FI118884B - Nebivololin käyttö antiaterogeenisenä aineena - Google Patents

Description

118884

Nebivololin käyttö antiaterogeenisenä aineena

Esillä oleva keksintö kohdistuu a,a'-iminobis(mety-leenibis[2-kromaanimetanoli]johdannaisen käyttöön valmis-5 tettaessa lääkeaineita ihmisten, jotka kärsivät verisuoni-ja hermostosysteemin ikääntymisestä tai degeneratiivisistä sairauksista, jotka liittyvät oksidätiiviseen stressiin, terapeuttiseen tai ennalta ehkäisevään käsittelyyn.

cx,a' -Iminobis (metyleeni)bis [2-kromaanimetanoli] joh-10 dannaisia kuvataan julkaisussa EP-0 145 067 /3-1-salpaavina aineina, joilla on terapeuttista tehoa korkean verenpaineen hoitoon. Nebivololi, joka koostuu (RSSS)- ja (SRRR)-oi, a' -iminobis (metyleeni) bis [6-fluori-2-kromaanimetanolis-ta], on geneerisesti kuvattu tässä. Spesifisesti nebivolo-15 li on kuvattu julkaisussa EP-0 334 429, ja siinä (SRRR)-enantiomeerin on osoitettu olevan tehokas ja selektiivinen j8-l-salpaava aine, kun taas (RSSS) -enantiomeerin on osoitettu olevan tehoton j3-l-salpaavana aineena, mutta tehon lisääjä sarjalle antihypertensiivisiä aineita, kuten ate-20 nololi, propanololi, pratsosiini, hydralatsiini ja mielenkiintoista kyllä, myös omalle (SRRR)-enantiomeerille. Vä- • * J ',· liaikana suoritetut tutkimukset ovat osoittaneet, että :: : monet nebivololin hyödylliset hemodynaamiset vaikutukset, ·*·.. jotka erottavat ne muista j3-l-salpaavista aineista, esi- • .*.tj 25 merkiksi että se äkillisesti alentaa verenpainetta spon- • · :·. taanisti hypertensiivisillä rotilla, vähentää perifeeris- • φ · ten verisuonten kokonaisvastusta ja suurentaa iskutila- • · · vuutta nukutetuilla koirilla, johtuvat suurelta osin (RSSS)-enantiomeeristä.

• · · 30 Kokeet osoittavat nyt, että a, a'-iminobis (metylee- • · *···* ni) bis [2-kromaanimetanoli] johdannaisilla on potentiaalista ;*·„· antioksidanttivaikutusta sekä in vitro että in vivo. Il- • * meisesti tämä on vasta toinen ryhmä (S-l-salpaajia karvedi- • · · •t lolin ja sen metaboliittien jälkeen, jolla on antioksi- • · · ··" 35 danttivaikutuksia in vitro ja in vivo, sillä erolla, että « • · 2 118884 a, a' -iminobis(metyleeni)bis[2-kromaanimetanoli]johdannaiset näyttävät olevan paljon tehokkaampia. Antioksidantti-vaikutustensa tähden a,a'-iminobis(metyleeni)bis[2-kromaanimetanoli] - johdannaiset ovat terapeuttisesti käyttökel-5 poisia hoidettaessa degeneratiivisia sairauksia samoin kuin verisuonten ja hermosysteemin ikääntymistä, joka johtuu hapettavasta stressistä.

Niinpä esillä oleva keksintö kohdistuu or,a'-iminobis (metyleeni)bis[2-kromaanimetanoli]johdannaisten, far-10 maseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen, stereo- kemiallisesti isomeeristen muotojen ja kyseisten johdannaisten, suolojen ja stereoisomeerien minkä tahansa seosten käyttöön valmistettaessa lääkeainetta ihmisten, jotka kärsivät verisuonten ja hermosysteemin ikääntymistä tai 15 degeneratiivisista sairauksista, joihin liittyy hapettava stressi, terapeuttista tai ennalta ehkäisevää hoitoa varten, kyseisillä johdannaisilla ollessa kaava (I):

OH H OH

• · φ · • ·· • · · • · i jossa R1 ja R3 ovat toisistaan riippumatta fluori, hydroksi *. . 25 tai vety, Rz ja R4 ovat toisistaan riippumatta vety tai * 1 2 3 4 1 " hydroksi, ja kuhin tähti merkitsee stereogeenista keskus- • · ta.

1 · 2 *.1 ' Keksintö kohdistuu myös menetelmään hoitaa potilai ta, jotka kärsivät verisuonten ja hermosysteemin ikäänty- • · 3 V/ 30 mistä tai degeneratiivisista sairauksista, joihin liittyy hapettava stressi, antamalla kyseisille potilaille määrän .·1 · a,a'-iminobis (metyleeni) bis [2-kromaanimetanoli] johdannais- • I..1 ta, joka on tehokas parantamaan, pysäyttämään, hidastamaan · "1 tai lievittämään kyseisiä ikääntymisestä aiheutuvien ja ·· 4 * • » 118884 3 degeneratiivisisten sairauksien kulkua ja /tai niistä aiheutuvia vaikutuksia.

Yhdisteet, joissa Rl ja R3 ovat hydrokseja ja R2 ja R4 ovat vetyjä, ajateltiin olevan pääasiallisia aineenvaih-5 duntatuotteita, joita muodostuu vastaavista yhdisteistä, joissa Rl ja R3 ovat fluoreja, mutta viimeaikaiset havainnot osoittavat, että näin ei ole. Kaikesta huolimatta näillä pseudo-metaboliiteilla on voimakas antioksidatiivi-nen vaikutus.

10 Erityisiä yhdisteitä, jotka sisältyvät keksintöön, ovat: (RSSS)- ja (SRRR)-a,a'-iminobis(metyleeni)bis[6-fluori-2-kromaanimetanoli], raseeminen seos, joka geneerisesti tunnetaan nebivololina, sen yksittäiset enantiomeerit, 15 (RSSS)- ja (SRRR)-a,a'-iminobis(metyleeni)bis[6-hydroksi-2-kromaanimetanoli], [(RSSS)+ (RSRR) + (SRSS) + (SRRR)]-o-[[[2-(kroman-2-yyli)-2-hydroksietyyli]amino]metyyli]-6-hydroksi-2-kromaanimetanolin etaanidioaatti (1:1); [ (SRSR) + (SRRS) + (RSSR) ] - ex, a' -iminobis (metyleeni) bis [6-hyd-20 roksi-2-kromaanimetanoli], ja [ (RRSR) + (RRRS) + (SSSR) + (SSRS) ] -or- [ [ [2- (kroman-2-yyli) -2- ·· · • V hydroksietyyli] amino] metyyli]-6-hydroksi-2-kromaanimetano-

Iin etaanidioaatti (1:1).

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa * 25 seuraamalla julkaisuissa EP-0 145 067 ja EP-0 334 429 ku- ;·. vattuja menetelmiä. Kun yhdisteillä on emäksisiä ominai- • ·· .···. suuksia, ne voidaan muuttaa farmaseuttisesti hyväksytyiksi • · · happoadditiosuolamuodoiksi käsittelemällä sopivalla hapol- . , la. Sopivia happoja ovat esimerkiksi epäorgaaniset hapot, * · · 3 0 kuten halidivetyhapot, esimerkiksi kloorivety- tai bromi- · *···* vetyhappo; rikki-; typpi-; fosfori- ja vastaavat hapot; ·*·,· tai orgaaniset hapot, kuten esimerkiksi etikka- propaani-, • · hydroksietikka-, maito-, rypäle-, oksaali-, maloni-, suk- • · · \ kiini-, maleiini-, fumaari-, maali-, viini-, sitruuna-, • · · *··! 35 metaanisulfoni-, etaanisulfoni-, bentseenisulfoni-, p-to- • · 118884 4 metaanisulfoni-, etaanisulfoni-, bentseenisulfoni-, p-to-lueenisulfoni-, syklaami-, salisyyli-, p-aminosalisyyli; pamoiini- ja vastaavat hapot. Termi additiosuola tässä käytettynä pitää sisällään myös solvaatit, joita kaavan 5 (I) mukaiset yhdisteet samoin kuin niiden suolat kykenevät muodostamaan. Tällaisia solvaatteja ovat esimerkiksi hyd-raatit, alkoholaatit ja vastaavat. Edullisin nebivololin happoadditiosuola on hydrokloridisuola. Suolat, jotka eivät ole farmaseuttisesti hyväksyttäviä, voivat olla käyt-10 tökelpoisia valmistettaessa kaavan (I) mukaisia yhdisteitä ja niitä sisältäviä koostumuksia.

Hapettava stressi viittaa ilmiöihin, jotka ovat samantapaisia kuin endogeenisten voimakkaiden oksidanttien vaikutus, erityisesti haitalliset vaikutukset kudoksessa. 15 Endogeenisia voimakkaita oksadantteja ovat esimerkiksi superoksidi (O/)., vetyperoksidi (H202) ja hydroksyyliradi-kaali (HO) . Kudos voi olla sentraalista, perifeeristä tai ydinkudosta, ja erityisesti se kuuluu verenkiertosystee-miin, hermostosysteemiin, munuaisiin, haimaan, lisäkilpi-20 rauhasiin ja sukurauhasiin. Hapettava vahinko kudossoluil-le johtuu lipidien peroksidaatiosta, joka johtaa muutok-siin solumembraanin yhtenäisyydessä ja toiminnassa. Hapes-·'·*; ta johdettujen vapaiden radikaalien aiheuttamaa endotee- m listä vauriota pidetään nykyään yleisesti avainvaiheena .·,; 25 valtimokovettumataudin ja vastaavien verenkiertosairauk- • ·· * sien aloittajana ja edistäjänä.

• ·· \.. Terapeuttisessa käsittelyssä annetaan kaavan (I) • | « * mukaista yhdistettä määrä, joka on tehokas parantamaan, pysäyttämään, hidastamaan tai lievittämään verenkierto- ja • · · *.V 30 hermostosysteemin degeneratiivisten sairauksien kulkua ja • · · /tai niistä aiheutuvia vaikutuksia. Ennalta ehkäisevässä käsittelyssä annetaan tällaista yhdistettä määrä, joka on .·*·. tehokas ehkäisemään tai viivästyttämään verenkierto- ja • · *·’ hermostosysteemin ikääntymisestä aiheutuvien ja degenera- 35 tiivisisten sairauksien puhkeamisesta ja kehittymistä.

• · , 118884 5 a, a' -Iminobis (metyleeni) bis [2-kromaanimetanoli] johdannaisten antioksadanttinen aktiivisuus voidaan osoittaa in vitro niiden kyvyllä tuhota vapaita radikaaleja (hyd-roksyyli, superoksidi ja typpioksidiradikaalit) ja täten 5 ehkäistä radikaalivälitteistä lipidien peroksidaatiota ja sytotoksisuutta. Hermosoluviljelmissä ne voivat tehokkaas-ti korvata tunnetun endogeenisen antioksidantin, vitamiini E:n (a-tokoferolin). Yhdisteet myös jäljittelevät superok-sididismutaasin (SOD) vaikutusta tuhoamalla superoksidia 10 (02') ' . Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden erilaisten stereo- isomeerien antioksidanttinen vaikutus on vastaava. Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden antioksidanttinen vaikutus on verrannollinen läsnä olevien hydroksiryhmien lukumäärään.

Erityisen mielenkiintoinen havainto on se, että 15 yhdisteet, joissa ainakin yksi ryhmistä R1-4 on hydroksi, annoksesta riippuen ehkäisee hapettuneen ihmisen matalati-heyksisen lipoproteiinin (ox-LDL) muodostumista mikromo-laarisella tasolla in vitro. Hapettunut LDL on mukana ate-rogeneesissä, samoin hapettuneiden membraanilipidien muo-20 dostuksessa. Kuviossa 1 kuvataan vaiheita, joita on havaittu hapettuneen LDL:n muodostuksen yhteydessä; Kuviossa ·· · • V 2 kuvataan hapettuneen LDL:n muodostuminen in vitro säälii*: dellyissä olosuhteissa ja aktiivisten lääkeaineiden läsnä ·*·.. ollessa.

25 Koska hydroksylointi on tärkeä entsymaattinen reak- • » I*. tio nebivololin metaboliassa, voidaan nähdä, että hydrok- .···, sianalogien antioksidatiivisen vaikutuksen valossa nebivo- • · · lolilla on tärkeitä suojavaikutuksia hapettavaa vahinkoa . . vastaan in vivo.

• * * ***** 30 Tämä on vahvistettu kaikkein odottamattomammalla ··· • · *···* havainnolla in vivo -testillä nimittäin, että testieläi- :*·,· millä, joita käsiteltiin kroonisesti nebivololilla, nor- • · .*·*. maali veri suoni systeemin vanheneminen, joka vertailueläi- ··♦ *. millä havaittiin, tukahtui, eli vanhenemisprosessi testat- ··· *··* 35 tavilla eläimillä hidastui merkittävästi.

• · 118884 6

Verisuoni- ja hermosysteemin taudit ja tilat, joihin liittyy hapettavaa stressiä ja joiden arvellaan olevan herkkiä käsittelylle kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä, ovat verisuonisysteemin normaali ja patologinen degeneraa-5 tio kuten aterogeneesi, ateromatoosi (verisuonten endotee-lin rasvojen degereraatio), valtimonkovetustauti, valti-monrasvoittumistauti, verisuonten liikakasvu, johon liittyy korkea verenpaine, veren lipoproteiinien runsaus ja normaali ikääntymisestä johtuva verisuonten degeneraatio; 10 sukurauhasten ja haiman verisuonten patologia; lisäkilpirauhasen reaktiivinen liikakasvu; ja krooninen munuaissairaus ; kasvainsairaudet,- j a tulehdussairaudet.

Edelleen kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä voi olla terapeuttista arvoa hermostosysteemistä, erityisesti peri-15 feerisestä hermostosysteemistä, tapahtuvan hermosolujen kadon ehkäisyssä tai hoidossa, joihin tiloihin liittyy hapettava vaurio tai vamma, esimerkiksi tromboembolinen kohtaus, aivohalvaus, verenvuotokohtaus, aivojen verettö-myyskohtaus, aivojen verisuonikouristus, aivojen vanhene-20 minen, aivojen tai selkäytimen trauma, sydänpysähdys, ar-teriaalinen hypotensio, sydämen tai keuhkojen kirurgia, • t · • V vakava hypoglykemia, hapettomuus, hapen niukkuus, hapen- ΓΓ: puute siskiökaudella; ja lievittämään hermostoa degeneroi- ·*·,, via sairauksia, joissa hapettavilla metabolisilla proses- • .\ί 25 seilla on merkittävä osa, kuten Huntingtonin korea, Alz- • · heimerin tauti, vanhuuden dementia, Pickin tauti, Korsako- • ·· vin tauti, olivo-pontoserebellaarinen atrofia, amyotroop- • · * pinen lateraalinen skleroosi, Parkinsonin tauti, Downin , , syndrooma, glutaarinen asidemia, epilepsia, kouristusti- i · « ’·*·* 30 lat, usean infarktin dementia, virusinfektion aiheuttama • *··»* neurodegeneraatio, esim. hermosto-AIDSin aikaansaama de- ·**,· mentia, kognitiiviset vaikeudet, neuro- ja myopatiat, jot- • « ka liittyvät HIV-infektioon, vesikauhu, tuhkarokko ja • · « •t j äykkäkouristus.

·*· »«·· • · 118884 7

Aterogeneesi on monimutkainen prosessi, jolle on tyypillistä kolesterolin keräytyminen makrofageihin, jotka sijaitsevat valtimon seinämillä. Makrofagit keräävät hapettuneen LDL:n sieppaajareseptorin avulla, jota päinvas-5 toin kuin normaalia LDL-reseptoria ei säätele solun kolesterolipitoisuus. Säätelymekanismin puute johtaa kolesterolin keräytymiseen soluun ja vaahtosolun muodostumiseen. Hapettunutta LDL:a on havaittu in vivo ateroskleroottisten vaurioiden läheisyydessä (katso Jackson, R. L. et ai. 10 (1993), Medicinal Research Reviews 13, 161 - 162) . LDL:n hapettuminen sisältää lipidin peroksidaation, aldehydin muodostuksen, proteiinin fragmentoitumisen ja LDL-partik-keliin liittyneen vitamiini E:n kulutuksen.

Auto-antibodeja hapettunutta LDL:a vastaan on iden-15 tifioitu ihmisellä. Niiden määrä on itsenäinen ennustaja kaulavaltimon ateroskleroosin etenemisessä (Salonen, J. T. et ai. (1992), The Lancet 339. No 883 - 887) . Edelleen herkkyys LDL:n hapetukselle yhdistetään sepelvaltimon ateroskleroosin ankaruuteen (Regnström, J. et ai. (1992), The 20 Lancet 339., No 8803, 1183 - 1186).

Mikä tahansa antioksidanttinen ominaisuus liitetty- *· · • *,ϊ nä sydän- ja verisuonistoa suojaavaan lääkeaineeseen sen ϊ]ϊ*: muiden farmakologisten ominaisuuksien lisäksi lisää sen terapeuttista vaikutusta ateroskleroottisen prosessin ete- • ·*.β! 25 nemisen ehkäisyssä.

• · :·. Arvot esimerkissä 1 jäljempänä osoittavat, että * ·· .·... nebivololin hydroksianalogeilla on kauaskantoinen antiok- • ♦ · sidanttinen vaikutus ihmisen LDL:ään. Käytetyt pitoisuudet .. in vitro olivat korkeat (2μΜ), mutta eivät relevantteja • · ·

*·*·’ 30 verrattuna in vivo tilaan. Todellakin sekä vitamiinin E

• mm • · *·.·* että tunnetun antioksidantin ja hipolipideemisen aineen :*·.· probukolin on osoitettu tunkeutuvan LDL-partikkelin lipi- * · difaasiin viikkojen aikana (Reaven, P. D. et ai. (1992), ·♦· \ Artheriosclerosis and Thrombosis, 12, No 3, 318 - 324; Ka- ····[ 35 gan, V. E. et ai. (1992), J. Lip. Res. , 33, 385 - 397).

• · 118884 8

Esimerkin 1 kokeen lyhyt kesto ei simuloi tätä in vivo -tilannetta. Lääkeaineiden jakautumisessa LDL-partikkelei-den vesifaasin ja lipidifaasin välillä ei mahdolllisesti saavuteta tasapainoa, niin että näiden lipidiliukoisten 5 lääkeaineiden kapasitettia aliarvioitiin, jonka osoitti se, että vitamiinia E, vertailuyhdistettä tarvittiin äärimmäisen suuri pitoisuus, (kuvio 2).

Kvalitatiivisesti nebivololin hydroksianalogien ja vitamiinin E vaikutus on samanlainen. Molemmat hidastavat 10 LDL:n hapettumista hapettumisen alettua vasta koesystee-missä läsnäolevien antioksidanttien kulutuksen jälkeen.

Esillä olevan keksinnön mukaiset lääkeaineiksi sopivat kaavan (I) mukaisten yhdisteiden farmaseuttiset valmisteet sisältävät yhtä tai useampaa alalla tunnettua täy-15 teainetta tai kantajaa. Valitsemalla sopivasti yhden tai useampia näistä täyteaineista tai kantajista farmaseuttiset valmisteet voidaan sovittaa suun kautta, peräsuoleen, emättimeen, paikalliseen, parenteraalisesti (mukaan lukien lihaksensisäinen, ihonalainen ja suonensisäinen) tai imp-20 lantaattina tapahtuvaa annostelua varten, tai muotoon, joka on sopiva annosteltessa inhaloimalla tai sisään pu- ·· · • *,ϊ haltamalla. Valmisteet voivat, milloin se on tarkoituksen- :T: mukaista, olla kätevästi erillisinä yksikköannoksina.

I*·,, Menetelmät tällaisten valmisteiden valmistamiseksi • 25 ovat hyvin tunnettuja alalla, ja niille on tunnusomaista, • * :*. että aktiivinen aine ja täyteaineet perusteellisesti se- • i« koitetaan toisiinsa. Kaikki prosessit sisältävät vaiheen, • · · jossa aktiivinen aine saatetaan kosketuksiin nestemäisten . , kantajien tai hienoksi jauhettujen kiinteiden kantajien ·«« **]j’ 3 0 tai molempien kanssa, ja sitten tarvittaessa muokataan • * *··.* tuote halutuksi koostumukseksi.

* ·*·,· Suun kautta tapahtuvaa annostelua varten farmaseut- • t tiset valmisteet voivat olla kiinteinä annosmuotoina, esi-• « ' ··· \ merkiksi tabletteina tai kapseleina, jotka valmistetaan ·§· ···· 3 5 tavanomaisilla menetelmillä farmaseuttisesti hyväksyttä- • » 118884 9 vien täyteaineiden, kuten sidonta-aineiden (esim. esigela-toitu tärkkelys, polyvinyylipyrrolidoni tai hydroksipro-pyylimetyyliselluloosa) ,· täyteaineiden (esim. laktoosi, mikrokiteinen selluloosa tai kalsiumfosfaatti); liukastus-5 aineiden (esim. magnesiumstearaatti, talkki tai piioksi-di) , takertumista ehkäisevien aineiden (esim. perunatärkkelys tai natriumtärkkelysglykollaatti); tai kostuttavien aineiden (esim. natriumlauryylisulfaatti) kanssa. Tabletit voidaan päällystää alalla hyvin tunnettujen menetelmien 10 mukaisesti.

Suun kautta annosteltavaksi tarkoitetut nestemäiset valmisteet voivat olla esimerkiksi liuosten, siirappien tai suspensioiden muodossa, tai ne voivat olla kuivana tuotteena, joka konstruoidaan vedellä tai muulla sopivalla 15 väliaineella ennen käyttöä. Tällaisia nestemäisiä valmisteita voidaan valmistaa tavanomaisilla tavoilla farmaseuttisesti hyväksyttävien lisäaineiden kuten suspendoivien aineiden (esim. sorbitolisiirappi, metyyliselluloosa tai hydratut syötävät öljyt); emulgoivien aineiden (esim. le-20 sitiini tai akaasia); ei-vesipitoisten väliaineiden (esim.

manteliöljy, öljymäiset esterit tai etyylialkoholi); ja ·* · • säilöntäaineiden (esim. metyyli- tai propyyli-p-hydroksi-bentsoaatit tai sorbiinihappo) .

·*·,, Suuhun kohdistuvaa paikallista annostelua varten • : 25 farmaseuttiset valmisteet voivat olla poskessa tai kielen • · :*, alla pidettävinä tabletteina, tippoina tai pastilleina, • «· *·.. jotka on muotoiltu tavanomaisella tavalla.

* · J

• t · * Orvaskedelle tapahtuvaa paikallista annostelua varten keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan muotoilla ras- • · · ’·*·* 30 voiksi, geeleiksi, voiteiksi, tai ihonpäälisiksi laasta- reiksi. Tällaiset valmisteet voidaan esimerkiksi muotoilla j\· vesipitoisen tai öljymäisen perustan kanssa samalla lisä- • · .·*·. ten sopivaa paksuntavaa, geeliyttävää, emulgoivaa, stabi- «·· loivaa, dispergoivaa, suspendoivaa ja/tai väriainetta.

♦ ··· • · 118884 10

Kaavan (I) mukaiset yhdisteet voidaan myös muotoilla depot-valmisteiksi . Tällaisia pitkävaikutteisia valmisteita voidaan antaa implantoimalla (esimerkiksi ihonalaisesti tai lihaksensisäisesti) tai suonensisäisellä injek-5 tiolla. Niinpä esimerkiksi yhdisteet voidaan muotoilla sopivien polymeeristen tai hydrofobisten aineiden (esimerkiksi emulsiona hyväksyttävässä öljyssä) tai ioninvaihto-hartsien kanssa, tai huonosti liukenevina johdannaisina, esimerkiksi huonosti liukenevana suolana.

10 Kaavan (I) mukaiset yhdisteet voidaan formuloida annosteltavaksi parenteraalisesti injektoimalla, käytännöllisesti suonensisäisellä, lihaksensisäisellä tai ihonalaisella injektiolla, esimerkiksi bolus-injektiolla tai jatkuvalla suonensisäisellä infuusiolla. Injektoitavaksi 15 tarkoitetut valmisteet voivat olla yksikköannosmuotoina, esim. ampulleina tai monen annoksen säiliöissä, joihin on lisätty säilöntäainetta. Valmisteet voivat olla näissä muodoissa suspensioina, liuoksina, emulsioina öljyssä tai vesipitoisessa väliaineessa, ja ne voivat sisältää formu-20 lointia helpottavia aineita, kuten suspendoivia, stabiloivia ja/tai dispergoivia aineita. Vaihtoehtoisesti ak- ·· · • V tiivinen aine voi olla jauhemuodossa konstruoitavaksi so- • ·· Ϊ pivan väliaineen, esimerkiksi steriilin pyrogeenivapaan veden kanssa.

• ·*·,· 25 Kaavan (I) mukaiset yhdisteet voidaan myös formu- * · I*, loida peräsuolen kautta annettaviksi valmisteiksi, kuten • ·· .···, peräpuikoiksi tai ummetusperäruiskeiksi, esimerkiksi si- • · « sältäen tavanomaisia peräpuikkoperustoja, kuten kaakaovoi-. . ta tai muita glyseridejä.

I f · 30 Nenän kautta tapahtuvassa annostelussa kaavan (I) * « *·;** mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää esimerkiksi nestemäi- senä suihkeena, jauheena tai tippojen muodossa.

• · ·***; Annosteltaessa inhaloimalla kaavan (I) mukaisia «*· *, yhdisteitä annetaan mukavasti aerosolisuihkeen muodossa ··· *··· 35 paineistetuista pakkauksista tai sumuttimista, käyttäen • » 118884 11 sopivia ponneaineita, esimerkiksi diklooridifluorimetaa-nia, trikloorifluorimetaania, diklooritetrafluorietaania, 1,1,1,2-tetrafluorietaania, hiilidioksidia tai muuta sopivaa kaasua. Paineistetun aerosolin ollessa kyseessä yksik-5 köannos voidaan määrittää käyttämällä venttiiliä, joka annostelee halutun määrän. Kapselit ja patruunat, jotka on valmistettu esimerkiksi gelatiinista ja jotka on tarkoitettu käytettäväksi inhalaattoreissa ja insufflaattoreis-sa, voidaan formuloida niin, että ne sisältävät jauhemais-10 ta keksinnön mukaisen yhdisteen ja sopivan jauhemaisen perustan, kuten laktoosin tai tärkkelyksen seosta. Mitkä tahansa yllä kuvatuista farmaseuttisista valmisteista voivat olla tavanomaiseen tapaan yhdistettyinä säädellysti vapautuvina muotoina.

15 Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden biosaatavuuden lisäämiseksi ne voidaan formuloida edullisesti sopivilla syklodekstriineillä. Sopivia syklodekstriinejä ovat α-,β-, γ-syklodekstriinit tai niiden eettert tai sekoitetut eetterit, jolloin yksi tai useampi syklodekstriinin anhydro-20 glykoosiyksikköjen hydroksryhmistä on substituoitu Cj^-al-kyylillä, erityisesti metyylillä, etyylillä tai isopropyy- ·· · • Iillä; hydroksi-C].6-alkyylillä, erityisesti hydroksietyy- ϊ"ΐ"ϊ Iillä, hydroksipropyylillä tai hydroksibutyylillä; karbok- ·*·.. si-Cj^-alkyylillä, erityisesti karboksimetyylillä tai kar- • .\i 25 boksietyylillä ; cM -alkyylikarbonyylillä, erityisesti ase- • · j·, tyylillä; Cj.g-alkyylioksikarbonyyli-C^-alkyylillä tai kar- S 11 .···. boksi-C^-alkyylioksi-C^-alkyylillä, erityisesti karboksi- • ♦ ♦ metoksipropyylillä tai karboksietoksipropyylillä; C^-al- , . kyylikarbonyylioksi-C^-alkyylillä, erityisesti 2-asetyyli- • · * 30 oksipropyylillä.

• · *♦;·* Erityisen huomionarvoisia kompleksinmuodostajina ja/tai liuottimina ovat β-CD, 2,6-dimetyyli-jS-CD, 2-hyd- ;***: roksietyyli-0-CD, 2-hydroksietyyli-7-CD, 2-hydroksipropyy- ··* \ Ιί-γ-CD ja (2-karboksimetoksi) propyyli-jS-CD ja erityisesti **··, 35 2 - hydroks ipr opyy 1 i-β- CD (2-HP-/3-CD) . Kaikkein edullisin • * 118884 12 syklodekstriinijohdannainen käytettäväksi esillä olevan keksinnön mukaisissa valmisteissa on 2-hydroksipropyyli-jS-syklodekstriini, jonka keskimääräinen molaarinen substituutio (M.S.) on välillä 0,35 - 0,50 (määritettynä massa-5 spektroskopialla) ja joka sisältää vähemmän kuin 1,5 % substituoimatonta j3-syklodekstriiniä. M.S.-arvot määritettynä NMR:lla tai IR.-lla vaihtelevat välillä 0,55 - 0,75.

Farmaseuttiset valmisteet voivat koostua pelkästään kaavan (I) mukaisesta yhdisteestä ja syklodekstriinistä 10 tai syklodekstriinijohdannaisesta. Tämä kiinteä muoto voidaan mukavasti valmistaa lyofilisoimalla vesipitoisesta liuoksesta, tai myös yhdessä saostamalla. Tällainen valmiste on erityisen käyttökelpoinen rekonstruoitavaksi vedellä, suolaliuoksella tai syklodekstriinin vesipitoisella 15 liuoksella, tai sekoittamalla ei-farmaseuttisten kiinteiden aineiden, erityisesti ruuan kanssa.

Edullisesti keksinnön mukaiset farmaseuttiset valmisteet ovat sopivia suun kautta annettaviksi.

Valmisteet voivat edullisesti olla erillisinä an-20 nosyksikköinä, erityisesti yksikköannosmuodossa. Kätevä yksikköannos sisältää aktiivista ainetta määrän, joka f· · • *t· vaihtelee välillä 0,1 - 100 mg. Tarvittava määrä kaavan :T: (I) mukaista yhdistettä päivittäisenä annoksena hoidossa ·*·,, ei vaihtele ainoastaa valitun yksittäisen yhdisteen mu- .·. J 25 kaan, vaan riippuu myös antotavasta, hoidettavan tilan • · ;·. luonteesta ja potilaan iästä, painosta ja tilasta, ja on ! ** ... viime kädessä hoitavan lääkärin arvioitavissa. Yleensä • · · • * · kuitenkin sopiva annos vaihtelee välillä noin 0,1 - 20 mg . , päivässä. Sopiva päivittäinen annos käytettäväksi ennalta • ' · · *·'·' 3 0 ehkäisyssä on yleensä samaa luokkaa.

• · *·.·* Haluttu annos on mukavasti yksittäisenä annoksena ;*·,· tai jaettuna annoksiin, joita annostellaan sopivin välein, • * .*". esimerkiksi kaksi, kolme, neljä tai useampia osa-annoksia *·« •t päivässä. Nebivololin päivittäinen annos voidaan antaa 35 yksittäisenä annoksena (o.d.), koska tällöin saavutetaan * • « 13 1 1 8884 tehokkaat plasman pitoisuudet yli 24 tunnin ajan. Johtuen aktiivisten metaboliittien, jotka nostavat antioksidant-tista tehoa, muodostumisesta, nebivololin antiaterogeeni-nen teho kasvaa annosta toistettaessa tai annettaessa 5 kroonisesti, kunnes vakaa tila saavutetaan.

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä voidaan myös käyttää yhdessä muiden verenpainetta alentavien aineiden tai muiden terapeuttisten aineiden, esimerkiksi hypolipeemisten, hypolipideemisten, kolesterolia alentavien aineiden, 10 ACAT-inhibiittorien tai antioksidanttien kanssa. Keksintö tarjoaa täten, lisäpiirteenään, yhdistelmän, joka koostuu tässä määritellystä valmisteesta yhdessä toisen terapeuttisesti aktiivisen aineen, erityisesti toisen verenpainetta alentavan aineen tai hypolipeemisten, hypolipideemis-15 ten, kolesterolia alentavien aineiden, ACAT-inhibiittorien tai antioksidanttien kanssa. Yhdistelmää voidaan antaa erikseen, eli samanaikaisesti, yhdessä tai peräkkäin millä tahansa edellä kuvatulla annostelutavalla, tai yhdistelmä voi myös olla farmaseuttisen valmisteen muodossa. Täten 20 farmaseuttinen tuote, joka sisältää (a) kaavan (I) mukaista yhdistettä ja (b) toista edellä kuvattua terapeuttista · · ί ainetta yhdistelmävalmisteena samanaikaisesti, erillään tai peräkkäin käytettäväksi ihmisen, joka kärsii verisuo- |’.it ni- tai hermostosysteemin ikääntymisestä tai degeneratii- • .·. : 25 visista sairauksista, joihin liittyy hapettava stressi, • 1 ··. terapeuttisessa tai ennalta ehkäisevässä hoidossa, muodos- t ·· *... taa keksinnön lisäpiirteen. Tällainen tuote voi sisältää • 9 · * kitin, joka koostuu säiliöstä, joka sisältää kaavan (I) mukaisen yhdisteen farmaseuttista valmistetta, ja toisesta • · · ***** 30 säiliöstä, joka sisältää toisen terapeuttisen aineen far- ··· maseuttista valmistetta. Tuotteella, joka erottaa kahden .\j aktiivisen aineen valmisteet, on se etu, että sopivat mää- Φ · .1·1. rät kumpaakin komponenttia ja annostelun ajoitus ja jär- ·] jestys voidaan valita potilaan mukaan.

··· ·1·· » “ 118884

Sopivia terapeuttisia aineita käytettäväksi edellä kuvatuissa yhdistelmissä ovat esimerkiksi verenpainetta alentavat aineet, erityisesti |8-l-salpaavat aineet, kuten esimerkiksi atenololi, seliprololi, propanololi; hypoli-5 peemiset aineet, eli lääkeaineet, jotka ovat käyttökelpoisia alennettaessa matalatiheyksisen lipoproteiinin tai kolesterolin määrää, kuten esimerkiksi HMG CoA -reduktaasin inhibiittorit, esimerkiksi lovastatiini, fluvastatiini, pravastatiini, simvastatiini ja vastaavat; gemfibrotsii-10 li,; zaragotsiinihappo; tai antioksidantit, esimerkiksi probukoli, vitamiini E (α-tokoferoli) tai erityisesti yhdisteet, joissa yhdistyy useita yllä mainituista fysiologisista ominaisuuksista, esim. karvediloli, verapamiili, diltiatseemi, vitamiini C (askorbiinihappo tai sen suola). 15 Kun kaavan (I) mukaisia yhdisteitä käytetään yhdes sä toisen terapeuttisen aineen kanssa, kummankin yhdisteen annos voi vaihdella siitä, mitä yhdistettä käytetään yksinään. Niinpä kun kaavan (I) mukaisia yhdisteitä käytetään yhdessä toisen terapeuttisen aineen kanssa, kummankin yh-20 disteen annos voi olla sama tai tavallisemmin alhaisempi kuin mitä käytetään silloin kun yhdistettä käytetään yk- ·1 1 ϊ sin. Alan asiantuntija pystyy nopeasti arvioimaan sopivat :T: annokset.

·1·., Esimerkki 1 : 25 Ihmisen LDL:n hapetus in vitro #e ·· ··, Ihmisen laskimoverta kerättiin EDTAan (2,68 mM lo- • ·· pullinen väkevyys). Plasma erotettiin sentrifugoimalla.

• e e • NaBr:a (37,3 mg/ml) lisättiin ja liuotettiin (lopullinen tiheys 1,036 g/ml). Sentrifugiputket täytettiin ensin ta- e e e *·1·1 30 solle, joka vastasi 2/3 niiden maksimaalisesta tilavuudes- e·· ta, täytettiin edelleen NaBr-liuoksella (1,036 g/ml) ja e sitten sentrifugoitiin 18 tuntia 45 000 rpmissä 50 Ti ro- • e .**·. torissa (Beckmann) . Sentroifugoinnin jälkeen kelluvat li- " poproteiinit otettiin talteen. Jäljelle jääneen liouksen ··· *··ί 3 5 tiheys säädettiin arvoon 1,055 g/ml. Sentrifugiputkien · 118884 15 täyttö ja sentrifugointi toistettiin edellä kuvatulla tavalla. Sentrifugoinnin jälkeen kelluva LDL dialysoitiin puskuria vastaan, joka sisälsi 127 nM NaCl:a, 8 nM Na2HP04.2H20:a, 2,7 mM KCl:a ja 1,7 mM KH2P04:a pH:Ssa 7,4.

5 Dialyysin jälkeen LDL suodatettiin Milliporen suodattimen (0,45 μΜ) läpi ja proteiinisisältö määritettiin. Laimennos, jonka pitoisuus oli 25 μg/ml, valmistettiin millipo-rella suodatetulla dialyysipuskurilla. Hapettuminen määritettiin Pharmacia Ultraspec III -spektrofotometrillä. Kon-10 jugoidun dieenin muodostusta havaittiin 234 nm:ssä. Kaksi mikrolitraa lääkeainetta tai liuotinta (DMSO) lisätiin Eppendorfin putkiin, sitten lisättiin 1 ml LDL:a (25 μg/ml), ja näitä aineita sekoitettiin varovasti ja sentri-fugoitiin 1 minuutti 13 000 g:ssä. Liuos pipetoitiin 15 Quartz-kyvettiin ja termostoitiin spektrofotometrissä 37 *C:ssa. Tasapainottamisen jälkeen hapetusreaktio aloitettiin lisäämällä CuS04:a (lopullinen väkevyys 10 μΜ) . Absorbanssi mitettiin joka kolmas minuutti kokeen aikana. Absorbanssi 234 nm:ssä jaettiin kolmeen faasiin: viivästy-20 mävaihe, lisääntymisvaihe ja hajoamisvaihe (kuvio 1) . Vii-västymävaihe määritettiin pohjalinjan ja lisääntymisvai- • · · • *.ϊ heen absorbanssikäyrän nousun tangentin leikkauspisteenä.

Hapettumisen nopeus määritettiin nousukäyrän tangenttina.

·*·., T,^ määritettiin aikana, joka tarvitaan saavuttamaan maksi- •*.t! 25 maalinen absorbanssi lisääntymisvaiheen ja hajoamisvaiheen • · :*. välillä. Absorbanssi t-^ssa miinus absorbanssi t0:ssa otettiin indikaattoriksi muodostuneen dieenin kokonaismäärälle.

. . Kokeen toistettavuuden todistamiseksi referenssi • · · 30 LDL näyte valmistettiin ja pidettiin pimeässä typessä · *···* 4 *C:essa. Tälle referenssinäytteelle tehtiin kaikki hape- tuskokeet.

• · :***. LDL eristettiin 23 kohteesta. Plasman kolesteroli ··· *. vaihteli välillä 156 - 278 mg/dl (keskiarvo 213 mg/dl), • · · 35 triglyseridien määrä vaihteli välillä 47 - 328 mg/dl (kes- • · 118884 16 kiarvo 191 mg/dl) ja fosfolipidit vaihtelivat välillä 178 - 327 mg/dl (keskiarvo 231 mg/dl).

Kuviossa 2 esitetään seuraavien nebivololin 2-hyd-roksianalogien antioksidatiivinen teho: 5 [ (RSSS) + (RSRR) + (SRSS) + (SRRR)]-a-[[[2-(kroman-2-yyli)-2- hydroksietyyli] amino] metyyli] -6-hydroksi-2-kromaanimetano-lin etaanidioaatti (1:1) ja [ (SRSR) + (SRRS) + (RSSR)]- a,a'-iminobis(metyleeni)bis[6-hydroksi-2-kromaanimetanoli]. ja viivästymävaihe molemmat kasvoivat ja hapettumisen no-10 peus väheni. In vitro nebivololilla ei ole antioksidatii-vista vaikutusta. Vitamiinilla E, joka oli vertailuaineena, ei myöskään ollut mitään antioksadanttista vaikutusta pitoisuuksilla, jotka olivat alhaisempia kuin 10 μΜ (tuloksia ei esitetty). Vitamiinin E t^ 20 μM:ssä oli lähellä 15 nebivololoin hydroksimetaboliittien arvoa t^ 2 μM:ssä kokeellisissa olosuhteissamme. Vitamiinilla E ei ollut vaikutusta hapettumisen nopeuteen, alkuperäiseen absorbans-siin eikä dieenien kokonaismäärään. Johtopäätöksenä voidaan sanoa, että nebivololin hydroksimetaboliiteilla on 20 antioksidatiivista vaikutusta ihmisen LDL:iin in vitro. Nebivololilla voi täten olla tärkeä suojaava vaikutus ha- • · · j \ί pettävää vauriota vastaan in vivo ateroskleroosissa, tu- :T: lehduksissa ja syövässä.

Esimerkki 2 • · · : 25 Nebivololin anti-ateromaattinen vaikutus in vivo • · ··, Tarkoituksena testata onko nebivololilla vaikutusta • ** ikääntymiseen liittyvään verisuonten patologiaan, lukui- • · · * sille rotille annosteltiin nebivololia suun kautta annoksina 0 (vain kantajaa), 2,5, 10 ja 40 mg/kg 24 kuukauden • · · *·*·* 30 aikana. Kantajana käytettiin 2-hydroksipropyyli-jS-syklo- • · · dekstriiniä, joka parantaa nebivololin biosaatavuutta.

.*.j Kullakin annoksella ryhmällä, jossa oli 50 urosta ja naa- • · .···. rasta, suoritettiin 2 vuoden koe. Ryhmä, jossa oli 50 • · urosta ja naarasta ja joka ei saanut nebivololia, sisälly-35 tettiiin myös tutkimukseen. Testattaville eläimille teh- e e 118884 17 tiin ruumiinavaus ja histologisia ei-neoplastisia muutoksia tarkkailtiin. Seuraavia histologisia piirteitä, jotka voivat liittyä verisuonten degeneraatioon tai ikääntymiseen, havannoitiin erityisesti: 5 - vatsan mesoteelin, haiman ja kivesten vaskulopa- tia, - lisäkilpirauhasten paikallinen ja diffuusi liikakasvu, ja - munuaisten histologia, erityisesti basofiilisten 10 munuaistiehyiden määrä, osoitus kroonisesta munuaissairaudesta ja mineralisaatiosta.

Histopatologisista havainnoista annettiin numero välillä 0-3 seuraavasti: - 0: ei histologisia muutoksia 15 - 1: vähäisiä histologisia muutoksia - 2: kohtalaisia histologisia muutoksia - 3: vakavia histologisia muutoksia.

Kullakin havainnolle laskettiin keskiarvo. Havainnot analysoitiin käyttäen Mann-Whitneyn U-testiä (kaksi-20 häntäinen todennäköisyys) tilastollisesti merkittävien erojen havaitsemiseksi vertailuryhmien ja käsiteltyjen j 1 : ryhmien välillä. Näistä arvioista tehtiin yhteenveto alla

olevaan taulukkoon. Merkittävyys laskettiin Mann-Whitney U

ϊ1.ί# -testillä kaksihäntäisenä: 1p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001.

» • · • · · • · · • · · • · • 1« ·· • · « « 1 » • · • · • · · · ··· · • · n» • · • · · • ·» • · • · · • · • 1 ··1 • · · ·«1· · 18 1 1 8884

Taulukko 1

Histologinen __Annos ryhmä (mg/kg)__ muutos

Vertailu Väliaine 2,5 10 40_

Urospuoliset

Epänormaali 5 mesoteeli: vaskulopatia 2,50 - - - 0,00*

Munuainen; basofiilinen 0,10 0,12 0,18 0,18 0,60*** 10 tiehyt krooninen 1,68 1,40 1,32* 1,24* 0,66*** sairaus 15 Haima: vaskulopatia 0,30 0,18 0,04 0,02* 0,00***

Lisäkilpirau hanen: 20 diffuusi hyperplasia 0,18 0,14 0,08 0,15 0,02* paikallinen hyperplasia 0,16 0,08 0,04 0,02* 0,00** 25

Kives: vaskulopatia 0,52 0,48 0,20* 0,08** 0,02***

Naaraspuoliset_ 30 Munuainen: ,, , basofiilinen I : tiehyt 0,04 0,14 0,18 0,18* 0,42*** • * • ·· ; ; : krooninen 35 sairaus 1,04 0,76 0,88 0,92 0,78 • · • · · *, , minerali- Ϊ M saatio 0,96 0,74 0,84 0,64* 0,14*** • · « » ! 40 (parenkyymi/ munuaisia : allas)

Haima: , , 45 vaskulopatia 0,12 0,04 0,04 0,02 0,00* • · · • i t ·*· • · *" Esimerkki 3 • * ·.*·· Primääriset alkioasteella olevat aivotursoviljelmät • · · : : 50 valmistettiin oleellisesti edellä kuvatulla tavalla (Pau- ·»* ' wels et ai., Van Aschouw, H. P., Peeters, L·., Hoeremans, * M., Leysen, J. E. (1992) Chronic treatment with sabeluzole • « 118884 19 protects cultured rat brain neurons from the neurotoxic effects of excitatory amino acids. Synapse, 12:271 - 280). Rottien alkioiden 17 päivän ikäiset aivotursomuodostelmat leikeltiin ja hajotettiin 0,05 % trypsiiniin, jossa oli 5 0,1 mg/ml DNase I:ä DMEM:ssä (Dulbecco Modified Eagle

Medium). Lämmöllä inaktivoitua hevosen seerumia (HS) lisättiin konsentraatioon 4 %, ja solut sentrifugoitiin, pestiin DMEMillä ja uudelleen suspendoitiin DMEM/Ham's F12:sta (3:1), joka sisälsi 10 % HS:a. Solut sijoitettiin 10 tiheytenä 4 x 105 solua/cm2 polylysiinillä esipäällyste-tyille multiwell-24-levyille. Ensimmäisenä päivänä viljelmässä väliaine vaihdettiin kemiallisesti määriteltyyn CDM-R12-väliaineeseen (DMEM-HEPES/Ham's F12 (3:1), joka sisälsi 0,26 % naudan seerumin albumiinia, 30 nM natriumsele-15 niittiä, 3 nM 3,3,',5-trijodi-L-tyroniinia, 0,35 μΜ reti-nolia, 0,3 μΜ retinoliasetaattia, 2,3 μΜ DL-a-tokoferolia, 2,1 μΜ DL-a-tokoferoliasetaattia, 3,6 μΜ linoleenihappoa, 3,6 μΜ linoleiinihappoa, 0,125 % ihmisen transferriiniä, 20 μΜ progesteronia, 57,7 μΜ kortikosteronia, 49 U/l insu-20 liinia, 0,4 μΜ biotiinia, 10 μΜ L-karnitiinia, 83 μΜ D(+)-galaktoosia, 3,3 μΜ glutationia, 10 μΜ etanolamiinia, 0,1 mM putreskiinia; Romijn, H. J., van Huizen, F., Wol-:*·*· ters, P. S. (1984) Towards an improved serum-free, chemi- f. cally defined medium for long-term culturing of cerebral ,·, · 25 cortex tissue. Neurosci. Behav. Rev., 8:301 - 334). Vil- • *t * jelmien akuutit ja pitkäkestoiset esikäsittelyt olivat • i« oleellisesti aiemmin kuvatun kaltaisia (Pauwels et ai., • · · 1992). Lääkeaineet liuotettiin ja laimennettiin 10 % tai 1 % hydroksipropyyli-/3-syklodekstriinillä niin, että V.! 30 liuottimen lopulliset pitoisuudet akuuteissa ja kroonisia- *«· sa annoksissa olivat vastaavasti 0,1 % ja 0,01 %. Seuraa- vissa esimerkeissä käytetty yhdiste A on [ (RRSR) + (RRRS) +- .···. (SSSR) + (SSRS) ] -a- [ [ [2- (kroman-2-yyli) -2-hydroksietyyli] - • · "* amino]metyyli]-6-hydroksi-2-kromaanimetanolin etaanidio- « ,,.'ϊ* 35 aatti (1:1) .

• · 118884 20

Akuutissa käsittelyssä lääkeainetta tai liuotinta lisättiin viljelmiin seitsemäntenä päivänä. Väliaine kor-vattiiin 20 minuutin kuluttua 200 μΐ-.lla kemiallisesti määriteltyä DMEM-väliainetta (sama koostumus kuin CDM-R12-5 väliaineessa, mutta ilman Ham's F12:a) (vertailu), tai kemiallisesti määritellyllä DMEM-vällaineella, joka sisälsi oksadatiivisen stressin laukaisijaa. Käytettyjä oksidatii-visen stressin laukaisijoita olivat ImM natriumnitroprus-sidi (SNP, typpioksidiradikaalia kehittävä yhdiste), tai 10 7,5 - 10 mM dietyyliditiokarbamaattia (DDTC, superoksidi- dismutaasin inhibiittori) ja testattavaa yhdistettä.

Pitkittyneen esikäsittelyn kokeissa lääkeainetta (konsentraatiovälillä 0,1 nM - 10 μΜ) lisättiin seerumiva-paaseen väliaineeseen viljelyn ensimmäisenä ja neljäntenä 15 päivänä. Seitsemäntenä päivänä viljelmät pestiin kerran DMEM:llä ja inkuboitiin 0,2 ml :11a kemiallisesti määriteltyä DMEM-väliainetta 2 tuntia 37 'Creessa. Solut pestiin ja väliaine korvattiin 0,2 ml :11a kemiallisesti määriteltyä DMEM-väliainetta (vertailu) tai kemiallisesti määri-20 teltyä DMEM-väliainetta, jossa oli oksidatiivisen stressin laukaisijaa (katso alla).

*· · • *,ϊ Sekä akuutissa kokeessa että pitkittyneen esikäsit- :*!*; telyn kokeessa ekstrasellulaariset ja intrasellulaariset LDH- (laktaattidehydrogenaasi) aktiivisuudet mitattiin t 25 spektrofotometrisesti 340 nm:ssä EPOS Analyzer 5060 :llä j*. Bergmeyerin menetelmän mukaisesti (Bergmeyer, H. U. (1974) • *·

Biochemical reagents: Methods of Enzymatic Analysis. H. U.

• * ·

Bergmeyer, toim. Academic Press, New York, 2. painos, s.

, # 480 - 242). Ekstrasellulaarista LDH-aktiivisuutta viljely- • * · *·*·* 30 väliaineessa ja sytoplasmista LDH-aktiivisuutta, jotka mi- • · *·..* tattiin solujen hajottamisen jälkeen 1 ml:ssa vettä, käy- ψ ·*·.· tettiin kokonais-LDH-aktiivisuuden ja LDH:n vapautumis-%:n • * .*·*. laskemisessa. Neuroprotektio viittaa LDH:n vapautumisen \ esto-%:iin, jossa oksadatiisen stressin laukaisijan ai- ··· ···· 35 heuttama LDH:n vapautuminen määritellään 0-%:isena suo- • · 118884 21 jauksena, ja LDH-.n vapautumisen perus (vertailu) taso määritellään 100~%:isena suojauksena.

VitE:n poistokokeissa primääriviljelmät valmistettiin edellä kuvatulla tavalla, mutta viljelyn ensimmäisenä 5 päivänä väliaine vaihdettiin kemiallisesti määriteltyyn CDM-R12-väliaineeseen, jossa joko oli (vertailu) tai ei ollut DL-a-tokoferolia (VitE) ja DL-a-tokoferoliasetaat-tia, testattavan yhdisteen läsnä ollessa tai ilman. Kun vitE oli pois viljelyalustalta, vakavia solukuolemia ha-10 vaittiin neljäntenä päivänä in vitro. Yhdisteiden lisääminen voisi pelastaa viljelmät. Viljelmien eloonjääminen mitattiin sytoplasmisen LDH-aktiivisuuden avulla. VitE:n kompensointi-% viittaa sytoplasmisen LDH:n %:iin, jolloin LDH-pitoisuudet, jotka olivat yhtä suuria kuin silloin kun 15 läsnä oli vitE:tä, määriteltiin 100 %:ksi, kun taas LDH-pitoisuudet olivat yhtä alhaiset kuin silloin kun vitE oli jätetty pois viljelmistä, määriteltiin 0 %:ksi. ECjo vitE:n kompensaatiolle viittaa yhdisteen konsentraatioon, joka tarvitaan ylläpitämään viljelmän henkiinjääminen 20 50-%:isesti siitä henkiinjäämisestä, joka havaitaan viljelmillä, jotka on kasvatettu vitE:llä täydennetyllä alus- • *,: talla. Kustakin yhdisteestä testattiiin seitsemää pitoi- suutta kolmena sarjana, itsenäisten kokeiden määrä on esi-·*·,, tetty taulukossa, ja keskiarvo ECS0-arvo ±SD on laskettu.

t .*.tI 25 Taulukko 2: VitE täydennystesti: nebivololijohdan- t · j·, naisten vaikutus, seulontaarvot i ·· t···. Taulukko 3: VitE täydennystesti: yhdisteen A teho • · «

Taulukko 4: Nebivololin, yhdisteen A ja karvedilo- t , Iin neuroprotektio in vitro typpioksidia ja superoksidira- • · · *·[·* 3 0 dikaaleja vastaan • · *·..* Primääriset hermoviljelmät ovat riippuvaisia anti- :*·.· oksidantin vitE läsnäolosta viljelyväliaineesta in vitro * · .*·*. eloonjäämisessä. Kun vitE jätetään pois viljelmän kasvat- ft· *t tamiseen tarkoitetusta väliaineesta, eloonjääminen putoaa ··“ 35 ±20 %:iin vertailusta. Yhdisteet, joilla on antioksidatii- • Φ 22 1 1 8884 visia vaikutuksia, kykenevät korvaamaan vitE:n puutteen, ja nämä voivat väliaineeseen lisättynä pelastaa vitE:tä sisältämättömän viljelmän. Lukuisia nebivololijohdannaisia testattiin pitoisuuksina 10'7M ja 10_6M primäärisillä hermo-5 viljemillä, joista oli jätetty vitE pois. Yhdiste A, nebivololi, 1-nebivololi ja d-nebivololi kykenivät kaikki pelastamaan vitE:tä sisältämättömät viljelmät tiettyyn rajaan asti (taulukko 2).

Yhdiste A oli kaikkein tehokkain yhdiste: täydelli-10 nen primäärisen hermoviljelmän, josta oli jätetty vitE pois, pelastuminen havaittiin pitoisuudella 10¾ (taulukko 2) . Yhdisteen A pitoisuus, jolla viljelmä pelastui 50-%risesti vertailuun nähden (vertailu on viljely, jota kasvatettiin väliaineessa, joka sisälsi 4,4 μΜ vitE:tä) 15 oli 126 ±88 nM (taulukko 3).

Viljelmien käsittely superoksidin dismutaasin inhibiittorilla DDTC ja typpioksidin luovuttajalla (SNP) johtaa radikaali- (02‘ja NO vastaavasti) välitteiseen neuro-toksisuuteen. Yhdisteet, joilla on antioksidatiivisia vai-20 kutuksia, kykenevät suojaamaan viljelmiä radikaalivälit-teiseltä neurotoksisuudelta, kun niitä lisätään vähän en- ·· t • *ti nen laukaisijan lisäystä tai sen aikana (akuutti käsitte- ly) / tai kun sitä annetaan 6 päivää ennen laukaisijaa j\. (pitkittynyt esikäsittely). Taulukon 3 perusteella on sei- • ,·. ϊ 25 vää, että nebivololi ja yhdiste A voivat saada aikaan neu- ·♦, * roprotektiota viljemissä DDTC:a tai SNP:a vastaan kummal- • ·· lakin käsittelytavalla. Mekanismi, joka on käsittelystä • · · * riippuvaisen neuroprotektion takana, on toistaiseksi tuntematon. Osittaista suojausta, joka havaitaan nebivololil- • · · *»V 30 la ja yhdisteellä A SNP:tä ja DDTC:tä vastaan, ei kuiten- kaan havaita karvedilolilla, mikä tekee nebivololin ja yh- •\j disteen A ylivoimaisiksi lääkeaineiksi tässä suhteessa.

• * ··· • · • · ··· 1 ύ • · 118884 23

Taulukko 2

VitE:n komplementaatiotesti: nebivololijohdannaisten vaikutus, seulontatiedot

Yhdiste Pitoisuus % vitE komplemen- (M) taatio (testien lukumäärä) 5 Yhdiste 10'7 27 ± 28 (16) ΙΟ-6 85 ± 21 (16) nebivololi 107 29 ± 29 (15) (RSSS, SRRR) 10-« 29 + 28 (15) 1-nebivololi 10'7 22 ± 20 (13) 10 (SRRR) 10^ 24 ± 26 (13) d-bebivololi 1Q.7 12 ± 17 (7) (RSSS) 1Q< 19 ± 22 (7)

Neuronaaliset primääriset aivotursoviljelmät kasva-15 tettiin ilman eloonjäämistekijää vitE, mikä johti vakaviin solukuolemiin. Kun nebivololijohdannaisia lisättiin viljelyn aikana, viljelmät pelastuivat tiettyyn asteeseen saakka. 100-%:inen vitE:n korvautuminen viittaa vastaavaan soluviljelmän eloonjäämiseen kuin vitE:tä sisältävällä solu- ·1.·. 20 viljelmällä.

• · •1:\ Taulukko 3 * · i f. VitE:n komplementaatiotesti: hydroksinebivololin teho • ·· • 1 ·.1·; Yhdiste Keskiarvo EC30 ± SD annosvas- ·· ί teiden lukumäärä ^••e ------------

Yhdiste A 126 + 88 nM (5) 25 • · • · · *·1·1 Neuronaaliset primääriset aivotursovil jelmät kasva- • e tettiin ilman eloon]aamistekijää vitE, mikä johti vakaviin •\j solukuolemiin. Kun hydroksinebivololi lisättiin viljelyn • e .···. aikana, viljelmät pelastuivat. EC1, viittaa pitoisuuteen, • ee1 •# 30 jossa viljelmä pelastui 50-%:isesti, mitattuna LDH-aktii- ♦ 1· ·1·1 visuudella.

· 24 1 1 8884

Taulukko 4

Nebivololin, yhdisteen A ja karvedilolin in vitro neuro-protektio typpioksidin ja superoksidin radikaaleja vastaan % neuroprotektin keskiarvo ± SD 5 (itsenäisten viljelmien lukumäärä)

Yhdiste Laukai- Pitkittynyt Akuutti sija esikäsittely käsittely 10'7M io-*m 10'vM io-*m nebivololi DDTC NA (2) 37±23(2) 32±28(5) 29±16(7) (RSSS, SNP 26±13 (2) 36±18(3) NA (2) NA (2) SRRR) 10 Yhdiste A DDTC NA (2) NA (2) 35±32 (5) 30±28(6) SNP 39±13(2) 38 (1) NA (2) NA (2) karvediloli DDTC NA (2) NA (2) NA (1) NA (4) SNP NA (1) NA (1) NA (1) NA(1) 15 Neuronaalisia primäärisiä aivotursoviljelmiä kasva tettiin CDM-R12 väliaineessa 7 päivää. Testattavia yhdisteitä annosteltiin ensimmäisenä ja neljäntenä viljelypäi-vänä (pitkitetty esikäsittely) tai seitsemäntenä päivänä (akuutti käsittely). Hapettavan stressin laukaisijaa li- ·· • *,* 20 sättiin seitsemäntenä päivänä, ja neuroprotektio lasketti*! tiin LDH:n vapautumisen ehkäisynä. NA merkitsee ei- aktii- **·.. vista, eli <25 % neurosuojausta.

« ·'· I Esimerkki 4 • ·· • · j*. Kystiinin glutamaatin kilpaileva inhibitio tietyis- i ·« ,···, 25 sä soluissa johtaa glutationin puutteeseen ja hapettavaan • t « stressiin. Tämä hapettavan stressin malli on kuvattu glian C6-glioomasoluille (Kato et ai., 1992. A mechanism for • ' · · ***** glutamate toxicity in the C6 glioma cells involving inhi- • · *···* bit ion of cystine uptake leading to glutathione depletion.

·**.· 30 Neurosci. 48:903 - 914) ja hermostoperäiselle solulinjalle * · .*·*. N18RE105 (Murphy et al., 1989. Glutamate toxicity in a

Ml \ neuronal cell line involves inhibition of cystine trans- ·«· ···* port leading to oxidative stress. Neuron 2:1547 - 1558).

• · 118884 25

Soluviljelmä: C6-glioomasolulinjaa (American Type Culture Collection, CCL 107) viljeltiin DMEM:ssä, johon oli lisätty 2 tai 4 nM glutamiinia, 1 nM pyruvaattia ja 5 tai 10 % lämmössä inaktivoitua vasikan sikiön seerumia. 5 Viljelmiä pidettiin 37 °C:eessa ilmassa, jossa oli 5 - 10 % C02:a, vedellä kyllästetyssä ilmakehässä.

Glutationin puute ia lääkeaineiden arviointi anti-oksidantteina: Kokeet suoritetttiin viljelyillä, joissa 011 30 000 ~ 50 000 solua/cm2, 24-syvennyksisillä viljely-10 levyillä (myrkyllisyys- ja lipidiperoksidimittauksiin) tai 136 000 solua/cm2 96-syvennyksisillä viljelylevyillä (GSH-määritys). Viljelyt siirrettiin 8-24 tunnin kuluttua vil-jelyvällaineeseen, jossa joko oli tai ei ollut mukana kystiinin oton inhibiittoria, glutamaattia lopullisena vä-15 kevyytenä 10 nM. Tavoitteena testata yhdisteitä hapettavan stressin inhibiittoreina lääkeaineet lisättiin yhdessä glutamaatin (lopullinen liuottimen pitoisuus oli 0,01 % hydrokspropyyli-j3-syklodekstriiniä, 0,1 % DMSO) kanssa. Solunsisäiset glutationipitoisuudet mitattiin 6-8 tunnin 20 kuluttua, lipidiperoksidit mitattiin 14-20 tunnin kuluttua, ja myrkyllisyys ja suojaus analysoitiin 48 tunnin ku- ·· * • *.: luttua käyttäen LDH-koetta Bergmeyerin ja Bernt in menetel- män mukaisesti (UV-assay with pyruvate and NADH. Medhods i*·.. of Enzymatic Analysis. 1974. H. U. Bergmeyer, toim. Acad.

·*·,· 25 Press, New York, 2. painos, ss. 574 - 579).

t · i\ GSH-pitoisuuden määrittäminen C6-alioomavilielmis- sä: GSH-tasot analysoitiin mikrometodilla, pääosin Vande- • · » putten et al. kuvaamalla menetelmällä (A microtiterplate . . assay for total glutathione and glutathione disulfide con- • · » 30 tents in cultured/isolated cells: performance study of a • · *·;·* new miniaturised protocol. 1994. Cell Biol. Toxicol. 10: i\{ 415 - 421), tehden muutoksia pesu- ja homogenisointipro- :"*· sesseihin. Solut (96-syvennyksisissä levyissä) pestiin • tt PBS:lla, homogenisoitiin 50 ul:ssa 10 mM HCl:a, joka si- «·· **,!f 35 sälsi 1,3 % 5-sulfosalisyylihappoa, ja homogenaattia sent- • · 26 1 1 8884 rifugoitiin 1 200 x g:ssä 10 minuuttia 4 'C:ssa. 4 0 μΐ emäliuosta siirrettiin 96-syvennyksisen levyn syvennykseen ja 200 μΐ reagenssia (1 mM 5,5'-ditiobis-(2-nitrobentsoe-happoa), 0,34 nM NADPH:a ja 6,3 mM EDTAa 143 mM fosfaatti-5 puskurissa pH:ssa 7,4) lisättiin. Tämä tasapainotettiin 5 minuutissa huoneenlämpötilaan, jonka jälkeen reaktio aloitettiin lisäämällä 40 μΐ glutationion reduktaasia (8,5 IU/ml 143 mM fosfaattipuskuria, 6,3 mM EDTAa pH:ssa 7,4), NADPH:n hapettumista seurattiin 414 nm:ssä 5 minuuttia 10 Multiscan MCC/340:lla (Labsystems), ja muutos absorbans-sissa (DA) minuuttia kohti laskettiin. Glutationipitoisuus pääteltiin standardikäyrältä, joka ulottui 0,2:sta 2:een (nmol) kaupallista GSHrta testiä kohti (DA/min esitettynä pitoisuuden suhteen).

15 Solunsisäisten peroksidien fluoresenssimittaus: So- lunsisäisten peroksidien muodostus havaittiin käyttäen 6-karboksi-2',7'-diklooridihydrofluoreskiinin diasetaat-tia, di(asetoksimetyyliesteriä) (C-DCDHF, molekulaariset koettimet). C.DCDHF liuotettiin DMSOriin pitoisuutena 10 20 nM ja varastoitiin -70 ’C:ssa typpi-ilmakehässä.Sen jälkeen kun viljelmä oli altistettu glutationia tuhoaville ·· · ; V aineille, soluja kuormitettiin 10 μΐ C-DCDHF:lla tunnin : ajan 37 °C:ssa. Väliaine imettiin pois, PBS lisättiin so- i\. luille ja levyjä luettiin Cytofluor II mikrolevyjen luki- ;*·.· 25 jalla (PerSeptive Biosystems) . Heräte- ja emissioaallonpi- • * *’· tuudet valittiin 485/530 nm:n suodatinparilla. Tulokset on ,···. esitetty suhteellisina fluoresenssiyksikköinä/ μ$ proteii- • · · nia.

. , Tulokset: C6-glioomasoluviljelmien käsittely 10 nM

* · · ltl 30 glutamaatilla kuuden tai useamman tunnin ajan johti voi- • · makkaaseen pienenemiseen solunsisäisissä glutationipitoi- Ϊ*·.: suuksissa (taulukko 5) . Glutationin väheneminen johti ha- ·***; pettävään stressiin, kuten ±6-kertainen kasvu myrkyllisten ··· *, solunsisäisten peroksidien määrässä osoittaa (taulukko 5).

···*. 35 Lopullisia solukuolemia tapahtui 16 - 48 tunnin kuluttua.

t · 27 1 1 8884

Ulkopuolinen myrkyllisyys ei sisälly tähän myrkyllisyyteen, kuten sytoplasmisen LDH:n vapautuminen (indeksi sel-lulaariselle myrkyllisyydelle) ei estynyt NMDA-antagonistilla MK801 (tietoja ei esitetty). Meidän viljelyolosuh-5 teissämme pohjana oleva LDH:n vapautuminen C6-glioomavil-jelmissä oli 2,7 ± 0,3 % kokonais-LDH:sta (keskiarvo ± SD, n = 12), ja LDH:n vapautuminen 48 tuntia 10 nM glutamaa-tilla käsittelyn jälkeen oli 93,2 + 1,3 % kokonais- LDH: sta. Sekä nebivololi että yhdiste A suojasivat näitä 10 viljelmiä solukuolemalta erittäin tehokkaasti (taulukko 6) . ICjq suojaukselle oli noin 9 nM sekä nebivololille että yhdisteelle A. Tämä suojaus ei johtunut glutationitasojen palautumisesta (taulukko 5) , joka pysyi noin puolessa terveiden vertailusolujen pitoisuuksista, osoittaen että mo-15 lempien yhdisteiden suojaus johtui yhteisvaikutuksesta GSH-tuhoutumis-välitteisen hapettavan stressin kanssa. So-lunsisäisten peroksidien arviointi osoitti, että sekä nebivololi että yhdiste A inhiboivat glutamiinivälitteistä kasvua peroksidaatiossa (taulukko 5).

20 JohtoOäätelmät: Tämä on selvä in vitro -näyttö sii tä, että molemmat yhdisteet toimivat soluviljelmissä po- ·· · • *,J tentiaalisina antioksidantteinä; ne suojaavat soluja ha- :Y: pettävän stressin välittämältä solukuolemalta, samoin kuin ·*·,, ne ehkäisevät hapettavan stressiin välittämää nousua myr- .'.φί 25 kyllisten solunsisäisten peroksidien määrässä.

• Φ ·* • · • *· ΦΦφ • · · • · « • · φφφ φ « « Φ φ ΦΦΦ Φ # φ φ φφφ φ * # Φφφ φ ·# φ Φ φφφ φ φ φ φ φφφ φ φφφ φ Φφφφ φ φ φ 118884 28

Taulukko 5

Glutationin puutoksen välittämä solunsisäinen peroksidaa-tio C6-glioomasoluissa 5 Yhdiste Pitoisuudet Solunsisäiset peroksi- pmol/syvennys dit (keskiarvo ± SD, 6) Suhteelliset fluore- senssiyksiköt//ig proteiinia ___(keskiarvo ± SD, n)_

Liuotin 90+9 86 ± 16 (2)

Glutamaatti, 296 ± 26 525 ± 57 (12)

10 mM

10 + Yhdiste A 301 ± 12 137 ± 8 (3) 1 μΜ + Nebivo- 301 ± 12 155 + 13 (3) 15 loli, 1 μΜ

Taulukko 6 20 Glutationin puutoksen välittämän oksadatiivisen stressin (myrkyllisyys) inhibitio C6-glioomasoluissa

Yhdiste Suojaus ΙΟΜ, nM

(keskiarvo ± SD, n = 3) ·· * t----- ------- -- a ♦

Yhdiste A 8,6 ± 0,2 aaa ,* Nebivololi 9,1 ± 0,1 • · \ . 25 • » » • · · a · t • a • aa a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a aaa a a a a aaa a a a aaa a aa a a aaa a a a a aa a a aaa a a a a a a a a

Claims (6)

118884 1. a,a'-iminobis(metyleeni)bis[2-kromaanimetanoli]-johdannaisten, farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditio-5 suolojen, stereokemiallisesti isomeeristen muotojen ja kyseisten johdannaisten, suolojen ja stereoisomeerien minkä tahansa seosten käyttö valmistettaessa lääkeaineita ihmisten, jotka kärsivät verisuoni- ja hermostosysteemin ikääntymisestä tai degeneratiivisista sairauksista, joihin liitit) tyy hapettava stressi, terapeuttiseen tai ennalta ehkäise vään hoitoon, kyseisillä johdannaisilla ollessa kaava (I): OH H OH 15 jossa R1 ja R3 ovat toisistaan riippumatta fluori, hydroksi tai vety, R2 ja R4 ovat toisistaan riippumatta vety tai hydroksi, ja kukin tähti merkitsee stereogeenista kes- .. , kusta.

* · · *#<·* 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tun- • · · *·* * 20 nettu siitä, että hoidettaviin sairauksiin kuuluvat ve- *· : *·· risuonisysteemin degeneraation patologiset muodot, kuten \**: aterogeneesi, ateromatoosi, valtimonkovetustauti, valtimon- : ·.. rasvoittumistauti, verisuonten liikakasvu, johon liittyy korkea verenpaine, veren lipoproteiinien runsaus tai nor-25 maali ikääntymisestä johtuva verisuonten degeneraatio; su- kurauhasten ja haiman verisuonten patologia; lisäkilpi- • · · .···, rauhasen reaktiivinen liikakasvu; krooninen munuaissairaus; • · kasvainsairaudet; ja tulehdussairaudet. • ·

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tun- ··· ϊ,,.ί 30 nettu siitä, että kaavan (I) mukainen yhdiste on nebivo- loli - ···· • · 118884

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kaavan (I) mukaista yhdistettä käytetään suun kautta annosteltavaksi tarkoitetun farmaseuttisen koostumuksen valmistuksessa.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että nebivololin päivittäinen annos vaihte-lee välillä 0,1 - 20 mg.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että päivittäinen annos annetaan yhtenä an-10 noksena. e* · • · · « · • · *·· • · · • « · ·· • · • ·* * • · • · · • · · • « • · • · • ·· • ·· • · * t * · * • · • · · • · · • t ·*» • · • · ··· • · • · * • * · * · «·· • · • · ♦ · * ·· ♦ **· « f 118884