FI120095B

FI120095B - Menetelmä peptidien valmistamiseksi, joilla on kasvuhormonia vapauttavaa aktiivisuutta

Info

Publication number: FI120095B
Application number: FI940807A
Authority: FI
Inventors: David H Coy; Cyril Y Bowers
Original assignee: Univ Tulane
Priority date: 1991-08-22
Filing date: 1994-02-21
Publication date: 2009-06-30
Also published as: SK20494A3; MX9204861A; BR9206398A; DE69227462T2; FI940807A; CA2116120A1; IL102848A0; ES2124263T3; PL169562B1; SK282895B6; EP0605484B1; HUT69178A; JP3179489B2; NZ244034A; BG98489A; JPH07507039A; HU9400495D0; CA2116120C; US5663146A; FI120691B

Description

X

Menetelmä peptidien valmistamiseksi, joilla on kasvuhormonia vapauttavaa aktiivisuutta Tämä keksintö koskee menetelmää sellaisten uusien 5 pol ypept.idiyhdls teiden valmistamiseksi, jotka edistävät kasvuhormonin vapautumista, kun niitä annetaan eläimille, edullisesti ihmisille.

Keksinnön tausta

Kasvuhormonin (GH) tasojen nostaminen eläimissä, 10 esimerkiksi nisäkkäissä ihmiset mukaanlukien, antamalla GH:ta vapauttavia yhdisteitä, voi johtaa painon nousuun ja maidontuotannon tehostumiseen, jos antamisen jälkeen ilmenee riittävän kohonneita GH-tasoja. Lisäksi tiedetään, että kasvuhormonitasojen nousu nisäkkäissä ja ihmisissä 15 voidaan saada aikaan käyttämällä tunnettuja kasvuhormonia vapauttavia aineita, kuten luonnossa ilmeneviä kasvuhormonia vapauttavia hormoneja.

Kasvuhormonitasojen nousu nisäkkäissä voidaan myös saada aikaan käyttämällä kasvuhormonia vapauttavia pep-20 tideja, joista jotkin on kuvattu aikaisemmin, esimerkiksi patenteissa US 4 223 019, US 4 223 020, US 4 223 021, US 4 224 316, US 4 226 857, US 4 228 155, US 4 228 156, US 4 228 157, US 4 228 158, OS 4 410 512, US 4 410 513.

Kohonneiden GH-tasojen aikaansaamiseksi on myös 25 käytetty vasta-aineita, jotka on suunnattu endogeenista j kasvuhormonin vapautumisen inhibiittoria, somatostatiinia j (SEIF) vastaan. Tässä jälkimmäisessä esimerkissä kasvuhormonitaso ja kohotetaan poistamalla endogeeninen GH:n vapau- j humisen inhibiittori (SRIF) ennen kuin se pääsee aivo- | s 30 lisäkkeeseen, jossa se estää GH:n vapautumista. j

Kuhunkin näistä menetelmistä, joilla voidaan edistää kasvuhormonitasojen kohoamista, sisältyy materiaaleja, jotka ovat kalliita syntetisoida ja/'tai eristää riittävän puhtaana kohde-eläimelle antamista varten. Lyhytketjuiset, 35 molekyylipainoltaan pienet, suhteellisen yksinkertaiset i 2 polypeptidit, jotka ovat sulit eel li sen halpoja valmistaa ja joilla on kyky edistää kasvuhormonin vapautumista, olisivat suotavia, koska niiden pitäisi olla helposti ja halvalla valmistettavissa, helposti modifioitavissa kemialli-5 sesti ja/'tai fysikaalisesti, samoin kuin helposti puhdistettavissa ja formuloitavissa, ja niillä pitäisi olla e r i n oma i s et ku1j et usomina isuudet.

Vaikka tunnetaankin joitakin lyhytketjuisia polypeptide jä jotka voivat edistää kasvuhormonitasojen vapau-10 tumista ja nousua veressä, kuten His-DTrp-Äla-Trp-DPhe-Lys-NH2, kuten pohditaan patentissa ÖS 4 410 512, on tärkeää kyetä tarkoin muuttamaan polypeptidejä eri syistä, kuten vapautuminen, biologinen imeytyminen, lisääntynyt retentioaika jne, Aminohappomuutoksilla tietyissä kohdissa 15 voi kuitenkin olla dramaattisia vaikutuksia lyhytketjuisen peptidin kykyyn edistää kasvuhormonin vapautumista.

Olisi suotavaa, jos olisi olemassa erilaisia lyhyt-ketjuisia polypeptidejä, jotka voivat edistää kasvuhormonitasojen vapautumista ja nousua eläinten veressä, erityi-20 sesti ihmisissä. Olisi myös edullista, jos sellaisia polypeptide jä voitaisiin käyttää edistämään kasvuhormoni-tasojen vapautumista ja/tai nousua eläinten ja ihmisten veressä.

Olisi myös suotavaa tarjota menetelmiä, joilla 25 voitaisiin edistää kasvuhormonitasojen vapautumista ja/tai nousua eläinten veressä sellaisia lyhytketjuisia polypeptidejä käyttämällä.

Keksinnön yhteenveto

Keksintö koskee siten menetelmää sellaisen peptidin 30 valmistamiseksi, jolla on kaava 'Äi-A2-Äla-C2~C3”Ä5, jossa Äi on Gly, DAla, β-Ala, Sar, Ava, Äib, ct-aminovoihappo (ABU), NH2 (CH2) 5CO tai Na-4-imidat sollet i kka-happo (ΙΜΆ), Ä2 On DTrp, DBNal, Ä5 on Ä3-ft4“A5· , Ά3-Α5-, Α4-Α5Λ täi Ä5·, 35 jossa 3 a) Ä3 on Ala, Gly, DAIa, Pro tai desAla, bj Ä4 on Ala, Gly, DAla, Pro, CG-Cio-suoraketj uinen alkyyliaminokarboksyylihappO tai desAla, ja c) A$.· on Lys (e~Ri, R2) -Z, 0rn(5-Ri,R2) -Z, NH(CH2)>;N-5 (R3,Bii), Lys-Z, Qrn-Z tai Arg-Z, joissa Ri on suora ket j uinen

Cz-CiQ-alkyyiirybjmä tai H-atomi, R2 on suoraketjuinen C2^ Cio~alkyyliryhrnä tai H~atomi, mutta Ri ja R2 eivät samanaikaisesti ole H, R2 on suoraketj uinen Cs-Cio-alkyyliryhmä tai H-atomi, R4 on suoraketj uinen Cs-Cio-alkyyliryhmä tai 10 H-atomi, Z on NH( suoraketj uinen C2-Cio-alkyyliryhmä), N { suoraketj uinen Cs-Cio-alkyyliryhmä) 2, O- ( suoraketj uinen C2-Cio~alkyyli ryhmä), NH2 tai OH, x on 2 — 15, C2 on Trp, Phe tai ChxAla, C3 on DPhe, DPal tai DChxÄla, 15 ja edellä mainittujen peptidien orgaanisten ja epäorgaanisten additiosuolojen valmistamiseksi.

Ai on edullisesti DAla.

A2 on edullisesti D%a:l.

Ä5 on edullisesti .

20 Cs on edullisesti Trp tai Phe.

Edullisemmin C2 on Trp.

C3 on edullisesti DPhe.

Polypeptidi on edullisesti Äi~Ä2-Ala-C2-DPhe-Ä5, edullisemmin polypeptidi on Äi-As-Ala-Trp-DPhe-As.

25 Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että (i) edellä kuvatut aminohapot tai aminohappojohdannaiset liitetään yhteen peptidin muodostamiseksi käyttäen kiinteän faasin menetelmää, tai (li) suoritetaan edellä kuvattujen aminohappojen tai aminohappojohdannaisten tai 30 näiden peptidifragmanttien syntetisointi liuosvaihemene- telmällä, joka sisältää ainakin kahden fragmentin kohden-saatioreaktion, peptidin muodostamiseksi.

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 on sarja kuvaajia, joista käy ilmi ihmisen 35 kasvuhormonin tasot seerumissa ajan funktiona.

4

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Olemme keksineet menetelmän valmistaa useita niisiä lyhytketjuisia polypeptideja, jotka saavat aikaan kasvu-hormonitasojen vapautumisen ja nousun eläinten veressä.

5 Polypeptidit ovat seuraahan kaavan mukaisia:

Ai-Ä2-Ala-Trp-DPhe-Äb, jossa Αχ on Gly, DAla, β-Ala, Sar, Ava, Aito, xmidatsolisti kkahappo, N-a.lempi alkyyliaminokarboksyylihappo, N, N-bis-alempi alkyyliaminökarboksyylihäppo, jossa alempi 10 alkyyliryhmä sisältää 2 - noin 10 suoraketjuista hiili-atomia. Alempi alkyyliryhmä on edullisesti 2 - 6 suora-ketjuista hiiliatomia. Alempi alkyyliryhmä voi olla substituoitu tai substituoimaton. Edullisia substituent-teja ovat 0, N tai Si. Alempi alkyyliryhmä on edullisesti 15 substituoimaton. Edullinen atsolikarboksyylihappo on Na-4-imidatsolietikkahappo {IMA). Ai on edullisesti Gly tai DAla. Ai on edullisimmin DAla.

Ä2 on DTrp, D%al. Edullisemmin Ä2 on DpNal.

As on A3-Ä4-Äs>, A3-A5', A4-Ä5’ tai As -. As on edullases-20 ti As-, As on Ala, Gly, DAla, Pro tai desAla. A4 on Ala, Gly, DAla, Pro,, lineaarinen alempi alkyyliaminokarboksyylihappo, tai des Ai a .· As.· on Lys(e-Ri, Ra) -Z, Orn (δ-Ri, R2J -Zr LArg (g-Rs-Re) , N.H (CH2) XN (R3,R4) * As- voi olla myös lys-Z,. Orn-Z tai Arg-Z, kun Ai ei ole: His, Ri on lineaarinen 25 alempi alkyyliryhmä tai H-atomi. R2 on lineaarinen alempi alkyyliryhmä tai H-atomi. Kun Rx on H, Ra ei ole H, samaten kun Ra on H, Ri ei ole H. R3 on lineaarinen alempi alkyyliryhmä tai H-atomi. R4 on lineaarinen alempi alkyyliryhmä tai H-atomi, Rs ja Rö ovat lineaarisia 30 alempia arkyyliryhmiä- Alempi alkyyliryhmä sisältää 2 -noin 10 suoraketjuista hiiliatomia. Alempi alkyyliryhmä on edullisesti 2 - 6 suoraketjuista hiiliatomia. Alempi alkyyliryhmä voi olla substituoitu tai substituoimaton. Edullisia substituentteja voivat olla O, N tai Si. Alempi 35 alkyyliryhmä on edullisesti substituoimaton:, g on guani- 5 diini. Z on NH(lineaarinen alempi alkyyliryhmä), M(lineaarinen alempi alkyyliryhmä)2, Ö~(lineaarinen alempi alkyyliryhmä) , RHa tai OH, jossa lineaarinen alempi aikyyli-ryhmä on edellä olevan määritelmän mukainen, x on 2 - 15. 5 x on edullisesti 2 - 6. Ä5> on edullisesti Lys-NHz. Ja minkä tahansa mainitun polypeptidin orgaaniset tai epäorgaaniset addit iosuolat.

Käytetyt aminohappotähteiden lyhenteet ovat stari-dardinomaisen peptidinimistön mukaisia: 10 Gly — Glysiini

Tyr = L-tyrosiini

Ile = L-isoleusiini

Glu - L-glutamiinihappo

Thr — L-treoniini 15 Phe == L-fenylalaniini

Ala = L-alaniini

Lys = L-lysiini

Asp = L-asparagiinihappo

Cys - L-kysteiini 20 Arg = 1-arginiini

Ava = aminovaleriaanahappo

Aib = aminoisovoihappo

Gin - L-glutamiini

Pro = L-pr. Oliini 25 leu ~ L-leusiini

Met = L-metIoniini

Ser = L-seriini

Asn == L-asparagiini

His = L-histidiinl 30 Trp - L-trypto£aani

Vai = L-valiini DOPA = 3,4-dihydro ks i f enyia1ani i n i

Met(Ö) ~ metioniinisulfoksidi

Abu - a-aminovoihappo 35 iLys « N—isopropyyli-L-lysiini 6 4-Abu ™ 4-aminovoihappo

Orn = L-o:r äitiini:

DaNal = a-naftyyli-D-alaniini

DpNal = β-naftyyii-D-alaniini 5 Sar = sarkosiini LAxg - homoarginiini

Chx = sykloheksyyli

ChxAla = L-sykloheksyylialaniini DCHxAla = D-sykloheksyylialaniini 10 IMA = Na-imidatsolietikkahappo

Tee - 1,2,3,4-tetrahydro-7-karoliini-3- karboksyyilhappo:

Tic = 1,2,3,:4-te:tbahydroiS:okinoliini-3- karbo ks yy1Ihappo 15 Tip = 4,5,6,7-tetrahyöro^lB-imidatsQ [e] karbpks yy1ihappo a, gamma-ABU = alfa, garnma-aminovoihappo DPal = D-3-pyridyylialaniini

Kaikki kolmikirjaimiset aminohappolyhenteet, joita 20 edeltää "D", viittaavat aminohappotähteen D-konfiguraati-oon, ja. glysiinin ajatellaan sisältyvän termiin "luonnossa ilmenevät 'L-aminohapot”.

Näissä lyhytketjäisissä polypeptideissä tietyt kohdat sietävät enemmän muutoksia kuin toiset, ilman että ne 25 vaikuttaisivat haitallisesti peptidin kykyyn edistää kas-vuhormonitasojen vapautumista ja/tai nousua eläinten veressä. Esimerkiksi As”kohta. Toiset kohdat sietävät vähemmän sellaisia muutoksia. Esimerkiksi keskellä sijaitsevat aminohappotähteet Ala, Trp, DPhe:, jotka on esitetty vas-30 taavasti merkein Cif C2 ja C3. Aikaisemmin uskottiin esimerkiksi, että Ai ja Ä2 pitäisi olla L- ja vastaavasti D-mUor dossa, ja että Trp ja DPhe pitäisi olla myös L- ja D-muodossa., mikä muodostaa LD LD -sarjan. Havaitsimme kuiten- j kin, että LD LD -sarja voi olla DD LD -sarja. Täten ha-35 valttiin yllättäen, että polypeptidi jolla on kaava Ä1-Ä2- 7

Ci“C2~C.3”Ä5f jossa Ai, Aj, As ovat edellä kuvatun kaltaisia ja Ci on Ala, C2 on Trp, Phe ja ChxA.la ja C3 on DPhe, DPal tai DChxAla, edistää fcasvuhormonitasojen vapautumista ja/-tai nousua eläimissä.

5 C2 on edullisesti Trp tai Phe, edullisemmin C? on

Trp.

C.3 on edullisesti DPhe. Kun C2 on ChxÄla, C3 on edullisesti DPhe. Kun C3 on DPal, Z on edullisesti OH.

Lisääntynyt taipuisuus, joka liittyy siihen että 10 valitaan emäksisiä, neutraaleja tai happamia aminohappotähteitä ja L- ja D-muotoja, joita voidaan käyttää aminohappojen Ai, Ä2, A3, Ä4, As, Ca ja C3 tapauksessa, tarjoaa suuren hallittavuuden halutun peptidin fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia silmälläpitäen.

15 Vaikka peptideillä 0Α1β-0βΝ3ΐ-Α1η-ΤΓρ-0ΡΗβ-Κγ3-ΝΗ2 ja DAla-Dphal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NHa on samanlaista GH:ta vapauttavaa aktiivisuutta, Trp:n substituointi Phe:llä voi lisätä peptidin DAla-DpNal-Äla-Phe-DPhe-Lys-NHs kemiallista stabiiliutta, koska Trp hapettuu herkemmin kuin Phe. Sa-20 moin Trp:n substituointi Phe:llä antaa peptidille enemmän hydrofobisuutta ja tämä jäljempänä kuvattu fysikaäiis-ke-miallinen ominaisuus: voi olla edullinen ajateltaessa suun kautta, ihon läpi ja/ta.i. nenän kautta imeytymisen tehostamista samoin kun peptidin formulointia. Lisäksi DAla-25 D hNa 1 -Ä1 a-Tr p - DPh e -Lys-NHz: n ja DAla^Nal-Ala-Phe-DPhe-Lys-N:H2:n ED50 {50-prosenttx:sesti: tehokas annos) rotan solun histamiinimäärityksessä on samanlainen, se on: 30,5 ± 0,5 ja 30,8 ± 0,3 pg/ml ja molemmat ovat parannus verrattuna Aia - H i s - D βΝ a 1 - Ai a -/F rp - D Ph e - Ly s - N H 2: n hist ami ini a kt i ivisuu-30 teen, joka oli 11,0 ± 1,0 pg/ml. Peptidit, joilla on vähemmän histamiinia vapauttavaa, aktiivisuutta (korkeampi ED50) voivat olla kliinisesti tehokkaampia, koska ne voisivat tuottaa vähemmän haitallisen paikallisreaktion peptidin injektiokohtaan ja/tai voivat vähemmän todennäköi- 8 sesti tuottaa systeemisiä antigeenisiä haitallisia kliinisiä vaikutuksia.

Taipuisuus tarjoaa myös tärkeitä etuja halutun peptidin formuloinnissa ja antamisessa mille tahansa lajille.

5 Nämä muutokset voivat myös parantaa suun kautta tapahtuvaa imeytymistä, samoin kuin peptidien metaboliaa ja erittymistä. Äla-His-D%al-Äla~Trp—DPhe-tys—ΝΗ2 (GHRP-1 > on esimerkiksi kasvuhormonia vapauttavalta kyvyltään ihmisessä tehokkaampi kuin Ala-His-DTrp-Ala-Trp-phe-Lys-NHs. DAla-10 D%ar-Ala-Trp~DPhe-Lys-NH2 (GHRP-2) on kuitenkin tehokkaampi kuin GHRP-1 suun kautta annettuna. Katso kuvio 1, jossa esitetään kasvuhormonitasot normaalien nuorten miesten seerumissa ajan funktiona, sen jälkeen kun on annettu 300 pg/kg GHRP-1:tä 40 kohteelle, kuvaajassa vasemmalla 15 (o), 600 ug/kg GHRP-1:tä 39 kohteelle, keskellä (A), ja 100 pg/kg GHRP-2:ta 11 kohteelle, kuvaajassa oikealla (□) . Näissä tutkimuksissa GHRP annettiin ensiksi 20 ml:ssa H20:ta, jota seurasi heti 100 ml Η20:ta, normaaleille nuorille miehille,: joiden keski-ikä oli noin 25. Veri otet-20 tiin kuten kuvaajassa on esitetty. GH mitattiin radioimmunologisella määrityksellä.

Odotetaan myös, että koska näissä peptideissä aromaattiset sivuketjut voidaan poistaa tietyistä kohdista, joissa niiden aikaisemmin ajateltiin olevan välttämättö-25 miä, ja että D-aminohappotähteen pitäisi olla biologisesti suojatumpi kuin h-muodon, voidaan käyttää joillekin peptideille suurempaa suojausta ja pienempiä painoja, jotta pölypeptidiä saadaan edelleen tarkoin muuteltua jotta saadaan mahdolliseksi sellaiset ominaisuudet kuten imeyty-30 minert nenän kautta, suun kautta, ihon läpi, stabiilisuus in vivo jne.

Ri.:n, IA:n, Ra:n, R4:n ja Z:n osia voidaan myös vaihdella, mikä tarjoaa näin ollen lisäkontrollin halutun yhdisteen fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien suhteen.

9

Vastaavasti voidaan saada aikaan peptidin: tehostunut vapautuminen tiettyyn reseptoriin ja tietyssä lajissa..

Edullisia kasvuhormonia vapauttavia yhdisteitä, joita valmistetaan tämän keksinnön mukaisella mene telinä!-5 la, ovat:

Ai-A2-A1 a -T r p - D Phe - A5, tai minkä tahansa sellaisen polypeptidin orgaaniset 10 tai epäorgaaniset additiosuoXat, joissa Ai, Ä2 ja As ovat edellä olevan määritelmän mukaisia.

Edullisessa suoritusmuodossa kasvuhormonia vapauttavalla peptidillä, jota valmistetaan tämän keksinnön mukaisella menetelmällä, on kaava: 15 DAla-Ä2 -Ala-Trp-DPhe-Äs, ja sen orgaaniset tai epäorgaaniset additiosuolar.

Tämän yhdisteryhmän eäullisillä jäsenillä on kaava: 20 D Ai a - D^Nal-Ala-T r p - D Plie-Ly sNH2, ΟΆΐ3-0%θ1~Αΐ3~ΤΓρ-ΟΡΗθ-:31γ3 (ε-iPr) NHa, DAla-DTrp-Äla-Trp-DPhe-Lys{e-iPr)NH2, DÄla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-LysNHs, DAla-D%al-:Ala-Trp-DPhe-NH {CH2) 5NH2, 2 5 NH2 (CH2) 5 CO - -N ai -Ä i a - T r p - D - Phe -NH (CH2) 5NH2, samoin kuin näiden orgaaniset tai epäorgaaniset additiosuolat.

Nämä yhdisteet ovat tällä hetkellä edullisimpia, koska nämä lyhytketjuisemmat polypeptidit ovat halvempia 30 syntetisoida, ja näiden spesifisten yhdisteiden on osoitettu edistävän hyvin tehokkaasti seerumin kasvuhormoni-tasojen nousua.

Muilla edullisilla kasvua vapauttavilla peptideillä^ | on kaava Ai-As-Ala-Phe-DPhe-As, Edullisiin jäseniin tässä 35 yhdisteryhmässä kuuluvat ne, joissa Ai on ΝαΙΜΑ, a,gam- 10 ma,ABU, DAla, His, Ala, His tai a,gamma,ABU, Ä2 on DpNai tai DPhe, ja As on LysNH2, LysNHz, Ärg HH2, NH-CHx-NHa (1,4-Chx-diamiini) tai Lys EA. Esimerkiksi NaiMA-D^Nal-Ala-Phe-DPhe-LysNHa, a, gamma, ABU-DpHal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, 5 DAla-DPhe -Ala- Phe - D Phe-Ly s NH2, PA1 a - H i s-DpNal-A1 a - Phe-DFh e -

LysMH?., Hal MA- D% a 1 - Al a ~ Ph e - D Ph e - NB-CHx- HH2,: ö, gamma, ABU-

DpHai-Ala-Phe-QPhe-KH-Ghx-NH2, DAla-D^al-Ala-Phe-DPhe-Lys EA, DAl:a-DpNal-Ala-Phe-DPhe“ArgNH:2, samoin kuin näiden orgaaniset tai epäorgaaniset additiosuolat.

10 Edullisiin peptideihin kuuluvat polypeptidit, joilla on kaava A1-A2-C1-C2-C3-Ä5, jossa Οχ on Ala, C.; on Trp, Phe: tai ChxAla, C3 on DPhe tai DChxÄla, Αχ on edullisesti DAla. Aa on edullisesti D^Nal:. Esimerkiksi DAla-Dί3Nal-Ala-ChxÄla-DPhe-L·ysNH2, DÄla-D^Nal-Ala-Phe-DChx:-15 Ala-LysHHa ja DÄla-DpNal-Ala-ChxÄla-DChxAlä-LysNH2, samoin kuin näiden orgaaniset tai epäorgaaniset additiosuolat.

iässä kuvatut yhdisteet ovat tyypillisesti helppoja syntetisoida, ne edistävät tehokkaasti seerumin hormonitasojen nousemista, ja ne ovat suotavia kaupallisen mitta— 20 kaavan tuotannossa ja. hyötykäytössä. Lisäksi nämä yhdisteet voivat olla edullisia sikäli että niillä on fysikaa-lis-kemiallisiä ominaisuuksia, jotka ovat suotavia silmälläpitäen sellaisten polypeptidiyhdisteiden tehokasta antamista monille erilaisille eläinlajeille, mikä johtuu tai-25 puisuudesta jonka ovat mahdollistaneet erilaiset substituutiot polypeptidiyhdisteiden monissa eri kohdissa, ja siitä että on valittu näiden polypeptidiyhdisteiden C-ter-minaalisen osan ja keskiosan polaarinen, neutraali tai ei-polaarinen luonne, niin että se piisi yhteensopiva halutun 30 antotavan kanssa, on suun kautta, nenän kautta, jatkuva antaminen, jossa käytetään erityisiä kemiallisia/mekaani-siä antömenetelmiä, Näitä peptidejä voidaan käyttää terapeuttisesti mihin tahansa tarkoitukseen johon kasvuhormonia voidaan 35 käyttää, kuten hoidettaessa hypotalamus-aivolisäke-peräis- 11 tä kiSpiökasvuisuuttar osteoporoosia, palovammoja ja munuaisten vajaatoimintaa akuuttia käyttöä varten, yhdisty-mätöntä luunmurtumaa varten ja haavan paranemisen edistämiseen. Lisäksi sitä voidaan käyttää edistämään kirurgiasi 5 ta toipumista ja akuuteissa/kröönisissa heikentävissä lääketieteellisissä sairauksissa. Suotuisia anabolisia vaikutuksia saadaan ihoon, lihakseen ja luuhun suhteessa ikään-tymisprosessiin ja samanaikaiseen elimistön rasvan vähenemiseen. Mukaan kuuluu myös syöpäpotilaiden hoito näillä 10 peptideillä, esimerkiksi näivetyksen estäminen ja/tai vähentäminen syöpäpotilaita. Nämä terapeuttiset käytöt saadaan aikaan käyttämällä peptidin terapeuttisesti tehokasta määrää. Sellainen määrä on se, joka tarvitaan edistämään seerumin kasvuhormoni tasojen vapautumista, kuten jäi jenipä-15; nä pohditaan.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavia yhdisteitä voidaan myös käyttää kohottamaan veren GH-tasoja eläimissä, lisäämään maidon tuotantoa naudoissa, lisäämään ruumiin kasvua sellaisissa eläimissä kuten 20 nisäkkäät (esim:, ihmiset, lampaat, naudat ja siat) samoin kuin kaloissa, siipikarjassa, muissa selkärankaisissa ja äyriäisissä, ja lisäämään villan ja/tai turkin tuotantoa nisäkkäissä· Ruumiin kasvun määrä riippuu eläinlajin sukupuolesta ja iästä, annettavan kasvuhormonia vapauttavan 25 yhdisteen määrästä ja identiteetistä, antoreitistä ja vastaavasta. Samoin tämän keksinnön mukaiset yhdisteet lisäävät seerumin GH:ta ihmisissä, lisäävät ruumiin kasvua lyhytkasvuisilla lapsilla, alentavat ruumiin rasvapitoisuutta ja parantavat proteiinimetaboliaa tietyissä lapsissa, 30 /parantavat ihon, lihaksen, luun proteiinimetaboliaa samalla kun ne alentavat vanhusten ruumiin rasvapitoisuutta, erityisesti kun läsnä on GH-puutos.

Nämä peptidit ovat myös hyödyllisiä parannettaessa seerumin pasvaprofiilia ihmisissä, sikäli että ne laskevat 35 seerumissa seerumikolesterolin ja "low density" -lipopro- 12 teiinin määrää ja nostavat seerumissa "high density" -li-poproteiinin määrää.

Tämän 'keksinnön mukaisesti uudet polypeptidiyhdisteet voidaan syntetisoida tavanomaisten liuosfaasin ja 5 kiinteän faasin peptidikemian menetelmien mukaisesti, tai sinänsä tunnetuilla tavoilla.

Peptidiamidej a varten kiinteän faasin synteesi aloitetaan edullisesti peptidin. C-terminaalisesta päästä.

Sovelias lähtömateriaali voidaan Valmistaa esimerkiksi 10 kiinnittämällä tarvittava suojattu alfa-aminohappo kloori-metyloituun hartsiin, hydroksimetyylihartsiiii, bentshyd-ryyliamiini (BHA) -hartsiin tai parametyylibentsyylihyd-ryyliamiini (p-Me-BHA) -hartsiin. Bio-Rad Laboratories (Richmond, California) myy yhtä sellaista kloorimetyy1i-15 hartsia kauppanimellä BIGBEADS SX-1. Hydroksimetyylihart-sin valmistus kuvataan Bodanskyn ym. artikkelissa, Cheminä. (Lontoo) 38, 1597 (1966). BHA-hartsin ovat kuvanneet Piettä ja Marshall, Chem. Comm., 650 (1970) ja se on kaupallisesti saatavilla (Peninsula Laboratories, Inc., Bel-20 mont, California).

Alkukiinnityksen jälkeen alfa-aminon suoj aryhmä voidaan poistaa valikoimalla happamia reagensseja, mukaan lukien tri fluorietikkahapon (TFA) tai suolahapon (HC1) liuokset orgaanisissa liuottimissa. huoneenlämmössä, Alfa- j 25 aminon suojaryhmäh poistamisen jälkeen jäljellä olevat suojatut aminohapot voidaan liittää: vaiheittain halutussa järjestyksessä. Kukin suojattu aminohappo voidaan saattaa yleensä reagoimaan noin kolmihkertaisena ylimääränä käyttämällä soveliasta karboksyyliryjmnäaktiyaattoria, kuten .30: disykloheksyylikarbodl-iniidi (DCC) tai di-isopropyylikar- bodi-imidi (DXC) liuoksessa, esimerkiksi metyleenlklo-ridissä (CH2CI2) tai dimetyyliformamidissa (DMF) ja näiden seoksissa.

Sen jälkeen kun haluttu aminohapposekvenssi on 35 saatu valmiiksi, haluttu peptidi voidaan lohkaista irti 13 bentshydryyiiamilriihar.tsikantaj asta käsittelemällä sellaisella reagenssilla kuten fluorivety (HP), joka ei pelkästään lohkaise peptidiä irti hartsista vaan lohkaisee irti yleisimmin käytetyt sivuketjun: suoja ryhmät. Kun käytetään 5 kloorimetyylihartsia tai hydxoksimetyylihartsia, HF-käsittely johtaa vapaan peptidihapon muodostumiseen. Peptidi-alkyyliamidejä ja -estereitä voidaan kuitenkin valmistaa näistä peptidihartseista löhkäiSemal la. soveliaalla alkyy-liamiinilla, dialkyyliamiinilla tai diaminoalkäahilla tai 10 transesteröimällä alkoholilla korkeissa pH-arvoissa.

Edellä kuvattu kiinteän faasin menetelmä on sinänsä tunnettu ja sen ovat kuvanneet Stewart ja Young, Solid Phase Peptide Synthesis: toinen laitos {Pierce Chemical

Co., Rockford, IL 1084).

15 Bodansky ym. esittävät teoksessa Peptide Synthesis, toinen laitos, John Wiley & Sons, New York, N.Y. 197 6, joitakin hyvin tunnettuja liuosmenetelmiä, joita voidaan käyttää syntetoitaessa tämän keksinnön peptidiosat.

Uskotaan, että peptidit on edullisempi syntetisoida 2.0, liuosvaihemenetelmällä, joka sisältää ainakin kahden pep- j tidifragmentin kondensointlreaktion. ) Tämä menetelmä käsittää sen, että peptidifragmentti X-Ai-Y kondensoidaan peptidifragmentin U-V-W kanssa, jolloin kaikki aminohapposivuketjut paitsi Ai: n sivuketjut 25 ovat neutraaleja tai suojattuja, ja jossa X on suo j. jossa suoj . on N-pään suojaryhmä: Y on A2-Q, Ala-Ag-Q, Aa-Ala-Q, Äla~Ä2“Ala-Q, A^-Ala-Trp-Q, Äla-Az-Äla-Trp-Q, Ala-Q tai -Q, jossa kun Y on Q, U on J-A2-Ala-Trp tai J-Ala~Ä2-Ala-Trp.

Kun Y on Äla-Q, ϋ on J-A2-Ala-Trp. Kun Y on A2-Q tai Ala-30; Ä2-Q, U on J-Ala—Trp. Kun Y on A2-Ala-Q tai Älä-Ä2-A3-Q, U

on J-Trp. Kun Y on Äs-Ala-Trp-Q tai Ala-Ä2-Ala-Trp-Q, U on J. V on As tai Z. Kun V on As, W on 2. Kun V on Z, W ei j ole läsnä. Ai, Ä2, As ja Z ovat kuten tässä On määritelty. | Q on peptidifragmentin karboksipää ja se on -0R3 tai | 35 -M, jossa M on osa jonka typpeä: sisältävä nukleofiili ky- | .1 ! 14 kenee syrjäyttämään, ja R3 on H, alkyyliryhmä joka sisältää yksi - noin 10 hiiliatomia, aryyliryhmä jossa on 6 ~ noin 12 hiiliatomia, tai aryyXialkyyliryhmä jossa on 7 - noin 12 hiiliatomia, J edustaa osoitetun fragmentin amiinipäätä 5 ja on H tai suojaryhmä, joka ei estä kytkentäreaktiota, esimerkiksi bentsyyli.

Tämän jälkeen suojaryhmät poistetaan. Vaihtoehtoisesti näin muodostunutta suojattua peptidiä voidaan käyttää jatkokondensaatioissa isomman peptidin valmistamiselle) si.

Tämä edullinen menetelmä kuvataan täydellisemmin US-patenttihakemuksessa nro 558 121, jonka John C. Hubbs ja S.W. Parker ovat panneet vireille 24, heinäkuuta 1990 otsikolla "Process for Synthesizing Peptides", joka liite-1,5: tään tähän viitteenä ja julkaistaan mmerolla WO92Q1709.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut peptidit voidaan antaa suun kautta, parenteraalisesti {lihaksensisäinen (i.m.), vatsaontelon sisäinen (i.p.), laskimonsisäinen (i.v.) tai ihonalainen (s.c.) injektio), 20 nenän kautta, vaginan kautta, peräsuolen kautta tai kielen alle, samoin kuin keuhkojen sisäisenä inhalaationa ja ne voidaan formuloida annosmuodoiksi, jotka soveltuvat kullekin antoreitille. Parenteraalinen antaminen on edullista.

25 Kiinteisiin annosmuotoihin suun kautta antamista varten kuuluvat kapselit, tabletit, pillerit, jauheet ja rakeet. Sellaisissa kiinteissä annosmuodoissa vaikuttava aine sekoitetaan ainakin yhden inertin kantajan kanssa, kuten sakkaroosi, laktoosi tai tärkkelys. Sellaiset annos-30 muodot voivat myös sisältää, normaalin käytännön mukaisesti, muitakin lisäaineita kuin inerttejä laimennusaineita, esim. liukuaineita kuten magnesiumstearaatti. Kapseleiden, tablettien ja pillereiden tapauksessa annosmuodot voivat myös sisältää puskuroivia aineita. Tabletit ja pillerit 35 voidaan lisäksi valmistaa enteropäällysteillä.

15

Nestemäisiin annosmuotoihin suun kautta tapahtuvaa antamista varten kuuluvat emulsiot, liuokset, suspensiot, siirapit, eliksiirit jotka sisältävät sinänsä tunnettuja inerttejä laimennusaineita, kuten vettä. Sellaisten inert-5 tien laimennusaineiden lisäksi koostumuksiin voi lisäksi sisältyä apuaineita, kuten kostutusaineita, emulgointi- ja suspensointiaineita ja makeutus-, maku- ja hajuaineita.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettaviin valmisteisiin parenteraalista antamista varten kuulo luvat steriilit vesipohjaiset tai ei-vesipohjäiset liuokset, suspensiot tai emulsiot. Esimerkkejä ei-vesipohjäisistä liuottimista tai vehikkeleistä ovat propyleeni-glykoli, polyetyleeniglykoli, kasviöljyt, kuten oliiviöljy ja maissiöljy, liivate ja injektoitavissa olevat orgaani-'

15 set esterit kuten etyyliolaaatti. Sellaiset annosmuodot voivat myös sisältää apuaineita kuten säilytys-, kostutus-, emulgointi- ja dispergointiaineita. Ne voidaan steriloida esimerkiksi suodattamalla bakteereja pidättävän suodattimen läpi, sisällyttämällä koostumuksiin steriloivia ainei-20 ta, säteriyttämällä koostumuksia tai kuumentamalla koostumuksia. Ne voidaan myös valmistaa steriiliin vesiliuokseen., tai johonkin muuhun steriiliin injektoitavissa olevaan liuokseen välittömästi ennen, käyttöä. I

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat uudet j 25 koostumukset ovat myös hyödyllisinä annettuna yhdessä kasvuhormonia vapauttavan hormonin kanssa (se on: luonnossa Ilmenevä kasvuhormonia vapauttava hormoni, sen analogit ja funktionaaliset ekvivalentit) samoin kuin yhdistelmänä muiden sellaisten yhdisteiden kanssa, jotka edistävät kas-30 vuhormonin vapautumista, esimerkiksi kasvuhormonia vapauttavat peptidit (katso US-patentti nro 4 880 778, johon viitataan täten viitteenä), esimerkiksi asetyylikoliinl-esteraasin inhibiittorit, β-salpaajat, a-2-salpaajat jne.

Sellaiset yhdistelmät edustavat erityisen edullista keinoa 35 antaa tämän keksinnön mukaisia kasvuhormonia vapauttavia 16 peptidejä, koska yhdistelmä edistää paljon suuremman kasvuhormonimäärän vapautumista kuin yhdistelmän kunkin komponentin aiheuttaman vasteen summan perusteella ennustetaan, se on: yhdistelmä tarjoaa synergistisen responssin 5 yksilöllisen komponentin Suhteen. Edellä siteeratussa patentissa kuvataan lisää yksityiskohtia kasvuhormonia vapauttavien peptidien yhdistelmien antamisesta. Sellaiset synergistiset yhdisteet ovat edullisesti yhdisteitä, jotka toimivat agonistina kasvuhormonia vapauttavan hormonin 10 reseptorissa tai inhiboivat somatostatiinin vaikutusta. Synergismi voi olla binääristä, se on: tämä yhdiste ja yksi synergistisistä yhdisteistä, tai sisältää useamman kuin yhden synergistisen yhdisteen.

Yhdistelmät., jotka aiheuttavat tehokkaasti kasvu- 1.5 hormonitason vapautumisen ja nousun sellaisen eläimen veressä kuten ihmiset, sisältävät tehokkaan määrän polypeptide jä, jotka on valittu tässä patenttivaatimuksiin kuuluvista polypeptideistä ja ainakin yhdestä seuraavista ryhmistä: ryhmän 1 polypeptidit, tai yhdiste joka edistää 20 kasvuhormonien vapautumista esim., ryhmän 2 polypeptidit, jossa ryhmän 1 polypeptidit voivat olla mitä tahansa luonnossa ilmeneviä kasvuhormonia vapauttavia 'hormoneja ja niiden funktionaalisia ekvivalentteja, missä mainitut polypeptidit vaikuttavat nisäkkäiden ja muiden selkärankais-25 ten ja äyriäisten kasvuhormonia vapauttavan hormonin reseptoriin, ryhmän 2 polypeptidit voivat olla mitä tahansa po-lypeptidejä, joilla on rakenne:

Tyr-DArg-Phe-NHb, 30 Tyr-DAla-Phe-NHs,

Tyr-DArg (NO;?) -Phe-NH?,

Tyr-DMet (O) -Phe-NHa,

Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2,

Tyr-DÄrg-Phe-Gly-NHs, 35 Tyr-DThr-Phe-Gly-NHs, 17

Phe-DArg-Phe-Gly-NH2,

Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,

Tyr-DAla-Gly-Phe-NH2,

Tyr-DArg-Gly-Trp-NH2, 5 Tyr“DArg(N02)~phe-Gly-NH2,

Tyr-DMet (G)-Phe-Gly-NH2, (NMe) Tyr-DArg-Phe-Sar-NPh,

Tyr-DArg-Phe-Gly-öli,

Tyr-DArg-Gly-(NMe)Phe-NH2, 10 Tyr-DArg-Phe-Sar-oli,

Tyr-DAla-Phe-Sar-oli,

Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH2,

Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(0}-oli,

Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Met(0}-oil, 15 Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly~NH2,

Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH2, Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2,

Tyr-DAla-Phe-Gly-oli,

Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-oli, 20 Tyr-DArg-Phe-Sar-NHs,

Tyr-DAla-Phe-Sar-NHj,

Tyr-DAla-Gly-(NMe)Ph.e-NH2, Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NHa,

Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NHz (syklinen disulfidi), 25 Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (vapaa ditioli),

Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 {syklinen disulfidi), Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NHa (vapaa ditioli), Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NHa, Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2, 30 Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NMa,

Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NHa, Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2, Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NHa, Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2, 35 Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NHs, 18

Tyr-DÄrg-Bhe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NHj, Tyr-DArg-Bhe-Gly-Tyr- Pro-Ser-NH2, ja mainittujen ryhmän 2 polypeptidien orgaaniset tai epäorgaaniset additiosuolat, jossa mainittu yhdistelmä 5 annetaan sellaisena suhteena että mainittu yhdistelmä: aiheuttaa tehokkaasti kasvuhormonin synergistisen vapautumisen ja kohoamisen sellaisen eläimen veressä.

Muut yhdisteet, jotka edistävät kasvuhormonien vapautumista, ovat ammattimiehen tiedossa ja niihin kuuluvat 10 asetyylikoliiniesteraasin inhibiittorit, (3-salpaajat ja ot“ -a gon x $t 11.

Edullisesti käytetään luonnossa ilmeneviä kasvuhormonia vapauttavia hormoneja ja näiden funktioekvi-valentteja yhdessä yhdisteiden kanssa, jotka edistävät 15 kasvuhormonien vapauttamista, yhdessä näiden peptidien kanssa. Esimerkiksi ryhmän 1 ja ryhmän 2 yhdisteitä näiden peptidien kanssa, toinen esimerkki on ryhmän 1 yhdisteet tai β-salpaajat näiden peptidien kanssa.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavan polypep-20 tidin määrä tai polypeptidien yhdistelmän määrä, joka annetaan, vaihtel.ee riippuen monista tekijöistä, esim. tietty hoidettava eläin, sen ikä ja sukupuoli, haluttu terapeuttinen vaikutus, antoreitti ja mitä polypeptidiä tai polypeptidien yhdistelmää käytetään. Kaikissa tapauk-25 sissa käytetään kuitenkin annosta, joka tehokkaasti (terapeuttisesti tehokas määrä) edistää kasvuhormonitason vapautumista ja nousua vastaanottavan eläimen veressä. Tavallisesti tämä annostaso on välillä noin 0,1 pg - 10 mg polypeptidin kokonaismääränä painokiloa kohti. Ammattimies 30 voi määrittää helposti kokeellisesti edullisen määrän tämän paljastuksen perusteella.

Esimerkiksi annostavan ollessa i.v, ihmisissä edullinen annostaso on välillä noin 0,1 pg - 10 pg poly— peptidin kokonaismääränä painokiloa kohti, edullisemmin 35 0,5 pg - 5 pg polypeptidin kokonaismääränä painokiloa koh- 19 ti,: vielä edullisemmin noin 0,7 g g - noin 3,0 pg painokiloa: kohti. Kun käytetään kasvuhormonia vapauttavien peptidien yhdistelmiä, voidaan käyttää alhaisempia: määriä tässä: kuvattua peptidiä, 5 Kun esimerkiksi yhdistetään tässä kuvattu peptidi esimerkiksi US-patentin nro 4 880 788 ryhmän I synergis-tisän yhdisteen kanssa, kuten G:HRB, edullinen alue on noin 0,1 pg - noin 5 pg tässä kuvattua yhdistettä painokiloa kohti ja noin 0,5 pg - noin 15,0 pg synergististä yhdis-10 tettä (esim, GHRH) ja edullisemmin noin 0,1 pg - noin 3 pg tätä yhdistettä noin 1,0 pg:n - noin 3 pg:n kanssa synergististä yhdistettä painokiloa kohti.

Kun antotapa on suun kautta antaminen, tarvitaan tyypillisesti suurempia: määriä. Esimerkiksi ihmisillä suun 15 kautta antamista varten anrtostaso on tyypillisesti noin 30 pg - noin 1 200 pg polypeptidiä painokiloa kohti, edullisemmin noin 70 pg - noin 600 pg polypeptidiä painokiloa kohti, vielä edullisemmin noin 200 pg - noin 600 pg poly-peptidin kokonaismääränä painokiloa kohti. Lehmät ja siat 20 tarvitsevat hoin saman annostason kuin, ihmiset, kun taas rotat tarvitsevat tyypillisesti korkeampia annostasoja. Tarkka taso voidaan päätellä helposti kokeellisesti tämän paljastuksen nojalla:.

Kuten edellä on sanottu, yleensä kasvuhormonia va-25 pauttavien peptidien yhdistelmien antaminen mahdollistaa: sen, että käytetään: alempia annoksia yksilöllisiä kasvuhormonia vapauttavia yhdisteitä suhteessa niihin annos-tasoihin, joita vaadittaisiin yksittäisten kasvuhormonia vapauttavien yhdisteiden tapauksessa, jotta saataisiin 30 aikaan samanlainen vaste, mikä johtuu yhdistelmän synergia ti sestä vaikutuksesta.

Tämän keksinnön suojapiiriin kuuluvat myös koostumukset, jotka sisältävät vaikuttavana aineenaan edellä kuvattujen polypeptidien ja niiden yhdistelmien orgaanisia 35 ja epäorgaanisia additiosuoloja, mahdollisesti liittyneenä 20 kantajaan, Xalmeimusaineeseen, ainetta hitaasti vapauttavaan matriisiin tai päällysteeseen.

Kasvuhormonia vapauttavien yhdisteiden tai näiden yhdistelmien, joiden ajatellaan kuuluvan tämän keksinnön 5 suojapiiriin, orgaanisiin tai epäorgaanisiin additiosuo-loihin kuuluvat sellaisten orgaanisten osien suolat kuten asetaatti, trlfluoriasetaatti, oksalaatti, valeraatti, oleaatti, lauraatti, bentsoaatti, laktaatti, tösylaatti, sxtraatti, maleaatti, fumaraatti, sukkinaatti, tartaraat-10 ti, naftalaatti ja vastaavat, ja sellaisten epäorgaanisten osien suolat kuten ryhmän I (se on: alkalimetallisuolat), ryhmän II (se on: maa-'alkalimetallisuolat) , ammonium- ja protamiinisuolat, sinkki, rauta ja vastaavat sellaisten vastaionien kanssa kuten kloridi, bromidi, sulfaatti, fos-15 faatti ja vastaavat, samoin kuin orgaanisten osien suolat joihin edellä viitataan.

Farmaseuttisesti soveliaat suolat ovat edullisia kun ajatellaan antamista ihmiskohteisiin. Sellaisiin suoloihin kuuluvat myrkyttömän alkalimetallin suolat, maa-20 alkalimetallisuolat ja ammoniumsuolat., joita käytetään yleisesti farmaseuttisessa teollisuudessa, mukaan lukien natrium-, kalium-, litium-, kalsium-, magnesium-, barium-, ammonium- ja protamiinisuolat, jotka valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla, lermi sisältää myös myrkyttömät happa-25 mat additiosuolat, jot.ka valmistetaan yleensä niin, että tämän keksinnön mukaiset yhdisteet saatetaan reagoimaan soveliaan orgaanisen tai epäorgaanisen hapon kanssa. Edustaviin suoloihin kuuluvat hydrokloridi, hydrobromldi, sulfaatti, bisulfaatti:, asetaatti, oksalaatti, valeraatti, 30 oleaatti, lauraatti, boraatti/ bentsoaatti, laktaatti, fosfaatti, tösylaatti, siträatti, maleaatti* fumaraatti, sukkinaatti, tartaraatti, naftylaatti ja vastaavat.

Keksintöä havainnollistavat lisäksi seuraavat, ei- I

rajoittavat esimerkit, 35 21

Esiraarfcfci 1

Kasvuhormonia vapauttavien; peptidien synteesi

Parametyylibentshydryyliamiinihydra kloridi (pMe-BHÄ.HC1) -hartsi sijoitetaan reaktioastiaan kaupallisesti 5 saatavilla olevassa automatisoidussa peptidisynteti saatto-rissa. Hartsi substituoidaan vapaalla amiinilla aina sub-stituutioasteeseen S mmöl/g. yhdisteet valmistetaan liittämällä yhteen yksittäisiä aminohappoja peptidisekvenssin karboksipäästä alkaen* siten että käytetään soveliasta 10 aktivoivaa ainetta, kuten N,N'-dxsykloheksyylikarbodi-imi-di (DCC). Yksittäisten aminohappojen alfa-amiini suojataan es imerkiks i t-but yylioksi karbohyyli johdannaisena (t-Boc) ja reaktiivisen puolen ketjun funktionaaliset ryhmät suojataan kuten taulukossa 1 pääpiirteittäin esitetään.

15 Taulukko 1

Sivuketjun suoj arybmät, jotka ovat soveliaita kiinteän faasin peptidisynteesissä Ärginiini: Ng-tosyyli Äspäragiinifrappo: Q-bentsyyli 20 Kysteiini: S-para-itietyylibentsyyli

Glutamiinihappo; O-bentsyyli

Histidiini: N^-tosyyli

LySiini:: NB-2/ 4-diklöoribentsyylioksikarbonyyli

Metioniini: 5~sulfoksidi 25 Seriini: O-bentsyyli

Treeniin i: O-bentsyyli T r yp t d fä ani: Nia-fo rmy y 1 i

Tyro s i i n i: 0-2,6-dikloor ib en t s yyli

Ennen ensimmäisen aminohapon inkorporaatiota hart-30 siä ravistellaan kolme kertaa (noin yksi minuutti kerrallaan) diklödrimetaanin kanssa {CH2CI2, noin 10 ml/hartsi-gramma ), neutraloidaan ravistelemalla kolmasti {noin kaksi minuuttia kerrallaan) dikloorimetaanissa olevan N/N-di-isopropyylietyyliamiinin (DIEA) kanssa {10:90, noin 10 35 ml/härtsigrairana) ja ravistellaan kolmasti {noin yksi 22 minuutti kerrallaan) dikloorimetäänin kanssa (noin 10 ml/hartsigramma)„ Ensimmäinen aminohappo ja kukin seu-raavista aminohapoista liitetään hartsiin käyttäen esimuo-dostettua symmetristä anhydridiä, niin että käytetään so-5 veliaalla tavalla. suojatun aminohapon hartsin reak tio kapasiteebin noin 6,0-kertaista kokonaismäärää ja DIG:n hartsin sitomiskapasiteetin noin 2,0-kertaista kokonaismäärää soveliaassa määrässä dikloorimetaania. Sellaisille aminohapoille, jotka ovat huonoliuokoisia dikloorimetaa-10 nissa, lisätään N,N-dimetyyliformamidia (DBF) homogeenisen liuoksen aikaansaamiseksi. Yleensä symmetrinen anhydridi valmistetaan jopa 30 minuuttia ennen kuin se pannaan reak-tioastiaan huoneenlämpötilassa tai sitä alemmassa lämpötilassa. Symmetrisen anhydridin valmistuksessa muodostuva 15 disykloheksyyliurea poistetaan suodattamalla liuos omalla painollaan reaktioastiaan. Aminohapon hartsiin liittämisen edistymistä seurataan yleensä väritestillä käyttämällä sellaista reagenssia kuten ninhydriini (joka reagoi primääristen ja sekundääristen amiinien kanssa). Sen jälkeen 20 kun suojattu aminohappo on liitetty täydellisesti hartsiin (> 99 %), alfa-aminon suojaryhmä poistetaan käsittelemällä happamalla reagenssilla (happamilla reagensseilla). Yleisesti käytetty reagenssi koostuu tirif luorietikkahapon (TFA) liuoksesta dikloorimetaanissa (33:66).

25 Sen jälkeen kun haluttu aminohapposekvenssi on saa tu valmiiksi, haluttu peptidi voidaan lohkaista irti hart-sikantajasta käsittelemällä sellaisella reagenssilla kuten fluorivety (HF), joka ei pelkästään lohkaise peptidiä hartsista vaan lohkaisee irti useimmin käytetyt sivuketjun 30 suojaryhmät. Kun käytetään BHä- tai p-Me-BHA-hartsia, HF-käsittely tuottaa suoraan vapaat peptidi amidit. Kun käytetään aminohappo-Merrifield-hartsia,: vapaat peptidi- alkyyiiamidit lohkaistaan irti käsittelemällä soveliaalla: amiinilla (tässä tapauksessa Boc-N—FMOG-Lys:n käyttö teki-35 si mahdolliseksi FMGC-ryhmän samanaikaisen poistamisen).

23 Täydellinen menetelmä,: jolla kukin yksittäinen aminohappotähde voidaan Inkorporoida hartsiin, esitetään pääpiirteittäin taulukossa 2.

Taulukko 2 5 Menetelmä, jolla yksittäiset aminohapot voidaan inkorporoida hartsiin Reagenssi Ravistelut Äika/Ravistelu I. Dikloorimetääni 3 1 min 10 2. T FA- d i k 1 oo r ime t a a n i .1 2 min (33;66} 3. TFE-dikloorimetaani 1 20 min (33:66) 4. Dikloorimetaani 3 1 min 15 5. DIEÄ, DM F 2 2 min (10:90) 6. Dikldörimetaani 3 1 min 7. B o c -aminohappo/DIC 1 15-120 min* i 8. Dikloorimetaani 3: 1 min 20 10. Tärkkäile llittämis- \ „ j reaktion edistymistä j II. Toista vaiheet 1-12 | kullekin yksittäiselle j aminohapolle j 25___

Liittämisaika riippuu yksittäisestä aminohaposta.

Liittymisastetta voidaan yleensä seurata väritestillä.

Jos liittyminen on epätäydellistä, sama aminohappo voidaan liittää uudelleen -eri menetelmällä, esim, HOBt-aktiivisel- | 30 la esterillä. Jos liittyminen on mennyt loppuun, voidaan j sitten liittää seuraava aminohappo. j Tätä menetelmää käyttäen valmistettiin yhdisteet, j jotka on kuvattu taulukoissa 3, 4, 5 ja 6. j ] | j -i * i 24

Esimerkki 2 GH:n vapautuminen rotissa in vivo

Hankittiin kypsymättömiä: Sprague-Dawley-naarasrot-tia (Charles River Laboratories, Wilmington, MÄ}. Säapumi-5 sen jälkeen niitä pidettiin 25 °C:n lämpötilassa 14:10 tunnin valo:pimeys-jaksolla. Vettä ja purina-rotanrehua oli saatavilla mielinmäärln. Poikaset pidettiin emojensa luona 21 päivän vanhoiksi.

Kaksikymmentäkuusi päivää vanhoja rottia, kuusi 10 rottaa per käsittelyryhmä, nukutettiin vatsaontelon sisäisesti pentobarbitaalilla (50 mg/kg) 20 minuuttia ennen i.v.-käsittelyä peptidillä. Normaali suolaliuos, joka oli 0,1-prosenttinen; liivatteen suhteen, oli vehikkeli peptidien laskimonsisäisille (i.v,) injektioille. Nukutetut 15 rotat,: jotka painoivat 55 - 65 grammaa/ injektoitiin i.v. taulukossa 3 osoitetulla määrällä kasvuhormonia vapauttavia yhdisteitä. Injektio tehtiin 0,1 ml:n liuoksena kau-lalaskimoon.

Kaikki eläimet uhrattiin giljotiinilla 10 minuuttia 20 viimeisen testi-injektion jälkeen (katso taulukko 3). Pään irrottamisen jälkeen kerättiin vartalosta tulevaa verta veren GH-tasojen määrittämiseksi. Sen jälkeen kun veren oli annettu hyytyä, se sentrifugoitiin ja seerumi erotettiin hyytymästä. Seerumi pidettiin pakastettuna siihen 25 päivään saakka, jolloin kerättiin näyte radioimmunologiseen määritykseen (RIA) kasvuhormonitasojen määritystä varten seuraavan menetelmän mukaisesti, jonka kehitti National Institute of Arthritis, Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIÄDDK).

30 Reagenssit lisätään yleensä RIA-analyysiputkiin yhdellä istumalla: jääkaappilämpötilassa (+4 °€) seuraavas-sa j ärj estyksessä: a) puskuri, b) "kylmä" (se on: ei-radioaktkivinen) standardi 35 tai tuntematon analysoitava seeruminäyte, 25 p) radiojodeerattu ka s vuho rmon iantigeeni, ja d) kasvuhormonia vastaan suunnattu antiseerumi.

Reagenssin lisäys suoritetaan yleensä nils, että saadaan aikaan lopullinen Rlä-putken laimennos noin 5 1:30: 000 (antiseerumin suhde nesteen kokonaistilavuuteen, ti1avuus/tilavuus)

Sekoitettuja reagensseja inkuboidaan sitten tyypillisesti huoneenlämpötilassa (noin 25 °C) noin 24 tuntia ennen toisen vasta-aineen lisäystä (esim. apinan gammag.lo-10 buliinia vastaan suunnattu vuohen tai kanin antiseerumi) joka sitoutuu kasvuhormonia vastaan suunnattuun, komplek-soituneeseen antiseerumiin ja aiheuttaa sen saastumisen. RIÄ-putkien saostuneet sisällöt: analysoidaan sitten silmälläpitäen laskentatapahtumien lukumääriä tietyssä aika-15 jaksossa gammatuikelaskurissa. Valmistetaan standärdikäyrä piirtämällä kuvaajaan radioaktiivisten laskentatapahtumien lukumäärä kasvuhoi^onl (GH) -tason funktiona. Tuntemattomien GH-tasot määritetään sitten standardikäyrän referenssinä .

20 Seerumin GH mitattiin RIÄrlla reagensseilla, jotka saatiin National Hormone and Pituitary Program -ohjelmalta.

Taulukossa 3 olevat seerumitasot mitataan yksikössä ng/ml lähtien rotan GH:n standardiarvosta 0,61 kansainvä-25 lista yksifcköä/mg (lö/mg). Tulokset mitataan keskiarvona +/- keskiarvon keskivirhe (SEM.) . Tilastollinen analyysi suoritettiin Studentin t-testiliä- Taulukossa 3 esitetyt tulokset ovat keskiarvoja kuudella rotalla tehdyistä tutkimuksista .

30 i 26

Taulukko 3

In vivo GH-vapahtuminen, jonka kasvuhormonia vapauttavat yhdisteet saivat aikaan pentobarbitaatilla nukutetuissa 5 rotissa.

(Eläimet uhrattiin ID minuuttia viimeisen injektion jälkeen)

Sarake A Kokonais- Kontrolli- Vapautunut GH

10 GH:ta väpaut- annos3 seerumi Seerumin GH ng/ml tava peptidi (jjg/iv) GH ng/ml + SEM (N-6) ± SEM (N=6)

Ala-His-DiSNal- 0,1 337 + 51 610 ± 90

Aia-Trp-DPhe-Lys-NH2b 0,3 337 + 51 1140 + 187 1.0 337+51 2909+257 3.0 337 + 51 3686 + 436

His-DTrp-Ala-Trp·' 0,1 131 + 43 540 + 148 DPhe»tys-HH2b 0,3 131+43 751+ 88 1,0' 131 + 43 1790 + 252 7.0 131 + 43 2481 + 209 DAia-D/3Nal-Ala- Ö^I 337" i 51~ 1381 + 222 ”

Trp-DPhe-Lys-NH, 0,3 337 + 51 2831 ± 304 10 337 + 51 2886 + 179 30 337+51 3678+287 15 DAla-DTrp-Ala-Trp- DPhe*Lys-NH2 0,1 111 ± 24 526 ± 86 0,3 111 + 24 1608 + 204 1.0 111 ± 24 2820 + 346 3.0 111 + 24 2437 + 214

Ala-Hi s - DjÖHa 1 - Ala -

Trp-DPhe-hySrHH2b 0,3 160 + 51 1418 + 302 lr0 160 ± 51 2201 + 269 ; 27

His-DTrp-Ala-Trp DPhe-Lys-NH^ 0,1 140 + 10 200 + 40 0,3 140 + 10 505 + 50 1.0 140 ± 10 1640 ± 215

Ala-His-D/JNal-Ala -

Trp-DPhe-Lys-HH2b 0,3 228 + 23 1746 ±318 1.0 228 ± 23 2610 ± 176

Gly- D/3Nal * Ala-Trp- DPha-Lys-NH, Q3 160 ± 36 1237 ± 249 1.0 160 ± 36 2325 ± 46 3.0 160 ± 36 2694 ± 370 10,0 160 ± 36 3454 ± 159

Ala - His - D0ilä 1 - Ala -

Trp - DPhe - Ly s - HH2b 0,1 160 ± 36 822 ± 243 0r3 160 ± 36 1594 + 292 1.0 160 ± 36 2180 ± 284

Gly -D#Nal-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,3 215 ± 33 1301 + 260 1.0 215 ± 33 2211 ± 146 3.0 215 + 33 2364 ± 365

Sar-D^Nal-Ala-Trp- DPhe-Lys-NHj 0,3 262 ± S3* 908 ± 264* 1.0 262 ± 53* 1681 ± 262* 3.0 262 ± 53 2600 ± 316* 5 ______________

Gly > Dj9Na 1 - Ala - Trp * DPhe-Lys-NH2 0,3 135 ± 32 1387 ± 352 1.0 135 ± 32 1958 ± 353 3.0 135 ± 32 2605 ± 97 /JAia - D/SNal * Ala - Trp - DPhe*Lys-NH? 0f 3 135 ± 32 1937 + 343 1.0 135 ± 32 3603 + 645 3.0 1.35 ± 32 4000 ± 500

Ava* ” - D/?Na 1 - Al a - ~~ '

Trp ·* DPhe - Lvs-* 0,3 135 ± 32 2469 ± 185 ifQ 135 ± 32 4034 ± 680 3f0 135 ± 32 3142 ± 392 28 D -Äl ä -0$ΝAI «Ala- Trp - DFhe - ——— nhch2ch2ch2ck2ch2nb2 0,3 m + 24 180 ± 37 1.0 111 + 24 636 + 133 3,0 111 + 24 1490 + 179 10,0 1U + 24 2248 + 70 D-Ala-DTrp-Ala-

Trp-öFhe - Ly s - ΝΓΗ 2 0,1 111 + 24 526 + 86 0,1 111 ± 24 1608 + 204 1.0 111 + 24 .2820 + 346 3.0 llli 24 2437 + 214

Aib-DjSNal-Ala-Trp- DPhe-tys-NH2 0,1 208 + 148* 26c + 58 0,3 208 ± 148* 331 + 108* 1.0 208 + 148* 368 + 133* 3.0 208 ± 148~ 1090 + 176* D-Ala - DilSNal - Ala -Trp - DPhe -

Lys( IPr) “NH2 0,1 215 + 49 608 + 115 0,3 215 + 49 1753 ± 419 1.0 215 + 49 1817 + 297 3.0 215 + 49 2336 + 196 *:) Liuotettu DMSChhon, 5 **) Liuotettu aminovaleriaanahappoon (Äva) a) Näin merkityt annokset annettiin 29 päivää van" hoiIle naaraspuolisille rotille b) Kontrolli - GHRP:t 10 Taulukossa 3 keksinnön mukaisia yhdisteitä ver rataan yhdisteisiin, jotka eivät ole tämän yleisen kaaväh mukaisia, ja niiden osoitetaan edistävän ylivertaisesti kasvuhormonitasojen vapautumista ja nousua sellaisten rot- j tien veressä, joille sellaisia yhdisteitä on annettu.

15 Edullisten yhdisteiden yllättävät kasvuhormonia: vapauttavat aktiivisuudet ovat varsin arvokkaita, koska lyhyempi-ketjuisen, molekyylipäinoltaan pienemmän polypeptidin, jossa on suhteellinen stabiili ja halpa aminohappo D-ala- 29 niini aminopäässä ja pentaanidiäMiini Lys:n paikalla C-päässä, pitäisi osoittautua olevan kustannuksiltaan alhainen keino lisätä kasvuhormonitasoj a eläimissä ja ihmisissä .

5 Esimerkki 3 - GH:n vapautuminen rotissa in vivo suun kautta tapahtuvan antamisen jälkeen

Esimerkin 2 menettely toistettiin, paitsi että rotille annettiin ilmaistut yhdisteannokset mahansisäisillä putkilla, Ennetut yhdisteet, käytetyt annostasot ja tulok-10 set esitetään taulukossa 4.

Taulukko 4

In vivo GH-vapautuminen, jota kasvuhormonia vapauttavat 15 yhdisteet edistivät pentoharbitaatilla nukutetuissa rotissa:, {Rotat uhrattu eri aikoina peptidin mahansisäisen antamisen jälkeen) 20 Sarake E Kokonais- Seerumin Seerumin GH:ta vapaut- annos GH ng/ml GH ng/ml tava peptidi (mg/kg) ± SEH (N=6) ± SEM (N=6) vi kap i s t e e s s ä {15' ) 25 {20’) (30')

Ala - HI s - D/3Na l*Ala-

Trp-DPha-Lys-HH?a 10 247 ± 32 786 + 244 30 247 + 32 1914 + 294 DÄla-D/?Mal*Ala- trpOPhe-Lys-lTHy 10" 247 * 32 116 + 298 30 247 £ 32 2038*444

Ava-DjSNal-Ala’

Trp-DPhe-Lys-NH2 30 322 +145* 2135 ± 586* 30

Cly-DjSHal-Ala-

Tjrp-Ofh€-Lys-NH2 30 247 + 32 1072 + 137

Ms-DTrp-Ala-

Irp-DPhe-Lys-NHx3 30 247 + 32 1810 +437

Ala-His-tySNal 1 Ala -

Trp-DPhe-Lys-NH2a 10 196 + 49(15') 1421+343 147 ± 30(207 1605 + 621 (201;) 133 + 18(30') 752 + 81 (30') DAla-DjUNal -Ala -

Trp-DPhe-Lys-NH2 10 196 + 49(15') 706 + 133 (15') 147 + 30(20') 1062 + 254 (20')

Gly-DtfNal-Ala-

Trp-DPhe- Lys-NH5 10 196 + 49(15') 957 + 188 (15') 147 + 30(20') 1685+524(20')

His-DTrp-Ala-

Trp-DPhe-Lys3 10 196+49(15') 1131 ± 189 (15') 147+30(20') 686+149(20')

Trp - DPhe - Lys -NH-j 10 194 + 49(15') 1202 ± 429 (15') 1 147+30(20') 1217+239(20’)

Ava-D4NaI-Ala-

Trp-DPhe-Lys-NHU 10 195+49(15') 1407+204 (15’) 147+30(20') 1251 ± 351 (20')

Suspensio (kevyt1 tai raskas2) etikkahappo lisätty 2 a) Kontrollipeptidit 5 GH:ta vapauttava aktiivisuus säilyy tämän keksinnön mukaisilla yhdisteillä hyödyllisillä tasoilla sen jälkeen kun ne on annettu rotille suun kautta. Tämä on arvokasta, koska tämä antomenateimä lisää peptidien terapeuttista 1Ö hyödyllisyyttä.

Esimerkki 4 - GH:n vapautuminen rotissa in vivo

Esimerkin 2 menettely toistettiin. Annetut yhdisteet, käytetyt annostasot ja tulokset esitetään taulukoissa 5 ja 6.

15 31

Taulukko 5

In vivo GH-vapautuminen,. jota kasvuhormonia vapauttavat synteettiset: peptidit edistivät pentobarbitaatilla nukute-5 tuissa rotissa.

(Eläimet uhrattiin 10 minuuttia viimeisen injektion jälkeen)

Kontrolli-

Sarake A Kokonais- seerumin Vapautunut GH

10 GH:ta vapaut- annos GH ng/ml Seerumin GH ng/ml tava peptidi (pg/iv) ± SEM (N=6) + SEM (N=6) DAla-DjSNal- 0,30 216 + 27 340 + 38

Ala-Ttp-DPhe-NH2 1,00 216 + 27 1205 + 335 3.00 216 + 27 1703 + 182 10.00 216 ± 27 2741+484 DAla»D/9NaI-Ala-Trp- DPhe-Ala*NH2 0,30 216 ± 27 611 + 68 1 0Q 216 ± 27 929 + 209 3.00 216+27 1765+320 10.00 216 + 27 2644 + 358 f ““ DAla - D/SNa 1 - A1 a - — ——

TrpDPhe-NH-Chx-NH2 0,03 216 ± 27 517 + 135 0,10 216+27 1078+174 0,30 216+27 1831+436 1.00 216 + 27 3120 + 761 I — — 0A1 a -DjSNal-Ala*'

Trp-DAla* Lys-HHj 0,10 187 + 36 220 + 34 0,30 187 + 36 167 ± 48 1.00 187+36 339+61 3.00 187 + 36 778 + 174 10.00 187+36 1676 + 470 30.00 187 + 36 1791 + 384 DAla - D^Nal -Ala*. b~Q3 153 + 27 409™ + 97

Tirp - DPhe - LysNH^ 0,10 153 + 27 1469 + 152 0,30 153 + 27 2322 + 265 15 1,00 153 + 27 2765 + 352 32 DAla-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Ala- NH(CH2)5NH2 0 03 177 ± 45 542 ± 98 0,10 177 ± 45 932 ± 84 0,,30 177 ± 45 1121 + 212 1.00 177 ± 45 2599 ± 144

NtiIMA-D#Nal-Ala-

Trp-DPhe-LysNH2 0,03 192 + 41 696 + 108 0.10 192 ± 41 1049 + 198 0* 30 192 ± 41 2567 + 419 1.00 192- ± 41 2001 + 341 DAla-D$Nal-Ala~Trp- DPhe-NH-Ghx-NJU 0,10 192 ± 41 846 + 105 0,30 192 ± 41 1886 + 493 1.00 192 + 41 2209 + 187 3.00 192+41 3359+433 DAla-Tcc-Ala-Trp- DPhe-Lys-MU 0,30 93 + 22 149 + 20 3.00 93 + 22 142 ± 35 DAla-Gly-Gly-Trp-DPhe .-

Lys-NH2 0,30 93 ± 22 107 + 14 3.00 93 + 22 89 + 15 DAla-D$Nal-Ala-

Trp-DPhe-Lys- NH2 0,03 93 + 22 230 + 23 0,10 93 + 22 1006 + 204 0,30 93 ± 22 2110 + 260 1 00 93 ± 22 1825 + 328 l DAla-DjSHal-Ala*Trp* DTIc-Lys-NfcL 0 03 93 ± 22 141 + 26 0#10 93 ± 22 156 + 62 0,30 93 ± 22 124 + 31 ljOO 93 ± 22 151 ± 24 DAla-Dj9Nal-Ala~

Trp-DFhe-Lys-QH 0,10 93+22 558+162 0,30 93 + 22 1730 ± 306 f 33 DAla*D0Nal-Ala- "

Tcc-DPhe-Lys-NH* 3,00 145 + 17 537 + 43 10.00 145 + 17 746 + 92 i *" DAla-D0Nal-Ala-Trp- DPal-Lys-NH, 0 10 145 + 17 365 ± 42 0,30 145 + 17 584 + 148 DAla - D/9Nal-Aia-Trp- DPal-Lys-OH 0,10 145 + 17 928 + 184 0,30 145 + 17 1782 ± 241

Tlp'Ala-D/3NaI - Ala-Ttp- DPhe-Lys-NHo 0,10 87 ± 11 168 ± 27 0,30 87 + 11 167 ± 28 1.00 87 ± 11 152 ± 74 3.00 87 + 11 272 ± 63 DAla - DjflNal-Ala* Trp - DPhe-Lys-NH2 0,03 247 + 53 870 + 136 0,10 247 + 53 1440 + 267 0,30 247 + 53 2420 + 456 1.00 247 ± 53 2855 + 347 3.00 247 + 53 3421 + 377 DAla-DTcc-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,10 247+53 165 + 26 0,30 247 ± S3 183 + 9 1.00 247 > 53 207 + 18 3.00 247 + 53 153 + 22 10.00 247 + 53 269 + 47

Ava-Trp" DTrp-LyS'NHj 0^10 247 + 53 153 + 30 0,30 247+53 144 + 14 1.00 247 + 53 117 + 9 3.00 247 + 53 205 + 59 10.00 247 + 53 214 + 48 DAla-D^Nal-Ala-Trp» DPal-Lys-NH, ' 0,03 228 + 48 203 + 20 0,10 228 + 48 772+142 0,30 228 + 48 979 + 182 1.00 228+48 1691 + 139 3.00 228 + 48 3249 + 526 34

Ala-HIs-D£NaL-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,10 228 + 48 894 + 112 0,30 228 + 48 1128 ± 274 1.00 228 + 48 1362 ±198 DAla-D/JNal -Ala-Trp- DPhe * Lys * OH 0,03 228 + *S 300 + 82 0,10 228 + 48 585 + 141 0,30 228 ± 48 1202 + 236 1.00 228 ± 48 2610 ± 355 DAla-DjMial-Äla-Trp- NMe-DPhe-Lys * NH 2 0,03 16? ± 29 123 + 17 0,10 167 + 29 132 + 30 0,30 167 ± 29 232 ± 49 1.00 167 ± 29 233 ±41

Ava-DAla-D£Nal- ~~~~

Ala - Trp - DPhe - Lys - NH2 0,03 167 ± 29 209 ± 33 0 10 167 ± 29 144 ± 42 0,30 167 + .29 185 ± 47 1.00 167 + 29 499 ± 110 £Ala-D£Nal~

Ala-Trp-DPhe-Lys-NH? 0,03 167 + 29 489 + 71 0,10 167 ± 29 1112 + 194 0,30 167 + 29 1993 + 259 1.00 167+ 29 3061 + 238 DAla-D^Nal-Gly-Trp- ’ ~~~ ~~ DPhe-Lys-NtU 0 10 121 + 14 226 + 26 0,30 121 + 14 170 ± 31 1.00 121 + 14 414 + 101 3.00 121 + 14 713 ± 126 DAl^-Dj8Nal-Gly-Giy- ~

Trp-DPhe-Lys-NH? 0,10 121 + 14 95 ± 15 0,30 121 + 14 82 + 16 1.00 121 + 14 177 + 43 3., 00 121 ± 14 223 + 58 5 35 DAla*D/JNal*Äla-Trp- DPhe-NH-Ch5C-NH2 0,03 121 + 14 335 ± 106 0,10 121 ± 14 652 + 129 0,30 121 ± 14 1528 + 252 1.00 121 + 14 2410 + 370 DAla-D/SNai-DAla-Trp- DPhe-Lys-NH, 0,10 200 ± 45 166 + 36 0r3ö 200 ± 45 197 ± 33 1.00 200 ± 45 343 + 73 3f00 200 ± 45 531 + 121 DAl a* DjSNa 1-Ala-Ala-

Trp-DPhe-Lys -NHo 0 ^10 200 + 45 147 + 21 0,30 200 + 45 184 + 45 1.00 200 + 45 206 ± 66 3.00 200 +.45 143 + 9 DAla-DflNal-Ala*Trp* D P h®-MK-Chs-NHg 0,10 200 + 45 1246 + 189 0,30 200 + 45 1616 + 250 1.00 200+ 45 2574 + 467 3.00 200. ± 45 2789 ± 130 DAla*D%al-Ala- Q~Ö3 200 ± 45 608 + 140

Trp-DPhe-Lys-NH, 0.30 200+45 920+225 1.00 200 + 45 1755 + 291 3.00 200 + 45. 2527 + 196 DAia-D£Nal -Ala-Trp-

Pro-Lys~NH2 0,03 157 + 40 113'+ 14 1.00 157 + 40 136 + 40 3.00 157 + 40 195 + 35 10^00 157 + 40 226 + 42 DÄla*D$Nal-Ala-Trp- DPro-Lys-MH., 0,30 157 + 40 234 + 36 1.00 157 + 40 358 + 48 3f00, 157 + 40 576 + 77 10,00 157 + 40 1624 + 241 36 DAla-D^Nal-Ala-Trp- DLeu-Lys-NHn 0 30 157 + 40 202 ± 27 ljxK) 157 + 40 165 + 12 '3,00 157 ± 40 307 + 51 10,00 157 + 40 1591 ± 568

Ava * D0Nal-Ala-Trp- DPhe-Lys-MH2 0,03 157 ± 40 768 ± 191 0,10 157 ± 40 1277 + 61 0,30 157 ± 40 1733 + 254 1.00 157 ± 40 2418 + 162 f 5 Taulukko 6

In vivo GH-vapautuminen, jota kasvuhormonia vapauttavat synteettiset peptidit edistivät pentobarbitaatilla nukutetuissa rotissa.

10 (Eläimet uhrattiin 10 minuuttia viimeisen injektion jälkeen)

Sarake A Kokonais- Kontrolli- Vapautunut GH | GH:ta vapaut- annos3 seerumi Seerumin GH ng/ml 15 tava peptidi (pg/iv) GH ng/ml + SEM (N=6) ± SEM (N—6) DAla*DjSNal-Ala- 0,03 186. ± 34 412 + 84 2rp*DPhe-iLysSH2 0,10 186 + 34 630 + 124 0,30 186 + 34 1877 + 195 1.00 186 + 34 3008 ± 417 DAla-D£INal-Ala~harao

Phe-0Phe-Lystffl2 0t03 93 ± 13 214 ± 71 0,10 93 ± 13 214 + 58 0,30 93 ± 13 406 + 121 1.00 93 + 13 1189 ± 120 | $ 37 DAla--Ala-Trp-DPhe-Ala-1,3- diaminopropa^P-i 0,03 93 + 13 444 + 60 0,10 93 ± 13 517 + 109 0,30 93 ± 13 2341 + 479 1.00 93 ± 13 2468 ± 276 DAla-D$Nal - Ala-Trp- DPhe-LysNH, 0,03 93 ± 13 362 + 64 0,10 93 + 13 800+192 0,,30 93 ± 13 2674 + 486 1.00 93 ± 13 3658 + 610 DAla-D0Nal-Ala-Trp- DPhe-Ala-1,6, 0,03 85 ± 16 395 ± 91 heksyylidianulini 0,10 85 + 16 905 + 113 0.30 85 + 16 735 + 166 1.00 85 + 16 2708 ± 310 IMA - DjSNa 1 - Ala - Trp - DPhe-Ala-l,3, 0,03 85 + 16 566 + 157 diaralnopropaäni 0,10 85 + 16 645 + 167 0,30 85 + 16 1428 ± 271 1.00 85 + 16 2972 ± 365 DAla-D/dKal-Ala-Irp- ~ DPhe-ArgNH? 0,03 125 + 12 252 + 29 0,10 125 + 12 645 ± 90 0-30 125 + 12 1180 ± 318 1.00 125+12 2197+285 ΪΗΑ-DiSMal-Ala-Trp- ““ ' " " DPhe-Ala-1,6 0,03 125 + 12 332 ± 59 heksyylidiamilni 0,10 125 + 12 609 + 165 0,30 123 + 12 1139 ± 232 1,00 125 + 12 1996 ± 372 38 DAla-D/3Nal-Ala-Trp-

LysNH2 0,30 160 + 33 187 + 44 1.,00 160 + 33 257 + 18 3.00 160 + 33 198 ± 31 10.00 160 + 33 193 + 33 30.00 ISO + 33 236 + 23 DAla-D/5Nal*Ala~

TrpNH2 0,30 160 + 33 115 + 22 1.00 160 ± 33 107 - + · 23 3.00 160 ± 33 101+ 13 10.00 160 + 33 199 + 40 30.00 160 + 33 232 + 69 ÖÄla - DjSNal -Ala-Trp- “ ~ ~ “““ D Phe > Al a - NH (OH 2.) 5 NH2 0,03 160 ± 33 517 + 89 0,10 160 + 33 1164+255 0,30 160 + 33 2023 + 242 1.00 160 + 33 3441 + 435 DAla - D/3Nal - Ala - Trp —

Pro-LysNHo 0,30 157 ± 40 113 ± 14 1.00 157 + 40 136 + 40 3^00 157+40 195 ± 35 10.00 157 + 40 226 + 42 DAla-D/SSal-Ala··

Trp-DPro-LysSHo 0,30 157 + 40 234 + 36 1.00 157 + 40 358 + 48 3.00 157 + 40 576 + 77 10.00 157 + 40 1624 + 241 DAla-D^Nal-Ala-Trp- DLeu-LvsNHn 0,30 157 + 40 202 ± 27 1 00 157 ± 40 165 + 12 3.00 157 + 40 307 ± 51 10.00 157.+ 40 1591 + 568

Ava-D$Nal-Ala-Trp DPhe-Lys^Hn 0,03 157 + 40- 768 + 191 0,10 157 ± 40 1277 + 61 0,30 157 + 40 1733 + 254 1.00 157 + 40 2418 + 162 5 39 ».yABU-D^NalrAla-

Trp-DPhe-LysNK? 0,03 108 ± 20 621 + 85 0,10 10S + 20 1230 + 317 0,30 108 + 20 2385 ± 182 1.00 108 ± 20 3011 + 380 DAIa-D£Na1-Ala -Trp- DPhe-HisNH2 0,03 108 ± 20 246 + 22 0,10 108 + 20 199+ 34 0,30 108 + 20 370 + 67 1.00 108 ± 20 1419 + 230 DAla - D^Nal - Ala - Phe - DPhs-LysNH, 0,03 108 + 20 366+81 0,10 108 ± 20 1011 + 175 0t3Q 108+20 2361+233 1.00 108 + 20 3057 ± 472 BAla-D^Nal-Ala-Trp- NH-Chx-NHo 0,10 108 ± 20 151 ± 35 0,30 108 + 20 251 + 43 1.00 108 + 20 227 + 55 3.00 108 + 20 349 + 72 DAla-D$Nal-Ala-Trp- DPhe-OmNHn 0,03 200 ± 33 515 ± 92 0,10 200 + 33 787 + 71 0,30 200 + 33 1288 ± 365 1.00 200 + 33 1888 + 615 DAla-D/SNal-Ala-Tcp- , 0 DHis-LysNH, 0r03 200 + 33 287 + 48 2 0,10 200+33 131+ 37 0,30 200 ± 33 337 + 78 1.00 200 + 33 457 + 124 40

Taulukoista 5 ja 6 käy ilmi/ että tämän kaavan mukaiset yhdisteet edistävät kasvuhormonitasojen vapautumista ja nousua veressä suuremmassa määrin kuin yhdisteet, jotka eivät ole kaavan mukaisia.

5 Esimerkki 5 SH:n vapautuminen ihmisissä in vivo

Normaaleille ihmiskohteille, miehille joiden keski-ifcä oli noin 25, annettiin suun kautta peptidiä AI a-Hi s·-:DpNal-Ala~Trp-DPhe-Lys“NH2 (GHRP-1) tai peptidiä DÄla-D%al-10 Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 (GHRP-2), Neljäkymmentä kohdetta sai 300: pg 1kg GHRF-l:tä 20 rnl:ssa H2Ö:ta, jota seurasi 100 ml pelkästään Huolta. 39 kohdetta sai 600 1kg GHRP-1:tä 20 ml:ssa H2O: ta, jota seurasi 100 ml Η20:ta, ja 11 kohdetta sai 100 pg/.kg GHRP-2:ta 20 ml:ssa HaÖ:ta, jota seurasi 15 100 ml H->0:ta. Verta otettiin ajoittain kuten kuviosta 1 käy ilmi, ja radioimmunologisella määrityksellä tutkittiin kasvuhormonitasot esimerkissä 2 kuvatulla menetelmällä. Tulokset esitetään kuviossa 1. Suun kautta tapahtuva antaminen (100 pg/kg GHRP-2:ta) sai aikaan korkeammat kas-20 vuhormoni.tasot kuin GHRP-l:n antaminen (300 pg/kg) suun kautta.

Esimerkki 6 GH:n vapautuminen rotissa in vivo

Noudatettiin esimerkin 2 mukaista yleistä menetel-25 mää, paitsi että peptidit injektoitiin ihonalaisesti pikemmin Jenin; laskiMonsisälsesti, ja uhrausaika oli 115 minuuttia pikemminkin kuin +10 minuuttia. Annetut yhdisteet, käytetyt annastasot ja tulokset esitetään taulukossa 7. ; 41

Taulukko 7

Kontrolli-

Sarake A Kokonais- seerumin Vapautunut GH

5 GH:ta vapaut- annos GH ng/ml Seerumin GH ng/ml tava peptidi (yg/iv) ± SEM (N-6) ± SEM (N=6) ....... ..... 1 - - ' ...............

IHA-D0Nal-Ala-

Phe-DPhe-Lys-NH2 0,03 147 + 21 181 + 36 0,10 147 + 21 399 + 40 q30 147 +21 808+187 1.00 147+21 2394+475 ctyABU- D^Nal-Ala-Phe- DPhe-Lys-KH, 0,03 147 + 21 192 + 29 0,10 147+21 288 + 62 0,30 147 + 21 461 + 90 1.00 147 + 21 1441 + 203 IHA-D£Nal-Ala-Trp-DPhe-Ala-1,5 - pencadiamine 0,03 147 + 21 475 + 96 0,10 147 + 21 916 + 169 0,30 147 + 21 1118 + 243 1-00 147 ± 21 2660 + 599

His - 1 - Ala- Fhe DPhe-Lys-MH, 0,03 217 + 33 317 + 55 0,10 217 ± 33 348 + 65 0,30 217 + 33 1283 + 258 1.00 217+33 1374+107

Ala-His-D^Nal-Ala-Phe-DPhe- Ly s - NH2 0,03 217 + 33 341 + 35 0,10 217 + 33 516 + 118 0,30 217 + 33 1060 ± 151 1.00 217 + 33 146? + 208 7ABU-0^tial-A la - Phe - D Ph e ~ Ly s - OT03 217 + 33 197 + 31 “2 0 10 217 + 33 132 ± 20 n*30 217 ± 33 524 + 116 l*(00 217 ± 33 1127 + 110 42 ÖAla - DjSNal - Al a -

Phe-DPhe-Lys- 0.03 217 + 33 287 + 62 NH, 0,10 217 + 33 1084 ± IS2 0.30 217 + 33 1982 ± 3*0 1.00 217 ± 33 2887 ± 275 DAla-DPhe-Ala-Phe- 0;03 132 ± 18 167 ± 29 DPhe-Lys-NH, 0.10 132 ± 18 499 ± 62 oj30 132 ± 18 1132 ± 145 1.00 132 ± 18 2147 ± 268 DAla-DjSNal-Ala-

Phe-DPhe-Lys-NH, 0,03 132 ± 18 336 ± 77 4 o; 10 132 ± 18 795 ± 132

Oj 30 132 + 18 1364 ± 224 1.00 132 ± 18 2272 ± 406 5 Esimerkki 7

Peptidifragmenttien kondensaatioreaktio peptidin muodostamiseksi Yleiset menetelmät

Sulamispisteet voidaan määrittää käyttämällä Thomas 10 Hoover -kapilläarisulamispistelaitetta. Infrapuna (IR) -spektrit voidaan mitata Rerkin-Elmer Model 137 tai Nicplet Model 5DX -spektrofatometrillä ja raportoida aaltolukuina (crrf1) . Massaspektrit (MS) voidaan hankkia käyttämällä VG Analytical Ltd.:n Model ZAB-1F massaspektrometria EI 15 (elektroni-impakti), FD (kehttädeadrptio) tai FÄB (nopea-atomipommit us) -tiloissa. GCHS voidaan hankkia käyttämällä Finnigan 4023 GCMS-laitetta, joka on varustettu 30 m DB5-kapillaaripylväällä (J & W Scientific), käyttäen heliumia kanta jakaasuna,. Optiset rotaatiot voidaan mitata käyttä-20 mällä Autopol III -polaximetria, jota valmistaa Rudolph Research.

1H -NM.R~ spektri voidaan hankkia JEOL GX-400 -NMR-instrumentilla,: joka toimii 400 MHz: n taa j uudella, tai JEOL GX-270 -NMR-instrumentilla, joka toimii 270 MHz:n 43 taajuudella. Nämä instrumentit .kykenevät rutiininomaisesti alle 0,7 Hz:n digitaaliseen resoluutioon. Kemialliset siirtymät ilmaistaan miljoonasosina suhteessa sisäiseen 3—(trimetyylisilyyli)-tetradeuteronatriumprQpionaattiin 5 (TSE) .

Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HBLC) voidaan saada aikaan käyttämällä Hitachi-järjestelmää·, joka koostuu L-5000-gradientin.säätelijästä ja 655Ä-pumpus-ta, joka. on kiinnitetty Vydac 2Q1TP1010 tai 218TP1010 se-10 mipreparatiiviseen pylvääseen. Veden, joka on 0,2-prosent-tinen trifluorietikkahapon suhteen, ja metanolin yhdistelmiä voidaan käyttää eiuointilxudttimena. Mielenkiintoiset yhdisteet eluoituvat tyypillisesti virtausnopeudella kuusi ml minuutissa, jolloin gradientti kasvattaa orgaanisen 15 komponentin osuutta nopeudella noin 1-2 % minuutissa. Sitten yhdisteet havaitaan soveliailla aallonpituuksilla käyttämällä LKB 2140 -UV-diodirividetektoria. Integroinnit voidaan sitten suorittaa käyttämällä Nelson Analytical -ohjelmistoa (versio 3.6).

20 Reaktiot suoritetaan inertissä typpi- tai argon- kaasukehässä ellei toisin spesifioida. Vedetön tetrahydro-furaani (THE’, U.V. grade) ja dimetyyliformamidi (DMF) voidaan ostaa Burdick and Jackson -yhtiöltä ja käyttää suoraan pullosta.

25 A. Tripeptidifragmentin - 2HN-Trp-DPhe-ijys (Boc) -KHa valmistus N“-benfcsyylioksikarbonyy li -N?-t-butoksikarbonyyli) -lysiiniamidi, 4.

10 °C:n lämpötilassa olevaan kafbonyylidi-imidat-30 solin (GDI, 2, 88,24 g, 0,544 mol) ja kuivan tetrahydrofu-r aan in (THEV 1500 ml) muodostamaan liuokseen lisätään hitaasti N“-bentsyylioksikarbonyyli- (N^-t-butofcsikarbonyy-li)lysiini (1, 180 g, 0,474 mol). Kaasun kehittymistä tarkkaillaan tämän lisäyksen aikana. Samalla kun N ^-bent-35 syylioksikarbonyyli-(K ‘’-t-butoksikarbonyyli) lysiini-imid- 4 4 atsoli-välituöte 3 on muodostumassa, lisätään kyllästetty ammoniakin ja THF:n (2000 ml) liuos (vedetön NHs-kaasu viedään THF: n läpi 5: - 10 °C:n lämpötilassa). Sen jälkeen kun välituotteen 3 muodostumisen arvioidaan olevan lopussa 5 (kun kaasun kehittyminen on loppunut, noin 2 tuntia)/ puolet 3:n sisältävästä THF-liuoksesta lisätään ammoniakki-liuokseen, 3:n sisältävän liuoksen loppuosa lisätään 30 minuuttia: myöhemmin. Jatkuva ammoniakkikaasun virtaus pidetään yllä koko additioiden ajan ja vielä 45 minuuttia 10 sen jälkeen. Kun kaksi 3:n sisältävää liuosta on lisätty, muodostuu valkoinen sakka. Reaktion annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan ja sekoittua 15 tuntia. Liuotin poistetaan lietteestä in vacuo., jäännös lietetään veteen, ja tuloksena oleva kiinteä aine kerätään imusuödatuksella...

15 H^-t-bufcoksikarbonyylilysiiniamicLi, 5

Lysiiniamidin 4 (181,48 g, 0,479 mol) liuos metsuolissa (MeOH, 1000 ml) lisätään kataiysaattorilietteeseen {5-prosenttinen Pd/C (5 g) metanolissa (250 ml)) argonissa. Vetyä koputetaan reaktioseöksen läpi (noin 15 minuut-20 tia) ja reaktiota sekoitetaan sitten vetykaasukehän alla, kunnes HPLC-analyysi osoittaa että reaktio on täydellinen (36 tuntia). Vetykäasukehä syrjäytetään sitten argonilla, Reaktioliuos selkeytetään CeliteR -kerroksen läpi ja liuotin poistetaan in vacuo, jolloin saadaan, kiinteä aine.

25 ^“-bentsyylioksikarbonyyli-D-fenylalanyyli- (N^-fc-

butoksikarfoonyylx)lysiiniamidi, S

N^-bentsyylio ks i ka rhönyy1i-D-feny1alaniini (6, 126,39 g, 0,423 mol) lisätään hitaasti 10 °C:n lämpötilassa olevaan CDI-liuokseen (2, 66,03 g, 0,409 mol) THF:ssä 30 (500 ml) . Kaasun kehittymistä tarkkaillaan addition ai kana. Kun kaasun kehittyminen lakkaa, lysiiniamidl 5 (110,75 g, 0,452 mol) lisätään THF-liuoksena (500 ml). Noin 48 tunnin kuluttua seos suodatetaan kiinteiden aineiden poistamiseksi. Suodos konsentroidaan in vacuo.

35 45

Tuloksena oleva jäännös pannaan etyyliasetaattiin (EtOAc, 500 ml) ja pestään sitten seuraavasti erotussuppilossa : 1. HC1:n vesiliuos (1 N, 3 x 500 ml), pesun 1 pH 5 noin 8, seuraavien pesujen pH:t 1, 2. vesi (500 ml), 3. NasCCb (puolikyllästetty, 2 x 500 ml) suodatetaan muodostuneiden kiteisten kiinteiden aineiden keräämiseksi (8) , 10 4. vesi (3 x 500 ml),

Orgaaninen kerros kuivataan MgSO^llä, Selkeyttämisen jälkeen liuotin poistetaan in vacuo. Tuloksena, oleva jäännös voidaan jälleenkiteyttää kuumasta EtOAc:sta, jolloin saadaan toinen 8_:n näyte.

15 D-fenylalanyyli- (N^-t-butoksikarbonyyli) lysiiniami- di, 9.

Amidin 8 (120,53 g, 0,229 mol) metanoliliuos (1 500 ml) lisätään katalysaattörilietteeseen (50 g 5-pro-senttista Pd/C:tä 200 ml:ssa MeöHuta). Argonkaasukehä syr-20 jäytetään vedyllä. Kun HPLG-analyysi viittaa siihen, että reaktio on mennyt loppuun (noin 4 tuntia), vetykaasukehä syrjäytetään argonilla. Reaktioliuos selkeytetään sitten CeliteR -kerroksen läpi ja suodos saatetaan jäännökseksi in vacuo. Tämä dipeptidituote voidaan käyttää suoraan 25 tripeptidin 12 valmistuksessa.

^-bentsyylioksikarbonYyli-tryptofyyli-D-fenyyli- alanyyli- (H^-t-butoksikarbonyyli) lysiiniamidi, 12 N^-bentsyylioksikarbonyylitryptofäänin (10, 67,60 g, 0,200 mol), THF: n (500 ml) ja CDI: n (.2, 33, 05 g, 0,204 30 mol) 10 °C:n lämpötilassa olevaa liuosta sekoitetaan kunnes kaasun kehittyminen lakkaa. 9:n liuos (40,8 g, 0,103 mol) THFrssä (noin 200 ml) lisätään sitten reaktioseok-seen. Tuloksena olevan liuoksen annetaan reagoida 15 tunnin ajan samalla kun se lämpenee huoneenlämpötilaan. Muo-35 dostuva kiinteä aine kerätään sitten imusuodatuksellä.

46

Suodos saatetaan jäännökseksi konsentroimalla in vacuo. Tuloksena oleva jäännös ja kiinteä aine yhdistetään jälleen ja otetaan EtOAc:hen (4 000 ml) hiukan lämmittäen. Kun liuos jäähdytetään huoneenlämpötilaan, muodostuu kiin-5 teä aine. Kiinteä aine kerätään imusuodatuksella. Tämä kiinteä aine jälleenkiteytetään kuumasta MeOH:sta, jolloin saadaan puhdistettu tripeptidi 12. EtOAc-suodos (ensimmäisestä kiteytyksestä) pestään seuraavasti erotussuppilossa: 1. HCl:n vesiliuos (1 N, 2 x 500 ml), 10 2. vesi (1 x 500 ml), 3. Na2C03:n vesiliuos (puoli kyllästetty, 2 x 500 ml), 4. Ma-Cl:n vesiliuos (1 x 500 ml) .

Orgaaninen kerros kuivataan MgSQqillä ja selkeyte-15 tään sitten imusuodatuksella, Suodoksen liuotin poistetaan in vacuo. Tuloksena oleva jäännös otetaan uudestaan EtO-Äcihen, jolloin saadaan kuiva kiinteä aine. Kiinteä aine voidaan panna jälleenkiteytykseen kuumassa MeOH:ssa, jolloin saadaan toinen 12:n saanto valkoisena kiinteänä ai-2 0 neena.

Tryptofyyli-D-fenylalanyyli- (Κζ-t-butyylioksikarbo- nyylDlysiinlamidi, 13

Tripeptidin 12 (64,59 g, 0,091 mol) metanoliliuos (1 500 ml) lisätään katalysaaitorilietteeseen (5 g 5-pro-25 senttistä Pd/C:tä 250 ml:ssa MeOH:ta) argonkaasukehässä. lisätään vielä tilavuus: MeOH:ta (2250 ml) . Argonkaasukehä syrjäytetään vedyllä ja annetaan reagoida (noin 24 tuntia) . Kun reaktio on mennyt loppuun, vetykaasukehä syrjäytetään argonilla. Liuos .selkeytetään: CeliteR -kerroksen 30 läpi ja suodos konsentroidaan in vacuor jolloin saadaan tripeptidi 13 valkoisena kiinteänä: aineena.

47 B. Tripeptidifragmentin -K-DAla-D^Nal-Äla-OMe valmistus N°-bent:syylioksikarbonyyli-D-alanyyli“D"beta-naf-fcyylialanixnin metyyliesterx, 25 5 EtOÄc:n (400 ml) ja D-beta-naftyylialaniinimetyyli- esterihydrokloridin ¢22, 0,62 mol) liuos pestään kyllästetyllä natriumkarbonaatilla (400 ml) ja 0,8 N natrium-hydroksidin vesiliuoksella (noin 500 ml), Tuloksena oleva vesifaasi poistetaan (pH 8,5) ja orgaaninen faasi pestään 10 perätysten puolikyllästetyllä Na2C03-vesiliuoksella (150 mi) ja sitten vedellä (50 ml) . 22:n vapaa emäsmuoto eristetään konsentroimalla etyyliasetaattikerros in vacuo, Disyklohefcsyylikarbodi-imidi (DCC, noin 95 g, 0,46 mol) lisätään -5 °C:n lämpötilassa olevaan {jää-etanoli-15 haude) Ma-bentsyylioksikarbonyyli-D-alaniinin (19, 143,5 g, 0,50 mol), M-hydroksisukkinimidin (HONSu, 23, 0,62 mol) ja vasta valmistetun 22: n vapaan emäsmuodon (noin 0,52 mol) liuokseen DMF:ssä (noin 3 1). Tuloksena olevan reaktio-liuoksen annetaan sekoittua 24 tunnin ajan samalla kun 20 sitä läiimitetääh huoneenlämpötilaan. HPLC-analyysiä pitäisi käyttää tarkkailemaan meneekö reaktio loppuun. Jos: se ei ole mennyt, reaktioseos jäähdytetään sitten noin -5 °C:n lämpötilaan ja reaktioon lisätään lisäosa disyklö-heksyylikaxbodi-imidiä (noin 0,17 mol). Reaktioseoksen 25 annetaan sitten sekoittua vielä 24 tuntia samalla kun se lämmitetään huoneenlämpötilaan. Seos suodatetaan sitten disykloheksyyliurean (DCU) poistamiseksi:. Vesi (1 1) lisätään suodakseen ja tuloksena oleva liuos konsentroidaan in vacuo. Tuloksena oleva jäännös otetaan ;HCl:n l-normaali-30 seen vesiliuokseen (noin 1 1 kunnes vesifaasin pH saavuttaa pH:n 1). Vesifaasi uutetaan sitten kahdella annoksella: etyyliasetaattia (1. 1 kumpikin). Etyyliasetaattikerrokset heitetään pois. Vesifaasin pH säädetään sitten lisäämällä kylmää 2-normaalista natriumhydroksidia (500 ml), ja nat-35 riumhydroksidinappeja. Tämän neutraloinnin aikana liuos 48 pidetään kylmänä lisäämällä kylmää etyyliasetaattia (1 1). Kun vesifaasin pH saavuttaa noin arvon 7, tuloksena on yleensä valkoisen sakan tai öljyn runsas saostuminen. Tämä sakka kerätään imusuodatuksella tai dekantoirna 11a ja pes-5 tään peräjälkeen puplikyllästetyllä natriumkarbonaatilla (2 x 1500 ml), vedellä (6 x 1500 ml) ja etyyliasetaatilla (3 x 1500 ml) . Tuloksena oleva materiaali kuivataan voimakkaassa alipaineessa vakiopainoon. Tämä materiaali voidaan hydrolysoida suoraan ilman jatkopuhdistusta.

10 Na-bentsyylioksikarbonyyli-D-alaiiyyli-p-naftyyli-D- alaniini, 26

Natriumhydroksidin vesiliuos (192 ml, liuoksessa 0,08 g/ml, 0,38 mol) lisätään dipeptidin 25 (noin 0,38 mol) , veden (360 ml) ja MeOH:n (noin 6 1) liuokseen.

15 Liuosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa kunnes hydrolyysi on täydellinen (noin 24 tuntia). Lähtöpeptidin katoaminen varmistetaan HPLC-analyysillä. Liuos konsentroidaan in vacuo jäännökseksi, joka liuotetaan veteen (noin 1 1).

Vesikerros (pH noin 10) uutetaan sitten EtOÄc:11a (2 x 20 500 ml) erotussuppilossa. Etyyliasetaattikerrokset heite tään pois. Tuloksena olevan vesifaasin pH säädetään noin 5:ksi väkevällä HCl:llä, jolioin tapahtuu yleensä valkoisen kiinteän aineen tai öljyn saostuminen. Tuote kerätään j a kuivataan in vacuo.

25 Kd-bentsyylioksikarbonyyli-D-alanYyli-D-beta-naf- tyylialaxiyyli-alaniinin metyyliesteri, 20 Dipeptidi N°-bentsyyIloksikarbonyyli-D-alanyyli-D-beta-naftyylialanlini (26, 0,253 mol) lisätään HONSu- liuokseen (23, 0,505 moi) DMF:ssä (800 ml) argonkaasuke- 30 hässä. Tähän liuokseen lisätään alaniinimetyyliesterihyd-mkloridin (15, 0,303 mol), N-metyylimorfoliiriin (16, 0,303 mol) ja DMF:n (200 ml) seos. Tuloksena oleva liuos jäähdytetään 10 °C lämpötilaan, jossa vaiheessa lisätään disykioheksyylifcarbodi—imidi (2_4, 0,265 mol) metyleeni- 35 kloridissa (273 ml). Reaktiota seurataan HPLCrllä samalla 49 kun reaktiolämpötila pidetään 10 öC:eessa kunnes reaktio on mennyt loppuun. Jos useiden päivienkään päästä {noin 4) reaktio ei ole edennyt loppuun, lisätään vielä annos |4/: aa (0,080 mol) ja reaktioseoksen annetaan sekoittua vielä 5 päivä 10 °C;n lämpötilassa. Reaktiota monitoroidaan taas HPLC-ahalyysillä kunnes se. on mennyt loppuun (tyypilli” sesfci noin 5 päivää). Reaktion aikana muodostuvat kiinteät aineet kerätään imusuodätuksella. SuodoS konsentroidaan sitten jäännökseksi in vacuo. Tuloksena oleva jäännös oter 10 tään etyyliasetaattiin ja uutetaan puolikyllästetyllä Na2C03:n vesiliuoksella (2 x 500 ml) . Etyyliasetaattifaasi kuivataan MgSO^: llä. Tuloksena oleva liuos selkeytetään; ja konsentroidaan jäännökseksi in vacuo.

2-normaalinen natriumhydroksidin vesiliuos (7,5 15 ml, 15 mmol) lisätään metanolin (500 ml) ja veden (200 ml) liuokseen, joka sisältää Nö-bentsyyliöksikarhönyyli-DAla-D^Nal-Ala-Omeia (13,7 mmol). Sen jälkeen kun reaktion on annettu sekoittua yli yön huoneenlämpötilassa, HPLC-ana-lyysi osoittaa jäljellä olevan lähtömateriaalin määrän. 20 Kun reaktio on oleellisesti mennyt loppuun (noin yli yön), tuloksena oleva liuos konsentroidaan in vacuo noin 200 ml:n tilavuuteen. Vesi (100 ml) lisätään ja pH säädetään noin 12:ksi lisäämällä 2-normaalista natriumhydroksi-dia (1 ml) . Tuloksena oleva liuos uutetaan etyyliasetaa-25 tiliä (2 x 500 ml) . Etyyliasetaattikerrokset heitetään pois. Vesifaasin pH säädetään sitten noin 5:ksi lisäämällä ;HCl:n vesiliuosta, mikä johtaa yleensä tuotteen saostu-miseen. On tärkeää minimoida vesifaasin tilavuus tämän saastumisen edistämiseksi. Vesifaasi dekantoidaan pois 30 tuotteesta j a tuotetta huuhdellaan sitten vedellä (2 x 50 ml). Eristetty tuote kuivataan vakiopainoon in vacuo.

C. Peptidifragmenttien kondensaatioreaktio heksa-peptidin tuottamiseksi

Kaksi peptidiä DÄla-DpNal-Ala-OH (33, 2,6 mmol) ja 35 Trp-D-Phe-Lys(Boc)-NH2 (13, 2,8 mmol) liuotetaan vedettö- 50 mään DMF:ään ja tuloksena oleva liuos konsentroidaan in vacuo. Tämä alustava konsentrointi suoritetaan yrityksenä poistaa mahdolliset läsnä kenties Olevat metanolijäännökset. Tuloksena oleva peptidiseos liuotetaan uudelleen 5 DMF:ään ja sitten lisätään K-hydroksisukkinimidi (5,1 mmöl). Tuloksena oleva liuos jäähdytetään sitten -2 °G:n liuoslämpötilaan ja sitten lisätään disyklohek-syylikarbodi-imidi (3,4 mmol) liuoksena met yleeni kloridissa (3,5 ml) . Tuloksena olevan reaktioseoksen annetaan 10 sekoittua -2 °C:n liuoslämpötilassa kolmen päivän ajan. HPLC-analyysiä käytetään määrittämään, onko reaktio mennyt oleellisesti loppuun. Tämän ajanjakson jälkeen, jos se ei ole mennyt, voidaan sitten lisätä vielä disykloheksyyli-karbodi-imidiä ja tuloksena olevan reaktioseoksen annetaan 15 sekoittua vielä päivä -2 °C; n lämpötilassa· Jos seuraavana päivänä (neljä päivää kaikkiaan) HPLC-analyysi viittaa jälleen epätäydelliseen: reaktioon, reaktioseoksen jäähdytys pitäisi lopettaa. Reaktion liuoslämpötilan voidaan antaa kohota hitaasti huoneenlämpötilaan (25 °C) tuntien 20 aikana (noin 8) . Tuloksena olevan reaktioseoksen annetaan sekoittua yli yön huoneenlämpötilassa. Menettely toistetaan kunnes reaktio on mennyt loppuun. Sitten lisätään vettä (50 ml) ja tuloksena olevan seoksen annetaan sekoittua vielä päivän. .Reaktioliuos suodatetaan sitten disyklo-25 heksyyliurean poistamiseksi ja tuloksena: oleva suodöa konsentroidaan in vacuo viskoosiksi öljyksi:· Tuloksena olevaan jäännökseen lisätään etyyliasetaatti ja puallkylläs-tetty natriumkarbonaatin vesiliuos (200 ml). Kaksifaasista seosta pyöritetään voimakkaasti pyöröhaihduttimessa noin 30 yhden tunnin ajan. Mitkä tahansa muodostuneet kiinteät aineet kerätään, jolloin tuote saadaan suodattamalla lasi-sintterisuppilossa. Orgaaninen kerros pestään vedellä ja, kuivataan sitten vakiopainoon in vacuo, jolloin saadaan tuote.

51 DAla“D“pNal“Äla-Trp-D-Phe-Lys-NH2 , 35

Heksapeptidi bentsyyliokslkarbonyyli-DÄla-D-pNal-Äla-Trp-D-Phe-Lys-(Boc)-NH2 (34, 1,02 mmol) lisätään tri- fluorietikkahapon (30 ml), dimetyylisulfidin (14 ml), 5 1>2-etääniditiolin (7 ml) ja anisölin (2,2 ml) huoneen- lämpöiseen liuokseen metyleenikloridissa (15 ml). Homogeenisen reaktioseoksen annetaan sekoittua 15 minuutin ajan. Tämän ajanjakson jälkeen lisätään vedetön eetteri (450 ml) , jotta saadaan aikaan epäpuhtaan, biologisesti 10 aktiivisen peptidituotteen 35 saostuminen. Tämä tuote eristetään suodattamalla lasisintterisuppilossa tai dekan-toimalla. Tuloksena oleva tuote liuotetaan veteen ja lyo-filisoidaan, lyofilisoitu tuote voidaan edelleen puhdistaa keskipäinekrqmätqgrafiaSsa 26 x 460 mm lasipylväässä, joka 15 sisältää Lichröprep™ R-18 -pylväspakkausmateriaalia (C-18, 25 - 40 nm, epäsäännöllinen mesh). Sen jälkeen kun peptidi on injektoitu liuoksena vedessä, pylväs eluo.idaan virtausnopeudella 9 ml minuutissa 0 - 25-prosenttisen metanoiin loivalla gradientilia 5 - 20 tunnin ajan, ja sitten gradi-20 entilla 25 - 55-prosenttinen metanoli noin 48 tunnin ajan. Gradientin metanolikonsentraatiota nostetaan sitten nopeudella 2 % tunnissa. Eluution aikana jäljellä oleva li-uotinkoostumus tehdään veteen, joka on 0,2-prosenttinen trifluorietikkahapon suhteen. Tuote (35) tunnistetaan 25 HPLC:llä ja eristetään konsentroimalla soveliaat eluutio-tilavuudet.

Keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti viitaten erityisesti sen edullisiin suoritusmuotoihin. Ymmärretään kuitenkin, että ammattimiehet voivat tätä paljastusta poh-30 dittuaan tehdä variaatioita ja modifikaatioita keksinnön hengen ja suojapiirin sisällä.

Claims

1. Menetelmä sellaisen farmaseuttisen ja eläinlääkinnässä käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jol-5 la on kaava Äi-Ä2-Ala-C2-C3-Ä5, jossa Ai. on Gly, DAla, β-Äla, Sar, Äva, Aib, ABU,

10 NH2(CH2)sC0 tai IMA, Ä2 on DTrp, DpNal, Ä5 on Ä3-A4-A5., Ä3-Αδ·, A4-A5· tai As>, jossa a) A3 on Ala, Gly, DAla tai Ero, bj A4 on Ala, Gly, DAla, Pro tai e2-Cio-suora-ketjuinen aikyyliaminokarboksyylihappo, ja 15 c) As·· on Lys(£-Ri,R2)-Z, Qrn (δ-Ri, R2)-Z, NH(CH2)XN- (R3, R4), Lys-2, Orn-Z tai Ärg-Z, joissa Ri on suoraketjuinen C2-Ci0-alkyyliryhmä tai H-atomi, R2 on suoraketj uinen C2~ CiQ~alkyyliryhmä tai H-atomi, mutta Ri ja R2 eivät samanai-kaisestri ole H, R3 on suoraketj uinen C 2 - C1 c - a i k y y 1 i r y hm ä 20 tai H-atomi, R.·; on suoraketj uinen C2-Cio-alkyyliryhmä tai H-atomi, Z on NH (suoraketjuinen Gz-Cia-alkyyliryhmä}, N (suoraket juinen C:2“Cio-aikyyli ryhmä) 2, ö- {suoraketj uinen Cs-Cxo-alkyyliryhmä), NH2 tai OH, x on 2 - 15, C2 on Trp, Phe tai ChxAla,

25 C:3 on DPhe:, DPal tai DChxAla, ja edellä mainittujen peptidien orgaanisten ja epäorgaanisten additiosuolojen valmistamiseksi, t u n -n e t t u siitä, että (i) edellä kuvatut aminohapot tai aminohappojohdannaiset liitetään yhteen peptidin muodostä-30 miseksi käyttäen kiinteän faasin menetelmää, tai (ii) suoritetaan edellä kuvattujen aminohappojen tai aminohappo-johdannaisten tai näiden peptidifragmahttien syntetisointi iiuosvaihemenetelmällä, joka sisältää ainakin kahden fragmentin kondensaatioreaktion, peptidin muodostamiseksi. |

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä:, t u n n e t t u siitä, että Αχ: on Gly tai DAla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että Ai on DAla.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että Ä2 on DTrp tai Dr'N'ai.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että Aa ori DpNal.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10. u n n ett u siitä, että Ä5 on A3-Ä4-A5·'.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että As on Ä3-Ä5'.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että Ä5 on Ä4-A5*,

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen mene telmä, t u n n e t t u siitä, että As on As>.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että C2 on Trp tai Phe.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 5, 9 tai 10 mu-20 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että C3 on DPhe.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että C2 on Trp.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että C3 on DPhe.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä:, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi, jolla on kaava: DAI a - DpNa 1 -AI a-T rp-DPhe -Ly sMHs, DAI a - D PN a 1 -A 1 a - T r p -DPhe-Lys(E-i P r}NH2/

30 DÄla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys(ε-lPr)NH2, DAI a - DT rp-Al a -T rp-DPhe-Ly 314¾., DAla-DpNal-Äla-Trp-DPhe-NH:{G:H2)5NH2, NH2 (CH2) 5CO-Dp~Nal-Ala-Tr:p-DPhe-NH <CH2) 5NH2, Naim-D^Nal-Ala-Phe-pPhe-tysNHa, 35 a,yÄBU-D%al-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, | DAla-DPhe-Äla-Phe-DPhe-LysNHa, NaIMA-DpNal-Ala-Phe-DPhe-NH-CHxNH2f af YÄBU-D^Nal-Ala-Phe-DPhe-NH-CHxNHa, DÄla-D^Nal-Ala-Phe-DPhe-LysNHa,

5 DMa-D%al-Ala-Trp“DPhe-ArgNH2, DAla-D^Nal-Äla-Phe-DPhe-Arg-NHa, DÄla-DpNal™Äla-ChxÄla-DPhe-LysNH2, DAla~DpNal~Ala-Phe-DChxAla-LysNH2, tai DÄla-DpNal~Äla-ChxAla-DChxÄla-LysNH2, 10 ja näiden orgaaniset tai epäorgaaniset additiosaolat. i | | ! ] | ] | Pafcenfckrav