patenttivaatimusten 1-6 mukainen testivalmiste, tunnettu siitä, että se sisältää puskuria riittä- 30 vän määrän pitämään tutkittavan nestemäisen näytteen pH:n alueella 5,0-7,0.

8. Testiväline glukoosin esiintymisen määrittämiseksi nestemäisestä näytteestä, tunnettu siitä, että se käsittää kantajamatriisin, johon on liittynyt 35 kiinteää ainetta seurauksena käsittelystä jollakin patent- 11 7176 7 tivaatimuksissa 1-7 määritellyllä nestemäisellä testival-misteella sekä sen jälkeen suoritetusta liuottimen haihduttamisesta, jolloin tuloksena on mainittu kuiva rea-genssikoostumus.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen testiväline, tun nettu siitä, että se on koeliuskan muodossa.

10. Menetelmä glukoosin puolikvantitatiiviseksi määrittämiseksi virtsasta, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen testiväline saate-10 taan kosketuksiin virtsan kanssa ja läsnä olevan glukoosin määrä määritetään reagenssin värin muuttumisen perusteella. 12 71 767