FI110438B - Menetelmä mutanttiherpesviruksen valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä mutanttiherpesviruksen valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI110438B FI110438B FI931309A FI931309A FI110438B FI 110438 B FI110438 B FI 110438B FI 931309 A FI931309 A FI 931309A FI 931309 A FI931309 A FI 931309A FI 110438 B FI110438 B FI 110438B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- virus
- att
- gene
- viral
- mutant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 50
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 title claims description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 177
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 55
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 48
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 16
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 101
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 54
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 36
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 11
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 10
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 claims description 9
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 3
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims 10
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims 2
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 claims 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims 2
- MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N thymol Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C=C1O MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 208000035484 Cellulite Diseases 0.000 claims 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 claims 1
- 241000721701 Lynx Species 0.000 claims 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims 1
- RYXPMWYHEBGTRV-UHFFFAOYSA-N Omeprazole sodium Chemical compound [Na+].N=1C2=CC(OC)=CC=C2[N-]C=1S(=O)CC1=NC=C(C)C(OC)=C1C RYXPMWYHEBGTRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 206010049752 Peau d'orange Diseases 0.000 claims 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 1
- 230000004397 blinking Effects 0.000 claims 1
- 230000036232 cellulite Effects 0.000 claims 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 claims 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 11
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 7
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 101150055782 gH gene Proteins 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 10
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 101100145155 Escherichia phage lambda cIII gene Proteins 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 101900350318 Simian immunodeficiency virus Surface protein gp120 Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 3
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N sivmac Chemical compound O=C([C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 101100296182 Caenorhabditis elegans paf-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 241000519995 Stachys sylvatica Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 210000004889 cervical nerve Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 206010061978 Genital lesion Diseases 0.000 description 1
- 241000700321 Herpes simplex virus (type 1 / strain SC16) Species 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 101150027427 ICP4 gene Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101800003344 Vaccinia growth factor Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000025698 brain inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 101150036031 gD gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000006656 viral protein synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16661—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
110438
Menetelmä mutanttiherpesviruksen valmistamiseksi Tämä hakemus koskee virusrokotteita. Erityisesti se koskee yhdistelmä-DNA-mutanttiviruksia käytettäväksi rokotteina; rokotteita, jotka sisältävät mutanttiviruk-5 siä; yhdistelmä-DNA-tekniikalla käsiteltyä solua; ja menetelmiä, jotka liittyvät rokotteiden tuottamiseen.
Virusrokotteita on perinteisesti kahta tyyppiä. Ensimmäistä tyyppiä ovat "tapetut" rokotteet, jotka ovat virusvalmisteita, jotka on tapettu käsittelemällä sopivalla kemikaalilla kuten β-propiolaktonilla. Toista tyyppiä ovat elävät "heikennetyt" rokotit) teet, jotka ovat viruksia, jotka on tehty isännälle vähemmän patogeenisiksi joko erityisellä virusgenomin DNA:n käsittelyllä, tai tavallisemmin kasvattamalla sukupolvien ajan (passage) tietyn tyyppisessä kudosviljelyjärjestelmässä. Näillä kahdella rokotetyypillä on kummallakin omat haittansa. Koska tapetut rokotteet eivät repli-koidu isännässä, ne on annettava injektiolla, ja siten ne voivat aiheuttaa sopimaton-15 ta immuunivastetyyppiä. Esimerkiksi Salk-rokote, tapettu poliovirusvalmiste, tuottaa immunoglobuliini (g) G-vasta-ainevastetta, muttei stimuloi IgA:ta suolessa, joka on primäärisen infektion luonnollinen paikka. Siten vaikka tämä rokote voi suojata yksilöt polymyeliitin neurologisilta komplikaatioilta, se ei estä primääristä in-: fektiota, eikä näin ollen anna "laumaimmuunisuutta". Lisäksi tapetut virukset eivät : ‘ : 20 mene isäntäsolujen sisälle ja replikoidu siellä. Siten ei ole saatavissa mitään edullis-"·; ta immuunivastetta ei-rakenteellisille proteiineille, joita muodostuu replikaation ai- kana. Ne eivät voi stimuloida virusantigeenejä vastaan suunnattujen sytotoksisten T-solujen tuotantoa. Antigeeniä edustavat solut voivat poimia "kuolleita" antigee-nejä ja esitellä T-soluille. Esittäminen tapahtuu kuitenkin MHC luokka II- * * * * 25 molekyylien kautta ja johtaa T-auttajasolujen stimulointiin. T-auttajasolut auttavat puolestaan B-soluja tuottamaan spesifistä vasta-ainetta antigeeniä vastaan. Sytotok-'· '*· sisten T-solujen muodostumisen stimuloimiseksi virusantigeenit on käsiteltävä eri- tyisen reitin kautta infektoitujen solujen sisällä, ja esiteltävä hajotettuina peptidi-·. f; fragmentteina MHC luokka I-molekyyleille. Tämän hajotusreitin ajatellaan toimi-.•••.30 van tehokkaimmin proteiineille, jotka syntetisoituvat infektoidun solun sisällä, ja siten vain virus, joka tulee isäntäsolujen sisälle ja ekspressoi immunogeenistä vi- • · * ' ·' rusproteiinia, voi muodostaa virusspesifisiä sytotoksisia T-soluja. Sen vuoksi tape- ’·.' ’: tut rokotteet ovat huonoja visinfektion vastaisen soluimmuniteetin indusoijia. Tältä kannalta elävät heikennetyt rokotteet ovat tyydyttävämpiä.
2 110438 Tähän mennessä eläviä heikennettyjä viruksia on tehty tuhoamalla ei-välttämätön geeni tai vaurioittamalla osaksi yhtä tai useaa välttämätöntä geeniä (missä tapauksessa vaurio on sellainen, että geenit ovat edelleen toimintakykyisiä, mutteivät toimi niin tehokkaasti). Elävillä heikennetyillä viruksilla on kuitenkin usein jäännös-5 patogeenisyyttä, jolla voi olla haitallista vaikutusta isännälle. Lisäksi, ellei heikentämistä aiheuteta spesifisellä deleetiolla, on edelleen olemassa mahdollisuus palautumiselle tarttuvampaan muotoon. Siitä huolimatta se tosiseikka, että jotain virus-proteiinin tuotantoa tapahtuu isännässä, tarkoittaa että ne ovat usein tehokkaampia kuin tapetut rokotteet, jotka eivät voi tuottaa tällaista virusproteiinia.
10 Samoin kuin eläviä heikennettyjä viruksia voidaan käyttää rokotteina sinänsä, niitä voidaan myös käyttää "rokotevektoreina" muille geeneille, ts. toisesta viruksesta (tai toisesta patogeenistä) olevien geenien kantajina, joita geenejä vastaan suojaa vaaditaan. Tyypillisesti rokotevektoreina käytetään rokkovirusperheen jäseniä, esimerkiksi vacciniavirusta. Kun virusta käytetään rokotevektorina on tärkeää, ettei 15 se aikaansaa patogeenisiä vaikutuksia. Ts. se voi tarvita heikentämistä samaan tapaan kuin yksinkertaista virusrokotetta heikennetään. Sen vuoksi tässä tapauksessa pätevät samat edellä kuvatut haitat.
On keksitty mahdolliseksi tuhota geeni virusgenomista ja aikaansaada niin kutsuttu "komplementoiva" solu, joka antaa virukselle käyttöön tuhotun geenin tuotteen.
• · I... 20 Tämä on saavutettu määrätyille viruksille, esimerkiksi adenoviruksille, herpesvi- ruksille ja retro viruksille. Adenoviruksia varten humaanisolulinja transformoitiin adenovirustyypin 5 DNA-fragmenteilla (Graham, Smiley, Russell & Naim, J. Gen.
'· ‘ Virol. 36 (1977) 59-72). Solulinja ekspressoi määrättyjä virusgeenejä, ja sen havait- , · · . tiin voivan ylläpitää kasvua virusmutanteilla, joilta nuo geenit oli tuhottu tai inakti- » · · v : 25 voitu (Harrison, Graham & Williams, Virology 77 (1977) 319-329). Vaikka visru kasvoi hyvin tällä solulinjalla ("komplementoivalla solulinjalla") ja tuotti tavallisia viruspartikkeleita, se ei voinut kasvaa lainkaan normaaleilla ihmissoluilla. Solut, jotka ekspressoivät SV40-viruksen (papovavirus) genomin T-antigeeniä kooditta-, \ vaa aluetta, on myös osoitettu voivan ylläpitää replikaatiota viruksilla, joilta on 30 spesifisesti tuhottu tämä alue (Gluzman, Cell 23 (1981) 182-195). Herpes simplex- , » viruksella on tuotettu solulinjat, jotka ekspressöivät gB-glykoproteiinia (Cai et ai., J. Virol. 62 (1987) 714-721), gD-glykoproteiinia (Ligas ja Johnson, J. Virol. 62 f·.· (1988) 1486) ja "Immediate Early"-proteiinia ICP4 (Deluca et ai., J. Virol. 56 (1986) 558), ja näiden on osoitettu ylläpitävän replikaatiota viruksilla, joissa on 35 spesifisesti inaktivoituja kopioita vastaavista geeneistä.
3 110438 Tämä keksintö aikaansaa valmistusmenetelmän mutanttivirukselle, jossa on tuhottu tai inaktivoitu viruksen geeni, joka koodittaa proteiinia, joka on välttämätön infek-toivan viruksen tuotannolle; ja jolloin mainittua virusta voidaan kasvattaa solussa, jolla on heterologinen nukleotidisekvenssi, joka sallii mainitun solun ekspressöidä 5 mainitun tuhotun tai inaktivoidun virusgeenin koodittamaa proteiinia.
Tämän keksinnän menetelmällä voidaan aikaansaada myös rokote, joka käsittää edellä kuvatua virusta yhdessä yhden tai usean täyteaineen ja/tai adjuvantin kanssa. Virusgenomi voi itse aikaansaada immunogeenin, tai se voi sisältää heterologisen geeni-inertion, joka ekspressöi immunogeenistä proteiinia.
10 Hakemuksessa kuvataan myös komplementoitua solua, joka on transfektoitu edellä kuvatulla heikennetyllä viruksella, käytettäväksi rokotteen tuotannossa.
Hakemuksessa kuvataan myös menetelmä, joka käsittää edellä kuvatun viruksen käytön valmistettaessa rokotetta käytettäväksi sairauden hoidossa tai ennaltaestos-sa.
15 Tämä keksintö aikaansaa siis menetelmän rokotteen tuottamiseksi, jossa menetelmässä: kasvatetaan solua, joka on infektoitu viruksella, jolla on tuhottu tai inaktivoitu geeni, joka koodittaa proteiinia, joka on välttämätön infektoivan viruksen tuo-‘ Γ: tarmolle, ja jolloin isäntäsolussa on heterologinen nukleotidisekvenssi, joka koodit- • “: taa mainittua virusgeeniä ja voi ekspressöidä mainitun geenin koodittamaa vält- • * * • .·. 20 tämätöntä geeniä; kerätään näin muodostunut virus, ja käytetään sitä rokotteessa.
'· ’ Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
.·*.*. Virus voi olla peräisin herpes simplex -viruksesta (HSV), jossa on inaktivoitu tai tuhottu esimerkiksi glykoproteiinia H (gH) koodittava geeni. Mutanttivirus voi • t : myös sisältää heterologisen sekvenssin, joka koodittaa immunogeeniä, joka on pe- ’..,’25 räisin patogeenistä. Isäntäsolu on sopivasti eukarioottista yhdistelmä-DNA-solulinjaa, joka sisältää geenin, joka koodittaa HSV-glykoproteiinia H. Toisena :/· I esimerkkinä virus voi olla peräisin ortopox-viruksesta, esimerkiksi vaccinia-: viruksesta, joka vuorostaan voi sisältää heterologisen sekvenssin, joka koodittaa pa- ..' ·, togeenistä peräisin olevaa immunogeeniä.
:,‘3p Tässä keksinnössä esitetään ainutlaatuinen tapa yhdistää tapetun rokotteen tehokkuus ja turvallisuus ylimääräisen immunologisen vasteen kanssa, joka indusoidaan heikennetyn rokotteen in vivo suorittamalla virusproteiinin tuotannolla. Edullisissa suoritusmuodoissa se käsittää kaksi ominaispiirrettä. Ensiksi, valittu geeni inakti- 4 110438 voidaan virusgenomin sisällä, tavallisesti luomalla spesifisen deleetion. Tämä geeni on osallisena infektoivan viruksen tuotannossa, mutta edullisesti se ei estä virusgenomin replikaatiota. Siten infektoitu solu voi tuottaa enemmän virusproteiinia replikoidusta geneettisestä materiaalista, ja joissain tapauksissa voi muodostua uu-5 siä viruspartikkeita, mutta nämä eivät olisi infektoivia. Tämä tarkoittaa, että virusinfektio ei voi levitä siirrostuskohdasta.
Keksinnön toinen ominaispiirre on solu, joka voi varustaa viruksen tuhotun geenin tuotteella, tehden siten viruksen kasvun mahdolliseksi kudosviljelmässä. Siten, vaikka viruksesta puuttuu välttämätöntä proteiinia koodittava geeni, se lisääntyy ja 10 tuottaa sopivassa isäntäsolussa kasvatettaessa täydellisiä viruspartikkeleita, joita ei ulkoisilta ilmiasuiltaan voida erottaa alkuperäisestä viruksesta. Tämä mutanttivi-rusvalmiste on siinä mielessä inaktiivista, että sillä on vajavainen genomi eikä voi tuottaa infektoivaa virusta normaalissa isännässä, ja niin sitä voidaan turvallisesti antaa määrä, joka vaaditaan muodostamaan suoraan humoraalisen vasteen isännäs-15 sä. Siten mutanttiviruksen ei tarvitse olla infektoiva suojattavan isännän soluille ja vain toimii paljolti samalla tavalla kuin tavanomainen tapettu tai heikennetty visru-rokote. Edullisesti immunisoiva virus on kuitenkin itse edelleen infektoiva, siinä mielessä, että se voi sitoutua soluun, mennä sen sisälle ja aloittaa viruksen replikaa-tiosyklin ja voi sen vuoksi aloittaa infektion suojattavaa lajia edustavan isäntäsolun T: 20 sisällä, ja tuottamaan sen sisällä jotain virusantigeeniä. Siten on olemassa lisämah-' ”; dollisuus stimuloida isännän immuunijärjestelmän soluvartta.
I * ·
Tuhottu tai inaktivoitu geeni on edullisesti sellainen, joka osallistuu virussykliin , » I · : * mahdollisimman myöhään aikaansaaden in vivo mahdollisimman paljon • · · ; V* virusproteiineja immunogeenisen vasteen muodostamiseksi. Geeni voi olla · 25 esimerkiksi geeni, joka on osallisena pakkauksessa tai jossain muussa replikaation jälkeisessä tapahtumassa, kuten HSV:n gH-glykoproteiini. Valittu geeni voi kuitenkin liittyä virusgenomireplikaatioon, ja in vivo ekspressoityjen proteiinien alue riippuu riippuu vaiheesta, jolla geeni normaalisti ekspressoityy. Ihmisen sytomegaloviruksen (HCMV) tapauksessa valittu geeni voi olla sellainen (muu : - *30 kuin "Immediate Early"-geeni), joka estää virusgenomin replikaation tehokkaasti in t ♦ vivo, koska "Immediate Early"-geeni, joka muodostuu ennen virusgenomin ·’ ·’: replikaatiota (ja on itse asiassa sille välttämätön) on erittäin immunogeeninen.
' · ’J Tätä keksintöä voidaan soveltaa mille hyvänsä virukselle, jossa voidaan tunnistaa yksi tai useita välttämättömistä geeneistä ja tuhota virusgenomista tai inaktivoida 35 sen sisällä. DNA-viruksilla, kuten adeno-, herpes-, papova- papillooma- ja parvovi- 5 110438 ruksilla tämä voidaan saavuttaa suoraan (i) valitun välttämättömän geenin kloonattujen DNA-kopioiden käsittelyllä in vitro spesifisten DNA-muutosten luomiseksi; ja (ii) johdetaan muutettu versio takaisin virusgenomiin vakiorekombinaatio- ja markkeripelastusmenettelytavoilla. Keksintö on kuitenkin sovellettavissa myös 5 RNA-viruksille. Nykyisin on käytettävissä tekniikkoja, jotka sallivat RNA-virusge-nomin komplementaaristen DNA-kopioiden käsittelemisen in vitro vakiogeenitek-niikoilla, ja sitten muuttamisen RNA:ksi transkriptiolla in vitro. Tulokseksi saadut RNA:t voidaan sitten johtaa takaisin virusgenomiin. Tekniikkaa on käytetty spesifisten muutosten aikaansaamiseksi sekä positiivisen että negatiivisen säikeen RNA-10 virusten, esimerkiksi polioviruksen (Racaniello ja Baltimore, Science 214 (1981) 916-919) ja influenssaviruksen (Lutyes et ai., Cell 59 (1989) 1107-1113) genomis-sa.
Teoriassa mikä hyvänsä geeni, joka koodittaa välttämätöntä proteiinia, olisi mahdollinen kohde tässä lähestymistavassa heikennettyjen virusten luomiseksi. Käy-15 tännössä useat seikat ohjaavat kuitenkin geenin valintaa.
1. Geenin pitäisi olla sellainen, jota vaaditaan myöhemmin infektiossa. Siten heikennetyn viruksen replikaatio ei keskeydy varhaisessa vaiheessa. Tämä tarkoittaa, että useimpia ja mahdollisesti kaikkia muita virusantigeenejä tuotetaan infektoidus- ;·. sa solussa, ja esitellään isännän immuunijärjestelmään isäntäsolun MHC luokka 1 :n ... 20 molekyylien yhteyteen. Tällainen esittely johtaa solun immuniteetin kehittymisen virusinfektiota vastaan sytotoksisten T-solujen tuotannon kautta. Sytotoksiset T-solut voivat tunnistaa nämä antigeenit, ja sen vuoksi tappaa viruksen infektoimia , * 4 t ) • ' soluja. On mahdollista, että tuhottu geeni voisi olla sellainen, jota ei vaadita lain- ; .' kaan viruksen kokoonpanoon, mutta joka on välttämätön, jotta kokoonpantu virus v * 25 voisi infektoida uusia soluja. Eräs esimerkki tällaisesta proteiinista on HSV-gH- proteiini. Tämän proteiinin läsnä ollessa muodostuu edelleen HSV-virioneja, mutta ne eivät ole infektoivia.
• · « » * ·*.’ 2. Ihanteellisesti valitun geenin tuote ei saisi, sinänsä, olla toksinen eukarioot- ·,· · tisolulle niin, että komplementoiva solu voi muodostua suhteellisen helposti. Tämä •. ‘ SO ei kuitenkaan ole ehdoton vaatimus, koska geeni voidaan sijoittaa komple- . Λ, mentoivassa solussa indusoitavan promoottorin kontrollin alle siten, että sen eks- » * \ pressio voidaan pistää päälle vaadittaessa.
« « * # *
Kohdegeenissä luodun mutaation luonne on myös valittavissa. Tyydyttävä on mikä hyvänsä muutos, joka tuottaa ei-funktionaalisen geenituotteen, mikäli vaara villi-35 tyypin rakenteeksi muuttumiselle on minimoitu. Tällaisia muutoksia ovat kohteena 6 110438 olevien vieraiden sekvenssien keskeyttäminen ja spesifisten deleetioiden muodostaminen. Tyydyttävin strategia terapeuttisena ja/tai ennaltaestävänä aineena käytettävälle rokotteelle olisi kuitenkin sellainen, jossa tehdään deleetio, joka ottaa huomioon komplementoivaan soluun johdettavan koko sekvenssin. Tämä lähestymis-5 tapa minimoi villityyppiviruksen uudelleenmuodostumisen vaaran virus- ja solu-DNA:n välisen rekombinaation kautta komplementoivassa solussa.
Vaikka on olemassa useita esimerkkejä spesifisesti inaktivoitujen virusten ja komp-lementoivien solujen yhdistelmistä (katso edellä olevaa esitystä), niitä on tähän asti käytetty joko viruksella suoritettavaan perustutkimukseen, tai retroviruksen tapauk-10 sessa turvallisemman vektorin tekemiseksi transgeenisten eläinten tuottamiseksi. Niitä ei ole käytetty rokotetarkoituksiin, eikä keksinnön hakijoiden tiedon mukaan tällaista käyttöä ole ehdotettu.
Samoin kuin keksintö koskee tällaisen inaktivoitu virus/komplementoiva solu-yhdistelmän käyttöä turvallisten rokotteiden tuottamiseksi villityyppivirusta vas-15 taan, se koskee myös saman järjestelmän käyttöä turvallisten virusvektoreiden tuottamiseksi käytettäväksi rokotteina vieraita patogeenejä vastaan.
Eräs esimerkki tällaisesta vektorista perustuu HSV:hen. HSV-genomi on riittävän suuri sisältämään huomattavasti geneettistä lisäinformaatiota, ja on kuvattu useita esimerkkejä yhdistelmä-DNA-HSV-viruksista, jotka sisältävät ja ekspressoivät vie-*:*. 20 rasta geenimateriaalia (esimerkiksi Ligas ja Johnson, J. Virol. 1988, mainittu edel-,···. lä). Siten virusta, jossa on deleetio edellä kuvatussa välttämättömässä virusgeenis-
I I
.! sä, ja joka myös sisältää ja ekspressoi määriteltyä vierasta geeniä, voitaisiin myös käyttää turvallisena vektorina muodostamaan immuunivastetta vierasta proteiinia • ’ vastaan.
• · · • · :25 Eräs HSV.n erityinen ominaispiirre on, että se voi muuttua infektoitujen yksilöiden hermosoluissa latentiksi, ja aktivoitua silloin tällöin uudelleen johtaen paikalliseen : vaurioon. Siten HSV:tä, jossa on deleetio välttämättömässä virusgeenissä ja joka ···’ ekspressoi vierasta geeniä, voitaisiin käyttää tuottamaan käsitellyssä yksilössä hermosolujen tarkoituksellisesti latentin infektion. Tällaisen latentin infektion uudel-:.! *30 leenaktivointi ei johtaisi vamman tuottamiseen, koska virusvektori olisi kykenemä-tön replikoituinaan täysin, vaan siitä olisi tuloksena viruksen replikoitumissyklin alkuosan alkaminen. Sen aikana voisi tapahtua vieraan antigeenin ekspressiota joh-’. ': taen immuunivasteen kehittymiseen. Tilanteessa, jossa tuhottu HSV-geeni määritte- * * li proteiinin, jota ei tarvita viruksen kokoonpanoon, vaan ainoastaan kokoonpantu- 35 jen virioneiden infektoivuuteen, tällainen vieras antigeeni voitaisiin sisällyttää ko- 7 110438 koonpantuihin viruspartikkeleihin, mikä johtaisi sen immunogeenisen vaikutuksen kasvuun. Tämä vieraan geenin ekspressio ja sen proteiinin sisällyttäminen viruspar-tikkeliin voisi tietysti tapahtua myös vaiheessa, jossa mutanttivirus ensin muodostuu komplementoivassa isännässään, missä tapauksessa mutanttivirus voisi rokot-5 teenä käytettäessä esitellä vieraan proteiinin hoidettavalle lajille välittömästi.
Eräässä toisessa esimerkissä vacciniavirus, rokkovirus, voi sisältää ja ekspressoida eri patogeeneistä olevia geenejä, ja on osoitettu, että nämä muodostavat tehokkaita rokotteita eläinkoejärjestelmissä käytettäessä. Mahdollisuudet ihmisissä käytettäväksi ovat runsaat, mutta johtuen tunnetuista sivuvaikutuksista, jotka liittyvät vac-10 cinian käyttöön rokotteena isorokkoa vastaan, esiintyy vastahakoisuutta modifioi-mattoman vacciniaviruksen käytölle laajassa mittakaavassa ihmisissä. On yritetty heikentää vacciniavirusta tuhoamalla ei-välttämättömiä geenejä kuten vaccinian kasvutekijägeeni (Buller, Chakrabarti, Cooper, Twardzik & Moss, J. Virology 62 (1988) 866-874). Tällaiset heikennetyt virukset voivat kuitenkin edelleen replikoi-15 tua in vivo, vaikkakin alentuneella tasolla. Vielä ei ole tuotettu vacciniavirusta, jossa on deleetio välttämättömässä geenissä, mutta tällainen virus, josta on tuhottu edellä kuvattu välttämätön geeni, komplementoivan solunsa kanssa kasvua varten, antaisi käyttöön turvallisemman version tästä rokotevektorista.
Edelleen eräs etu tällä yleisellä strategialla heterologisia proteiineja vastaan im-20 munisoimiseksi on, että voi olla mahdollista suorittaa useita tehokkaita rokotuksia • · · .· : samalla virusvektorilla tavalla, joka ei ole mahdollinen tavanomaisilla elävillä vi- : : rusvektoreilla. Koska tavallinen elävä virusrokote luultavasti perustuu sen tehok- kuuteen replikoitua isäntäeläimessä useiden infektio syklien ajan, sen käyttökel- » ....: poisuus vähenee vakavalla tavalla yksilössä, jolla on immuniteettia tätä virusta vas- :\\25 taan. Siten toinen altistus samalla viruksella, olipa se sitten tehostusimmunisoinnin aikaansaamiseksi samaa proteiinia vastaan, tai aikaansaamaan uutta vastetta eri • » » proteiinia vastaan, on luultavasti tehoton. Käytettäessä virusvektoria, jossa on deleetio välttämättömässä geenissä, jolloin usean syklin replikaatio ei ole toivottavaa *; ‘: tai tarpeellista, immunisointiin johtavat tapahtumat tapahtuvat kuitenkin hyvin pian ...*30 immunisoinnin jälkeen. Mutanttiviruksen annos voi olla suhteellisen suuri (koska • :': se lienee täysin turvallista), ja sen vuoksi on epätodennäköistä, että jonkin aikaa • · » · .···. täydelliseen liikekannallepanoon vaativa isännän immuunijärjestelmä estää nämä varhaiset tapahtumat.
Vaikka olemme edellä viitanneet mutanttivirukseen, jolta puuttuu välttämätön gee-35 ni, ja joka mahdollisesti sisältää immunogeenisen patogeeniproteiinin geenin, mu- g 110438 tantista voisi puuttua useampia kuin yksi välttämätön geeni ja/tai se voisi sisältää useampia kuin yhden immunogeenisen patogeeniproteiinin geenin. Siten mutantti-virus voisi sisältää geenin HIV gp 120:tä varten, toimimaan edellä ehdotetulla tavalla rokotteena, ja myös geenin HIV-gag-proteiinia varten ekspressöityäkseen ro-5 kotetun isännän sisällä ja tullakseen esitellyksi isäntäsolun pinnalla MHC-I:n yhteyteen T-soluvasteen stimuloimiseksi isännässä.
Jotta keksintö ymmärrettäisiin selvemmin, sitä kuvataan edelleen pelkästään esimerkinomaisesti, eikä rajoittavasti, viitaten seuraaviin kuvioihin, joissa: kuviossa 1 esitetään plasmidin pGHl tuottaminen; 10 kuviossa 2 esitetään plasmidin pGH2 tuottaminen; kuviossa 3a esitetään plasmidin pSP64Ta luomiseen käytetty komplementaaristen oligonukleotidien pari; kuviossa 3b esitetään kuvataan plasmidin pSP64TA tuottaminen; kuviossa 4a esitetään plasmidin pCMVIEP luomiseen käytetyt kaksi oligonukleo-15 tidia; kuviossa 4b esitetään plasmidi pCMVIEP; kuviossa 5 esitetään plasmidi pCMVlacZ; ja kuviossa 6 esitetään plasmidi pGH3.
kuviossa 7 kuvataan toimintasuunnitelma plasmidin pGH-120 konstruoimiseksi.
·;·. 20 Herpes simplex -virus, josta on tuhottu glykoproteiini H (gH-HSV)
Ml '···* Herpes simplex -virus (HSV) on suurikokoinen DNA-virus, joka aiheuttaa ihmises-• *.* sä suuren joukon patogeenisiä oireita, mukaan lukien yhä uudelleen esiintyvät kas-vo- ja sukuelinvauriot, ja harvinaisen vaikkakin usein kohtalokkaan aivotuleh-: * : duksen. Infektiota tällä viruksella voidaan kontrolloida jonkin verran kemoterapial- : 25 la käyttäen asikloviirilääkettä, mutta tähän mennessä ei ole ollut primäärisen infektion estämiseen tarkoitettua rokotetta. Vaikeus rokotuksessa HSV.tä vastaan on, et-: tä yleensä virus leviää kehoon suoralla siirtymisellä solusta soluun. Siten humoraa- . · · ·, lisen immuunisuuden tehokkuus on epätodennäköistä, koska verenkierrossa oleva vasta-aine voi neutraloida vain solunulkoista virusta. Tärkeämpää virusinfektion :30 kontrollille on solun immuunisuus, ja siten rokote, joka voi muodostaa sekä humo-raalista että solun immuniteettia, mutta joka on myös turvallinen, olisi huomattava etu.
*. : Sopiva inaktivoinnin kohdegeeni HSV-genomin sisällä on glykoproteiini H-geeni (gH). gH-proteiini on glykoproteiini, joka on läsnä viruskuoren pinnalla. Tämän 9 110438 proteiinin ajatellaan olevan osallisena membraanin fuusiotapahtumassa viruksen joutuessa infektoidun solun sisälle. Tämä johtuu siitä, että lämpötilaherkkiä viruksia, joilla on vaurio tässä geenissä, ei erity ei-sallivassa lämpötilassa viruksen infektoimista soluista (Desai et ai., J. Gen. Virol. 69 (1988) 1147-1156). Proteiini eks-5 pressöityy infektion myöhäisessä vaiheessa, ja niin sen puuttuessa voi yhä tapahtua huomattavasti virusproteiinin synteesiä.
Kaikki yhdistelmä-DNA-menettelytavat suoritetaan vakiomenetelmillä, jotka kuvataan käsikirjassa "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, toimittajat Sam-brook, Fritsch ja Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
10 A. HSV-gH-geeniä ekspressoivan solulinjan luominen gH-geeni on läsnä HSV tyyppi 1-genomin ainutlaatuisella pitkällä alueella (Unique Long region) (UL), nukleotidien 46382 ja 43868 välillä (McGeoch et ai., J. Gen. Virol. 69 (1988) 1531-1574). Tämän geenin kloonattua kopiota on saatavissa plas-midin pAF2 sisällä. Tämä plasmidi tuotettiin leikkaamalla plasmidista pTZgH 15 Bglll/Xhol -fragmentin, joka sisältää täydellisen hG-koodisekvenssin, ja kloonaamalla sen kuvatulla tavalla plasmidin pSP64T BgHI-kohtaan (Gompels ja Minson, J. Virol. 63 (1989) 4744-4755). Hindlll-fragmentti, joka sisältää promoottorise-kvenssin glykoproteiini D (gD)-geeniä varten (ulottuen nukleotidista -392 nukleotidiin +11, suhteessa dG-geenin alkuun) katkaistaan sitten plasmidista pSVD4 ·:·. 20 (Everett, Nucl. Acids Res. 11 (1983) 6647-6667), ja kloonataan pAF2:n ainutlaa- .···. toiseen Hindlll-kohtaan pGHl:n luomiseksi (kuvio 1) siten, että promoottori on oi-• · .E! keassa suunnassa gH-geenin ekspression ajamiseksi. Siten tämä plasmidi sisältää täydellisen hG-koodisekvenssin HSV tyyppi 1 gD-geenipromoottorin kontrollin al-; la. Sitten tämä plasmidi puhdistetaan ja transfektoidaan yhdessä Vero-soluihin : -'25 pNEO-plasmidin (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) kanssa käyttämällä vakio v : kalsiumfosfaatti-yhdessäsaostostekniikkaa (Graham ja Van der Eb, Virology 52 (1973) 456-467). Sitten valitaan Vero-solut, jotka ovat saavuttaneet resistenssin meomysiiniä vastaan kasvattamalla soluja sukupolven ajan (passage) lääkkeessä ': G418, ja näiden solujen kolonioita kloonataan rajoittavalla laimennoksella. Sitten . ‘. 30 nämä neomysiiniresistentit solut monistetaan kudosviljelmässä, ja sitten näytteitä infektoidaan HSV tyyppi 2-viruksella. Infektiosta HSV tyyppi 2-viruksella on vai-' · ·/ ‘ kutoksena transkription indusointi tyypin 1 gD-promoottorista, joka on läsnä komp-lementoivassa solugenomissa, ja siten tyyppi 1 gH-proteiinin tuotannon stimuloi-minen komplementoivassa solussa. Infektoitojen solujen liuotostootteet seulotaan 35 gH-proteiinin ekspression suhteen "Western blot"-menetelmällä käyttäen polyklo- 10 110438 naalista antiseerumia, jonka tiedetään tunnistavan spesifisesti tyypin 1 gH-pro-teiinin (Desai et ai., 1988 mainittu edellä). Sitten solut, jotka ekspressoivat vaadittua proteiinia, ja sitten valmistetaan säilytetyt ja pakastetut kantaliuokset. Tämä materiaali edustaa gH+-komplementoivaa solulinjaa.
5 B. Katkaistun gH-geenin sisältävän HSV tyyppi 1-viruksen tuottaminen
Plasmidista pUG102 (Gompels ja Minson, Virology 153 (1986) 230-247) katkaistaan p6432 emäsparin BgHI-fragmentti, joka sisälsi gH:n koodisekvenssin reunustavien HSV-sekvenssien kanssa ja kloonataan plasmidiin pAT153 (Twigg ja Sher-rat, Nature 283 (1980) 216) pGH2:n luomiseksi (kuvio 2). Tämä plasmidi sulate-10 taan PvuITlla, joka katkaisee vain gH-koodisekvenssin sisällä kahdessa asemassa (nukleotidit 44955 ja 46065 numerointijärjestelmän mukaan, jonka on kehittänyt McGeoch et ai., 1988, mainittu edellä), ja puhdistetaan näistä kahdesta fragmentista suurempi. Sitten valmistetaan seuraavalla menettelytavalla DNA-fragmentti, joka koostuu täydellisestä B-galaktosidaasigeenistä E. colista alavirtaan cytomegalovi-15 ruksen (CMV) välittömästä varhaisesta geenipromoottorista. Ennen kaikkea emäs-pariutetaan komplementaaristen oligonukleotidien pari (esitetään kuviossa 3a) ja liitetään BgIII:lla sulatetun, fosfataasilla käsitellyn pSP64T:n kanssa (Krieg ja Melton, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 7057-7071) plasmidin pSP64Ta muodostamiseksi, kuten kuviossa 3b esitetään. Lisätty linkkeri sisältää myös E. colin B-galaktosi-20 daasigeenin (IacZ) aloituskodonin ja ensimmäiset kolme kodonia. Seuraavaksi mo-,* : nistetaan CMV:n välittömän varhaisen geenipromoottorin "ydinalue" plasmidista pUG-Hl (Gompels ja Minson, 1989, mainittu edellä) polymeraasiketjureaktiotek-nilkalla (PCR-Molecular Cloning, toimittaja Sambrook et ai., mainittu edellä) käyt-tämällä kuviossa 4a esitettyä kahta oligonukleotidia, jotka vastaavat sekvenssejä 25 -302 - -288, ja -13 ja -36, vastaavasti (numeroitu suhteessa CMV välittömän aikai- ’. t sen geenin alkuun tavalla, joka on kuvattu julkaisussa Akrigg et ai, Virus Research 2 (1985) 107-121). Nämä oligonukleotidit sisältävät 5'-päissään myös Hindlll-rest-riktioentsyymikohdat, ja promoottorista ylävirtaan emäspariutuvan oligonukleoti-din tapauksessa lisä-Smal-kohdan. Sitten PCR-amplifioitu tuote-DNA sulatetaan ...:30 HindllLlla ja kloonataan Hindlll-sulatettuun pSP64Ta:han plasmidin pCMVIEP:n ; luomiseksi (kuvio 4b). Lopuksi DNA-fragmentti, joka sisältää täydellisen kopion • · · · .**·. E. colin B-galaktosidaasigeenistä, josta puuttuu vain koodisekvenssin äärimmäinen 5'-pää, eristetään sulattamalla plasmidin pSC8 (Chakrabarti et ai., Mol. Cell. Biol. 5 : ·’ (1985) 3403-3409) BamHLllä, ja kloonattiin pCMVIEP:n ainutlaatuiseen BgHI- :. ‘i35 kohtaan pCMVlacZ:n muodostamiseksi (kuvio 5). Sitten eristetään DNA-frag mentti, joka sisältää B-galaktosidaasigeenin CMV IE-promoottorin kontrollin alai- π 110438 sena, sulattamalla pCMVlacZm SmaLllä, ja liitettiin edellä kuvatun pGH2:n PvuII-fragmentin kanssa pGH3:n muodostamiseksi, joka koostuu gH-geenin kopiosta, jonka keskeyttää funktionaalinen B-galaktosidaasigeeni (kuvio 6). Seuraava vaihe on villityyppi-gH-geenin korvaaminen HSV-genomissa tällä keskeytetyllä ver-5 siolla, ja tämä tehdään sallimalla HSV-DNA:n ja plasmidi pGH3:n välisen rekom-binaation, minkä jälkeen valitaan ne virukset, jotka ovat saaneet funktionaalisen B-galaktosidaasigeenin. Sen vuoksi plasmidi pGH3-DNA ko-transfektoidaan gH-gee-niä ekspressoiviin soluihin (kappaleessa A kuvattu gH+ komplementoiva solulinja) yhdessä puhdistetun HSV-DNA:n kanssa, joka on eristetty puhdistetuista HSV-vi-10 rioneista (Killington ja Powell, teoksessa "Techniques in Virology: A practical Approach" (toimittaja B.W.J. Mahy) s. 207-236, IRL Press, Oxford (1985)) vakiokal-siumfosfaattisaostustekniikalla (Graham ja Van der Eb, 1973, mainittu edellä). Sitten tästä transfektiokokeesta muodostunut jälkeläis-HSV-virus siirrostetaan vakio-täplänmuodostusmäärityksellä komplementoivien gH+-solujen yksisolukerroksille, 15 käyttäen agar-päällystä, kun läsnä on 5-bromi-kloori-3-indolyyli-B-D-galaktosidia (X-gal), kromogeenista substraattia, jonka β-galaktosidaasientsyymi muuttaa siniseksi. Siten täplät, jotka ovat tuloksena infektiosta β-galaktosidaasia sisältävistä ja ekspressoivista virusgenomeista, näyttävät sinisiltä. Sen vuoksi näiden virus-genomien sisältää keskeytetty versio gH-geenistä. Virusta otetaan talteen näistä 20 täplistä poimimalla agarpalasia levyn sopivasta paikasta, ja valmistamalla viljelmiä kasvattamalla virusta komplementoivassa gH+-solulinjassa. Koska nämä virukset ;·. sisältävät gH-geenin ei-funktionaalisia versioita, niiden pitäisi olla kykenemättömiä .···. muodostamaan täpliä soluilla, jotka eivät sisällä ja ekspressoi gH-geenin endo- .!'! geenistä funktionaalista kopiota, ja niin tämän varmistamiseksi virusnäytteellä tut- ’. 25 kitaan sen kyky muodostaa täpliä villityyppi-Vero-soluyksikerroksilla verrattuna ; / gH-komplementoiva soluun. Lopuksi näistä kannoista valmistetaan virus-DNA:ta : ·' ja tarkistetaan odotetun DNA-rakenteen suhteen gH-geenin ympärillä "Southern :: : blotting"-menetelmällä. Oikean geneettisen rakenteen varmistamisen jälkeen val mistetaan sitten suuri varasto puutteellisen gH-geenin sisältävää virusta siirrosta-: ‘ * 30 maila virusnäytteen gH+-komplementoiva solulinjan suurimittakaavaiseen viljel-mään (infektion multiplisiteetti = 0,01), ja kerätään solut kolme päivää myöhem-. \ min. Infektoidut solut rikotaan sonikoimalla soluun liittyvän viruksen vapauttami- seksi, ja koko sonikoitua seosta varastoidaan -70 °C:ssa viruksen pääkantaliuokse-’··.·* na. Sitten määritetään viruskantaliuoksen tiitteri täplämäärityksellä gH+-komp- : · 35 lementoiva solulinjalla. Sitten tämän viruskantaliuoksen näytteitä käytetään työli- uosten valmistamiseksi kuten edellä, ja sitten näitä työliuoksia käytetään laborato-rioeläinten infektoimiseen alla kuvatulla tavalla.
12 110438 C. Tutkimuksia gH'-HSV:n suojaavasta vaikutuksesta lämmöllä tapettuun virukseen verrattuna
Isännän immunologisen vasteen määrittämiseksi tätä virusta kohtaan suoritettiin hiirillä altistuskokeita alla kuvatun koesuunnitelman mukaisesti.
5 Elävän gH'-virusvalmisteen suojaustehoa verrattiin villityypin (WT) viruksen (kanta SC16) inaktivoituun valmisteeseen seuraavalla tavalla.
Inaktivoidun villityyppiviruksen valmistus rokotusta varten HSV-tyyppiä 1 (kanta SC16) kasvatettiin Vero-solujen alhaisella infektion multip-lisiteetilla (0,01 pfu/solu). Kolmen päivän kuluttua virus kerättiin, ja soluliman vi-10 rus otettiin talteen Dounce-homogenisoinnilla. Tumat poistettiin sentrifugoimalla 15 min ajan nopeudella 500 x g, ja virus otettiin talteen supematantista sentrifugoimalla edelleen 40 % sakkaroosikerrokseen nopeudella 12 000 r/min t 12K:ssa 60 min ajan Beckman Sw27 -roottorilla. Vyöhykkeen muodostanut virus laimennettiin, pelletöitiin ja puhdistettiin sakkaroosigradienttisentrifugoinnilla (Killington 15 ja Powell, 1985, mainittu edellä). Virusvyöhyke kerättiin gradientista, ja virus otettiin talteen sentrifugoimalla. Virus suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), määritettiin infektoivuus täplätitrauksella hamsterinpoikasen munuais(BHK)-soluilla, ja partikkelien lukumäärä määritettiin elektronimikroskopialla. Valmisteen partikkeli:infektoivuus-suhde oli 110 partikkelia/pfu. Virus lai-·* * 20 mennettiin tasoon 2,5 x 1010 pfu/ml PBS:ään, ja inaktivoitiin käsittelemällä β- :' propiolaktonilla 60 min ajan 20 °C:ssa. Sitten eriä varastoitiin -70 °C: ssa.
....: Elävän gH‘-viruksen valmistus rokotusta varten.
: ·’ Tämä materiaali valmistettiin villityyppivirukselle kuvatulla tavalla paitsi, että vi- v : rasta kasvatettiin gH+-komplementoivassa solulinjassa, joka sisälsi ja ekspressöi 25 HSV-tyyppi 1 hG-geeniä, ja sitä ei inaktivoitu β-propiolaktonilla käsittelemällä.
Tämän valmisteen partikkeli:infektoivuus-suhde oli 150:1. Tämän valmisteen kon-sentraatio säädettiin tasolle 2,5 x 1010 pfii/ml, ja eriä varastoitiin PBS:ssä -70 °C:ssa.
Rokotusprotokolla : .30 4-viikkoisia naaraspuolisia balb/C-hiiriä (ostettu yhtiöstä Tucks U.K. Ltd) rokotet-tiin erilaisilla inaktivoidun WT-viraksen tai elävän gH'-viruksen annoksilla 2 μΐ ti- ,3 110438 lavuuksissa fosfaattipuskuroitua suolaliuoksella tippa-annolla ja neularaaputuksella oikeaan korvaan seuraavasti:
Ryhmä A kontrolli - ei virusta
Ryhmä B 5 x 104 pfu virusrokote 5 Ryhmä C 5 x 105 pfu virusrokote
Ryhmä D 5 x 106 pfu virusrokote
Ryhmä E 5x10 pfu virusrokote 14 päivän kuluttua kaikki hiiret altistettiin samanlaisella siirrostuksella vasempaan korvaan 2 x 106 pfu HSV-l-kantaa SC16 (villityyppivirus). Hiiret tapettiin 5 päivän 10 kuluttua ja määritettiin viruksen infektoivuus vasemmassa korvassa ja vasemmissa kaulahermosolmukkeissa dl, cIII ja cIV (yhdistetty). Latenttisuustutkimuksia varten muut rokotetut ja altistetut eläimet tapettiin 1 kuukauden kuluttua, ja testattiin latentti infektio leikkaamalla eli-, cIII- ja cIV-kaulahermosolmukkeet. Näitä inku-boitiin väliaineessa viiden päivän ajan, homogenisoitiin sitten ja määritettiin infek-15 toivan viruksen läsnäolo vakiotäplämäärityksellä. Kaikki seuraavat tulokset esitetään yksikössä pfu/elin.
•« · • · 14
Taulukko 1 - Infektion akuutin vaiheen aikana läsnä olevan altistusviruksen tiitteri elävällä gH -viruksella rokottamisen jälkeen 110438
Virustiitteri - logiopfu (WT SCI6)
Hiiri no. Korvat keski- kaulahermo- keski- 5 arvo solmukkeet arvo 1 4,2 3,3 ryhmä A 2 4,2 4,3 3,4 3,4 3 4,6 3,4 4 4,3 3,4 10 1 3,4 1,5 ryhmä B 2 ei 0,85 2,4 1,8 3 ei 2,0 4 ei 1,5 1 ei ei 15 ryhmä C 2 ei - ei 3 ei ei 4 ei ei 1 ei ei ryhmä D 2 ei - ei 20 3 ei ei 4 ei ei 1 ei ei :...· ryhmä E 2 ei - ei • V 3 ei ei ' j 1 ’ 1 25 4 ei ei
’.Yhdistetyt kaulahermosolmukkeet dl, cIII ja cIV
» * »
Taulukko 2 - Infektion akuutin vaiheen aikana läsnä olevan altistusviruksen tiitteri inaktivoidulla WT HSV-l:llä rokottamisen jälkeen 15 110438
Virustiitteri - log10pfu (WT SC16)
Hiiri no. Korvat keski- kaulahermo- keski- 5 arvo solmukkeet* arvo 1 5,7 2,6 ryhmä A 2 4,4 5,2 2,3 2,3 3 5,7 2,1 1 4,2 1,9 10 ryhmä B 2 3,6 3,8 3,1 1,2 3 3,5 ei 4 3,8 ei 1 ei ei ryhmä C 2 2,5 2,0 ei 15 3 2,9 ei 4 2,7 ei 1 3,9 ei ryhmä D 2 2,0 2,6 ei 3 2,0 ei 20 4 2,3 ei 1 ei ei ' ryhmä E 2 ei - ei ···* 3 ei ei • V 4 ei ei * ♦ ,
: . ·. 25 Yhdistetyt kaulahermosolmukkeet dl, cIII ja cIV
I »
Taulukko 3 - Latenttiviruksena kaulahermosolmukkeissa läsnä olevan altistusviruk- sen tiitteri elävällä gH-HSV-l:llä rokottamisen jälkeen ,. 110438
ID
Hiiri no. Virustiitteri kau- uudelleenakti- lahermosolmukkeissa voitumistaajuus 5 (logiopfu WT) 1 5,4 ryhmä A 2 4,6 3 5,0 5/5 4 4,8 10 5 5,3 1 ei ryhmä B 2 1,5 3/4 3 5,1 4 5,3 15 1 ei ryhmä C 2 ei 1/3 3 3,2 1 ei ryhmä D 2 ei 0/4 20 3 ei 4 ei 1 ei '···* ryhmä E 2 ei 0/4 • 3 ei :--:25 4 ei 9 * ·
..! t * Yhdistetyt kaulahermosolmukkeet dl, cIII ja cIV
1 * · > • · * * · • t • * · » » » t · · * I · * · » » » t · I I I I · I I t 17 1 10438
Taulukko 4 - Latentin altistusviruksen tiitteri kaulahermosolmukkeissa inakti-voidulla WT HSV-l:llä rokottamisen jälkeen
Hiiri no. Virustiitteri kau- uudelleenakti- lahermosolmukkeissa voitumistaajuus 5 (logiopfu WT) 1 ei ryhmä A 2 5,0 3 5,0 3/4 4 5,2 10 1 3,5 ryhmä B 2 4,0 3/4 3 5,5 4 ei 1 3,6 15 ryhmä C 2 5,1 2/4 3 ei 4 ei 1 ei ryhmä D 2 4,8 1/4 20 3 ei 4 ei ·' ' 1 ei • *« ryhmä E 2 ei 0/4 • V 3 ei :'*:25 4 ei
* Yhdistetyt kaulahermosolmukkeet dl, cIII ja cIV
t · · » (pfu = täpliä muodostavia yksiköitä; gH' on virus, jossa on puutteellinen gH-geeni).
• » < i i Näissä tuloksissa esitetään infektion akuutin vaiheen aikana korvissa ja kaulaher-mosolmukkeissa läsnä olevan altistusviruksen WT SCI6 tiitterin. Siten alhainen i. · i 30 tiitteri osoittaa rokotushoito-ohjeen hyvää tehokkuutta gH -viruksella, kun taas kor- L J keampi tiitteri ilmaisee huonomman tehokkuuden. Tuloksista on selvää, että roko-tus elävällä gH'-HSV-viruksella on paljon tehokkaampaa kuin yhtäsuurella määräl-lä inaktivoitua WT-virusta. Inakti voi dulla valmisteella vaadittiin annos 5 x 107 pfu ’ ‘ estämään altistusviruksen replikaatio korvassa, kun taas elävää gH"-virusta vaadit-35 tiin 100 - 1 000 kertaa vähemmän. Elävä gH'-virusrokote määrällä 5 x 105 pfu ja 110438 18 enemmän pystyi myös estämään altistus viruksen replikaation kaulahermosolmuk-keissa infektion akuutin vaiheen aikana, ja lisäksi sillä nähtiin selvä suojausvaikutus latentti-infektion muodostumista vastaan kaulahermosolmukkeissa.
Ilman gH-geeniä oleva HSV vektorina immunisoinnissa vierasta antigeeniä vas-5 taan: SIVmac kanta 142:n gpl20-geenin lisääminen gH‘-HSV-viruksen genomiin
Viruksia, joissa on deleetioita välttämättömissä geeneissä, voidaan edellä kuvatulla tavalla käyttää turvallisina vektoreina vieraiden antigeenien vapauttamiseksi immuunijärjestelmään, ja edellä kuvattu gH'-virus edustaa sopivaa esimerkkiä tällaisesta vektorista. Tätä virusta voitaisiin käyttää ekspressöimään mitä hyvänsä 10 vierasta antigeeniä, mutta erityisen kiinnostava mahdollisuus olisi AIDS-viruksen, ihmisen immuunikatoviruksen (HIV) tärkeimmät antigeeniset proteiinit. Siten nämä sekvenssit lisättäisiin gH'-HSV-genomiin tavalla, joka varmistaisi niiden ekspression normaalien solujen (ts. ei-komplementoivien solujen) yhdistelmä-DNA-viruksella infektoinnin aikana. Yksilön infektointi tällaisella viruksella voisi 15 johtaa latenttiin infektioon, joka voisi silloin tällöin johtaa uudelleenaktivoitumisen jälkeen vieraan antigeenin tuotannon purkauksiin, antaen tulokseksi tuon proteiinin vastaisen immuunivasteen stimuloinnin.
Koska tutkimuksia tämän lähestymistavan testaamiseksi suoraan ihmisillä ei nykyisin ole sovellettavissa ihmisille, voidaan lähestymistapaa testata alkuvaiheena api-·;·. 20 noissa käyttämällä apinan AIDS-virusta SIVmac (makakeista eristetty apinan im-muunikatovirus). Tähän tarkoitukseen sopiva SIV-geeni on sellainen, joka koodit- • « .!'! taa gp 120-proteiinia, yhtä tärkeimmistä antigeenisistä kohteista tällä viruksella. Sen vuoksi tämä geeni liitetään gH"-HSV-genomiin, ja määritetään tämän viruksen te- j hokkuus rokotteena apinoiden suojaamisessa SlV.lle altistusta vastaan.
• · ; * · *; 25 Kaikkein ensimmäiseksi SIV gpl20 -geeni kloonataan sytomegalovirus IE-ydin- promoottorista seuraavaksi (Gompels ja Minson, 1989, mainittu edellä), ja seuraa- , -, : vaksi DNA-kasetti, joka koostuu gp 120 -geenistä ja ylävirran CMV-promoottorista, kloonataan plasmidiin pGH2 (kuvio 2). Tulokseksi saatu plasmidi ko-transfektoi- *; ’ daan sitten gH+-komplementoiva solulinjaan yhdessä DNA:n kanssa, joka on puh- « • .· ;30 distettu gH' HSV:stä, ja yhdistelmä-DNA-virus, joka on saanut gpl20 -geenin gH-HSV-viruksessa läsnä olevan β-galaktosidaasigeenin sijasta, eristetään seulomalla ;·*,·, β-galaktosidaasigeenin keskeytyksen suhteen.
110438 19 A. Plasmidin konstruointi SIV gpl20-koodisekvenssin yhdistämiseksi HSV-genomiin
Kuviossa 7 esitetään tämän menettekytavan kokonaiskaavio. Sacl-restriktioentsyy-mifragmentti (vastaten emäksiä 5240 - 8721) katkaistaan SIV-genomin kloonatusta 5 DNA-kopiosta (Chakrabarti et ai., Nature 328 (1987) 543, ja kloonattiin plasmidin pUC118 Sacl-kohtaan (Viera ja Messing, Methods in Enzymology 153 (1987) 3) plasmidin pSIV 1 muodostamiseksi, joka voidaan muuttaa yksisäikeiseksi DNA:ksi käsiteltäväksi kohtasuunnatulla mutageneesillä. Tämä DNA-alue, joka sisältää SIV env -geenin (sijaitsee välillä 6090 - 8298), muutetaan sitten kohtasuunnatulla muta-10 geneesillä (Brierley et ai., Cell 57 (1989) 537) restriktioentsyymikohdan lisäämiseksi EcoRV-entsyymiä varten asemiin 6053 - 6058 käyttämällä synteettistä oligo-nukleotidia 5'GAAGAAGGCT AT AGCTA AT ACAT.
Sitten lisätään SIV env-geenin sisälle asemaan 7671 - 7676 toinen EcoRV-kohta, 15 joka vastaa env-geenisekvenssin gpl20- ja gp40-alueiden välillä olevaa kat-kaisukohtaa, käyttäen synteettistä oligonukleotidia
5'CAAGAAATAAACTATAGGTCTTTGTGC
plasmidin pSIV2 luomiseksi. DNA-fragmentti (1617 emäsparia), joka vastaa SIV : env -geenin gpl20 -osaa, valmistetaan sitten sulattamalla SIV2:n EcoRV:llä.
20 CMV "immediate early" geenipromoottorin ydinalue saadaan plasmidista pUG-Hl (Gompels ja Minson, 1989, mainittu edellä) PCR-tekniikalla käyttämällä seuraavia ; > ’ kahta synteettistä oligonukleotidia.
» * * ·*·’: ylävirta-aluke
5’ ATC GAATTC CT AT AG CCTGGCATTATGCCCAGTACATG
f « » « ♦ • ·
····; 25 EcoRI EcoRV
.· i alavirta-aluke M t 5TCAAAGCTT CT AT AG CCCGGGGAGCTCTGATT AT AT AGACCTCCC ;\j Hindlll EcoRV Smal 20 110438
Sitten tämän reaktion tuote katkaistaan EcoRI- ja Hindlll-entsyymeillä, jolloin muodostuu DNA-fragmentti, joka sitten kloonataan EcoRI- ja Hindlll-sulatettuun plasmidiin pUCl 18 plasmidin pCMVIE2 luomiseksi, jossa on ainutlaatuinen Smal-kohta, joka sijaitsee juuri alavirtaan CMV-promoottorisekvenssistä. SIVmac gpl20 5 -koodisekvenssin sisältävä EcoRV-fragmentti, joka on valmistettu edellä kuvatulla tavalla, kloonataan sitten tähän Smal-kohtaan, ja valitaan sitten plasmidi pSIV3, jossa on SIV-koodisekvenssi oikein suuntautuneena sallimaan koodisekvenssin ekspression promoottorista. Sitten tämä plasmidi sulatetaan EcoRV:llä tuottamaan tylppäpäisen DNA-fragmentin, joka koostuu SIV-fragmentista yhdessä CMV-10 promoottorin kanssa, joka sitten kloonataan PvuII-sulatettuun pGH2:een (kuvio 2) pGH-120:n tuottamiseksi.
Yhdistelmä-DNA-gH- HSV:n sisältävän SIV gpl20:n konstruointi DNA:ta puhdistetaan gH' HSV -viruksesta, joka on konstruoitu edellisessä kappaleessa yksityiskohtaisesti esitetyllä tavalla, ja ko-transfektoidaan gH+-komplemen-15 toiviin soluihin yhdessä puhdistetun pGH-120-DNA:n kanssa. Sitten tästä transfek-tiomenettelytavasta eristetty jälkeläisvirus siirrostetaan gH+-komplementoiva solu-linjan yksikerroksille vakiotäplämäärityksellä kuten edellä käyttäen agarpäällystä X-gal:in läsnä ollessa. Parentaali-gH‘-virus sisältää funktionaalisen β-galaktosi-daasigeenin, joka sijaitsee jäännös-gH-koodisekvenssien sisäpuolella ja muodostaa 20 X-gal:in läsnä ollessa sinisiä täpliä. Yhdistelmä-DNA-virukset, jotka ovat saaneet β-galaktosidaasigeenin sijasta SIV gpl20-koodisekvenssin, muodostavat kuitenkin • ” ‘: valkoisia täpliä. Virus otetaan talteen näistä valkoisista täplistä poimimalla agarpa- i ( a lasia, ja valmistetaan viruskantaliuoksia kasvattamalla virusta gH+-komplemen- i toivassa solulinjassa. Näistä kantaliuoksista valmistetaan virus-DNA:ta, ja tarkis-25 tetaan "Southern Blotting"-menetelmällä oikean DNA-rakenteen suhteen gH-geenin ympärillä SIV-koodisekvenssistä peräisin olevia sopivia koettimia käyttä- * mällä. Lopuksi valmistetaan edellä kuvatulla tavalla viruksen kantaliuoksia ennen eläimissä suoritettavia rokotustutkimuksia.
• · I » ·
> I
*" * · Rokote, joka sisältää heikennettyä virusta, voidaan valmistaa tekniikan tasolla tun- i » « . *, 30 netuilla vakiotekniikoilla. Rokote voi sisältää esimerkiksi yhtä tai useaa täyteainetta I t » ja/tai adjuvanttia. Rokotteella käyttöön annettavan heikennetyn viruksen tehokas I * ’ * ’ annos voidaan määrittää tekniikan tasolla hyvin tunnetuilla tekniikoilla.
t * * I * I I »
I I
I 1 »
• I
Claims (29)
1. Menetelmä mutanttiherpesviruksen valmistamiseksi, jonka viruksen genomi on vajavainen valitun geenin suhteen, joka on välttämätön infektoivien viruspartik-kelien tuotannolle siten, että mutanttivirus kykenee infektoimaan normaaleja isän-5 täsoluja ja replikoituinaan ja ilmentämään viraalisia geenejä näissä soluissa, mutta ei kykene aikaansaamaan infektoivien uusien viruspartikkeleiden tuottoa mainituissa isäntäsoluissa, tunnettu siitä, että menetelmässä viljellään täydentäviä isäntäsoluja, jotka ovat muu kuin mainittu normaali isän-täsolu ja joihin on viety heterologinen nukleotidisekvenssi ja jotka kykenevät il-10 mentämään sitä, mikä aikaansaa valikoidun välttämättömän geenin toiminnan, jonka suhteen mutanttiherpesviruksella on vajavainen genomi, ja jotka solut on infek-toitu viruksella, ja annetaan soluviljelmän tuottaa infektoivia uusia viruspartikkelei-ta, joissa on vajavainen genomi; ja otetaan virus talteen viljelmästä; 15 jolloin mainittua mutanttivirusta käytetään ennalta ehkäisevästi tai terapeuttisesti immuunivasteen muodostamisessa sillä infektoidussa kohteessa. ·:*. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vajavaisuus . · · ·. sallii ei-infektoivien viruspartikkelien tuotannon ja vapautumisen, kun mutanttiher- pesvirus infektoi muita isäntäsoluja kuin mainitun täydentävän isäntäsolun. ’•"20 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mutant- j * : tiherpesvirus voi suojata sillä immunisoidun herkän lajin infektiolta vastaavalla vil- :T: lityyppi viruksella.
2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att bristfälligheten tilläter produktion och frigörelse av icke-infekterande viruspartiklar, da mutantherpesviru-set infekterar andra värdceller än nämnda kompletterande värdcell.
3. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att mutantherpesviru-5 set kan skydda en känslig art som immuniserats med viruset mot infektion av mots- varande vildtypvirus.
4. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-3, kännetecknat av att i genomen hos nämnda mutantherpesvirus firms ocksä en heterolog sekvens som kodar immu-nogenen sä, att da mutantherpesviruset infekterar normala värdceller kan immuno- 10 genen uttryckas.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että • * * *; mainitun mutanttiherpesviruksen genomissa on myös immunogeeniä koodaava he- ..25 terologinen sekvenssi siten, että mutanttiherpesviruksen infektoidessa normaaleja • isäntäsoluja immunogeeni kykenee ilmentymään. * » · ♦ • « · ’·;·’ 5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mu- : · : tanttiherpesvirus on mutantti herpes simplex -viruksesta (HSV). • · *
5. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-4, kännetecknat av att mutanther-pesviruset är en mutant av herpes simplex-virus (HSV).
6. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-5, kännetecknat av att bristfälligheten är i en gen, som fungerar i ett sent stadium av viruscykeln. 15 7. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-5, kännetecknat av att bristfällig heten är i en gen, som inverkar vid packning.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että va-30 javaisuus on geenissä, joka toimii viraalisen syklin myöhäisessä vaiheessa. 110438 22
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vajavaisuus on geenissä, joka vaikuttaa pakkautumisessa.
8. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-5, kännetecknat av att bristfälligheten är i en gen, som inverkar pä en företeelse efter replikationen.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vajavaisuus on geenissä, joka vaikuttaa replikoitumisen jälkeiseen tapahtumaan.
9. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-5, kännetecknat av att bristfällig-20 heten är i en gen, som inte behövs vid samlande av viruset.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että va javaisuus on geenissä, jota ei tarvita viruksen kokoamisessa.
10. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetecknat av att bristfälligheten är i en glykoproteingen.
10. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vajavaisuus on glykoproteiinigeenissä.
11. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat av att bristfälligheten är i gly-koproteingenen gH. 25 12. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-11, kännetecknat av att mutant- viruset kan fä tili ständ en latent infektion pä ett ställe infekterat därav, som aktive-ras pä nytt periodiskt, vilket leder tili produktion av protein kodat av viruset i den latent infekterade cellen i det infekterade objektet.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vajavaisuus 10 on glykoproteiinigeenissä gH.
12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mutanttivirus voi aikaansaada sillä infektoidussa kohteessa piilevän infektion, joka aktivoituu uudelleen aika-ajoin, johtaen viruksen koodittamien proteiinien tuotantoon infektoidun kohteen latentisti infektoidussa solussa.
13. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-12, kännetecknat av att den kom-30 pletterande cellen kommer frän en rekombinant cellinje. 26 110438
13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ... täydentävä solu on rekombinanttisolulinjasta. • · • ·
14. Förfarande för tillverkning av vaccin vilket används förebyggande eller tera-peutiskt för att bilda en immun respons i en med vaccinet immuniserad individ, kännetecknat av att, vid förfarandet (i) odlas celler, vilka är infekterade med mutantherpesvirus, vars genom är bristfäl-5 lig i förhallande tili valda gen, som är essentiel för produktion av infekterade virus- partiklar, varvid odlingscellen är en kompletterande värdcell, vilken har förtsetts med en heterolog nukleotidsekvens och förmär uttrycka det som ästadkommer funktionen av den valda nödvändiga genen, varvid odlingscellen kan producera nya infekterande viruspartiklar, varvid, fastän viruset kan infektera normala värdceller 10 och fä till stand replikation och uttryck av virusantigener i dylika normala värdceller, det är oförmöget att producera nya infekterande viruspartiklar av dylika normala värdceller, da de normala värdcellema är nägon annan än nämnda kompletterande värdcell; (ii) cellodlingen fär producera nya viruspartiklar som infekterar viruset; 15 (iii) viruset ätervinns ur odlingen; och (iv) viruset används för formulering av ett vaccinpreparat i en dos som innehäller virus ända tili 5x10 pfu.
14. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi ennalta ehkäisevään tai terapeuttiseen käyttöön immuunivasteen muodostamiseksi rokotteella immunisoidussa yksilössä, •; | tu n nettu siitä, että menetelmässä • · · • I · • _;20 (i) viljellään soluja, jotka on infektoitu mutanttiherpesviruksella, jonka genomi on ’·' * vajavainen valitun geenin suhteen, joka on välttämätön infektoivien viruspartikke- lien tuotannolle, viljelysolun ollessa täydentävä isäntäsolu, johon on viety heterolo-ginen nukleotidisekvenssi ja joka kykenee ilmentämään sitä, mikä aikaansaa vali- • * ’ \* koidun välttämättömän geenin toiminnan, jolloin viljely solu voi tuottaa uusia infek- : ' 25 toivia viruspartikkeleita, ja jolloin vaikka virus kykenee infektoimaan normaaleja isäntäsoluja ja saamaan aikaan viraalisten antigeenigeenien replikoitumisen ja il-•; * ’ mentymisen tällaisissa normaaleissa isäntäsoluissa, se ei kykene tuottamaan infek- • toivia uusia viruspartikkeleita tällaisista normaaleista isäntäsoluista, normaalien : ’ ·.: isäntäsolujen ollessa jokin muu kuin mainittu täydentävä isäntäsolu; 30 (ii) annetaan soluviljelmän tuottaa viruksen infektoivia uusia viruspartikkeleita; (iii) otetaan virus talteen viljelmästä; ja (iv) käytetään virusta rokotevalmisteen formuloimiseksi annoksena, joka sisältää n 23 110438 virusta 5x10 pfu asti.
15. Förfarande enligt patentkrav 14, kännetecknat av att det atervunna viruset används i fas (iv) för formulering av ett vaccinpreparat i en dos som innehäller vi- 20 rus ända tili 5 x 10 6 pfu.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että talteenotet-tua virusta käytetään vaiheessa (iv) rokotevalmisteen formulointiin annoksena si- 5 sältäen virusta 5 x 106 pfu asti.
16. Förfarande enligt patentkrav 15, kännetecknat av att det atervunna viruset används i fas (iv) för formulering av ett vaccinpreparat i en dos som innehäller virus ända tili 5 x 10 5 pfu.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että talteenotet-tua virusta käytetään vaiheessa (iv) rokotevalmisteen formulointiin annoksena sisältäen virusta 5 x 105 pfu asti.
17. Förfarande enligt patentkrav 16, kännetecknat av att det ätervunna viruset 25 används i fas (iv) för formulering av ett vaccinpreparat i en dos som innehäller virus ända tili 5 x 10 4 pfu.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että talteenotet-10 tua virusta käytetään vaiheessa (iv) rokotevalmisteen formulointiin annoksena sisältäen virusta 5 x 104 pfu asti.
18. Förfarande enligt nägot av patentkraven 14-17, kännetecknat av att bristfäl-ligheten tilläter produktion och frigörelse av icke-infekterande viruspartiklar, dä viruset infekterar andra värdceller än nämnda kompletterande värdcell. 27 110438
18. Jonkin patenttivaatimuksen 14-17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vajavaisuus sallii ei-infektoivien viruspartikkelien tuotannon ja vapautumisen, kun virus infektoi muita isäntäsoluja kuin mainitun täydentävä isäntäsolun.
19. Förfarande enligt nägot av patentkraven 14-18, kännetecknat av att viruset kan skydda en känslig art som immuniserats mot infektion av motsvarande vildtyp-virus.
19. Jonkin patenttivaatimuksen 14-18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virus voi suojata sillä immunisoidun herkän lajin infektiolta vastaavalla *:·. villityyppiviruksella. '···' 20. Jonkin patenttivaatimuksen 14-19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ' .: mainitun mutanttiherpesviruksen genomissa on myös immunogeeniä koodaava he- '•"20 terologinen sekvenssi siten, että mutanttiherpesviruksen infektoidessa normaaleja \ ’ isäntäsoluja immunogeeni kykenee ilmentymään.
20. Förfarande enligt nägot av patentkraven 14-19, kännetecknat av att i geno-5 men hos nämnda mutantherpesvirus finns ocksä en heterolog sekvens som kodar immunogenen sä, att da mutantherpesviruset infekterar normala värdceller kan im-munogenen uttryckas.
21. Förfarande enligt nägot av patentkraven 14-20, kännetecknat av att viruset är en mutant av herpes simplex-virus (HSV). 10 22. Förfarande enligt nägot av patentkraven 14-21, kännetecknat av att bristfal- ligheten är i en gen, som fungerar i ett sent stadium av viruscykeln.
21. Jonkin patenttivaatimuksen 14-20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että , . virus on mutantti herpes simplex -viruksesta (HSV).
22. Jonkin patenttivaatimuksen 14-21 mukainen menetelmä, tunnettu, että vaja-; ‘25 vaisuus on geenissä, joka toimii viraalisen syklin myöhäisessä vaiheessa.
23. Förfarande enligt nägot av patentkraven 14-21, kännetecknat av att bristfäl-ligheten är i en gen, som inverkar pä packning.
23. Jonkin patenttivaatimuksen 14-21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että : ·. ·. vajavaisuus on geenissä, joka vaikuttaa pakkautumisessa.
24. Förfarande enligt nägot av patentkraven 14-21, kännetecknat av att bristfäl-15 ligheten är i en gen, som inverkar pä en företeelse efter replikationen.
24. Jonkin patenttivaatimuksen 14-21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vajavaisuus on geenissä, joka vaikuttaa replikoitumisen jälkeiseen tapahtumaan. 24 110438
25. Förfarande enligt nägot av patentkraven 14-21, kännetecknat av att bristfäl-ligheten är i en gen, som inte behövs vid samlande av viruset.
25. Jonkin patenttivaatimuksen 14-21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vajavaisuus on geenissä, jota ei tarvita viruksen kokoamisessa.
26. Förfarande enligt patentkrav 21, kännetecknat av att bristfälligheten är i gly-koproteingenen. 20 27. Förfarande enligt patentkrav 26, kännetecknat av att bristfälligheten är i gly- koproteingenen gH.
26. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vajavaisuus on glykoproteiinigeenissä.
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vajavaisuus on glykoproteiinigeenissä gH.
28. Förfarande enligt nägot av patentkraven 14-27, kännetecknat av att mutant-viruset kan fä tili ständ en latent infektion pä ett ställe infekterat därav, som aktive-ras pä nytt periodiskt, vilket leder tili produktion av protein kodat av viruset i den 25 latent infekterade cellen i det infekterade objektet.
28. Jonkin patenttivaatimuksen 14-27 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virus voi aikaansaada sillä infektoidussa kohteessa piilevän infektion, joka aktivoituu uudelleen aika-ajoin, johtaen viruksen koodittamien proteiinien tuotantoon kä- 10 sitellyn kohteen latentisti infektoidussa solussa.
29. Jonkin patenttivaatimuksen 14-28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että täydentävä solu on rekombinanttisolulinjasta. 15 1. Förfarande för att tillverka mutantherpesvirus, vars genom är bristfallig i för- hällande tili valda gen, som är essentiel för produktion av infekterande viruspartik-lar pä sä sätt, att mutantviruset förmär infektera normala värdceller och replikera och uttrycka virusgener i dessa celler, men är oförmöget att fä till stand en produktion av infekterande nya viruspartiklar i nämnda värdceller, kännetecknat av att i 20 förfarandet odlas kömpietterande värdceller, vilka är andra än nämnda normala värdcell och vilka har försetts med en heterolog nukleotidsekvens och vilka förmär uttrycka det som ästadkommer funktionen av den valda nödvändiga genen, i förhallande tili vil-ken mutantherpesviruset har en bristfallig genom, och varvid cellema är infekterade 25 med viruset, och cellodlingen far producera infekterande nya viruspartiklar, vilka har en bristfällig genom; och viruset ätervinns ur odlingen; varvid nämnda mutantvirus används preventivt eller terapeutiskt för att bilda im-munskydd i det objekt det infekterat. 25 110438
29. Förfarande enligt nägot av patentkraven 14-28, kännetecknat av att den kompletterande cellen kommer frän en rekombinant cellinje.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9020799 | 1990-09-25 | ||
| GB909020799A GB9020799D0 (en) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | Viral vaccines |
| GB9104903 | 1991-03-08 | ||
| GB919104903A GB9104903D0 (en) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | Viral vaccines |
| GB9101632 | 1991-09-23 | ||
| PCT/GB1991/001632 WO1992005263A1 (en) | 1990-09-25 | 1991-09-23 | Viral defective vaccine produced by transcomplementing cell line |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI931309A0 FI931309A0 (fi) | 1993-03-24 |
| FI931309A FI931309A (fi) | 1993-03-24 |
| FI110438B true FI110438B (fi) | 2003-01-31 |
Family
ID=26297693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI931309A FI110438B (fi) | 1990-09-25 | 1993-03-24 | Menetelmä mutanttiherpesviruksen valmistamiseksi |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6541009B1 (fi) |
| EP (2) | EP0953648A3 (fi) |
| JP (1) | JP3895366B2 (fi) |
| KR (1) | KR100372934B1 (fi) |
| AT (1) | ATE194657T1 (fi) |
| AU (1) | AU658836B2 (fi) |
| BR (1) | BR9106879A (fi) |
| CA (1) | CA2091678C (fi) |
| DE (1) | DE69132311T2 (fi) |
| DK (1) | DK0550553T3 (fi) |
| ES (1) | ES2150416T3 (fi) |
| FI (1) | FI110438B (fi) |
| GB (1) | GB2263480B (fi) |
| GR (1) | GR3034484T3 (fi) |
| HK (1) | HK1001656A1 (fi) |
| MX (1) | MX9203717A (fi) |
| NO (1) | NO314550B1 (fi) |
| OA (1) | OA09777A (fi) |
| WO (1) | WO1992005263A1 (fi) |
Families Citing this family (81)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10399031I1 (de) * | 1987-08-28 | 2004-01-29 | Health Research Inc | Rekombinante Viren. |
| NL9020389A (nl) * | 1989-03-08 | 1991-12-02 | Health Research Inc | Systeem voor het in de gastheer selecteren van recombinant-pokkenvirussen. |
| US7374768B1 (en) | 1990-09-25 | 2008-05-20 | Xenova Research Limited | Viral vaccines |
| KR100372934B1 (ko) | 1990-09-25 | 2003-12-24 | 캔탑 파마슈티칼스 리서취 리미티드 | 형질 상보성 세포주에 의해 생성된 바이러스 결손 백신 |
| US5837261A (en) * | 1990-09-25 | 1998-11-17 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Viral vaccines |
| US5665362A (en) * | 1990-09-25 | 1997-09-09 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Viral vaccines |
| ATE181108T1 (de) | 1991-08-26 | 1999-06-15 | Immuno Ag | Direkt molekuläre klonierung eines modifizierten genoms eines chordopocken-virus |
| TW289731B (fi) * | 1992-07-09 | 1996-11-01 | Akzo Nv | |
| DE69333751T2 (de) * | 1992-07-30 | 2005-12-29 | Akzo Nobel N.V. | Nicht-verbreitendes lebendes herpesvirusvakzin |
| US7223411B1 (en) * | 1992-07-31 | 2007-05-29 | Dana-Farber Cancer Institute | Herpesvirus replication defective mutants |
| CA2141574C (en) * | 1992-07-31 | 2009-11-24 | David Knipe | Herpesvirus vaccines |
| AU696336B2 (en) * | 1993-03-19 | 1998-09-10 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Defective mutant non-retroviral virus (e.g. HSV) as vaccine |
| WO1995003399A2 (en) * | 1993-07-19 | 1995-02-02 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Production method for preparation of disabled viruses |
| WO1995004546A1 (en) * | 1993-08-06 | 1995-02-16 | Kai Juhani Ernst Krohn | Novel mutated human and simian immunodeficiency viruses and vaccines containing said viruses |
| EP0659885A1 (en) * | 1993-12-21 | 1995-06-28 | Akzo Nobel N.V. | Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity |
| AU694519B2 (en) * | 1994-04-29 | 1998-07-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions |
| US5807557A (en) * | 1994-07-25 | 1998-09-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Soluble herpesvirus glycoprotein complex |
| US6156319A (en) | 1994-07-25 | 2000-12-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Soluble herpesvirus glycoprotein complex vaccine |
| GB9415319D0 (en) * | 1994-07-29 | 1994-09-21 | Medical Res Council | HSV viral vector |
| GB9415369D0 (en) * | 1994-07-29 | 1994-09-21 | Lynxvale Ltd | Mutant virus |
| GB9423663D0 (en) * | 1994-11-23 | 1995-01-11 | Cantab Pharma Res | Viral preparations, immunogens, and vaccines |
| ATE324435T1 (de) * | 1995-02-21 | 2006-05-15 | Cantab Pharmaceuticals Res Ltd | Virale zubereitungen, vektoren, immunogene und impfstoffe |
| WO1996029421A1 (en) * | 1995-03-23 | 1996-09-26 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Vectors for gene delivery |
| EP0828823A4 (en) * | 1995-06-01 | 1999-02-10 | Merck & Co Inc | HERPES SIMPLEX TYPE 1 VIRUS PROTEASE MUTANTS AND VECTORS THEREOF |
| EP0856062A2 (en) * | 1995-10-19 | 1998-08-05 | St. Jude Children's Research Hospital | Herpesvirus vectors and their uses |
| DE19709148C1 (de) * | 1997-03-06 | 1998-09-03 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen infektiöse Erreger |
| IL132323A0 (en) | 1997-04-28 | 2001-03-19 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors |
| EP0884382A3 (en) * | 1997-06-10 | 2000-10-25 | Pfizer Products Inc. | Processes for preparation of marek's disease virus using continuous mammalian cell lines |
| US6875606B1 (en) | 1997-10-23 | 2005-04-05 | The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Human α-7 nicotinic receptor promoter |
| GB9804632D0 (en) | 1998-03-05 | 1998-04-29 | Cantab Pharma Res | Virus preparations and methods |
| GB9808922D0 (en) | 1998-04-24 | 1998-06-24 | Cantab Pharmaceuticals Res Ltd | Virus preparations |
| US6225456B1 (en) | 1998-05-07 | 2001-05-01 | University Technololy Corporation | Ras suppressor SUR-5 |
| US6506889B1 (en) | 1998-05-19 | 2003-01-14 | University Technology Corporation | Ras suppressor SUR-8 and related compositions and methods |
| GB9816761D0 (en) | 1998-07-31 | 1998-09-30 | Phogen Limited | Herpesvirus preparations and their uses |
| US6399354B1 (en) | 1998-07-31 | 2002-06-04 | President And Fellows Of Harvard College | Replication-competent virus expressing a detectable fusion protein |
| EP1153136A2 (en) | 1998-12-09 | 2001-11-14 | The General Hospital Corporation | Enhanced packaging of herpes virus amplicons and generation of recombinant virus vectors |
| US6441156B1 (en) | 1998-12-30 | 2002-08-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Calcium channel compositions and methods of use thereof |
| GB9927353D0 (en) * | 1999-11-19 | 2000-01-19 | Cantab Pharma Res | Virus preparation and use |
| GB0018307D0 (en) | 2000-07-26 | 2000-09-13 | Aventis Pharm Prod Inc | Polypeptides |
| US7416726B2 (en) | 2000-04-13 | 2008-08-26 | The Rockefeller University | Enhancement of antibody-mediated immune responses |
| ATE536375T1 (de) | 2000-05-10 | 2011-12-15 | Mayo Foundation | Menschliche igm antikörper, welche die fähigkeit besitzen, den wiederaufbau der myelinstruktur zu induzieren und deren diagnostische und therapeutische anwendung im zentralen nervensystem |
| DK1317564T3 (da) | 2000-09-14 | 2007-12-03 | Sinai School Medicine | Screeningsfremgangsmåder til at identificere G-proteiner og andre forbindelser, som modulerer phosphodiesterase (PDE)-aktiviteten |
| US7060442B2 (en) | 2000-10-30 | 2006-06-13 | Regents Of The University Of Michigan | Modulators on Nod2 signaling |
| ATE501161T1 (de) | 2000-12-28 | 2011-03-15 | Wyeth Llc | Rekombinantes schutzprotein aus streptococcus pneumoniae |
| DK1499349T3 (da) | 2001-03-02 | 2010-04-06 | Univ Rockefeller | Rekombinante hybrid-allergenkonstrukter med reduceret allergenitet, der bibeholder det naterulige allergens immunogenitet |
| US7803982B2 (en) | 2001-04-20 | 2010-09-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | T1R3 transgenic animals, cells and related methods |
| MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
| US7785608B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
| US7432057B2 (en) | 2004-01-30 | 2008-10-07 | Michigan State University | Genetic test for PSE-susceptible turkeys |
| GB0716992D0 (en) | 2007-08-31 | 2007-10-10 | Immune Targeting Systems Its L | Influenza antigen delivery vectors and constructs |
| GB0408164D0 (en) | 2004-04-13 | 2004-05-19 | Immune Targeting Systems Ltd | Antigen delivery vectors and constructs |
| US7604798B2 (en) | 2004-07-15 | 2009-10-20 | Northwestern University | Methods and compositions for importing nucleic acids into cell nuclei |
| AU2005274948B2 (en) | 2004-07-16 | 2011-09-22 | Genvec, Inc. | Vaccines against aids comprising CMV/R-nucleic acid constructs |
| GB2421025A (en) * | 2004-12-09 | 2006-06-14 | Oxxon Therapeutics Ltd | HSV vaccination vectors |
| US7439327B2 (en) | 2005-01-18 | 2008-10-21 | Nuvelo, Inc. | Stem cell factor-like proteins and uses thereof |
| WO2007005898A2 (en) | 2005-07-05 | 2007-01-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Blocking leukocyte emigration and inflammation by interfering with cd99l2 |
| US20100008944A1 (en) * | 2005-07-29 | 2010-01-14 | President And Fellows Of Harvard College | Herpes simplex virus mutant and uses therefore |
| AR064642A1 (es) | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
| US8093043B2 (en) | 2008-06-04 | 2012-01-10 | New York University | β-TrCP1, β-TrCP2 and RSK1 or RSK2 inhibitors and methods for sensitizing target cells to apoptosis |
| KR20110031343A (ko) | 2008-06-20 | 2011-03-25 | 와이어쓰 엘엘씨 | 베타-용혈성 스트렙토코커스 균주로부터 유래된 ｏｒｆ1358을 사용하는 조성물 및 방법 |
| AU2009259923B2 (en) | 2008-06-20 | 2015-09-03 | Duke University | Compositions, methods and kits for eliciting an immune response |
| AR074273A1 (es) | 2008-11-05 | 2011-01-05 | Wyeth Corp | Composicion inmunigenica de multiples componentes para la prevencion de la enfermedad estreptococica beta-hemolitica bhs. uso. metodo |
| WO2010096561A1 (en) | 2009-02-18 | 2010-08-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof |
| US9186370B2 (en) | 2010-03-19 | 2015-11-17 | University Of South Alabama | Methods and compositions for the treatment of cancer |
| RU2580620C2 (ru) | 2010-08-23 | 2016-04-10 | ВАЙЕТ ЭлЭлСи | СТАБИЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ АНТИГЕНОВ Neisseria meningitidis rLP2086 |
| PE20140173A1 (es) | 2010-09-10 | 2014-02-20 | Wyeth Llc | Variantes no lipidadas de antigenos orf2086 de neisseria meningitidis |
| WO2012135696A2 (en) | 2011-04-01 | 2012-10-04 | University Of South Alabama | Methods and compositions for the diagnosis, classification, and treatment of cancer |
| LT2691530T (lt) | 2011-06-10 | 2018-08-10 | Oregon Health & Science University | Cmv glikoproteinai ir rekombinantiniai vektoriai |
| WO2013103401A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | University Of South Alabama | Methods and compositions for the treatment of cancer |
| MY198910A (en) | 2012-03-09 | 2023-10-02 | Pfizer | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
| EP2964665B1 (en) | 2013-03-08 | 2018-08-01 | Pfizer Inc | Immunogenic fusion polypeptides |
| AU2014249045A1 (en) | 2013-03-11 | 2015-10-29 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Delivery of CARD protein as therapy for occular inflammation |
| MX369534B (es) | 2013-09-08 | 2019-11-11 | Pfizer | Composiciones de neisseria meningitidis y sus metodos. |
| US9950056B2 (en) | 2013-09-24 | 2018-04-24 | Duke University | Compositions, methods and kits for eliciting an immune response |
| EP3105311A1 (en) | 2014-02-10 | 2016-12-21 | Univercells NV | System, apparatus and method for biomolecules production |
| WO2015127094A1 (en) | 2014-02-19 | 2015-08-27 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Delivery of nrf2 as therapy for protection against reactive oxygen species |
| CN107249626A (zh) | 2015-02-19 | 2017-10-13 | 辉瑞大药厂 | 脑膜炎奈瑟球菌组合物及其方法 |
| SG11201906519RA (en) | 2017-01-31 | 2019-08-27 | Pfizer | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| EP3624845A1 (en) | 2017-05-15 | 2020-03-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| AU2018269319A1 (en) | 2017-05-15 | 2019-11-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5338683A (en) * | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
| AU6170486A (en) * | 1985-08-23 | 1987-02-26 | Advanced Genetics Research Institute | Defective viral vaccines |
| US4996152A (en) * | 1987-12-04 | 1991-02-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Avian herpesvirus amplicon as a eucaryotic expression vector |
| CN1038306A (zh) * | 1988-03-21 | 1989-12-27 | 维吉恩公司 | 重组反转录病毒 |
| JP2755817B2 (ja) * | 1988-11-14 | 1998-05-25 | アメリカ合衆国 | パルボウイルスキャプシド |
| JP3140757B2 (ja) * | 1989-02-06 | 2001-03-05 | デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート | パッケージング欠陥ｈｉｖプロウイルス、細胞系及びその使用 |
| NL9020389A (nl) | 1989-03-08 | 1991-12-02 | Health Research Inc | Systeem voor het in de gastheer selecteren van recombinant-pokkenvirussen. |
| FR2663228A2 (fr) * | 1989-09-29 | 1991-12-20 | Agronomique Inst Nat Rech | Composition immunisante contre la maladie de newcastle et procede de preparation. |
| CA2039921A1 (en) * | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Xandra O. Breakefield | Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication |
| KR100372934B1 (ko) | 1990-09-25 | 2003-12-24 | 캔탑 파마슈티칼스 리서취 리미티드 | 형질 상보성 세포주에 의해 생성된 바이러스 결손 백신 |
| JP3602530B2 (ja) * | 1991-03-07 | 2004-12-15 | ヴァイロジェネティクス コーポレイション | 遺伝子操作したワクチン菌株 |
| CA2141574C (en) | 1992-07-31 | 2009-11-24 | David Knipe | Herpesvirus vaccines |
-
1991
- 1991-09-23 KR KR1019930700913A patent/KR100372934B1/ko active
- 1991-09-23 AU AU86489/91A patent/AU658836B2/en not_active Ceased
- 1991-09-23 EP EP19990106514 patent/EP0953648A3/en not_active Withdrawn
- 1991-09-23 ES ES91917033T patent/ES2150416T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-23 CA CA 2091678 patent/CA2091678C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-23 EP EP19910917033 patent/EP0550553B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-23 WO PCT/GB1991/001632 patent/WO1992005263A1/en active IP Right Grant
- 1991-09-23 DE DE1991632311 patent/DE69132311T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-23 DK DK91917033T patent/DK0550553T3/da active
- 1991-09-23 JP JP51739991A patent/JP3895366B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-23 AT AT91917033T patent/ATE194657T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-23 BR BR9106879A patent/BR9106879A/pt not_active Application Discontinuation
-
1992
- 1992-06-29 MX MX9203717A patent/MX9203717A/es unknown
-
1993
- 1993-03-23 GB GB9306044A patent/GB2263480B/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-03-23 NO NO19931057A patent/NO314550B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-03-24 FI FI931309A patent/FI110438B/fi active
- 1993-03-25 OA OA60354A patent/OA09777A/en unknown
-
1995
- 1995-06-05 US US08/462,632 patent/US6541009B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-01-27 HK HK98100722A patent/HK1001656A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-09-26 GR GR20000402173T patent/GR3034484T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO931057L (no) | 1993-05-03 |
| KR100372934B1 (ko) | 2003-12-24 |
| NO931057D0 (no) | 1993-03-23 |
| DE69132311T2 (de) | 2000-12-14 |
| ATE194657T1 (de) | 2000-07-15 |
| FI931309A0 (fi) | 1993-03-24 |
| EP0953648A2 (en) | 1999-11-03 |
| GB2263480A (en) | 1993-07-28 |
| HK1001656A1 (en) | 1998-07-03 |
| DK0550553T3 (da) | 2000-10-23 |
| GB9306044D0 (en) | 1993-06-02 |
| DE69132311D1 (de) | 2000-08-17 |
| AU8648991A (en) | 1992-04-15 |
| EP0953648A3 (en) | 2007-09-12 |
| JP3895366B2 (ja) | 2007-03-22 |
| FI931309A (fi) | 1993-03-24 |
| GB2263480B (en) | 1994-07-20 |
| CA2091678A1 (en) | 1992-03-26 |
| CA2091678C (en) | 2003-04-22 |
| EP0550553A1 (en) | 1993-07-14 |
| GR3034484T3 (en) | 2000-12-29 |
| US6541009B1 (en) | 2003-04-01 |
| OA09777A (en) | 1993-11-30 |
| BR9106879A (pt) | 1993-07-20 |
| JPH06504194A (ja) | 1994-05-19 |
| ES2150416T3 (es) | 2000-12-01 |
| MX9203717A (es) | 1992-09-01 |
| EP0550553B1 (en) | 2000-07-12 |
| AU658836B2 (en) | 1995-05-04 |
| NO314550B1 (no) | 2003-04-07 |
| WO1992005263A1 (en) | 1992-04-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI110438B (fi) | Menetelmä mutanttiherpesviruksen valmistamiseksi | |
| US5665362A (en) | Viral vaccines | |
| JP3602530B2 (ja) | 遺伝子操作したワクチン菌株 | |
| JP5926804B2 (ja) | Ｃｍｖ用ワクチンとしての条件付き複製サイトメガロウイルス | |
| EP3407910B1 (en) | Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) equine encephalitis virus vaccine | |
| JP2002514885A (ja) | ポックスウイルス−イヌジステンパーウイルス（ｃｄｖ）組み換え体類および組成物類および前記組み換え体類を用いる方法 | |
| US7645455B2 (en) | Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides | |
| JP3034025B2 (ja) | 自己アセンブルド欠損非自己増殖性ウイルス粒子 | |
| CN105555958A (zh) | 水疱性口炎病毒的改性基质蛋白 | |
| JP2007254489A (ja) | Ｈｔｌｖ抗原を発現する組換え弱毒化ポックスウイルスを含有する免疫原性組成物 | |
| EP1439856B1 (en) | Recombinant rabies vaccine and methods of preparation and use | |
| JPH11511961A (ja) | 組換えポックスウイルス−カリシウイルス［ウサギ出血疾患ウイルス（ｒｈｄｖ）］組成物および使用 | |
| Vlastos et al. | VP1 pseudocapsids, but not a glutathione‐S‐transferase VP1 fusion protein, prevent polyomavirus infection in a T‐cell immune deficient experimental mouse model | |
| Van der Ryst et al. | Study of the immunogenicity of different recombinant Mengo viruses expressing HIV1 and SIV epitopes | |
| EP1171454B1 (en) | Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides | |
| WO2013011942A1 (ja) | 変異狂犬病ウイルス及びワクチン | |
| RU2236256C2 (ru) | Вакцина, содержащая мутантный вирус герпеса | |
| US7374768B1 (en) | Viral vaccines | |
| US7238672B1 (en) | Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides | |
| CN1062601C (zh) | 病毒疫苗 | |
| Xiang et al. | A simple method to test the ability of individual viral proteins to induce immune responses | |
| Morghen et al. | Virus vectors for immunoprophylaxis | |
| CZ127394A3 (en) | Replication-capable recombinant virus, process of obtaining thereof and vaccine composition |