FI119696B - BMP-11:tä koodaavat DNA-sekvenssit, valmistusmenetelmä ja käytöt in vitro - Google Patents

BMP-11:tä koodaavat DNA-sekvenssit, valmistusmenetelmä ja käytöt in vitro Download PDF

Info

Publication number
FI119696B
FI119696B FI955419A FI955419A FI119696B FI 119696 B FI119696 B FI 119696B FI 955419 A FI955419 A FI 955419A FI 955419 A FI955419 A FI 955419A FI 119696 B FI119696 B FI 119696B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
bmp
seq
sequence
amino acid
polypeptide
Prior art date
Application number
FI955419A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI955419A0 (fi
FI955419A (fi
Inventor
John M Wozney
Anthony J Celeste
Original Assignee
Genetics Inst Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genetics Inst Llc filed Critical Genetics Inst Llc
Publication of FI955419A0 publication Critical patent/FI955419A0/fi
Publication of FI955419A publication Critical patent/FI955419A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI119696B publication Critical patent/FI119696B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/18—Feminine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Hematology (AREA)

Description

BMP-11 :tä koodaavat DNA-sekvenssit, valmistusmenetelmä ja käytöt in vitro BMP-11 kodande DNA-sekvenser, produktionsförfarande och användningar in vitro 5 Keksinnön tausta
Esillä oleva keksintö liittyy uuteen puhdistettujen proteiinien joukkoon, josta käytetään nimitystä BMP-11. Keksintö kohdistuu BMP-11-proteiineja koodaaviin DNA-mole-kyyleihin, näitä sekvenssejä käsittäviin isäntäsoluihin ja vektoreihin, menetelmään 10 BMP-11 -proteiinien valmistamiseksi sekä BMP-11 -proteiinien käyttöön in vitro.
Keksijät ovat tätä ennen käyttäneet näistä BMP-11-proteiineista nimitystä Aktiviini WC. BMP-11-proteiinit saattavat olla käyttökelpoisia luun ja/tai ruston muodostumisen indusoimiseksi sekä haavan paranemisessa ja kudoksen korjautumisessa tai luun 15 muiden morfogeneettisten proteiinien aktiivisuuden lisäämiseksi. Näitä BMP-11-proteiineja voidaan ehkä myös käyttää follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) tuotannon säätelemiseksi, raskauden estämiseksi, hermosolujen elossapysymisen edistämiseksi, punasolujen muodostumisen (hematopoiesis) kiihottamiseksi sekä suku- • · · • · · *·* * rauhaskasvaimien kehittymisen tukahduttamiseksi.
20 • · ·
Patenttijulkaisussa US 4 798 885 on kuvattu DNA, johon prepro-inhibiinin a- ja β- • · · j·* · ketjut ovat koodautuneet. Patenttijulkaisussa US 5 071 834 on kuvattu kaksi beetas- • · · ’ ketjua käsittävän aktiviinin farmaseuttiset koostumukset, joissa aktiviiniin on se- • · · • · · * koitettu farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa.
25 • · · • · ·
Patenttijulkaisussa 5 102 807 on kuvattu puhdistettu inhibiiniproteiini, joka tukah- • · *·* duttaa FSH:n tuotannon luteinisoivan hormonin tuotantoa tukahduttamatta.
• · • · · * · · • · • · · • · •; · ’ Keksinnön yhteenveto 30 BMP-11-proteiini on proteiinien TGF-B-pääryhmän jäsen. Tähän TGF-B-pääryh- • · · mään kuuluvat luun morfogeneettisinä proteiineina (BMP) tunnettujen proteiinien 2 perhe sekä nimellä inhibiini-B tunnettujen proteiinien ryhmä. Kuten ohessa on tarkasteltu, kun BMP-11 dimerisoidaan toisen BMP-ll:n kanssa (homodimeeri), niin tällöin BMP-11 -proteiinilla odotetaan olevan BMP-11 :n aktiivisuutta, joka kuvataan myöhemmin, ja joka voidaan mitata ohessa esitetyissä esimerkeissä kuvattujen mää-5 ritysten mukaisesti. Kun BMP-11 dimerisoidaan heterodimeeriksi inhibiini-a-proteii-nien tai muiden inhibiini-B-proteiinien kanssa, niin tällä inhibiini-B/BMP-ll-hetero-dimeerillä odotetaan olevan follikkelia stimuloivan hormonin tuotantoon kohdistuvia vaikutuksia, kuten jäljempänä esitetään. Edelleen on odotettavissa, että homodimee-risessä muodossa tai toisen, luun morfogeneettisten proteiinien perheeseen kuuluvan 10 jäsenen kanssa muodostuneessa heterodimeerisessä muodossa olevalla BMP-11:11a on BMP:n aktiivisuutta, eli kykyä indusoida luun, ruston ja/tai muunlaisen sidekudoksen muodostumista. Niinpä BMP-ll:n ympäristöstä riippuen se voi muodostaa dimeerejä, jolla on joko aktiviinin tai inhibiinin aktiivisuutta tai luuta, rustoa ja/tai muuta sidekudosta indusoivaa aktiivisuutta. Näin ollen BMP-11-aktiivisuus määri-15 tellään kyvyksi säädellä FSH:n tuotantoa ohessa esitetyn esimerkin 8 mukaisessa määrityksessä, tai kyvyksi indusoida luun, ruston ja/tai muun sidekudoksen muodostumista ohessa esitettyjen esimerkkien 5-7 mukaisissa määrityksissä.
• · · • · · • · ·
Inhibiineiksi ja aktiviineiksi kutsuttuja proteiineja syntyy sukurauhasissa ja niitä • · 20 esiintyy luonnostaan munarakkulanesteessä. Nämä proteiinit vaikuttavat aivolisäk- ; keen etulohkon tasolla inhiboiden (inhibiinit) tai kiihottaen (aktiviinit) follikkelia • · · • · · · : stimuloivan hormonin (FSH) vapautumista [yleiskatsauksia on esitetty esimerkiksi • · · julkaisuissa Ying, S.-Y., Endocr. Rev., 9:267—293 (1988), tai Ling, N. et ai, Vita- • · · mins and Hormones, 44:1-146 (Academic Press 1988)]. Lyhyesti, dimeerisiä prote-25 iineja, jotka käsittävät yhden inhibiini-a-ketjun sekä yhden inhibiini B-ketjun (Ba tai • «
Bb), kutsutaan inhibiineiksi, ja niiden tunnusomaisena piirteenä on kyky estää fol- • · « likkelia stimuloivan hormonin (FSH) vapautuminen, kun taas toisia dimeerisiä prote- • · « ,··*. iineja, jotka käsittävät kaksi inhibiini-B-ketjua (BA tai Bb), kutsutaan aktiviineiksi, ja • · • · · \ niiden tunnusomaisena piirteenä on kyky kiihottaa follikkelia stimuloivan hormonin ♦ · · *" 30 (FSH) vapautumista [katso esim. Ling et ai., Nature, 321:779-782 (1986), tai Vale • · • · • · · 3 et ai., Nature, 321:776-779 (1986), tai Mason et ai., Nature, 318:659-663 (1985), tai Forage et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:3091-3095 (1986)].
Tiedetään, että FSH kiihottaa munasolujen kehittymistä nisäkkään munasaijoissa 5 (Ross et ai. teoksessa Textbook of Endocrinology, toimittanut Williams, sivu 355 (1981), ja että munasarjojen liiallinen kiihottaminen FSH:lla johtaa monen munasolun irtoamiseen. FSH on myös tärkeä kivesten toiminnalle. Niinpä inhibiini-a-perheen jäsenen kanssa muodostuneina heterodimeereinä olevaa BMP-11 :tä voidaan käyttää raskauden estämiseen sen perusteella, että inhibiini kykenee heikentämään 10 naarasnisäkkäiden hedelmällisyyttä sekä heikentämään siittiösolujen syntymistä koi-rasnisäkkäissä. Muiden inhibiinien riittävien määrien antaminen voi aiheuttaa hedelmättömyyttä näissä nisäkkäissä. Homodimeerinä tai inhibiini-B-ryhmään kuuluvien muiden proteiinialayksiköiden kanssa muodostuneena heterodimeerinä olevaa BMP-11 :tä voidaan käyttää hedelmällisyyttä indusoivana hoitavana aineena sen pe-15 rusteella, että aktiviinimolekyylit kykenevät kiihottamaan FSH:n vapautumista aivolisäkkeen etulohkon soluista. Katso esimerkiksi US-patenttijulkaisu 4 798 885. BMP-11 saattaa olla myös käyttökelpoinen sukukypsyyden saavuttamisen varhaista- ... miseksi seksuaalisesti kypsymättömissä nisäkkäissä, millä tavalla voidaan pidentää • · · • · · kotieläinten kuten lehmien, lampaiden ja sikojen elinaikaiseen lisääntymiseen liit- • · 20 tyvää suorituskykyä. Mahdollista on lisäksi se, että BMP-11 :tä voidaan käyttää her-mosolujen eloonjäämisen edistämiseksi [katso esim. Schubert et ai, Nature, • « · • · · · ; 344:868-870 (1990)] tai niiden avulla voidaan muokata punasolujen muodostumista • · · • · · · .·;·. indusoimalla erytroidisolujen erilaistumista [katso esim. Broxmeyer et ai., Proc.
• · ·
Natl. Acad. Sei. USA, 85:9052-9056 (1988), tai Eto et ai., Biochem. Biophys. Res.
.·.·. 25 Cornm., 142:1095-1103 (1987)], tukahduttaa sukurauhaskasvaimien kehittymistä • ♦ .***. [katso esim. Matzuk et ai., Nature, 360:313-319 (1992)] tai lisätä luun morfoge- ♦ · · .‘.t neettisten proteiinien aktiivisuutta [katso esim. Ogawa et ai., J. Biol. Chem., .I»* 267:14233-14237 (199211.
• · • · · • · · 30 BMP-11-proteiinien tunnusomaiseksi piirteeksi voidaan edelleen esittää niiden kyky • · • · '** muokata follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) vapautumista vakiintuneissa biolo- 4 gisissa in vitro -määrityksissä, joissa käytetään rotan aivolisäkkeen etulohkon soluja alalla kuvatulla tavalla [katso esim. Vale et ai., Endocrinology, 91:562-572 (1972); Ling et ai., Nature, 321:779-782 (1986), tai Vale et ai., Nature, 321:776-779 (1986)]. Mahdollisena pidetään sitä, että kun BMP-11-proteiini on homodimeerinä 5 tai toisten inhibiini-B-ketjujen kanssa muodostuneena heterodimeerinä, niin sillä on kiihottavia vaikutuksia follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) vapautumiseen aivolisäkkeen etulohkon soluista, kuten alalla on kuvattu [Ling et ai, Nature, 321:779-782 (1986), tai Vale et ai, Nature, 321:776-779 (1986)]. Lisäksi mahdollisena pidetään sitä, että kun BMP-11-proteiini on inhibiini-a-ketjun kanssa muodostuneena 10 heterodimeerinä, niin se estää follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) vapautumisen aivolisäkkeen etulohkon soluista, kuten alalla on kuvattu [katso esim. Vale et ai, Endocrinology, 91:562-572 (1972)]. Näin ollen, kyseessä olevasta koostumuksesta riippuen on odotettavaa, että BMP-11-proteiinilla on ristiriitaisia ja päinvastaisia vaikutuksia follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) vapautumiseen aivolisäkkeen etu-15 lohkosta.
Aktiviini A.lla (inhibiini-BA:n homodimeerinen koostumus) on osoitettu olevan eryt- ... ropoietiinia stimuloivaa aktiivisuutta [katso esim. Eto et ai, Biochem. Biophys. Res.
• · ·
Comm., 142:1095-1103 (1987), sekä Murata et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, • · · · V 20 85:2434-2438 (1988), sekä Yu et ai, Nature, 330:765-767 (1987)]. Mahdollisena pidetään sitä, että BMP-11-proteiinilla on samankaltaista, erytropoietiinia kiihottavaa • Il ; .·. aktiivisuutta. BMP-11-proteiinin tämän aktiivisuuden tunnusomaiseksi piirteeksi • · · * * * * .·;·. voidaan esittää vielä BMP-11-proteiinin kyky tuoda esiin punasolujen syntymiseen • · · t liittyvä aktiivisuus sellaisessa biologisessa määrityksessä, joka toteutetaan käyttäen 25 ihmisen K-562-solulinjaa tavalla, joka on kuvattu julkaisussa Lozzio et ai, Blood, • m ;***. 45:321-334 (1975), sekä US-patenttijulkaisussa 5 071 834], • a · • · • aa • · a .···. Useiden proteiinien, joista käytetään nimityksiä BMP-1 - BMP-9, rakenteet on selvi- • · * * * ·. tetty aikaisemmin. Sillä perusteella, että näillä proteiineilla on ainutlaatuisia in- a a a • · · !" 30 dusoivia aktiivisuuksia ja että niitä on läsnä luussa, voidaan päätellä, että ne ovat • · • · tärkeitä säätelijöitä luun korjausprosesseissa, ja että ne voivat osallistua luukudoksen 5 normaaliin ylläpitoon. Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettava BMP-11-proteiini on edellä mainittujen BMP-proteiinien kaltainen, ja sillä odotetaan olevan BMP:n aktiivisuuksia kuten kykyä indusoida luuta, rustoa ja/tai muuta sidekudosta kuten jänteitä tai nivelsiteitä, sekä BMP:llä olevia, haavan paranemiseen liittyviä 5 aktiivisuuksia. Lisäksi odotetaan, että keksinnön mukaisesti valmistettavat proteiinit voivat toimia yhdessä tai ehkä synergistisesti muiden samankaltaisten proteiinien ja kasvutekijöiden kanssa. Niinpä muut keksintöön liittyvät hoitomenetelmät ja -koostumukset käsittävät hoitavan määrän vähintään yhtä keksinnön mukaisesti valmistettavaa BMP-11-proteiinia sekä hoitavan määrän vähintään jotakin toista 10 sellaista BMP-proteiinia, jotka toiset BMP-proteiinit on julkaistu alla kuvatuissa, saman omistajan patenttijulkaisuissa ja -hakemuksissa. Tällaiset yhdistelmät voivat käsittää BMP-proteiinien erillisiä molekyylejä tai erilaisista BMP-osista koostuvia heteromolekyylejä. Nämä BMP-11-proteiinit on voitu lisäksi yhdistää muihin sellaisiin aineisiin, jotka ovat edullisia luu- ja/tai rustovaurioiden, haavojen tai kyseessä 15 olevan kudoksen hoidon kannalta. Näistä aineista voidaan mainita erilaiset kasvutekijät kuten orvaskeden (epidermal) kasvutekijä (EGF), fibroblastien kasvutekijä (FGF), verihiutaleista peräisin oleva kasvutekijä (PDGF), transformoivat kasvuteki- ... jät (TGF-α ja TGF-B) sekäk-fibroblastin kasvutekijä (kFGF), lisäkilpirauhashormoni * · · • · · (PTH), leukemiaa inhiboiva tekijä (LIF/HILDA/DIA), insuliinin kaltaiset kasvu- • · · · • · . 20 tekijät (IGF-I ja IGF-II). Näiden aineiden osia voidaan myös käyttää keksinnön mu- " ! kaisesti valmistettavia BMP-11-proteiineja sisältävissä koostumuksissa.
• · · • · ♦ · • · • · · • · · • · · ·
. ·: ·. Naudan BMP-11 :n DNA-sekvenssi (SEQ ID NRO 1) j a aminohapposekvenssi (SEQ
• · · ID NRO 2) sekä ihmisen BMP-1 l:n DN A-sekvenssi (SEQ ID NRO 10) ja amino-25 happosekvenssi (SEQ ID NRO 11) on esitetty oheisissa sekvenssiluetteloissa. Akti- • « viiniproteiinit kykenevät säätelemään follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) tuo- • · · Λ( tantoa ja näin ollen BMP-1 l:ta voidaan käyttää raskauden estävänä tai hedelmäni- • · · '···' syyttä aikaansaavana hoitavana aineena. Puhdistetulla BMP-11-proteiinilla, joka on • · • · · homodimeerisessä muodossa tai inhibiini-B-ryhmään kuuluvien proteiinien kanssa • · · • · · "I 30 muodostuneina heterodimeereinä, odotetaan olevan aktiviinin aktiivisuutta ja sitä • « • · voidaan käyttää FSH:n kiihottamiseen. Lisäksi odotetaan, että puhdistettua BMP-11- proteiinia voidaan käyttää luuta, rustoa ja/tai muuta sidekudosta indusoivana ainee na.
6
Naudan BMP-ll:ta voidaan tuottaa viljelemällä SEQ ID NRO 1-sekvenssin mukai-5 set nukleotidit 375-704 käsittävällä DNA-sekvenssillä transformoitua solua ja ottamalla talteen ja puhdistamalla viljelyalustasta proteiini, jonka tunnusomaisena piirteenä on SEQ ID NO 2-sekvenssin mukaiset aminohapot 1-109 käsittävä aminohapposekvenssi, ja joka ei sisällä olennaisesti muita sellaisia proteiinimaisia materiaaleja, joiden kanssa sitä tuotettiin yhdessä.
10
Ihmisen BMP-11 odotetaan homologiseksi naudan BMP-ll:n kanssa. Niinpä keksintö käsittää ihmisen BMP-ll:tä koodaavat DNA-sekvenssit sekä menetelmän näiden DNA-sekvenssien koodaaman ihmisproteiinin valmistamiseksi. Menetelmässä DNA-sekvenssien saamiseksi käytetään naudan BMP-ll:tä vastaavaa nukleoti-15 disekvenssiä tai sen osia, joiden avulla toteutettujen koettimien avulla voidaan seuloa kiqastoja ihmisgeenin tai sen kappaleiden löytämiseksi standarditekniikoita käyttäen. DNA-sekvenssi, johon on koodautunut osa ihmisen BMP-11-proteiinista (SEQ
... ID NRO 3), sekä vastaava aminohapposekvenssi (SEQ ID NRO 4) on kuvattu sek- • · · • · · ' . venssiluettelossa. Näiden sekvenssien avulla voidaan myös toteuttaa koettimia, joita • · · · • · . 20 koettimia ja standarditekniikoita käyttäen saadaan ihmisen BMP-ll:n täydellinen ··· "*!t geeni. Ihmisen BMP-ll:tä voidaan tuottaa viljelemällä BMP-11 DNA-sekvenssillä • · · j V transformoitua solua ja ottamalla BMP-11 talteen ja puhdistamalla se viljelyalustas- • · · ··· t .
.·;·. ta. Tämä puhdistettu ilmentynyt proteiini ei sisällä olennaisesti muita proteiinimaisia • · · materiaaleja, joiden kanssa sitä tuotettiin yhdessä, eikä myöskään muita konta- .·.·. 25 minantteja.
• · · • · • · · • · • · • · ·
Mahdollista on, että tällä talteen saadulla, puhdistetulla proteiinilla todetaan kyky • · · 1.! säädellä FSH:n tuotantoa. Näiden keksinnön mukaisesti valmistettujen proteiinien • · ·' tunnusomaiseksi piirteeksi voidaan edelleen esittää niiden kyky säädellä follikkelia • · · •j·* 30 stimuloivaa hormonia (FSH) vakiintuneissa biologisissa in vitro -määrityksissä, jois- • · • · 1 sa käytetään rotan aivolisäkkeen etulohkon soluja. BMP-11-proteiinien tunnusomai- 7 seksi piirteeksi voidaan myös esittää kyky indusoida luun, ruston ja/tai muun sidekudoksen muodostumista, esimerkiksi jäljempänä kuvattavassa, rotan luun muodostumiseen perustuvassa määrityksessä.
5 Keksinnön mukaisesti valmistettuja BMP-11-proteiineja voidaan sisällyttää hoidon kannalta tehokas määrä farmaseuttisiin koostumuksiin farmaseuttisesti hyväksyttävässä kuljettimessa tai kantajassa. Näitä BMP-11-koostumuksia voidaan käyttää follikkelia stimuloivan hormonin säätämiseksi ja se voi olla käyttökelpoinen raskauden estämiseksi Koostumukset voivat sisältää lisäksi vähintään yhtä, hoidon kannalta 10 käyttökelpoista ainetta kuten BMP-proteiineja BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 ja BMP-7, jotka on kuvattu esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa 5 108 922; 5 013 649; 5 116 738; 5 106 748; 5 187 076; sekä 5 141 905; BMP-8, joka on kuvattu PCT-julkaisussa WO91/19089; sekä BMP-9, joka on kuvattu PCT-julkaisussa W093/00432, sekä BMP-10, joka on kuvattu samanaikaisesti vireillä 15 olevassa, 12. toukokuuta 1993 jätetyssä patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 08/061 695. Näitä BMP-11-koostumuksia voidaan myös käyttää lukuisissa sellaisissa sovellutuksissa, joihin liittyy follikkelia stimuloivan hormonin tuotannon säätelyä, raskauden estäminen mukaan lukien. Näissä menetelmissä tällaista käsittelyä tarvit- • · · * 1 2 3 4 1 * , sevalle potilaalle annetaan tehokas määrä BMP-11 -proteiinia.
• · · i • · 20 • · · Nämä koostumukset voivat käsittää BMP-11-proteiinin lisäksi inhibiini-B-proteiini- * · · 1'1.1 ryhmän tai inhibiini-a-proteiinien muita jäseniä sekä muita, hoidon kannalta käyttö- • · · φ·j.j kelpoisia aineita, mukaan lukien kasvutekijät kuten orvaskeden (epidermal) kasvute- • · · kijä (EGF), fibroblastin kasvutekijä (FGF), transformoiva kasvutekijä (TGF-α ja . ·. ·, 25 TGF-β) sekä insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF).
• · · • · · · • · • · • · · Näitä BMP-11-koostumuksia voidaan myös käyttää lukuisten luu- ja/tai rustovauri- • · · !.! oiden sekä hampaan ympäryskudoksen ja erilaisten haavojen hoitamiseksi. Näissä • · *·1 menetelmissä potilaalle, joka tarvitsee tällaista luuta ja/tai rustoa muodostavaa tai ♦ · · 2 j·1 30 haavaa hoitavaa tai kudosvaurioita hoitavaa käsittelyä, annetaan tehokas määrä 3 • · 4 BMP-11-proteiinia. Nämä menetelmät voivat myös käsittää keksinnön mukaisesti 8 valmistetun proteiinin antamisen yhdessä vähintään yhden muun sellaisen uuden BMP-proteiinin kanssa, joita uusia BMP-proteiineja on kuvattu edellä mainituissa, saman omistajan patenttijulkaisuissa ja -hakemuksissa. Lisäksi nämä menetelmät voivat myös käsittää BMP-11-proteiinin antamisen yhdessä muiden kasvutekijöiden 5 kuten EGF, FGF, TGF-a, TGF-β ja IGF kanssa.
Keksinnön muuna piirteenä ovat edelleen BMP-11-proteiinin ilmentymistä koodaa-vat DNA-sekvenssit. Tällaisista sekvensseistä voidaan mainita SEQ ID NRO 1-sekvenssin havainnollistama nukleotidisekvenssi suunnassa 5' --> 3', tai sellaiset 10 DNA-sekvenssit, jotka hybridisoituvat tarkoin rajatuissa olosuhteissa SEQ ID NRO 1-sekvenssin mukaisen DNA-sekvenssin kanssa ja joihin on koodautunut proteiini, jolla on BMP-11-aktiivisuutta. Lopuksi, esillä oleva keksintö kattaa myös SEQ ID NRO 1-sekvenssien alleeliset tai muut muunnokset riippumatta siitä, johtavatko tällaiset nukleotidimutokset peptidisekvenssin muuttumiseen vai ei.
15
Edelleen eräänä muuna keksinnön piirteenä ovat DNA-sekvenssit, jotka koodaavat
BMP-11-proteiinin ilmentymistä. Tällaisista sekvensseistä voidaan mainita SEQ ID
>ti NRO 1- tai SEQ ID NRO 10 -sekvenssin havainnollistama nukleotidisekvenssi suun- • · ·
* . nassa 5' — > 3' sekä DNA-sekvenssit, jotka ovat identtiset SEQ ID NROl :n tai SEQ
• * · t • · . 20 ID NRO 10:n esittämän DNA-sekvenssin kanssa geneettisen koodin degeneroitu- ♦ ··
Γ!( mistä lukuun ottamatta, ja joihin on koodautunut SEQ ID NRO 2:n tai SEQ ID NRO
• · · |*V 11 :n mukainen proteiini. Esillä olevan keksinnön piiriin kuuluvat edelleen DNA-sek- • · ·
V venssit, jotka hybridisoituvat tarkoin rajatuissa olosuhteissa SEQ ID NRO 1- tai SEQ
• · · ID NRO 10 -sekvenssin mukaisen DNA-sekvenssin kanssa ja joihin on koodautunut 25 proteiini, jolla on BMP-11-aktiivisuutta. Lopuksi, esillä oleva keksintö kattaa myös • · · • · .*·*. SEQ ID NRO 1- tai SEQ ID NRO 10 -sekvenssien alleeliset tai muut muunnokset ··· riippumatta siitä, johtavatko tällaiset nukleotidimuutokset peptidisekvenssin muut- • · · !.!t tumiseen vai ei, kunhan vain peptidisekvenssillä on edelleen BMP-11 -aktiivisuutta.
• · ··· • · « *·|·* 30 Keksinnön eräänä muuna piirteenä ovat edellä kuvatun DNA-sekvenssin käsittävät • « 1 vektorit liitettynä toiminnallisesti sopivaan, ilmentymistä säätelevään sekvenssiin.
9 Näitä vektoreita voidaan käyttää uudessa menetelmässä BMP-11-proteiinin tuottamiseksi, jossa menetelmässä BMP-11-proteiinia koodaavalla ja sopivaan, ilmentymistä säätelevään sekvenssiin toiminnallisesti liitetyllä DNA-sekvenssillä transformoitua solulinjaa viljellään sopivassa viljely alustassa ja BMP-11-proteiini ote-5 taan siitä talteen ja puhdistetaan. Tässä menetelmässä isäntäsoluina voidaan käyttää lukuisia tunnettuja prokarioottisia ja eukarioottisia soluja tämän polypeptidin ilmentämiseksi.
Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaisille DNA-sekvensseille, näitä sekvens-10 sejä käsittäville isäntäsoluille ja vektoreille, menetelmälle BMP-11-proteiinien valmistamiseksi ja BMP-11-proteiinien käytölle in vitro on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksissa.
Esillä olevan keksinnön muut piirteet ja edut ovat ilmeisiä seuraavan yksityiskohtai-15 sen kuvauksen j a keksinnön edullisten suoritusmuotojen perusteella.
Sekvenssien kuvaus • · · • · · ’·' 1 SEQ ID NRO 1 on naudan BMP-11 :n osittainen nukleotidisekvenssi, johon on koo- ··· · 20 dautunut kypsä naudan BMP-11-polypeptidi.
··· * · · · • · ♦ · · • · · I2 3 4.1 SEQ ID NRO 2 on SEQ ID NRO 1-sekvenssiin koodautuneen osittaisen propeptidin • · · • · · ja naudan täydellisen kypsän BMP-11 -polypeptidin aminohapposekvenssi.
• · · 25 SEQ ID NRO 3 on ihmisen BMP-11 :n osittainen nukleotidisekvenssi.
• · 1 • · • · · • · • · • · · .·. SEQ ID NRO 4 on ihmisen BMP-11-polypeptidin osittainen aminohapposekvenssi, • · · * 1 1 *.joka on koodautunut SEQ ID NRO 3-sekvenssiin.
• · • · • · · · · 2 '•j·1 30 SEQ ID NRO 5 ja 6 ovat naudan BMP-1 l:een sopivia alukkeita, joita on käytetty 3 • » 4 ihmisen BMP-11 :n tai muiden BMP-11-proteiinien eristämiseksi.
10 SEQ ID NRO 7 on DNA-sekvenssi, joka on istutettu pMT2 CXM-plasmidiin Xhol-tunnistuskohdan lisäämiseksi SV40-replikaation alkamiskohdan läheisyyteen.
5 SEQ ID NRO 8 on DNA-sekvenssi, joka on istutettu pMT21-plasmidiin Xhol-tunnistuskohdan istuttamiseksi ennen DHFR-geeniä.
SEQ ID NRO 9 on DNA-sekvenssi, joka käsittää osan ECM-viruksen johtosekvens-sistä.
10 SEQ ID NRO 10 on DNA-sekvenssi, johon on koodautunut osittainen propeptidi sekä ihmisen täydellinen kypsä BMP-11-proteiini.
SEQ ID NRO 11 on SEQ ID NROlO-sekvenssiin koodautuneen osittaisen propepti-15 din ja ihmisen täydellisen kypsän BMP-11 -polypcptidin aminohapposekvenssi.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus ··· v : BMP-11 ··· · * * 20 • · · •••j Naudan BMP-ll:n nukleotidisekvenssi (SEQ ID NRO 1) ja siihen koodautunut • · · *·*/ aminohapposekvenssi (SEQ ID NRO 2) sekä ihmisen BMP-11 :n nukleotidisekvens- • · ·
si (SEQ ID NRO 10) sekä siihen koodautunut aminohapposekvenssi (SEQ ID NRO
• · · • · · 11) on esitetty oheisessa sekvenssiluettelossa. Puhdistettuja naudan BMP-11-
. . 25 proteiineja valmistetaan keksinnön mukaisesti viljelemällä tunnuksella SEQ ID
• ' · NRO 1 esitetyn koodaavan DNA-sekvenssin nukleotidit 375-704 tai tunnuksella • · SEQ ID NRO 10 esitetyn koodaavan DNA-sekvenssin nukleotidit 760-1086 käsittä- • · · ·*·* väliä DNA-sekvenssillä transformoitua isäntäsolua ja ottamalla talteen ja puhdis- • · • · *** tamalla viljelyalustasta proteiini, joka sisältää tunnuksella SEQ ID NRO 2 esitetyn 30 sekvenssin mukaiset aminohapot 1-109 tai tunnuksella SEQ ID NRO 11 esitetyn • · · • · 1 sekvenssin mukaiset aminohapot 1-109 käsittävän aminohapposekvenssin tai sen 11 kanssa olennaisesti homologisen sekvenssin. BMP-11-proteiinien tuottamiseksi nisä-kässoluissa tämä DNA-sekvenssi käsittää lisäksi sopivan propeptidin kytkettynä kehykseen edellä mainittujen BMP-11 :tä koodaavien DNA-sekvenssien kanssa. Tämä propeptidi voi olla BMP-11 :n luonnollinen propeptidi tai TGF-B-pääryhmän toi-5 sesta jäsenestä peräisin oleva propeptidi.
Esillä olevan keksinnön mukainen ihmisen BMP-11-sekvenssi saadaan käyttäen koettimena kokonaista naudan BMP-11 DNA-sekvenssiä tai sen kappaleita tai tunnuksella SEQ ID NRO 3 esitettyä ihmisen osittaista BMP-11-sekvenssiä. Niinpä 10 ihmisen BMP-11 DNA-sekvenssi käsittää SEQ ID NRO 3-sekvenssin nukleotideistä 28-185 koostuvan DNA-sekvenssin. Ihmisen BMP-11-proteiini käsittää SEQ ID NRO 4-sekvenssin aminohapoista 1-52 koostuvan aminohapposekvenssin.
On odotettavaa, että BMP-11, joka on ilmennetty nisäkässoluissa kuten CHO-15 soluissa, esiintyy BMP-11-proteiinin aktiivisten lajien, joiden N-pääte vaihtelee, heterogeenisena populaationa. On odotettavaa, että aktiiviset lajit käsittävät aminohapposekvenssin, joka alkaa SEQ ID NRO 1-sekvenssin tai SEQ ID NRO 10-sekvenssin aminohapon 6 kohdasta vähintään kysteiinijäännöksellä tai kauempaa N- • ♦ · • · · * . päätteen suuntaan siirtyen. Näin ollen on odotettavissa, että aktiivisia BMP-11- • · . 20 proteiineja koodaavat DNA-sekvenssit käsittävät SEQ ID NRO 1-sekvenssin nuk- • ♦ ♦ !**! leotidit 375 tai 390-701 tai SEQ ID NRO 10-sekvenssin nukleotidit 760 tai 775- • · · • · · |’V 1086, ja se voi käsittää ylimääräisen nukleotidisekvenssin SEQ ID NRO 1- • · ♦ ” V sekvenssin tai SEQ ID NRO 10-sekvenssin 5'-suunnassa.
• · · 25 Ihmisen BMP-11 :n N-pääte on määritetty kokeellisesti E. co//:ssa ilmentämällä seu- • · · • · .·*·. raavasti: [MJNLGLDXDEHSSE, missä X tarkoittaa aminohappojäännöstä, jolla ei • · · ole selvää signaalia, mikä on yhtäpitävää sen kanssa, että kysteiini sijaitsee tässä • · · • · ·
V asemassa. Niinpä on odotettavaa, että tämän BMP-11-lajin N-pääte on SEQ ID NRO
’·’ 1- tai SEQ ID NRO 10-sekvenssin aminohapon 1 kohdalla, ja tätä lajia koodaavat • · ·
*· j·* 30 DNA-sekvenssit käsittävät SEQ ID NRO 1 :n nukleotidit 375-701 (nauta) tai SEQ ID
*·· NRO 10:n nukleotidit 760-1086 (ihminen). Ihmisen BMP-11-monomeerin ilmei- 12 seksi molekyylipainoksi määritettiin SDS-PAGE-menetelmällä noin 12 kd. Ihmisen BMP-11-proteiini esiintyy kirkkaana, värittömänä liuoksena 0,1 % trifluorietikkaha-possa.
5 Viljelyalustasta talteen otetut BMP-11-proteiinit puhdistetaan eristämällä ne muista proteiinimaisista materiaaleista, joiden kanssa niitä tuotettiin yhdessä, sekä muista läsnä olevista kontaminanteista.
BMP-11-proteiinien tunnusomaiseksi piirteeksi voidaan esittää niiden kyky säädellä 10 FSH-tuotantoa. BMP-11-proteiinien tunnusomaiseksi piirteeksi voidaan edelleen esittää niiden kyky muokata follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) vapautumista vakiintuneissa biologisissa in vitro -määrityksissä, joissa käytetään rotan aivolisäkkeen etulohkon soluja kuvatulla tavalla [katso esim. Vale et ai., Endocrinology, 91:562-572 (1972); Ling et ai., Nature, 321:779-782 (1986), tai Vale et ai., Nature, 15 321:776-779 (1986)]. BMP-11-proteiinien tunnusomaiseksi piirteeksi voidaan myös esittää niiden kyky indusoida luun, ruston ja/tai muun sidekudoksen muodostumista. BMP-1 l:n tällaisen kudosta indusoivan aktiivisuuden tunnusomaiseksi piirteeksi voidaan esittää lisäksi kyky indusoida luun, ruston ja/tai muun sidekudoksen muo- • · · * * dostumista j älj empänä olevissa esimerkeissä kuvatuissa kokeissa.
• · 20 • · ·
Ohessa aikaansaadut BMP-11-proteiinit sisältävät myös SEQ ID NRO 1- ja SEQ ID
• « » • · · NRO 10 -sekvenssien kaltaisten sekvenssien koodaamia tekijöitä, mutta jotka ovat • · · muokkautuneet luonnollisella tavalla (esim. alleeliset muunnokset nukleotidisek- • · · venssissä, jotka muunnokset voivat johtaa polypeptidissä aminohappomuutoksiin) 25 tai joita on muokattu tarkoituksellisesti. Esimerkiksi synteettisissä polypeptideissä • · · .···. voi toistua täydellisesti tai osittain SEQ ID NRO 2- tai SEQ ID NRO 11-sekvenssin • · • · · .*. aminohappojäännösten jatkuvat sekvenssit. Koska näillä sekvensseillä on samankal- • · · • · · 1/. täiset, primääriin, sekundääriseen tai tertiääriseen rakenteeseen ja konformaatioon '** liittyvät tunnusomaiset piirteet kuin SEQ ID NRO 2- tai SEQ ID NRO 11-sek- • · · *·|·* 30 venssien mukaisilla inhibiini-B-polypeptideillä, niin niillä voi olla niiden kanssa sa- • · • · • 1« 13 mankaltaista BMP-11-aktiivisuutta. Niinpä niitä voidaan käyttää luonnossa esiintyvien BMP-11-polypeptidien biologisesti aktiivisina korvikkeina hoitoprosesseissa.
Ohessa kuvattujen BMP-11-proteiinien sekvensseissä esiintyviin muihin erityisiin 5 mutaatioihin liittyy glykosylaatiokohtien muokkautumista. Näitä muokkauksia voi esiintyä O-kytkeytyneissä tai N-kytkeytyneissä glykosylaatiokohdissa. Esimerkiksi glykosylaation puuttuminen tai ainoastaan osittainen glykosylaatio on aminohapon korvautumisen tai häviämisen seuraus asparagiiniin kytketyssä glykosylaation tun-nustamiskohdissa. Nämä asparagiiniin kytketyt glykosylaation tunnistamiskohdat 10 käsittävät tripeptidisekvenssejä, jotka solun asianmukaiset glykosylaatioentsyymit tunnistavat spesifisesti. Nämä tripeptidisekvenssit ovat joko asparagiini-X-treoniini tai asparagiini-X-seriini, missä X on tavallisesti mikä tahansa aminohappo. Erilaiset aminohappokorvautumiset tai -häviämät, joita esiintyy glykosylaation tunnistamis-kohdan joko ensimmäisessä tai kolmannessa aminohappoasemassa tai niissä molem-15 missä (ja/tai toisessa asemassa esiintyvä aminohapon häviämä), johtavat glykosylaation puuttumiseen muokkautuneessa tripeptidisekvenssissä. Lisäksi BMP-11-proteiinin ilmentyminen bakteerisoluissa johtaa glykosyloitumattomaan proteiiniin gly- .,. kosylaation tunnistamiskohtia muuttamatta.
• · · • · ·
Ml · • · . 20 Esillä oleva keksintö kohdistuu myös uusiin DNA-sekvensseihin, joihin ei ole liitty- nyt muita proteiinimaisia materiaaleja koodaavia DNA-sekvenssejä, ja jotka koo- • · · ; / daavat BMP-11-proteiinien ilmentymistä. Näistä DNA-sekvensseistä voidaan maini- • · · ta tunnuksilla SEQ ID NRO 1 tai SEQ ID NRO 10 esitetyt sekvenssit suunnassa 5' -- lii > 3', sekä sellaiset sekvenssit, jotka hybridisoituvat näihin sekvensseihin tarkoin raja-25 tuissa hybridisointiolosuhteissa, esimerkiksi 0,1 x SSC, 0,1 % SDS 65 °C:ssa [katso • ·
Maniatis et ai., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor • · · ,·*.. Laboratory (1982), sivut 387-389], ja jotka koodaavat sellaista proteiinia, jolla on • · · • · .···. BMP-11-aktiivisuutta. Näihin DNA-sekvensseihin kuuluvat myös ne, jotka käsittä- • · • · · *. vät tunnuksella SEQ ID NRO 3 esitetyn DNA-sekvenssin, sekä ne, jotka hybridisoi- I I « • · · I “ 30 tuvat niihin tarkoin rajatuissa hybridisointiolosuhteissa, j a jotka koodaavat proteiinia, • · jo 11a on BMP-11 -aktiivisuutta.
14
Samoin ne DNA-sekvenssit, jotka koodaavat SEQ ID NRO 1- tai SEQ ID NRO 10 -sekvenssien koodaamia BMP-11-proteiineja, mutta joiden kodonisekvenssit eroavat toisistaan geneettisen koodin degeneroitumisen tai alleelisten muunnosten seurauk-5 sena (luonnostaan esiintyvät emäsmuutokset lajipopulaatiossa, jotka muutokset johtavat tai eivät johda aminohappomuutokseen), koodaavat ohessa kuvattuja uusia tekijöitä. Keksinnön piiriin kuuluvat myös tunnuksella SEQ ID NRO 1 tai SEQ ID NRO 10 kuvatuissa DNA-sekvensseissä esiintyvät muunnokset, jotka johtuvat pis-temutaatioista tai indusoiduista muokkauksista (mukaan lukien istutus, häviämä ja 10 korvaus) koodautuneiden polypeptidien aktiivisuuden, puoliintumisajan tai tuotannon parantamiseksi.
Esillä olevan keksinnön eräänä muuna piirteenä on uusi menetelmä BMP-11-proteiinien tuottamiseksi. Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä viljellään so-15 pivaa solulinjaa, joka on transformoitu keksinnön mukaista BMP-11-proteiinia koo-daavalla, tunnettujen säätelevien sekvenssien alaisuudessa olevalla DNA-sekvens-sillä. Transformoituja isäntäsoluja viljellään ja BMP-11-proteiinit otetaan talteen ja puhdistetaan viljelyalustasta. Nämä puhdistetut proteiinit eivät sisällä olennaisesti • · · * * * * . muita proteiineja, joiden kanssa niitä tuotettiin yhdessä, eikä muita kontaminantteja.
• · · · • · 20 • · ·
Sopivat solut tai solulinjat voivat olla nisäkässoluja, joista voidaan mainita kiinan- • · · Γ V hamsterin munasaijasolut (CHO). Sopivien, isäntänä toimivien nisäkässolujen valin- • · · ['· ·· [ ta sekä transformointi-, viljely-, monistus-, seulonta-, tuotteen tuotanto- ja puhdistus- • · · menetelmät ovat tunnettuja alalla. Katso esim. Gething ja Sambrook, Nature, 25 293:620-625 (1981), tai vaihtoehtoisesti Kaufman et ai, Mol. Cell. Biol., 5(7):1750- • · .···. 1750 (1985), tai Howley et ai., US-patenttijulkaisu 4 419 446. Toinen sopiva, ohei- • · · .*. sissa esimerkeissä kuvattu nisäkässolulinja on apinan COS-l-solulinja. Nisäkässolu • · · I.! CV-1 voi olla myös sopiva.
• · · « • · « 30 Bakteerisolut voivat olla myös sopivia isäntiä. Esimerkiksi eri E. coli -kannat (esim. ’** HB101, MC1061) ovat biotekniikassa hyvin tunnettuja isäntäsoluja. Tässä menetel- 15 mässä voidaan myös käyttää eri B. subtilis-, Pseudomonas- tai muita basillikantoja ja muita vastaavia.
Monia alan asiantuntijalle tuttuja hiivasolukantoja voidaan myös käyttää isäntäsolui-5 na esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä polypeptidien valmistamiseksi. Lisäksi toivottaessa hyönteissoluja voidaan käyttää isäntäsoluina esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä. Katso esim. Miller et ai, Genetic Engineering, 8:277—298 (Plenum Press 1986) sekä edellä mainitut kirjallisuusviitteet.
10 Esillä olevan keksinnön erään muun piirteen mukaisesti aikaan on saatu vektorit, joita voidaan käyttää menetelmässä näiden uusien BMP-11-polypeptidien ilmentämiseksi. Nämä vektorit sisältävät edullisesti edellä kuvatut uudet BMP-proteiineja koodaavat DNA-sekvenssit kokonaan. Lisäksi vektorit sisältävät sopivia ilmentymistä sääteleviä sekvenssejä, jotka tekevät mahdolliseksi BMP-ll-proteiinisekvens-15 sien ilmentämisen. Esillä oleva keksintö kattaa myös vaihtoehtoisesti ne vektorit, jotka sisältävät edellä kuvattuja muokkautuneita sekvenssejä. Lisäksi SEQ ID NRO 1- tai SEQ ID NRO 10 -sekvenssiä tai muita, BMP-11-proteiineja koodaavia sek- ... venssejä on voitu manipuloida siten, että ne ilmentävät kypsää BMP-11-proteiinia, • · · • · · hävittämällä BMP-ll:tä koodaavat propeptidisekvenssit ja korvaamalla ne muiden • · · « • · 20 BMP-proteiinien, aktiviiniproteiinien tai TGF-B-pääryhmän muiden jäsenten täydel- j * ' lisiä propeptidej ä koodaavilla sekvensseillä.
• ♦ · ··· · • · • · · • · · • · ♦ · Näitä vektoreita voidaan käyttää solulinjojen transformoimiseksi ja ne sisältävät va- • · · liituja sääteleviä sekvenssejä liitettyinä toimivasti keksinnön mukaisiin koodaaviin 25 DNA-sekvensseihin, jotka säätelevät sekvenssit kykenevät ohjaamaan koodaavien • · DNA-sekvenssien replikaatiota ja ilmentymistä valituissa isäntäsoluissa. Tällaisiin • · · vektoreihin sopivat säätelevät sekvenssit ovat tuttuja alan asiantuntijalle ja ne voi- • · · .···, daan valita isäntäsoluista riippuen. Tällainen valikointi on rutiinitoimenpide eikä se • · • · · • ^ ole esillä olevan keksinnön osa.
30 ··· • · • φ *·· 16
Isäntänä toimivissa nisäkässoluissa ilmentämistä varten vektorit voivat käsittää koo-daavan sekvenssin, jonka koodaaman propeptidin avulla isäntäsolu kykenee erittämään proteiineja, ja joka on kytketty sopivassa lukukehyksessä kypsää BMP-11-proteiinia koodaavaan sekvenssiin. Sopivia propeptidiä koodaavia sekvenssejä voidaan 5 saada proteiinien TGF-B-pääryhmään kuuluvia proteiineja, esimerkiksi BMP-2 -BMP-9-proteiineja koodaavasta DNA:sta. Katso esimerkiksi US-patenttijulkaisu 5 168 150, jonka sisältö liitetään täten oheen tällä viittauksella, ja jossa nisäkäsprote-iinin, joka on muu kuin BMP-2, esiasteosaa koodaava DNA on fuusioitu kypsää BMP-2-proteiinia koodaavaan DNA.han. Näin ollen esillä oleva keksintö kattaa 10 kimeeriset DNA-molekyylit, jotka käsittävät proteiinien TGF-B-pääryhmään kuuluvasta jäsenestä peräisin olevaa propeptidiä koodaavan DNA-sekvenssin kytkettynä oikeassa lukukehyksessä BMP-11-polypeptidiä koodaavaan DNA-sekvenssiin. Käsitteellä "kimeerinen" tarkoitetaan sitä, että propeptidi on peräisin muusta poly-peptidistä kuin BMP-11 :stä.
15
Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettua proteiinia, joka säätelee FSH:n tuotantoa, voidaan käyttää mahdollisesti hedelmällisyyden parantamiseen, kun sen ilmentynyt koostumus on homodimeeri tai muiden inhibiini-B-perheen proteiinien • · · *** ] kanssa muodostunut heterodimeeri. Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettuja • · · · . 20 proteiineja voidaan myös käyttää raskauden ehkäisyyn, kun sen ilmentynyt koostu- • · · I'" mus on inhibiini-a-perheen proteiinien kanssa muodostunut heterodimeeri.
• · · • ♦ · ··· · * · • · · • · · '!!/ Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettua proteiinia, joka indusoi ruston ja/tai • · · luun muodostumista sellaisissa olosuhteissa, joissa luu ei muodostu normaalisti, voi-25 daan käyttää iuumurtumien ja rustovaurioiden parantamiseksi ihmisessä ja muissa • · · • · ,···. eläimissä. BMP-11-proteiinia sisältävää valmistetta voidaan käyttää ennal- • · • · · taehkäisevästi vähentämään umpimurtumia sekä avoimia murtumia sekä myös pa- • · · • · · rantamaan tekonivelten kiinnittymistä. Luuta synnyttävän aineen indusoima uuden • · luun muodostuminen myötävaikuttaa synnynnäisten, vammasta johtuvien tai syövän • · · **j·* 30 seurauksena tehdystä poistoleikkauksesta johtuvien kallo-kasvovikojen koqautumi- • · **** seen, ja sitä voidaan myös käyttää kosmeettisessa plastiikkakirurgiassa. BMP-11- 17 proteiinia voidaan käyttää hampaan ympäryskudoksen sairauksien hoitamiseen sekä muissa hampaiden korjaustoimenpiteissä. Tällaisten aineiden avulla voidaan saada aikaan ympäristö, joka vetää puoleensa luuta muodostavia soluja, joka kiihottaa luuta muodostavien solujen kasvua tai indusoi luuta muodostavien solujen emosolujen 5 erilaistumista. Keksinnön mukaisesti valmistettuja BMP-11-polypeptidejä voidaan myös käyttää luukadon (osteoporoosin) hoitoon. Alalla on kuvattu erilaisia luuta synnyttäviä, rustoa indusoivia ja luuta indusoivia tekijöitä. Niitä on tarkasteltu esim. eurooppalaisissa patenttihakemuksissa 148 155 ja 169016.
10 Keksinnön mukaisesti valmistettuja proteiineja voidaan myös käyttää haavan hoidossa ja vastaavissa kudoskorjaukeissa. Erilaisista haavatyypeistä voidaan mainita palohaavat, viiltohaavat ja haavaumat, näihin kuitenkaan rajoittumatta (haavan paranemista ja vastaavia kudoskoijauksia on tarkasteltu PCT-patenttijulkaisussa W084/01106).
15
Keksinnön mukaisesti valmistettuja BMP-11-proteiineja voidaan käyttää hoitomenetelmässä ja koostumuksissa murtumien ja muiden rusto- ja/tai luuvaurioihin tai hampaan ympäryskudoksen sairauksiin liittyvien tilojen korjaamiseksi, samoin hoitome- • · · *·* * netelmässä ja koostumuksissa haavan parantamiseksi ja kudoksen korjaamiseksi.
• · · · 20 Tällaiset koostumukset käsittävät hoidon kannalta tehokkaan määrän vähintään yhtä »«· *"* keksinnön mukaisesti valmistettua BMP-11-proteiinia sekoitettuna farmaseuttisesti • · · • · · ***.’ hyväksyttävään kuljettuneen, kantajaan tai matriisiin.
• · · • · · • · · · • · · • · · • · · Tällainen valmiste, jossa käytetään BMP-11 -proteiinia, voi myös lisätä hermosolujen • ^ 25 elossapysymistä ja tästä syystä se voi olla käyttökelpoinen elinsiirroissa sekä hoidet- • · · • · . · · ·, taessa tiloj a, joihin liittyy hermosoluj en heikentynyttä elossapysymistä.
«M
• · « · · • · · *.* On odotettavaa, että keksinnön mukaisesti valmistetut BMP-11-proteiinit voivat 7 toimia yhdessä tai jopa synergistisesti muiden samankaltaisten proteiinien ja kasvu- • · · '·!' 30 tekijöiden kanssa. Näin ollen muut menetelmät ja koostumukset käsittävät hoitavan • · · *···* määrän vähintään yhtä keksinnön mukaisesti valmistettua BMP-11-proteiinia sekä 18 hoitavan määrän vähintään yhtä muuta sellaista BMP-proteiinia tai muuta kasvutekijää, joka on kuvattu edellä mainituissa, saman omistajan patenttijulkaisuissa ja -hakemuksissa. Tällaiset yhdistelmät voivat käsittää erillisiä molekyylejä tai eri osista muodostuvia heteromolekyylejä. Esimerkiksi menetelmä ja koostumus voivat 5 käsittää disulfidikytketyn dimeerin, jossa on BMP-11-proteiinista muodostuva alayksikkö ja inhibiini-a-proteiinista, inhibiini-h-proteiinista tai BMP-proteiinista, esimerkiksi BMP-1 - BMP-10-proteiinista peräisin oleva alayksikkö. Aineista, joita voidaan käyttää yhdessä BMP-1 l:n kanssa, voidaan mainita erilaiset kasvutekijät kuten orvaskeden kasvutekijä (EGF), verihiutaleista peräisin oleva kasvutekijä 10 (PDGF), transformoivat kasvutekijät (TGF-α ja TGF-β) sekä insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF). Muut hoitomenetelmät ja koostumukset käsittävät hoitavan määrän vähintään yhtä keksinnön mukaisesti valmistettua BMP-11-proteiinia sekä hoitavan määrän vähintään yhtä sellaista BMP-proteiinia, joka on kuvattu edellä mainituissa, saman omistajan patenttijulkaisuissa ja -hakemuksissa. Tällaiset yhdistelmät 15 voivat käsittää BMP-proteiinien erillisiä molekyylejä tai heteromolekyylejä, jotka ovat muodostuneet eri BMP-osista. Esimerkiksi menetelmä ja koostumus voivat käsittää disulfidikytketyn dimeerin, jossa on BMP-11-proteiinista muodostuva alayksikkö sekä jostakin edellä kuvatusta "BMP"-proteiinista peräisin oleva alayksikkö.
« · · *·* ] Niinpä esillä oleva keksintö kattaa menetelmän puhdistetun BMP-ll-polypeptidin ««« « 20 valmistamiseksi, joka peptidi on heterodimeeri, jossa yksi alayksikkö käsittää vähin- ··· **** tään tunnuksella SEQ ID NRO 2 tai SEQ ID NRO 11 esitetyn sekvenssin aminoha- • · · • · ♦ ** V poista 1-109 muodostuvan aminohapposekvenssin, ja jossa yksi alayksikkö käsittää • · · proteiiniryhmästä BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP- • · · 8 ja BMP-9 valitun, luun morfogeneettisen proteiinin aminohapposekvenssin. Jokin 25 muu suoritusmuoto voi käsittää BMP-11-osista muodostuvan heterodimeerin. Edel- « · · • ♦ .···. leen, BMP-11-proteiineja voidaan yhdistää muihin sellaisiin aineisiin, jotka ovat ··· .·. edullisia luu- ja/tai rustovaurioiden, haavan tai kyseessä olevan kudoksen hoidolle.
• · · ♦ « · *.* Näistä aineista voidaan mainita erilaiset kasvutekijät kuten orvaskeden (epidermin) kasvutekijä (EGF), fibroblastien kasvutekijä (FGF), verihiutaleista peräisin oleva 30 kasvutekijä (PDGF), transformoivat kasvutekijät (TGF-α ja TGF-β) sekä k-*···* fibroblastin kasvutekijä (kFGF), lisäkilpirauhashormoni (PTH), leukemiaa inhiboiva 19 tekijä (LIF/HILDA/DIA), insuliinin kaltaiset kasvutekijät (IGF-I ja IGF-II). Näiden aineiden osia voidaan myös käyttää keksinnön mukaisesti valmistettuja BMP-11-proteiineja sisältävissä koostumuksissa.
5 Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettuja BMP-11-proteiineja voidaan myös käyttää koostumuksissa yhdessä luun morfogeneettisten proteiinien kanssa. Katso esim. Ogawa et ai, WO 92/14481 (1992); Ogawa et ai, J. Biol. Chem., 267:14233-14237 (1992). Näissä koostumuksissa käyttökelpoisia luun morfogeneettisiä proteiineja ovat BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 ja BMP-7, jotka on 10 kuvattu esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa 5 108 922; 5 013 649; 5 116 738; 5 106 748; 5 187 076; sekä 5 141 905; BMP-8, joka on kuvattu PCT-julkaisussa WO91/19089; sekä BMP-9, joka on kuvattu PCT-julkaisussa W093/00432, sekä BMP-10, joka on kuvattu samanaikaisesti vireillä olevassa, 12. toukokuuta 1993 jätetyssä patenttihakemuksessa, jonka saijanumero on 08/061 695.
15 Tällaisten fysiologisesti hyväksyttävien proteiinikoostumusten valmistus ja sopivaan muotoon saattaminen, kiinnittäen asianmukaista huomiota pH-arvoon, stabiilisuu-teen ja muihin vastaaviin, ovat alan asiantuntijan kykyjen mukaista. Nämä hoitavat • · · *·* ] koostumukset ovat tällä hetkellä myös arvokkaita eläinlääketieteellisissä sovellutuk- • * · · 20 sissa, koska BMP- ja TGF-proteiineilta puuttuu lajispesifisyys. Erityisesti kotieläi- ··· "" met ja rotuhevoset ovat ihmisten lisäksi toivottavia potilaita tällaisessa hoidossa, • · · • · · jossa käytetään esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettua BMP-11 -proteiinia.
• · · • · · • · · · • · · • · · • · ·
Hoitomenetelmässä koostumusta annetaan ulkoisesti, systeemisesti tai paikallisesti • · 25 siirrännäisenä tai laitteena. Kun tällaista hoitavaa koostumusta annetaan, niin se on * · · ,···. luonnollisestikin pyrogeenittomassa ja fysiologisesti hyväksyttävässä muodossa.
• · • · · ,·. Edelleen, koostumus voidaan toivottaessa kapseloida tai injektoida viskoosissa muo- • · ♦ • · » 1,1 dossa sen viemiseksi vaurioituneeseen luu-, rusto- tai kudoskohtaan. Ulkoinen käyttö • · • · "* voi sopia haavan parantamiseen ja kudoksen koijaamiseen. Näissä menetelmissä • · · ’···* 30 hoidon kannalta käyttökelpoisia, BMP-11-proteiineista eroavia aineita, joita voidaan • · *···* myös valinnaisesti sisällyttää koostumukseen edellä kuvatulla tavalla, voidaan vaih- 20 toehtoisesti tai lisäksi antaa samanaikaisesti tai peräkkäin BMP-11-koostumuksen kanssa.
Luun, ruston tai muun sidekudoksen muodostuksen kannalta on edullista, että koos-5 tumus käsittää matriisin, joka kykenee viemään BMP-11- tai muut BMP-proteiinit hoitoa tarvitsevan kudoksen vaurioituneeseen kohtaan, ja joka toimii kehittyvän luun ja ruston rakenteena, ja joka optimaalisessa tapauksessa voi imeytyä elimistöön. BMP-11 ja/tai muu luuta indusoiva proteiini voi vapautua hitaasti tästä matriisista ja tämä matriisi voi saada aikaan asianmukaisen tilan ja sopivan ympäristön solun si-10 sään tihkumista varten. Tällaisia matriiseja voidaan muodostaa materiaaleista, joita käytetään tällä hetkellä muissa lääketieteellisissä siirrännäissovellutuksissa.
Matriisimateriaalin valinta perustuu biologiseen yhteensopivuuteen, biologiseen ha-joavuuteen, mekaanisiin ominaisuuksiin, kosmeettiseen ulkonäköön ja rajapinta-15 ominaisuuksiin. BMP-11-koostumusten erityinen käyttösovellutus määrää sopivan matriisimuodon. Näissä koostumuksissa käyttökelpoiset matriisit voivat olla biologisesti hajoavia ja kemiallisesti määriteltyä kalsiumsulfaattia, trikalsiumfosfaattia, hyd-roksiapatiittia, polymaitohappoa ja polyanhydridejä. Muut mahdolliset materiaalit • · · * # ovat biologisesti hajoavia ja biologisesti hyvin määriteltyjä, kuten luun, jänteiden tai • · · · • · . 20 ihon kollageeni. Muut matriisit muodostuvat puhtaista proteiineista tai solun uiko- • · » i".' puolisista matriisikomponenteista. Muut mahdolliset matriisit ovat biologisesti ha- • · · • · · J* V joamattomia ja kemiallisesti määriteltyjä ja niistä voidaan mainita sintrattu hydrok- • · · ]···] siapatiitti, biolasi, aluminaatit tai muut keraamit. Matriisit voivat koostua mitä tähän- » · « • ...
sa edellä mainittuja erilaisia materiaaleja sisältävistä yhdistelmistä, joista voidaan 25 mainita polymaitohapon ja hydroksiapatiitin tai kollageenin ja trikalsiumfosfaatin • · » • · .*··, yhdistelmät. Biokeraamien koostumusta voidaan muuttaa esimerkiksi kalsium- ··· .*. aluminaatti-fosfaatiksi ja niitä voidaan käsitellä huokoskoon, hiukkaskoon, hiuk- • ♦ · • · · kasmuodon ja biologisen hajoavuuden muuttamiseksi.
• · ··· • * · • * · ··« ··· * · • « ··· 21
Edistymistä voidaan seurata määrittämällä säännöllisin väliajoin luun kasvu ja/tai korjautuminen. Tätä edistymistä voidaan seurata esimerkiksi röntgensäteillä, histo-morfometrisillä määrityksillä ja tetrasykliinillä merkitsemällä.
5 Hoitava lääkäri määrittää annoskoon ottamalla huomioon ne erilaiset tekijät, joilla on vaikutusta BMP-11-proteiinin vaikutukseen, ja joista voidaan mainita potilaan ikä, sukupuoli ja ruokavalio, mahdollisen infektion vakavuus, antamisen ajankohta sekä muut kliiniset tekijät. Annostelu voi vaihdella koostumuksessa läsnä olevan BMP-proteiinin tai kasvutekijän tyypistä riippuen. Annostus voi myös vaihdella käytetyn 10 matriisityypin mukaan.
Seuraavat esimerkit havainnollistavat esillä olevan keksinnön toteuttamista käytännössä ajatellen naudan BMP-11-proteiinin talteen ottamista ja tunnusomaisten piirteiden selvittämistä sekä sen käyttämistä ihmisen ja muiden BMP-11-proteiinien tal-15 teen saamiseksi, ihmisproteiinien saamista ja proteiinien ilmentämistä yhdistelmä-DNA-tekniikoilla.
Esimerkki 1 ··· • · · • · · : 20 Naudan BMP-11 ··· ···· • · • · · j·· ' 800 000 geneettistä yhdistelmää ("rekombinanttia"), jotka saatiin lambdaEMBL3- • · · "·,/ vektoriin muodostetusta naudan perimäkirjastosta, maljattiin 100 maljalle tiheydeksi • · · • · · * 8000 yhdistelmä-DNA-teknistä bakteriofaagiplakkia yhtä maljaa kohden. Näistä . . 25 maljoista muodostettiin yhdistelmä-DNA-teknisten bakteriofaagiplakkien toistetut • · · • · · !.! nitroselluloosakopiot ja ne monistettiin. Ihmisen BMP-7 DNA-kappale, joka vastaa • · nukleotidejä 1081-1403 (kuvio 4, US-patenttijulkaisu 5 141 905) 32P-merkittiin • · · *·[·* Feinbergin et ai. satunnaisalukemenetelmällä [Anal. Biochem. 132:6-13 (1983)] ja • · **· hybridisoitiin suodatinjoukkoon tavanomaisessa hybridisaatiopuskurissa (SHB) (5x ·.!.· 30 SSC, 0,170 SDS, 5x Denhardt's, 100 μg/ml lohen sperman DNA) 60 °C:ssa 2-3 vuo- • ·· • · *···* rokautta. Suodattimet pestiin vähemmän rajatuissa olosuhteissa (4 x SSC, 0,1 % 22 SDS 60 °C:ssa). Lukuisia positiivisesti hybridisoituvia rekombinantteja todettiin. 52 positiivisesti hybridisoituvaa yhdistelmä-DNA-teknistä bakteriofaagiplakkia valittiin ja ne maljattiin uudestaan sekundaarimaljojen tuottamiseksi. Näiden yhdistelmä-DNA-teknisten plakkien toistetut nitroselluloosakopiot tehtiin näistä 52 sekundaari-5 maljasta ja ne monistettiin. Yksi nitroselluloosasuodattimien joukko hybridisoitiin ihmisen BMP-7 DNA-koettimeen edellä kuvatulla tavalla ja suodattimet huuhdottiin samoissa, vähemmän rajatuissa olosuhteissa. Toinen suodatinjoukko hybridisoitiin BMP-5-, BMP-6- ja BMP-7-sekakoettimeen SHB:ssä 65 °C:ssa yön yli ja huuhdottiin olosuhteissa 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, 65 °C:ssa (tarkoin rajatut hybridisaatio- ja 10 huuhteluolosuhteet). Tämä sekakoetin koostuu suhteellisen samansuuruisista määristä 32P-merkittyjä DNA-kappaleita, jotka käsittävät nukleotidit 1452-2060 (kuvio 4, US-patenttijulkaisu 5 106 748) ihmisen BMP-5-sekvenssistä, nukleotidit 1395-1698 (kuvio 4, US-patenttijulkaisu 5 187 076) ihmisen BMP-6-sekvenssistä sekä nukleotidit 1081-1403 (kuvio 4, US-patenttijulkaisu 5 141 905) ihmisen BMP-7-sekvenssis-15 tä. Nämä BMP-5-, BMP-6- ja BMP-7 DNA-kappalcct 32P-merkittiin satunaisaluke-menetelmällä ja yhtä suuret lukumäärät impulsseja minuutissa (counts per minute; cpm) kutakin koetinta yhdistettiin ja lisättiin SHB:hen, joka sisälsi toisen joukon nit-roselluloosasuodatinkopioita näistä 52 sekundaarimaljasta. Lisäanalyysiä varten va-Iittiin 14 rekombinanttia, jotka hybridisoituivat positiivisesti ihmisen BMP-7-koetti- •j. 20 meen vähemmän rajatuissa olosuhteissa ja jotka hybridisoituivat heikosti tai ei lain- • · · · • kaan BMP-5/6/7-sekakoettimeen tarkoin rajatuissa olosuhteissa. Kaikki 14 rekombi- • · · · • nanttia, joilla todettiin nämä hybridisaatioon liittyvät tunnusomaiset piirteet, plakki- • · · · puhdistettiin ja kustakin valmistettiin bakteriofaagi-DNA:ta. Näistä 14 rekombinan-tista, joilla todettiin edellä kuvatut hybridisaatioon liittyvät tunnusomaiset piirteet, • » 25 yhdessä oleva positiivisesti hybridisoituva alue, josta käytetään nimitystä lamb- • · · da7r30, on paikannettu 0,5 kb:n suuruiseen Sacl-restriktiokappaleeseen. Tämä kap-pale alikloonattiin plasmidivektoriin (pGEM-3) ja DNA-sekvenssi analysoitiin.
• · :***; Lambda7r-30-kloonin osittainen DNA-sekvenssi (SEKVENSSI ID NRO 1) ja pää- • · · . !·. telty aminohapposekvenssi (SEKVENSSI ID NRO 2) on esitetty sekvenssiluette- • · # ·· · .···. 30 loissa.
• · ··· 23
Bakteriofaagi lambda7r-30 on talletettu kantakokoelmaan ATCC 7. huhtikuuta 1993 ja sille on annettu talletusnumero ATCC 75439. Tämä talletus täyttää mikro-organis-mitalletusten kansainväliseen hyväksymiseen liittyvän Budapestin sopimuksen (The Budapest Treaty of the International Recognition of the Deposit of Microorganisms 5 for the Purpose of Patent Procedures) ja sen alaisten säädösten vaatimukset.
Tämä lambda7r-30-klooni koodaa vähintään osaa esillä olevan keksinnön mukaisesta naudan BMP-11-proteiinista. Lambda7r-30-kloonin nukleotidisekvenssi sisältää SEQ ID NRO l:n nukleotidit 246-701 käsittävän, 456 nukleotidin suuruisen avoi-10 men lukukehyksen. SEQ ID NRO 1-sekvenssin nukleotidit 324-701 käsittävä nukleotidisekvenssi määrittää 378 nukleotidin suuruisen avoimen lukukehyksen, johon on koodautunut vähintään 126 aminohappoa naudan BMP-11-proteiinin C-päätteen osasta, määritettynä muihin BMP-proteiineihin ja muihin TGF-B-perheeseen kuuluviin proteiineihin vertaamalla. Nukleotidisekvenssi 246-323 määrittää avoimen lu-15 kukchykscn, joka rajoittuu ennustettua, 126 aminohaposta muodostuvaa BMP-11-peptidiä koodaavaan sekvenssiin, mutta DNA-sekvenssin tästä alueesta (246-323) päätelty peptidiaminohappojen pienempi samanlaisuus muiden BMP-proteiinien ja ... muiden TGF-B-perheeseen kuuluvien proteiinien kanssa sekä lukuisten mahdollisten • · · im>; akseptorisilmukointikohtien konsensussekvenssien läsnäolo tekevät naudan BMP- • t 20 11-geeniin kuuluvan eksonin 5-rajan määrittämisen vaikeaksi. Kehyksessä olevan • · · · : lopetuskodonin läsnäolo nukleotidiasemissa 243-245 osoittaa, että kloonin lamb- • · · ··· · : da7r-30 nukleotidisekvenssi sisältää vähintään yhden eksoni/introni-rajan naudan • · · · . *: *. BMP-11 -geenistä.
:Y; 25 Muihin TGF-B-perheeseen kuuluviin proteiineihin liittyvien tietojen perusteella en- • · :***: nustetaan, että BMP-ll-esiastepolypeptidi pilkkoutuu moniemäksisen sekvenssin ·«« ARG-SER-ARG-ARG kohdalta yhtäpitävästi ehdotetun proteolyyttisen keskimää- • · · • · .···. räisen muokkaussekvenssin ARG-X-X-ARG kanssa. Tämän BMP-ll-esiastepoly- • · ··· *. peptidin pilkkoutumisen odotetaan tuottavan 109 aminohaposta koostuvan kypsän • · · • · ♦ .’!! 30 peptidin, joka alkaa asemasta 1 aminohapolla ASN. Odotetaan, että BMP-ll:n • · muokkautuminen kypsään muotoon käsittää dimeroitumisen sekä N-päätteen alueen 24 poistumisen analogisesti samankaltaisen TGF-B-proteiinin muokkautumisen kanssa [Gentry et ai., Molec. & Cell. Biol., 8:4162 (1988); Derynck et ai., Nature, 316:701 (1985)].
5 Tästä syystä mahdollisena pidetään sitä, että BMP-11 :n kypsä aktiivinen muoto käsittää kahdesta polypeptidialayksiköstä muodostuvan homodimeerin, jotka kumpikin alayksikkö käsittävät aminohapot 1-109, ja joilla on noin 12 000 daltonia oleva ennustettu molekyylipaino. Muiden aktiivisten lajien oletetaan käsittävän aminohapot 6-109, sisältäen täten ensimmäisen säilyvän kysteiinijäännöksen. Samoin kuin TGF-10 β-proteiiniperheen muidenkin jäsenten tapauksessa, BMP-11-proteiinin karboksi-päätteen alueessa esiintyy suurempaa sekvenssin säilymistä kuin enemmän amino-päätteen puolella olevassa osassa. Aminohappojen prosentuaalinen samanlaisuus tämän BMP-11-proteiinin kysteiinirikkaassa C-päätteen domeenissa (aminohapot 6-109) verrattuna muiden TGF-B-perheeseen kuuluvien proteiinien vastaavaan aluee-15 seen on seuraava: BMP-2, 39 %; BMP-3, 37 %; BMP-4, 37 %, BMP-5,42 %, BMP-6, 45 %; BMP-7, 42 %; BMP-8, 39 %; BMP-9, 40 %; Vgl, 39 %; GDF-1, 34 %; TGF-Bl, 36 %; TGF-B2, 38 %; TGF-B3, 38 %; inhibiini B(B), 41 %; inhibiini B(A), 39 %.
• · · • · · • · 20 Esimerkki 2 ···♦ • · • ♦ · • · « : Ihmisen BMP-11 • · · ··· · ««« • · « • · · *
Naudan ja ihmisen BMP-11-geenit oletetaan merkittävän homologisiksi, mistä syys-25 tä naudan koodaavaa sekvenssiä tai sen osaa käytetään koettimena ihmisen perimä- • · :***: kirjaston seulomiseksi tai koettimena, jonka avulla voidaan tunnistaa ihmisen solu- linja tai kudos, joka syntetisoi analogista ihmisproteiinia. Ihmisen perimäkirjasto, • · · • · .*··. kuten Stratagenen luettelonumero 944201, voidaan seuloa tällaisella koettimella, ♦ ·· *. eristäen mahdolliset positiiviset kloonit, joista saadaan DNA-sekvenssi. Osoitus siitä, • · · .'!! 30 että tämä rekombinantti koodaa osaa ihmisen BMP-11 :sta, perustuu naudan ja ihmi- * · sen proteiini- sekä geenirakenteiden homologisuuksiin.
25
Sen jälkeen, kun on saatu yhdistelmä-DNA-tekninen bakteriofaagi, jonka sisältämä DNA koodaa osaa ihmisen BMP-11-molekyylistä, ihmisen koodaavaa sekvenssiä voidaan käyttää koettimena BMP-11 mRNA:ta syntetisoivan ihmissolulinjan tai -ku-5 doksen tunnistamiseksi. Vaihtoehtoisesti, naudan BMP-1 l:tä koodaavaa sekvenssiä voidaan käyttää koettimena tällaisen ihmissolulinjan tai -kudoksen tunnistamiseksi. Lyhyesti, RNA eristetään valitusta solu- tai kudoslähteestä ja sitä joko käsitellään elektroforeettisesti formaldehydi-agaroosi-geelillä ja se siirretään nitroselluloosalle, tai sen annetaan reagoida formaldehydin kanssa ja siitä muodostetaan täpliä suoraan 10 nitroselluloosalle. Sitten nitroselluloosa hybridisoidaan koettimeen, joka on saatu naudan tai ihmisen BMP-1 l:tä koodaavasta sekvenssistä. Vaihtoehtoisesti, naudan BMP-ll:tä koodaavaa sekvenssiä käytetään oligonukleotidialukkeiden toteuttamiseksi, jotka alukkeet monistavat spesifisesti BMP-1 l:tä koodaavan sekvenssin sitä osaa, joka sijaitsee tämän spesifisen monistamisreaktion toteuttamiseksi käytettyjen 15 alukkeiden välissä. Mahdollisena pidetään sitä, että naudan ja ihmisen BMP-11-sekvenssien avulla voidaan spesifisesti monistaa vastaavia ihmisen BMP-1 l:tä koo-daavia sekvenssejä lähtemällä rhRNA-, cDNA- tai perimän DNA-mallineista. Kun ... positiivinen lähde on tunnistettu jollakin edellä kuvatulla menetelmällä, mRNA- • · · . valitaan oligo (dT)-selluloosakromatografisesti ja cDNA syntetisoidaan ja kloona- • · 20 taan lambdagtlO- tai muihin alan asiantuntijalle tuttuihin lambda-bakteriofaagi- • ♦ · · ; vektoreihin (eli lambdaZAP) käyttäen vakiintuneita tekniikoita (Toole et ai., edellä).
♦ · · ·♦· · : Mahdollista on myös toteuttaa tämä edellä kuvattu, oligonukleotidialukkeella ohjattu • · ♦ • · · · .·;·. monistusreaktio suoraan edeltäkäsin muodostetulla ihmisen cDNA.lla tai perimäkir- jastolla, joka on kloonattu lambda-bakteriofaagivektoriin. Näissä tapauksissa kiqas- ; . 25 to, jonka tuottama spesifisesti monistunut DNA-tuote koodaa osaa ihmisen BMP-11 - • · l"l proteiinista, voitaisiin seuloa suoraan, käyttäen koettimena monistetusta, BMP-1 l:tä • · · .·[·m koodaavasta DNAista saatua kappaletta.
• · » • · • · • · • · · ·. Oligonukleotidialukkeiden, jotka on toteutettu naudan BMP-1 l:n perimäkloonin • · · • · · III 30 lambda7r-30 DNA-sekvenssin perusteella, ennustetaan tekevän mahdolliseksi ihmi- • · • · sen BMP-1 l:tä koodaavien sekvenssien spesifisen monistamisen. Seuraava oligo- 26 nukleotidialuke on suunniteltu tunnuksella SEQ ID NRO 1 esitetyn DNA-sekvenssin nukleotidien 501-521 perusteella, ja se on syntetisoitu automaattisen DNA-syntetisaattorin avulla.
Aluke C: TAGTCTAGATGCTCCGGCCAGTGCGAGAGTAC
5
Alukkeen C ensimmäiset yhdeksän nukleotidiä (alleviivattu) käsittävät restriktioen-donukleaasin Xbal tunnistamissekvenssin, jota voidaan käyttää hyväksi helpottamaan keksinnön mukaista BMP-11-proteiinia koodaavan, spesifisesti monistetun DNA-sekvenssin manipulointia, joten ne eivät ole peräisin tunnuksella SEQ ID 10 NRO 1 esitetystä DNA-sekvenssistä.
Seuraava oligonukleotidialuke on suunniteltu tunnuksella SEQ ID NRO 1 esitetyn DNA-sekvenssin nukleotidien 701-678 perusteella, ja se on syntetisoitu automaattisen DNA-syntetisaattorin avulla.
15 Aluke D: TGCGGATCCGGAGCAGCCACAGCGATCCAC
Alukkeen D ensimmäiset yhdeksän nukleotidiä (alleviivattu) käsittävät restriktioen-donukleaasin BamHI tunnistamissekvenssin, jota voidaan käyttää hyväksi helpotta- • · · ... j maan keksinnön mukaista BMP-11-proteiinia koodaavan, spesifisesti monistetun • ·
20 DNA-sekvenssin manipulointia, joten ne eivät ole peräisin tunnuksella SEQ ID
···· : NRO 1 esitetystä DNA-sekvenssistä.
• · · i • · • · · • · · • · ·
Edellä esitetyissä alukkeissa on käytetty seuraavia tavanomaisia nukleotidisymbole-ja: A, adenosiini; C, sytosiini; G, guaniini; ja T, tyrniini.
25 • ·
Edellä kuvattuja alukkeita C ja D käytetään alukkeina, joiden avulla voidaan monis-taa erityinen nukleotidi ihmisen perimän DNA:sta. Tämä monistusreaktio toteutetaan • · • · *··. seuraavasti: • · · 27 seen, joka sisältää 200 μΜ kutakin deoksinukleotidi-trifosfaattia (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP), 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,001 % gelatiinia, 1,25 yksikköä Taq DNA-polymeraasia, 100 pM oligonukleotidialuketta C sekä 100 pM oligonukleotidialuketta D. Tämä reaktioseos alistetaan sitten termisiin 5 jaksoihin seuraavalla tavalla: 3 minuuttia 94 °C:ssa, 1 minuutti 50 °C:ssa, 1 minuutti 72 °C:ssa yhden jakson ajan, sitten 1 minuutti 94 °C:ssa, 1 minuutti 50 °C:ssa, 1 minuutti 72 °C:ssa 39 jakson ajan.
DNA, joka monistettiin spesifisesti tällä reaktiolla, erotettiin liiallisista oligonukleoti-10 dialukkeista C ja D, joita käytettiin monistamisen käynnistämiseen, käyttämällä DNA-puhdistushartsiin perustuvaa menettelytapaa valmistajan esittämissä olosuhteissa. Tuloksena ollut DNA-tuote pilkottiin restriktioendonukleaaseilla Xbal ja BamHI, uutettiin fenolilla ja uutettiin kloroformilla. Puskurin vaihto ja pienten DNA-kappaleiden, joita syntyi Xbal/BamHI-restriktioentsyymeillä pilkkomisen seu-15 rauksena, poistaminen tapahtui laimentamalla pilkottu DNA-tuote puskuriin 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, mitä seurasi sentrifugointi centricon™ 30-mikrovä-kevöintilaitteen läpi (W.R. Grace & Co., Beverly, Ma.; Tuote nro 4209). Tuloksena ollut, XbaJ/BamHI-pilkottu, monistettu DNA-tuote alikloonattiin plasmidivektoriin ... : (pBluescript) polykytkijäalueessa sijaitsevien Xbal- ja BamHI-restriktiokohtien vä- ... 20 liin. Tuloksena olleiden alikloonien DNA-sekvenssianalyysi osoittaa, että tämä spe- • · · · • sifisesti monistettu DNA-sekvenssituote koodaa keksinnön mukaisen ihmis-BMP-·»· · • 11-proteiinin osaa. Tämän spesifisesti monistetun DNA-kappaleen DNA-sekvenssi • · · · (SEQ ID NRO 3) ja siitä päätelty aminohapposekvenssi (SEQ ID NRO 4) on esitetty sekvenssiluettelo ssa.
:Y: 25 • · • · · Tämän sekvenssin nukleotidit 1-27 käsittävät osan oligonukleotidialukkeesta C ja • ! nukleotidit 186-213 käsittävät osan oligonukleotidialukkeesta D, joita alukkeita käy- • · tettiin tämän spesifisen monistusreaktion toteuttamiseksi. Johtuen siitä, että oligo- • · · , .·. nukleotidialukkeiden C ja D (joiden suunnittelu on perustunut naudan BMP-11 • · · • · · .···, 30 DNA-sekvenssiin) tehtävänä oli käynnistää monistusreaktio, ne eivät välttämättä • · • · · vastaa täsmälleen ihmisen BMP-11 :tä koodaavaa todellista sekvenssiä, mistä syystä 28 niitä ei lueta edellä mainitussa aminohapposekvenssin muodostuksessa. Tunnuksella SEQ ID NRO 3 esitetyn sekvenssin nukleotidit 28-185 käsittävää DNA-sekvenssiä tai sen osaa, jotka on monistettu spesifisesti ihmisen perimän DNA-mallineesta, voidaan käyttää koettimena muiden, ihmisen BMP-ll:tä koodaavien sekvenssien tun-5 nistamiseksi ihmisen perimäkirjastosta tai ihmisen cDNA-khjastosta käyttäen alan asiantuntijalle tuttuja tavanomaisia hybridisointi/seulontatekniikoita.
1 200 000 rekombinanttia, jotka olivat peräisin lambdaZAPn-vektoriin muodostetusta, ihmissikiön aivojen cDNA-kiijastosta (Stratagene, luettelon nro 936206), maljat-10 tiin 50 maljalle tiheydeksi 24 000 yhdistelmä-DNA-teknistä bakteriofaagiplakkia yhtä maljaa kohden. Näistä maljoista muodostettiin yhdistelmä-DNA-teknisten bak-teriofaagiplakkien toistetut nitroselluloosakopiot. SEQ ID NRO 3-sekvenssin nukleotidien 53-82 perusteella suunniteltu oligonukleotidikoetin syntetisoitiin automaattisella DNA-syntetisaattorilla. Tämä oligonukleotidikoetin merkittiin radioaktiivises-15 ti gamma-1?P-ATP:llä ja se hybridisoitiin toistettujen nitroselluloosakopioiden kumpaankin joukkoon SHB:ssä, 65 °C:ssa. Yhdeksän positiivisesti hybridisoitunutta rekombinanttia todettiin. Yksi näistä positiivisesti hybridisoituneista rekombinanteis-ta, josta käytetään nimitystä lambdaFB30.5, plakkipuhdistettiin. Tämän puhdistetun • · · ... ; lambdaFB30.5 cDNA-kloonin bakteriofaagivarastot muodostettiin maljalle ja bakte- • · .:. 20 riofaagi-DNA eristettiin. Toimittajan (Stratagene) kuvaamalla in vivo -pilkkomisme- ···· : .·. netelmällä tuotettu bakteeriplasmidi, josta käytetään nimitystä FB30.5, ja joka sisäl- • · · · j tää lambdaFB30.5-bakteriofaagi cDNA-kloonin koko istutetteen, on talletettu kanta- • · · · kokoelmaan ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti, ja sille on annettu talletusnumeroksi ATCC #69619. 25 FB30.5-kloonin DNA-sekvenssin osa on esitetty SEQ ID NRO 10 -sekvenssissä.
• · • · · • · • · • · · ,·.·. 1 000 000 rekombinanttia, jotka olivat peräisin lambdaFIX-vektoriin muodostetusta « · · • · . · * ·. ihmisen perimän kirj astosta (Stratagene, luettelon nro 944201), maljattiin 50 maljalle ·· · *. tiheydeksi 20 000 yhdistelmä-DNA-teknistä bakteriofaagiplakkia yhtä maljaa koh- • · · !!! 30 den. Näistä maljoista muodostettiin yhdistelmä-DNA-teknisten bakteriofaagiplakki- • · en toistetut nitroselluloosakopiot. SEQ ID NRO 10-sekvenssiin kuuluvien nukleoti- 29 dien 57-86, lukuun ottamatta SEQ ID NRO 10-sekvenssissä nukleotidien 59-61 kohdalla esiintyvää tahatonta korvautumista GCG:sta muotoon CAC, perusteella suunniteltu oligonukleotidikoetin syntetisoitiin automaattisella DNA-syntetisaatto-rilla. Tämä oligonukleotidikoetin merkittiin radioaktiivisesti gamma-32P-ATP:llä ja 5 se hybridisoitiin toistettujen nitroselluloosakopioiden kumpaankin joukkoon SHB:ssä, 65 °C:ssa. Viisi positiivisesti hybridisoitunutta rekombinanttia todettiin. Yksi näistä positiivisesti hybridisoituneista rekombinanteista, josta käytetään nimitystä 30GEN.4, plakkipuhdistettiin. Tämän puhdistetun 30GEN.4-perimäkloonin bakteriofaagivarastot muodostettiin maljalle ja bakteriofaagi-DNA eristettiin. Tämän 10 perimäkloonin bakteriofaagivarasto on talletettu kantakokoelmaan ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti, ja sille on annettu talletusnumeroksi ATCC #75775. 30GEN.4-kloonin DNA-sekvenssin osa on esitetty SEQ ID NRO 10 -sekvenssissä. Tämän 30GEN.4-perimäkloonin DNA-sekvenssin osa määritettiin samanlaiseksi kuin osa FB30.5-15 cDNA-kloonin DNA-sekvenssistä. Tämän SEQ ID NRO 10 -sekvenssin päällekkäisyyden (nukleotidit 1-98) suuruutta käytettiin perustana BMP-10-proteiinia osittain koodaavaa sekvenssiä koottaessa. Tämän 30GEN.4-perimäkloonin odotetaan sisäl- ,···. tävän lisäksi ihmisen BMP-11-proteiinia koodaavat 5'-sekvenssit, joihin BMP-11- • · · : esiastepolypeptidin loppuosan odotetaan koodautuneen, käynnistävä metioniini mu- 20 kaan lukien. Ihmisen BMP-1 l:n osittainen sekvenssi on esitetty SEQ ID NRO 10 - • ·· · { sekvenssissä, ja huomattakoon, että nukleotidien 1-198 on todettu olevan läsnä sekä • ·· · • 30GEN.4-perimäkloonissa että FB30.5 cDNA-kloonissa, kun taas nukleotidit 199- • · · · :*·*; 1270 ovat peräisin yksinomaan FB30.5-cDNA-kloonista. SEQ ID NRO 10 ennustaa vähintään 362 aminohappoa käsittävän ihmisen BMPll-esiasteproteiinin. Muihin 25 BMP-proteiineihin ja muihin TGF-B-perheeseen kuuluviin proteiineihin liittyvien • · · tietojen perusteella ennustetaan, että tämä esiastepolypeptidi pilkkoutuu moniemäk-sisen sekvenssin ARG-SER-ARG-ARG kohdalta (SEQ ID NRO 11 -sekvenssin « · :***; aminohapot -4...-1) yhtäpitävästi ehdotetun proteolyyttisen keskimääräisen muok- • · · kaussekvenssin ARG-X-X-ARG kanssa. On odotettavaa, että ihmisen BMP-11-• · · 5 • · · • · · ,···_ 30 esiastepolypeptidin pilkkoutuminen tästä kohdasta tuottaa 109 aminohaposta koos- • l • · · tuvan kypsän peptidin, joka alkaa SEQ ID NRO 11 -sekvenssin asemasta 1 amino- 30 hapolla ASN. Odotetaan, että ihmisen BMP-ll:n muokkautuminen kypsään muotoon käsittää dimeroitumisen sekä N-päätteen alueen poistumisen analogisesti samankaltaisen TGF-B-proteiinin muokkautumisen kanssa [Gentry et ai, Molec. & Cell. Biol., 8:4162 (1988); Derynck et ai, Nature, 316:701 (1985)]. Tästä syystä 5 mahdollisena pidetään sitä, että ihmisen BMP-11 :n kypsä aktiivinen muoto käsittää kahdesta polypeptidialayksiköstä muodostuvan homodimeerin, jotka kumpikin alayksikkö käsittävät SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminohapot 1-108, ja joilla on noin 12 000 daltonia oleva ennustettu molekyylipaino. Muiden aktiivisten lajien oletetaan käsittävän SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminohapot 7-108, sisältäen täten ensim-10 mäisen säilyvän kysteiinijäännöksen. Mahdollisia ovat myös sellaiset heterodimee-riset molekyylit, jotka käsittävät yhden BMP-11-alayksikön ja BMP/TGF-B-pääryhmään kuuluvan toisen jäsenen muodostaman toisen alayksikön.
Esimerkki 3 15 BMP-1 l:n ilmentäminen #^ Naudan, ihmisen tai muun nisäkkään BMP-11 -proteiinien tuottamiseksi sitä tuottava • · · i(< . DNA siirrettiin sopivaan ilmentämisvektoriin ja vietiin nisäkässoluihin tai muihin • · 20 edullisiin eukarioottisiin tai prokarioottisiin isäntiin tavanomaisilla yhdistelmä- ti·· : DNA-teknisillä menetelmillä. Mahdollista on, että ihmisen biologisesti aktiivisen • · · ·#· · : .·. yhdistelmä-DNA-teknisen BMP-11-proteiinin edullinen ilmentämisjärjestelmä voi- ··· · . 1: *. daan transformoida stabiilisti nisäkässoluihin.
• · · 25 Alan asiantuntija kykenee muodostamaan nisäkkään ilmentämisvektorit käyttämällä • · :***: SEQ ID NRO 1- tai SEQ ID NRO 10-sekvenssiä tai muita BMP-11-proteiineja il- • · · mentäviä DNA-sekvenssejä tai muita muokattuja sekvenssejä ja tunnettuja vektorei- • · · .···. ta, joista voidaan mainita pCD [Okayama et ai, Mol. Cell. Biol., 2:161-170 (1982)], \ pJL3, pJL4 [Gough et ai, EMBO J., 4:645-653 (1985)] sekä pMT2 CXM.
30 • · • · ··· 31
Nisäkkään ilmentämisvektori pMT2 CXM on p91023(B):n johdannainen (Wong et ai., Science 228:801-815. 1985), joka eroaa viimeksi mainitusta siinä suhteessa, että se sisältää ampisilliinin vastustuskyvyn geenin tetrasykliinin vastustuskyvyn geenin tilalla, ja se sisältää edelleen Xhol-kohdan cDNA-kloonien istuttamista varten. Vek-5 torin pMT2 CXM toiminnalliset elementit on kuvattu (Kaufman, R.J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:689-693) ja niistä voidaan mainita adenoviruksen VA-gee-nit, SV40-replikaation alkamiskohta, joka sisältää 72 emäsparin suumisen tehostajan, adenoviruksen suuri myöhäinen promoottori, joka sisältää 5'-silmukointikohdan, sekä suuri osa adenoviruksen kolminkertaisesta johtosekvenssistä, joka on läsnä ade-10 noviruksen myöhäisissä mRNA-sekvensseissä, akscptori-3'-sihnukointikohta, DHFA-istute, SV40 varhainen polyadenylaatiokohta (SV40) sekä pBR322-sekvens-sit, joita tarvitaan lisääntymiseen E. coli:ssa.
Plasmidi pMT2 CXM on saatu pMT2-VWF:stä pilkkomalla se EcoRI-entsyymillä, 15 joka pMT2-VWF on talletettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) talletusnumerolla ATCC 67122. EcoRI-entsyymillä pilkkominen leikkaa pMT2-VWF:ssä läsnä olevan cDNA-istutteen, jolloin saadaan ... lineaarisessa muodossa oleva pMT2, joka voidaan ligatoida ja jolla voidaan transfer- • · · moida E. coli HB 101 tai DH-5 niin, että saadaan aikaan ampisilliinin vastustuskyky.
• · 20 Plasmidi pMT2 DNA voidaan valmistaa tavanomaisilla menetelmillä. Sitten muo- ; '1' dostetaan pMT2 CXM käyttäen ulos/sisäänsilmukointiin perustuvaa mutageneesiä • · · • · · · • .·, [Morinaga et ai, Biotechnology, 84:636 (1984)]. Tällä tavalla saadaan poistetuiksi • · · • · · · SV40 replikaation alkamiskohdan lähellä sijaitsevaan Hindlll-kohtaan liittyvät • · · emäkset 1075-1145 sekä pMT2:n tehostinsekvenssit. Se istuttaa lisäksi seuraavan 25 sekvenssin: 5'- PO-CATGGGCAGCTCGAG-3' nukleotidin 1145 kohdalle. Tämä • · · • · ;***; sekvenssi sisältää Xhol-restriktioendonukleaasin tunnistamiskohdan. pMT2CXM- • · · johdannainen, josta käytetään nimitystä pMT23, sisältää restriktioendonukleaasien • · · .···, PstI, EcoRI, Sali ja XhoI tunnistamiskohdat. Plasmidien pMT2 CXM ja pMT23 • · • · · • < DNA voidaan preparoida tavanomaisilla menetelmillä.
• · · 1 30 · • · • · · 32 pMT21:stä saatu pEMC2Bl saattaa myös soveltua esillä olevaan keksintöön. pMT21 on saatu pMT2:sta, joka on puolestaan saatu pMT2-VWF:sta. Kuten edellä on kuvattu, EcoRl-pilkkominen leikkaa pMT-VWF:ssa läsnä olevan cDNA-istutteen, jolloin saadaan lineaarisessa muodossa oleva pMT2, joka voidaan ligatoida ja jolla voidaan 5 transformoida E. coli HB 101 tai DH-5 niin, että saadaan aikaan ampisilliinin vastustuskyky. Plasmidi pMT2 DNA voidaan valmistaa tavanomaisilla menetelmillä.
pMT21 on saatu pMT2:sta seuraavan kahden muokkauksen avulla. Ensin hävitetään 76 emäsparia DHFR cDNA.n lukematta jäävästä alueesta, mukaan lukien 19 G- 10 jäännöksen pala G/C-hännästä cDNA:n kloonaamiseksi. Tässä toimenpiteessä Xhol-kohta istutetaan seuraavan sekvenssin saamiseksi välittömästi ennen DHFRiää: 5' -CTGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGAGCCATCATG -3'
PstI Eco Rl XhoI
15 Sitten yksi ainoa Clal-kohta istutetaan pilkkomalla entsyymeillä EcoRV ja Xbal, käsittelemällä DNA-polymeraasi I:n Klenow-kappaleella ja ligatoimalla Clal-kytki-jään (CATCGATG). Tämä hävittää 250 emäsparin lohkon adenovirukseen liittyväs-tä RNA- (VAI) -alueesta, mutta se ei häiritse VAI RNA-geenin ilmentymistä tai ·;· · toimintaa. pMT21 pilkotaan EcoRTlla ja XhoI:11a ja sitä käytetään pEMC2Bl- ··· 20 vektorin muodostamiseen.
• · · · • · « · · • · · • · · · ί:: Osa EMCV-johtosekvenssistä saadaan pMT2-ECATl-muodosteesta [S.K. Jung, et ί.ί : ai, J. Virol. 62:1651-1660 (1989)] pilkkomalla entsyymeillä EcoRI ja PstI, jolloin saadaan 2752 bp:n kappale. Tämä kappale pilkotaan TaqEllä, jolloin saadaan 508 • · 25 emäsparin EcoRI-TaqI-kappale, joka puhdistetaan elektroforeettisesti matalassa ·«« *...· lämpötilassa sulavalla agaroosigeelillä. 68 emäsparin välikappale ja sen komple- menttijuoste syntetisoidaan siten, että siinä on irrallinen 5-TaqI-pää ja irrallinen 3-: Xhol-pää, sen sekvenssin ollessa seuraava:
5'-CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTnTCCnT
• · · .·*·. 30 Taql ··· 33 GAAAAACACG ATTGC-3 *
Xhol Tämä sekvenssi on yhtäpitävä EMC-viruksen johtosekvenssin nukleotidien 763-827 5 kanssa. Se muuttaa myös ECM-viruksen johtosekvenssin asemassa 10 olevan ATG:n ATT:ksi ja sitä seuraa Xhol-kohta. pMT21 EcoRI-XhoI-kappaleen, EMC-viruksen EcoRI-TaqI-kappaleen ja 68 emäsparin suuruisen oligonukleotidivälikap-paleen TaqI-XhoI-välikappaleen välinen kolminkertainen ligaatio johtaa vektoriin pEMC2Bl.
10 Tämä vektori sisältää SV40 replikaation alkamiskohdan ja tehostimen, adenoviruk-sen suuren myöhäisen promoottorin, cDNA-kopion suuresta osasta adenoviruksen kolmiosaista sekvenssiä, pienen hybridivälisekvenssin, SV40-polyadenylointisignaa-lin ja adenoviruksen VA I-geenin, DHFR- ja B-laktamaasimcrkkijaksot sekä EMC-15 sekvenssin sopivasti toisiinsa nähden toivotun cDNA:n voimakkaan ilmentymisen ohjaamiseksi nisäkässoluissa.
Vektoreiden muodostukseen voi liittyä BMP-11 DNA-sekvenssien muokkautumista.
... : Esimerkiksi BMP-11 cDNA:ta voidaan muokata poistamalla koodaamattomat nuk- ··. 20 leotidit koodaavan alueen 5'- ja 3'-päistä. Nämä hävitetyt koodaamattomat nukleoti- ···· • dit voidaan korvata tai jättää korvaamatta muilla sellaisilla sekvensseillä, jotka tiede-··· · : tään edullisiksi ilmentymisen kannalta. Nämä vektorit transformoidaan sopiviin isän- täsoluihin BMP-11-proteiinien ilmentämiseksi. Lisäksi SEQ ID NRO 1- tai SEQ ID NRO 10 -sekvenssiä tai muita BMP-11-proteiineja koodaavia sekvenssejä voidaan • · Y/ 25 manipuloida kypsän BMP-1 l:n ilmentämiseksi hävittämällä BMP-1 l:n propeptidiä ··· :,M·' koodaavat sekvenssit ja korvaamalla ne sellaisilla sekvensseillä, jotka koodaavat ; V. muiden BMP-proteiinien, aktiviiniproteiinien tai TGF-fi-pääryhmään kuuluvien mui- • · :***; den jäsenten täydellisiä propeptidejä.
♦ ·· • · · • · · ··· .···. 30 Alan asiantuntija kykenee manipuloimaan SEQ ID NRO 1- ja SEQ ID NRO 10 - • · ··· sekvenssejä eliminoimalla koodaavaan sekvenssiin rajoittuvat nisäkkään säätelysek- 34 venssit tai korvaamalla ne bakteerisekvensseillä bakteerivektoreiden luomiseksi bakteerisoluissa tapahtuvaa solun sisäistä tai solun ulkopuolista ilmentämistä varten. Esimerkiksi, näitä koodaavia sekvenssejä voitaisiin manipuloida edelleen (esim. ligatoida muihin tunnettuihin kytkijöihin tai muokata hävittämällä niistä koodaamat-5 tomat sekvenssit tai muuttamalla niiden nukleotidejä muilla tunnetuilla tekniikoilla). Sitten tämä muokattu, BMP-liitä koodaava sekvenssi voitaisiin istuttaa tunnettuun bakteerivektoriin käyttäen esimerkiksi sellaisia toimenpiteitä, joita on kuvattu julkaisussa T. Taniguchi et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5230-5233 (1980). Tämä esimerkkinä kuvattu bakteerivektori voitaisiin sitten transformoida isäntänä toimiviin 10 bakteerisoluihin, joissa BMP-11 -proteiini saataisiin ilmennetyksi. Strategia BMP-11- proteiinien ilmentämiseksi solun ulkopuolisesti bakteerisolujen avulla on kuvattu esimerkiksi eurooppalaisessa patenttihakemuksessa EPÄ 177 343.
Samanlaisia manipulointeja voidaan toteuttaa istutusvektorin muodostamiseksi [kat-15 so esim. toimenpiteet, jotka on kuvattu julkaistussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 155 476] hyönteissoluissa tapahtuvaa ilmentämistä varten. Myös hiivavek-tori voitaisiin muodostaa käyttäen hiivan säätelysekvenssejä esillä olevan keksinnön ... mukaisten tekijöiden ilmentämiseksi solun sisäisesti tai solun ulkopuolisesti hii- • · · • · · vasolujen avulla [katso esim. toimenpiteet, jotka on kuvattu julkaistussa PCT- ··· · • · . 20 hakemuksessa W086/00639 sekä eurooppalaisessa patenttihakemuksessa EPÄ 123 289].
• · · ··· · • · • · · » · · • · · · .·;·. Keksinnön mukaisesti menetelmä BMP-11-proteiinin suurten määrien tuottamiseksi • · · nisäkässoluissa voi käsittää sellaisten solujen muodostamisen, jotka solut sisältävät 25 lukuisia kopioita heterologisesta BMP-11-geenistä. Tämä heterologinen geeni on • · .1. kytketty monistettavaan merkkijaksoon, esimerkiksi dihydrofolaatti-reduktaasi- ··· geeniin (DHFR-geeniin), jonka avulla suurentuneen lukumäärän geenikopioita sisäl- • · · .*.*e tävät solut voidaan valita niiden lisäämiseksi metotreksaatin (MTX) suurenevissa •# pitoisuuksissa käyttäen toimenpiteitä, jotka on kuvattu julkaisussa Kaufman ja • · · *** 30 Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-629 (1982). Tätä lähestymistapaa voidaan soveltaa • ♦ • · moniin erilaisiin solutyyppeihin.
35
Esimerkiksi plasmidi, joka sisältää keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin BMP-11 :tä varten liittyneenä toiminnallisesti muihin, sen ilmentymisen mahdollistaviin plasmidisekvensseihin, sekä DHFR-ilmentämisplasmidi pAdA26SV(A)3 [Kaufman 5 ja Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304 (1982)] voidaan siirtää yhdessä DHFR-puut-teellisiin CHO-soluihin, DUKX-BII, erilaisilla menetelmillä, mukaan lukien samanaikainen saostaminen kalsiumfosfaatilla ja transfektio, elektroporaatioon tai proto-plasteihin perustuva fuusio. DHFR:ää ilmentävät transformantit valitaan niiden kasvattamiseksi alfa-alustalla, joka sisältää dialysoitua sikiövasikan seerumia, minkä 10 jälkeen ne valikoidaan monistamista varten kasvattamalla suurenevissa MTX-pitoisuuksissa (esim. peräkkäiset vaiheet 0,02, 0,2, 1,0 ja 5 μΜ olevissa MTX-pitoisuuksissa) tavalla, joka on kuvattu julkaisussa Kaufman et ai, Mol. Cell. Biol, 5:1750 (1983). Transformantit kloonataan ja biologisesti aktiivisen BMP-11 ilmentymistä seurataan yhdellä tai useammalla BMP-11-aktiivisuusmäärityksellä, joita on 15 kuvattu jäljempänä esimerkeissä 5-8. BMP-11-ilmentymisen tulisi voimistua MTX-vastustuskyvyn suurentuessa. BMP-11-polypeptidien tunnusomaiset piirteet selvitetään käyttämällä alalla tunnettuja standarditekniikoita kuten impulssimerkitsemistä ... [35S]-metioniinilla tai -kysteiinillä sekä elektroforeesia polyakryyliamidigeelillä.
• · · • · ·
Samankaltaisia toimenpiteitä voidaan noudattaa muiden samankaltaisten BMP-11- • · . 20 proteiinien tuottamiseksi.
···· • · • · · • · · • · · · : · Esimerkki 4 • · · • · · ··· · • · · • · · • · ·
Ilmentyneen BMP-ll:n biologinen aktiivisuus 25 • · · • ·
Edellä esimerkissä 3 saatujen ilmentyneiden BMP-11-proteiinien biologisen aktiivi- ··· suuden mittaamiseksi proteiinit otetaan talteen soluviljelmästä ja puhdistetaan eris- • · · .···. tämällä BMP-11-proteiinit muista proteiinimaisista materiaaleista, joiden kanssa ne • · • · · \ syntyivät yhdessä, sekä muista kontaminanteista. Puhdistettu proteiini voidaan mää- • · · • · · I" 30 nttää alla esimerkeissä 5-8 kuvattujen, BMP-11-aktiivisuudelle tarkoitettujen määri- • · • · tysten mukaisesti.
36
Esimerkki 5 W-20-biomääritys 5 A. W-20-solujen kuvaus W-20 luuytimen peruskudossolujen käyttö osoittavana solulinjana perustuu siihen, että nämä solut muutetaan osteoblastien kaltaisiksi soluiksi BMP-proteiinilla käsittelyn jälkeen [Thies et ai., Journal of Bone and Mineral Research, 5:305 (1990); sekä 10 Thies et ai., Endocrinology>, 130:1318 (1992)]. Erityisemmin W-20-solut ovat luuytimen peruskudoksen klonaalinen solulinja, jonka tutkijat ovat saaneet täysikasvuisista hiiristä laboratoriossa Dr. D. Nathan, Children's Hospital, Boston, MA. W-20-solujen käsittely tietyillä BMP-proteiineilla johtaa (1) alkalisen fosfataasin suurentuneeseen tuotantoon, (2) PTH-stimuloidun cAMP:n induktioon, sekä (3) osteo-15 kalsiinin synteesin indusoitumiseen soluissa. Kohdat (1) ja (2) edustavat osteoblastin fenotyyppiin liittyviä tunnusomaisia piirteitä, kun taas kyky syntetisoida osteokalsii-nia on sellainen fenotyyppiin liittyvä ominaisuus, jota esiintyy vain kypsissä osteo- ... blasteissa. Edelleen, tähän mennessä olemme havainneet W-20-peruskudossolujen • · · • · · * . konversion osteoblastien kaltaisiksi soluiksi ainoastaan BMP-proteiineilla käsitellä- • · . 20 essä. Tällä tavalla BMP:llä käsitellyissä W-20-soluissa esiintyvät in vitro - aktiivisuudet korreloivat in vivo BMP-proteiineille tunnetun luun muodosta- • · · • *.* misaktiivisuuden kanssa.
• · · • · · ·*· · • · · • · · • · ·
Alla on kuvattu kaksi in vitro -määritystä, joita voidaan käyttää uusien, luuta in-25 dusoivien molekyylien BMP-aktiivisuuksien vertaamiseen.
• · ··· • · • · • · · B. W-20-soluihin ja alkaliseen fosfataasiin perustuvan määrityksen toteuttami- • · · nen • · • · ··· » · · 30 W-20-solut maljataan 96 kuoppaa käsittäville kudosviljelymaljoille tiheydeksi > · ► · 1 10 000 solua kuoppaa kohden, 200 pl:aan alustaa (DME, joka sisältää 10 % lämmön 37 avulla inaktivoitua sikiö vasikan seerumia, 2 mM glutamiinia ja 100 yksikköä/ml penisilliiniä + 100 ttg/ml streptomysiiniä). Solujen annetaan kiinnittyä yön yli ilmakehässä, joka sisältää 95 % ilmaa, 5 % CO2, lämpökaapissa, 37 °C:ssa.
5 Nämä 200 μΐ alustaa poistetaan kustakin kuopasta monikanavapipetillä ja korvataan yhtä suurella tilavuudella testattavaa näytettä DME-alustassa, joka sisältää 10 % lämmöllä inaktivoitua sikiövasikan seerumia, 2 mM glutamiinia ja 1 % penisilliini-streptomysiiniä. Testattavat aineet määritetään kolmena rinnakkaisnäytteenä.
10 Testattavia näytteitä ja standardeja inkuboidaan 24 tunnin ajan W-20-osoittajasolu-jen kanssa. 24 tunnin kuluttua maljat poistetaan lämpökaapista 37 °C:n lämpötilasta ja kokeen väliaine poistetaan soluista.
W-20-solukerrokset huuhdotaan 3 kertaan 200 μΐ/kuoppa kalsiumia/magnesiumia 15 sisältämättömällä, fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella ja nämä huuhteluliuokset heitetään pois.
... 50 μΐ lasissa tislattua vettä lisätään kuhunkin kuoppaan ja sitten määritysmaljat laite- • · · ji t (. taan hiilihappojäätä ja etanolia sisältävään hauteeseen nopeata jäädyttämistä varten.
• · 20 Jäätyneet määritysmalj at poistetaan hiilihappojäätä ja etanolia sisältävästä hauteesta • · * # : ja ne sulatetaan 37 °C:ssa. Tämä vaihe toistetaan vielä 2 kertaan siten, että yhteensä • · · • ·· · l . *. 3 j äädytys-sulatus-toimenpidettä toteutetaan. Tämän jälkeen kalvoon sitoutunut aika- • · · · • *ϊ*. linen fosfataasi on valmis mitattavaksi.
• · · 25 Kuhunkin määritysmalj aan lisätään 50 μΐ määritysseosta (50 mM glysiiniä, 0,05 % • · :1: Triton X-100, 4 mM MgCfe, 5 mM p-nitrofenolifosfaattia, pH = 10,3) ja määritys- maljoja inkuboidaan sitten 30 minuuttia 37 °C:ssa vesihauteessa, jota ravistellaan • · ;' ’ *. nopeudella 60 värähdystä minuutissa.
• · · • · · • · · ,···, 30 Tämän 30 minuuttia kestäneen inkuboinnin päätyttyä reaktio pysäytetään lisäämällä • · • · · 100 μΐ 0,2 N NaOH:ta kuhunkin kuoppaan ja laittamalla määritysmalj at jäihin.
38
Spektrofotometrinen absorbanssi mitataan kustakin kuopasta aallonpituudella 405 nanometriä. Näitä arvoja verrataan sitten tunnettuihin standardeihin kussakin näytteessä läsnä olevan alkalisen fosfataasin aktiivisuuden arvioimiseksi. Absorbanssiar-5 vot tuotetaan esimerkiksi käyttämällä tunnettuja määriä p-nitrofenolifosfaattia. Tulokset on esitetty taulukossa I.
Taulukko I
Tunnettujen p-nitrofenolifosfaattistandardien absorbanssiarvot p-nitrofenolifosfaatti (pmoolia) Keskim. absorbanssi (405 nm) 0,000 o 0,006 0,261 ± 0,024 0,012 0,521 ±0,031 0,018 0,797 ±0,063 0,024 1,074 ±0,061 0,030 1,305 ±0,083
Tunnettujen BMP-määrien absorbanssiarvot voidaan määrittää ja muuntaa taulukos-10 sa II esitetyllä tavalla μmooleiksi p-nitrofenolifosfaattia, joka pilkkoutuu aikayksi-kössä.
• · ·
: Taulukko II
• · •f1 2 3 W-20-soluilla saadut alkalisen fosfataasin arvot BMP-2:lla käsiteltäessä • · · · • · :.· · BMP-2-pitoisuus, ng/ml Absorbanssi, 405 nm pmoolia substraattia/h 0 0,645 0,024 O’1·1 1,56 0,696 0,026 3,12 0,765 0,029 6,25 0,923 0,036 12,50 1,121 0,044 • · ’ 9 \\ 25,0 1,457 0,058 V.; 50,0 1,662 0,067 100,0 1,977 0,080 • I _ _ _ · · 2 • · · • · · 3 • · • · »·· 39 Näitä arvoja käytetään sitten tunnettujen BMP-11-määrien aktiivisuuksien vertaamiseksi BMP-2-proteiiniin.
C. Osteokalsiini-RIA-menetelmä 5 W-20-soluja maljataan 106 solua/kuoppa 24 kuoppaa käsittäville monikuoppaisille kudosviljelymaljoille 2 ml:aan DME:tä, joka sisältää 10 % lämmön avulla inaktivoi-tua sikiö vasikan seerumia, 2 mM glutamiinia. Solujen annetaan kiinnittyä yön yli ilmakehässä, joka sisältää 95 % ilmaa ja 5 % C02:ta, 37 °C:n lämpötilassa.
10
Seuraavana päivänä alustaksi muutetaan DME, joka sisältää 10 % sikiövasikan seerumia, 2 mM glutamiinia ja testattavaa ainetta yhteensä 2 ml:n tilavuudessa. Kutakin testattavaa ainetta laitetaan kolmeen rinnakkaiskuoppaan. Testattavia aineita inku-boidaan yhdessä W-20-solujen kanssa yhteensä 96 tuntia, korvaten alusta 48 tunnin 15 kuluttua samoilla koealustoilla.
96 tunnin kuluttua 50 μ1 koealustaa poistetaan kustakin kuopasta ja osteokalsiinin ... tuotanto määritetään käyttäen hiiren osteokalsiinille sopivaa radioimmuunimääritys- • ♦ ♦ • · · . tä. Määrityksen yksityiskohdat on kuvattu reagenssipakkauksessa, jonka valmistaja • · 20 on Biomedical Technologies, Inc., 378 Page Street, Stoughton, MA 02072. Määri- :*]·, tyksen reagenssit ovat löydettävissä tuotenumeroilla BT-431 (hiiren osteokalsiini- ··* * ; .·, standardi), BT-432 (vuohen anti-hiiri-osteokalsiini), BT-431 R (jodattu hiiren osteo- • · · ··· · kalsiini), BT-415 (normaali vuohen seerumi) ja BT-414 (aasin anti-vuohi-IgG).
• ♦ · BMP-käsittelyn vasteena W-20-solujen syntetisoiman osteokalsiinin RIA toteutetaan 25 valmistajan esittämän menetelmän mukaisesti.
• « • · • · ···
Koenäytteillä saatuja arvoja verrataan hiiren osteokalsiinin tunnetuilla standardeilla • · · • · ... , .···. saatuihin arvoihin sekä osteokalsiinin määrään, jonka W-20-solut tuottivat vasteena ♦ · • · · \ tunnettujen BMP-2-määrien altistukselle. Arvot, jotka liittyvät BMP-2:lla indusoi- • ♦ · • ♦ · ") 30 tuun osteokalsiinin synteesiin W-20-soluissa, on esitetty taulukossa III.
• · ♦ · • · · 40
Taulukko III
Osteokalsiinin synteesi W-20-so luissa BMP-2:n pitoisuus, ng/ml Osteokalsiinin synteesi, ng/kuoppa 0 0,8 2 0,9 4 0,8 8 2,2 16 2,7 31 3,2 62 5,1 125 6,5 250 8,2 500 9,4 1000 10,0
Esimerkki 6 5 Rosen-muokattu Sampath-Reddi-määritys * * * ·* .' : Rotan luun muodostumismäärityksestä, joka on kuvattu julkaisussa Sampath ja Red- *·* : di, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:6591-6595 (1983), käytettiin muokattua versiota, jolla arvioitiin BMP-11-proteiineilla oleva, luuta, rustoa ja/tai muun sidekudosta in- • · :.· · 10 dusoiva aktiivisuus. Tätä muokattua määritystä kutsutaan ohessa Rosen-muokatuksi • · : Sampath-Reddi-määritykseksi. Sampath-Reddi-määritykseen kuuluva etanolisaos- V · tusvaihe korvataan dialysoimalla (mikäli koostumus on liuos) tai diasuodattamalla (mikäli koostumus on suspensio) määritettävä fraktio vettä vastaan. Sitten tämä liuos • · • · « ***** tai suspensio tasapainotetaan 0,1 % TFA:lla. Tuloksena oleva liuos lisätään 20 ··· • · *···* 15 mg:aan rotan matriisia. Vertailuna käytetään rotan valematriisinäytettä, jota ei ole • · : : käsitelty proteiinilla. Tämä materiaali pakastetaan ja lyofilisoidaan ja tuloksena oleva ··· jauhe suljetaan numeroa 5 oleviin gelatiinikapseleihin. Nämä kapselit istutetaan 21- • .*. 49 vuorokauden ikäisissä urospuolisissa Long Evans-rotissa ihon alle eläinten vatsa- ·· · rintakehän alueeseen. Istutteet poistetaan 7-14 vuorokauden jälkeen. Kunkin istut- • m teen yhtä puolikasta käytetään alkalisen fosfataasin analyysissa [katso Reddi et ai,
Proc. Natl. Acad. Sei., 69:1601 (1972)].
41
Kunkin istutteen toinen puolikas kiinnitetään ja sitä käsitellään histologista analyysia 5 varten. 1 pm glykolimetakrylaattileikkeitä värjätään Von Kossalla ja happamalla fuskiinilla kussakin istutteessa esiintyvän, luun ja ruston indusoituneen muodostumisen voimakkuuden arvioimiseksi. Arvot +1...+5 kuvaavat istutteesta saadun kunkin histologisen leikkeen sitä aluetta, johon on muodostunut uusia luu- ja/tai rustosoluja sekä matriisia. Arvo +5 tarkoittaa sitä, että yli 50 % istutteesta on uutta luuta ja/tai 10 rustoa, jota on syntynyt suorana seurauksena istutteessa olleelle proteiinille. Arvot +4, +3, +2 ja +1 tarkoittavat vastaavasti sitä, että enemmän kuin 40 %, 30 %, 20 % ja 10 % istutteesta sisältää uutta rustoa ja/tai luuta.
Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen BMP-11-proteiinien 15 aktiivisuus voidaan määrittää tällä määrityksellä.
Esimerkki 7 • · · • ♦ · • · ♦ * . Ilmentyneen BMP-ll:n biologinen aktiivisuus • · ♦ ♦ • · 20 ··♦ I*’I Edellä esimerkissä 3 saatujen, ilmentyneiden BMP-11-proteiinien biologisen aktiivi- • · · : suuden mittaamiseksi proteiinit otetaan talteen soluviljelmästä ja ne puhdistetaan • · · • · · · eristämällä BMP-11-proteiinit muista proteiinimaisista materiaaleista, joiden kanssa • · · ne on tuotettu yhdessä, sekä muista kontaminanteista. Puhdistettu proteiini voidaan . ·. ·. 25 määrittää esimerkissä 6 kuvatulla, rotan luun muodostumista määrittävällä kokeella.
• · · • · • ♦ ♦ · m.\ Puhdistaminen tapahtuu alan asiantuntijalle tutuilla standarditekniikoilla.
• · · • · ··· • · • · • · · ·_ Proteiinianalyysi toteutetaan standarditekniikoilla, joista voidaan mainita SDS- • · · 30 PAGE-akryyliamidi [Laemmli, Nature 227:680 (1970)] ja hopeavärjäys [Oakley, et l · * i • · · 42 al., Anal. Biochem. 105:361 (1980)] sekä immuunitäplä [Towbin, et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:4350 (1979)].
Edellä olevissa kuvauksissa on kuvattu yksityiskohtaisesti esillä olevan keksinnön 5 tällä hetkellä edullisina pidetyt suoritusmuodot. Lukuisat muunnokset ja vaihtelut ovat odotettavia keksinnön käytännön sovellutuksissa ja ne ovat ilmeisiä alan asiantuntijalle tämän kuvauksen perusteella. Liitteenä olevien patenttivaatimusten katsotaan kattavan nämä muunnokset ja vaihtelut.
10 Esimerkki 8
Kokeet BMP-ll:n aktminiaktiivisuuden määrittämiseksi
Puhdistaminen toteutetaan alan asiantuntijalle tutuilla standarditekniikoilla. Mahdol-15 lista on se, samoin kuin muidenkin TGF-B-pääryhmään kuuluvien proteiinien tapauksessa, että puhdistaminen voi käsittää hepariini-Sepharosen käytön.
Proteiinianalyysi toteutetaan standarditekniikoilla, joista voidaan mainita SDS- • · · *·’ ] PAGE-akryyliamidi [Laemmli, Nature 227:680 (1970)] ja hopeavärjäys [Oakley, et ··· m 20 ai., Anal. Biochem. 105:361 (1980)] sekä immuunitäplä [Towbin, et ai., Proc. Natl.
··· :1·; Acad. Sei. USA, 76:4350 (1979)].
• · · • · · ··· · • · • · · • · · *!!.1 BMP-11-proteiinien muiksi tunnusomaisiksi piirteiksi voidaan lisäksi esittää niiden • · · kyky muokata follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) vapautumista vakiintuneissa 25 in vitro -biomäärityksissä, joissa käytetään aivolisäkkeen etulohkon soluja tavalla, • · · * · · · · .···. joka on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Vale et ai., Endocrinology, 91:562-572 • « (1972); Ling et ai, Nature, 321:779-782 (1986), tai Vale et ai., Nature, 321:776- • · · • · · *,1 779 (1986)], joiden julkaisujen sisältö liitetään oheen tällä viittauksella.
• · • · • · · • · · *·:.1 30 Vaihtoehtoisesti, BMP-ll:n tunnusomaiseksi piirteeksi voidaan esittää niiden kyky • · · • · 2 2 kiihottaa erytropoietiinin aktiivisuutta ihmisen K-562-solulinjassa, kuten on kuvattu 43 julkaisussa Lozzio et ai, Blood, 45:321—334 (1975), sekä US-patenttijulkaisun 5 071 834 palstassa 15, jotka julkaisut liitetään oheen tällä viittauksella.
Lisäksi BMP-11 :n tunnusomaiseksi piirteeksi voidaan esittää niiden aktiivisuus solu-5 jen eloonjäämismäärityksissä, joita on kuvattu julkaisussa Schubert, Nature, M4:868-870 (1990), joka julkaisu liitetään oheen tällä viittauksella.
Edellä olevissa kuvauksissa on kuvattu yksityiskohtaisesti esillä olevan keksinnön tällä hetkellä edullisina pidetyt suoritusmuodot. Lukuisat muunnokset ja vaihtelut 10 ovat odotettavia keksinnön käytännön sovellutuksissa ja ne ovat ilmeisiä alan asiantuntijalle tämän kuvauksen perusteella. Liitteenä olevien patenttivaatimusten katsotaan kattavan nämä muunnokset ja vaihtelut.
15 ··· • · · • · · ··· · • · ··· ·«·· • · • · · • · · ··· · • · • · · • · · ··· · ··· • · · • · · • · • · · • · · • · ··· • · • · • · · • · • · · • · · • · ··· • · • · · • 1 · · 1 · · ··· • · · 1 · · 44
SEKVENSSILUETTELO
(1) Yleisiä tietoja: (i) Hakija: (A) Nimi: Genetics Institute, Inc.
5 (B) Katu: 87 CambridgePark Drive (C) Kaupunki: Cambridge (D) Osavaltio: Massachusetts
(E) Maa: USA
(F) Postinumero (ZIP): 02140 10 (G) Puhelin: 617 876-1170 (H) Telefax: 617-876-5851 (ii) Keksinnön nimitys: BMP-11-koostumukset (iii) Sekvenssien lukumäärä: 11 (IV) Tietokoneella luettava muoto: 15 (A) Kantajatyyppi: levyke (B) Tietokone: IBM PC-yhteensopiva
(C) Käyttöjärjestelmä: PC-DOS/MS-DOS
(D) Ohjelmisto: Patentin Release 1,0, versio 1.25 (EPO) • · · ’·’ * 20 (2) SEQ ID NRO 1-sekvenssiin liittyvät tiedot: (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: • · · • · · · (A) Pituus: 789 emäsparia • · • · · "· · (B) Tyyppi: nukleiinihappo • · • · · · (C) Juosteisuus: kaksoisjuoste • · · • · · '·* 25 (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: DNA (perimästä) • · · * · * · ’ (iv) Alkuperäinen lähde: • · (A) Organismi: Bos Taurus
:,v (B) Kanta: N audan aktiviini W C
30 (ix) Piirre:
. (A) Nimi/tunnus: CDS
• · · • · · • · • · • · · 45 (B) Sijainti: 324 .. 704 (ix) Piirre: (A) Nimi/tunnus: misc_piirre (B) Sijainti: 322 .. 323 5 (D) Muut tiedot: /huom= "intronin oletettu 3'-pää" (ix) Piirre: (A) Nimi/tunnus; mat peptidi (B) Sijainti: 375 .. 701 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NRO 1: AAACTGTATT TTGGGGTGAA'GGTCTGAGTT AATAGATTCA CGGOACAACA AAGATGOCCT 60 GTTGTTGAGA CCTTGGGCCA AGGCGCTGAT GAGGGTCAGG TTGCCAAGAG AGAGAGAATT 120 AGGGAAGGTG ACTTTAGGGA GACATGGCTA GCTGGCAACA AAAGTGGGTA GAAAACAGGO 180 GTTGGGGAGG GCAGCACTGG AGAAGCTCAG AAATCACTTG GTCTCTCTTC TCCTCCCCCT 240 JQ ACTGAGGGGC AGGTGAGAAG AAACAGGGAG TAGGAGCTCC TCGAGGCTCT ATTACATCTC 300 TTTCTCCTCT CCCTCACCCC CAG CAT CCT TTT ATG GAG CZT CGA GTC CTA 350
Hie Pro Phe Met Glu Leu Arg Val Leu -17 -15 -10 GAS AAC ACA AAA CGG TCC CGG CGG AAC CTO GGC CTO GAC TGC GAT GAA 398
Glu Asn Thr Lye Arg Ser Arg Arg Aan Leu Gly Leu Aap Cye Aep Glu -5 15 CAT TCA AGT GAG TCC CCC TOT TGC CCC TAC CCC CTC ACT GTG GAC TTT 446
Hie Ser Ser Glu Ser Arg Cye Cya Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp 'Phe 10 15 20 • · · * GAG GCT TTT GGC TCG GAC TGG ATC ATC GCT CCT AAA CCC TAC AAG GCC «94 ....: Glu Ala Phe Gly Trp Aap Trp lie lie Ala Pro Lye Arg Tyr Lye Ale • * 25 30 35 40 # AAC TAC TGC TCC GGC CAG TGC GAG TAC ATG TTT ATG CAA AAG TAT CCG 542 !“* Aan Tyr Cye Ser Gly Gin Cye Glu Tyr Met phe Met Gin Lye Tyr Pro ::: 45 50 55 eee · I CAC ACC CAC TTG GTG CAA CAG GCT AAC CCA AGA GGC TCT GCG GGG CCC 590 ··· · Hie Thr Hie Leu Val Gin Gin Ala Aen Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro 60 65 70 eee TGC TGC ACA CCC ACC AAG ATG TCC CCA ATC AAC ATG CTC TAC TTC AAT 638
Cya Cye Thr Pro Thr Lye Ket Ser Pro Ile Aan Het Leu Tyr Phe Aen 75 80 85 e e • · e '·'·* GAC AAG CAG CAG ATT ATC TAC GGC AAG ATC CCT GGC ATG GTG GTG GAT 686 .·♦·. Aap Lye Gin Gin lie lie Tyr eiy Lye He pro Gly Met Val Val Aep ·...· so 95 loo e CCC TGT GCC TGC TCC TAAGGTGGGG GAGAGCGGAT CCCTCCCCAA CAGACGCXGC 741 ·.*.· Arg Cye Gly Cye Ser ··· 105 110 • e • e CCCTAGACTC CCCCAGCCCT GACCCCCTGC TCCCCGCCCC TAGAGCTC 789 e • e e • · e eee eee e e • · eee 46 (2) SEQ ID NRO 2-sekvenssiin liittyvät tiedot: (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: (A) Pituus: 126 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo 5 (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NRO 2:
His Pro Phe Met Glu Leu Arg Vai Leu Glu Asn Thr lys hra Ser hra -17 -15 -10 -5
Arg Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys 15 10 15
Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Vai Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp 20 25 30 lie Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys ser Gly Gin Cys 35 40 45
Glu Tyr Met Phe Met Gin Lys Tyr Pro Hls Thr Bis Leu Vai Gin Gin 50 55 60
Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met 65 70 75 • · · ·.· : Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gin Gin Ile Ile Tyr 80 85 90 95 • ·
Gly Lys Ile Pro Gly Het Vai Vai Asp Arg cys Gly Cys Ser 100 105 ; ·1· 10 • · · 1 v ··· · : (2) SEQ ID NRO 3-sekvenssiin liittyvät tiedot: : T: (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: (A) Pituus: 213 emäsparia : (B) Tyyppi: nukleiinihappo i j 15 (C) Juosteisuus: kaksoisjuoste . ·. ·. (D) Topologia: lineaarinen • · · • · . · · ·. (ii) Molekyylin tyyppi: DNA (perimästä) • · • s s ·. (iv) Alkuperäinen lähde: • · · • · · • · · · · • · • · • · · 47 (A) Organismi: Homo Sapiens (B) Kanta: Ihmisen aktiviini WC (ix) Piirre: (A) Nimi/tunnus: CDS 5 (B) Sijainti: 28 .. 183 (ix) Piirre: (A) Nimi/tunnus: misc_piirre (B) Sijainti: 184 .. 185 (D) Muut tiedot:/huom= "kaksi kolmasosaa kodonista osittaisen kloonin 10 päässä" (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NRO 3:
TCTAGATGCT CCGGCCAGTG CGAGTAC ATG TTC ATG CAA AAA TAX CCG CAT SI
Met Pbe Het Gin Ly e Tyr Pre Bie 1 5 ACC CAT TTC GTO CAG CAG GCC AAT CCA AGA CGC TCT CCT GGG CCC TGT 99
Thr Hill Leu Vai Gin Gin Ala Aan Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cye 10 15 20 TGT ACC CCC ACC AAG ATG TCC CCA ATC AAC ATG CTC TAC TTC AAT GAC 147
Cye Thr Pro Thr Lye Met ser Pro lie Aan Net Leu Tyr phe Aan Asp 25 30 35 40 AAG CAG CAG ATT ATC TAC GGC AAS ATC CCT GGC ATG CTGGTGGATC 193
Lye Gin Gin Ile Ile Tyr Gly Lye Ile Pro Gly Met *5 50 • · 1 .I". GCTGTGGCTG CTCCGGATCC 213 • · • · · • 1 · · : : 1: 15 (2) SEQ ID NRO 4-sekvenssiin liittyvät tiedot: • (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: • · a · : 1 i 1: (A) Pituus: 52 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo : V: (D) Topologia: lineaarinen 20 (ii) Molekyylin tyyppi: proteiini .(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NRO 4: e e e • · • e · e e e · ··· e • e e e e e e • e# e · e e • e « e · 48
Met phe Met Gin Lye Tyr Pro Hie Thr His Leu val Gin Gin Ala Asn 15 10 15
Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cya Cys Thr Pro Thr Lya Met Ser Pro 20 25 30
Ile Aen Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lye Gin Gin He lie Tyr Gly Lye 35 40 45 lie Pro Gly Met 50 (2) SEQ ID NRO 5-sekvenssiin liittyvät tiedot: (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: 5 (A) Pituus: 30 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: DNA (perimästä) 10 (iv) Alkuperäinen lähde: (A) Organismi: Naudan aktiviiniin WC sopiva aluke C (ix) Piirre: (A) N imi/tunnus: misc_piirre S·.' (B) Sijainti: 1 .. 9 • · · 15 (D) Muut tiedot:/huom= "Xbal :n restriktiokohta" • · (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NRO 5: • · • · · • · · : /, TAGTCTAGAT GCTCCQGCCA GTGCGAGTAC 30 • · · ··· e • · · • · e • e · • 20 (2) SEQ ID NRO 6-sekvenssiin liittyvät tiedot: • · O .· (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: • · · S : (A) Pituus: 30 emäspana (B) Tyyppi: nukleiinihappo • · · • a .···. (C) Juosteisuus: yksinkertainen • · ♦ · ♦ 25 (D) Topologia: lineaarinen • « · • · · ··· 1 2 3 · · 2 • · • · 3 49 (ii) Molekyylin tyyppi: DNA (perimästä) (iv) Alkuperäinen lähde: (A) Organismi: Naudan aktiviiniin WC sopiva aluke D (ix) Piirre: 5 (A) Nimi/tunnus: misc_piirre (B) Sijainti: 1 .. 9 (D) Muut tiedot:/huom= "BamHIrn restriktiokohta" (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NRO 6: TGCGGATCCG GACCAGCCAC ACCGATCCAC 30 10 (2) SEQ ID NRO 7-sekvenssiin liittyvät tiedot: (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: (A) Pituus: 15 emäsparia 15 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: DNA (perimästä) . ·: ·, (iv) Alkuperäinen lähde: • · ·
20 (A) Organismi: pMT2 CXM-vektoriin istutettu DNA
• · (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NRO 7: ···· • · • · · • · · • · CATOCGCAGC TCGAC 15 * · · • · « • · · · • · ·
• · I
• · t • 25 (2) SEQ ID NRO 8-sekvenssiin liittyvät tiedot: . 1. 1. (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: • · . 1 1 ·. (A) Pituus: 34 emäsparia • · · (B) Tyyppi: nukleiinihappo • · · • · · *.1 (C) Juosteisuus: yksinkertainen • · • · *” 30 (D) Topologia: lineaarinen • · · • · · • · · · · • · • · • · · 50 (ii) Molekyylin tyyppi: DNA (perimästä) (iv) Alkuperäinen lähde: (A) Organismi: pMT21-vektoriin istutettu DNA (ix) Piirre: 5 (A) Nimi/tunnus: misc_piirre (B) Sijainti: 1 .. 6 (D) Muut tiedot:/huom= "Pst-restriktiokohta" (ix) Piirre: (A) Nimi/tunnus: misc piirre 10 (B) Sijainti: 15 ..26 (D) Muut tiedot:/huom= "Eco Rl- ja Xhol-restriktiokohdat" (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NRO 8: CTGCACeCGJt GCCTBAATTC CTCGAGCCAT CATG 34 15 (2) SEQ ID NRO 9-sekvenssiin liittyvät tiedot: (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: (A) Pituus: 68 emäsparia ... (B) Tyyppi: nukleiinihappo • · · | . 20 (C) Juosteisuus: yksinkertainen • · (D) Topologia: lineaarinen J (ii) Molekyylin tyyppi: DNA (perimästä) • · · • * V (iv) Alkuperäinen lähde: • · · (A) Organismi: Osa EMC-viruksen johtosekvenssistä • · i 25 (x) Julkaistut tiedot: . (A) Kirjoittajat: Jung, S.K.
l.l (C) Julkaisu: J. Virol.
*1* (D) Vuosikerta: 63 • · •‘•V (F) Sivut: 1651-1660 ··· :·#··: 30 (G) Päiväys: 1989 ί^ί (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NRO 9: ··· • · • · • · · 51 CGAGGTTAAA AAACGTCTAG GCCCCCCGAA CCACCGGGAC GTGGTTTTCC mCMMOC 60 ACGATTGC 68 (2) SEQ ID NRO 10-sekvenssiin liittyvät tiedot: (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: 5 (A) Pituus: 1270 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: DNA (perimästä) 10 (iv) Alkuperäinen lähde: (A) Organismi: Ihmisen BMP-11 (vii) Välitön lähde: (B) Klooni: FB30.5 (ix) Piirre:
15 (A) Nimi/tunnus: CDS
(B) Sijainti: 1 .. 1086 (ix) Piirre: (A) Nimi/tunnus: mat_peptidi ’·* [ (B) Sijainti: 760 .. 1086 20 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NRO 10: ·· 6 • · · · • · • · · • · * ’**.* G AG CGC TCC AGC CGG CCA GCC CCG TCC GTG G CG CCC GAG CCO GAC GCC 48 : : : elu arg Ser Ser Arg pro Ai* Pro S«r v*l AI* Pro Glu Pro Asp Gly *·· · -253 -250 -245 -240 • · · • · · *·* * TCC CCC GTG TCC G TT TGG CCO CAG CAC ACC CCC GAG CTC CCC CTA GAG 96
Cye Pro Vai Cya Vai Trp Arg dn Hie Ser Arg Glu Leu Arg Leu Glu -235 -230 -225 I : : AGC ATC AAG TCC CAG ATC TTG AGC AAA CTG CGC CTC AAC GAG GCG CCC 144
Ser Ile Lye Ser Gin Ile Leu ser Lye Leu Arg Lee Lye Glu Ala Pro : : -220 -215 -210 ··· AAC ATC AGC CGC GAG GTG GTG AAG CAG CTG CTG CCC AAG GCG COG CCG 192 • : : A*n Ile 8er Arg Glu Vai Vai Lye Qln Leu Leu Pro Ly* Ala Pro Pro .·.* -205 -200 -195' -190 ·*· ·...· CTG CAG CAG ATC CTG GAC CTA CAC CAC TTC CAG CGC GAC GCG CTG CAG 2*0 . Leu Gin Gin Ile Leu Asp Leu Hi* Asp Phe Gin Gly Asp Ale Leu Gin . .·. -18S -180 -175 e e e e e e e e e e e e e e e e 52 CCC GAO GAC nc CTO GAG GAO GAC GAO TAG CAC GCC ACC ACC OAG ACC 288
Pro Olli Asp Ph· Lou Glu elu Asp Glu Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr -170 -165 -160 GTC ATT ACC ATO GCC CAG GAG ACG GAC CCA GCA CTA CAO ACA GAT GGC 336
Val lie Ser Hat Ala Gin Glu Thr Asp Pro Ala Val Gin Thr Asp Gly -155 -150 -145 AGC CCT CTC TGC TGC CAT TTT CAC TTC AGC CCC AAG GTG ATG TTC ACA 384
Ser Pro Leu Cye eye Hie Phe His Phe Ser Pro Lye Val Met Phe Thr -140 -135 -130 AAG OTA CSC AAG GCC CAG CTG TCG GTG TAC CTA COG CCT GTA CCC CGC 432
Lys Val Leu Lye Ala Gin Leu Trp Val Tyr Leu Arg Pro Val Pro Arg -125 -120 -115 -110 CCA GCC ACA GTC TAC CTG CAG ATC TTG CGA CTA AAA CCC CTA ACT GOG 4B0
Pro Ala Thr val Tyr Leu Gin lie Leu Arg Leu Lys Pro Leu Thr Gly -105 -100 -95 GAA GGG ACC GCA GGG GGA GGG GGC GGA GGC CGG CGT CAC ATC CGT ATC 526
Glu Gly Thr Ala Gly Oly Gly Gly Gly Gly Arg Arg Hie lie Arg He -90 -55 -80 CGC TCA CTG AAG ATT GAO CTG CAC TCA CGC TCA GGC CAT TGC CAO AGC 576
Arg Ser Leu Lye He Glu Leu Hie Ser Arg ser Gly Hie Trp Gin ser -75 -70 -65 ATC GAC TTC AAG CAA GTG CTA CAC AGC TGG TTC CGC CAC CCA CAG AGC 624 lie Asp Phe Lye Gin Val Leu Hie Ser Trp Phe Arg Gin Pro Gin Ser -60 -55 -50 AAC TGG GGC ATC OAO ATC AAC CCC TTT OAT CCC AGT GGC ACA GAC CTG 672
Aen Trp Gly He olo He Aen Ala Phe Asp Pro ser Gly Thr Asp Leu -45 -40 -35 -30 GCT GTC ACC TCC CTO CGC CCC CCA CCC GAC GGG CTG CAT CCA TTC ATG 720
Ala Val Thr Ser Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly Leu Hie Pro Phe Met -25 -20 -15 GAG CTT CGA OTC CTA GAO AAC ACA AAA CGT TCC CGG CGG AAC CTG GGT 768 *.* * Glu Leu Arg Val Leu Glu Aen Thr Lys Arg Ser Arg Arg Asn Leu Gly ....: -10 ~5 1 • e . CTG GAC TCC GAC GAG CAC TCA AGC GAG TCC CGC TCC TGC CCA TAT CCC 816 *;* Leu Aep Cye Aep Glu Hie Ser Ser Glu Ser Arg Cye Cye Arg Tyr Pro ··*· 5 10 15 e e : CTC ACA CTG CAC τη GAG GCT TTC GGC TGC CAC TGG ATC ATC GCA CCT 864 ; Leu Thr Val Aep Phe Glu Ala Phe Gly Trp Aep Trp 21e lie Ala Pro :.: : 20 25 30 35 aag ogc tag aao gcc aac tag tgc tcc ggc cag toc gag tag ato ttc 912 • Lye Arg Tyr Lye Ala Aen Tyr Cye Ser Oly Oln Cye Glu Tyr Met Phe 40 45 50 .·· ATO CAA AAA TAT CCO CAT ACC CAT TTC GTG CAG CAG GCC AAT CCA AOA 960 ·.· · Met Oln Lye Tyr Pro His Thr Hie Leu Val Oln Oln Ala Aen Pro Arg ... 55 60 65 • a e a aaa a • a • a a • a a a a aaa • · • a :* 5 a • · · • a a aaa a e a • a • a • a a 53 CSC TCT GCI GGG CCC TGT TGT ACC CCC ACC AAC ATG TCC CCA ATC AAC looa
Cly Ser Ala Gly Pro Cye Cye Thr Pro Tbr Lye Met ser pro Ile Aan 70 75 80 APS CTC TAC TTC AAT CAC AAC CAG CAO ATT ATC TAC CGC AAG ATC CCT 1056
Met Leu Tyr Phe Aen Aep Lye Gin Gin lie He Tyr Gly Lye He Pro 85 90 95 GGC ATG OTG GIG GAT CGC TGT GGC TGC TCT TAA6GT66GG GATAGAGGAT H06
Gly Met Val Val Aep Arg Cye Gly Cye Ser 100 105 GCCTCCCCCA CAGACCCTAC CCCAAGACCC CTAGCCCTGC CCCCATCCCC CCAAGCCCTA 1166 GAGCTCCCTC CACTCTTCCC GCGAACATCA CACCGTTCCC CGACCAAGCC GTGTCGAAXA 1226 CAACAGAGGG AGGCAGGTGG GAATTGAGGG TGAGGGGTTT GOGG 1270 (2) SEQ ID NRO 11-sekvenssiin liittyvät tiedot: (i) Sekvenssin tunnusomaiset piirteet: 5 (A) Pituus: 362 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NRO 11: 10
Glu Arg ser Ser Arg Pro Ala Pro Ser Vai Ala Pro Gin Pro Asp Gly ... -253 -250 -245 -240 • · e
Cye Pro Vai Cye Vai Trp Arg Gin Hie ser Arg Glu Lew Arg Leu Glu -235 -230 -225 ··· Ser Ile Lya Ser Gin Ile Leu ser Lye Leu Arg Leu Lye Glu Ala Pro ··*· -220 -215 -210 • e • · e ··· · Aan lie Ser Arg Glu Vai Vai Lya Gin Leu Leu pro Lye Ala Pro Pro : .*. -205 -200 -195 -190 • e e • ♦ e e
Leu Gin Gin Ile Leu Asp Leu His Aep Phe Gin Gly Asp Ala Leu Gin *.* * -1B5 -180 -175
Pro Glu Asp Phe Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr . . -170 -165 -160 • e e M Vai Ile Ser Ket Ala Gin Glu Thr Aep Pro Ala Vai Gin Thr Aep Gly : : -155 -150 -145 eee ·*. Ser Pro Leu Cye Cye Hie Phe His Phe Ser Pro Lya Vai Het Phe Thr ::: -140 -135 -130 eee e e • e • e e e • e e e eee eee eee • e • e eee 54
Lya Vai Leu Lye Ala Gin Leu Trp Val Tyc Leu Arg Pro Val Pro Arg -125 “120 -115 -110
Pro Ala Thr Val Tyr Leu Gin He Leu Arg Leu Lye Pro Leu Thr Gly -105 -100 -95
Glu Gly Thr Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg Hie Ile Arg He -90 -85 -80
Arg Ser Leu Lye He Glu Leu His Ser Arg Ser Gly Bis Trp Gin Ser -75 -70 -65
He Asp Phe Lye Gin Val Leu Hie ser Trp Phe Arg Gin Pro Gin Ser -60 -55 -50
Aan Trp Gly He Glu He Aen Ala Phe Asp Pro Ser Gly Thr Asp Leu -45 -40 -35 -30
Ala Val Thr Ser Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly Leu His Pro Phe Met -25 -20 -15
Glu Leu Arg Val Leu Glu Aen Thr Lya Arg Ser Arg Arg Aen Leu Gly -10 -5 1
Leu Aap Cys Asp Glu HiS ser ser Glu ser Arg Cya Cye Arg Tyr Pro 5 10 15
Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Aap Trp He He Ala Pro 20 25 30 35
Lye Arg Tyr Lye Ala Aen Tyr Cya Ser Gly Gin Cye Glu Tyr Met Phe 40 45 50
Met Gin Lye Tyr Pro Hie Thr His Leu Val Gin Gin Ala Aen Pro Arg 55 60 65
Gly Ser Ala Gly Pro Cya Cye Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro He Aen 70 75 80 e e e e e e e e e e *:**: Met Leu Tyr Phe Aen Asp Lye Gin Gin He He Tyr Gly Lye lie Pro . 85 90 95 • · · "** ely Met Val Val Asp Arg Cya Gly Cye Ser : 100 105 e e a • ee « e e • e e e a · eee e ee· eee • e · e a e e a · eee e a • · G e e • e eee e e e • · · eee e e eee e e e e ee* e e eee eee eee eee e e e e eee

Claims (47)

1. Eristetty DNA-molekyyli, joka käsittää SEQ ID NRO 1 -sekvenssin nukleotidistä 375 tai 390 nukleotidiin 701. 5
2. Eristetty DNA-molekyyli, joka käsittää SEQ ID NRO 10 -sekvenssin nukleotidistä 760 tai 775 nukleotidiin 1086.
3. Eristetty DNA-molekyyli, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa SEQ 10 ID NRO 2 -sekvenssin aminohappoja 1 tai 6 - 109.
4. Eristetty DNA-molekyyli, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminohappoja 1 tai 6 - 109.
5. Eristetty DNA-molekyyli, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminohaposta 1 tai 7 aminohappoon 108.
6. DNA-sekvenssi, joka koodaa BMP-11-aktiivisuutta omaavan proteiinin, • · i ·* ] tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi käsittää minkä tahansa patentti- • M · 20 vaatimuksen 1-5 mukaisen sekvenssin luonnossa esiintyvät alleeliset sekvenssit ·♦· • * * * ja vastaavat degeneratiiviset kodonisekvenssit. • · · • · ♦ ··· ♦ • · • · * • · · *11.* 7. DNA-sekvenssi, joka koodaa vähintään yhtä BMP-11-aktiivisuutta omaavan • · * proteiinin, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi hybridisoituu minkä SS' 25 tahansa patenttivaatimuksen 1 - 5 mukaiselle sekvenssille komplementaarisen • · · • · .··♦. sekvenssin kanssa tarkoin rajatuissa hybridisaatio-olosuhteissa, käsittäen esimer- • · ··· kiksi hybridisoinnin 65 °C:ssa ja huuhtelun 65 °C:ssa 0,1 x SSCrssä, 0,1 % • · · M SDSissä. • · • · ··· • · · **j·* 30 8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että • · ··** BMP-11-aktiivisuus on valittu follikkelia stimuloivan hormonin tuotannon sääte- lyn, hermosolujen elossapysymisen edistämisen, hematopoieesin stimuloinnin ja sukurauhaskasvaimien kehittymisen tukahduttamisen joukosta.
9. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että
5 BMP-11-aktiivisuus on valittu luunmuodostuksen indusoinnin, rustonmuodostuk- sen indusoinnin, muun sidekudoksen muodostuksen indusoinnin, luunmurtuman hoidon, synnynnäisten kallo-kasvovikojen koijauksen, vammasta johtuvien kallo-kasvovikojen koijauksen, syövästä johtuvien kallo-kasvovikojen koijauksen, hampaan ympäryskudoksen sairauksien hoidon, haavojen hoidon, palohaavojen hoi-10 don, viiltohaavojen hoidon, haavaumien hoidon, luunmurtumien koijauksen, elinsiirtojen hoidon ja sellaisten tilojen hoidon, joihin liittyy hermosolujen heikentynyttä elossapysymistä, joukosta.
10. Kimeerinen DNA-molekyyli, joka käsittää proteiinien TGF-B-pääryhmään 15 kuuluvasta jäsenestä peräisin olevaa propeptidiä koodaavan DNA-sekvenssin kytkettynä samaan lukukehykseen minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen DNA-sekvenssin kanssa. • · · • · · *·* * 11. Isäntäsolu, joka on transformoitu jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisella ··· ·
20 DNA-molekyylillä. ·*♦ ···♦ • · • ♦ · • · ·
12. Vektori, joka käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen DNA- • · ♦ molekyylin liitettynä toiminnallisesti sen ilmentymistä säätävään sekvenssiin. • · ·
13. Isäntäsolu, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 12 mukaisella vektoril- • · · • · ·♦· la • · ια· • · ··· • · • · · • · ·
14. Menetelmä puhdistetun luun morfogeneettisen proteiinin 11 (BMP-11) tuot- • · *1* tamiseksi, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa: • · · *·:·* 30 ··· • · *··* (a) viljellään patenttivaatimuksen 11 tai 13 mukaista isäntäsolua; ja (b) mainittu BMP-11-proteiini otetaan talteen ja puhdistetaan.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on transformoitu DNA-molekyylillä, joka käsittää SEQ ID NRO 1 - 5 sekvenssin nukleotidit 375-701.
16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on transformoitu DNA-molekyylillä, joka käsittää SEQ ID NRO 10 -sekvenssin nukleotidit 760 - 1086. 10
17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on transformoitu DNA-molekyylillä, joka käsittää SEQ ID NRO 1 -sekvenssin nukleotidejä 375 - 701 vastaavat degeneratiiviset kodonisekvenssit.
18. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on transformoitu DNA-molekyylillä, joka käsittää SEQ ID NRO 10 -sekvenssin nukleotidejä 760 - 1086 vastaavat degeneratiiviset kodonisekvenssit. ·· · • · · *·* 19. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu • 7 • M · 20 isäntäsolu on transformoitu DNA-molekyylillä, joka käsittää nukleotidisek- ··· **** venssin, joka koodaa SEQ ID NRO 2 -sekvenssin aminohappoja 1 tai 6 - 109. • · · • · · ··· · • · • · · • · · ‘II.* 20. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu • · · 7 7 • · · isäntäsolu on transformoitu DNA-molekyylillä, joka käsittää nukleotidisek-25 venssin, joka koodaa SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminohappoja 1 tai 6 - 109. • · · • · ··· • · • · ··· .·, 21. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu • · · « · · I.isäntäsolu on nisäkässolu. • · • · ··· • · ·
22. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ··· • · ···* isäntäsolu on CHO-solu.
23. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on COS-l-solu.
24. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on CV-1-solu.
25. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on bakteerisolu. 10
26. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu on E. coli -solu.
27. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu 15 isäntäsolu on B. subtilis -solu.
28. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu •.. isäntäsolu on Pseudomonas-sohi. • · · • · · • ·
29. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ···· : isäntäsolu on hiivasolu. • · · ··· · • · * · « • · · ··· · ·*:*. 30. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu • · · ' ' m isäntäsolu on hyönteissolu. 25 • ·
31. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu * · · isäntäsolu on nisäkässolu ja tämä DNA-molekyyli käsittää lisäksi proteiinien ·*·' TGF-B-pääryhmään kuuluvasta jäsenestä peräisin olevaa propeptidiä koodaavan ···* DNA-sekvenssin, joka propeptidiä koodaava DNA-sekvenssi on kytketty asian- • · · 30 mukaiseen lukukehykseen koodaavan DNA-sekvenssin kanssa. • l ·«·
32. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää lisäksi vaiheen, jossa mainittu polypeptidi dimerisoidaan kaksi alayksikköä käsittäväksi homodimeeriksi, jossa kumpikin alayksikkö käsittää vähintään SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminohapot 1-108 käsittävän amino hap- 5 posekvenssin.
33. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää lisäksi vaiheen, jossa puhdistettu luun morfogeneettinen proteiini-11 (BMP-11) -polypeptidi dimerisoidaan kaksi alayksikköä käsittäväksi hetero- 10 dimeeriksi, jossa yksi alayksikkö käsittää SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminohapot 1-109 käsittävän aminohapposekvenssin ja toinen alayksikkö käsittää BMP- I :n aminohapposekvenssin.
34. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mene-15 telmä käsittää lisäksi vaiheen, jossa puhdistettu luun morfogeneettinen proteiini- II (BMP-11) -polypeptidi dimerisoidaan kaksi alayksikköä käsittäväksi hetero-dimeeriksi, jossa yksi alayksikkö käsittää SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminoha-pot 1-109 käsittävän aminohapposekvenssin ja toinen alayksikkö käsittää BMP- • · · |>M. 2 :n aminohapposekvenssin. . 20 • · · • · · · : 35. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mene- • · · • · · · : telmä käsittää lisäksi vaiheen, jossa puhdistettu luun morfogeneettinen proteiini- • · · · 11 (BMP-11) -polypeptidi dimerisoidaan kaksi alayksikköä käsittäväksi hetero- dimeeriksi, jossa yksi alayksikkö käsittää SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminoha- :Y; 25 pot 1 - 109 käsittävän aminohapposekvenssin ja toinen alayksikkö käsittää BMP- • · 3 :n aminohapposekvenssin. ··· • · • · · • · · • · .···. 36. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mene- • · • · · *. telmä käsittää lisäksi vaiheen, jossa puhdistettu luun morfogeneettinen proteiini- • · · • · · III 30 11 (BMP-11) -polypeptidi dimerisoidaan kaksi alayksikköä käsittäväksi hetero- • · dimeeriksi, jossa yksi alayksikkö käsittää SEQ ID NRO 11 -sekvenssin amino ha- pot 1-109 käsittävän aminohapposekvenssin ja toinen alayksikkö käsittää BMP-4:n aminohapposekvenssin.
37. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mene-5 telmä käsittää lisäksi vaiheen, jossa puhdistettu luun morfogeneettinen proteiini- 11 (BMP-11) -polypeptidi dimerisoidaan kaksi alayksikköä käsittäväksi hetero-dimeeriksi, jossa yksi alayksikkö käsittää SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminohapot 1-109 käsittävän aminohapposekvenssin ja toinen alayksikkö käsittää BMP-5:n aminohapposekvenssin. 10
38. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää lisäksi vaiheen, jossa puhdistettu luun morfogeneettinen proteiini-11 (BMP-11) -polypeptidi dimerisoidaan kaksi alayksikköä käsittäväksi hetero-dimeeriksi, jossa yksi alayksikkö käsittää SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminoha- 15 pot 1-109 käsittävän aminohapposekvenssin ja toinen alayksikkö käsittää BMP-6:n aminohapposekvenssin. ... 39. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mene- • · · • · · telmä käsittää lisäksi vaiheen, jossa puhdistettu luun morfogeneettinen proteiini- • · 20 11 (BMP-11) -polypeptidi dimerisoidaan kaksi alayksikköä käsittäväksi hetero- dimeeriksi, jossa yksi alayksikkö käsittää SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminoha- • · · « · · φ • ,·# pot 1-109 käsittävän aminohapposekvenssin ja toinen alayksikkö käsittää BMP- • · · • · · » .·: ·. 7 :n aminohapposekvenssin. • · ·
40. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mene- • · · • · .***. telmä käsittää lisäksi vaiheen, jossa puhdistettu luun morfogeneettinen proteiini- • · · e/. 11 (BMP-11) -polypeptidi dimerisoidaan kaksi alayksikköä käsittäväksi hetero- • · · .·.*. dimeeriksi, jossa yksi alayksikkö käsittää SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminoha- • · •m pot 1-109 käsittävän aminohapposekvenssin ja toinen alayksikkö käsittää BMP- • · · ;** 30 8:n aminohapposekvenssin. • · • · ·· ·
41. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää lisäksi vaiheen, jossa puhdistettu luun morfogeneettinen proteiini-11 (BMP-11) -polypeptidi dimerisoidaan kaksi alayksikköä käsittäväksi hetero-dimeeriksi, jossa yksi alayksikkö käsittää SEQ ID NRO 11 -sekvenssin aminoha- 5 pot 1-109 käsittävän aminohapposekvenssin ja toinen alayksikkö käsittää BMP-9:n aminohapposekvenssin.
42. Puhdistetun luun morfogeneettinen proteiini-11 (BMP-11) -polypeptidin käyttö in vitro follikkelia stimuloivan hormonin vapauttamisen säätelemiseksi, 10 tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää SEQ ID NRO 2 -aminohapposekvenssin aminohapot 1-109.
43. Puhdistetun luun morfogeneettinen proteiini-11 (BMP-11) -polypeptidin käyttö in vitro follikkelia stimuloivan hormonin vapauttamisen säätelemiseksi, 15 tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää SEQ ID NRO 11 -aminohapposekvenssin aminohapot 1-109.
44. Puhdistetun luun morfogeneettinen proteiini-11 (BMP-11) -polypeptidin käyt- • · · ....j tö in vitro erytropoietiiniaktiivisuuden stimuloimiseksi, tunnettu siitä, että • · 20 polypeptidi käsittää SEQ ID NRO 2 -aminohapposekvenssin aminohapot 1 - 109. ···· • · • · · • · · ··· · : 45. Puhdistetun luun morfogeneettinen proteiini-11 (BMP-11) -polypeptidin käyt- ··· · tö in vitro erytropoietiiniaktiivisuuden stimuloimiseksi, tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää SEQ ID NRO 11 -aminohapposekvenssin aminohapot 1 - :V: 25 109. • · ··· • · • · • · ·
46. Puhdistetun luun morfogeneettinen proteiini-11 (BMP-11) -polypeptidin käyt- • · · • · .*·*. tö in vitro hermosolujen elossapysymisen säätelemiseksi, tunnettu siitä, että ··· *. polypeptidi käsittää SEQ ID NRO 2 -aminohapposekvenssin aminohapot 1-109. • · · ♦ · · ::: 30 • · • · ♦··
47. Puhdistetun luun morfogeneettinen proteiini-11 (BMP-11) -polypeptidin käyttö in vitro hermosolujen elossapysymisen säätelemiseksi, tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää SEQ ID NRO 11 -aminohapposekvenssin aminohapot 1 -109. 5 • · · * · · • · · • · • · · • · · · • · • · · • · ♦ • · · · • · • · · • · · • · · · • · · • · · • · · • 1 • 1 · • · · • · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · · • · · · • · • · 1
FI955419A 1993-05-12 1995-11-10 BMP-11:tä koodaavat DNA-sekvenssit, valmistusmenetelmä ja käytöt in vitro FI119696B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6146493A 1993-05-12 1993-05-12
US6146493 1993-05-12
US9405288 1994-05-12
PCT/US1994/005288 WO1994026892A1 (en) 1993-05-12 1994-05-12 Bmp-11 compositions

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI955419A0 FI955419A0 (fi) 1995-11-10
FI955419A FI955419A (fi) 1996-01-08
FI119696B true FI119696B (fi) 2009-02-13

Family

ID=22035966

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI955419A FI119696B (fi) 1993-05-12 1995-11-10 BMP-11:tä koodaavat DNA-sekvenssit, valmistusmenetelmä ja käytöt in vitro

Country Status (17)

Country Link
US (7) US5639638A (fi)
EP (4) EP1378572B1 (fi)
JP (2) JP3681069B2 (fi)
KR (1) KR100227406B1 (fi)
AT (2) ATE258984T1 (fi)
AU (1) AU678582B2 (fi)
BR (1) BR9406715A (fi)
CA (1) CA2161808C (fi)
DE (2) DE69434875T2 (fi)
DK (2) DK1378572T3 (fi)
ES (2) ES2213745T3 (fi)
FI (1) FI119696B (fi)
HK (1) HK1060898A1 (fi)
NO (1) NO320119B1 (fi)
OA (1) OA10191A (fi)
PT (2) PT1378572E (fi)
WO (1) WO1994026892A1 (fi)

Families Citing this family (134)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE20004692U1 (de) 2000-03-14 2001-07-26 Sofamor Danek Gmbh Wirbelimplantat zum Einschrauben in einen Wirbelzwischenraum
US6150328A (en) * 1986-07-01 2000-11-21 Genetics Institute, Inc. BMP products
US20080139474A1 (en) * 1991-11-04 2008-06-12 David Israel Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
WO1993009229A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 Genetics Institute, Inc. Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
US20030074680A1 (en) * 1993-03-19 2003-04-17 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US6465239B1 (en) * 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
US7393682B1 (en) * 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
EP1378572B1 (en) * 1993-05-12 2006-10-25 Genetics Institute, LLC Bmp-11 compositions
US6291206B1 (en) * 1993-09-17 2001-09-18 Genetics Institute, Inc. BMP receptor proteins
ATE319823T1 (de) * 1993-12-07 2006-03-15 Inst Genetics Llc Bmp-12, bmp-13 und diese enthaltende sehne- induzierende zusammensetzungen
US5942496A (en) 1994-02-18 1999-08-24 The Regent Of The University Of Michigan Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
US7332575B2 (en) * 1994-03-18 2008-02-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptide from aquatic species, and transgenic aquatic species
US5906827A (en) * 1994-06-03 1999-05-25 Creative Biomolecules, Inc. Matrix for the manufacture of autogenous replacement body parts
US5914234A (en) * 1994-07-08 1999-06-22 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-11
US20030167492A1 (en) 1994-07-08 2003-09-04 Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a gdf-11 dominant negative polypeptide, and methods of making and using same
US6008434A (en) 1994-07-08 1999-12-28 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-11 transgenic mice
US5846770A (en) * 1994-11-22 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding human chordin
US5645084A (en) * 1995-06-07 1997-07-08 Danek Medical, Inc. Method for spinal fusion without decortication
US5635372A (en) * 1995-05-18 1997-06-03 Genetics Institute, Inc. BMP-15 compositions
EP1364656B1 (en) 1995-06-05 2013-11-20 Genetics Institute, LLC Use of bone morphogenetic proteins for healing and repair of connective tissue attachment
US5902785A (en) * 1995-06-06 1999-05-11 Genetics Institute, Inc. Cartilage induction by bone morphogenetic proteins
US5700774A (en) * 1996-03-26 1997-12-23 Genetics Institute, Inc. Compositions comprising bone morphogenic proteins and truncated parathyroid hormone related peptide, and methods of inducing cartilage by administration of same
US5965403A (en) * 1996-09-18 1999-10-12 Genetics Institute, Inc. Nucleic acids encoding bone morphogenic protein-16 (BMP-16)
US6037519A (en) 1997-10-20 2000-03-14 Sdgi Holdings, Inc. Ceramic fusion implants and compositions
AU742365B2 (en) 1997-03-14 2002-01-03 Selective Genetics, Inc. Adenoviral vectors with modified tropism
US7041641B2 (en) 1997-03-20 2006-05-09 Stryker Corporation Osteogenic devices and methods of use thereof for repair of endochondral bone and osteochondral defects
US20010016646A1 (en) 1998-03-20 2001-08-23 David C. Rueger Osteogenic devices and methods of use thereof for repair of endochondral bone, osteochondral and chondral defects
EP1988395A1 (en) 1997-05-30 2008-11-05 Curis, Inc. Methods for evaluating tissue morphogenesis and morphogenic activity
US5972368A (en) 1997-06-11 1999-10-26 Sdgi Holdings, Inc. Bone graft composites and spacers
EP1007673B1 (en) 1997-07-30 2008-12-17 Emory University Novel bone mineralization proteins, dna, vectors, expression systems
US7923250B2 (en) 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
AU8666398A (en) * 1997-08-01 1999-02-22 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6696260B1 (en) * 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
US20020052026A1 (en) 1997-10-08 2002-05-02 Steven M. Vicik Methods of refolding proteins
US6511509B1 (en) 1997-10-20 2003-01-28 Lifenet Textured bone allograft, method of making and using same
AU1276399A (en) * 1997-11-07 1999-05-31 Genetics Institute Inc. Neuronal uses of bmp-11
US6027917A (en) 1997-12-10 2000-02-22 Genetics Institute, Inc. Bone morphogenetic protein (BMP)-17 and BMP-18 compositions
US20030036629A1 (en) * 1997-12-12 2003-02-20 Barry Foster Novel tgf-beta protein purification methods
US6004937A (en) * 1998-03-09 1999-12-21 Genetics Institute, Inc. Use of follistatin to modulate growth and differentiation factor 8 [GDF-8] and bone morphogenic protein 11 [BMP-11]
US7147839B2 (en) 1998-05-29 2006-12-12 Curis, Inc. Methods for evaluating tissue morphogenesis and activity
CA2336536A1 (en) * 1998-07-28 2000-02-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-11
JP4156197B2 (ja) 1998-08-06 2008-09-24 ウォーソー・オーソペディック・インコーポレーテッド 複合型椎骨間スペーサ
US6849255B2 (en) * 1998-08-18 2005-02-01 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Methods and compositions for enhancing cartilage repair
US6727224B1 (en) 1999-02-01 2004-04-27 Genetics Institute, Llc. Methods and compositions for healing and repair of articular cartilage
EP1181041A2 (en) * 1999-04-30 2002-02-27 Curis, Inc. Morphogen-induced enhancement of fertility
WO2001045577A2 (en) 1999-12-06 2001-06-28 Sdgi Holdings, Inc. Intervertebral disc treatment devices and methods
US20030082233A1 (en) * 2000-12-01 2003-05-01 Lyons Karen M. Method and composition for modulating bone growth
US6752831B2 (en) 2000-12-08 2004-06-22 Osteotech, Inc. Biocompatible osteogenic band for repair of spinal disorders
EP1341484B1 (en) 2000-12-08 2009-05-06 Osteotech, Inc. Implant for orthopedic applications
US7141392B2 (en) 2001-01-09 2006-11-28 Queen Mary And Westfield College Latent fusion protein
US6942853B2 (en) * 2001-01-09 2005-09-13 Queen Mary And Westfield College Latent fusion protein
EP1790726B1 (en) * 2001-02-08 2013-07-03 Wyeth LLC Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
TW200526779A (en) 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
KR100420798B1 (ko) * 2001-02-10 2004-03-02 (주)알에이싸이언스 펩타이드 벡터
WO2002099037A2 (en) * 2001-06-01 2002-12-12 Wyeth Compositions and methods for systemic administration of sequences encoding bone morphogenetic proteins
TWI267378B (en) 2001-06-08 2006-12-01 Wyeth Corp Calcium phosphate delivery vehicles for osteoinductive proteins
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US6798160B2 (en) * 2001-11-02 2004-09-28 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Electric working machine
CA2467260C (en) * 2001-11-27 2010-07-06 Takiron Co., Ltd. A porous organic-inorganic composite implant material and process for producing the same
CH695985A5 (de) * 2002-01-21 2006-11-15 Straumann Holding Ag Oberflächenmodifizierte Implantate.
EP1572909A4 (en) 2002-02-21 2007-06-06 Wyeth Corp PROTEIN CONTAINING A DOMAINE OF FOLLISTATIN
US7572763B2 (en) * 2002-02-21 2009-08-11 Wyeth Follistatin domain containing proteins
BR0310087A (pt) * 2002-05-17 2005-08-16 Wyeth Corp Veìculos sólidos injetáveis para ácido hialurÈnico para aplicação de proteìnas osteogênicas
AU2003259765B2 (en) * 2002-08-13 2009-01-22 Wyeth Peptides as solubilizing excipients for transforming growth factor Beta proteins
DE60331778D1 (de) * 2002-09-16 2010-04-29 Univ Johns Hopkins Metalloproteaseaktivierung von myostatin und verfahren zur modulation der myostatinaktivität
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20040223966A1 (en) * 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
UA85055C2 (ru) 2003-06-02 2008-12-25 Уайт Применение ингибиторов миостатика (gdf8) в сочетании с кортикостероидами для лечения нервно-мышечных заболеваний
ES2282904T3 (es) * 2003-09-12 2007-10-16 Wyeth Barras solidas de fosfato calcico inyectables para el suministro de proteinas osteogenicas.
US8372419B2 (en) 2004-03-10 2013-02-12 Scil Technology Gmbh Coated implants, their manufacturing and use thereof
EP1740609A2 (en) 2004-04-27 2007-01-10 Research Development Foundation Antagonism of tgf-beta superfamily receptor signaling
EP1763362B1 (en) 2004-05-25 2011-07-06 Stryker Corporation Use of op-1 for treating cartilage defects
US7749268B2 (en) 2004-05-26 2010-07-06 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods for treating the spine
BRPI0514253A (pt) * 2004-08-12 2008-06-03 Wyeth Corp terapia de combinação para diabetes, obesidade e doenças cardiovasculares usando composições contendo inibidores de gdf-8
US7473678B2 (en) 2004-10-14 2009-01-06 Biomimetic Therapeutics, Inc. Platelet-derived growth factor compositions and methods of use thereof
WO2006081379A1 (en) * 2005-01-26 2006-08-03 Wyeth Use of sfrps as markers of bmp activity
MX2007011405A (es) * 2005-03-23 2007-10-11 Wyeth Corp Deteccion de una respuesta inmune para agentes moduladores de crecimiento y la diferenciacion del factor 8 (gdf 8).
AU2006230434A1 (en) * 2005-03-30 2006-10-05 Wyeth Methods for stimulating hair growth by administering BMPs
US8506646B2 (en) 2005-04-29 2013-08-13 Warsaw Orthopedic, Inc. Multi-purpose medical implant devices
US20060247790A1 (en) * 2005-04-30 2006-11-02 Mckay William F Shaped osteochondral grafts and methods of using same
JP5052517B2 (ja) 2005-10-06 2012-10-17 イーライ リリー アンド カンパニー 抗ミオスタチン抗体
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
US8147860B2 (en) 2005-12-06 2012-04-03 Etex Corporation Porous calcium phosphate bone material
CA2641860C (en) 2006-02-09 2015-07-14 Biomimetic Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating bone
JP5362554B2 (ja) 2006-05-17 2013-12-11 ストライカー コーポレイション 軟骨の欠損を処置するための可溶性形態形成タンパク質の使用
US9161967B2 (en) 2006-06-30 2015-10-20 Biomimetic Therapeutics, Llc Compositions and methods for treating the vertebral column
ES2664229T3 (es) 2006-06-30 2018-04-18 Biomimetic Therapeutics, Llc Composiciones y métodos de biomatriz-PDGF para el tratamiento de lesiones del manguito rotador
US8524265B2 (en) 2006-08-17 2013-09-03 Warsaw Orthopedic, Inc. Medical implant sheets useful for tissue regeneration
EA015916B1 (ru) 2006-09-05 2011-12-30 Эли Лилли Энд Компани Моноклональные антитела к миостатину и их применения
JP2008104401A (ja) * 2006-10-25 2008-05-08 Kyoto Univ 精原幹細胞のインビトロ増殖方法
AU2007234612B2 (en) 2006-12-14 2013-06-27 Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc Protein stabilization formulations
EP2120859B1 (en) 2006-12-21 2013-11-20 Stryker Corporation Sustained-release formulations comprising bmp-7 crystals
US7678764B2 (en) 2007-06-29 2010-03-16 Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc Protein formulations for use at elevated temperatures
EP2187932B1 (en) 2007-08-07 2015-01-28 DePuy Synthes Products, LLC Protein formulations comprising gdf-5 in aqueous acidic solution
US8741840B2 (en) 2008-02-13 2014-06-03 Washington University BMP-7 for use in treating neointimal hyperplasia
WO2009129101A1 (en) 2008-04-14 2009-10-22 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Liquid buffered gdf-5 formulations
AU2009291828C1 (en) 2008-09-09 2016-03-17 Biomimetic Therapeutics, Llc Platelet-derived growth factor compositions and methods for the treatment of tendon and ligament injuries
JP5819733B2 (ja) 2009-02-12 2015-11-24 ストライカー コーポレイションＳｔｒｙｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 障害および疾患に対する全身治療のためのＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー含有タンパク質の末梢投与
SG173634A1 (en) 2009-02-12 2011-09-29 Stryker Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR MINIMALLY-INVASIVE SYSTEMIC DELIVERY OF PROTEINS INCLUDING TGF-ß SUPERFAMILY MEMBERS
US20120148539A1 (en) 2009-03-24 2012-06-14 Moulay Hicham Alaoui-Ismaili Methods and Compositions for Tissue Engineering
US8609127B2 (en) 2009-04-03 2013-12-17 Warsaw Orthopedic, Inc. Medical implant with bioactive material and method of making the medical implant
US20110002897A1 (en) 2009-06-11 2011-01-06 Burnham Institute For Medical Research Directed differentiation of stem cells
US9399086B2 (en) 2009-07-24 2016-07-26 Warsaw Orthopedic, Inc Implantable medical devices
WO2011031856A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Stryker Corporation Bmp -7 for use in treating pain induced by injuries and diseases of an articular joint
EP2352750B1 (en) 2009-09-17 2012-06-13 Stryker Corporation Buffers for controlling the ph of bone morphogenetic proteins
CA2785038A1 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Stryker Corporation Bmp-7 variants with reduced immunogenicity
US8492335B2 (en) 2010-02-22 2013-07-23 Biomimetic Therapeutics, Llc Platelet-derived growth factor compositions and methods for the treatment of tendinopathies
WO2011139594A2 (en) 2010-04-27 2011-11-10 Medtronic, Inc. Artificial bursa for intra-articular drug delivery
US9688735B2 (en) 2010-08-20 2017-06-27 Wyeth Llc Designer osteogenic proteins
EP2949338B1 (en) 2010-08-20 2017-10-25 Wyeth LLC Designer osteogenic proteins
WO2012177759A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 Rdc Holdings, Llc System and method for repairing joints
US8998925B2 (en) 2011-06-20 2015-04-07 Rdc Holdings, Llc Fixation system for orthopedic devices
JP6124986B2 (ja) * 2012-03-19 2017-05-10 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． 拡張期心不全を処置するための増殖分化因子（ｇｄｆ）
WO2014012101A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Trustees Of Tufts College Silk powder compaction for production of constructs with high mechanical strength and stiffness
US20160120945A1 (en) * 2013-02-15 2016-05-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Thymic Regeneration
US10092627B2 (en) 2013-04-08 2018-10-09 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for rejuvenating skeletal muscle stem cells
US9572912B2 (en) 2013-04-19 2017-02-21 Theracell, Inc. Demineralized bone fibers having controlled geometry and shapes and methods thereof
WO2015070076A2 (en) * 2013-11-08 2015-05-14 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for rejuvenating neuromuscular junctions
US10017566B2 (en) 2013-11-12 2018-07-10 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Growth differentiation factor (GDF) for treatment of diastolic heart failure
WO2016123583A1 (en) 2015-01-29 2016-08-04 Theracell, Inc. Demineralized bone fiber composition for use in minimally invasive surgery
US10428130B2 (en) 2015-03-17 2019-10-01 Istituto Biochimico Italiano Giovanni Lorenzini S.P.A. Purification of bone morphogenetic proteins (BMPs)
CA2986753A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Warsaw Orthopedic, Inc. Implants including an oxysterol and methods of use
ES2846848T3 (es) 2015-10-26 2021-07-29 Harvard College Polisacáridos reducidos y oxidados y métodos de uso de los mismos
CA3010799A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 President And Fellows Of Harvard College Treatment with gdf11 prevents weight gain, improves glucose tolerance and reduces hepatosteatosis
KR101810385B1 (ko) * 2016-02-04 2017-12-20 주식회사 강스템바이오텍 Gdf11을 포함하는 조성물 및 그의 용도
US10688222B2 (en) 2016-11-21 2020-06-23 Warsaw Orthopedic, Inc. Lyophilized moldable implants containing an oxysterol
US10639157B2 (en) 2017-03-14 2020-05-05 Theracell, Inc. Demineralized bone fiber composition for use in minimally invasive surgery
US11464888B2 (en) 2017-06-12 2022-10-11 Warsaw Orthopedic, Inc. Moldable formulations containing an oxysterol in an acellular tissue matrix
KR101893339B1 (ko) * 2017-09-19 2018-08-31 주식회사 강스템바이오텍 Gdf11을 포함하는 조성물 및 그의 용도
US11103618B2 (en) 2018-02-22 2021-08-31 Warsaw Orthopedic, Inc. Demineralized bone matrix having improved handling characteristics
CN109097425B (zh) * 2018-08-28 2022-06-07 浙江康嘉基因技术有限公司 一种多肽及用作流感疫苗免疫佐剂的用途
US11498880B2 (en) 2019-07-26 2022-11-15 Warsaw Orthopedic, Inc. Calcium phosphate granules and methods of making them

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
EP0105014B1 (en) 1982-09-24 1992-05-20 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Repair of tissue in animals
US4588684A (en) 1983-04-26 1986-05-13 Chiron Corporation a-Factor and its processing signals
NZ210699A (en) 1984-01-04 1989-06-28 Int Genetic Eng Isolation of an osteogenic protein of the p3 immunologically related family
ZA848495B (en) 1984-01-31 1985-09-25 Idaho Res Found Production of polypeptides in insect cells
CA1341617C (en) 1984-06-08 2011-06-28 Henry George Burger Inhibin isolated from ovarian follicular fluid
WO1986000639A1 (en) 1984-07-06 1986-01-30 Sandoz Ag Lymphokine production and purification
EP0169016B2 (en) 1984-07-16 2004-04-28 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Polypeptide cartilage-inducing factors found in bone
EP0177343B1 (en) 1984-10-05 1992-07-22 Genentech, Inc. Dna, cell cultures and methods for the secretion of heterologous proteins and periplasmic protein recovery
US4740587A (en) * 1985-07-18 1988-04-26 The Salk Institute For Biological Studies Inhibin and method of purifying same
US5089396A (en) * 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5215893A (en) * 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4798885A (en) 1986-02-07 1989-01-17 Genentech, Inc. Compositions of hormonally active human and porcine inhibin containing an α chain and 62 chain
NZ231899A (en) * 1985-10-03 1991-07-26 Genentech Inc Human or porcine inhibin peptide compositions and dna encoding them
US4737578A (en) * 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5013649A (en) 1986-07-01 1991-05-07 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding osteoinductive products
IL83003A (en) * 1986-07-01 1995-07-31 Genetics Inst Factors that soak bone formation
US5106748A (en) 1986-07-01 1992-04-21 Genetics Institute, Inc. Dna sequences encoding 5 proteins
US5187076A (en) * 1986-07-01 1993-02-16 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding BMP-6 proteins
ZA874681B (en) 1986-07-01 1988-04-27 Genetics Inst Novel osteoinductive factors
US5108922A (en) 1986-07-01 1992-04-28 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding BMP-1 products
US5041538A (en) * 1987-08-28 1991-08-20 The Salk Institute For Biological Studies Mammalian follistatin
US5168150A (en) 1988-03-17 1992-12-01 Electronique Serge Dassault Device for the processing of a magnetic-track ticket, especially an air transport ticket
US5071834A (en) 1988-09-16 1991-12-10 Genentech, Inc. Purified activin B composition
US5166190A (en) * 1990-01-08 1992-11-24 Genentech, Inc. Method for increasing fertility in males
DE69132823T2 (de) * 1990-05-16 2002-07-18 Genetics Inst Knochen- und knorpel-bildung hervorrufende proteine
US5168050A (en) * 1990-05-24 1992-12-01 Genentech, Inc. Mammalian expression of the bone morphogenetic protein-2b using bmp2a/bmp2b fusion
EP0550625B1 (en) * 1990-09-26 2003-11-05 Genetics Institute, LLC Bmp-5 derivatives
CA2071912C (en) * 1990-11-30 2002-10-15 Hanne Bentz Use of a bone morphogenetic protein in synergistic combination with tgf-beta for bone repair
US5208219A (en) 1991-02-14 1993-05-04 Celtrix Pharmaceuticals Inc. Method for inducing bone growth
AU662155B2 (en) * 1991-05-10 1995-08-24 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Targeted delivery of bone growth factors
CA2108770C (en) * 1991-06-25 2007-04-03 John M. Wozney Bmp-9 compositions
US5171579A (en) * 1991-10-11 1992-12-15 Genetics Institute, Inc. Formulations of blood clot-polymer matrix for delivery of osteogenic proteins
WO1993009229A1 (en) * 1991-11-04 1993-05-13 Genetics Institute, Inc. Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
DK0653942T3 (da) 1992-07-31 2003-10-20 Curis Inc Morphogen-induceret nerve-regenerering og -reparation
CA2157577C (en) * 1993-03-19 2009-11-17 Se-Jin Lee Growth differentiation factor-8
EP1378572B1 (en) * 1993-05-12 2006-10-25 Genetics Institute, LLC Bmp-11 compositions
KR100231640B1 (ko) * 1993-05-12 1999-12-01 토마스 제이 데스로저 Bmp-10 조성물
DE69434739T2 (de) * 1993-08-26 2007-05-10 Genetics Institute, LLC, Cambridge Menschliche Knochen-morphogenetische Proteine zur Verwendung bei neuronaler Rehgeneration
US5914234A (en) * 1994-07-08 1999-06-22 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-11
US5545616A (en) * 1994-09-22 1996-08-13 Genentech, Inc. Method for predicting and/or preventing preterm labor
CA2249596C (en) 1996-03-22 2011-11-08 Creative Biomolecules, Inc. Methods for enhancing functional recovery following central nervous system ischemia or trauma
JP3361278B2 (ja) 1997-12-26 2003-01-07 シャープ株式会社 反射型液晶表示装置とその製造方法、ならびに回路基板の製造方法
US6004937A (en) * 1998-03-09 1999-12-21 Genetics Institute, Inc. Use of follistatin to modulate growth and differentiation factor 8 [GDF-8] and bone morphogenic protein 11 [BMP-11]

Also Published As

Publication number Publication date
EP1378572B1 (en) 2006-10-25
HK1060898A1 (en) 2004-08-27
FI955419A0 (fi) 1995-11-10
JP2005046155A (ja) 2005-02-24
JPH09501304A (ja) 1997-02-10
US5639638A (en) 1997-06-17
FI955419A (fi) 1996-01-08
DE69434875T2 (de) 2007-09-06
KR960701996A (ko) 1996-03-28
US6437111B1 (en) 2002-08-20
DE69434875D1 (de) 2006-12-07
EP0698094A1 (en) 1996-02-28
WO1994026892A1 (en) 1994-11-24
US20060172391A1 (en) 2006-08-03
ES2274157T3 (es) 2007-05-16
US6340668B1 (en) 2002-01-22
US7175997B2 (en) 2007-02-13
DK0698094T3 (da) 2004-05-03
ATE343635T1 (de) 2006-11-15
US20030166910A1 (en) 2003-09-04
BR9406715A (pt) 1996-02-06
AU6910594A (en) 1994-12-12
NO954492L (no) 1995-11-08
AU678582B2 (en) 1997-06-05
EP1378572A1 (en) 2004-01-07
PT698094E (pt) 2004-05-31
ES2213745T3 (es) 2004-09-01
EP2272959A1 (en) 2011-01-12
DE69433530D1 (de) 2004-03-11
OA10191A (en) 1996-12-18
US20030083252A1 (en) 2003-05-01
NO954492D0 (no) 1995-11-08
PT1378572E (pt) 2007-01-31
EP1770161A3 (en) 2008-04-23
JP3681069B2 (ja) 2005-08-10
ATE258984T1 (de) 2004-02-15
CA2161808C (en) 2008-08-05
EP1770161A2 (en) 2007-04-04
US5700911A (en) 1997-12-23
DE69433530T2 (de) 2005-01-05
DK1378572T3 (da) 2007-02-05
KR100227406B1 (ko) 1999-12-01
EP0698094B1 (en) 2004-02-04
CA2161808A1 (en) 1994-11-24
NO320119B1 (no) 2005-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI119696B (fi) BMP-11:tä koodaavat DNA-sekvenssit, valmistusmenetelmä ja käytöt in vitro
AU677849B2 (en) BMP-10 compositions
US5932216A (en) Antibodies to bone morphogenetic protein-10 (BMP-10)
US5728679A (en) BMP-15 compositions
CA2265508C (en) Bone morphogenetic protein-16 (bmp-16) compositions
AU763470B2 (en) Bone morphogenetic protein (BMP)-17 and BMP-18 compositions
CA2574929C (en) Bone morphogenetic protein (bmp)-17 and bmp-18 and compositions
AU763300B2 (en) Bone morphogenetic protein-16 (BMP-16) compositions
WO1999002678A1 (en) Wa545 compositions
MXPA00000820A (en) Wa545 compositions
MXPA00005709A (en) Bone morphogenetic protein (bmp)-17 and bmp-18 compositions

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 119696

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed