FI111011B

FI111011B - Mikro-organismien kiinteä kasvualusta, sen valmistus ja käyttö

Info

Publication number: FI111011B
Application number: FI970163A
Authority: FI
Inventors: Helena Tuompo; Leena Scheinin; Marita Jussila
Original assignee: Orion Yhtymae Oyj
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1997-01-15
Publication date: 2003-05-15
Also published as: CZ247099A3; EP0970188A1; HUP0000868A2; US6258586B1; PL334519A1; NO993297L; AU722087B2; FI970163A0; WO1998031785A1; NO993297D0; AU5663998A; FI970163A; JP2001507941A; HUP0000868A3; CZ290141B6

Description

111011

Mikro-organismien kiinteä kasvualusta, sen valmistus ja käyttö

Keksinnön kohteena on käyttövalmis mikrobien elatusaine, 5 joka sisältää selluloosaeetteripohjaista hydrogeeliä ja ravinteita. Elatusaine voidaan kuivata kiinteälle pohjal-j le, säilyttää kuivattuna ja kostuttaa käyttöönotettaessa joko suoraan tutkittavalla näytteellä tai vedellä. Elatusainealusta voidaan upottaa tutkittavaan näytelluokseen 10 tai painaa tutkittavaa kosteaa näytepintaa vasten, minkä jälkeen alustaa inkuboidaan sopivassa lämpötilassa, kunnes mikro-organismit ovat kasvaneet visuaalisesti tunnistettaviksi pesäkkeiksi.

15 Infektioita ja kontaminaatiota aiheuttavien mikro-organismien määrän ja lajin määritys on tärkeää valittaessa joko sopivaa hoitomuotoa lääkinnässä tai torjuntamuotoa elintarviketeollisuudessa ja muualla ympäristöhygieniassa. Tätä tarkoitusta varten on kehitetty lukuisia elä-20 tusaineita ja elatusainealustoja eri bakteerien ja sienten osoittamiseksi.

Sairauksia diagnostisoivassa mikrobiologiassa pyritään määrittämään ja tunnistamaan infektioita aiheuttavat mik-25 ro-organismit, mm. bakteerit (sekä aerobit että anaerobit bakteerit) ja sienet (hiivat ja homeet), mahdollisimman tarkkaan erilaisista ihmis- ja eläinperäisistä näytteistä (esim. virtsa, veri, seerumi, plasma, aivo-selkäydinneste, pleuraneste, askitesneste, märkä, haavaerite, yskös, 30 uloste ja nielunäyte), jotta voitaisiin valita tehokas parantava hoitomuoto. Mikrobeista joudutaan määrittämään usein myös herkkyys eri antimikrobilääkkeille. Tähänkin käytetään erilaisia elatusaineita ja elatusainealustoja.

ψ 4 35 Mikro-organismit aiheuttavat ongelmia myös useilla eri teollisuuden alueilla. Jos ne pääsevät kerääntymään prosesseihin, niistä aiheutuvat terveysriskit ja saastu-misongelmat tulevat hankaliksi hoitaa. Mikrobit pystyvät # t * 1 111011 2 yleensä tehokkaasti vastustamaan puhdistusta desinfektio-ja antiseptisten aineiden sekä antibioottien vaikutusta suojaavan, mikrobisolujen ja prosessiliuosten kiinteän materian muodostaman ns. biofilmikerroksen sisällä, jossa 5 ne voivat säilyä hengissä pitkiäkin aikoja.

Useat tuotantoprosessit vaativat korkeaa hygieenistä tasoa, koska lieväkin mikro-organismien kasvusto voi pilata koko tuotteen. Alentunut hygienia aiheuttaa ongelmia var-10 sinkin elintarviketeollisuudessa, terveydenhuollossa, sairaanhoidossa ja vesijärjestelmissä. Muunlaisia ongelmia kuten esim. bakteerien aikaansaamaa limamuodostusta prosessiteollisuuden laitteissa ja putkistoissa voi esiintyä erityisesti puunjalostusteollisuudessa, ja ho-15 meitä voi esiintyä kaikkialla ilmanvaihtokanavissa. Teollisuudessa on todettu, että mikrobit ovat osaltaan myös muiden ongelmien aiheuttajia, kuten esimerkiksi korroosion synnyssä. Mikrobeja ja niiden aiheuttamia ongelmia tavataan muualtakin, kuten esimerkiksi kylpyhuoneen kaa-20 keleistä, saunan lauteilta ja uima-altaista. Sairaaloissa tauteja aiheuttavat mikrobit voivat esim. kolonisoitua ilmanvaihtojärjestelmään ja aiheuttaa näin sairaalainfektioita. Siksi jatkuva hygienian seuranta mikrobipitoi-suuksia määrittämällä onkin käytössä useimmissa tiloissa, 25 joissa on tiedostettava hygienian taso.

Mikro-organismien klassiset viljelymenetelmät perustuvat kasvualustoihin, joissa geeliytyvänä aineena on merilevistä eristetty agar-agar. Elatusainealustat on joko itse 30 valmistettava kuivasta jauheesta työläästi tai ostettava käyttövalmiina. Kaupan olevat käyttövalmiit elatusainealustat ovat valmiina paisuneessa, vettyneessä muodossa. Itsevalmistettujen ja teollisten agar-agaria sisältävien kosteiden elatusainealustojen säilyvyysaika on rajalli-35 nen, koska ne kuivuvat helposti eikä niitä voi kostuttaa uudelleen. Jotta kosteus ja steriiliys säilyisivät mahdollisimman kauan, tällaisia elatusainealustoja on varas- 3 111011 toitava hyvin tiiviissä pakkauksissa, jotka vaativat runsaasti tilaa.

US-patentin 3,046,201 mukaisessa elatusainealustassa käy-5 tetään agar-agarin sijasta silloitettuja polyakryyliami-dihydrogeelejä tai polyakryyliamidin ja gelatiinin, sili-kageelin tai tärkkelyksen seoksia geeliytyvinä aineina. Geeliä ei kuivata eikä sillä ole näytteen nestettä absorboivaa ominaisuutta.

10 US-patentin 3,360,440 mukaisessa menetelmässä valmistetaan kuivageeli sekoittamalla ravinteet selluloosaeette-riin ja lyofilisoimalla seos. Ennen lyofilisointia seokseen voidaan lisätä mikro-organismeja, jolloin saadaan 15 käyttövalmis säilyvä viljelmä. Kuivageeli resuspendoidaan steriilillä vedellä ennen käyttöä mikrobien määritykseen tai, mikäli mikrobeja on lisätty ennen lyofilisointia, mikrobien kasvatusta. Mikrobimäärityksissä näytteen mikrobit imeytyvät geelin sisään ja kasvavat siten morfolo-20 gialtaan eri näköisinä kuin tavallisilla alustoilla, joissa kasvu tapahtuu geelin pinnalla. Tämä vaikeuttaa huomattavasti tulosten luettavuutta ja siten heikentää määritysten luotettavuutta. Lisäksi lyofilisointi menetelmänä on monivaiheinen ja vaatii suhteellisen kalliita 25 laitteistoja.

Mainitun US-patentin 3,360,440 mukaisessa testipakkauksessa vesi ja kuivattu geeli on sisällytetty säiliön eri osiin. Resuspendoinnin jälkeen geeli voidaan siirtää ha-30 lutulle alustalle painamalla säiliön seinämää. Testipak-. kaus on monimutkainen eikä se ole käyttövalmis.

4 * Tämän lisäksi tunnetaan menetelmiä, joissa absorboivaan < kalvoon, jona voidaan käyttää suodatinpaperia tai muuta 35 vastaavaa imukykyistä kantajakerrosta, imeytetään ravinteet ja geeli. Geeli voidaan myös levittää kalvon pinnal-: le tai geelin korvaa bakteereita läpäisemätön kalvo.

4 4 1Π011 Näissä menetelmissä absorboiva kalvo pitää kasvulle tarvittavan kosteuden sisällään. Tällaisia menetelmiä kuvataan patenttijulkaisuissa US 3,881,993, EP 0 374 905, US 3,814,670 ja EP 0 006 192, joita tarkastellaan lähemmin 5 seuraavassa.

US-patentin 3,881,993 mukaisessa menetelmässä absorboivalle alustalle, joka toimii myös tukirakenteena, on imeytetty ravinteet, reagenssit ja geeliytyvä aine ja 10 alusta on kuivattu ali- tai ylipaineessa. Geeliytyvänä aineena käytetään inerttiä kumia, lineaarisia polysakkarideja tai natriumalginaattia. EP-julkaisun 0 374 905 mukaisessa menetelmässä geeliytyvät aineet imeytetään filtteripaperin sisään. Geeliytyvänä aineena käytetään 15 natriumalginaattia. Menetelmän mukaista testialustaa käytetään märkänä. US-patentin 3,814,670 mukainen menetelmä on edellisten kaltainen, poikkeuksena se, että geeliker-ros levitetään absorboivan kalvon pinnalle. Geeliytyvinä aineina voidaan käyttää agaria, gelatiinia, selluloosaku-20 meja, karrageeneja, alginaatteja, albumiineja, polysakka rideja tai polypeptideja. Kasvualusta on kuivattu. EP-julkaisu 0 006 192 kuvaa kuivattua kasvualustaa, jossa elatusainekartongin päällä on muovikalvo, joka on vinyy-liasetaatin tai akryylihappoestereiden homopolymeeri, 25 vinyylipropionaatin ja vinyyliasetaatin, vinyylipropio-naatin ja vinyylikloridin, vinyyliasetaatin ja maleiini-happoestereiden, akryylinitriilin, akryylihappoestereiden ja vinyylipropionaatin tai butadieenin ja styreenin kopo-lymeeri. Avaaja-aineena käytetään polyetyleeniglykoleja, 30 polyetyleenioksideja, polyvinyylipyrrolidonia, polyvinyy-lialkoholeja, osittain saippuoituneita polyvinyylieste-reitä, vinyylipyrrolidonin ja vinyyliestereiden sekapoly-meereja tai selluloosajohdannaisia, kuten hydroksialkyy-liselluloosaa.

Edellä mainittujen menetelmien haittana on, että kasvualustan geeliytyvä ainesosa tarvitsee tukikerroksia pysy- 35 111011 5 äkseen koossa, mikä tekee jo alustojen valmistuksesta hankalaa. Niillä menetelmillä, missä myös geeliytyvä aine imeytetään absorboivan kerroksen sisään, on lisäksi se heikkous, että pinta, jossa mikrobit kasvavat, on epä-5 tasainen, jolloin mikrobit näyttävät katsojasta täysin toisenlaisilta kuin klassisessa osoitusmenetelmässä aga-rin pinnalla.

Tunnetaan myös elatusaineita, joissa geeliytyvät aineet 10 ovat kylmään veteen liukenevia jauheita. Ne kiinnitetään hydrofobiselle alustalle tartuntakerroksen avulla kuten patenteissa US 5,089,413 ja US 4,565,783 sekä WO-patent-tijulkaisussa 93/12218. Lisäksi kasvualusta sisältää usein vielä ilmaa läpäisevän membraanin. Geelillä voidaan 15 päällystää myös hydrofobinen alusta suoraan, jolloin geeli on silloitettu ionisidoksilla lisäämällä geeliin suoloja. Tällaisia kasvualustoja on käytetty patenttien US 5,089,413 ja US 4,565,783 mukaisissa menetelmissä vain sivelyviljelyalustoina. Haittana on, että silloitettaessa 20 suolojen avulla mikrobien kasvu usein estyy.

Patenttien US 5,089,413 ja US 4,565,783 mukaisissa menetelmissä liima-aineina käytetään iso-oktyyliakrylaatin ja akryyliamidin tai akryylihapon kopolymeereja tai 2-25 metyylibutyyliakrylaatin ja akryylihapon kopolymeereja tai silikonikumia. Geeliytyvänä jauheena käytetään al-giniinia, karboksimetyyliselluloosaa, hydroksietyylisel-luloosaa, guarkumia, Johanneksen leipäpuun palkokumia, ksantaanikuraia tai näiden seoksia. WO-patenttijulkaisun 30 93/12218 mukaisessa menetelmässä käytetään tartuntaker- roksena iso-oktyyliakrylaatin ja akryyliamidin tai N-vi- * , nyylipyrrolidonin kopolymeeria. Tartuntakerrokseen kiin nitetään kylmään veteen liukeneva jauhe, joka on superab-4 sorboivan ja geeliytyvän aineen seos. Geeliytyvä aine voi 35 olla alginiini, guarkumi, hydroksimetyyliselluloosa, Johanneksen leipäpuun palkokumi, karboksimetyyliselluloosa, ksantaanikumi tai näiden seos. Superabsorboiva aine on 111011 6 glykolimodifioitu polysakkaridi, tärkkelysnatriumakry-laattiakryyliamidi-graftpolymeeri tai näiden seos. Näissä menetelmissä mikrobit kasvavat geelin sisällä lukuunottamatta sivelyviljelyalustaa. Haittana onkin, että pesäk-5 keiden morfologia ei ole samankaltainen kuin agar-agar-pinnoilla.

Keksinnön tarkoituksena on poistaa edellä mainitut ongelmat ja saada aikaan uusi elatusainealusta mikro-organis-10 mien viljelemiseksi ja tunnistamiseksi.

Keksinnön kohteena oleva hydrogeelielatusaine on erityisen sovelias käytettäväksi mikro-organismien määrittämiseen ihmis- ja eläinperäisistä näytteistä lääketieteel-15 listen diagnoosien vahvistamiseksi ja hoitomuodon valitsemiseksi .

Keksinnön tarkoituksena on myös saada aikaan ratkaisu mikro-organismien ja niiden muodostamien biofilmien mää-20 rittämiseksi mm. elintarviketeollisuuden ja puunjalostusteollisuuden prosessilaitteista ja ilmanvaihtojärjestelmien teräspinnoilta.

Keksinnön kohteena oleva elatusainealusta on erityisen 25 sovelias sellaisissa tilanteissa, joissa ei ole mahdollista valmistaa itse elatusaineita ja joissa tarvitaan hygienian jatkuvaa seurantaa, kuten elintarviketeollisuuden omavalvonta ja sairaaloissa tauteja aiheuttavien bakteerien tuhoamisen varmistaminen esim. eri pinnoilta, 30 liuoksista ja ilmanvaihtojärjestelmistä.

Tarkoituksena on ollut kehittää elatusainealusta, jolla voidaan saavuttaa parempi herkkyys eri mikrobeille, mutta jota voidaan kuitenkin elatusaineen ainesosia ja niiden 35 suhteita muuntelemalla hyödyntää eri herkkyysalueilla.

Pitkän säilyvyysajan takaamiseksi kasvualustan on oltava kuivamuodossa. Kasvualustan on oltava helppokäyttöinen.

111011 7

Tarkoituksena on ollut myös, että ravinteet ja muut rea-genssit lisätään geeliin ja että geeli voidaan kiinnittää suoraan vettä läpäisemättömälle alustalle ilman imukykyisiä kantajakerroksia tai tartuntakerroksia.

5 ’ Vaatimuksena on myös, että geeli toimii suodattimen ta voin, jolloin mikrobit tarttuvat geelin pintaan näytteen sisältämän nesteen imeytyessä geeliin. Imeytyneen nesteen ansiosta ravinteet liukenevat ja diffundoituvat mikrobien 10 käytettäväksi, jolloin mikrobit kasvavat morfologialtaan samanlaisina kuin klassisilla agar-agar-alustoilla.

Tarkoituksena on ollut kehittää imukykyinen, 1 000 -1 000 000 mPas:n (2 % vesiliuos, 20 °C, 100 kPa) vis-15 kositeetin omaava geeli, joka ravinteiden ja muiden tarvittavien komponenttien lisäyksen jälkeen voidaan levittää sopivalle vettä läpäisemättömälle alustalle, kuivata normaali-ilmanpaineessa 0,01 - 20 paino-%:n kosteuteen sekä steriloida tarvittaessa esimerkiksi säteilyttämällä 20 tai kaasuttamalla.

Nyt on havaittu, että edellä olevat vaatimukset voidaan täyttää, jos geeliytyvänä aineena käytetään verkkoutet-tuja selluloosaeetteripohjaisia hydrogeelejä. Ne ovat ko-25 valenttisilla sidoksilla silloitettuja hydrofiilisiä polymeerejä, jotka paisuvat vedessä, mutta pitävät muotonsa pysyvän kolmiulotteisen rakenteensa ansiosta eivätkä siten tarvitse erillisiä tukirakenne- tai kiinnityskerrok-sia kuten tunnetun tekniikan mukaiset ratkaisut. Siten 30 keksinnön mukainen hydrogeelielatusaine voidaan kuivata vettä hylkivälle alustalle ilman liima-aineita.

« rt

Selluloosaeetterigeelissä olevien kemiallisten silloitusten määrällä voidaan säädellä geelin suodatinominai-35 suuksia. Mitä enemmän silloituksia geelissä on, sitä pienempi on sen huokoskoko. Mikrobit tarttuvat geelin pintaan näytteen sisältämän nesteen imeytyessä geeliin, joi- δ 111011 loin näyte konsentroituu. Geelin imukykyä ja samalla ela-tusaineen herkkyyttä voidaan säädellä valitsemalla lähtöaineiksi sopivia hydrofiilisten ja hydrofobisten sellu-loosaeettereiden seoksia (hydrofiilisiä ovat esim. nat-5 riumasetaattiryhmän tai hydroksialkyyliryhmän sisältävät selluloosaeetterit ja hydrofobisia esim. alkyyli- tai bentsyyliryhmän sisältävät selluloosaeetterit). Sellu-loosaeetterien silloitusten sekä hydrofiilisyys/hydrofo-bisuus -ominaisuuksien ansiosta geeliin voidaan imeyttää 10 nestetilavuudeltaan ja bakteerimäärältään suurempi näyte.

Keksinnön mukaisen peruskoostumuksen omaavaa elatusainet-ta voidaan käyttää eri herkkyysalueilla. Niinpä sillä voidaan määrittää esimerkiksi 1 - 103 CFU/ml tai 103 - yli 15 107 CFU/ml. Keksinnön mukainen elatusainealusta soveltuu siten hyvin käytettäväksi sekä teollisuuden hygieniaval-vonnassa että toisaalta lääketieteellisessä diagnostiikassa.

20 Keksinnön mukainen kuiva elatusainealusta imee näytteeseen kastettaessa itseensä muutaman minuutin kuluessa vakioisen neste-määrän (10 - 1000 μΐ riippuen tarvittavasta herkkyydestä), jossa on ekvivalentti määrä mikrobeja tutkittavaan näytemäärään verrattuna. Näytteellä kos-25 tunut kasvualusta on yhtä sileä ja tasainen kuin normaaleissa agar-agaralustoissa ja mikrobit muodostavat normaalin inkubointiajan jälkeen pesäkkeitä geelin pinnalle.

Muodostuvan geelipinnan kovuutta ja geelin viskoottisia 30 ominaisuuksia voidaan myös säädellä käyttämällä eri mole-kyylipainon ja viskositeetin omaavia selluloosaeettereitä lähtöaineina.

Selluloosaeettereiden etuina on myös, että niistä valmis-35 tetut geelit ovat kirkkaita ja läpinäkyviä, raaka-aineet ovat halpoja bulkkituotteita ja luonnonpolymeereinä eivät tuota ympäristölle haittaa hajotessaan.

111011 9

Selluloosaeettereinä voidaan käyttää selluloosajohdannai-sia, joissa selluloosan OH-ryhmien vetyjä on korvattu alkyyli-, kuten esimerkiksi metyyli-, etyyli- tai propyy-liryhmillä, hydroksialkyyli-, kuten esimerkiksi hydrok-5 sietyyli- tai hydroksipropyyliryhmillä, bentsyyli- tai ' hydroksibentsyyliryhmillä tai karboksimetyylin alkalime- tallisuoloilla, kuten natriumasetaatilla, tai näiden seoksilla. Kussakin selluloosan glukoosiyksikössä voi olla 0-3 edellä mainituilla ryhmillä substituoitua OHIO ryhmää. Selluloosaeettereiden viskositeetti voi olla 100 - 100 000 mPas, mieluiten 1 000 - 10 000 mPas (2% vesiliuos, 20 °C lämpötila, 100 kPa paine) ja molekyylipaino 500 - 1 000 000, edullisesti 1 000 - 500 000. Lopputuotteen viskositeetti saadaan edellä mainitun viskositeetin 15 omaavia selluloosaeettereitä lähtöaineina käytettäessä halutulle viskositeettialueelle 1 000 - 1 000 000 mPas.

Selluloosaeetterit ovat lineaarisia polymeerejä, joista voidaan muodostaa hydrogeelejä verkottamalla niitä eri 20 tavoin. Selluloosaeettereitä voidaan silloittaa selluloosalle tunnetuilla tavoilla. Niinpä kolmiulotteinen verk-kopolymeeri voidaan saada aikaan esimerkiksi a) antamalla selluloosaeetterien OH-ryhmien reagoida for-25 maldehydin, glyoksaalin, urean tai melamiinin monomety-loli- ja dimetylolijohdannaisten, ureaformaldehydi- ja melamiiniformaldehydiesipolymeerien, dimetylolietyleeni-urean, epikloorihydriinin, diepoksidien, di-isosyanaat-tien (George Odian Principles of Polymerization 1981, 30 671, John Wiley & Sons, Inc) tai divinyylisulfonin (David . C. Harsh ja Stevin H. Gehrke; Journal of Controlled Re- „ lease, 17 (1991) 175-186 ja U. Anbergen ja w. Oppermann;

Polymer, Voi 31, 1990, 1854-1858) kanssa, 35 b) säteilyttämällä (mm. elektronit, neutronit, gamma- ja UV-säteily) (George Odian Principles of Polymerization 1981, 671-672, John Wiley & Sons, Inc) tai 111011 10 c) graftpolymeroimalla selluloosaeetterit vinyylimonomee-rien kanssa vapaaradikaalimekanismilla. Vapaat radikaalit tuotetaan joko säteilyttämällä (esim. gamma- tai UV-sä-teily) tai kemiallisella aktivaatiolla (redox-systeemi, 5 peroksidit tai diatsoniumsuolat) (A. Hebeish, J.T. Guthrie, The Chemistry and Technology of Cellulosic Copolymers, 1981 32-241, Springer-Verlag). Vinyylimonomeereina voidaan käyttää esimerkiksi akroleiinia, akryyliamidia, 2-akryyliamido-2-metyylipropaanisulfonihappoa, 2-akryy-10 liamido-2-metyylipropaanisulfonihapon suoloja, akryyli-happoa, akryylihapon suoloja, akrylonitriiliä, metakryy-liamidia, metakryyliamidopropyylitrimetyyliammoniumklori-dia, metakryylihappoa, metakryylihapon suoloja, 2-meta-kroyylioksietaanisulfonihappoa, 2-metakroyylioksietaani-15 sulfonihapon suoloja, 2-metakryylioksietyylitrimetyyliam-moniumkloridia, 3-metakryylioksi-2-hydroksipropyylitri-metyyliammoniumkloridia, metakroloyylikloridia, N,N'-metyleenibisakrylamidia tai näiden seoksia.

20 Selluloosaeettereitä voidaan siten verkkouttaa esimerkiksi divinyylisulfonilla alkalisessa liuoksessa. Divinyy-lisulfoni muodostaa silloituksia additioreaktiolla joko polymeerirungossa tai substituoiduissa ryhmissä sijaitsevien OH-ryhmien kanssa. Käytettävä divinyylisulfonin mää-25 rä on valittavissa halutun silloitustiheyden ja silloitettavien polymeerien reaktiivisuuden ja konsentraation mukaan ja on esimerkiksi metyyliselluloosalle, hydroksi-propyyliselluloosalle ja karboksimetyyliselluloosalle noin 0,005 - 1,5 g divinyylisulfonia per gramma kuivaa 30 polymeeriä, edullisesti noin 0,05 - 0,5 g divinyylisulfonia per gramma kuivaa polymeeriä 2 prosenttisessa sellu-loosaeetteriliuoksessa. Teoreettinen silloitustiheys divinyylisulfonilla tai jollakin muulla edellä esitetyssä vaihtoehdossa a) mainitulla yhdisteellä silloitettaessa 35 on noin 8,5 x 10'5 - 2,5 x 10‘2 moolia per gramma kuivaa selluloosaeetteriä, edullisesti noin 8,5 x 10"4 - 8,5 x 10"3 moolia per gramma kuivaa selluloosaeetteriä.

111011 11

Keksinnön mukaisessa elatusainealustassa silloitettuihin selluloosaeettereihin perustuvan hydrogeelin huokoskoko on noin 0,1 - 1000 nm, edullisesti noin 1,0 - 500 nm.

5 Hydrogeelien absorptio-ominaisuuksia voidaan parantaa ' detergenttien lisäyksellä. Detergentteinä voidaan käyttää anionisia (esimerkiksi Na-lauryylisulfaatti) tai nonioni-sia (esim. Tween 20, Triton X-100) detergenttejä. Hydrogeelien absorptio-ominaisuuksia voidaan myös säädellä 10 muilla geeliytyvillä, vesiliuoksia absorboivilla yhdisteillä kuten edellä mainitut selluloosaeetterit, edellä mainittujen graftpolymeroinnissa käytettyjen polymeerien kopolymeerit, agar-agar, albumiinit, alginaatit, gelatiini, guarkumi, karrageenit, ksantaanikumi, polypeptidit ja 15 muut modifioidut polysakkaridit.

Mahdollisten detergenttien ja geeliytyvien aineiden lisäksi geeliin lisätään ravinteita (mm. peptonit, ravinto-hydrolysaatit ja sokerit) sekä tarvittaessa pH:n säätä-20 jiä, substraatteja, muita biokemiallisiin osoitusreakti-oihin liittyviä reagensseja, selektiivisiä estoaineita, antibiootteja ja väriaineita ennen geeliseoksen kuivausta.

25 Näin saatu selluloosaeetteripohjäinen hydrogeelielatusai-ne voidaan levittää sopivalle vettä läpäisemättömälle alustalle ja kuivata 0,01 - 20 paino-%:n kosteuteen. Sopivia vettä läpäisemättömiä alustoja ovat esimerkiksi polypropeeni-, polystyreeni- tai polyesterialustat, 30 joista voidaan valmistaa kastolevytyyppisiä testiliuskoja. Haluttaessa elatusaine voidaan kuivata myös lasikui-tuverkolle, mikäli verkko on sopivan tiheä ja hydrogeelin silloitus riittävä. Kuivaus voidaan suorittaa normaali-ilmanpaineessa tai haluttaessa ali- tai ylipaineessa.

35 Sopiva loppukosteus on 0,01 - 20 paino-%, edullisesti 0,05 - 10 paino-%.

111011 12

Kuivattu elatusainealusta säilyy käyttökelpoisena pitkiä aikoja ja sen käyttömahdollisuudet ovat monipuoliset. Niinpä kuiva elatusainealusta voidaan upottaa suoraan tutkittavaan näyteliuokseen tai painaa tutkittavaa koste-5 aa näytepintaa vasten, jolloin geeli imee itseensä vakiomäärän näytettä. Mikäli tutkittavana kohteena on kuiva pinta, geeli voidaan ensin kostuttaa esimerkiksi vedellä ja painaa sitten tutkittavaa pintaa vasten tai pinta voidaan kostuttaa ja painaa kuiva geeli sitten kostutettua 10 pintaa vasten. Kiinteä kuiva näyte puolestaan voidaan suspendoida nesteeseen, johon elatusainealusta kastetaan. Kuiva elatusainealusta voidaan myös kostuttaa ja tiputtaa sitten tutkittava näyte alustalle.

15 Keksintö koskee myös kuivatun hydrogeelielatusainealustan sisältävää mikrobiologista testipakkausta, jossa ela-tusaineen geeliytyvä ainesosa muodostuu keksinnön mukaisesta kovalenttisesti silloitettuihin selluloosaeetterei-hin perustuvasta hydrogeelistä, jolloin hydrogeelielatus-20 aine voidaan kiinnittää suoraan vettä läpäisemättömälle alustalle ilman kantaja- tai tartuntakerroksia. Testipakkaus voi lisäksi sisältää esimerkiksi kostutusliuoksen ja näytteenottoliuoksen. Testiliuskan säilytyspakkaus voi toimia myös sen inkubointikammiona.

25

Edellä esitetyn perusteella keksinnön mukainen elatus-ainekoostumus voi sisältää divinyylisulfonilla ristisi-dottaessa esimerkiksi (prosenttiosuudet w/v laskettu nesteen tilavuudesta) 30 a) 0,1-10 paino-% natriumkarboksimetyyliselluloosaa J b) 0,1 - 10 paino-% hydroksipropyylimetyyliselluloosaa tai hydroksipropyyliselluloosaa c) 0,05-0,5 paino-% natriumhydroksidia 35 d) 0,005 - 1,5 g divinyylisulfonia/g selluloosaeetteriä e) 0,01 - 1,0 paino-% Tween 20 f) 0,1-10 paino-% hiivaekstraktia 111011 13 g) 0,1-10 paino-% Lablemcoa ja h) 0,001 - 0,005 paino-% Bromthymol blueta, joka seos levitetään vettä läpäisemättömälle alustalle ja kuivataan 20 - 60 °C:ssa 0,01 - 20 paino-% kosteuteen.

5 ' Mikäli selluloosaeetterit verkkoutetaan graftpolymeroi- malla, keksinnön mukainen elatusainekoostumus voi sisältää esimerkiksi (prosenttiosuudet w/v laskettu nesteen tilavuudesta) 10 a) 0,1-10 paino-% natriumkarboksimetyyliselluloosaa b) 0,1-10 paino-% akryyliamidia c) 0,01 - 10 paino-% Ν,Ν'-bismetyleeniakryyliamidia d) 0,001 - 0,1 paino-% kaliumhydroksidia 15 e) 0,001 - 0,01 paino-% natriumpyrosulfiittia f) 0,005 - 0,1 paino-% kaliumpersulfaattia ja g) 0,1-10 paino-% BHI-ravinnetta, joka levitetään vettä läpäisemättömälle alustalle ja kuivataan 20 - 60 °C:ssa 0,01 - 20 paino-% kosteuteen. Ka-20 liumpersulfaatti ja natriumpyrosulfiitti toimivat edellä esitetyssä koostumuksessa graftpolymeroinnin redox-initi-aattorina aikalisissä olosuhteissa, jolloin akryyliamidi ja Ν,Ν'-bismetyleeniakryyliamidi polymeroituvat sellu-loosaeettereiden kanssa.

25

Keksintöä ryhdytään seuraavassa lähemmin tarkastelemaan sovellusesimerkkien avulla. Sovellukset ovat esimerkkejä eikä niiden tarkoituksena ole missään tapauksessa rajoittaa keksintöä.

30

Mikrobit on kasvatettu ennestään tunnetulla tekniikalla • · J BHI-liuoksessa ja kasvustoista on laimennettu käyttösus- pensiosarjat (CFU/ml). Suspensiossa olevat mikrobit on määritetty uudella kiinteällä alustalla ja verrattu en-35 nestään tunnettuun viljelytekniikkaan, kuten ravintoagar-maljaviljely ja kastolevy (Uricult ™, Hygicult ™).

111011 14

Esimerkki 1.

450 mg natriumhydroksidia liuotetaan 400 ml:aan ionivaih-dettua vettä. Tähän liuotetaan 2 g hydroksipropyylimetyy-5 liselluloosaa (viskositeetti 4000 mPas, 2 % liuos) tai hydroksipropyyliselluloosaa (molekyylipaino 370 000) ja 4 g natriumkarboksimetyyliselluloosaa (viskositeetti 6000 mPas, 1 % liuos). Sekoitetaan 3 tuntia 60 °C:ssa, jäähdytetään huoneenlämpöön ja lisätään 0,4 ml divinyylisulfo-10 nia, sekoitetaan ja seisotetaan 16 tuntia. Sekoitetaan 2 tuntia 60 °C:ssa, laimennetaan geeli l%:ksi ja säädetään pH natriumhydroksidilla pH 7:ksi. 100 ml:aan edellämainittua geeliä lisätään 0,05 g Tween 20, 0,6 g hiiva-ekstraktia, 0,3 g Lablemcoa ja 3 mg Bromthymol blueta.

15 Saatu seos kuivataan polypropeenipohjalle (200 μΐ/cm2) huoneenlämpötilassa ja näin saatu kuiva elatusainealusta leikataan 12 cm2 testiliuskoiksi.

Esimerkki 2.

20 12 g natriumkarboksimetyyliselluloosaa (viskositeetti 6000 mPas 1 % liuos) liuotetaan 600 ml:aan vettä ja kaasutetaan inertillä kaasulla ja lämmitetään 70°C:een. Seokseen lisätään 0,6 g Ν,Ν'-bismetyleeniakryyliamidia ja 25 0,6 g akryyliamidia, jotka on liuotettu 20 ml:aan vettä.

Lisätään 1 ml 1 M kaliumhydroksidiliuosta, 35 mg natrium-pyrosulfiittia ja polymeroidaan lisäämällä 100 mg kalium-persulfaattia. Sekoitetaan inertissä kaasuatmosfäärissä 4 tuntia. Seokseen lisätään 15 g BHI-ravinnetta, säädetään 30 pH 7:ksi ja seos kuivatetaan polypropeenipohjalle (200 μΐ/cm2) huoneenlämpötilassa ja näin saatu kuivaela-tusainealusta leikataan 12 cm2:n testiliuskoiksi.

» *

Esimerkki 3.

35

Testiliuskojen imukykyä testattiin kastamalla esimerkkien 1 ja 2 testiliuskat 0,9 % NaCl-liuokseen 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 ja 2,5 minuutiksi ja punnitsemalla liuskat. Tulokset 111011 15 on esitetty taulukossa 1.

Taulukko l. Testiliuskojen nesteen imemiskyky

Imeytysaika min/imeytynyt nestemäärä ml ^ 5 Geeli 0,5 min 1,0 min 1,5 min 2,0 min 2,5 min 1 0,26 ml 0,39 ml 0,41 ml 0,46 ml 0,49 ml 2 0,23 ml 0,34 ml 0,40 ml 0,45 ml 0,49 ml 3 0,38 ml 0,54 ml 0,62 ml 0,69 ml 0,75 ml 10 Geeli 1 = Natriumkarboksimetyyliselluloosa-hydroksipro-pyylimetyyliselluloosa-hydrogeeli (esim. 1)

Geeli 2 = Natriumkarboksimetyyliselluloosa-hydroksipro-pyyliselluloosahydrogeeli (esim. 1)

Geeli 3 = Graftnatriumhydroksipropyylimetyyliselluloosa-15 akryyliamidi-N,N'-bis-metyleeniakryyliamidipolymeeri (esim. 2)

Johtopäätöksenä tuloksista voidaan todeta, että hydrofii-lisemmista selluloosa-eettereistä syntetisoidut geelit 20 imevät enemmän nestettä samassa ajassa.

Esimerkki 4.

• Esimerkin 1 natriumkarboksimetyyliselluloosa-hydroksipro- 25 pyylimetyyliselluloosa-testiliuskat kastettiin puoleksi minuutiksi Escherichia coli (ATCC 25922) laimennossarjaan 101 - 108 CFU/ml. Näytettä imeytyi 0,25 ml. Testiliuskoja inkuboitiin 37 °C:ssa 20 tuntia. Vertailuna oli ravinto-agarmalja, jolle pipetoitiin näytettä 0,1 ml. Kasvutihey-30 det luettiin vastaavasti kuin ravintoagarmaljoilta. Tulokset kerättiin taulukkoon 2.

35 111011 16

Taulukko 2. Escherichia colin kasvutiheydet ravintoagar-maljoilla ja testiliuskoilla_.

bakteerilaimennos Kasvutiheys Kasvutiheys CFU/ml CFU/ml ravintoagarmal- testiliuskalla _ jalla__ 101___3___8_ 5 JLO]__18__38_ 103___10]__10]_ 104 __Vtf__lOj_ 105 ___10]__10]_ 106___10]__>10''_ 10 _1θ]___>10]__>107_ 10e__>107__>107_

Taulukon 2 kasvutiheyksistä voidaan todeta, että kasvutiheys on verrannollinen näytemäärään.

15

Esimerkki 5.

Esimerkin 1 natriumkarboksimetyyliselluloosa-hydroksipro-pyylimetyyliselluloosa-testiliuskojen toimivuutta tutkit-20 tiin eri bakteereilla ja hiivalla. Testiliuskat kastettiin puoleksi minuutiksi Escherichia coli- (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae- (ATCC 33495), Proteus mirabilis-(ATCC 12453), Pseudomonas aeruginosa- (ATCC 27853), Enterococcus faecalis- (ATCC 29212), Staphylococcus aureus-25 (ATCC 25922) ja Candida albicans- (ATCC 14053) laimen-nossarjoihin 101 - 108 CFU/ml. Näytettä imeytyi 0,25 ml. Testiliuskoja inkuboitiin 37 °C:ssa 20 tuntia. Vertailuna oli Uricult™ kastolevyn Cled-elatusaine, jonka näytemäärä on 0,025 ml. Kasvutiheydet luettiin vertaamalla Uricultin 30 mallitauluun. Tulokset kerättiin taulukkoon 3.

111011 17

Taulukko 3. Eri mikrobien kasvutiheydet testiliuskoilla ja UricultTH:in Cled elatusaineella_

Mikrobilaimennos CFU/ml 4

Mikrobi/ 5 Testiliuska/ 101 102 1 03 104 1 05 1 06 1 07 1 08 «. Uricult™-Cled E. co//

Testiliuska 8 38 104 105 107 >107 >107 >107

Uricult™-Cled 0 1 6 1 04 1 04'5 106 107 >107 10 K. pneumoniae

Testiliuska 4 10“ 104 10“ >107 >107 >107 >107

Uricult™-Cled 1 2 1 03 1 04 1 0s 106 107 >107 P. mirabilis

Testiliuska 14 39 104 105 >107 >107 >107 >107 15 Uricult™-Cled 5 5 7 10“ 1 04 1 05 1 06 1 07 P. aeruginosa

Testiliuska 6 17 104 10“ >107 >107 >107 >107

Uricult™-Cled 0 2 10 104 >107 >107 >107 >107 S. aureus 20 Testiliuska 1 2 1 8 1 04 1 05 1 0“ >107 >107

Uricult™-Cled 0 0 10 10“ 104'5 10“ 106 107 E. faecalis

Testiliuska 1 10“ 104 104'5 >107 >107 >107 >107

Uricult™-Cled 0 1 3 10“ 104 10“ 106 >107 25 C. albicans

Testiliuska 0 0 0 20 10“ >107 >107 >107

Uricult™-Cled 0 0 1 103 104 105 10“ 106 30 Mikrobikasvusto oli jopa sata kertaa tiheämpää testiliuskoilla, koska niihin imeytyi runsaammin näytettä kuin Cled-elatusaineeseen, 35 Esimerkki 6.

Esimerkin 1 natriumkarboksimetyyliselluloosa-hydroksipro-<. pyylimetyyliselluloosa-testiliuskojen toimivuutta tutkit- 40 tiin hiivalla ja homeella. Testiliuskat kastettiin kahdeksi minuutiksi Candida albicans- (ATCC 14053) ja As- 111011 18 pergillus niger- laimennossarjoihin 101 - 10e CFU/ml. Näytettä imeytyi 0,45 ml. Testiliuskoja inkuboitiin 37 °C:ssa 20 tuntia (C. albicans) tai 22 °C:ssa 72 tuntia (A. niger). Vertailuna oli Hygicult™ Y & F, jonka näyte-5 määrä on 0,050 ml. Kasvutiheydet luettiin vertaamalla Hygicultin mallitauluun.

Taulukko 4. Hiivan ja homeen kasvutiheydet testiliuskoilla ja Hygicult ™ Y & F:llä.

10 __Hiiva/Homelaimennos CFU/ml_

Mikrobi

Testiliuska 101 102 103 104 105 106

Hygicult™ Y & F________ 15 c. albicans

Testiliuska 0 2 50 300 104'5 >107

Hygicult™ Y & F _0__3__1 32 104 106 A. niger

Testiliuska 01026 18 20 Hygicult™ Y & F | 0 |q |l | 6 36 104'5

Verkkoutettuihin selluloosaeettereihin perustuva hydro-geelielatusaine ylläpitää homeiden ja hiivan kasvua, vaikka tässä esimerkissä elatusaineen ravinteet eivät ole 25 optimeja hiivalle eikä homeelle kuten Hygicult™ Y & F:ssä.

Esimerkki 7.

30

Erilaisten selluloosaeetteripohjäisten hydrogeeliela-tusainealustojen toimivuus tutkittiin kastamalla testattavat elatusaineliuskat puoleksi minuutiksi Escherichia . coli- (ATCC 25922), Enterococcus faecalis- (ATCC 29212) 35 ja Candida albicans- (ATCC 14053) laimennossarjaan 101 -104 CFU/ml ja inkuboimalla 37 °C:ssa 20 tuntia. Kasvutiheydet luettiin vertaamalla Uricult™:in mallitauluun. Tulokset kerättiin taulukkoon 5.

40 111011 19

Taulukko 5. Escherichia colin, Enterococcus faecaliksen ja Candida albicansin kasvutiheydet, CFU/ml eri hydrogee-lielatusainealustoilla

Mikrobilaimennos CFU/ml s E. coli IF. faecalis |C. albicans

Geeli 101 10" 10J 10* 10l 10z 10J ΙΟ4 101 10' 10J 104 ϊ 1 "38 To^TcT5-!! Tö3-Tör""Iö5-"ö o “ö ~2Ö~~ 2 16 ~49 104 105 1 ~2Ϊ ϊΰ5 1Ö5 5 ~2 ~2Ö 10*“ 3 Ϊ "54 Τσ5 Γ0^"7 "35 "lö^Tö^lj "4 Tö W~

Geeli 1 = Natriumkarboksimetyyliselluloosa-hydroksipro-pyylimetyyliselluloosa-hydrogeeli (esim. 1)

Geeli 2 = Natriumkarboksimetyyliselluloosa-hydroksipro-pyyliselluloosahydrogeeli (esim. 1) 5 Geeli 3 = Graftnatriumhydroksipropyylimetyyliselluloosa-akryyliamidi-N,lT-bis-metyleeniakryyliamidipolymeeri (esim. 2)

Taulukon 5 esimerkeistä nähdään, että erilaisista sellu-10 loosaeettereistä valmistetut hydrogeelit ylläpitävät mikrobien kasvua.

Yhteenvetona edellä esitetyistä esimerkeistä voidaan todeta, että 15 - kaikki mikrobit kasvavat keksinnön mukaisella elatusai nealustalla, vaikka esimerkkien elatusaineiden koostumusta ei mitenkään optimoitu eri mikrobeille, - keksinnön mukainen elatusainealusta on yleisesti ottaen « * * herkempi kuin ravintoagar tai kaupalliset valmiit kasto- 20 levyt, 4 - kasvu keksinnön mukaisella elatusainealustalla on verrannollinen näytemäärään.

Claims

111011

1. Kuivattu mikrobien hydrogeelielatusaine, tunnettu siitä, että se käsittää kovalenttisesti silloitettuihin sel-luloosaeettereihin perustuvan hydrogeelin, jolloin hydro- 5 geelielatusaine voidaan kiinnittää suoraan vettä läpäisemättömälle alustalle ilman kantaja- tai tartuntakerrok-sia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hydrogeelielatusaine, tunnettu siitä, että geeliytyvä ainesosa sisältää sekä 10 hydrofiilisiä että hydrofobisia selluloosaeettereitä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen hydrogeelielatusaine, tunnettu siitä, että selluloosaeettereissä selluloosan OH-ryhmien vetyjä on korvattu alkyyli-, kuten esimerkiksi metyyli-, etyyli- tai propyyliryhmillä, hydrok- 15 sialkyyli-, kuten esimerkiksi hydroksietyyli- tai hydrok-sipropyyliryhmillä, bentsyyli- tai hydroksibentsyyliryh-millä tai karboksimetyylin alkalimetallisuoloilla, jolloin kussakin selluloosan glukoosiyksikössä voi olla 0 -3 edellä mainituilla ryhmillä substituoitua OH-ryhmää.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen hydro geelielatusaine, tunnettu siitä, että selluloosaeetterin molekyylipaino on 500 - 1 000 000, edullisesti 1 000 -500 000.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen hydro-25 geelielatusaine, tunnettu siitä, että selluloosaeetterin viskositeetti on 100 - 100 000 mPas, mieluiten 1 000 -10000 mPas (2 % liuos, 20 °C).

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen hydrogeelielatusaine, tunnettu siitä, että silloitettuihin 30 selluloosaeettereihin perustuvan hydrogeelin huokoskoko on 0,1 - 1 000 nm, edullisesti 1,0 - 500 nm.

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen hydro- t * 111011 geelielatusaine, tunnettu siitä, että se käsittää silloitetun selluloosaeetteripohjäisen hydrogeelin lisäksi ravinteita, sekä mahdollisesti muita tarvittavia kom-* ponentteja, kuten muita geeliytyviä yhdisteitä, pH:n sää- 5 täjiä, detergenttejä, substraatteja, muita biokemialli-siin osoitusreaktioihin liittyviä reagensseja, selektiivisiä estoaineita, antibiootteja ja väriaineita.

8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen hydro-geelielatusaine, tunnettu siitä, että se on kuivattu vet- 10 tä läpäisemättömälle alustalle 0,01 - 20 paino-%:n kosteuteen .

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hydrogeelielatusaine, tunnettu siitä, että geeliin voidaan lisätä selluloosa-eettereitä, vinyylimonomeereistä, kuten akroleiinista, 15 akryyliamidista, 2-akryyliamido-2-metyylipropaanisulfo-nihaposta, 2-akryyliamido-2-metyylipropaanisulfonihapon suoloista, akryylihaposta, akryylihapon suoloista, akry-lonitriilistä, metakryyliamidista, metakryyliamidopropyy-litrimetyyliammoniumkloridista, metakryylihaposta, meta-20 kryylihapon suoloista, 2-metakroyylioksietaanisulfoniha-posta, 2-metakroyylioksietaanisulfonihapon suoloista, 2-metakryylioksietyylitrimetyyliammoniumkloridista, 3-me-takryylioksi-2-hydroksipropyylitrimetyyliammoniumklori-dista, metakroyylikloridista, Ν,Ν'-metyleenibisakryyli- 25 amidista tai näiden seoksista polymeroituja kopolymee-reja, agar-agaria, albumiineja, alginaatteja, gelatiinia, guarkumia, karrageeneja, ksantaanikumia, polypeptideja ja muita modifioituja polysakkarideja.

10. Menetelmä kuivatun mikrobien hydrogeelielatusaine- * < ... 30 alustan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että hydrogeelin muodostamiseksi selluloosaeettereitä verkkoutetaan toisiinsa a) antamalla selluloosaeetterien OH-ryhmien reagoida esimerkiksi divinyylisulfonin, formaldehydin, glyoksaalin, « · 111011 urean tai melamiinin monometyloli- ja dimetylolijohdannaisten, ureaformaldehydi- ja melamiiniformaldehydiesipo-lymeerien, dimetylolietyleeniurean, epikloorihydriinin, diepoksidien tai di-isosyanaattien kanssa, tai 5 b) säteilyttämällä tai c) graftpolymeroimalla selluloosaeetterit vapaaradikaali-mekanismilla vinyylimonomeerien, kuten akryyliamidin ja N, N'-bismetyleeniakryyliamidin, kanssa, saatuun silloitettuun hydrogeeliin lisätään ravinteita 10 sekä mahdollisesti muita tarvittavia komponentteja, ja saatu hydrogeelielatusaine levitetään vettä läpäisemättömälle alustalle ja kuivataan, jolloin elatusaine kiinnittyy alustalle suoraan ilman kantaja- tai tartuntakerrok-sia. 15 li. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geeliin lisätään ravinteiden lisäksi muita komponentteja, kuten geeliytyviä, vesiliuoksia absorboivia yhdisteitä, pH:n säätäjiä, detergenttejä, substraatteja, muita biokemiallisiin osoitusreaktioihin liittyviä 20 reagensseja, selektiivisiä estoaineita, antibiootteja tai väriaineita, ja saatu hydrogeelielatusaine levitetään vettä läpäisemättömälle alustalle, kuivataan 20 - 60 °C:ssa 0,01 - 20 paino-%:n kosteuteen ja leikataan testi-liuskoiksi.

12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että verkkoutettaessa selluloosaeette-reitä patenttivaatimuksen 11 vaihtoehdon a) mukaisesti selluloosaeettereiden teoreettinen silloitustiheys on 8,5 x 10"5 - 2,5 x 10"2 moolia per gramma kuivaa sellu-30 loosaeetteriä.

13. Jonkin patenttivaatimuksista 10 - 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että verkkoutettaessa selluloosa-eettereitä divinyylisulfonilla divinyylisulfonin määrä on O, 005 - 1,5 g / 1 g selluloosaeetteriä. 111011

14. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että graftpolymeroitaessa selluloosaeet-terit akryyliamidin ja Ν,Ν'-bismetyleeniakryyliamidin ’ kanssa akryyliamidin määrä on 0,1 - 10 paino-% (w/v) ja 5 Ν,Ν'-bismetyleeniakryyliamidin määrä 0,01 - 10 paino-% (w/v).

15. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrogeelejä voidaan muodostaa selluloosaeet-tereistä graftpolymeroimalla vapaaradikaalimekanismilla 10 akroleiinin, akryyliamidin, 2-akryyliamido-2-metyyli-pro-paanisulfonihapon, 2-akryyliamido-2-metyylipropaanisul-fonihapon suolojen, akryylihapon, akryylihapon suolojen, akrylonitriilin, metakryyliamidin, metakryyliamidopropyy-litrimetyyliammoniumkloridin, metakryylihapon, metakryy-15 lihapon suolojen, 2-metakroyylioksietaanisulfonihapon, 2-metakroyylioksietaanisulfonihapon suolojen, 2-metakryy-lioksietyylitrimetyyliammoniumkloridin, 3-metakryylioksi- 2-hydroksipropyylitrimetyyliammoniumkloridin, metakroyy-likloridin, N^'-metyleenibisakryyliamidin tai näiden 2 0 seosten kanssa.

16. Mikrobiologinen testipakkaus, joka käsittää kuivatun mikrobien hydrogeelielatusainealustan, tunnettu siitä, että hydrogeelielatusaineen geeliytyvä ainesosa käsittää kovalenttisesti silloitettuihin selluloosaeettereihin 25 perustuvan hydrogeelin, jolloin hydrogeelielatusaine voidaan kiinnittää suoraan vettä läpäisemättömälle alustalle ilman kantaja- tai tartuntakerroksia.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen mikrobiologinen testipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi pin- • · 30 nankostutusliuoksen, näytteenottoliuoksen ja säilytys- a pakkauksen, joka voi toimia inkubointikammiona.

18. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen hydrogeelielatusaineen käyttö määritettäessä mikrobien lajia ja määrää eri herkkyysalueilla. 111011