JP3034025B2 - 自己アセンブルド欠損非自己増殖性ウイルス粒子 - Google Patents

自己アセンブルド欠損非自己増殖性ウイルス粒子

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Description

【発明の詳細な説明】 背景 ワクチン接種は過去30年の間にウイルスの病気の抑制
において重大な役割を演じてきた。ワクチン接種は免疫
性の簡単な原理に基づく：感染性因子にいったん暴露さ
れると、動物は同一因子による感染に対して保護する免
疫防御を準備する。ワクチン接種の目的は、感染の前に
防御を準備することを動物に誘発することである。便利
には、これは免疫原としてウイルスの弱毒化または殺し
た形態の使用により達成された。過去においてこれらの
アプローチの成功は、一部分、自然の抗原の提示および
自然の感染において得られた免疫応答の完全な領域を引
き出す弱毒化ウイルスの能力のためであった。しかしな
がら、従来のワクチンの方法は、常に、ある数の潜在的
制限を受けて来た。弱毒化した菌株は突然変異してより
ビルレントまたは非免疫原性となることがある；不適切
に不活性化ワクチンはそれらが防止しようと設計される
病気を引き起こすことがある。
組み換えDNA技術は、免疫原として、完全な感染因子
よりむしろ、規定された抗原の使用に基づくワクチンの
開発を可能とすることによって、従来のワクチンの制限
のいくつかを排除する可能性を提供する。これらは、化
学的に合成された免疫反応性のエピトープから成る、ペ
プチドのワクチン；組み換え異種細胞中のウイルスのタ
ンパク質の発現により産生された、サブユニットのワク
チン；および１つまたはある数の規定された抗原の提示
のための生きているウイルスのベクターの使用を包含す
る。
ペプチドおよびサブユニットの両者はある数の潜在的
制限を受ける。主要な問題は、操作したタンパク質のコ
ンフォメーションがそれらの自然のエンヴェロープにお
いて抗原のそれをまねることを保証することが困難であ
ることである。適当なアジュバントおよび、ペプチドの
場合において、担体のタンパク質を、免疫反応性を促進
するために使用しなくてはならない。さらに、これらの
ワクチンは主として体液の応答を誘発し、こうして有効
な免疫性を引き出すことができない。
ペプチドおよびサブユニットのワクチンの使用に関連
する問題のあるものは、生きているウイルスのベクター
を使用して異種抗原を提示することによって克服するこ
とができる。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペ
スウイルスおよびポックスウイルスを包含する、ある数
のウイルス［セプコ（Cepko）ら、1984、細胞（Cell）3
7:1053−1062;モリン（Morin）ら、1987、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、84:4626−4630;ロ
ウウェ（Lowe）ら、1987、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.N
atl.Acad.Sci.）USA、84:3896−3900;パニカリ（Panica
li）およびパオレッティ（Paoletti）、1982、プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、79:4927−493
1;マッケット（Mackett）ら、1982、プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、79:7415−7419］が開
発された；最大の努力は、この目的に感染性真核生物の
クローニングベクターとして、ワクシニアウイルス、オ
ルソポックスウイルスの開発に集中されてきた［パオレ
ッティ（Paoletti）およびパニカリ（Panicali）、米国
特許第4,603,112号］。種々の病原体からの抗原をエン
コードするものを包含する、異種遺伝子は、ワクシニア
ウィルス系において発現されてきた。すべての場合にお
いて、組み換えワクシニアウイルスにより発現された外
来遺伝子産生物は、自然条件下に合成された遺伝子に類
似するか、あるいはそれと同一であった。ある場合にお
いて、組み換えワクシニアウイルスを使用する実験動物
のワクチン接種は、関連する病原体を使用する対抗に対
してこれらの動物を保護した［パオレッティ（Paolett
i）ら、1984、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.S
ci.）USA、81:193−197;キエニイ（Kieny）ら、1984、
ネイチャー（Nature）、312:163−166;アリゾン（Alizo
n）ら、1984、ネイチャー（Nature）、312:757−760;ボ
イレ（Boyle）ら、1985、遺伝子（Gene）、35:169−17
7;イルマ（Yilma）ら、1988、サイエンス（Science）、
242:1058−1061）。
組み換えのアプローチは、そのためのワクチンが現在
存在しないか、あるいは従来のワクチンのアプローチが
望ましさに劣る、病気に対するワクチンを開発する試み
において使用されてきている。例えば、ヒトの免疫欠損
ウイルス（HIV）は、最初に、後天性免疫欠損病気症候
群（AIDS）の病因因子として同定された［バレ−シノウ
シ（Barre−Sinoussi）ら、1983、サイエンス（Scienc
e）、220:864;レベイ（Levey）ら、1984、サイエンス
（Science）、225:840;ガロ（Gallo）ら、1984、サイエ
ンス（Science）、224:500］ので、安全かつ有効なワク
チンの開発にかなりの努力が向けられて来た。これらの
努力は、免疫原として小さい合成ペプチドの使用から全
体の不活性化ウイルスの範囲の、方法の広いスペクトル
に頼ってきた。
AIDSの流行の出現は20世紀の最も重大な公衆の健康の
脅威を表す。1981年におけるAIDSの認識以来、広範な研
究はこの病気の理解において実質的な進歩をもたらし
た。病原性ウイルス（HIV）は同定され、そして伝染の
主要な道筋は性的接触および血液産生物の交換であるこ
とが示された［カラン（Curran）ら、1985、サイエンス
（Science）、229:1352］。HIVの多数の分離物のゲノム
のヌクレオチド配列は決定され、そしてウイルスの分子
生物学は集中的に研究されている。しかしながら、多く
の研究は感染した個体のウイルスの複製およびこの病気
の病原性におけるその役割を明らかにすることにおいて
なされなくてはならない。
ヒトの免疫欠損ウイルス、HIV−１およびHIV−２は、
レトロウイルスのレンチウイルスのサブクラスの構成員
である［ゴンダ（Gonda）ら、1985、サイエンス（Scien
ce）、227:173;ソニゴ（Sonigo）ら、1985、細胞（Cel
l）、42:369］。また、このサブクラスにおいて、関連
するサルの免疫欠損ウイルスが存在する［SIV;ダニエル
（Daniel）ら、1985、サイエンス（Science）、228:120
1］。ヒトおよびサルの免疫欠損ウイルスは同様な形態
を共有する。ウイルス粒子は、ウイルスRNAゲノム［ラ
ブソン（Rabson）およびマーチン（Martin）、1985、細
胞（Cell）、40:477］を含むカプシドのタンパク質（ウ
イルスのgag遺伝子によりエンコードされる）から構成
された内部のコアを含有する。中央のコアは、ウイルス
的にエンコードされるエンヴェロープの糖タンパク質を
含有する脂質エンヴェロープにより取り囲まれている。
効率よい複製に要求されるウイルスでエンコードされる
酵素、例えば、逆トランスクリプターゼおよびインテグ
ラーゼ（pol遺伝子によりエンコードされる）は、ま
た、ウイルス粒子中に組み込まれる。
HIVおよびSIVのゲノムのヌクレオチド配列の分析にお
いて、これらのウイルスは、また、明確なゲノムの有機
化（第１図）、ならびにかなりのDNA配列の相同性［チ
ャクラバルチ（Chakrabarti）ら、1987、ネイチャー（N
ature）、328:543;フランチニ（Franchini）ら、1987、
ネイチャー（Nature）、328:539］を共有することが示
された。ほぼ10kbのゲノムは、ウイルスの複製のための
調節セグメント、ならびに、それぞれ、コアタンパク
質、逆トランスクリプターゼ−プロテアーゼ−エンドク
ヌレアーゼ、およびエンヴェロープ糖タンパク質の遺伝
情報を指定するgag、polおよびenv遺伝子を含有する、
フランキングの長い末端の反復（LTP）配列からなる。
これらのウイルスは、また、少なくとも６つの追加の遺
伝子を含有し、それらのあるものは既知の調節機能を有
する。
最後に、ヒトおよびサルの免疫欠損ウイルスは、共通
の生物学的性質、例えば、細胞変性作用、CD4を有する
細胞のための屈性、および、最も重要なことには、ヒト
（HIV−１およびHIV−２）またはヒト以外の霊長類（SI
V）における長期間の持続性の感染および慢性の免疫欠
損の病気を誘発する能力を共有する。HIVとSIVとの間の
類似性は、免疫欠損の病気の病原性および防止の研究の
ためのモデルの系として、アカゲザルのSIVの感染の開
発に導いた。
HIVワクチンのために全ウイルスの使用では明らかな
困難が存在する。弱毒化ウイルスがビルレンスに復帰し
うることの懸念、および殺したウイルスの調製物の不完
全な不活性化の危険、ならびに血清陰性の個体の中にHI
Vゲノムを導入することに気が進まないことは、感染の
防止について生きている弱毒化または殺したHIVワクチ
ンの使用に対して議論された。
現在考慮されているAIDSは可能な組み換えアプローチ
の範囲にまたがる；すべてではないが、多数は免疫原と
してエンヴェロープ糖タンパク質のすべてまたは一部分
の使用に頼る。しかしながら、今日まで試験した組み換
えワクチンの多くは失望した結果を生じた。例えば、エ
ンヴェロープ糖タンパク質から成るサブユニットのワク
チンを使用してチンパンジーを免疫化したとき、生体外
でウイルスを中和することができるHIVに対する特異的
体液免疫応答が引きだされた；しかしながら、この免疫
化はHIV感染から動物を保護することができなかった
［バーマン（Berman）ら、1988、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci）USA、85:5200−5204］。チンパ
ンジーにおいてHIVの感染のHIVの予防のためのワクチン
として、HIVエンヴェロープ糖タンパク質を発現する生
きている組み換えワクシニアウイルスの使用は、また、
不成功であった。これらの組み換え体により感受性細胞
の感染は、エンヴェロープのポリペプチドの通常の合
成、グリコシル化、処理、および膜の移送を生ずる［チ
ャクラバルチ（Chakrabarti）ら、1986、ネイチャー（N
ature）、320:535;フ（Hu）ら、1986、ネイチャー（Nat
ure）、320:537］。遺伝子産生物はAIDSの患者からの血
清抗体により認識することができ、そしてCD4細胞表面
エピトープを発現する細胞とのシンシチウムの形成を仲
介することが示された［リフソン（Lifson）ら、1986、
ネイチャー（Nature）、323:725］。これらの組み換え
体を使用するいくつかの種のワクチン接種は、菌株特異
的ヒトの免疫応答ならびに細胞仲介応答を誘発したフ
［（Hu）ら、1986、ネイチャー（Nature）、320:537;チ
ャクラバルチ（Chakrabarti）ら、1986、ネイチャー（N
ature）、320:535;キエニイ（Kieny）ら、1986、バイオ
テクノロジー（Biotechnology）、４:790;ザーリング
（Zarling）ら、1986、ネイチャー（Nature）、323:34
4;（Hu）ら、1986、ネイチャー（Nature）、328:721;ザ
グリー（Zagury）ら、1987、ネイチャー（Nature）、32
6:249;ザグリー（Zagury）ら、1987、ネイチャー（Natu
re）、322:728］。それにもかかわらず、これらの免疫
応答にかかわらず、これらのワクチンはHIVによる感染
からチンパンジーを保護することができなかった［（H
u）ら、1986、ネイチャー（Nature）、328:721］。これ
らの初期のワクシニアの失敗は種々の因子に帰すること
ができる。ワクシニアの組み換え体の免疫原性は最適で
はなかったであろう；事実、組み換え体はチンパンジー
において低い抗体力価を誘発した。確かに、これらのワ
クチンが単一のHIV−１のポリペプチドのみの発現を誘
発するという事実は、それらが保護の免疫応答を刺激す
る最大の可能性をもたないことがあることを示唆する。
さらに、AIDSのワクチンを評価するためのチンパンジー
の使用はそれ自体、チンパンジーとして、問題であり、
それらはHIVで感染することができるが、AIDSを発生し
ない［アルター（Alter）ら、1984、サイエンス（Scien
ce）、226:549;フルツ（Fultz）ら、1986、ウイルス学
誌（J.Virology）、58:116］。
AIDSのワクチンの開発に対する組み換えのアプローチ
のいずれかに対する潜在的欠点は、それらは免疫原とし
て単一のHIV抗原、最も通常にはエンヴェロープ糖タン
パク質の使用に頼ってきた。生きている弱毒化したまた
は殺した全ウイルスの使用に基づく他の病気（例えば、
ポリオ、はしか、おたふくかぜおよび狂犬病）のための
伝統的ワクチンのアプローチの過去における成功は、抗
原の提示が保護的免疫応答の誘発において極めて重要で
あること示唆する。
組み換えDNA技術における進歩は、個々の抗原ばかり
でなく、かつまた欠損非自己増殖性ウイルス様粒子の合
成のために異種の発現系の使用を可能とすることある。
ある種のウイルスのカプシドのタンパク質は対応するウ
イルスに形態学的および免疫学的に類似する粒子にアセ
ンブルすることができる。例えば、生体外で合成したい
くつかのピコルナウイルスのP1前駆体は個々のカプシド
のタンパク質に処理することができ、次いでこれらのタ
ンパク質を免疫反応性ビリオン様タンパク質にアセンブ
ル（assemble）することができる［ニックリン（Nickli
n）ら、1986、バイオテクノロジー（Biotechnology）
４:33;パルメンバーグ（Palmenberg）ら、1979、ウイル
ス学誌（J.Virology）、32:770;シー（Shih）ら、197
8、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、
75:5807;ハネカク（Hanecak）ら、1982、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、79:3973;グルブマ
ン（Grubman）ら、1985、ウイルス学誌（J.Virolog
y）、56:120］。いくつかの組み換え体の発現系中の生
体内で発現されたカプシドのタンパク質の自己アセンブ
リー（self−assembly）は、また、報告された。例え
ば、ヒトのＢ型肝炎は酵母菌細胞中で発現されるとき、
ポリペプチドはヒトの血漿から分離したものに外観が類
似する粒子にアセンブルする［バレンズエラ（Valenzue
la）ら、1982、ネイチャー（Nature）、298:347］；こ
れらの粒子はいくつかの種における抗Ｂ型肝炎抗体の産
生を刺激し、そしてウイルスの対抗からチンパンジーを
保護することができる［マクアレーア（McAleer）ら、1
984、ネイチャー（Nature）、307:178］。他の例におい
て、ウシ乳頭腫ウイルス/CPV組み換えプラスミドで形質
転換したネズミの細胞中のイヌのパルボウイルス（CP
V）カプシドのタンパク質VP1およびVP2の同時発現（coe
xpression）は、自己アセンブリーするウイルス様粒子
の形成を生ずることが示された［マザラ（Mazzara）
ら、1986、ワクチンに対する現代のアプローチ（Modern
Approch to Vaccines）、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー、コールド・ハーバー（Cold
Spring Harbor Laboratory）、ニューヨーク;R.M.チ
ャノック（Chanock）およびR.A.ラーナー（Lerner）
（編）、pp.419−424;マザラ（Mazzara）ら、米国特許
出願第905,299号、1986年９月８日提出］；感受性のイ
ヌのワクチン接種に使用するとき、これらの空のカプシ
ドはCPVの抵抗に対して保護することができる免疫応答
を誘発した。最後に、バキュロの発現ベクターを使用し
てスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiper
da）細胞中で発現されたHIV−１ p55gag前駆体のポリ
ペプチドは、細胞の培地中に分泌されるウイルス様粒子
にアセンブルすることが示された［ゲイセン（Gheyse
n）ら、1988、新しいワクチンに対する現代のアプロー
チ（Modern Approaches to New Vaccines）、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド
・ハーバー（Cold Spring Harbor Laboratory）、ニ
ューヨーク、９月14〜18日、アブストラクトNo.72］。
発明の要約 本発明は、生体内または生体外で欠損非自己増殖性ウ
イルス粒子に自己アセンブリーすることができる異種ウ
イルスの少なくとも２つの異なるポリペプチドを発現す
ることができる、組み換えウイルスのベクター、およお
び組み換えウイルスを産生する方法に関する。本発明
は、また、親ウイルスで生体内または生体外において組
み換えて組み換えウイルスのベクターを産生する中間体
のDNAベクター、および組み換えウイルスのベクターで
宿主をワクチン接種して、相関関係のある異種病原性ウ
イルスに対して保護的免疫性を誘発する方法に関する。
さらに、本発明は、組み換えウイルスのベクターにより
産生された、欠損非自己増殖性ウイルス粒子、例えば、
HIV、SIV、またはピコルナウイルスに関する；これらの
ウイルス粒子は分離し、そしてそれら自体、病原性ウイ
ルスに対してワクチン接種するための、あるいは治療の
目的、例えば、感染した個体において免疫応答を増強す
るための、あるいは治療剤、例えば、細胞障害性薬物を
特異的細胞の型への送達をターゲッティングするため
の、免疫原として使用することができる。
図面の簡単な説明 第１図は、サルの免疫欠損ウイルス（SIV）およびヒ
トの免疫欠損ウイルス（HIV）の同様なゲノムの有機化
を示す。
第２図は、ワクシニアウイルス中のSIVmac251のgagお
よびプロテアーゼの挿入および発現のためのプラスミド
ベクターである、pAbT4592の構成を示す。pAbT4592は、
ワクシニアHind III Ｍ領域中の組み換えを指令するた
めのワクシニアDNAによりフランキングされた、ワクシ
ニア40Kプロモーターの制御下にgag−prot遺伝子を含有
する。ベクターDNAは、ワクシニアの組み換え体の選択
のための29Kの宿主−領域遺伝子、およびE.coli中の増
殖および選択のためのバクテリアのレプリコンおよびア
ンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。
第３図は、ワクシニアウイルス中のSIVmac251のenvの
挿入および発現のためのプラスミドベクターである、pA
bT4593の構成を示す。pAbT4593は、ワクシニアHind III
Ｍ領域中の組み換えを指令するためのワクシニアDNA
によりフランキングされた、ワクシニア40Kプロモータ
ーの制御下にenv遺伝子を含有する。ベクターDNAは、ワ
クシニアの組み換え体の選択のための29Kの宿主−領域
遺伝子、およびE.coli中の増殖および選択のためのバク
テリアのレプリコンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子を
包含する。
第４図は、ワクシニアウイルス中のSIVmac251のenvお
よびgag−protの挿入および発現のためのプラスミドベ
クターである、pAbT4597の構成を示す。pAbT4597は、ワ
クシニア30Kプロモーターの制御下にgag−prot遺伝子、
およびワクシニア40Kプロモーターの制御下にenv遺伝子
を含有する。これらの遺伝子は、ワクシニアHind III
Ｍ領域中の組み換えを指令するためのワクシニアDNAに
よりフランキングされている。ベクターDNAは、ワクシ
ニアの組み換え体の選択のための29Kの宿主−領域遺伝
子、およびe.coli中の増殖および選択のためのバクテリ
アのレプリコンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含
する。
第５図は、ワクシニアウイルス中のHIV−1gagの挿入
および発現のためのプラスミドベクターである、pAbT16
4の構成を示す。pAbT164は、ワクシニア7.5Kプロモータ
ーの制御下にHIV gag遺伝子、DNA領域はワクシニア中
の組み換えを指令するためのワクシニアTK遺伝子をフラ
ンキングする、ワクシニアの組み換え体を選択するため
のワクシニアBamFプロモーター、およびE.coli中の増殖
および選択のためのバクテリアのレプリコンおよびアン
ピシリン抵抗性遺伝子を含有する。
第６図は、ワクシニアHind III Ｍ領域中の組み換え
を指令するためのワクシニアDNAによりフランキングさ
れた、ワクシニア40Kプロモーターの制御下にHIV−１の
env遺伝子の挿入および発現のためのプラスミドベクタ
ーである、pAbT4603の構成を示す。ベクターDNAは、ワ
クシニア組み換え体の選択のための29K宿主−領域遺伝
子、およびE.coli中の増殖および選択のためのバクテリ
アのレプリコンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子を含有
する。
第７図は、ワクシニア中のHIV−１のenvおよびgag−p
rotの挿入および発現のためのプラスミドベクターであ
る、pAbT621の構成を示す。pAbT621は、ワクシニア40K
プラスミド制御下にHIVのenv遺伝子、およびワクシニア
30Kプラスミドの制御下にHIVのgag−prot遺伝子を含有
する。これらの遺伝子は、ワクシニアHind III Ｍ領域
中の組み換えを指令するためのワクシニアDNAによりフ
ランキングされている。ベクターDNAは、ワクシニアの
組み換え体の選択のための29K宿主−領域遺伝子、およ
びE.coli中の増殖および選択のためのバクテリアのレプ
リコンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。
発明の詳細な説明 １、ウイルスの抗原をエンコードする遺伝子 欠損非自己増殖性ウイルス粒子に自己アセンブリーす
ることができるウイルスのポリペプチドをエンコードす
る遺伝子は、DNAウイルスのゲノムのDNAまたはRNAウイ
ルスのゲノムのcDNAからか、あるいは遺伝子を含有する
入手可能なサブゲノムのクローンから得ることができ
る。これらの遺伝子は、ウイルスのカプシドのタンパク
質（すなわち、ウイルスのタンパク質の外殻を構成する
タンパク質）をエンコードするものおよび、エンヴェロ
ープドウイルス、例えば、レトロウイルスの場合におい
て、ウイルスのエンヴェロープ糖タンパク質をエンコー
ドする遺伝子を包含する。追加のウイルスの遺伝子は、
また、カプシドのタンパク質の成熟および粒子の自己ア
センブリーのために要求される。これらは、カプシドの
タンパク質またはエンヴェロープ糖タンパク質のプロセ
シングの原因となるウイルスのプロテアーゼをエンコー
ドすることができる。
一例として、ピコルナウイルスのゲノムの構造はよく
特性決定されてきており、そしてヴィリオンのアセンブ
リーに導くタンパク質の合成のパターンは明瞭である
［ルエッカート（Rueckert）、R.,ウイルス学（Virolog
y）（1985）、B.N.フィールズ（Fields）ら編、レイブ
ン・プレス（Raven Press）、ニューヨーク、pp.705−
738］。ピコルナウイルスにおいて、ウイルスのカプシ
ドのタンパク質は、単一の長いリーディングフレームを
含有するRNAゲノムによりエンコードされ、そして細胞
のプロテアーゼおよびウイルスのプロテアーゼの組み合
わせにより成熟カプシドタンパク質を生ずるようにプロ
セシングされるポリタンパク質の一部分として合成され
る。こうして、カプシドの自己アセンブリーに要求され
るピコルナウイルスの遺伝子は、カプシドの構造遺伝子
およびそれらの成熟に要求されるウイルスのプロテアー
ゼの両者を包含する。
自己アセンブリー性カプシドのタンパク質をエンコー
ドする遺伝子を分離することができるウイルスの他の例
は、レトロウイルスのHIVおよびSIVである。これらのウ
イルスのゲノムの構造は、よく特性決定され、そして第
１図に線図的に表されている。２つのウイルスの遺伝子
の有機化は顕著に類似し、そしてHIVの構造遺伝子の各
々の相同体はSIV中に存在する。
HIVおよびSIVのgag遺伝子はカプシドのタンパク質を
エンコードする。ピコルナウイルスのカプシドのタンパ
ク質のように、HIVおよびSIVのgagタンパク質は前駆体
のポリペプチドとして合成され、このポリペプチドは引
き続いて、ウイルスのプロテアーゼにより、成熟カプシ
ドのタンパク質にプロセシングされる。しかしながら、
gag前駆体のポリペプチドはタンパク質のプロセシング
の不存在下にウイルス様粒子に自己アセンブリルするこ
とができる［ゲイセン（Gheysen）ら、1988、新しいワ
クチンに対する現代のアプローチ（Modern Approaches
to New Vaccines）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー、コールド・ハーバー（Cold Spri
ng Harbor Laboratory）、ニューヨーク、９月14〜18
日、アブストラクトNo.72］。ピコルナウイルスのカプ
シドと異なり、HIVおよびSIVのカプシドは、ウイルスの
糖タンパク質を含有する、ゆるい膜のエンヴェロープに
より取り囲まれている。これらはウイルスのenv遺伝子
によりエンコードされる。
実施例は、本発明の組み換えウイルス中の発現のため
に選択されたSIVおよびHIVの遺伝子の使用を例示する。
これらの遺伝子およびそれらのタンパク質は、表１に概
略的に示されている。env、gagおよびpolの遺伝子から
の誘導された３つの主要なヴィリオンは前駆体のポリペ
プチドとして合成され、これらのポリペプチドは引き続
いて切断されて表１に概略的に示す成熟ポリペプチドを
生ずる。
２、親ウイルス レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイル
ス、およびポックウイルスを包含する、ある数のウイル
スは、異種抗原の発現のための生きているウイルスのベ
クターとして開発された［セプコ（Cepko）ら、1984、
細胞（Cell）、37:1053−1062;モリン（Morin）ら、198
7、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、
84:4626−4630;ロウウェ（Lowe）ら、1987、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、84、3896−390
0;パニカリ（Panicali）およびパオレッティ（Paolett
i）、1982、プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA、79:4927−4931;マクケット（Mackett）ら、19
82、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、
79:7415−7419］。実施例はポックスウイルスの族の使
用を例示する。好ましいボックスウイルスはワクシニア
ウイルス、すなわち、小さいポックスに対するワクチン
として数年間使用されてきている比較的良性のウイルス
である。ワクシニアウイルスは感染性真核生物のクロー
ニングベクターとして開発され「パオレッティ（Paolet
ti）およびパニカリ（Panicali）、米国特許第4,603,11
2号］および組み換えワクシニアウイルスはいくつかの
実験系におけるワクチンとして首尾よく使用されてき
た。ウイルスは非腫瘍遺伝子と考えられ、よく特性決定
されたゲノムを有し、そして感染性を損失しないで大量
の外来DNAを有することができる［マクケット（Macket
t）、M.およびG.L.スミス（Smith）、1986、ジャーナル
・オブ・ゼネラル・ビロロジー（J.Gen.Virol.）、67:2
067］。
３、親ウイルスとの生体内組み換えのためのDNAベクタ
ー 本発明の方法に従い、ウイルス粒子にアセンブルする
ことができるポリペプチドの遺伝情報を指定するウイル
スの遺伝子を、親ウイルスのゲノムの中に、親ウイルス
のタンパク質の正常の補体の発現と一緒に、そのウイル
スによりそれらが発現されうるような方法で、挿入され
る。これは、まず、親ウイルスとの生体内の組み換えの
ためのDNA供与体ベクターを構成することによって達成
することができる。
一般に、DNA供与体ベクターは、次の要素を含有す
る： ｉ）ベクターを原核生物の宿主中で増幅することができ
るように、複製の原核生物の由来、 ii）ベクターを含有する原核生物の宿主細胞の選択を可
能とするマーカーをエンコードする遺伝子（例えば、抗
生物質の抵抗性をエンコードする遺伝子）、 iii）少なくとも２つの異種ウイルス遺伝子（例えば、S
IV、HIV、またはピコルナウイルスの遺伝子）DNA配列、
各遺伝子は遺伝子の発現を指令することができる転写プ
ロモーターに隣接して位置する、および iv）異種遺伝子が挿入され、要素iiiの構成体をフラン
キングする、親ウイルスのベクターのゲノムの領域に対
して相同性であるDNA配列。
ポックスウイルスの中に多数の外来遺伝子を導入する
ための供与体プラスミドを構成する方法は、米国特許出
願第910,501号、発明の名称「仮性狂犬病のワクチ
ン」、その教示を引用によってここに加える、に記載さ
れている。一般に、供与体ベクターの構成のためのすべ
てのウイルスのDNA断片は、転写プロモーターを含有す
る断片およびその中に外来遺伝子を挿入すべき親ウイル
スのゲノムの領域に対して相同性の配列を含有する断片
を包含し、ゲノムのDNAまたはクローニングしたDNA断片
から得ることができる。供与体のプラスミドは、１価、
３価または多価であることができる（すなわち、１また
は２以上の挿入された外来遺伝子配列を含有することが
できる）。
供与体ベクターは、好ましくは、挿入された外来DNA
を含有する組み換えウイルスの同定を可能とするマーカ
ーをエンコードする、追加の遺伝子を含有する。いくつ
かの型のマーカー遺伝子を使用して、組み換えウイルス
の同定および分離を行うことができる。これらは次のも
のを包含する：抗生物質または化学的抵抗性をエンコー
ドする遺伝子［例えば、参照、スピロポウロス（Spyrop
ouls）ら、1988、ウイルス学誌（J.Virology）、62:104
6;ファルクナー（Falkner）およびモス（Moss）、198
8、ウイルス学誌（J.Virology）、62:1849;フランケ（F
ranke）ら、1985、モレキュラー・アンド・セルラー・
バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、５:19818］、ならび
に比色アッセイにより組み換えウイルスのプラークの同
定を可能とする遺伝子、例えば、E.coliのlacZ遺伝子
［パニカリ（Panicali）ら、1986、遺伝子（Gene）47:1
93−199］。
組み換えワクシニアウイルスの選択の方法は、単一の
ワクシニア−エンコードデッド機能、すなわち、29K宿
主−領域遺伝子産生物に頼る［ギラード）Gillard）
ら、1986、プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA、83:5573］。この方法は米国特許出願第205,18
9号、1988年６月20日提出、発明の名称「組み込えポッ
クスウイルスを選択する方法」、その教示を引用によっ
てここに加える、に記載されている。簡単に述べると、
ウイルスのゲノムのHind III K/M領域に位置する、29K
遺伝子の中に突然変異を含有するワクシニアウイルス
を、生体内の組み換えのための宿主として使用する。29
Kの突然変異は、ある種の宿主細胞、例えば、RK13（ラ
ットの腎臓）細胞上のこのウイルスの増殖を防止する。
外来遺伝子の挿入のためのプラスミドは、突然変異の遺
伝子を収容することができるワクシニアのDNA配列を含
有する；これらの配列は、また、Hind III Ｍ領域中の
突然変異遺伝子の部位への組み換えを指令する。こうし
て、組み換えワクシニアウイルは、RK13細胞中で増殖す
る能力を取り戻し、そしてこの基準でこれらの細胞上で
増殖できない非組み換え親ウイルスから分離することが
できる。
好ましいワクシニアウイルスとの組み換えのための好
ましいベクターは、次のものからなる： ａ、ワクシニアウイルス中で隣接する遺伝子の発現を指
令することができる、１または２以上の転写プロモータ
ー（例えば、ワクシニア7.5K、30K、40K、11KまたはBam
Fプロモーターまたはこれらのプロモーターの修飾され
た変異型、各は次のものに連鎖している； ｂ、問題のウイルスの抗原をエンコードする１または２
以上の構造遺伝子、各々は転写プロモーターの制御下に
ある； ｃ、組み換え親ウイルスの選択のためのマーカー、これ
は次のものからなることができる： （１）選択可能なマーカーをエンコードする遺伝子（例
えば、E.coliのlacZ遺伝子）に連鎖した転写プロモータ
ー（例えば、ワクシニアウイルスのBamFプロモータ
ー）；または （２）ウイルスの宿主−領域または他のウイルスの増殖
促進機能を回復する親ウイルスの構造遺伝子（例えば、
ワクシニアの29Kポリペプチド）； ｄ、要素ａ〜ｃの構成体をフランキングする親ウイルス
のある領域と相同性のDNA配列（例えば、ワクシニアTK
またはHind III Ｍ配列）； ｅ、プラスミドと形質転換したバクテリア細胞の選択の
ためのマーカーを包含する原核生物の宿主中の複製のた
めのベクターのバックボーン（例えば、抗生物質抵抗性
をエンコードする遺伝子）。
４、ウイルスのゲノム中の外来DNA配列の組み込みのお
よび組み換え体の分離 感染した細胞中の供与体プラスミドDNAとウイルスのD
NAとの間の相同性組み換えは、所望の要素を組み込んだ
組み換えウイルスを形成する。生物内の組み換えのため
に適当な宿主細胞は、一般に、ウイルスにより感染しそ
してプラスミドベクターによりトランスフェクションす
ることができる、真核生物の細胞である。ポックスウイ
ルスとともに使用するために適当な細胞の例は、ニワト
リの胚の線維芽細胞、HuTK143（ヒト）細胞、およびCV
−１およびBSC−40（両者はサルの腎臓）細胞である。
ポックスウイルスによる細胞の感染およびプラスミドベ
クターによるこれらの細胞のトランスフェクションは、
この分野において標準の技術により［パニカリ（Panica
li）およびパオレッティ（Paoletti）、米国特許第4,60
3,112号］。
生体内の組み換え後、組み換え組み換えウイルスの子
孫をいくつかの技術の１つにより同定することができ
る。例えば、DNA供与体ベクターが外来遺伝子を親ウイ
ルスのチミジンキナーゼ（TK）遺伝子の中に挿入するた
めに設計された場合、組み込まれたDNAを含有するウイ
ルスはTK-であり、そしてこの基準に基づいて選択する
ことができる［マケット（Mackett）ら、1982、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、79:741
5］。あるいは、マーカーまたはインジケーター遺伝子
をエンコードする遺伝子と問題の外来遺伝子との同時組
み込みを、前述したように、使用して組み換えの子孫を
同定することができる。１つの好ましいインジケーター
遺伝子はE.coliのlacZ遺伝子である：ベータ−ガラクト
シダーゼを発現する組み換えウイルスは、その酸素のた
めの発色性基質を使用して選択することができる［パニ
カリ（Panicali）ら、1986、遺伝子（Gene）47:193］。
組み換えワクシニアウイルスとともに使用するための第
２の好ましくはインジケーター遺伝子はワクシニア29K
遺伝子である：野生型29K遺伝子−エンコーデッド機能
を発現する組み換えウイルスはRK13細胞上の増殖により
選択することができる。
実施例においてより詳細に記載するように、HIVまた
はSIV遺伝子を含有する１価または２価の供与体プラス
ミドを、ワクシニアのTK遺伝子またはHind III Ｍ領域
中に組み換え、そして組み換えウイルスを前述したよう
に選択した。
５、組み換えウイルスにより発現されたウイルスの抗原
の特性決定 いったん組み換えウイルスが同定されると、種々の方
法を使用して挿入された遺伝子によりエンコードされる
ポリペプチドの発現をアッセイすることができる。これ
らの方法は、次のものを包含する：黒色プラークアッセ
イ（ウイルスのプラーク上で実施するその場の酵素のイ
ムノアッセイ）、ウェスタン・ブロット分析、放射線免
疫沈澱（RIPA）、および酵素イムノアッセイ（EIA）。
ウイルスの病原体により発現された抗原に対する抗体
は、容易に入手可能であるか、あるいはこの分野におい
て知られている方法に従いつくることができる。例え
ば、ヒトまたはサルの免疫欠損ウイルスについて、抗体
は（ａ）親ウイルス/SIV組み換え体について、SIVで感
染したアカゲザルからの血清であるすることができ；そ
して（ｂ）親ウイルス/HIV組み換え体について、HIVで
感染したヒトの患者からの血清、または特異的HIVポリ
ペプチドに対して向けられた商業的に入手可能モノクロ
ーナル抗体であることができる。
６、ウイルス粒子の形成 前の節に記載した発現の分析を使用して、挿入された
異種ウイルスの遺伝子によりエンコードされたポリペプ
チドの合成を確証することができるが、これらのポリペ
プチドが、生体内または生体外で、欠損ウイルス粒子に
自己アセンブルするかどうかという問題を処理しない。
２つの実験のアプローチを使用してこの問題を検査する
ことができる。
第１のアプローチは、１または２以上のウイルスのポ
リペプチドを発現する組み換えウイルスで感染した細胞
のリゼイトの電子顕微鏡検査により視的に検査すること
である。下に報告する実験において、例えば、SIVおよ
び／またはHIVのgag、env＋gag、またはenv＋gag＋pol
の遺伝子を発現するワクシニアの組み換え体は、欠損の
レトロウイルスの粒子を形成した;gagおよびenvのポリ
ペプチドを同時発現する組み換え体で感染した細胞にお
いて、粒子のエンヴェロープは、粒子の表面上の糖タン
パク質の「スパイク」の存在により示されるように、エ
ンヴェロープの糖タンパク質を含有した。粒子の表面上
のレトロウイルスのエンヴェロープ糖タンパク質の存在
は、免疫金の電子顕微鏡検査により、エンヴェロープ糖
タンパク質の１つに対して向けられたモノクローナル抗
体を使用して実証することができる。
ウイルスのポリペプチドを発現する組み換えウイルス
により産生された欠損ウイルス粒子をさらに特性決定す
るために、これらの粒子は、高い速度遠心により、［35
S］−メチオニンの存在下に組み換えウイルスで感染し
た細胞の培地から分離することができる。培地の遠心か
ら生ずる沈澱を再懸濁し、そして沈澱および上澄み液の
両者を適当な抗血清で免疫沈澱させて、各分画の中に存
在するウイルスのポリペプチドを分析することができ
る。例えば、HIVまたはSIVのポリペプチドを発現する組
み換え体の場合において、ヒト抗hic抗血清（ワクシニ
ア/HIV組み換え体について）またはアカゲザル抗SIV抗
血清（ワクシニア/SIV組み換え体について）をこれらの
分析に使用することができる。
HIVまたはSIVのenvおよびgagポリペプチドを同時発現
する組み換えウイルスの場合において、沈澱はレトロウ
イルスの粒子が形成する場合エンヴェロープおよびコア
の両者のポリペプチドを含有するであろう。実施例に記
載するように、この実験をHIVまたはSIVのenvおよびgag
のポリペプチドを同時発現するワクシニアの組み換え体
を使用して実施したとき、沈澱は、これらのポリペプチ
ドが欠損レトロウイルス粒子にアセンブリングした場
合、envおよびgagの両者のポリペプチドを含有した。対
照的に、上澄み液はエンヴェロープ糖タンパク質gp120
のみを含有した。
培地の遠心から生ずる沈澱中の物質をさらに特性決定
するために、沈澱を再懸濁し、そしてスクロースの勾配
で分析した。次いで、勾配を分画し、そして分画を適当
な抗血清で免疫沈澱させた。これらの実験は、沈澱が欠
損ウイルス粒子について期待する密度においてバンドを
含有するかどうかをを示す。
これらの方法を、また、使用して、同一の感染した細
胞の中に存在する２つの異なるウイルスにより指令され
たウイルスのポリペプチドの発現が、欠損ウイルス粒子
を産生するがどうかを決定することができる。例えば、
これらの実験は、gagを発現する１つの組み換え体およ
びenvを発現する第２の組み換え体で生体外で同時感染
した細胞を使用して、実施することができる。envおよ
びgagの両者のポリペプチドの単一の細胞中の同時の発
現は、単一の２価の組み換えウイルスによるか、あるい
は２つの異なる１価のウイルスにより指令されるにかか
わらず、ウイルスでエンコードされたエンヴェロープ糖
タンパク質を含有するエンヴェロープにより取り囲まれ
た、gagポリペプチドからなるタンパク質のコアを含有
する欠損レトロウイルス粒子を形成することが期待され
るであろう。
７、ワクチン 欠損非自己増殖性ウイルス粒子に自己アセンブリルす
ることができる異種ウイルスの抗原を発現する生きてい
る組み換えウイルスのベクターは、異種の欠損ウイルス
粒子を発現するために使用するウイルスのベクターがワ
クチンした宿主を感染するが、その宿主中で有意の病気
を引き起こない場合、感染の感受性のヒトまたは動物を
ワクチン接種するために使用することができる。このよ
うな温和なベクターの例は、ある種のポックスウイル
ス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスを包含す
る。例えば、生きている組み換え体ワクシニアウイルス
でワクチン接種した後、宿主内でウイルスの複製が起こ
る。複製の間、ウイルスの遺伝子は組み換えウイルスの
遺伝子の補体と一緒に発現される。こうして、免疫化後
の２週の間、生きている組み換えウイルスが複製されて
いるとき［フェンナー（Fenner）、F.ウイルス学（Viro
logy）、フィールズ（Fields）編、レイブン・プレス、
ニューヨーク、1985、pp.661−684］、ウイルスの抗原
は宿主の免疫系に、真性のウイルスの感染における抗原
の提示を密接にまねる方法で、すなわち、自然ウイルス
に極めて類似する欠損非自己増殖性ウイルス粒子とし
て、提示することができる。遊離の粒子としておよび組
み換えウイルスで感染した細胞に関連して反復して提示
されたウイルスの抗原は、免疫系をプライミングしてウ
イルスの感染の初期の事象の間、ウイルスを認識しそし
てそれを排除する潜在的能力を有することができる。
あるいは、これらの組み換えベクターのウイルスによ
り産生された欠損ウイルス粒子は、組み換えベクターの
ウイルスで生体外で感染した細胞から、およびこれらの
感染した細胞の培地から分離し、そしてウイルスの感染
に対して感受性の個体のワクチン接種のためにそれら自
体使用することができる。これらの粒子は、自然のウイ
ルスに類似するが、感染性ウイルスの遺伝子物質を含有
しないであろう。結局、それらは普通の殺したウイルス
のワクチン調製物の利点を提供する：ワクチン接種宿主
の免疫系に免疫原性抗原を確実に提示する能力。同時
に、このような粒子は感染の防止のためのワクチンとし
て殺したウイルスの使用に対する主要な欠点を回避し、
これらの欠点は殺したウイルスの調製物の不完全な不活
性化の危険性および、ある種のウイルス、例えば、レト
ロウイルスの場合についてのように、血清陰性の個体の
中への完全なウイルスのゲノム（例えば、HIVゲノム）
を導入することに気が進まないことを包含する。
これらの欠損ウイルス粒子を利用するワクチン組成物
は、一般に、製剤学的に許容されうるベヒクル中の免疫
化量のウイルス粒子からなるであろう。ワクチンは投与
配合物と適合性の方法で、かつ治療学的に有効でありか
つ免疫原性であるような量で投与されるであろう。
最後に、精製した粒子は、生きている組み換えウイル
スとの組み合わせにおいて、合計のワクチン接種のプロ
トコルの一部分として、主要な免疫化剤として使用し、
次いで生きている組み換えウイルスでワクチン接種する
か、あるいは生きている組み換えウイルスで主要なワク
チン接種後に合計の免疫応答を促進するために使用する
ことができる。
８、欠損ウイルス粒子にアセンブリングすることができ
るウイルスの抗原を発現する組み換えウイルスの治療学
的使用；これらの組み換えウイルスにより産生された欠
損ウイルス粒子の治療学的使用 免疫化が感染に対して保護することができない場合、
前に感染した個体の免疫化は個体内のそのウイルスの潜
伏期間を延長することができる。長い潜伏期間により特
性決定されたウイルスの感染、例えば、HIVの感染の場
合においてとくに重要でありことがある。HIVウイルス
の感染と臨床的AIDSの発生の間の長いインキュベーショ
ン時間は、健康および病気による衰退期とともに持続す
る初期の感染に対する応答のためであることであろう。
そうである場合、レトロウイルス様粒子を産生するHIV
抗原／親ウイルス組み換え体で免疫化するか、あるいは
精製された粒子それら自体で免疫化することによって免
疫応答を促進することは、病気の発生を防止し、そして
感染性を減少することができる［ソーク（Salk）、198
7、ネイチャー（Nature）、327:473］。
９、ターゲテッド（targetted）薬物の送達のための欠
損ウイルス粒子の治療学的使用 欠損非自己増殖性ウイルス粒子は、また、ある種の薬
物（例えば、細胞障害性薬物、抗ウイルス剤）をウイル
ス受容体を有する細胞に送達するために使用することが
できる。このような薬物は、この分野において知られて
いる技術により、ウイルス粒子の外側にカップリングす
るか、あるいは標的細胞内に組み込み、そして標的細胞
に高い特異性で送達することができる。例えば、細胞障
害性薬物を欠損HIV粒子にカップリングし、そして高度
の特異性をもってCD4+T細胞に送達することができる。
なぜなら、これらの粒子上に存在するHIVエンヴェロー
プ糖タンパク質は特異的にかつ高い親和性でCD4分子に
結合するからである。同様に、ポリオウイルスは、例え
ば、咽頭および腸の細胞に優先的に結合し、こうしてこ
れらの細胞に対する特異的因子の送達を指令するために
使用することができる。
10、ウイルス様粒子の診断的使用 免疫原性のウイルス様粒子を使用してウイルスの感染
を診断することができる。粒子を使用して、ヴィリオン
上の種々のエピトープを確認するモノクローナル抗体お
よびポリクローナル抗血清のパネルをレイズ（raise）
することができる。これらのモノクローナル抗体および
／またはポリクローナル抗体は、イムノアッセイのため
に、個々にまたは一緒に捕捉抗体として使用して、尿、
血液または糞便中のウイルスの存在を検出することがで
きる。
あるいは、粒子それら自体はイムノアッセイのための
抗原として使用して、尿、血液または糞便中の抗体の存
在を検出することができる。とくに好ましいイムノアッ
セイは固相の免疫測定アッセイ（酵素の放射能の測定）
である。このようなアッセイにおいて、ウイルス様粒子
を固相上に固定化して免疫吸着性を提供する。固相の免
疫吸着の使用のための技術はこの分野において知られて
いる。
次の実施例によって、本発明をさらに説明する。
実施例 材料および方法 細胞およびウイルス E.coli菌株MC1061［カサダバン（Casadaban）および
コウヘン（Cohen）、1980、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、138:179］を、
すべてのプラスミドの増殖のための宿主として使用し
た。サルの腎臓の細胞系BSC−40［ブロックマン（Brock
man）およびナサンス（Nathans）、1974、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、71:942］、チミジ
ンキナーゼ欠損（TK−）ヒト細胞系Hu143TK−［バチェ
ッティ（Bacchetti）およびグラハム（Graham）、197
7、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、
74:1590］およびウサギ腎臓の細胞系RK13［ATCC＃CCL3
7;ベーレ（Beale）ら、1963、ランセット（Lancet）、
２:640］をワクシニアの感染およびトランスフェクショ
ンに使用した。
ワクシニアウイルス菌株NYCBH（ATCC＃VR−325）およ
び29K−lacZ＋菌株vABT33（参照、米国特許出願第205,1
89号、1988年６月10日提出、その教示を引用によってこ
こに加える）を、生体内の組み換えのための親ウイルス
として使用した。
酵素 制限酵素は、ニュー・イングランド・バイオラブス
（New England Biolabs）またはベーリンガー・マン
ヘイム（Boehringer Mannheim）から入手した。DNAポ
リメラーゼの大きい断片（クレノー）はユナイテッド・
ステイツ・バイオケミカル・コーポレーション（United
States Biochemical Corp.）から入手し、T4ポリメ
ラーゼはニュー・イングランド・バイオラブス（New E
ngland Biolabs）から入手し、そしてT4 DNAリガーゼ
はベーリンガー・マンヘイム（Boehringer Mannheim）
から入手した。
分子クローニングの手順 制限酵素の消化、DNA断片およびプラスミドの精製、
クレノーによるDNAの処理、T4 DNAポリメラーゼ、リガ
ーゼ、またはリンカーおよびE.coliの形質転換は、本質
的に記載したように実施した［マニアチス（Maniatis）
ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・ハーバー
（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールド・ス
プリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニュー
ヨーク、1982、ここに引用によって加える］。
ポリヌクレオチドの突然変異誘発は、ブランデイス大
学（Brandeis University）の生物学的から入手した合
成オリゴヌクレオチドを使用しあて、アマーシャム（Am
ersham）により供給した試薬して実施し、そしてそれら
の試薬を製造業者の指示に従い使用した。
ワクシニアウイルスの組み換え体の調製 ウイルスの感染、トランスフェクション、プラークの
精製およびウイルスの増幅は本質的に記載したように実
施した［スピロポウロス（Spyropoulos）ら、1988、ウ
イルス学誌（J.Virology）、62:1046］。29K＋組み換え
体を選択し、そしてRK13細胞上で精製した（参照、米国
特許出願第205,189号、1988年６月10日提出、その教示
を引用によってここに加える）。TK-組み換え体を選択
し、そして50ミリモルのブロモデオキシウリジンの存在
下に精製した。
ワクシニアのウイルスのゲノムの分析 DNAを記載したようにワクシニアウイルスで感染した
細胞から抽出し［エスポシト（Esposito）ら、1981、ジ
ャーナル・オブ・ビロロジカル・メソッズ（J.Virol.Me
thods）２:175］そして記載されているように制限酵素
の消化およびサザン・ハイブリダイゼーションにより分
析した［マニアチス（Maniatis）ら、分子クローニン
グ：実験室のマニュアル（Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー、
ラボラトリー、コールド・ハーバー（Cold Spring Ha
rbor Laboratory）、コールド・スプリング・ハーバー
（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、1982］。
タンパク質分析 黒色プラークのアッセイおよび免疫沈澱の分析は、本
質的に記載されているようにして実施した［スミス（Sm
ith）ら、1983、プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）USA、80:7155およびウィッテク（Wittek）ら、
1984、ウイルス学誌（J.Virology）、49:371］；参照、
また、米国特許出願第910,501号、1986年９月23日提
出、その教示を引用によってここに加える。黒色プラー
クおよび免疫沈澱のアッセイのために、全SIVに対する
アカゲザルのモノクローナル抗体、または全HIVに対す
るヒトの抗血清を使用した。免疫沈澱の分析のために、
ワクシニアで感染した細胞を［3H］−グルコサミンまた
は［35S］−メチオニンで標識した。
組み換え体のワクシニアに対して向けられたレトロウイ
ルスの粒子の形成の生物学的分析 野生型または組み換えワクシニアウイルスで感染した
BSC−40細胞を、免疫沈澱分析に使用したのと同一の標
識手順を使用して、［35S］−メチオニンで標識した。1
6〜18時間後、感染した細胞からの培地を集め、そして1
000rpmにおいて５分間清浄化した。生ずる上澄み液を24
Kにおいて90分間SW28ローターで遠心した。上澄み液を
除去し、そして生ずる沈澱を3mlのPBS（136ミリモルのN
aCl、2.7ミリモルのKCl、8.1ミリモルのNa2HPO4、1.5ミ
リモルのKH2PO4）中に再懸濁した。上澄み液および沈澱
からの試料を、前の節に記載するようにアカゲザル抗SI
V抗血清またはヒト抗HIV抗血清を使用して、免疫沈澱分
析にかけた。
BSC−40細胞を、前述したように、野生型または組み
換えワクシニアウイルスで10の多重度で16〜18時間感染
した。次いで、培地を除去し、そして感染した細胞をPB
SBamF中の0.2％のゼラチン中で２回洗浄した。
免疫金の着色のために、試料をPBS/ゼラチン中の10％
のヤギ血清中の４℃において30分間インキュベーション
し、次いでPBS/ゼラチン中で希釈した適当なモノクロー
ナル抗体中で60分間インキュベーションした。次いで、
試料をPBS/ゼラチン中で２回洗浄し、そして１％の胎児
仔ウシ血清、0.1％のアジ化ナトリウムおよび５％のヒ
ト抗体血清とともにPBS中で金（5nm）と接合したヤギ抗
マウスIgGの1:20の希釈物と60分間インキュベーション
した。細胞を再びPBS/ゼラチン中で洗浄した。
未処理または免疫金着色した細胞を0.1モルのソジウ
ムカコジレート（sodium cacodylate）緩衝液（pH7.
2）中の2.5％のグルタルアルデヒド中で一夜固定し、次
いで0.1モルのソルジウムカコジレート緩衝液（pH7.2）
中で２回洗浄した。次いで、試料を１％のOsO4/0.1モル
のカコジレート緩衝液（pH7.2）中で1.5時間固定し、次
いで0.1モルのカコジレート緩衝液（pH7.2）中で２回洗
浄した。次いで、試料を次の等級のアルコール中で各々
10分間脱水した:50。70、80、95、100（３×）。次い
で、試料をポリプロピレンオキシドで各５分間処理し、
次いでキャップをしないバイアル内のポリプロンオキシ
ド（４部）/epox812（６部）中で一夜処理した。次い
で、試料をepox812の中に埋め込み、そして36時間硬化
した。
ソーバル・ポーター・ブラム（Sorval porter Blu
m）MT−２超ミクロトームで1000Aで切片を切断し、アル
コール性酢酸ウラニルおよびサトウ（Sato）鉛着色［サ
トウ（Sato）、J.Elect.Mic.（日本）17:158−159］で
着色し、そしてJEOL電子顕微鏡で見た。
実施例1:SIV遺伝子を含有する組み換えプラスミドの構
成 この実施例は、ワクシニアウイルスと生体内組み換え
のためのSIV遺伝子を含有する組み換えプラスミドの構
成を例示する（生体内組み換え（IVR）ベクター）。プ
ラスミドpAbT4532B、pAbT4533、pAbT4536、pAbT4537、p
AbT4574、pAbT4578、pAbT4582B、pAbT4583およびpAbT45
89の構成および構造は、米国特許出願第205,454号、198
8年６月10日提出、に記載されている。プラスミドpAbT4
027の構成および構造は、米国特許出願第910,501号、19
86年９月23日提出、に記載されている。プラスミド4587
の構成および構造は、米国特許出願第229,343号、1988
年８月５日提出、に記載されている。前述の特許出願の
教示を引用によってここに加える。
pAbT4592（第２図）:pAbT4578（参照、米国特許出願
第205,454号、1988年６月10日提出）をKpn IおよびEcoR
Iで消化し、そして2221塩基対（bp）の断片を分離し
た。この断片をKpn IおよびEcoR Iで消化したpAbT4587
に結合して、pAbT4592を得た。pAbT4592はワクシニアウ
イルス中のSIVmac251gagおよびproteaseの挿入および発
現のためのベクターである。pAbT4592は、ワクシニアHi
nd III Ｍ領域によりフランキングされた、gag−prot
遺伝子をワクシニア40Kプロモーターの制御下に含有す
る。ベクターDNAは、ワクシニア組み換え体の選択のた
めの29K宿主−領域遺伝子、およびE.coli中の増殖およ
び選択のためのバクテリアの複製およびアンピシリン抵
抗性遺伝子を包含する。
pAbT4593（第３図）:pAbT4574（参照、米国特許出願
第205,454号、1988年６月10日提出）をKpn IおよびBamH
Iで消化し、そして2589bpの断片を分離した。この断片
をBamH Iで処理しそして仔ウシアルカリ性ホスファター
ゼ（CIP）で処理したpAbT4587に結合して、pAbT4593を
得た。pAbT4593はワクシニアウイルス中のSIVmac251env
の挿入および発現のためのベクターである。pAbT4593
は、ワクシニアHind III Ｍ領域中の組み換えを指令す
るワクシニアDNAによりフランキングされた、env遺伝子
をワクシニア40Kプロモーターの制御下に含有する。ベ
クターDNAは、ワクシニア組み換え体の選択のための29K
宿主−領域遺伝子、およびE.coli中の増殖および選択の
ためのバクテリアの複製およびアンピシリン抵抗性遺伝
子を包含する。
pAbT4597（第４図）:pAbT4574（参照、米国特許出願
第205,454号、1988年６月10日提出）をSac Iで消化し、
そして消化したDNAをまずT4 DNAポリメラーゼで、次い
でCIPで処理した。pAbT4589をSph Iで消化し、次いでT4
DNAポリメラーゼで処理し、そして最後にSma Iで消化
した。2750bpの断片を消化したpAbT4589から分離した；
この断片をSac Iで消化したpAbT4589に結合してpAbT459
7を産生した。pAbT4597をワクシニアウイルス中のSIVma
c251envおよびgag−protの挿入および発現のためのベク
ターである。pAbT4573は、ワクシニア30Kプロモーター
の制御下にgag−prot遺伝子、およびワクシニア40Kプロ
モーターの制御下にenv遺伝子を含有する。これらの遺
伝子は、ワクシニアHind III Ｍ領域中の組み換えを指
令するためのワクシニアDNAによりフランキングされて
いる。ベクターDNAは、ワクシニア組み換え体の選択の
ための29K宿主−領域遺伝子、およびE.coli中の増殖お
よび選択のためのバクテリアの複製およびアンピシリン
抵抗性遺伝子を包含する。
実施例2:HIV遺伝子を含有する組み換えプラスミドの構
成 pSVHenvおよびpBF128は、HIV−１菌株B10ゲノムの一
部分を含有するプラスミドである；これらイー・アイ・
デュポン社から得た。pHXBc2はHIV−１菌株HSB2ゲノム
の一部分を含有するプラスミドであり、ハーバード・メ
ディカル・スクールのジョセフ・ソドロスキー（Joseph
Sodroski）博士から入手した。プラスミドpAbT4532B
およびpAbT4554の構成および構造は、米国特許出願第20
5,454号、1988年６月10日提出、に記載されている。プ
ラスミドpAbT4007の構成および構造は、米国特許出願第
910,501号、1986年９月23日提出、に記載されている。
前述の特許出願の教示を引用によってここに加える。
pAbT164（第５図）：プラスミドpBF128をNco Iおよび
BamH Iで消化し、そしてDNAポリメラーゼのクレノー断
片で処理した;HIV−1gag遺伝子を含有する1700bpの断片
をこの消化から分離した。この断片を、Sam Iで消化し
そしてCIPで処理したプラスミドpAbT4532Bに結合して、
pAbT164を産生した。
pAbT164はワクシニア中のHIV−１ gagの挿入および
発現のためのベクターである。pAbT164は、ワクシニア
7.5Kプロモーターの制御下にHIV gag遺伝子、DNA領域
はワクシニア中の組み換えを指令するワクシニアTK遺伝
子をフランキングする、ワクシニア組み換え体の選択の
ためのワクシニアBamFプロモーターの制御下にlacZ遺伝
子、およびE.coli中の増殖および選択のためのバクテリ
アの複製およびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。
pAbT4603（第６図） プラスミドpSVHenvをXba IおよびXho Iで消化し、そ
してDNAポリメラーゼのクレノー断片で処理した:HIV−
１ env遺伝子を含有する2700bpの断片をこの消化物か
ら分離した。この断片をSam Iで消化しそしてCIPで処理
したプラスミドpAbT4007に結合して、プラスミドpAbT16
7を産生した。
プラスミドpAbT167をKpn IおよびXba Iで消化し、そ
してHIV−１ env遺伝子の５′末端を含有する225bpの
断片をこの消化物から分離した。この断片を、Xba Iお
よびKpn Iで消化しそしてCIPで処理したm13mp18バクテ
リオファージDNA［ニュー・イングランド・バイオラブ
ス（New England Biolabs）］に結合して、pAbT220を
産生した。env遺伝子の５′末端を、材料および方法に
記載するように、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘
発により５′非解読配列の大部分を修飾して除去した。
このオリゴヌクレオチド５′−GAAAGAGCAGTAGACAGTGG−
３′（バンデイス大学生物学部）を使用して、Acc I部
位をenv解読配列のATG開始コドンからほぼ10bp上流に挿
入して、pAbT221をつくった。pAbT221をEcoR IおよびHi
nd IIIで消化し、そしてほぼ230bpの断片を分離した。
これをEcoR IおよびHind IIIで消化しそしてCIPで処理
したプラスミドpEMBL18＋［デンテ（Dente）ら、1983、
核酸の研究（Nucleic Acids Research）、11:1645）
に結合して、プラスミドpAbT8536をつくった。
pAbT8536をAcc Iで消化し、DNAポリメラーゼのクレノ
ー断片で処理し、次いでKpn Iで消化した。env遺伝子の
突然変異誘発した５′非解読領域を含有する138bpの断
片をこの消化物から分離した。プラスミドpAbT167をKpn
IおよびSac Iで消化し、そしてenv遺伝子の大部分を含
有する2461bpの断片を分離した。pAbT8536からの138bp
の断片およびpAbT167からの2461bpの断片を、Sma Iおよ
びSac Iで消化しそしてCIPで処理したpAbT4554に結合し
て、プラスミドpAbT8539をつくった。
pAbT8539をEcoR Iで消化し、そしてenv遺伝子を含有
する2682bpの断片を分離した。これをEcoR Iで処理しそ
してCIPで処理したpAbT4587に結合して、pAbT4603をを
つくった。
pAbT4603はワクシニアウイルス中のHIV−１ envの挿
入および発現のためのベクターである。pAbT4603は、ワ
クシニアHind III Ｍ領域中の組み換えを指令するワク
シニアDNAによりフランキングされた、env遺伝子をワク
シニア40Kプロモーターの制御下に含有する。ベクターD
NAは、ワクシニア組み換え体の選択のための29K宿主−
領域遺伝子、およびE.coli中の増殖および選択のための
バクテリアの複製およびアンピシリン抵抗性遺伝子を包
含する。
pAbT621（第７図） 7A、プラスミドpAbT598（第7a図）の構成。pHXBc2」ソ
ドロスキー（Sodroski）ら、ネイチャー（Nature）、32
2:470（1986）］から誘導されたプラスミドをBgl Iおよ
びSac Iで消化して、ヌクレオチド位置715−6002に相当
する断片を解放した。次いで、このDNAをT4 DNAポリメ
ラーゼで処理した。HIV−１ gagおよびpolを含有する5
287bpの断片をこの消化物から分離し、そしてSma Iで消
化しそしてCIPで処理したpAbT536に結合して、プラスミ
ドpAbT599をつくった。
pAbT599をNde Iで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処
理し、次いでさらにBgl IIで処理し、そして3027bpの断
片をこの消化物から分離した。この断片をKpn IでpAbT1
64を消化した後分離した8864bpの断片に結合し、T4 DN
Aポリメラーゼで処理し、そしてさらにBgl IIで消化し
て、プラスミドpAbT598をつくった。
Ｂ、pAbT621（第7b図）の構成。
pAbT4603をPst Iで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処
理し、そしてさらにSal Iで消化し、そしてこの消化か
ら生ずる6326bpの断片を分離した。pAbT598をBamH Iお
よびBal Iで消化し、そして1838bpの断片を分離した。p
AbT4554をSal IおよびBamH Iで消化し、そして420bpの
断片を分離した。これらの３つの断片を一緒に結合して
pAbT621をつくった。
pAbT621はワクシニア中のHIV−１ envおよびgag−pr
otの挿入および発現のためのベクターである。pAbT621
は、ワクシニア40Kプロモーターの制御下にHIV env遺
伝子、ワクシニア30Kプロモーターの制御下にSIV gag
−prot遺伝子を含有する。これらの遺伝子は、ワクシニ
アHind III Ｍ領域中の組み換えを指令するワクシニア
DNAによりフランキングされている。ベクターDNAは、ワ
クシニア組み換え体の選択のための29K宿主−領域遺伝
子、およびE.coli中の増殖および選択のためのバクテリ
アの複製およびアンピシリン抵抗性遺伝子を包含する。
実施例3:ワクシニアのプロモーターの制御下にHIV−１
またはSIVmac251遺伝子を含有する組み換えワクシニア
ウイルスの構成 生体内の組み換えは、組み換えワクシニアウイルスを
つくる方法がある［ナンカノ（Nankano）ら、1982、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、79:159
3;パオレッティ（Paoletti）およびパニカリ（Panical
i）、米国特許第4,603,112号］。これらの組み換えウイ
ルスは、ワクシニアウイルスで感染した細胞の中に問題
の遺伝子を含有するDNAをトランスフェクションするこ
とによって形成する。小さい百分率の子孫のウイルス
は、ワクシニアのゲノム上の特定の部位に組み込まれた
問題の遺伝子を含有するであろう。これらの組み換えウ
イルスは外来遺伝子を発現することができる［パニカリ
（Panicali）およびパオレッティ（Paoletti）、1982、
プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.sci.）USA、79:4
927;パニカリ（Panicali）ら、1984、プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、80:5364］。
Hind III Ｍ領域におけるワクシニアウイルスのゲノ
ムの中にSIVmac251またはHIV−１遺伝子を挿入するため
に、この領域に位置する29K宿主−領域遺伝子に基づく
選択の方法［ギラード（Gillard）ら、1986、プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、83:5573］を
使用した。組み換えワクシニアウイルスvAbT33は、29K
遺伝子の一部分の代わりにlacZ遺伝子を含有する。この
lacZの挿入は29K遺伝子の機能を破壊する；したがっ
て、vAbT33は29K遺伝子産生物を必要とするRK13細胞上
で増殖することができない。さらに、vAbT33は、lacZ遺
伝子の存在のために、ベータ−ガラクトシダーゼ、ブロ
ウガル（Bluogal）、のための発色性基質の存在下に許
容性細胞上で青色のプラークを形成する。参照、米国特
許出願第205,189号、1988年６月10日提出。
IVRベクターpAbT4592、pAbT4593、pAbT4597、pAbT460
3、およびpAbT621を、ワクシニアウイルスvAbT33で感染
したBSC−40細胞の中にトランスフェクションした（参
照、材料および方法）。組み換えウイルスをRK13細胞上
でブロウガルの存在下に白色プラークとして選択した。
プラークを取り上げそして精製し、そして、サザン分析
により、適当なSIVmac251またはHIV−１遺伝子を含有す
ることが示された:vAbT252はSIV gag−protを含有す
る;vAbT271はHIV−１ envを含有する;vAbTは253SIV e
nvを含有する;vAbt264はSIV envおよびSIV gag−prot
の両者を含有する；そしてvAbT344はHIV−１ envおよ
びgag−protを含有する。
Hind III Ｊ領域に位置する、TK位置においてワクシ
ニアウイルスのゲノムの中にSIVmac251またはHIV−１遺
伝子を挿入するために、ブロモデオキシウリジン（BUd
R）に対するTK+ウイルスの感受性に基づく選択方法を使
用した。ブロモデオキシウリジンはTK+に対する致死的
であるが、組み換え体、TK-を増殖させる。したがっ
て、生体内組み換えのためのプラスミドは、TK+ワクシ
ニアウイルスで感染したHu14TK-の中にトランスフェク
ションされる（参照、材料および方法）。
さらに、TKにおける挿入のためのプラスミドベクター
は、ワクシニアBamFプロモーターの制御下にE.coli la
cZ遺伝子を含有する；所望の外来遺伝子を含有する組み
換えウイルスは、また、lacZ遺伝子を含有し、したがっ
てベータ−ガラクトシダーゼ、ブロウガル、の存在下に
増殖させるとき、青色のプラークを産生する。こうし
て、組み換えウイルスはBUdR中で選択し、そしてさらに
ブロウガルの存在下に青色のプラークとして同定するこ
とができる。
TK位置に挿入されたHIV−１遺伝子を含有する組み換
えワクシニアウイルスを構成するために、野生型NYCBH
ウイルスをベクターpAbT164との生体組み換えのための
親ウイルスとして使用して、組み換えウイルスvAbT141
を産生した。
SIVmac251 env、gag−protおよびpolを含有する組み
換えワクシニアウイルスを構成するために、vAbT264をp
AbT4583との生体内組み換えのための親ウイルスとして
使用し、pAbT4583は、ワクシニアTK遺伝子に対して相同
性のDNAによりフランキングされた、ワクシニア40Kプロ
モーターの制御下にSIVmac251 pol遺伝子を含有するIV
Rベクターである。このベクターは、米国特許出願第20
5,454号、1988年６月10日提出、に記載されている。こ
れは組み換えウイルスvAbT277を生じ、このvAbT277は、
ワクシニア40Kプロモーターの制御下にTK位置に挿入さ
れたSIVmac251 pol遺伝子、および、Hind III Ｍ位置
に挿入された、それぞれ、40Kおよび30Kのワクシニアプ
ロモーターの制御下に、SIVmac251 envおよびgag−pro
t遺伝子を含有する。
実施例4:組み換えワクシニアウイルス中のSIVまたはHIV
−１抗原についての黒色プラークのアッセイ 材料および方法に記載されている黒色プラークのアッ
セイは、ワクシニア感染細胞により発現されたタンパク
質を検出することができる、その場の酵素に基づくイム
ノアッセイである。このアッセイはワクシニア組み換え
体vAbT252、vAbT253、vAbT264およびvAbT277について、
ロナルドC.デスロシアース（Ronald C.Desrosiers）
［ニュー・イングランド・リージョナル・プライメント
・リサーチ・センター（New England Regional Prim
ate Research Center）、マサチュセッツ州サウスボ
ロウ］から入手したSIV感染アカゲザルを使用して実施
し、そしてvAbT141およびvAbT344について、ジョン・ス
リバン（John Sullivan）［ユニバーシティ・オブ・マ
サチュセッツ・メディカル・スクール（University of
Massachusetts Madical Sohool）、マサチュセッツ
州ウォルセスター］から入手した、HIV−１感染したヒ
トの患者からの血清を使用して実施した。
陰性の対照ウイルスNYCBHまたはvAbT33により形成し
たプラークは、細胞の単層それ自体上のバックグラウン
ドと一致するバックグラウンドの色のみを示した。ワク
シニア組み換え体vAbT252、vAbT253、vAbT264、vAbT27
7、vAbT141、vAbT271およびvAbT344により形成したプラ
ークは明確な暗い紫色に着色し、これは細胞の単層上の
バックグラウンドより非常に暗く、これらの組み換え体
がSIVmac251またはHIV−１抗原を強く発現することを示
す。
実施例5:組み換えワクシニアウイルスからのSIVmac251
またはHIV−１抗原の免疫沈澱 免疫沈澱の分析は、組み換えワクシニアウイルスvAbT
252、vAbT253、vAbT223、vAbT264、vAbT277、vAbT141、
vAbT271およびvAbT344で感染した細胞について、材料お
よび方法に記載するように、実施した。表１に要約する
結果が示すように、これらのワクシニア組み換え体の各
々はエンコードされたポリペプチドを発現する。
実施例6:SIVまたはHIV抗原を発現するワクシニア組み換
え体により産生されるレトロウイルス粒子の生化学的検
出 実施例５に記載する発現の分析は、挿入されたHIVま
たはHIV遺伝子によりエンコードされるポリペプチドの
合成を確証するために使用できるが、これらのポリペプ
チドが欠損ウイルス粒子に生体内で自己アセンブリルす
るかどうかという問題を取り扱わない。env、gag−prot
またはenvおよびgag−protの両者を発現するワクシニア
組み換え体が感染した細胞の培地の中に解放されるレト
ロウイルス様粒子を産生するかどうかを決定する１つの
手段として、遠心により沈澱させることができるenvお
よび／またはgagポリペプチドを含有する構造体の存在
について培地を検査した。BSC−40細胞をSIV/ワクシニ
ア組み換え体vAbT253（env）、vAbT252（gag−prot）ま
たはvAbT264（envおよびgag−prot）で感染するか、あ
るいはHIV/ワクシニア組み換え体vAbT141（gag）、vAbT
271（env）またはvAbT344（envおよびgag−prot）で感
染した。感染した細胞を材料および方法に記載するよう
に［35S］−メチオニンで標識した。感染の16〜18時間
後、培地を集め、そすて1000rpmにおいて５分間遠心す
ることによって清浄化した。生ずる上澄み液を取り出
し、そして8W28ローター内で24Kにおいて90分間遠心し
た。次いで、上澄み液を取り出し、そして生ずる沈澱を
1mlのPBS緩衝液（13ミリモルのNaCl、2.7ミリモルのKC
l、8.1ミリモルのNa2HPO4、1.5ミリモルのKH2PO4）の中
に再懸濁した。上澄み液および沈澱からの試料を、材料
および方法に記載するように、SIV/ワクシニア組み換え
体についてアカゲザル抗SIV抗血清を使用するか、ある
いはHIV/ワクシニア組み換え体についてヒト抗HIV抗血
清を使用して、免疫沈澱分析した。結果が示すように、
envおよびgag−prot組み換え体vAbt264およびvAbT344に
ついて、上澄み液はSIV/ワクシニア組み換え体の増殖の
間に多分培地の中に落ちたgp120にのみを含有する［キ
エニー（Kieny）ら、1986、バイオ／テクノロジー（Bio
/Technology）４:790］が、沈澱はgp120ばかりでなく、
かつまたenv遺伝子エンコードされたgp32（vAbT264につ
いて）またはgp41（vAbT344について）ならびにgagエン
コードされたp55、p40、p24およびp15を含有した。これ
らの結果が強く示唆するように、組み換え体ワクシニア
が産生したenvおよびgagタンパク質は粒子または複合体
に自己アセンブリルする。
それぞれ、HIV gagまたはSIV gag−protタンパク質
にのみを発現するvAbT141またはvAbT252について、沈澱
した物質はgagタンパク質を含有し、これはgagポリペプ
チドの自己アセンブリーによる未成熟のウイルス粒子の
形成と一致した。対照的に、それぞれ、SIVまたはHIV
env糖タンパク質にのみを発現するvAbT253およびvAbT27
1について、免疫沈澱可能なポリペプチドは沈澱の中に
存在しなかったが、実質的な量のpg120は上澄み液の中
に存在した。これらの結果は次の予測と一致した。すな
わち、gagポリペプチドが、単独であるいは他のウイル
スの構造タンパク質、例えば、env糖タンパク質と組み
合わせて発現されるときにのみ、欠損ウイルス粒子の形
成は起こる。
実施例7:電子顕微鏡検査を使用する、SIVまたはHIV−１
ポリペプチドを発現する組み換えワクシニアウイルスに
よるレトロウイルス粒子の形成の実証 gag、gag＋env、またはgag＋env＋polポリペプチドを
発現する組み換えワクシニアウイルスはレトロウイルス
様粒子にアセンブリングすることができるという追加の
確証として、これらの組み換えワクシニアウイルスで感
染した細胞のリゼイトを上の材料および方法の節に詳細
に説明した方法により電子顕微鏡で視的に検査した。
これらの実験において次のことが示された:gag（vAbT
141またはvAbT252）、env＋gag（vAbT223、vAbT264また
はvAbT344）またはenv＋gag＋pol（vAbT277）を発現す
るワクシニア組み換え体は、エンヴェロープド（envelo
ped）レトロウイルス粒子の形成を生ずる;gagおよびenv
ポリペプチドを同時発現する組み換え体（vAbT223、vAb
T264、vAbT344およびvAbT277）において、粒子のエヴェ
ロープは、粒子の表面上の糖タンパク質の「スパイク」
の存在により示されるように、エンヴェロープ糖タンパ
ク質を含有する。SIV組み換え体vAbT223について、粒子
の表面上のSIVエンヴェロープ糖タンパク質の存在は、
また、エンヴェロープ糖タンパク質の１つに対して向け
られたモノクローナル抗体usb、免疫金の電子顕微鏡検
査で実証された。
プラスミドの受託 プラスミドE.coli MC1061 pAbT4597およびE.coli
MC1061 pAbT621は、ブタベスト条約の規定に従い、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（the A
merican Type Culture Collection）米国マリイラン
ド州ロックビレ、に1989年５月31日に受託された。これ
らのプラスミドは、それぞれ、受け入れ番号67998およ
び67999を割り当てられた。
同等の実施態様 当業者は、ここに記載する本発明の特定の実施態様に
対して多数の同等の実施態様を認識するか、あるいは日
常の実験を越えない実験を使用して確証することができ
るであろう。このような同等の実施態様は次の請求の範
囲に包含される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ０７Ｋ 14/155 (72)発明者 ロバーツ，ブライアン アメリカ合衆国マサチユセツツ州02139 ケンブリツジ・ローレンスストリート 35 (72)発明者 パニカリ，デニス・エル アメリカ合衆国マサチユセツツ州01720 アクトン・ノンセツトパス114 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 7/00 A61K 39/12 C07K 14/155 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】HIV又はSIVのエンベロープポリペプチドを
    コードする遺伝子及びHIV又はSIV gagポリペプチドをコ
    ードする遺伝子を同時発現し、それによって同時発現さ
    れたポリペプチドがエンベロープされた欠陥非自己増殖
    性HIV又はSIV粒子に集合する組換えポツクスウイルスベ
    クター。
  2. 【請求項２】レンチウイルスの酵素ポリペプチドをコー
    ドするHIV又はSIV pol遺伝子をHIV又はSIVのエンベロー
    プ及びgagポリペプチドと共にまた同時発現する請求の
    範囲第１項記載のベクター。
  3. 【請求項３】ワクシニアウイルスである請求の範囲第１
    項又は第２項記載のベクター。
  4. 【請求項４】エンベロープポリペプチドをコードする遺
    伝子がHIV又はSIV envである請求の範囲第１〜３項のい
    ずれかに記載のベクター。
  5. 【請求項５】HIV又はSIVの単一の種由来の２種のDAN配
    列であって、HIV又はSIV DNA配列の一方がgag遺伝子で
    あり且つHIV又はSIV DNA配列の他方がpol遺伝子である
    ２種のDNA配列が挿入されているポツクスウイルスベク
    ターであって、該ポツクスウイルスベクターで感染させ
    た真核生物宿主細胞中でgag及びpolタンパク質が発現さ
    れ、そしてgag及びpolタンパク質は欠陥非自己増殖性HI
    V又はSIV粒子に自己集合するポツクスウイルスベクタ
    ー。
  6. 【請求項６】ポツクスウイルスがワクシニアウイルスで
    ある請求の範囲第５項記載のポツクスウイルスベクタ
    ー。
  7. 【請求項７】SIV又はHIVの単一の種由来の２種のDNA配
    列であって、該DNA配列の一方がgag遺伝子であり且つ該
    DNA配列の他方がenv遺伝子である２種のDNA配列が挿入
    されたポツクスウイルスベクターであって、該ポツクス
    ウイルスベクターで感染させた真核生物宿主細胞中でga
    g及びenvタンパク質が同時発現され、そしてgag及びenv
    タンパク質は欠陥非自己増殖性SIV又はHIV粒子に自己集
    合するポツクスウイルスベクター。
  8. 【請求項８】２種のDNA配列がHIVの単一の種由来のもの
    である請求の範囲第７項記載のポツクスウイルスベクタ
    ー。
  9. 【請求項９】HIVの単一の種由来の３種のDNA配列であっ
    て、第一のDAN配列がgag遺伝子であり、第二のDNA配列
    がpol遺伝子であり且つ第三のDNA配列がenv遺伝子であ
    る３種のDNA配列が挿入されているポツクスウイルスベ
    クターであって、該ポツクスウイルスベクターで感染さ
    せた真核生物宿主細胞中でgag、pol及びenvタンパク質
    が同時発現され、そしてgag、pol及びenvタンパク質は
    欠陥非自己増殖性HIV粒子に自己集合するポツクスウイ
    ルスベクター。
  10. 【請求項１０】請求の範囲第１〜３、５、６及び７〜９
    項のいずれかに記載のベクターで感染させた真核生物宿
    主細胞によって生産される欠陥非自己増殖性HIV又はSIV
    粒子。
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