FI63742B - FRAMEWORK FOR THERAPEUTIC TREATMENT OF DIYDROCYCLOSPORINE - Google Patents

Description

1 637421 63742

Menetelmä terapeuttisesti käytettävän dihydrosyklospo-riini G:n valmistamiseksiA process for the preparation of a therapeutically useful dihydrocyclosporin G.

Jakamalla erotettu patentihakemuksesta 7931H2 5 Tämä keksintö koskee kaavan I mukaisen dihydro-syklosporiini G:n valmistusmenetelmää.This invention relates to a process for the preparation of dihydrocyclosporin G of formula I.

I * CH, ^CH2 , CH,I * CH, ^ CH2, CH,

CH HO .CHCH HO .CH

I /CH3 ^CH3 ?h2I / CH3 ^ CH3? H2

C«2 Ch3- CH CHj I CH2 CHJC «2 Ch3- CH CHj I CH2 CHJ

C«3- N-CH-CO-K-CM-c-N-CH- CO-N-CH-C-il-CHiC «3- N-CH-CO-K-CM-c-N-CH-CO-N-CH-C-yl-CHi

«- til L I t II«- til L I t II

i O MOi O MO

COC/O

CB\ I rCB \ I r

CH-CIU-CH L I TCH-CIU-CH L I T

en/ I . » .. I N-CH,en / I. ».. I N-CH,

20 CH3"H I20 CH3 "H I

H OHH OH

\ ° « I «. ϋ i ' i J\ ° «I«. ϋ i 'i J

OC-CM-rv CO-Cm — rv CO — CH-U C—-CH N-CO — CHOC-CM-rv CO-Cm - rv CO - CH-U C —- CH N-CO - CH

lii li! 1 CH3 ** CHj CH j Cl<3 CH CH}lii li! 1 CH3 ** CHj CH j Cl <3 CH CH}

I ^ v. II ^ v. I

I CH3 Ch5 iI CH3 Ch5 i

CH CHCH CH

CHj ^CHj CH-. NCHJCH 2 ^ CH 2 CH-. NCHJ

2525

Keksinnön mukaisesti dihydrosyklosporiini G:tä valmistetaan siten, että kaavan TI mukainen syklo-sporiini G hydrataan.According to the invention, dihydrocyclosporin G is prepared by hydrogenating cyclosporin G of formula TI.

2 63742 c2 63742 c

HB

h/'C\h2 ^Chj I cn3 CH HO. XM J...h / 'C \ h2 ^ Chj I cn3 CH HO. XM J ...

I C“K ^ciT»'^c«3I C “K ^ ciT» '^ c «3

CM} CHj CM CH3 I CH, CHJCM} CHj CM CH3 I CH, CHJ

III I I I 2 IIII I I I 2 I

CHj-N-CH-CO-N-CM-C-N-CH-- CO-W-CM-C-U-CMjCHj-N-CH-CO-N-CM-C-N-CH-- CO-W-CM-C-U-CMj

I I L II t I L II II I L II t I L II I

I O HOI O HO

CO 1 CHj I · coCO 1 CHj I · co

\ I I TT\ I I TT

CH-CM.-CM U I XICH-CM.-CM U I XI

/ I I/ I I

CHj I n-CH,CHj I n-CH,

CHj-N · ICHj-N · I

I H OHI H OH

I O « I I II *· I I II O «I I II * · I I I

OC-CH-N-CO- CH-Kl-CO—CM-N-c-CH-N — CO — CHOC-CH-N-CO-CH-Kl-CO-CM-N-c-CH-N-CO-CH

III III IIII III I

CH} H CH] CH, CHj CM CH}CH} H CH] CH, CHj CM CH}

I S’ \ II S '\ I

I CHJ CHj II CHJ CHj I

CM -CMCM -CM

/ \ / s _/ \ / s _

CHj CHJ CH} CHJCHj CHJ CH} CHJ

Keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan sinän sä tunnetuilla menetelmillä, esim. käyttämällä katalyyttistä hydrausta.The process according to the invention is carried out by methods known per se, e.g. using catalytic hydrogenation.

Edullisia liuottimia ovat etyyliasetaatti ja alem- 5 mat alifaattiset alkoholit, kuten metanoli, etanoli ja isopropanoli. Hydraus on edullista suorittaa neutraalilla alueella 20-30°C:ssa ulkoilman paineessa tai hieman korotetussa paineessa. Katalyytteinä tulevat kysymykseen platina ja edullisesti palladium, esim. palladium/ 10 hiili.Preferred solvents are ethyl acetate and lower aliphatic alcohols such as methanol, ethanol and isopropanol. The hydrogenation is preferably carried out in the neutral range at 20-30 ° C at ambient pressure or at slightly elevated pressure. Suitable catalysts are platinum and preferably palladium, e.g. palladium / 10 carbon.

Lähtöaineena käytetty syklosporiini G valmistetaan siten, että syklosporiini G:tä tuottavaa kantaa, esimerkiksi Tolypocladium-sieniin kuuluvaa Tolypocladium inflatum Gams-kantaa viljellään ravintoliuoksessa 15 ja syklosporiini G eristetään.The cyclosporin G used as a starting material is prepared by culturing a cyclosporin G-producing strain, for example the Tolypocladium inflatum Gams strain belonging to the Tolypocladium fungus, in a nutrient solution 15 and isolating the cyclosporin G.

Viljely suoritetaan sinänsä tunnetuilla, vastaavien kantojen viljelyssä käytetyillä menetelmillä, kuten esim. esimerkissä on kuvattu.The cultivation is carried out by methods known per se and used for culturing the corresponding strains, as described, for example, in the example.

Il 3 63742Il 3 63742

Edullinen syklosporiini G:tä tuottava kanta on Tolypocladium inflatum Gams-sienilajiin kuuluva NRRL 8044.The preferred cyclosporin G-producing strain is NRRL 8044 belonging to the fungal species Tolypocladium inflatum Gams.

Näyte tästä kannasta luovutettiin laitoksen United States Department of Agriculture (Northern Research and Development 5 Division), Peoria, 111., U.S.A., kokoelmiin, jossa sille annettiin numero NRRL 8044, ja josta se on yleisesti saata? vissa. Toinen näyte tästä kannasta luovutettiin laitokseen Fermentation Research Institute, Inage, Chiba City, Japan, jossa sille annettiin numero FRI FERM-P No. 2796. Tämä kanta 10 luettiin aikaisemmin sienilajiin Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.), ja se on kuvattu esim. englantilaisessa patenttijulkaisussa 1 491 509.A sample of this strain was donated to the collections of the United States Department of Agriculture (Northern Research and Development 5 Division), Peoria, 111, U.S.A., where it was assigned the number NRRL 8044, and from which it is generally obtained? able. A second sample of this strain was donated to the Fermentation Research Institute, Inage, Chiba City, Japan, where it was assigned the number FRI FERM-P No. 2796. This strain 10 was previously read into the fungal species Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.) And is described, for example, in English Patent 1,491,509.

Syklosporiini G voidaan eristää tunnetuilla menetelmillä, kuten esim. esimerkissä kuvataan. Tällöin syklosporiini 15 G saadaan erilleen samanaikaisesti läsnäolevista luonnontuotteista, kuten vähemmän polaarisesta syklosporiini D:stä, hieman polaarisemmasta syklosporiini A:sta (tunnetaan myös nimellä S 7481/F-l) , polaarisemmasta syklosporiini. B:stä (tunnetaan myös nimellä S 7481/F-2) ja vielä polaarisemmasta 20 syklosporiini C:stä.Cyclosporin G can be isolated by known methods, as described, for example, in the example. In this case, cyclosporin 15 G is separated from co-occurring natural products, such as less polar cyclosporin D, slightly more polar cyclosporin A (also known as S 7481 / F-1), more polar cyclosporin. B (also known as S 7481 / F-2) and an even more polar cyclosporin C.

Dihydrosyklosporiini G:llä on osoittautunut olevan hyvä niveltulehdusten vastainen vaikutus (ED^g = 27 mg/kg p.o. Freundin adjuvantilla aikaansaadussa niveltulehduksessa). Erikoisen merkittävä on kuitenkin tämän yhdisteen erittäin 25 vähäinen immunosuppressiivinen vaikutus verrattuna tähän asti tunnettuihin syklosporiineihin. Esim. FI-patenttijulkaisusta 54 606 tunnetulla syklosporiini Ailia lymfosyyttien stimu-lointitestissä proliferaation inhib.itioasteeksi saatiin 51 %. Tällä ominaisuudella on erittäin tärkeä merkitys, koska tulen-30 dusten vastaiset aineet eivät saisi vahingoittaa lymfosyyttejä.Dihydrocyclosporin G has been shown to have good anti-arthritis activity (ED 2 = 27 mg / kg p.o. in Freund's adjuvant arthritis). Of particular significance, however, is the very low immunosuppressive effect of this compound compared to cyclosporins known to date. For example, in the cyclosporin Alia lymphocyte stimulation test known from FI patent publication 54,606, the degree of proliferation inhibition was found to be 51%. This property is very important because anti-fire agents should not damage lymphocytes.

Dihydrosyklosporiini G itä voidaan käyttää lääkkeenä sellaisenaan, sopivina tai valmisteina, joihin on sekoitettu farmaseuttisesti hyväksyttäviä inerttejä apuaineita.Dihydrocyclosporin G can be used as a medicament as such, suitable or in admixture with pharmaceutically acceptable inert excipients.

Seuraavassa esimerkissä tarkoittavat kaikki lämpö-35 tilat Celsius-asteita.In the following example, all heat-35 states refer to degrees Celsius.

" 63742"63742

Esimerkki: Dihvdrosvklosporiini GExample: Dihydrosvklosporin G

700 mg palladium/hiilikatalyyttiä (10 % palladiumia) esihydrataan 30 minuuttia 20 mltssa etanolia.700 mg of palladium / carbon catalyst (10% palladium) are prehydrated for 30 minutes in 20 ml of ethanol.

Tähän palladiumkatalyyttisuspensioon lisätään liuos, 5 jossa on 4,55 g syklosporiini G:tä 60 ml:ssa etanolia, ja tämän jälkeen hydrataan 21°C:ssa 99 kPa:n paineessa, kunnes vedynkulutus lakkaa. Seuraavaksi katalyytti suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan kuiviin vakuumissa 20-40°C:ssa. Jäännös koostuu ohutkerroskro-10 matografisesti yhtenäisestä dihydrosyklosporiini G:stä, joka on valkoisen amorfisen jauheen muodossa, jonka sp. on 150-153° (kuivattu korkeavakuumissa 80°C:ssa 4 tuntia).To this palladium catalyst suspension is added a solution of 4.55 g of cyclosporin G in 60 ml of ethanol and then hydrogenated at 21 ° C under a pressure of 99 kPa until hydrogen consumption ceases. The catalyst is then filtered off and the filtrate is evaporated to dryness in vacuo at 20-40 ° C. The residue consists of thin-layer chromatographically uniform dihydrocyclosporin G in the form of a white amorphous powder, m.p. is 150-153 ° (dried under high vacuum at 80 ° C for 4 hours).

Bruttokaava: C~0H,, ..N,, 0, _ 7n 63 115 11 12 15 = “232° (c = 0,64 kloroformissa) UV-spektri metanolissa: pääteabsorptio IR-spektri metyleenikloridissa: katso kuva 3. ^H-NMR-spektri (CDCl^), 90 Mhz, sisäisenä standardina tetrametyylisilaani: katso kuva 4.Gross formula: C ~ 0H ,, ..N ,, 0, _ 7n 63 115 11 12 15 = “232 ° (c = 0.64 in chloroform) UV spectrum in methanol: terminal absorption IR spectrum in methylene chloride: see Figure 3. ^ H 1 H NMR Spectrum (CDCl 3), 90 MHz, internal standard tetramethylsilane: see Figure 4.

20 Lähtöaineena käytetty syklosporiini G voidaan valmistaa seuraavasti: 500 litraan ravintoliuosta, joka sisältää litraa kohti 40 g glukoosia, 2,0 g natriumkaseinaattia, 2,5 g ammoniumfosfaattia, 5 g MgSO^VI^O, 2 g KF^POj^, 3 g 25 NaNOj, 0,5 g KC1 , 0,01 g FeSO^ sekä mineraaleista vapaata vettä, siirrostetaan 50 litraa kannan NRRL 8044 esiviljelmää ja saatua seosta inkuboidaan teräsfer-' menttorissa 13 vuorokautta 27°C:ssa käyttämällä sekoitusta (170 1/min) ja ilmastusta (1 litra ilmaa/min/litra 30 ravintoliuosta) (katso DE-hakemusjulkaisu 2 455 859).The cyclosporin G used as starting material can be prepared as follows: to 500 liters of nutrient solution containing 40 g of glucose per liter, 2.0 g of sodium caseinate, 2.5 g of ammonium phosphate, 5 g of MgSO 4 VI 2, 2 g of KF 2 PO 3, 3 g 25 NaNO 3, 0.5 g KCl, 0.01 g FeSO 4 and mineral-free water are inoculated with 50 liters of preculture of strain NRRL 8044 and the resulting mixture is incubated in a steel fermentor for 13 days at 27 ° C using agitation (170 l / min). and aeration (1 liter air / min / liter 30 nutrient solution) (see DE-A-2 455 859).

Viljelyliuokseen sekoitetaan viljelyliuoksen tilavuuden verran n-butyyliasetaattia, orgaaninen faasi erotetaan ja väkevöidään vakuumissa ja konsentraatis-ta poistetaan rasva kolmivaiheisessa erotuksessa meta-35 noli-vesiseoksen (9:1) ja petrolieetterin avulla.The culture medium is mixed with a volume of the culture medium, n-butyl acetate is separated, the organic phase is separated and concentrated in vacuo and the concentrate is defatted in a three-step separation using a methanol-water mixture (9: 1) and petroleum ether.

5 637425,63742

Metanolifaasi otetaan talteen, väkevöidään vakuumissa ja raakatuote saostetaan lisäämällä vettä. Suodattamalla talteenotettu tuote kromatografoidaan 5-7-kertaisena määrällä "Sephadex LH-20:täM käyttämällä eluent-5 tina metanolia. Sen jälkeen kärkijakeet kromatografoidaan silikageeli 60:llä (raekoko 0,063 - 0,2 mm (Merck)) käyttämällä asetoni-heksaaniseosta (2:1), ja tällöin ensimmäisinä eluoituneissa jakeissa on pääasiassa syklosporiini A:ta ja syklosporiini D:tä ja myö-10 hemmin eluoituneissa osissa pääasiassa syklosporiini C:tä. Jatkopuhdistusta varten kiteytetään syklosporiini Aita ja D:tä sisältävät jakeet 2-2,5-kertaisesta määrästä asetonia -15°C:ssa, tuote kromatografoidaan kaksi kertaa silikageeli 60:llä (raekoko 0,063 - 0,2 mm 15 (Merck)) käyttämällä eluenttina asetoni-heksaaniseosta (2:1), jolloin ensimmäisissä jakeissa eluoituu syklosporiini D:tä voimakkaasti rikastuneena. Nämä jakeet liuotetaan kaksinkertaiseen määrään asetonia ja annetaan kiteytyä -15°C:ssa. Epäpuhdas kidemassa 20 koostuu hyvin voimakkaasti rikastuneesta syklosporiini D:stä ja emäliuos sisältää syklosporiini D:n lisäksi myös muita komponentteja, kuten syklosporiini G:tä. Syklosporiini G:n erottamiseksi emäliuos haihdutetaan kuiviin, jäännös kromatografoidaan silika-25 geeli 6 0 :1lä (raekoko 0,063-0,2 mm (Merck)) käyttämällä eluenttina vedellä kyllästettyä etikkaesteriä, jolloin ensin eluoituneet jakeet sisältävät syklosporiini D:tä ja myöhemmin eluoituneet jakeet syklosporiini G:tä sekä muita komponentteja. Rikastamista jat-30 ketään siten, että seos kromatografoidaan silikageeli 60:llä (raekoko 0,063-0,2 mm (Merck)) käyttämällä ensin eluenttina kloroformi-metanoliseosta (98:2) ja sen jälkeen heksaani-asetoniseosta (2:1), ja tällöin myöhemmin eluoituneet jakeet sisältävät syklospo-35 riini G:tä erittäin rikastuneessa muodossa. Kun puhdistusta jatketaan siten, että syklosporiini G:tä 6 63742 sisältävät jakeet kiteytetään kahdesti huoneenlämpö-tilassa eetteripetrolieetteriseoksesta (1:1), saadaan ohutkerroskromatograafisesti yhtenäistä, puhdasta (puhtausaste >95 %) syklosporiini G:tä värittöminä 5 monitahokkaina, sp. 193-194° (kiteitä kuivattu kor-keavakuumissa 80°C:ssa 2 tuntia).The methanol phase is collected, concentrated in vacuo and the crude product is precipitated by adding water. The product recovered by filtration is chromatographed 5-7 times with Sephadex LH-20M using methanol as eluent. The fractions are then chromatographed on silica gel 60 (grain size 0.063-0.2 mm (Merck)) using acetone-hexane (2 : 1), in which case the first fractions eluted contain mainly cyclosporin A and cyclosporin D and the subsequently eluted fractions contain mainly cyclosporin C. For further purification, fractions 2-2.5- containing cyclosporin Aita and D are crystallized. of acetone at -15 ° C, the product is chromatographed twice on silica gel 60 (grain size 0.063-0.2 mm (Merck)) using acetone-hexane (2: 1) as eluent, eluting cyclosporin D in the first fractions. These fractions are dissolved in twice the amount of acetone and allowed to crystallize at -15 [deg.] C. The crude crystalline mass 20 consists of very highly enriched cyclosporin D and the mother liquor contains cyclosporin. in addition to orine D, other components such as cyclosporin G. To separate cyclosporin G, the mother liquor is evaporated to dryness, the residue is chromatographed on silica gel 6 0: 1 (grain size 0.063-0.2 mm (Merck)) using water-saturated ethyl acetate as eluent, the fractions eluted first containing cyclosporin D and the fractions subsequently eluted. cyclosporin G and other components. Concentration is continued by chromatographing the mixture on silica gel 60 (grain size 0.063-0.2 mm (Merck)) using first chloroform-methanol (98: 2) followed by hexane-acetone (2: 1) as eluent, and then the fractions eluted later contain cyclosporin G in a highly enriched form. Purification is continued by crystallizing cyclosporin G-6 63742 fractions twice at room temperature from a mixture of ether and petroleum ether (1: 1) to give a thin layer chromatographically uniform, pure (> 95% purity) cyclosporin G as colorless 5 complexes, m.p. 193-194 ° (crystals dried under high vacuum at 80 ° C for 2 hours).

= -245° (c = 1,00 kloroformissa) -191° (c = 1,04 metanolissa).= -245 ° (c = 1.00 in chloroform) -191 ° (c = 1.04 in methanol).

UVspektri metanolissa: pääteabsorptio 10 IR-spektri metyleenikloridissa: Ks. kuva 1.UV spectrum in methanol: final absorption 10 IR spectrum in methylene chloride: Cf. picture 1.

^H-NMR-spektri (CDClg), 90 MHz, sisäisenä standardina tetrametyylisilaani: Katso kuva 2.1 H-NMR spectrum (CDCl 3), 90 MHz, internal standard tetramethylsilane: See Figure 2.

Bruttokaava: CggH^gN^O^g.Gross formula: CggH ^ gN ^ O ^ g.

»»

Il.Il.

Claims (4)

63742 Patenttivaatimus . Menetelmä kaavan I mukaisen terapeuttisesti käyttökelpoisen dihydrosyklosporiini G:n valmistamisek- 5 si, C«3N CH, I £ ch2 10 ^CHJ , CM3 C» HO. yCH ' . I CB\ /CB’ C»5 i"s CM? CH3 cm CH3 I CH, CH3 I II i l i l CW3- M - CH - CO-N-C H—c— N-CH CO N —CH — C—ls( CH, L t II L I L II I O HO 15 CH3^ J · CM-ClHj-Ch t X CMl I N~ C Hj CM3-n 3 I H OH I p « I i H v I i OC'CH-M—CO-CH —M CO — CH-hi c CH—M-CO — CH63742 Claim. A process for the preparation of a therapeutically useful dihydrocyclosporin G of formula I, C? 3N CH, I? Ch2 10 ^ CHJ, CM3 C »HO. yCH '. I CB \ / CB 'C »5 i" s CM? CH3 cm CH3 I CH, CH3 I II yl CW3- M - CH - CO-NC H — c— N-CH CO N —CH - C — ls (CH , L t II LIL II IO HO 15 CH3 ^ J · CM-ClHj-Ch t X CMl IN ~ C Hj CM3-n 3 IH OH I p «I i H v I i OC'CH-M — CO-CH - M CO - CH-hi c CH-M-CO-CH 20 III III I ch3 m CH3 CHj CH3 CH CH} I ^CH, I Ch3 Ch3 C»I3 CH} 25 tunnettu siitä, että kaavan II mukainen syklosporiini G 63742 C II h'' \h2 CH-\ ^CH3 I 9^3 Cm HO. /CH ' I CM^ /CM’ ,>£<"> NcHj ΪΜ2 CHZ CH3 CM CHj I CH2 CMj Cm,- N-CH-CO-N-CH — c-N-CH-CO-N—CH— C—S-CM, I I L II L I l U I I O M O co I en, I co \ I I Cm-CHj-Ch V J II CH3 I H-CMj CH,- N I J M OH I o i I v H «. I 11 OC- CH-K — CO-CH — N-co — CH-u-C-CM—M-CO-CM III III I CHj H CMj CHj CM3 cm CM? I CHJ ^CH* I CH CH / \ / s, CHj CM3 CHj CHJ hydrataan. 63742 Patentkrav. Förfarande för framställning av terapeutiskt användbart dihydrocyklosporin G med formeln I, 5 C«3N ch, I * Cll220 III III I ch3 m CH3 CHj CH3 CH CH} I ^ CH, I Ch3 Ch3 C »I3 CH} 25 characterized in that the cyclosporin of the formula II G 63742 C II h '' \ h2 CH- \ ^ CH3 I 9 ^ 3 Cm HO. / CH 'I CM ^ / CM',> £ <"> NcHj ΪΜ2 CHZ CH3 CM CHj I CH2 CMj Cm, - N-CH-CO-N-CH - cN-CH-CO-N — CH— C — S -CM, IIL II LI l UIIOMO co I en, I co \ II Cm-CHj-Ch VJ II CH3 I H-CMj CH, - NIJM OH I oi I v H «.I 11 OC- CH-K - CO- CH - N-co - CH-uC-CM-M-CO-CM III III I CHj H CMj CHj CM3 cm CM? I CHJ ^ CH * I CH CH / \ / s, CHj CM3 CHj CHJ is hydrogenated. For the preparation of therapeutically active dihydrocyclosporin G with formula I, 5 C «3N ch, I * Cll2 10 CHV /CH3 I ?H3 CH ^ HO .CM * | CH>\ >^WNCM3 |H2 CM? CHj CM ch3 I CH, CHj „ lii il i l CHj-N-CH-CO-M-CH—c— N-CH- CO-N —CM — C— n-CH, * <-11 «. I I ;i I O HO CO l5 ch3^ J CO CM-CH?-CH t. J „ I H-CH, CM3-N I 3 I H OH I °r « I i II v I OC-CH-N— CO-C H — K-CO-CH-N-e-CH-N-CO-CH10 CHV / CH3 I? H3 CH ^ HO .CM * | CH> \> ^ WNCM3 | H2 CM? CHj CM ch3 I CH, CHj „lii il i l CHj-N-CH-CO-M-CH-c-N-CH-CO-N-CM-C-n-CH, * <-11«. II; i IO HO CO 15 ch3 ^ J CO CM-CH? -CH t. C H - K-CO-CH-Ne-CH-N-CO-CH 20. Il III I CM0 H CH3 CH, CH3 CH CH, I / \ I I CMl CHj I CM CH / \ / \ CH3 CHJ CM] CMj kännetecknat därav, att man hydrerar cyklosporin G med formeln II20. Il III I CM0 H CH3 CH, CH3 CH CH, I / \ I I CMl CHj I CM CH / \ / \ CH3 CHJ CM] CMj