FI107451B - Menetelmä ICAM-1 (solujen välisen kiinnikemolekyylin) saamiseksi oleellisesti puhtaassa muodossa - Google Patents

Description

107451

Menetelmä ICAM-1 (solujen välisen kiinnikemolyylin) saamiseksi oleellisesti puhtaassa muodossa - Förfarande för att erhälla ICAM-1 (intermolekulära adhesionsmolekyler) i väsentligen ren form

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää ICAM-1 :n (solujen välinen kiinnikemo-lekyyli-1) saamiseksi oleellisesti puhtaassa, funktionaalisesti aktiivisessa muodossa, ja joka oleellisesti ei sisällä yleensä ihmisen ICAM-1 :n liittyviä, luonnossa esiintyviä proteiineja.

Valkosolujen on käytettävä kiinnittymään solusubstraatteihin puolustaakseen oikealla tavalla isäntää vieraita hyökkääjiä kuten bakteereita tai viruksia vastaan. Erinomaisen katsauksen puolustusjärjestelmästä esittää Eisen, H.W. (“Microbiology”, 3. painos, Harper & Row, Filadelfia, PA.1980, ss. 290 - 295 ja 381 - 418). Niiden on käytettävä kiinnittymään endoteelisoluihin kyetäkseen siirtymään verenkierrosta käynnissä olevan tulehduksen esiintymiskohtiin. Lisäksi niiden tulee kiinnittyä antigeenin käsittäviin soluihin, jotta normaali spesifinen immuunivaste voisi tapahtua, ja lopuksi niiden tulee kiinnittyä tarkoituksenmukaisiin kohdesoluihin, jotta viruksen tartuttamissa soluissa tai kasvainsoluissa voisi tapahtua lyysi.

«

• · «I

.·: ·. Vastikään tällaisten kiinnittymisien välitykseen osallistuvia valkosolupintamole- .···. kyylejä tunnistettiin käyttäen hybridoomateknologiaa. Suppeasti ottaen, tunnis- tettiin ihmisen T-solujen vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita (Davignon, D., et ai,. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 78 (1981) 4535 - 4539) sekä hiiren pernasoluja (Springer, T., et ai.. Eur.J.Immunol. 9 (1979) 301 - 306), jotka sitoutuivat valko- solupintoihin ja inhiboivat edellä kuvattuja kiinnitysliitteisiä funktioita (Springer, T., et ai.. Fed. Proc. 44 (1985) 2660 - 2663). Näiden vasta-aineiden tunnistamat « « " .···. molekyylit nimitettiin Mac-1:ksi ja imusolufunktioliitteiseksi antigeeniksi 1 • · · . *. (LFA-1). Mac-1 on heterodimeeri, jota esiintyy syöjäsolu-, jyvässolupinnoilla sekä suurien jyväsimusolujen pinnoilla. LFA-1 on heterodimeeri, jota esiintyy • · *; useimmilla imusoluilla (Springer, T.A. et ai.. Immunol.Rev. 68 (1982) 111 - 135).

: Nämä kaksi molekyyliä, sekä kolmas molekyyli, p150,95 (jonka kudosjakauma on samankaltainen kuin Mac-1 :n), osallistuvat solukiinnittymiseen (Keizer, G., et ai.. Eur.J.Immunol. 15 (19851 1142-1147).

2 107451

Edellä kuvattujen valkosolumolekyylien todettiin kuuluvan sukulaisglykoproteii-nien ryhmään (Sanchez-Madrid, F. et ai.. J.Exper.Med. 158 (1983) 1785 - 1803; Keizer, G.D. et ai.. Eur.J.Immunol. 15 (1985Ί 1142 -1147). Tämä glykoproteiini-ryhmä koostuu heterodimeereistä, joissa on yksi alfa-ketjuja yksi beeta-ketju. Vaikka näiden antigeenien alfa-ketjut poikkeavat toisistaan, beeta-ketju todettiin erittäin säilyväksi (Sanchez-Madrid, F., et ai.. J.Exper.Med. 158 (1983) 1785 -1803). Glykoproteiiniryhmän (jota toisinaan kutsutaan “CD18:ksi”) beeta-ketjun molekyylipainoksi todettiin 95 kd:tä, kun taas alfa-ketjujen todettiin vaihtelevan 150 kd:stä 180 kd:hen (Springer, T.. Ted.Proc. 44 (1985) 2660-2663). Vaikka membraaniproteiinien alfa-alayksiköt eivät jää beeta-yksiköiden keskinäistä laajaa homologiaa, analysoimalla tarkasti glykoproteiinien alfa-alayksiköitä on ilmennyt, että niiden välillä on huomattavia yhtäläisyyksiä. Katsauksia LFA-1-sukuisten glykoproteiinien alfa- ja beeta-alayksiköiden samankaltaisuuksista esittävät Sanchez-Madrid, F., et ai.. (J.Exper. Med. 158 (1983) 586 - 602; J.Exper.Med 158 (1983) 1785 - 1803.

On tunnistettu ryhmä yksilöitä, jotka eivät kykene ilmentämään normaaleja määriä mitään tämän kiinnikeproteiiniryhmän jäsentä valkosolujensa solupinnoilla (Anderson, D.C. et ai.. Fed.Proc. 44 (1985) 2671 -2677: Anderson, D.C.. et ai.. J.Infect.Dis. 152 (1985) 668 - 689). Näiden potilaiden imusolut osoittivat in vitro samankaltaisia puutteita, kuin normaalit kanssahenkilöt, joiden LFA-1-ryhmä-.···. molekyylejä vastustivat vasta-aineet. Edelleen nämä yksilöt eivät kyenneet tuottamaan normaalia immuunivastetta, koska heidän solunsa eivät kyenneet • » kiinnittymään solusubstraatteihin (Anderson, D.C. et ai.. Fed.Proc. 44 (1985) 2671 - 2677; Anderson, D.C. et ai.. J.Infect.Dis. 152 (19851 668 - 6891. Nämä * · » tiedot osoittavat, että immuunireaktiot heikentyvät, kun imusolut eivät kykene kiinnittymään normaalilla tavalla LFA-1-ryhmän funktionaalisten kiinnikemole-.···. kyylien puuttumisen johdosta.

• · • · · Täten yhteenvetona, imusolujen kyky ylläpitää eläimen terveyttä ja elinkelpoisuutta edellyttää, että imusolut kykenevät kiinnittymään toisiin soluihin (kuten i V endoteelisoluihin). Tämän kiinnittymisen on todettu edellyttävän solu-solukon- V·: takteja, joihin liittyy spesifisiä reseptorimolekyylejä, joita esiintyy imusolujen solupinnoilla. Nämä reseptorit mahdollistavat imusolun kiinnittymisen muihin 3 107451 imusoluin tai endoteelisoluihin ja muihin ei-verisuonisoluihin. Solupinnan resep-torimolekyylit on todettu toisiaan hyvin likeisesti muistuttavaksi. Henkilöt, joiden imusoluilta puuttuvat nämä solupintareseptorimolekyylit, potevat kroonisia ja toistuvia tulehduksia, sekä muita kliinisiä oireita, mukaan lukien puutteelliset vasta-ainevasteet.

Koska imusolukiinnittyminen liittyy prosessiin, jolla vieraskudos tunnistetaan ja hylätään, tämän prosessin ymmärtämisellä on huomattava merkitys elinsiirtojen, kudossiirtojen, yliherkkyyden ja kasvainopin aloilla.

Keksintö käsittää siis menetelmän ICAM-1 :n saamiseksi oleellisesti puhtaassa muodossa, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että se a) valmistetaan rekombinantti-DNA-molekyyli, joka kykenee koodaamaan ihmisen ICAM-1 :n funktionaalisesti aktiivisen molekyylin tai sen funktio-naalisesti aktiivisen johdannaisen, b) transformoidaan isäntäsolu mainitulla rekombinantti-DNA-molekyylillä, c) viljellään isäntäsolu olosuhteissa, jotka sallivat mainitun ICAM-1 :n tai sen funktionaalisesti aktiivisen johdannaisen ilmentämisen, ja d) eristetään ICAM-1 tai sen funktionaalinen johdannainen puhtaana, jok.a .; ·., sisältää ainakin yhden seuraavista polypeptideistä: (a) -V-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; (b) -X-G-S-V-L-V-T-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; :Y: (c) -L-L-G-l-E-T-P-L; (d) -F-L-T-V-Y-X-T; (e) -V-E-L-A-P-L-P; (f) -E-L-D-L-R-P-Q-G-L-E-L-F-E; (g) -L-N-P-T-V-T-Y-G-X-D-S-F-S-A-K; . \ (h) -S-F-P-A-P-N-V; 0) -l-r-g-e-k-e-i_; O') -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P; : ‘ ; (k) -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E; (l) -P-R-G-G-S; (m) -P-G-N-N-R-K; 4 107451 (n) -Q-E-D-S-Q-P-M; (o) -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S; (p) -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S; ja (q) -D-L-R-P-Q-G-L-E.

Kuviossa 1 esitetään diagrammin muodossa normaalin solun ja solun, jolta LFA-1 puuttuu, välinen kiinnittyminen.

Kuviossa 2 esitetään diagrammina normaali/normaalisolukiinnitysprosessi.

Kuviossa 3 esitetään soluaggregaation kinetiikkaa 50 ng:n/ml PMA:ta puuttuessa (X) tai läsnäollessa (O).

Kuviossa 4 esitetään LFA-1-ja LFA-1+-solujen koaggregaatio. EBV:llä transformoituja soluja (104), jotka oli leimattu karboksifluoreseiinidiase-taatilla, kuvion mukaisesti, sekoitettiin 105 kpkseen ei-leimattuja autologisia soluja (umpinaiset pylväät) ja JY-soluja (avoimen pylväät) PMA:n läsnäollessa. 1,5 tunnin kuluttua leimatut solut, aggregaateissa tai vapaina, laskettiin käyttäen esimerkin 2 kvalitatiivista määritystä. Leimattujen solujen prosentuaalinen osuus aggregaateissa on merkitty. Esitetään yksi edustava koe kahdes- .···. ta suoritetusta.

• · ·

Kuviossa 5 esitetään ICAM-1 :n ja LFA-1 :n immuunisaostus JY-soIuista. JY- • · » soluista Triton X-100 lysaatteja (vyöhykkeet 1 ja 2) tai verrokki-lyysipuskuria (vyöhykkeet 3 ja 4) immuunisaostettiin vasta-aineel-la, joka kykenee sitoutumaan ICAM-1 :een (vyöhykkeet 1 ja 3), tai .···. vasta-aineilla, jotka kykenevät sitoutumaan LFA-1 :een (vyöhyk- • t · . *. keet 2 ja 4). Paneelissa A on esitetty tulokset pelkistävissä olo- • · · suhteissa; paneelissa B on esitetty tulokset, jotka saatiin ei-pelkis- • · T* tävissä olosuhteissa. Molekyylipainostandardit ajettiin vyöhyk- : *.: keessä S.

• · · • · 5 107451

Kuviossa 6 esitetään IL-1-ja gamma-interferonivaikutuksien ICAM-1-ilmen-nykseen ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluilla kinetiikkaa. Ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x 104 solua/0,32 cm2/kuoppa. IL-1 :tä (10 U/ml, umpinaiset ympyrät) tai yhdistelmä-gamma-interferonia (10 U/ml, avoimet neliöt) lisättiin, minkä jälkeen merkittynä ajankohtana määritysseos jäähdytettiin 4°C:seen ja suoritettiin epäsuoran sitoutumisen määritys Standardipoikkeama ei ylittänyt 10 %:ia.

Kuviossa 7 esitetään IL-1- ja gamma-interferonivaikutuksien ICAM-1 :een pitoisuusriippuvuus. Ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x 104 solua/09,32 cm2/kuoppa. IL-2:ta (avoimet ympyrät), yhdistelmä-humaani-IL-1:tä (avoimet neliöt), yhdistelmä-hiiri-IL-1 :tä (umpinaiset neliöt), yhdistelmä-humaani-gamma-interferonia (umpinaiset ympyrät) ja yhdistelmä-beetainterferonia (avoimet kolmiot) lisättiin merkittynä laimennoksena ja seoksia inkuboitiin 4 tunnin ajan (IL-1) tai 16 tunnin ajan (beeta-ja gamma-interferoni). Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja nelinkertaisista määrityksistä; standardipoikkeama ei ylittänyt 10 %:ia.

. :'. Kuviossa 8 esitetään ICAM-1 -cDNA:n nukleotidi- ja aminohapposekvenssi.

.··*. Ensimmäinen ATG on asemassa 58. Translatoidut sekvenssit, jotka vastaavat ICAM-1-trypsiinipeptidejä, on alleviivattu. Hydrofo-binen oletettu signaalipeptidi ja vastaavasti transmembraanisek-venssit on alleviivattu voimakkaasti. N-kytkentäglykosylaatiokoh- __ · dat on merkitty laatikkoon. Polyadenylaatiosignaali AATAAA ase-massa 2976 on merkitty yläpuolisella viivalla. HL-60-cDNA-kloo-nin sekvenssi on esitetty. Endoteelisolu-cDNA sekventoitiin lähes koko pituudeltaan ja siinä esiintyi vain vähäisiä poikkeamia.

• · · IM · • ·

Kuviossa 9 esitetään ICAM-1-homologia-alueet ja suhde immunoglobuliini- • · · • » » > ·* supergeeniryhmään. (A) 5 homologisen alueen rinnakkainasetus (Dl-5). Kaksi rinnakkain asettunutta jäännöstä tai useampi rinnakkain asettunut jäännös on merkitty laatikolla. Jäännökset, jotka 6 107451 olivat säilyneet kaksi kertaa tai useamman kerran NCAM-alueilla, sekä jäännökset, jotka olivat säilyneet C2- ja C1-sarja-alueilla, asetettiin ICAM-1:n sisäisten toistojen rinnalle. Ennakoitujen bee-ta-säikeiden sijainti ICAM-1-alueella on merkitty tankoviivoin ja pienillä kirjaimilla rinnakkainasetuksen päällä, ja beetasäikeiden tunnettu sijainti immunoglobuliini-C-alueilla on merkitty tankovii-voilla ja rinnakkainasetuksen alapuolisin suurin kirjaimin. Oletetun disuifidisilian asema ICAM-1-alueella on merkitty SS. (B-D) Prote-iinialueiden, jotka ovat ICAM-1-alueisiin nähden homologisia, rinnakkainasettelu; proteiinit asetettiin alustavasti rinnakkain suorittamalla haku NBRF-tietokannoissa FASTP-ohjelmaa käyttäen. Proteiinisekvenssit ovat MAG, NCAM, T-soIureseptori-alfa-alayk-sikkö-V-alue, IgM-myy-ketju ja alfa-1-B-glykoproteiini.

Kuviossa 10 on esitetty diagrammina ICAM-1 :n ja MAG:n sekundaarirakentei-den vertailu.

Kuviossa 11 esitetään LFA-1 -positiivisia EBV-transformoituja B-varhaisimu-solusoluja, jotka sitoutuvat !CAM-1:een tasomembraaneissa.

Kuviossa 12 esitetään LFA-1 -positiivisia T-varhaisimusoluja ja T-lymfomasolu-ja sitoutumassa ICAM-1 :een muoviin sidotuissa rakkuloissa.

Kuviossa 13 esitetään JY-B-varhaisimusolun sitoutumisen ICAM-1 :een estymi-nen muoviin sidotuissa rakkuloissa esikäsiteltäessä solut tai rak- • · e kulat monoklonaalisilla vasta-aineilla.

• ·

Kuviossa 14 esitetään lämpötilan vaikutus T-varhaisimusolujen sitoutumiseen • · · . *. ICAM-1 :een muoviin sidotuissa rakkuloissa.

• · · • ♦ · • · · · ··» • · • ·

Kuviossa 15 esitetään kaksivalenssisten kationien tarve T-varhaisimusolujen * .* sitoutumiselle ICAM-1 :een muoviin sidotuissa rakkuloissa.

• « 7 107451

Kuviossa 16 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena T-soluliitteisen antigeenin OKT3 tunnistukseen. ΌΚΤ3" merkitsee antigeenin lisäystä.

Kuviossa 17 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena ei-spesifisen T-solu-mitogeenin, konkavalliini-A:n, tunnistukseen. "CONA" merkitsee konkanavalliini-A:n lisäystä.

Kuviossa 18 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena avaimenreikä-malja-kotilohemosyaniiniantigeenin tunnistukseen. Avaimenreikämalja-kotilohemosyaniinin lisäys soluihin on merkitty "KLH".

Kuviossa 19 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena jäykkäkouristustoksoi-diantigeenin tunnistukseen. Jäykkäkouristustoksoidiantigeenin lisäys soluihin on merkitty "AGN".

Kuviossa 20 on esitetty monoklonaalisten vasta-aineiden RR1/1, R6.5, LB2 ja . ···. CL203 sitoutuminen ICAM-1 -deleetiomutantteihin.

Kuviossa 21 esitetään ICAM-l-deieetiomutanttien sitoutuminen LFA-1:een.

• mm • « · • · m • · · ~ ·

Kuviossa 22 esitetään ICAM-1-vastaisten monoklonaalisten vastaaineiden RRI/1, R6.5, LB2 ja CL203 tunnistamat epitoopit.

• · · • · • · » . Kuviossa 23 esitetään ICAM-1-alue-2-mutanttien sitoutumiskapasiteetti • · · :;i.: LFA-1 :een.

• » • · • · · : V Kuviossa 24 esitetään ICAM-1-alue-3-mutanttien sitoutumiskapasiteetti • · :«*‘i LFA-1 :een.

8 107451

Kuviossa 25 esitetään ICAM-1-alue-1-mutanttien sitoutumiskapasiteetti LFA-1:een.

Kuviossa 26 esitetään ICAM-aminopää-alueiden rinnakkaisasetus.

Keksinnössä käytettyä luontaista sitoutumisligandia kutsutaan nimellä "solujen välinen kiinnikemolekyyli-Γ tai "ICAM-1". ICAM-1 on 76 - 97 kd:n glykoproteiini. ICAM-1- ei ole heterodimeeri. ICAM-1 :n "funktionaalinen johdannainen" on yhdiste, jolla on biologista aktiivisuutta (joko funktionaalista tai rakenteellista), joka on oleellisesti samanlaista kuin !CAM-1:n biologinen aktiivisuus. Ilmaisun "funktionaaliset johdannaiset" piiriin tarkoitetaan kuuluviksi molekyylin "fragmentit", "variantit", "analogit" tai "kemialliset johdannaiset". Molekyylin, kuten ICAM-1:n, "fragmentilla" tarkoitetaan molekyylien mitä tahansa polypeptidialaryhmää. Erityisen edullisia ovat ICAM-1 :n fragmentit, joilla on ICAM-1-aktiivisuutta ja jotka ovat liukoisia (eli eivät ole sidottuja membraaniin). Molekyylin, kuten ICAM-1 :n, "variantilla" tarkoitetaan molekyyliä, joka on rakenteeltaan ja funktioltaan oleellisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen fragmentti. Molekyylin sanotaan olevan "oleellisesti samanlainen" kuin jokin toinen molekyyli, jos kyseisten kahden molekyylin rakenteet ovat oleellisesti samanlaiset tai jos kum-mailakin molekyylillä on samanlainen biologinen aktiivisuus. Täten edellyttäen, että kahdella molekyylillä on samanlainen aktiivisuus, niitä pidetään toistensa .' ‘ . variantteina ilmaisun tässä käytetyssä merkityksessä silloinkin, jos yhden mole- kyyleistä rakennetta ei esiinny toisessa, tai jos aminohappojäännössekvenssit eivät ole identtiset. Molekyylin kuten ICAM-1 :n "analogilla" tarkoitetaan molekyy-liä, joka on funktioltaan oleellisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen fragmentti. Tässä käytettynä molekyyliä kutsutaan toisen molekyylin "kemialli-seksi johdannaiseksi", jos se sisältää ylimääräisiä kemiallisia ryhmiä, jotka eivät .***. normaalisti kuulu molekyyliin. Tällaiset ryhmät voivat parantaa molekyylin liukoi- • · ♦ . \ suutta, imeytymistä, biologista puoliintumisikää jne. Ryhmät voivat vaihtoehtoi- • · « sesti alentaa molekyylin myrkyllisyyttä, poistaa tai heikentää molekyylin mahdol- • · *** lista epätoivottavaa sivuvaikutusta jne. Tällaisia vaikutuksia tuottamaan kykene- • * · • .* viä ryhmä julkistetaan käsikirjassa Remington's Pharmaceutical Sciences. 1980.

• · :· *: "Toksiinijohdannais’-molekyylit muodostavat "kemiallisten johdannaisten" eri tyisluokan. "Toksiinijohdannais"-molekyyli on molekyyli (kuten ICAM-1 tai vasta- 107451 g aine), joka sisältää toksiiniryhmän. Tällaisen molekyylin sitoutuminen soluun tuo toksiiniryhmän lähelle solua ja edistää siten solun kuolemista. Voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa toksiiniryhmää; kuitenkin edullisesti käytetään sellaisia toksiineja kuten esimerkiksi risiinitoksiini, difteriatoksiini, radioisotooppitoksiinit, membraaniväylän muodostavat toksiinit jne. Menettelyitä tällaisten ryhmien kytkemiseksi molekyyliin tunnetaan alalla hyvin.

Antigeenimolekyylit kuten ICAM-1 tai LFA-1-ryhmämolekyylit ilmentyvät luontaisesti imusolujen pinnalla. Täten jos tällaisia soluja viedään sopivaan eläimeen, esimerkiksi vatsaonteloon ruiskuttamalla jne., seurauksena on vasta-aineiden muodostuminen, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1 :een tai LFA-1-ryhmämo-lekyyleihin. Haluttaessa tällaisesta eläimestä voidaan ottaa seerumia ja käyttää sitä lähteenä polyklonaalisten vasta-aineiden saamiseksi, jotka kykenevät sitoutumaan näihin molekyyleihin. Edullisesti kuitenkin tällaisista eläimistä otetaan pernasoluja, jotka fuusioidaan myeloomasolulinjaan, minkä jälkeen näiden fuusiosolujen annetaan muodostaa hybridoomasolu, joka erittää monoklonaali-sia vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1 :een tai johonkin LFA-1-ryhmämolekyyliin.

t;... Edellä kuvatun mukaisesti saadut hybridoomasolut voidaan seuloa erilaisilla « . ’: ·; menetelmillä haluttujen hybridoomasolujen tunnistamiseksi, jotka erittävät vasta- ainetta, joka kykenee sitoutumaan joko ICAM-1 :een tai johonkin LFA-1-ryhmä- < · · .;..: molekyyliin. Edullisessa seulontamäärityksessä tällaiset molekyylit tunnistetaan niiden kyvystä inhiboida Epstein-Barrin viruksella transformoitujen solujen agg-regaatiota. Vasta-aineet, jotka kykenevät inhiboimaan tällaista aggregaatiota, seulotaan sitten edelleen sen määrittämiseksi, inhiboivatko ne mainittua aggre- ·;··: gaatiota sitoutumalla ICAM-1 :een vai LFA-1 -ryhmämolekyyliin. Tällaisessa seu- lonnassa voidaan käyttää mitä tahansa keinoa ICAM-1 :n erottamiseksi LFA-1- • « · . ryhmämolekyyleistä. Täten esimerkiksi vasta-aineen sitomaa antigeeniä voidaan

• I I

analysoida esimerkiksi immuunisaostamalla ja polyakryyliamidigeelielektrofo- • · reettisesti. Jos sidottu antigeeni kuuluu LFA-1 -ryhmämolekyyleihin, immuuni- • » · : ·' seostettu antigeeni todetaan dimeeriksi, kun taas jos sitoutunut antigeeni on » · · *· ICAM-1, vain yksi molekyylipainolaji on immuunisaostunut. Vaihtoehtoisesti on mahdollista erottaa ne vasta-aineet, jotka sitoutuvat LFA-1-ryhmämolekyyleihin, 10 107451 niistä, jotka sitoutuvat ICAM-1:een, seulomalla vasta-aineen kyvyn suhteen sitoutua sellaisiin soluihin, kuten jyvässolut, jotka ilmentävät LFA-1:n, mutta eivät ICAM-1 :tä. Vasta-aineen Qonka tiedetään inhiboivan solu-aggregaatiota) kyky sitoutua jyvässoluihin merkitsee, että vasta-aine kykenee sitoutumaan LFA-1 :een. Tällaisen sitoutumisen puuttuminen merkitsee vasta-ainetta, joka tunnistaa ICAM-1 :n. Vasta-aineen kyky sitoutua soluun kuten jyvässoluun voidaan todeta alan keskimääräistenkin taitajien tavanomaisesti käyttämin keinoin. Tällaisia keinoja ovat immuunimääritykset, solu-agglutinaatio, suodatinsitoutu-mistutkimukset, vasta-ainesaostus jne.

Mainitut aggregaatio-vastaiset vasta-aineet voidaan vaihtoehtoisesti tunnistaa mittaamalla niiden kyky sitoutua differentiaalisesti soluihin, jotka ilmentävät ICAM-1:n (kuten aktivoituihin endoteelisoluihin), ja niiden kyvyttömyys sitoutua soluihin, jotka eivät ilmennä ICAM-1 :tä. Alan keskimääräisetkin taitajat havainnevat vaikeuksitta, että edeltäviä määrityksiä voidaan modifioida, tai ne voidaan suorittaa erilaisessa keskinäisessä järjestyksessä, jolloin saadaan lukuisia erilaisia mahdollisia seulontamäärityksiä, joista kullakin kyetään tunnistamaan tai erottamaan toisistaan ICAM-1 :een LFA-1 -ryhmämolekyylin asemesta sitoutumaan kykeneviä vasta-aineita.

«I « I

Esillä olevan keksinnön mukaan saadut tulehdusvastaiset aineet voidaan saada .···. luontaisilla prosesseilla (kuten esimerkiksi indusoimalla eläin, kasvi, sieni, bak- « I · teeri, jne., tuottamaan ICAM-1 :n ei-immunoglobuliini-antagonistia, tai indusoi-maila eläin tuottamaan polyklonaalisia vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutu-maan ICAM-1 :een); synteettisillä menetelmillä (kuten esimerkiksi käyttäen •

Merrifield-menetelmää polypeptidien syntetisoimiseksi ICAM-1 :n, ICAM-1 :n funktionaalisten johdannaisten tai ICAM-1 :n proteiini-antagonistien Qoko immu- .···. noglobuliini- tai ei-immunoglobuliini-) edelleen syntetisoimiseksi; hybridoomatek- 1«· . *. nologisesti (kuten esimerkiksi ICAM-T.een sitoutumaan kykenevien monoklo- • · · • * * '.‘λ* naalisten vasta-aineiden tuottamiseksi); tai yhdistelmä-DNA-teknisesti (kuten • · V esimerkiksi esillä olevan keksinnön mukaisten tulehdusvastaisten aineiden • · · : V tuottamiseksi erilaisissa isännissä (eli hiivassa, bakteereissa, sienissä, nisäkäs- * · V*: soluviljelmissä jne.) tai yhdistelmäplasmidi- tai virusvektoreista. Käytettävän menetelmän valinta riippuu sellaisista tekijöistä kuten kätevyys, haluttu saanto, „ 107451 jne. Välttämättä ei tarvitse käyttää vain yhtä edellä kuvattua menetelmää, prosessia tai tekniikkaa nimenomaisen tulehdusvastaisen aineen tuottamiseksi; edellä kuvattuja prosesseja, menetelmiä ja tekniikoita voidaan yhdistää jonkin nimenomaisen tulehdusvastaisen aineen saamiseksi.

A. LFA-1:n sitoutumisoarin flCAM-1) tunnistus 1. LFA-1-riippuvaisen aggregaation määrityksiä

Monet Epstein-Barr-viruksella transformoidut solut osoittavat aggregaatiota.

Tätä aggregaatiota voidaan tehostaa forboliesterien läsnäololla. Tällaisen homo-tyyppisen aggregaation (eli aggregaation, johon liittyy vain yksi solutyyppi) todettiin salpautuvan LFA-1-vastaisilla vasta-ainella (Rothlein, R., et ai., J.Exper.Med. 163 (1986) 1132-1149), joka viite sisällytetään tähän viitteeksi. Täten LFA-1-riippuvaisen sitoutumisen laajuus voidaan määrittää määrittämällä spontaanin tai forboliesteririippuvaisen aggregaattimuodostuksen laajuus.

LFA-1-riippuvaista aggregaatiota häiritsevä aine voidaan tunnistaa käyttämällä määritystä, jolla kyetään määrittämään, häiritseekö aine Epstein-Barr-viruksella «. transformoitujen solujen spontaania vai forboliesteririippuvaista aggregaatiota.

Tällaisessa määrityksessä voidaan käyttää useimpia Epstein-Barr-virus-trans- .«·. formoituja soluja, kunhan solut kykenevät ilmentämään LFA-1-reseptorimole- • · kyylin. Tällaisia soluja voidaan valmistaa Springerin, T.A., et ai., J.Exper.Med.

160 (1984) 1901 -1918, joka viite sisällytetään tähän viitteeksi, tekniikalla. Vaik- « · · ka mitä tahansa tällaista solua voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukai- • · · . · sessa LFA-1-riippuvaisen sitoutumisen määrityksessä, edullisesti käytetään JY-solulinjasoluja (Terhosi, C.T., et ai., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 73 (1976) 910).

• · .··*. Soluja voidaan inkuboida missä tahansa sopivassa kasvualustassa; kuitenkin . \ edullisimmin soluja viljellään RPM11640 -kasvualustassa, jota on täydennetty • « · 10 %:lla vasikansikiöseerumia ja 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä (Gibco • ·

Laboratories, NY). Soluja tulisi viljellä olosuhteissa, jotka sopivat nisäkässolu- : V lisäännytykseen (eli yleensä 37°C:n lämpötilassa, ilmakehässä, jossa on 5 % • · \*\: C02:ta, 95 %:n suhteellisessa ilman kosteudessa jne.).

12 107451 2. LFA-1 sitoutuu ICAM-1:een

On tunnistettu henkilöitä, joiden imusoluista puuttuu LFA-1 reseptorimolekyyli-ryhmä (Anderson, D.C., et ai.. Fed.Proc. 44 (1985) 2671 - 2677; Anderson, D.C., et ai.. J.Infect.Dis. 152 (1985) 668 - 689). Tällaisten yksilöiden sanotaan kärsivän valkosolukiinnitysvajauksesta (LAD). Tällaisten yksilöiden EBV-trans-formoidut solut eivät kykene aggregoitumaan, eivät spontaanisti eivätkä forboli-esterien läsnäollessa edellä kuvatussa aggregaatiomäärityksessä. Kun tällaisia soluja sekoitetaan LFA-1 :n ilmentäviin soluihin, todettiin aggregaatio (Rothlein, R., et ai.. J.Exper.Med. 163 (1986) 1132 -1149) (kuvio 1). Merkittävää on, että näitä aggregaatteja ei muodostunut, jos näitä soluja inkuboitiin LFA-1-vastaisten vasta-aineiden läsnäollessa. Täten vaikka aggregaatio edellytti LFA-1 :tä, LFA-1 -vajaiden solujen kyky muodostaa aggregaatteja LFA-1-pitoisten solujen kanssa osoitti, että LFA-1: n sitoutumispari ei ole LFA-1, vaan paremminkin aiemmin tuntemattomaksi jäänyt solukiinnikemolekyyli. Kuviossa 1 esitetään solukiinnit-tymisen mekanismi.

B. Solujen välinen kiinnikemolekvvli-1 (ICAM-1) >. Uusi solujen välinen kiinnikemolekyyli ICAM-1 tunnistettiin ja osittain karakteri- I I · 4 ]·:·. soitiin ensin Rothleinin, R.. et ai.. J.lmmunol. 137 (1986) 1270 -1274, joka viite ,···, sisällytetään tähän viitteeksi, menettelyn mukaan. ICAM-1-molekyylin toteami- seksi valmistettiin monoklonaalisia vasta-aineita hiirien pernasoluista, kun hiiriä oli immunoitu soluilla, jotka olivat peräisin yksilöistä, joiden LFA-1-ilmennys oli geneettisesti puutteellinen. Saadut vasta-aineet seulottiin niiden kyvyn suhteen inhiboida LFA-1 :n ilmentävien solujen aggregaatiota (kuvio 2). Yksityiskohtaises- ti ottaen, ICAM-1-molekyylin toteamiseksi hiiriä immunoitiin EBV-transformoi- .···. duilla B-soluilla, jotka oli saatu LAD-potilaista, jotka eivät ilmennä LFA-1-anti- ··· . ·. geeniä. Näistä eläimistä poistettiin sitten pernasolut, jotka fuusioitiin myelooma- • · · soluihin ja annettiin monoklonaalisia vasta-aineita tuottavien hybridoomasolujen t · *:*' muodostua. EBV-transformoituja B-soluja, jotka olivat peräisin normaaleista : yksilöistä, jotka ilmentävät LFA-1 :n, inkuboitiin sitten hybridoomasolun tuotta- • · man monoklonaalisen vasta-aineen läsnäollessa mahdollisen monoklonaalisen vasta-aineen tunnistamiseksi, joka kykenisi inhiboimaan EBV-transformoitujen 13 107451 B-solujen forboliesterivälitteisen, LFA-1-riippuvaisen spontaanin aggregaation. Koska hybridoomasolut saatiin soluista, jotka eivät olleet koskaan "tutustuneet" LFA-1-antigeeniin, LFA-1 :n vastaista monoklonaalista vasta-ainetta ei muodostunut. Täten mikä tahansa vasta-aine, jonka todetaan inhiboivan aggregaatiota, kykenee välttämättä sitoutumaan antigeeniin, joka vaikkakaan ei ole LFA-1 osallistuu LFA-1-kiinnitysprosessiin. Vaikka voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää tällaisten monoklonaalisten vasta-aineiden saamiseksi, edullisesti ICAM-1 :een sitoutuvia monoklonaalisia vasta-aineita hankitaan immunoimalla BALB/c-hiiriä käyttäen teitä ja aikatauluja, joita kuvaavat Rothlein, R., et ai. fj.lmmunol. 137 (1986) 1270 -1274), Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ääreisveren yksitumasolujen kanssa, jotka ovat peräisin yksilöistä, joilta puuttuu LFA-1. Tällaisia soluja julkistavat Springer, T.A., et ai. (J.Exper.Med. 160 (1984) 1901 -1918).

Edullisessa menetelmässä vasta-aineiden muodostamiseksi ja toteamiseksi, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1 :een, hiiriä immunoidaan joko EBV-trans-formoiduilla B-soluilla, jotka ilmentävät sekä ICAM-1 :n että LFA-1 :n, tai edullisemmin TNF-aktivoiduilla endoteelisoluilla, jotka ilmentävät ICAM-1 :n mutta eivät LFA-1 :tä. Edullisimmassa menetelmässä hybridoomasolujen muodostami-seksi, jotka tuottavat ICAM-1-vastaisia vasta-aineita, BALB/c-hiiri immunoitiin toisiaan seuraten JY-soluilia sekä differentioiduilla U937-soluilla (ATCC CRL-,···. 1593). Tällaisista eläimistä poistetaan pernasolut, jotka fuusioidaan myelooma- soluihin, ja annetaan vasta-ainetta tuottavien hybridoomasolujen muodostua. Vasta-aineet seulotaan niiden kyvyn suhteen inhiboida EBV-transformoidun • · solulinjan LFA-1-riippuvaista, forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, kuten JY- solujen, jotka ilmentävät sekä LFA-1-reseptorin että ICAM-1 :n. Kuten esittäneet

Rothlein, R., et ai.. (J.lmmunol. 137 (1987) 1270 -1274), tällaista aggregaatiota .··. inhiboimaan kykeneviä vasta-aineita testataan sitten niiden kyvyn suhteen inhi- • · · . boida jonkin solulinjan forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, kuten SKW3:n • « * (Dustin, M., et ai.. J.Exoer.Med. 165 (1987) 672 - 692), jonka kykyä spontaanisti « · « * T aggregoitua forboliesterin läsnäollessa inhiboi vasta-aine, joka kykenee sitoutu- « · 1 : V maan LFA-1 :een, mutta eivät inhiboi ICAM-1-vastaiset vasta-aineet. Vasta-

• I

aineet, jotka kykenevät inhiboimaan solujen kuten JY-solujen forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, mutta eivät kykene inhiboimaan solujen kuten SKW3- 14 107451 solujen forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, ovat todennäköisesti ICAM-1-vastaisia vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti vasta-aineet, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1:een, voidaan tunnistaa seulomalla vasta-aineiden suhteen, jotka kykenevät inhiboimaan LFA-1-riippuvaisen aggregaation LFA:n ilmentävissä soluissa (kuten JY-soluissa), mutta eivät kykene sitoutumaan soluihin, jotka ilmentävät LFA-1 :n mutta vain vähän tai ei lainkaan ICAM-1:tä (kuten normaalit jyvässolut) tai kykenevät sitoutumaan soluihin, jotka ilmentävät ICAM-1 :n mutta eivät LFA-1 :tä (kuten TNF-aktivoidut endoteelisolut). Toinen vaihtoehto on immuunisaostus soluista, jotka ilmentävät ICAM-1 :n, LFA-1 :n tai molemmat käyttäen vasta-aineita, jotka inhiboivat solujen, kuten JY-solujen, LFA-1-riippuvaista aggregaatiota, jolloin SDS-PAGE:lla tai vastaavalla menetelmällä määritetään vastaaineen saostaman molekyylin joitakin molekyyliominaisuuksia. Jos ominaisuus on sama kuin ICAM-1 :n vastaava, vasta-aine voidaan olettaa ICAM-1-vastaiseksi vasta-aineeksi.

Käyttäen edellä kuvatulla tavalla valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita ICAM-1 -solupintamolekyyli puhdistettiin ja karakterisoitiin. ICAM-1 puhdistettiin ihmissoluista ja -kudoksesta käyttäen monoklonaalivasta-aine-affiniteetti-kroma-tografiaa. Tällaisessa menetelmässä ICAM-1 :n kanssa reagoiva monoklonaali-•, nen vasta-aine kytketään inerttiin kolonnimatriisiin. Tällaisen kytkennän saarni- seksi voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää; kuitenkin edullisesti käytetään « · « ,···, Oettgenin, H.C., et ai.. J.Biol.Chem. 259 (1984) 12034, menetelmää. Kun solu- • · lysaatti käytetään matriisin läpi, läsnä olevat ICAM-1-molekyylit adsorboituvat ja • « jäävät matriisiin. Muuttamalla kolonnin pH:ta tai ionipitoisuutta sitoutuneet • · · .··*. ICAM-1-molekyylit voidaan eluoida kolonnista. Vaikka mitä tahansa sopivaa • · · matriisia voidaan käyttää, edullisesti matriisimateriaalina käytetään Sepharose-geeliä (Pharmacia). Kolonnimatriisien muodostaminen ja niiden käyttö proteiinin • · .···. puhdistamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja.

«·· • · • « ·

Alan keskimääräistenkin taitajien hallitsemalla tavalla edellä kuvattuja määrityk- **:·’ siä voidaan käyttää yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka kykenevät heikentämään « * · : tai inhiboimaan solukiinnittymisen nopeutta tai laajuutta.

• · « · · • · « w 15 107451 ICAM-l on solupintaglykoproteiini, joka ilmentyy ei-verta-muodostavi 11 a soluilla, kuten verisuonten endoteelisolut, kateenkorva-epiteelisolut, tietyt muut epiteelisolut ja sidekudosmuodostussolut, ja vertamuodostavilla soluilla kuten kudossyöjäsolut, mitogeenistimuloidut T-imusolu-emosolut, ja imusolmukkeen itukeskus-B-solut ja hermosolun tuojahaarakeso-luilla risoissa, imusolmukkeissa ja Peyerin imusolmukkeissa. ICAM-1 ilmentyy voimakkaasti verisuonen endoteelisoluilla T-solu-alueilla imusolmukkeissa ja risoissa, jotka osoittavat reaktiivista liikakasvua. ICAM-1 ilmentyy alhaisina määrinä ääreisveren imusoluissa. Joidenkin myelomonosyyttisolulinjojen forboliesteri-stimuloitu differentiaatio lisää voimakkaasti ICAM-l-ilmennystä. Täten ICAM-1 ilmentyy ensisijaisesti tulehduskohdissa, eikä ilmenny yleensä "hiljaisissa" soluissa. ICAM-1-ilmennys ihon sidekudosmuodostussoluilla kasvaa kolminkertaisesta viisinkertaiseksi sekä interleukiini-I:n että gamma-interferonin vaikutuksesta tasoilla 10 U/ml neljän ja vastaavasti 10 tunnin aikana. Induktio riippuu proteiini- ja mRNA-synteesistä ja on takautuva.

ICAM-1 osoittaa molekyylipainoheterogeniaa eri solutyypeissä, • < jolloin molekyylipaino on 97 kd:tä sidekudosmuodostussoluilla, « * · ‘ 114 kd:tä myel omonosyyttisolul in jal la U937, ja 90 kd:tä B- ·...·’ varhaisimusolul la JY. ICAM-l:n biosynteesiin on todettu liittyvän noin 73 kd:n solunsisäisen prekursorin. Tunikamysii-:V: nillä (joka inhiboi glykosylaatiota) käsittelemällä saatavan ei-N-glykosyloidun muodon molekyylipaino on 55 kd:tä.

•

Forboliesterillä stimuloiduista U937-soluista tai sidekudos- * · · M muodostussoluista eristetyn ICAM-1:n pääasiallinen tuote on • · · • « · sama ja sen molekyylipaino on 60 kd:tä kemiallisen deglykosy- • · ·.· · laation jälkeen. ICAM-1-monoklonaalivasta-aineet häiritsevät fytohemagglutiniini-emosolujen kiinnittymistä solui in joihin, .·[·. joilta puuttuu LFA-1. Esikäsittelemällä sidekudosmuodostusso- • · · ] \ luja, mutta ei imusoluja, monoklonaalisilla vasta-aineilla, 16 107451 jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1:een, estetään imusolusi dekudosmuodostussolukiinnittyminen. Esikäsittel emä1lä imusoluja, mutta ei sidekudosmuodostussoluja, LFA-l-vastaisi1 la vasta-aineilla on todettu niinikään saatavan imusolu-sidekudos-muodostussolukiinnittymisen inhibitio.

ICAM-1 on täten CD18-kompleksin sitoutumisligandi valkosoluilla. Se on indusoitavissa sidekudosmuodostussoluilla ja endotee-lisoluilla in vitro tulehdusvälittäji11ä kuten IL-l:llä, gamma-interferonilla ja kasvainnekroositekijäilä aikavälillä, joka sopii imusolujen suodattumiseen tulehdusvauriokohtiin in vivo (Dustin, M.L., et ai ,, J. Immunol 137 (1986) 245 - 254; Prober, J.S., et ai ., J.Immunol. 137 (1986) 1893 - 1896). Edelleen ICAM-1 ilmentyy ei-vertamuodostavi11 a soluilla, kuten verisuonten endoteelisolui1la, kateenkorvan epiteelisoluilla, muilla epiteelisoluilla ja sidekudosmuodostussolui11 a ja vertamuodostavi11 a soluilla kuten kudossyöjäsolui 11 a, mitogeenistimuloidui11 a T-imusolu-emosoluilla ja imusolmukkeen itukeskus-B-solui11 a ja hermosolun tuojahaarakesolui11 a risoissa, imusolmukkeissa ja Peyerin imusolmukkeissa (Dustin, M.L., et ai . . J. Immunol. 137 (1986) 245 - 254). ICAM-1 ilmentyy keratinosyyteillä hyvänlaatuisissa tulehdusvaurioissa kuten yliherkkyysihottuma, ihon jäkälätauti, tulehdustautiin liittyvä v ihottuma, nokkosrokko ja rakkulasairaus. Allergisissa ihoreaktioissa, jotka oli aiheutettu sivelemällä potilaan iholle hapteenia, jolle tämä on yliherkkä, ilmeni myös voimakas • · ;1j1. ICAM-1-ilmennys keratinosyytei 11 ä. Toisaalta myrkylliset iholaastarit iholla eivät aikaansaaneet ICAM-l-ilmennystä keratinosyyteil lä. ICAM-l:tä esiintyy keratinosyytei 11 ä, jotka ♦ · · on saatu kudosnäytteistä, jotka ovat peräisin erilaisiin • · · \ 1 ihohäiriötiloihin liittyvistä ihovaurioista, ja ICAM-ilmennys • · · indusoituu yliherkkyyslaastarikoevaurioissa, kun taas : keratinosyytit myrkkylaastarikoevaurioissa eivät ilmentäneet ICAM-1:tä.

• · · i 1 t • 1 « 17 107451 ICAM-1 on täten solusubstraatti, johon imusolut voivat kiinnittyä, jolloin imusolut voivat migroitua tulehduskohtiin ja/tai suorittaa erilaisia efektorifunktioita, jotka myötävaikuttavat tähän tulehdukseen. Tällaisia funktioita ovat vasta-ainetuotanto, viruksen tartuttamien kohdesolujen lyysi jne. Tässä käytettynä ilmaisulla "tulehdus” tarkoitetaan sekä spesifisen että ei-spesifisen puolustusjärjestelmän reaktioita. Tässä käytettynä ilmaisulla "spesifinen puolustusjärjestelmä" tarkoitetaan immuunijärjestelmän osaa, joka reagoi spesifisten antigeenien läsnäoloon. Tulehduksen sanotaan olevan seurausta spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, jos tulehduksen aiheuttaa, tai sitä välittää, tai siihen liittyy spesifisen puolustusjärjestelmän reaktio. Esimerkkejä tulehduksesta, joka on seurausta spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, ovat vaste antigeeneille, kuten rubella-virukselle, autoimmuunisairaudet, viivästyneen tyypin T-soluvälitteinen yliherkkyysvaste (kuten esimerkiksi yksilöillä, joiden Mantaux-koe on "positiivinen"), jne.

"Ei-spesifinen puolustusjärjestelmäreaktio" on vaste, jota välittävät valkosolut, joilta puuttuu immunologinen muisti.

< * " Tällaisia soluja ovat jyvässolut ja syöjäsolut. Tässä 1 käytettynä tulehduksen sanotaan olevan seurausta ei-spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, jos tulehduksen aiheuttaa, sitä välittää tai siihen liittyy ei-spesif isen puol ustus jär-jestelmän reaktio. Esimerkkejä tulehduksesta, jotka ovat ·*·*; ainakin osittain seurausta ei-spesif isen puolustusjärjestelmän reaktiosta, ovat tulehdus, joka liittyy tiloihin kuten: täysi-kasvuisen hengityksen vajaatoiminta (ARDS) tai moniel invauri ot, • · · jotka seuraavat verenmyrkytystä tai ulkoista tapaturmaa; sydän- • · · *. lihaksen tai muun kudoksen reperfuusiovaurio; akuutti munuais- • · : kerästen tulehdus; reaktiivinen niveltulehdus; ihotaudit, »•e joihin liittyy akuutteja tulehduksellisia komponentteja; .·[·. akuutti märkäinen aivokalvontulehdus tai muu keskushermoston • · » ' tulehdustila; lämpövaurio; hemodialyysi; leukafereesi; 18 107451 haavainen paksusuolen tulehdus; Crohnin sairaus; kuoliota aiheuttava suolistotulehdus; jyvässolu-transfuusioon liittyvät oireyhtymät; ja sytokiini-indusoitu myrkyllisyys.

5 Tämän keksinnön mukaan saatuja funktionaalisia ICAM-1-johdannaisia, ja erityisesti sellaiset johdannaiset, jotka käsittävät ICAM-1 :n fragmentteja tai mutanttivariantteja, joissa on alueet 1, 2 ja 3, voidaan käyttää tällaisten ei-spesifisen puolustusjärjestelmän reaktioiden hoidossa tai terapiassa. Edullisempia tällaiseen hoitoon tai terapiaan ovat ICAM-1-fragmentit tai -mutanttiva-10 riantit, jotka sisältävät ICAM-1 :n alueen 2. Edullisempia tällaiseen hoitoon tai terapiaan oat ICAM-1-fragmentit tai -mutanttivariantit, jotka sisältävät ICAM-1 :n alueen 1.

Lisäksi esillä oleva keksintö tarkastelee ICAM-1 :n ja sen funktionaalisten joh-15 dannaisten käyttöä astman hoidossa.

C. ICAM-1-geenin kloonausta ICAM-1 -geenin kloonaamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa lukuisista me-20 nettelyistä. Yhdessä tällaisessa menetelmässä analysoidaan kuljetinvektorikir-jasto, joka koostuu cDNA-inserteistä (jotka on saatu ICAM-1 :n ilmentävästä solusta), insertin läsnäolon suhteen, joka sisältää ICAM-1-geenin. Tällainen analyysi voidaan suorittaa transfektoimalla soluja vektorilla ja määrittämällä > · [’ sitten ICAM-1-ilmennys. Edullisen menetelmän mukaan tämän geenin kloonaa- 25 miseksi määritetään ICAM-1-molekyylin aminohapposekvenssi. Tämän tehtä- ; · · · e · ; . väri suorittamiseksi ICAM-1-proteiini voidaan puhdistaa ja analysoida I * * I · · automaattisella sekventoijalla. Vaihtoehtoisesti molekyyli voidaan fragmentoida • · syaanibromidilia, tai proteaaseilla kuten papaiinilla, kymotrypsiinillä tai tryp-siinillä (Oike, Y„ et ai.. J.Biol.Chem. 257 (19821 9751 - 9785; Liu, C., et ai..

• · .···. 30 Int.J.Pept.Protein Res. 21 (1983) 209-215). Vaikka on mahdollista määrittää ICAM-1 :n aminohapposekvenssi kokonai- • · * « · · • · • · · • « • · «· · # » * • t · # · · I I I * • · • · · « · 107451 suudessaan, edullisesti määritetään molekyylin peptidifrag-menttien sekvenssi. Jos peptidit ovat pituudeltaan yli 10 aminohappoa, sekvenssi-informaatio on yleensä riittävä jonkin geenin kuten ICAM-l-geenin kloonaamiseksi.

Aminohappojäännöksien sekvenssi peptidissä merkitään tässä joko käyttämällä niistä yleisesti käytettyä 3-kirjaimista merkintää tai niiden 1-kirjain merkintää. Luettelo näistä 3- ja 1-kirjainmerkinnöistä voidaan etsiä käsikirjoista, kuten Biochemistry, Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY, 1970. Kun tällainen sekvenssi on merkitty pystysuoraan, tarkoitetaan aminopään jäännöksen sijaitsevan luettelossa ylimpänä, ja peptidin karboksyylipään jäännöksen luettelossa alimpana. Vastaavasti kun merkintä on vaakasuorassa, tarkoitetaan aminopään olevan vasemmalla ja karboksyylipään puolestaan oikealla viimeisenä. Peptidin käsittämät aminohappojäännökset voidaan erottaa väliviivoilla. Näiden väliviivojen tarkoitus on yksinomaan selkeyttää sekvenssimerkinnän ulkoasua. Pelkästään havainnollistavana esimerkkinä aminohapposekvenssi, joka on merkitty: -Gly-Ala-Ser-Phe- «i c ( tarkoittaa, että Ala-jäännös on kytketty Gly:n karboksyyliryh- mään, ja että Ser-jäännös on kytketty Ala-jäännöksen karboksyy- li ryhmään ja Phe-jäännöksen aminoryhmään. Merkintä ilmoittaa ' ' edelleen, että aminohapposekvenssi sisältää tetrapeptidin Gly- ·.·.· ALa-Ser-Phe. Merkinnän tarkoitus ei ole rajata aminohapposek- ♦ · · i venssiä tähän yhteen tetrapeptidiin, vaan sen tarkoituksena on käsittää (1) tetrapeptidi, jossa yksi tai useampi aminohappo- j*;*: jäännös on kytketty joko amino- tai karboksyylipäätyyn, (2) • ♦ tetrapeptidi, jossa yksi tai useampi aminohappo jäännös on \ kytketty sekä amino- että karboksyylipäätyyn, (3) tetrapeptidi, * · · :·: ' joka ei käsitä ylimääräisiä aminohappo jäännöksiä.

• · · • · « · • « « :Y: Sitten kun yksi tai useampi sopiva peptidifragmentti on sekventoitu, tarkastellaan niitä koodittamaan kykeneviä DNA- 20 1 0 7 4 51 sekvenssejä. Geneettisen koodin degeneraattiluonteen johdosta jonkin tietyn aminohapon koodittamiseen voidaan käyttää useampaa kuin yhtä kodonia (Watson, Molecular Biology of the Gene, 3. painos, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977 , ss. 356 - 357). Peptidifragmentteja analysoidaan aminohapposekvenssien tunnistamiseksi, joita kykenevät koodittamaan oligonukleo-tidit, joiden degeneraatti-aste on alhaisin. Tämä suoritetaan edullisesti tunnistamalla sekvenssejä, jotka sisältävät aminohappoja, joita koodittaa vain yksi ainoa kodoni. Vaikka toisinaan tällaisia aminohapposekvenssejä voi koodittaa vain yksi oiigonukleotidi, useimmiten aminohapposekvenssin kykenee koodittamaan useampi kuin yksi samankaltaisten oligonukleoti-dien sarjasta. Tärkeätä on, että kun sarjan kaikki jäsenet sisältävät oiigonukleotideja, jotka kykenevät koodittamaan peptidifragmentin, ja täten sisältävät mahdollisesti saman nukleotidisekvenssin kuin geeni, joka koodittaa peptidifrag-menttia, vain yksi sarjan jäsen sisältää nukleotidisekvenssin, joka on identtinen tämän geenin nukleotidisekvenssiin nähden. Koska tämä jäsen esiintyy sarjassa, ja kykenee hybridoitumaan DNAthan jopa sajan muiden jäsenien läsnäollessa, on mahdollista käyttää ei-fraktioitua oiigonukleotidisarjaa samalla tavalla kuin käytettäisiin yksittäistä oligonukleotidia peptidiä koodittavan geenin kloonaamiseksi.

Edellä kuvattuun nähden täysin analogisesti voidaan käyttää • · oligonukleotidia (tai oi igonukl eotidisar jaa) , jonka nukleoti- ··· *.· · disekvenssi komplementoi oligonukleotidisekvenssiä, tai sek-venssisarjaa, joka kykenee koodittamaan peptidifragmentin.

• · • · · • · · • · :*·*: Sopiva oi igonukl eotidi , tai sopivia oi igonukl eotidide ja, joka . kykene/jotka kykenevät koodittamaan ICAM-l-geenifragmentin, • · · **!.* (tai joka kykenee kömpiementoimaan tällaista oligonukleotidia, • « *·;·* tai oi igonukl eotidisar jaa) tunnistetaan (käyttäen edellä : : : kuvattua menettelyä), syntetisoidaan ja hybridoidaan alalla *:·*: hyvin tunnettuun tapaan DNA:hän tai edullisemmin cDNA-valmis- 21 107451 teeseen, joka on saatu ihmissoluista, jotka kykenevät ilmentämään ICAM-l-geenisekvenssejä. Nukleiinihappohybridoin-titekniikoita julkistavat Maniatis, T., et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Coldspring Harbor, NY, 1982, ja Haymes, B.D., et al♦. Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985, jotka viitteet liitetään tähän viitteiksi. Käytetty DNA- tai cDNA-lähde on edullisesti rikastettu ICAM-l-sekvenssien suhteen. Tällainen rikastuminen voidaan helpoimmin saada cDNA:sta, joka on saatu uuttamalla RNA soluista, joita on viljelty olosuhteissa, jotka indusoivat ICAM-l-synteesiä (kuten U937, jota kasvatetaan forboliesterin läsnäollessa, jne.).

Edellä kuvatuilla tai niiden kaltaisilla tekniikoilla on menestyksekkäästi kyetty kloonaamaan ihmisen aldehydidehydro-genaasigeenejä (Hsu, L.C., et ai. . Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82 (1985) 3771 - 3775), fibronektiinigeeni (Suzuki, S., et ai..

Eur.J.Mol .Biol.Organ.J. 4 (1985) 2519 - 2524), ihmisen estro-geenireseptorigeeni (Walter, P., et ai ., Proc.Nat1.Acad.Sci.

USA 82 (1985) 7889 - 7893), kudostyyppi-plasminogeeniaktivaat-torigeeni (Pennica, D., et ai . . Nature 301 (1983) 214 - 221) ja ihmisen istukan alkalisen fosfataasin kömpiementti-DNA (Kam, W., et ai., Proc.Natl.Acad.Sei. USA 82 (1985) 8715 - 8719).

.. Edullisen vaihtoehtoisen tavan mukaan ICAM-l-geenin kloonaami- • · · *.* seksi valmistetaan ilmennysvektorikirjasto kloonaamalla DNA tai • · ♦ - *·* * edullisemmin cDNA ICAM-l:n ilmentämään kykenevästä solusta ilmennysvektoriin. Sitten kirjasto seulotaan jäseniensä • · V.: suhteen, jotka kykenevät ilmentämään proteiinin, joka sitoutuu • * · V · ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen, ja jolla on sellainen nuk- : .·. leotidisekvenssi, että se kykenee koodittamaan polypeptidejä, • · · ’♦··. joilla on sama aminohapposekvenssi kuin ICAM-l:llä tai ICAM-1- « · fragmenteilla.

• » • · · • · · • · *·"’· Kloonattu ICAM-l-geeni, joka on saatu edellä kuvatuilla 22 1 0 7 4 51 menetelmillä, voidaan toiminnallisesti kytkeä ilmennysvek-toriin, ja viedä bakteerisoluihin tai eukaryoottisiin soluihin ICAM-l-proteiiinin tuottamiseksi. Tekniikoita tällaisia suorituksia silmälläpitäen julkistavat Maniatis, T., et ai., supra. ja ne ovat alalla hyvin tunnettuja.

D. LFA-l-riippuvaisen aggregaation määrityksien käyttöjä

Edellä kuvattua määritystä, jolla kyetään mittaamaan LFA-1-riippuvaista aggregaatiota, voidaan käyttää aineiden tunnistamiseksi, jotka toimivat antagonisteina inhiboiden LFÄ-1-riippuvaisen aggregaation astetta. Tällaiset antagonistit voivat toimia häiritsemällä LFA-l:n tai ICAM-l:n kykyä välittää aggregaatiota. Täten tällaisia aineita ovat immunoglobuliinit kuten vasta-aine, joka kykenee sitoutumaan joko LFA-l:een tai ICAM-l:een. Lisäksi ei-immunoglobuliini- (eli kemiallisia) aineita voidaan tutkia käyttäen edellä kuvattu määritystä sen määrittämiseksi, ovatko ne LFA-l-aggragaation antagonisteja.

E. ICAK-l-reseptoriproteiineihin sitoutumaan kykenevien vasta- i”'·· aineiden käyttöjä I. Tulehdusvastaiset aineet • tili CD18-kompl eksi jäsenien vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet • · · inhiboivat valkosolujen monia kiinnitysriippuvaisia funktioita, • t · mukaanlukien sitoutuminen endoteeliin (Haskard, D., et ai., .. J. Immunol. 137 (1986) 2901 - 2906), homotyyppiset kiinnitty- • ♦ · 'ill miset (Rothlein, R. , et ai . , J.Exp.Med. 163 (1986) 1132 - • · · *·* ’ 1149), antigeeni- ja mitogeeni-indusoitu imusolujen lisään- i tyminen (Davignon, D. , et ai . , Proc.Nat 1, Acad. Sei . USA 78 ··* · (1981) 4535 - 4539), vasta-ainemuodostus (Fischer, A., et ai , I 11 J. Immunol. 136 (1986) 3198 - 3203), ja kaikkien valkosolujen • · · *'·* efektorifunktiot kuten sytotoksinen 1 yysiaktiivisuus T-soluilla (Krensky, A.M., et ai, J. Immunol. 132 (1984) 2180 - 2182), 23 107451 syöjäsoluilla (Strassman, G., et ai . , J. Immunol. 136 (1986) 4328 - 4333), ja kaikilla soluilla, jotka osallistuvat vasta-aiueriippuvaisiin solusytotoksisuusreaktioihin (Kohl, S., et ai .. J.Immunol. 133 (1984) 2972 - 2978). Kaikissa edeltävissä funktioissa vasta-aineet inhiboivat valkosolun kykyä kiinnittyä sopivaan solusubstraattiin, mikä puolestaan inhiboi lopputulosta.

Kuten edellä esitetty ICMA-l-molekyylien sitoutuminen LFA-1-ryhmämolekyyleihin on ensiarvoisen merkityksellistä solukiin-nittymisessä. Kiinnitysprosessin välityksellä imusolut kykenevät jatkuvasti tarkkailemaan eläintä vieraiden antigeenien läsnäolon varalta. Vaikka nämä prosessit ovat normaalisti toivottavia, ne voivat niinikään aiheuttaa elinsiirrehyljintää, kudossiirrehyljintää ja monia autoimmuunisairauksia. Täten mikä tahansa keino, jolla kyettäisiin heikentämään tai inhiboimaan solukiinnitystä, olisi erittäin toivottava elinsiirre-, kudossiirrevastaanottajille sekä autoimmuunipotilaille.

ICAM-l:een sitoutumaan kykenevät monoklonaaliset vasta-aineet t t sopivat erittäin hyvin tulehdusvastaisiksi aineiksi nisäkäskoh-

I I I

' teessä. Merkittävästi tällaiset aineet poikkeavat yleisistä tulehdusvastaisista aineita sikäli, että ne kykenevät selek- tiivisesti inhiboimaan kiinnittymistä, eivätkä tuota muita iY: sivuvaikutuksia, kuten myrkyllisyys munuaisille, joita tavataan • · ·*{*; tavanomaisilla aineilla. ICAM-l:een sitoutumaan kykeneviä « monoklonaalisiä vasta-aineita voidaan tämän vuoksi käyttää estämässä elin- tai kudoshyl jintää ja autoimmuunivasteiden • · · ’·. modifioimiseksi pelkäämättä tällaisia sivuvaikutuksia nisäkäs- • · · • t · kohteessa.

• i • * · • t · ··· · ··* ί,,.ϊ Merkittävästi, käyttämällä ICAM-l:n tunnistamaan kykeneviä .V. monoklonaalisia vasta-aineita kyetään mahdollisesti suorit-

I I I

tamaan elinsiirtoja jopa HLA-ei-yhteensopivien yksilöiden * « välillä.

24 107451 2. Viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktion suppressorit

Koska ICAM-l-molekyylit ilmentyvät valtaosin tulehduskohdissa, kuten kohdissa, joissa esiintyy viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktio, ICAM-l-molekyyleihin sitoutumaan kykenevillä (erityisesti monoklonaalisilla) vasta-aineilla on terapeuttisia käyttömahdollisuuksia tällaisten reaktioiden heikentämiseksi tai eliminoimiseksi. Tätä terapeuttista käyttömahdollisuutta voidaan hyödyntää jommallakummalla kahdesta tavasta. Ensinnäkin koostumusta, joka sisältää ICAM-l-vastaista monoklonaalista vasta-ainetta, voidaan antaa potilaalle, jolla on viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktio. Esimerkkiksi tällaisia koostumuksia voidaan antaa yksilölle, joka on joutunut kosketuksiin antigeenien kuten myrkkymuratin, myrkkytammen jne., kanssa.

Toisessa suoritusmuodossa ICAM-l:een sitoutumaan kykenevää monoklonaalista vasta-ainetta annetaan potilaalle yhdessä antigeenin kanssa myöhemmän tulehdusreaktion estämiseksi. Täten antamalla ICAM-l:een sitoutuvan monoklonaalisen vasta-aineen ohella antigeeniä voidaan tilapäisesti saada yksilö sietämään , myöhempää altistusta tuolle antigeenille.

* I < ‘ 3. Terapia kroonisille tulehdussairauksille

Koska LAD-poti 1 aat, joilta puuttuu LFÄ-1, eivät tuota tuleh-dusvastetta, arvellaan, että LFA-l:n luontaisen ligandin, ICAM-l:n, antagonismi niinikään estää tul ehdusvasteen. ICAM-1-vastaisten vasta-aineiden kyky inhiboida tulehdusta on perusta niiden terapeuttiselle käytölle kroonisten tulehdussairauksien • · · • 4 ja autoimmuunisairauksien hoidossa, kuten punahukka, autoim- 4 4 4 muuni-kilpirauhastulehdus, kokeellinen aivojen ja selkäytimen 4 4 ! yliherkkyystulehdus (EAE) , multippeliskleroosi, Reynaudin 4 4 4 ·...* oireyhtymän tietyt muodot, nivelreuma, jne. Tällaisia vasta- .·.·. aineita voidaan käyttää terapiana myös hi 1 setystaudin hoidossa.

4 4

Yleensä ottaen ICAM-l:een sitoutumaan kykenveiä monoklonaalisia 4 4 vasta-aineita voidaan käyttää sellaisten sairauksien hoidossa, 25 107451 joita tällä hetkellä hoidetaan steroiditerapialla.

4. Diagnostisia ja prognostisia käyttöjä

Koska ICAM-1 ilmentyy pääasiassa tulehduskohdissa, ICAM-l:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää keinona tartunta- ja tulehduskohdan kuvantamiseksi tai visualisoimiseksi potilaassa- Tällaisessa käytössä monoklonaaliset vasta-aineet leimataan todettavalla leimalla, käyttäen radioisotooppeja, affiniteettileimoja (kuten biotiini, avidii-ni, jne.), fluoroivia leimoja, paramagneettisia atomeja jne. Menettelyt tällaisen leimaamisen suorittamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja. Vasta-aineiden kliinistä käyttöä diagnostisessa kuvantamisessa tarkastelevat Grossman, H.B.,

Urol.Clin.North Amer. 13 (1986) 465 - 474; Unger, E.C., et ai., Invest.Radioi 20 (1985) 693 - 700, ja Khaw, B.A., et ai♦, Science 209 (1980) 295 - 297.

Tulehduksen läsnäolo voidaan niinikään todeta käyttämällä ,·, sitoutumisl igande ja, kuten mRNA, cDNA tai DNA, joka sitoutuu ICAM-l-geenisekvensseihin, tai ICAM-l-mRNA-sekvensseihin, ICAM-l:n ilmentävissä soluissa. Tekniikoita tällaisten hybridointi-“ määrityksien suorittamiseksi kuvaavat Maniatis, T. (supra.).

« C l i • · Tällaisten todettavalla leimalla leimattujen vasta-aineiden « ·· . : sijaintipaikan toteaminen merkitsee tulehduskohtaa tai kasvainkehitystä. Yhdessä suoritusmuodossa tämä tulehduksen etsintä suoritetaan ottamalla kudos- tai verinäytteitä ja • 1 ;1·1; inkuboimalla tällaisia näytteitä todettavalla leimalla lei- .1. mattujen vasta-aineiden läsnäollessa. Edullisessa suoritus- • · · 2 2 · muodossa tämä tekniikka toteutetaan ei-invasiivisel la tavalla • « · • · ’···’ käyttäen magneettikuvannusta, fluorografiaa jne. Tällaista :Y: diagnostista koetta voidaan käyttää elinsiirrevastaanottajien ....: tarkkailemiseksi mahdollisen kudoshyl jinnän varhaisten merkkien varalta. Tällaisia määrityksiä voidaan suorittaa samoin 26 1 0 7 4 51 pyrittäessä määrittämään potilaan taipumus nivelreumaan tai muihin kroonisiin tulehdussairauksiin.

5. Apuaine antigeenisen materiaalin antamiseksi terapeuttisessa tai diagnostisessa tarkoituksessa

Immuunivasteet terapeuttisille tai diagnostisille aineille kuten esimerkiksi nautainsuliini, interferoni, kudostyypin plasminogeeniaktivaattori tai hiiren monoklonaaliset vasta-aineet, heikentävät huomattavasti tällaisten aineiden terapeuttista tai diagnostista arvoa ja voivat itse asiassa aiheutta sairauksia kuten seerumisairauden. Tällaista tilannetta voidaan helpottaa käyttämällä tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita. Tässä suoritusmuodossa tällaisia vasta-aineita annettaisiin yhdessä terapeuttisen tai diagnostisen aineen kanssa. Vasta-aineita lisäämällä estetään vastaanottajaa tunnistamasta ainetta, jolloin vastaanottajaa estetään käynnistämästä sen vastaista immuunivastetta. Seurauksena tällaisen immuunivasteen puuttumisesta potilaalle voidaan antaa enemmän terapeuttista tai diagnostista ainetta.

F. Solujen välisen kiinnikemolekvvli-1:n (ICAM-1) käyttöjä ICAM-1 on LFA-l:n sitoutumispari. Sellaisena ICAM-1:tä tai sen • · funktionaalisia johdannaisia voidaan käyttää vastavuoroisesti vaihdettavasta LFA-l:een sitoutumaan kykenevien vasta-aineiden kanssa sairauden hoidossa. Täten liukoisessa muodossa tällaisia molekyylejä voidaan käyttää tulehduksen, elinhyl jinnän, siirre- • · hyi jinnän, jne., estämiseksi. ICAM-l:tä tai sen funktionaalisia ♦ « · johdannaisia voidaan käyttää vastaavalla tavalla ICAM- « m : vastaisina vasta-aineina terapeuttisten tai diagnostisten « · a aineiden immunogeenisyyden alentamiseksi. 1 teja voidaan käyttää ICAM-l:n tai LFA-l:n pinnoillaan ilmen- · · ICAM-1 :tä, sen funktionaalisia johdannaisia ja sen antagonis- • · 27 107451 tavien kasvainsolujen etäispesäkemuodostuksen tai lisääntymisen salpaami-seksi. Tällaisen päämäärän saavuttamiseksi voidaan käyttää lukuisia menetelmiä. Esimerkiksi vertamuodostavien solujen migraatio edellyttää LFA-1-ICAM- 1-sitoutumista. Tällaisen sitoutumisen antagonistit estävät siksi tämän migraa-5 tion ja salpaavat etäispesäkkeiden muodostamisen valkosolulinjojen kasvain-soluista. Vaihtoehtoisesti potilaalle voidaan antaa toksiinijohdannaismolekyyle-jä, jotka kykenevät sitoutumaan joko ICAM-1 :een tai LFA-1-ryhmämolekyyliin. Tällaisten toksiinijohdannaismolekyylien sitoutuessa käsvainsoluihin, jotka ilmentävät ICAM-1:n tai LFA-1-ryhmämolekyylin, toksiinin läsnäolo tappaa 10 kasvainsolun estäen siten kasvaimen kasvun.

C. ICAM-1-riippuvaisen kiinnittymisen ei-immunoalobuliini antagonistien käyttöjä 15 ICAM-1 -riippuvainen kiinnittyminen voidaan estää ei-immunoglobuliini-anta- gonisteilla, jotka kykenevät sitoutumaan joko ICAM-1 :een tai LFA-1:een. Yksi esimerkki ICAM-1 :n ei-immunoglobuliini-antagonistista on LFA-1. Esimerkki ei-immunoglobuliini-antagonistista, joka sitoutuu LFA-1 :een, on ICAM-1. Käyttämällä edellä kuvattuja määrityksiä voidaan tunnistaa ja puhdistaa muita ei-20 immunoglobulini-antagonisteja. ICAM-1-riippuvaisen kiinnittymisen ei-immuno-globuliini-antagonisteja voidaan käyttää samassa tarkoituksessa kuin LFA-1 -vastaisia vasta-aineita tai ICAM-1 -vastaisia vasta-aineita.

• H. Tämän keksinnön mukaan saatujen koostumuksien antaminen « 25 ; · · · ICAM-1 :n terapeuttiset vaikutukset voidaan saada antamalla potilaalle ICAM-1- ( i · molekyyliä kokonaisuudessaan, tai sen mitä tahansa terapeuttisesti aktiivista I · · peptidifragmenttia.

« · · • · .'···. 30 ICAM-1 ja sen funktionaaliset johdannaiset voidaan saada joko synteettisesti, käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa tai proteolyyttisesti. ICAM-1 :n terapeut- • · · *:/.* tisia etuja voidaan lisätä käyttämällä ICAM-1 :n funktionaalisia johdannaisia, • « joihin on lisätty ylimääräisiä aminohappojäännöksiä kytkemisen kantajaan * · I I « « » · • I · · • * ♦ · * • «· • « 28 107451 helpottamiseksi tai ICAM-1:n aktiivisuuden tehostamiseksi. Tämän keksinnön piiriin tarkoitetaan edelleen kuuluvaksi ICAM-1 :n funktionaaliset johdannaiset, joista puuttuvat tietyt aminohappojäännökset, tai jotka sisältävät muutettuja aminohappojäännöksiä, kunhan tällaiset johdannaiset osoittavat kykyä vaikut-5 taa solukiinnitykseen.

Sekä esillä olevan keksinnön mukaan saadun ICAM-1-molekyylin sanotaan "oleellisesti ei sisältävän luontaisia epäpuhtauksia", jos sitä sisältävät valmisteet ovat oleellisesti vapaita materiaaleista, joiden yhteydessä näitä tuotteita 10 normaalisti ja luontaisesti esiintyy.

Annettaessa potilaalle ICAM-1 :tä (tai sen fragmenttia, varianttia tai johdannaista) vastaanottavalle potilaalle annetun aineen annostus vaihtelee riippuen tekijöistä kuten potilaan ikä, paino, pituus, sukupuoli, yleinen terveydentila, 15 aiempi sairaushistoria jne. Annettaessa potilaalle ICAM-1-molekyylejä tai niiden funktionaalisia johdannaisia, edullisesti tällaisia molekyylejä annetaan annostus, joka samoin on noin 1 pg/kg -10 mg/kg (potilaan ruumiinpainoa), vaikka voidaan antaa alempiakin tai korkeampiakin annostuksia. Kuten alla esitetään terapeuttisesti tehokasta annosta voidaan alentaa, jos LFA-1-vastai-20 sen vasta-aineen ohella annetaan ICAM-1-vastaista vasta-ainetta. Tässä käytettynä yhdistettä sanotaan annettavan toisen yhdisteen ohella, jos näiden kahden yhdisteen antaminen suoritetaan ajallisesti niin lähellä toisiaan, että kumpaakin yhdistettä voidaan todeta samanaikaisesti potilaan seerumista.

I · f · < * · < · 25 Sekä ICAM-1 :een sitoutumaan kykenevää vasta-ainetta että itse ICAM-1 :tä I t · · · ; . voidaan antaa potilaille laskimonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihonalaisesti, I I * ruoansulatuskanavan kautta tai sen ulkopuolisesti. Annettaessa vasta-aine tai * * · ' ICAM-1 ruiskuttamalla antaminen voidaan suorittaa jatkuvan nestesiirron väli- ...e tyksellä tai kerta- tai moniannoksena.

30 *·* Kyseisen keksinnön mukaan saatuja tulehdusvastaisia aineita on tarkoitus *;’·/ antaa vastaanottaville kohteille määrä, joka on riittävä tukahduttamaan tuleh- • · **:·" duksen. Määrän sanotaan olevan riittävä "tukahduttamaan" tulehduksen, jos • ♦ I · » • » · · • · · * · · 107451 aineen annostus, antotie jne. ovat riittävät heikentämään tai estämään tulehduksen.

ICAM-1-vastainen vasta-aine tai sen fragmentti voidaan antaa joko yksinään 5 tai yhdistettynä yhteen tai useampaan immuunivastetta heikentävään aineeseen (erityisesti elin- tai kudossiirrevastaanottajalle). Tällainen yksi tai useampi yhdiste voidaan antaa "ennaltaehkäisevässä" tai "terapeuttisessa" tarkoituksessa. Annettaessa yhtä tai useampaa immuunivastetta heikentävää yhdistettä ennaltaehkäisevästi ne annetaan ennen minkään tulehdusvasteen tai -oireen 10 ilmenemistä (esimerkiksi ennen, samanaikaisesti kuin, sen jälkeen kun suoritetaan elin- tai kudossiirto mutta ennen kuin ilmenee oireita kudoshyljinnästä). Yhden tai useamman yhdisteen ennaltaehkäisevän antamisen tehtävänä on estää tai heikentää mahdollista myöhempää tulehdusvastetta (kuten esimerkiksi siirretyn elimen tai kudoksen hyljintää, jne.). Kun yhtä tai useampaa im-15 muunivastetta heikentävää yhdistettä annetaan terapeuttisesti, se/ne annetaan samanaikaisesti kuin (tai pian sen jälkeen kun) varsinainen tulehdusoire (kuten esimerkiksi elimen tai kudoksen hyljintä) käynnistyy (tai on käynnistynyt). Yhden tai useamman yhdisteen terapeuttisen annon tehtävänä on heikentää mahdollista tosiasiallista tulehdusta (kuten esimerkiksi siirretyn elimen tai 20 kudoksen hyljintä). Esillä olevan keksinnön mukaisia tulehdusvastaisia aineita voidaan täten antaa joko ennen tulehduksen käynnistymistä (kuten ennakoidun tulehduksen tukahduttamiseksi) tai tulehduksen käynnistymisen jälkeen.

Koostumuksen sanotaan olevan "farmakologisesti hyväksyttävä", jos vastaan-25 ottava potilas voi sietää sen annon. Tällaista ainetta sanotaan annettavan c < · · « | . "terapeuttisesti tehokas määrä", jos annettu määrä on fysiologisesti merkittävä.

I I I

*Aine on fysiologisesti merkittävä, jos seurauksena sen läsnäolosta todetaan

« · I

t · · * muutos vastaanottavan potilaan fysiologiassa.

* · · 4 * 30 Esillä olevan keksinnön mukaan saadut ICAM-1-molekyylit voidaan koostaa tunnetuilla menetelmillä farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostumuksien vai- • · ► mistamiseksi, jolloin näitä materiaaleja, tai niiden funktionaalisia johdannaisia, « · T yhdistetään seokseksi farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan. Sopivia • ♦ * ♦ · < « · • · » * » * • ♦ · • K • « 30 107451 kantajia ja niiden koostamista, mukaan lukien muut humaaniproteiinit, esim. humaaniseerumialbumiini, kuvataan esimerkiksi käsikirjassa "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. painos, Osol, A., toim. Mack, Easton PA, 1980. Farmaseuttisesti hyväksyttävän koostumuksen muodostamiseksi, joka soveltuu tehokkaaseen antoon, tällainen koostumus sisältää tehokkaan määrän ICAM-vastaista vasta-ainetta tai ICAM-1-molekyyliä, tai niiden jotain funktionaalista johdannaista, yhdessä sopivan määrän kantajaa kanssa.

Muita farmaseuttisia menetelmiä voidaan käyttää vaikutuksen keston kontrolloimiseksi. Kontrolloidun vapautumisen valmisteita voidaan saada käyttämällä polymeerejä ICAM-1-vastaisen vasta-aineen tai ICAM-1 :n, tai niiden funktionaalisten johdannaisten, kompleksoimiseksi tai absorboimiseksi. Kontrolloituun vapautumiseen voidaan päästä valitsemalla tarkoituksenmukaisia makromolekyylejä (esimerkiksi polyesterit, polyaminohapot, polyvinyylipyrrolidoni, etyleeni-vinyyliasetaatti, metyyliselluloosa, karboksimetyyliselluloosa, tai protamiinisul-faatti) ja makromolekyylien pitoisuuksia sekä menetelmiä niiden sisällyttämiseksi vapautumisen kontrolloimiseksi. Toinen mahdollinen menetelmä vaikutuksen keston säätelemiseksi käytettäessä kontrolloidun vapautumisen valmisteita on sisällyttää ICAM-1-vastainen vasta-aine tai ICAM-1-molekyylejä, tai niiden funktionaalisia johdannaisia, polymeerimateriaalihiukkasiin, jolloin materiaaleina tulevat kyseeseen polyesterit, polymaminohapot, hydrogeelit, poly(maitohappo) tai etyleenivinyyliasetaattikopolymeerit. Vaihtoehtoisesti sen sijaan että nämä aineet sisällytettäisiin polymeerihiukkasiin, on mahdollista sulkea nämä materiaalit mikrokapseleihin, jotka on valmistettu esimerkiksi koaservaatiotekniikoilla tai rajapintapolymeroinnilla, esimerkiksi hydroksimetyyliselluloosa- tai gelatiini-mikrokapseleihin ja vastaavasti poly(metyylimetasylaatti)mikrokapseleihin, tai kolloidisiin lääkekuljetusjärjestelmiin, esimerkiksi liposomeihin, albumiinimikro-palloihin, mikroemulsioihin, nanohiukkasiin ja nanokapseleihin tai makroemulsi-oihin. Tällaisia tekniikoita julkistetaan käsikirjassa "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1980.

Kuvattuamme nyt keksintöä yleisesti se tulee ymmärrettävämmäksi tutustumalla seuraaviin esimerkkeihin, jotka esitetään havainnollistamismielessä, jolloin 31 107451 niiden tarkoituksena ei ole rajoittaa esillä olevaa keksintöä, ellei siten nimenomaan mainittu.

ESIMERKKI 1 Nisäkässolujen viljely

Yleensä ottaen esillä olevan keksinnön mukaisia EBV-transformoituja soluja ja hybridoomasoluja säilytettiin RPMI 1640--kasvualustassa, jota oli täydennetty pitoisuudella 20 mM L-glutamiinia, 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä ja 10 %:lla nautasikiö- (tai vasikansikiö-) seerumia. Soluja viljeltiin 37°C:ssa 5 % hiilidioksidia käsittävässä ilmakehässä 95 %:n ilman suhteellisessa kosteudessa.

Epstein-Barr-virus- (EBV-) transformanttien saamiseksi 106 kpl:ta T-soluja, joista oli poistettu ääreisveren yksitumasolut, millilitraa kohden RPMI 1640-kas-vualustaa, jota oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia (FCS) ja 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä, inkuboitiin 16 tunnin ajan B95-8-solujen EBV-pitoi-sella supernatantilla (Thorley-Lawson, D.A., et ai.. J.Exper.Med. 146 (1977) 495). 0,2 ml:n solu-eriä sijoitettiin 10 mikrotiitterilevykuoppaan. Kasvualustaa korvattiin RPMI 1640-kasvualustalla 0‘ota oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia ja 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä) kunnes havaittiin solukasvua. Soluja kasvoi useimmissa kuopissa ja niitä lisäännytettiin samassa kasvualustassa. Fytohemagglutiniini- (PHA-) emosoluja sijoitettiin pitoisuudeksi 106 so-lua/ml RPMI 1640 -kasvualustaan Göta oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia), joka sisälsi 1:800 laimennoksena PHA-P:tä (Difco Laboratories, Inc., Detroit, Ml). PHA-solulinjoja lisäännytettiin interleukiini-2:Ila (IL-2:lla) käsitellyssä kasvualustassa ja käsiteltiin viikoittain PHA:lla (Cantrell, D.A., et ai.. J.Exper.Med. 158 (1983) 1895).

Edeltävän menettelyn julkisti Springer, T., et ai.. J.Exper.Med. 160 (1984) 1901 -1918, joka viite sisällytetään tähän viitteeksi. Edeltävällä menettelyllä saadut solut seulotaan sitten LFA-1-vastaisilla vasta-aineilla sen määrittämiseksi, ilmentävätkö ne LFA-1-antigeenin. Tällaisia vasta-aineita julkistavat Sanchez-Madrid, F., et ai.. J.Exper.Med. 158 (1983) 1785.

32 107451 ESIMERKKI 2

Soluaggregaation ja -kiinnityksen määrityksiä

Solukiinnityksen asteen määrittämiseksi käytettiin aggregaatiomäärityksiä. Näissä määrityksissä käytetyt solulinjat pestiin kahdesti RPMI 1640-kasvualustalla, joka käsitti pitoisuuden 5 mM Hepes-puskuria (Sigma Chemical, Co., St. Louis), ja uudelleenlietettiin pitoisuudeksi 2 x 106 solua/ml. Tasapohjaisiin, 96 kuopan mikrotiitterilevyihin (n:o 3596, Costar, Cambridge, MA) lisättiin 50 mikrolitraa sopivaa monoklonaalivasta-ainesupernatanttia tai 50 mikrolitraa täydellistä kasvualustaa, joka sisälsi tai ei sisältänyt puhdistettuja monoklonaalisia vasta-aineita, 50 mikrolitraa täydellistä kasvualustaa, joka sisälsi 200 ng/ml forbolies-teri forbolimyristaattiasetaattia (PMA), ja 100 mikrolitraa soluja pitoisuudeksi 2 x 106 solua/ml täydellistä kasvualustaa. Tällöin loppupitoisuudeksi tuli 50 ng/ml PMA:ta ja 2 x 105 solua/kuoppa. Solujen annettiin laskeutua vapaasti, jolloin aggregaatio-aste arvosteltiin eri ajankohtina. Arvot vaihtelivat välillä 0 - 5+, jolloin 0 merkitsi, että oleellisesti lainkaan soluja ei ollut rykelmissä; 1+ merkitsi, että alle 10 % soluista oli aggregaateissa; 2+ merkitsi, että alle 50 % soluista oli aggregoitunut; 3+ merkitsi, että solut olivat 100 %:isesti pienissä, irtonaisissa rykelmissä; 4+ merkitsi, että solut olivat 100 %:isesti aggregoituneet suuremmiksi rykelmiksi; ja 5+ merkitsi, että solut olivat 100 %:isesti suurissa, hyvin tiiviissä rykelmissä. Kvantitatiivisemman arvion saamiseksi solukiinnityksestä reagens-seja ja soluja lisättiin 5 ml:n polystyreeniputkiin samassa järjestyksessä kuin edellä. Putket asetettiin telineessä kiertoravistelijaan 37°C:seen. Putkia ravisteltiin tunnin ajan noin 200 kierr./min kierrosnopeudella, minkä jälkeen 10 mikrolitraa solususpensiota sijoitettiin hemosytometriin ja kvantitoitiin vapaiden solujen lukumäärä. Aggregaatio-% laskettiin seuraavasta yhtälöstä: vapaiden solujen lukumäärä aggregaatio-% = 100 x (1-------------------------------------- käytettyjen solun lukumäärä Käytettyjen solujen lukumäärä edellisessä kaavassa on solujen lukumäärä milli-litrassa verrokkiputkisisältöä, joka sisälsi vain soluja ja täydellistä kasvualustaa ja jota ei inkuboitu. Vapaiden solujen lukumäärä edeltävässä yhtälössä on sama 33 107451 kuin ei-aggregoitujen solujen lukumäärä millilitrassa kokeessa käytettyä putki-sisältää. Edeltäviä menettelyitä on kuvannut Rothlein, R., et ai.. J.Exoer.Med. 163(1986) 1132 1149.

ESIMERKKI 3 LFA-1-riippuvainen solu-aggregaatio

Esimerkissä 2 kuvattua kvalitatiivista aggregaatiota mittaava määritys suoritettiin käyttäen Epstein-Barr-transformoitua solulinjaa JY. Lisättäessä PMA:ta kasvualustaan mikrotiitterilevyillä todettiin solu-aggregaatiota. Ajankuluvideonauhoi-tukset osoittivat, että JY-solut mikrotiitterilevyjen pohjalla olivat liikkuvia ja osoittivat aktiivista membraanin rypistymistä ja valejalkaliikettä. Naapurussolujen valejalkojen välinen kontakti johti usein solu-solukiinnittymiseen. Jos kiinnittyminen oli pitävä, solukontaktialue siirtyi uropodiin. Kontakti pystyttiin säilyttämään huolimatta kiivaasta soluliikehdinnästä ja solujen vedosta vastakkaisiin suuntiin. PMA:lla käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen solujen välinen pääasiallinen ero vaikutti olevan näiden kontaktien stabiilisuudessa kontaktien kerran muodostuttua.

PMA.IIa muodostui solurykelmiä, jotka kasvoivat kooltaan sitä mukaa kun lisää soluja kiinnittyi niiden äärilaitamille.

Toisena keinona kiinnityksen mittaamiseksi käytettiin esimerkissä 2 kuvattua kvantitatiivista määritystä. Solususpensioita ravistettiin 200 kierr./min kierrosno-peudella 2 tunnin ajan, minkä jälkeen ne siirrettiin hemosytometriin ja laskettiin sellaisten solujen lukumäärä, jotka eivät olleet aggregaateissa. PMA:n puuttuessa 42 % (SD = 20 %, N = 6) JY-soluista oli aggregaateissa 2 tunnin kuluttua, kun taas JY-soluista, joita oli inkuboitu identtisissä olosuhteissa 50 ng:lla/ml PMA:ta, 87 % (SI) = 8 %, N = 6) oli aggregaateissa. Aggregaation kineettisissä tutkimuksissa ilmeni, että PMA tehosti aggregaation nopeutta ja laajuutta kaikkina testattuina ajankohtina (kuvio 3).

„ 107451 34 ESIMERKKI 4

Solujen aggregaation inhibitio käyttäen LFA-1 -vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita LFA-1-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksien PMA-indusoi-tuun soluaggregaatioon tutkimiseksi näitä vasta-aineita lisättiin soluihin, joita inkuboitiin kuten esimerkin 2 mukaisessa kvalitatiivisessa aggregaatiomäärityk-sessä. Monoklonaalisten vasta-aineiden todettiin inhiboivan soluaggregaattien muodostusta PMA:n sekä läsnäollessa että toisaalta puuttuessa. Monoklonaalisten vasta-aineiden LFA-1-alfa-ketjun vastaiset sekä F(ab')2- että Fab'-frag-mentit kykenivät inhiboimaan soluaggregaatiota. Kun oleellisesti 100 % soluista muodosti aggregaatteja LFA-1-vastaisen vasta-aineen puuttuessa, alle 20 %:n soluista todettiin olevan aggregaateissa vasta-ainetta käytettäessä. Tämän kokeen tuloksia kuvaavat Rothlein, R., et ai. fJ.Exper.Med. 163 (1986) 1132 -1149).

ESIMERKKI 5

Soluaggregaatio edellyttää LFA-1-reseptorin läsnäoloa EBV-transformoituja varhaisimusoluja valmistettiin potilaista kuten kuvattu esimerkissä 1. Tällaiset solut seulottiin monoklonaalisia vasta-aineita vastaan, jotka kykenevät tunnistamaan LFA-1 :n, ja LFA-1 :n todettiin puuttuvan soluilta. Käytettiin esimerkissä 2 kuvattua kvalitatiivista aggregaatiomääritystä käyttäen edellä kuvattuja soluja, joista puuttuu LFA-1. Tällaiset solut eivät spontaanisti aggregoituneet edes PMA:n läsnäollessa.

ESIMERKKI 6 !CAM-1:n löytäminen

Esimerkin 5 solut, joista puuttuu LFA-1, leimattiin karboksifluoreseiinidiasetaatil-la (Patarroyo, M., et ai.. Cell.lmmunol. 63 (1981) 237 - 248). Leimattuja soluja sekoitettiin suhteessa 1:10 autologisiin soluihin tai JY-soluihin ja määritettiin aggregaateissa olevien fluoreseiinilla leimattujen solujen prosentuaalinen osuus Rothleinin, R., et ai.. J.Exrper.Med. 163 (1986) 1132 -1149, menetelmän mu- 35 107451 kaan. Solujen, joista puuttui LFA-1, todettiin kykenevän ko-aggregoitumaan LFA-1 :n ilmentävien solujen kanssa (kuvio 4).

Sen määrittämiseksi, oliko LFA-1 :IIä merkitystä vain aggregaattimuodostukses-sa vai (myös) niiden ylläpidossa, edellä kuvattuihin ennalta muodostettuihin aggregaatteihin lisättiin LFA-1 :een sitoutumaan kykeneviä vasta-aineita. Vasta-ainelisäyksen todettiin voimakkaasti rikkovan valmista aggregaattia. Ajankulu-videonauhoitus vahvisti, että monoklonaalisten vasta-aineiden lisääminen valmiisiin aggregaatteihin alkoi aiheuttaa rikkoontumista 2 tunnin kuluessa (taulukko 1). LFA-1-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden lisäämisen jälkeen valejalkaliikehdintä ja muutokset yksittäisten solujen aggregaateissa muodossa jatkuivat muuttumattomina. Yksittäisiä soluja erkani vähän kerrallaan aggregaatin laidalta; 8 tunnin kuluttua solut olivat valtaosin hajautuneet. Videoajankulu-nauhoituksen mukaan ennalta muodostettujen aggregaattien rikkoontuminen LFA-1 monoklonaalivasta-aineiden toimesta vaikutti ekvivalenttiselta aggregaa-tioprosessille LFA-1 -monoklonaalivasta-aineen puuttuessa ajassa taaksepäin.

TAULUKKO 1 LFA-1-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kyky rikkoa ennalta muodostettuja PMA-indusoituja JY-soluaggregaatteja _Aaareaaatiolukema_

Koe 2 ha 18 h_ _-mAb_+mAb 1 4+ 4+ 1+b 2 3+ 4+ 1+c 3 5+ 5+ 1+d

Aggregaatio kvalitatiivisessa mikrotiitterilevymäärityksessä arvioitiin visuaalisesti. Kun LFA-1-vastaista vasta-ainetta oli läsnä koko määritysaikajakson, aggregaatio oli alle 1+.

aAggregaation määrä juuri ennen monoklonaalivasta-ainelisäystä ajankohtana 2 tuntia.

36 107451 bTS1/18 + TS1/22 CTS1/18 dTS1/22 ESIMERKKI 7 LFA-1-riippuvaisen aggregaation kaksivalenssisten ionien tarve LFA-1-riippuvaiset kiinnitykset sytotoksisten T-solujen ja kohteiden välillä edellyttävät magnesiumin läsnäoloa (Martz, E., J.Cell.Biol. 84 (1980) 584 - 598). PMA-indusoidun JY-soluaggregaation riippuvuutta kaksivalenssisesta kationista testattiin. JY-solut eivät aggregoituneet (käytettäessä esimerkin 2 määritystä) kasvualustassa, joka ei sisältänyt kalsium- tai magnesiumioneja. Kaksivalenssi-sen magnesiumin lisääminen tuki aggregaatiota niinkin alhaisena ionipitoisuute-na kuin 0,3 mM. Pelkästään kalsiumionien lisäämisellä oli vähäinen vaikutus. Kalsiumionien todettiin kuitenkin lisäävän magnesiumionien kykyä tukea PMA-indutoisua aggregaatiota. Kun kasvualustaan lisättiin pitoisuus 1,25 mM kal-siumioneja, niin alhaisten magnesiumionipitoisuuksien kuin 0,02 mM todettiin tukevan aggregaatiota. Nämä tulokset osoittavat, että solujen LFA-1 riippuvainen aggregaatio edellyttää magnesiumioneja ja että kalsiumionit, vaikkakin yksinään riittämättömiä, voivat vaikuttaa synergisesti magnesiumionien kanssa aggregaatiota edistäen.

ESIMERKKI 8

Hybridoomasolujen eristys, jotka kykenevät ilmentämään ICAM-1-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita ICAM-1:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita eristettiin Rothleinin, R., et ai.. J.lmmunol. 137 (1986) 1270 - 1274, menetelmän mukaan, jolloin mainittu viite on sisällytetty tähän viitteeksi. Täten 3 BALB/c-hiirtä immu-noitiin vatsaontelonsisäisesti EBV-transformoiduilla ääreisveriyksitumasoluilla, jotka oli saatu yksilöstä, jolta puuttui LFA-1 (Springer, T.A., et ai.. J.Exper.Med.

„ 107451

OI

160 (184) 1901). Kussakin immunoinnissa käytettiin noin 107 solua kohden milli-litraa RPMI 1640-kasvualustaa. Immunointiruiskeet annettiin 45, 29 ja 4 päivää ennen kuin hiiristä otettiin pernasoluja haluttujen hybridoomasolulinjojen tuottamiseksi. Päivänä 3 ennen pernasolujen ottoa hiirille annettiin vielä 107 solua 0,15 ml:ssa kasvualustaa (laskimonsisäisesti).

Edellä kuvatuista eläimistä eristetyt pernasolut fuusioitiin P3X73Ag8.653-mye-loomasoluihin suhteessa 4:1 Galfren, G., et ai.. Nature 266 (19771 550, menettelyn mukaan. Näytteitä saaduista hybridoomasoluista sijoitettiin 96 kuopan mikrotiitterilevyille. Hybridoomasupernatantit seulottiin aggregaatio-inhibition suhteen ja yksi inhiboiva hybridooma (testatusta 600 kuopasta) kloonattiin ja alakloonattiin käyttäen rajaavan laimentamisen tekniikkaa. Tämä alaklooni nimettiin RR1/1.1.1 :ksi (tästä eteenpäin merkitty "RR1/1").

Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 todettiin toistettavalla tavalla inhiboivan LFA-1:n ilmentävän solulinjan JY PMA:lla stimuloitua aggregaatiota. RR1/1-monoklonaalivasta-aine inhiboi aggregaatiota samanasteisesti, tai hieman vähemmän, kuin jotkut LFA-1-alfa-1-beeta-aIayksiköiden vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet. Sitä vastoin HLA:n, joka ilmentyy runsaasti JY-soIuilla, vastaiset verrokkimonoklonaalivasta-aineet eivät inhiboineet aggregaatiota. Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 sitoma antigeeni määritellään solujen väliseksi kiinnikemolekyyIi-1 :ksi (ICAM-1).

ESIMERKKI 9 ICAM-1-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö ICAM-1-molekyylin karakterisoimiseksi ICAM-1 :n luonteen määrittämiseksi ja erityisesti sen määrittämiseksi, poikke-siko ICAM-1 LFA-1:stä, soluproteiineja immuunisaostettiin käyttäen monoklo-naalista vasta-ainetta RR1/1. Immuunisaostus suoritettiin Rothleinin, R., et ai.

(J.Immunol. 137 (1986) 1270 -1274) menetelmän mukaan. JY-soIuihin tuotettiin lyysi niiden pitoisuudessa 5 x 107 solua/ml liuoksessa, jossa oli 1 % Triton x-100 -valmistetta, 0,14 M NaCI, 10 mM Tris, pH 8,0, ja juuri ennen käyttöä lisättävä 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, käyttäen 0,2 yksikköä/ml trypsiini-inhibiitto- 38 107451 ria aprotiini (lyysipuskurissa) 20 minuutin ajan 4°C:ssa. Lysaatteja sentrifugoitiin 10 000 x g:ssä 10 minuutin ajan, minkä jälkeen ne esikirkastettiin lisäämällä 50 %:isena suspensiona 50 mikrolitraa CNBr-aktivoitua, glysiinillä sammutettua Sepharose C1-4B -geeliä, jolloin käsittelyaika oli 1 tunti 4°C:ssa. Yksi millilitra lysaattia immuunisaostettiin lisäämällä 20 mikrolitraa 50 %:ista suspensiota, jossa oli monoklonaalista vasta-ainetta RR1/1 kytkettynä Sepharose C1-4B-hartsiin (1 mg/ml), jolloin käsittelyaika oli yön yli 4°C:ssa (Springer, T.A., et ai.. J.Exper.Med. 160 (1984) 1901). Sepharoseen sidottu monoklonaalinen vasta-aine valmistettiin käyttäen Sepharose C1-4B:n CNBr-aktivointia karbonaattipus-kurissa Marchin, S., et ai. (Anal.Biochem. 60 (1974) 149) menetelmän mukaan. Pestyillä immuunisakoilla suoritettiin SDS-PAGE ja hopeavärjäys Morrisseyn, J.H., Anal.Biochem. 117 (1981) 307, menettelyn mukaan.

Kun proteiineja oli eluoitu SDS-näytepuskurilla (Ho, M.K., et ai.. J.Biol.Chem. 258 (1983) 636=, 100°C:ssa, näytteet jaettiin puoliksi ja niillä suoritettiin elektro-foreesiajo (SDS-8 % PAGE) pelkistävissä (kuvio 5A) tai ei-pelkistävissä (kuvio 5B) olosuhteissa. Nauhat, joiden molekyylipaino on 50 kd:tä ja 25 kd:tä, vastaavat immunoglobuliinien monoklonaalivasta-aine-Sepharosesta raskasta ja kevyttä ketjua (kuvio 5A, vyöhyke 3). Havaittiin myös vaihtelevia määriä muita nauhoja 25 - 50 kd -painoalueella, mutta niitä ei esiintynyt sakoisssa, jotka olivat peräisin karvaisista leukemiasoluista, joista saatiin vain 90 kd:n molekyylipainonauha. LFA-1:n 177 kd:n alfa-alayksikön ja 95 kd:n beeta-alayksikön todettiin migroitu-van eri tavalla kuin ICAM-1 sekä pelkistävissä (kuvio 5A, vyöhyke 2) että ei-pel-kistävissä (kuvio 5B, vyöhyke 2) olosuhteissa.

Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 vaikutuksen PHA-varhaisimusolu-aggre-gaatioon määrittämiseksi käytettiin esimerkissä 2 kuvattua kvantitatiivista aggre-gaatiomääritystä. Täten T-soluemosoluja stimuloitiin 4 päivän ajan PHA:lla, minkä jälkeen ne pestiin perusteellisesti ja kasvatettiin sitten 6 päivän ajan IL-2:lla käsitellyssä kasvualustassa. PHA:n todettiin sisäistyvän tämän 6 päivän mittaisen viljelyn aikana, ja se ei myötävaikuttanut aggregaatiomääritykseen. Kolmessa eri määrityksessä erilaisilla T-soluemosoluvalmisteilla ICAM-1 -mono-klonaalivasta-aineet inhiboivat aggregaatiota toistettavalla tavalla (taulukko 2).

39 107451 TAULUKKO 2 PMA-stimuloidun PHA-varhaisimusoluaggregaation inhibitio RRl/l-monoklonaalivasta-aineellaa % - %

Koe" PMA HAb Aggregaatit inhibitio b lc - Verrokki g + Verrokki 51 g + HIA-A,B 58 -14d + LFA-l-'alf a 31 39 + ICAM-1 31 39 2e - Verrokki >10 + Verrokki 78 0 + LFA-1—beta 17 78 r + ICAM-1 50 36 3f - — 7 + Verrokki 70 + HLA-A,B 80 -14 + LFA-3 83 -19 + LFA-l-alfa 2 97 + LFA-l-beta 3 95 + ICAM-1 34 51 « · · « < 4 · aPHÄ-indusoitujen varhaisimusolujen aggregaatio, jota : : stimuloitiin 50 ng:lla/ml PMA:ta, kvantitoitiin epäsuorasti 444 laskemalla mikroskoopin avulla ei-aggregoitujen solujen lukumäärä kuten kuvattu esimerkissä 2.

• · · • · • · · * · 1 • · · bInhibitio-% verrattuna soluihin, joita käsiteltiin PMA:11a ja X63-monoklonaalivasta-aineella.

«ti • · · • · • · · • · · *·] ’ cAggregaatio mitattiin tunnin kuluttua siitä, kun oli samanai- • kaisesti lisätty monoklonaalinen vasta-aine ja PMA. Soluja »1» · ravisteltiin 175 kierr./min kierrosnopeudel 1 a.

• · » · • « 1 • \ Negatiivinen luku merkitsee aggregaation prosentuaalista tehostumista.

107451 40 «Aggregaatio mitattiin tunnin kuluttua siitä, kun oli samanaikaisesti lisätty monoklonaalinen vasta-aine ja PMA. Soluja pelletoitiin 200 x g:ssä 1 min ajan, niitä inkuboitiin 37 °c:ssa 15 minuutin ajan,.minkä jälkeen ne uudelleenlietet-tiin varovaisesti ja ravisteltiin 45 minuutin ajan 100 kierr./ min kierrosnopeudel1 a.

fSoluja esikäsiteltiin PMA:Ha 4 tunnin ajan 37 °C:ssa. Sitten kun monoklonaalinen vasta-aine oli lisätty, putkien sisältöä inkuboitiin 37 °C:ssa ravistelematta 20 minuutin ajan ja sitten ravistellen 100 minuutin ajan 75 kierr./min kierrosnopeudel1 a.

LPA-1-monoklonaalivasta-aineet olivat toistettavalla tavalla voimakkaammin inhiboivia kuin ICAM-l-monoklonaalivasta-aineet, kun taas HLA A B - ja LPA-3-monoklonaalivasta-ainei11 a ei ollut vaikutusta. Nämä tulokset osoittavat, että testatuista monoklonaalisista vasta-aineista vain LFA-l:een tai ICAM-l:een sitoutumaan kykenevät kykenivät estämään solukiinnitystä.

ESIMERKKI 10 4 at ICAM-l-vastaisen monokl onaal isen vasta-aineen valmistus a · a « i «

Immunointi

I < I 1 I

4 i » Φ m · · ***** BALB/c-hiiri immunoitiin vatsaontel onsisäisesti (i.p.) ruiskut- • · · *.1 ’ tamalla 0,5 ml:n erinä 2 x 107 JY-solua RPMI-kasvualustassa 103 ja 24 päivää ennen fuusiota. Päivinä 4 ja 3 ennen fuusiota • · iti hiiriä immunoitiin i.p. 107 PMA-differentioidulla U937-solulla ; Γ: o,5 ml:ssa RPMI-kasvualustaa.

* • · * i · ’",1 U937-soluien differentiaatio « · • 1 *44 ίίί 13937-soluja (ATCC CRL-1593) dif f erentioitiin inkuboimalla niitä pitoisuutena 5 x 105/ml RPMl:ssä, joka sisälsi 10 % nautasikiö-seerumia, 1 %:n glutamiinia ja 50 mikrogrammaa/ml gentamysiiniä 107451 41 (täydellinen kasvualusta), joka sisälsi 2 ng/ml forboli-12-myristaattiasetaattia (PMÄ), steriilissä polypropyleenias-tiassa. Tämän inkuboinnin 3. päivänä puolet kasvualustatila-vuudesta poistettiin ja korvattiin tuoreella täydellisellä ja PMA:ta sisältävällä kasvualustalla. Päivänä 4 solut poistettiin, pestiin ja valmisteltiin immunointia silmälläpitäen.

Fuusio

Immunoiduista hiiristä saadut pernasolut fuusioitiin P3x63 Ag8.653 -myeloomasoluihin suhteessa 4:1 Galfren et ai ., (Nature 266 (1977) 550) mukaan. Fuusioinnin jälkeen solut maljoitettiin 96 kuopan tasapohjaisiin mikrotiitterilevyihin pitoisuudeksi 105 pernasolua/kuoppa.

ICAM-l-vastaisina positiivisten solujen valinta

Viikon kuluttua 50 mikrolitraa supernatanttia seulottiin esimerkin 2 mukaisessa kvalitatiivisessa määrityksessä käyttäen « · • " sekä JY- että SKW3-soluja aggregoituvina solutinjoina. Solut * supernatanteista, jotka inhiboivat JY-solu-aggregaatiota mutta eivät SKW3-solu-aggregaatiota, valittiin ja kloonattiin 2 ker-taan käyttäen rajaavan laimentamisen menetelmää.

• · · • · · Tällä kokeella saatiin tunnistetuksi ja sittemmin kloonattiin • · · kolme erillistä hybridoomasolulinjaa, jotka tuottivat ICAM-1-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita. Näiden hybridoomasolu- • · · linjojen tuottamat vasta-aineet olivat IgG2a, IgG2b ja vastaa- • · · • · · vasti IgM. Hybridoomasolulinja, joka tuotti ICAM-l-vastaista : vasta-ainetta IgG2a, nimettiin nimellä R6’ 5 ,D6’E9,B2 . Edullisen hybridoomasolul in jän tuottama vasta-aine nimettiin nimellä R6'5'D6,E9,B2 (tässä nimellä "R6-5-D6") .

• · · • · 1 « 107451 42 ESIMERKKI 11 ICAM-l:n ilmennys ja säätely ICAM-l:n ilmentymisen mittaamiseksi kehitettiin radio-immuunimääritys. Tässä määrityksessä puhdistettua RRl/l:tä jodattiin käyttäen jodogeenia, jonka spesifinen aktiivisuus oli 10 mikrocurie-yksikköä/mikrogramma. Endoteelisoluja kasvatettiin 96 kuopan levyillä ja käsiteltiin kuten kuvattu kullekin kokeelle. Maljat jäähdytettiin 4 °C:seen sijoittamalla ne kylmähuoneeseen 0,5-1 tunniksi, eikä (siis) välittömästi jäihin. Solu-yksikerrokset pestiin 3x kylmällä täydellisellä kasvualustalla ja inkuboitiin sitten 30 minuutin ajan 4 °C:ssa 125I-RR1/1:i1ä. Solu-yksikerrokset pestiin sittten 3x täydellisellä kasvualustalla. Sitoutunut ^-251 vapautettiin käyttäen 0,1 N natriumhydroksidiliuosta ja laskettiin. ^-251-RRl/l:n spesifinen aktiivisuus säädettiin käyttäen ei-leimattua RRl/l:tä lineaarisen signaalin saamiseksi tässä tutkimuksessa tavatuilla antigeenitiheyksi11ä. Ei-spesifinen sitoutuminen määritettiin lOOOx ylimäärän ei-leimattua RRl/l:tä läsnäollessa ' " ja saatu arvo vähennettiin kokonaissitoutumisesta spesifisen ’ sitoutumisen saamiseksi.

ICAM-l-ilmennys , edellä kuvatulla radioimmuunimäärityksel lä : : : mitattuna, kasvaa ihmisen napalaskimon endoteelisolui11 a • o (HUVEC) ja ihmisen alaraajan iholaskimon endoteelisolui 11 a (HSVEC) IL-l:n, TNF:n, LPS:n ja IFN-gamman vaikutuksesta (taulukko 3). Alaraajan iholaskimon endoteelisoluja käytettiin • · · !.! tässä tutkimuksessa napalaskimon endoteel isolui 11 a saatujen »44 »44 *, tuloksien varmistamiseksi viljellyissä suuren laskimon endo- ·,· · teelisoluissa, jotka oli saatu täysikasvuisen henkilön kudok- : : sesta. ICAM-l:n perusilmennys on 2x korkeampi alaraajan iholaskimon endoteelisolui 11 a kuin napalaskimon endoteeliso-luilla. Altistettaessa napalaskimon endoteelisolut yhdistelmä-IL-l-alfai 1 e, -IL-l-beetal1 e ja -TNF-gammal1 e ICAM-l-ilmennys kasvoi 10 - 20 kertaisesti. IL-l-alfa, TNF ja LPS olivat te- 107451 43 hokkainunat indusorit ja IL-1 oli vähemmän tehokas painosta laskettuna ja myös vasteen kyllästyspitoisuuksina (taulukko 3). IL-l-beeta pitoisuutena 100 ng/ml lisäsi ICAM-l-ilmennystä 9-kertaisesti HUVEC-soluilla ja 7,3-kertaisesti HSVEC-soluilla, jolloin puolimaksimaalinen kasvu saatiin pitoisuudella 15 ng/ml. rTNF pitoisuutena 50 ng/ml lisäsi ICAM-l-ilmennystä 16-kertaisesti HUVEC-soluilla ja 11-kertaisesti HSVEC-soluilla, jolloin puolimaksimaalinen vaikutus saatiin pitoisuudella 0,5 ng/ml. Interferoni-gamma tuotti merkittävän kasvun ICAM-1-ilmennykseen, joka oli 5,2-kertainen HUVEC-soluilla tai 3,5-kertainen HSVEC-soluilla, pitoisuudessa 10 000 U/ml. LPS:n vaikutus pitoisuutena 10 mikrogrammaa/ml oli samaa suuruusluokkaa kuin rTNF:n. Näiden välittäjien yhdistäminen pareittain johti additiivisiin tai additiivista hieman alhaisempiin vaikutuksiin ICAM-1-ilmennykseen (taulukko 3). Ristititraa-malla rTNF rIL-l-beetalla tai rlFN-gammal1 a ei saatu syner-gismiä näiden optimin alapuolisten tai optimaalisten pitoisuuksien välille.

: *' Koska LPS nosti ICAM-l-ilmennystä endoteelisoluilla pitoi- ‘ suuksina, joita joskus esiintyy kasvualustassa, mahdollisuutta, '.(ΐ|ί että perus-ICAM-l-ilmennys johtuisi LPS:stä, tutkittiin.

*; Testattaessa useampia seerumieriä todettiin, että alhaisen j ; ; endotoksiinipitoisuuden käsittävä seerumi antoi 25 % alhai-semman ICAM-l-pohjailmennyksen. Kaikki tässä ilmoitetut • · · tulokset oli saatu endoteelisoluilla, joita kasvatettiin .. alhaisen endotoksiinipitoisuuden käsittävässä seerumissa.

• · · 4 · «

Kuitenkin lisäämällä LPS:ää neutraloivaa antibioottia poly- ♦ · · *·) * myksiini-B pitoisuutena 10 mikrogrammaa/ml ICAM-1 -ilmennys : laski enää vain 25 % (taulukko 3). ICAM-l-ilmennyksen kasvuun

Ml · IL-l:llä tai TNF:llä käsiteltäessä ei vaikuttanut 10 mikro- • · * .*. gramman/ml polymyksiini-B: tä läsnäolo, mikä sopii yhteen näiden • ♦ « ' *. valmisteiden käsittämien alhaisten endotoksiinitasojen kanssa (taulukko 3).

44 1 0 7 4 51 TAULUKKO 3 ICAM-l-vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet

125j , spesifisesti· sidottu J

Tila (16 h) HUVEC HSVEC ' ( tuike/min. ) verrokki 603 + 11 - 1132 ±31 100 ng/ml rIL-1 beta 5680 + 633 9x 8320 ± 766 7.3x 50 ng/ml rIL-l-alfa 9910 + 538 16x 50 ng/ml rTNF alfa 9550 ± 1500 jgx 12690 +657 11.2x 10 /ig/ml LPS 9530 + 512 16x 10459 + 388 9.2x 10 ng/ml rlFN gamma 3120 + 308 5.2x 4002 ± 564 3.5x rIL-1 beta + rTNF 1469 + 1410 24x 16269 + 660 14x rIL-1 beta + LPS 13986 + 761 . 23x 10870 + 805 lOx rIL-1 beta + rlFN gamma 7849 + 601 13x 8401 +~390 7.4x rIi!r + 15364 ± 1241 24x 16141 + 1272 14x rTNF + rlFN gamma 13480 ± 1189 22x 13238 + 761 12x LPS + IFN gamma 10206 + 320 17x 10987 + 668 lOx polymytsiini B(10ug/ml) 480 + 23 polymytsiini B + rIL-1 5390~+ 97 llx - polymytsiini. B + rTNF 9785 + 389 20x v 1 1 /ig/ml^LPS 7598 + 432 13x .···. polymytsiini B + LPS 510 + 44 l.lx

1 « I

* * k • · · • · ··» • · · • · · • · :.V 1CAM-1-ilmennyksen säätäminen ylöspäin HVEC- ja HUVEC-soluilla • · · ’ - HUVEC- tai HSVEC-soluja mal joitetti in 96 kuopan levyille : suhteessa 1:3 yhteenkasvaneesta solu-yksikerroksesta ja • · * “*·] annettiin kasvaa yhteen. Sitten soluja käsiteltiin mainituilla « · Ί materiaaleilla tai kasvualustalla 16 tunnin ajan, minkä jälkeen • · suoritettiin RIA-määritys kuten menetelmien yhteydessä esitetty. Kaikki määrityslukemat ovat 4-kertaisista rinnakkaismäärityksistä.

45 107451 ESIMERKKI 12 ICAM-l:n inter1eukini-1- ja gamma-interferoni -induktion kinetiikka

Interleukiini-1:n ja gamma-interferonin vaikutuksien ICAM-1-ilmennykseen ihon sidekudosmuodostussoluilIa kinetiikkaa tutkittiin käyttäen vuohen 3-251-1 eimattua anti-hiiri-IgG-vasta-aine-sitoutumismääritystä, Dustin, M.L., et ai.

(J. Immunol, 137 (1986) 245 - 254; joka viite sisällytetään tähän viitteeksi). Tämän sitoutumismäärityksen suorittamiseksi ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin 96 kuopan mikrotiitterilevyllä tiheyteen 2 - 8 x 104 solua/kuoppa (0,32 cm2). Solut pestiin kahdesti RPMI 1640 -kasvualustalla, jota oli täydennetty kuten kuvattu esimerkissä 1. Solut pestiin vielä kerran Hankin tasapainoitetul1 a suolaliuoksella (HBSS), jossa oli pitoisuudet 10 mM Hepes, 0,05 % NaN3, ja 10 % 1ämpöinaktivoitua nautasikiöseerumia. Pesu tällä sitoutumis-puskurilla suoritettiin 4 °C:ssa. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 mikrolitraa edellä kuvattua sitoutumispuskuria ja 50 mikro-litraa sopivaa hybridoomasupernatanttia, jolloin negatiivisena ja positiivisena verrokkina käytettiin X63:ea ja vastaavasti W6/32:ta. Kuoppien sisältöä inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 °C:ssa samalla kevyesti ravistellen, minkä jälkeen kuopat pestiin kahdesti sitoutumispuskurilla ja toista vasta-ainetta, * · · vuohen 3.251-1 eimattua anti-hiiri-IgG:tä, lisättiin pitoisuus 50 • · · * nCi/100 mikrolitraa. Vuohen 3-251-leimattu hiirivastainen vasta-aine valmistettiin käyttäen Iodogen-valmistetta (Pierce) Frakerin, P.J. et ai. (Biochem. Biophys . Res . Commun. 80 (1978) • · · V · 849) menetelmän mukaan. 30 minuutin 4 °C:ssa kuluttua solut : pestiin kahdesti 200 mikrol itral 1 a sitoutumispuskuria ja iti i .···, solukerros tehtiin liukoiseksi lisäämällä 100 mikrolitraa 0,1 N • · ’·* natriumhydroksidiliuosta. Tämä ja 100 mikrolitran pesuerä • · • · · laskettiin Beckmanin malli 5500 gamma-laskijalla. Sitoutuneet spesifiset tuikkeet/min laskettiin kaavasta [tuiketta/min monoklonaalivasta-aineella] - [tuiketta/min X63:lla]. Kaikki 107451 46 vaiheet, mukaan lukien indusointi spesifisillä reagensseilla, suoritettiin 4-kertaisin rinnakkaismäärityksin.

Interleukiini-1:n, jonka puoliintumisaika ICAM-l-induktiossa on 2 tuntia, vaikutus oli nopeampi kuin gamma-interferonin, jonka puoliintumisaika on 3,75 tuntia (kuvio 6). Aikakäyrä paluussa ICAM-1-1epotasoi11 e vaikutti riippuvan solusyklistä tai solu-kasvunopeudesta. Lepotilassa olevissa soluissa interleukiini-l:n ja gamma-interferonin vaikutukset ovat stabiileja 2-3 päivän ajan, kun taas log-faasiviljelmissä ICAM-1-ilmennys pysyttelee lähellä pohjatasoa 2 päivää näiden indusorien poistamisen jälkeen.

Kuviossa 7 on esitetty annos-vastekuvaajät ICAM-1-induktiol1 e yhdistelmä-hiiri- ja yhdistelmä-humaani-interleukiini-1:1lä ja yhdistelmä-humaani-gamma-interferonilla. Gamma-interferonilla ja interleukiini-1:11ä todettiin olevat samankaltaiset pitoi-suusriippuvuudet, jolloin vaikutukset pitoisuudessa 1 ng/ml olivat lähes identtiset. Humaani- ja hiiri-yhdistelmä-inter-leukiini-1:1 lä oli niinikään samankaltaiset kuvaajat, mutta ne ovat paljon vähemmän tehokkaita kuin humaani-interleukiini-1-valmisteet ICAM-l-ilmennyksen indusoinnissa.

Sykloheksamidi, joka inhiboi proteiinisynteesiä, ja aktinomy- « · · 1/. siini-D, joka inhiboi mRNA-synteesiä, tuhoavat sekä interleu- • * · • · · * kiini-l:n että gamma-interferonin vaikutukset ICAM-l-ilmen- nykseen sidekudosmuodostussoluilla (taulukko 4). Lisäksi • · · *·*.* tunikamysiini, joka inhiboi N-kytkenteistä glykosylaatiota, V* inhiboi interleukiini-1:n vaikutusta vain 43 %:lla. Nämä j tulokset osoittavat, että proteiini- ja mRNA-synteesi, mutta ei .···. N-kytkenteinen glykosylaatio, ovat edellytyksiä interleukiini- * · 1- ja gamma-interferoni-stimuloiduille ICAM-l-ilmennyksen *·*·* nousuille.

« ♦ 47 107451 TAULUKKO 4

Sykioheksimidin, aktinomysiini-D:n ja tunikamysiinin vaikutukset ICAM-l-induktioon IL-l:llä ja gamma-IFN:1lä ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluillaa ~ TTs : Γ T7-!

Vuohen I-anti-hiiri-IgG

spesifinen sitoutuminen (tuike/ , mm.

Käsittely_anti-ICAH-1 Tnti-HLft-A. B.C

Verrokki (4 h) 1524 ± 140 11928 + 600 + sykloheksimidi 1513 + 210 10678 + 471 + aktinomysiini D 1590 + 46 12276 + 608 + tunikamysiini 1461 + 176 12340 + 940 IL 1 (10 U/ml) (4 h.) 4264 ± 249 12155 + 510 + sykloheksimidi · 1619 + 381 12676 + 446 + aktinomysiini D 1613 + 88 12294 + 123 + tunikamysiini 3084 + 113 13434 + 661 IFN-τ' (10 U/ml) (18 h) 4659 ± 109 23675 ± 500 + sykloheksimidi 1461 + 59 10675 + 800 + aktinomysiini D 1326 + 186 12089 + 550

« i I · I

* 4 ( 4 4 t

• · I

i « · t I 4 f 1 4 4 4 1 » · · • · aIhmisen sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x • · · 104 solua/0,32 cm2 kuoppa. Käsittelyt suoritettiin 50 . . mikrolitran lopputilavuudessa, joka sisälsi mainitut 9 9 · *.1 reagenssit. Sykioheksimidiä, aktinomysiini-D : tä ja \1 1 tunikamysiinia lisättiin pitoisuus 20 mikrogrammaa/ml, 10 • mikro-M ja vastaavasti 2 mikrogrammaa/ml sytokiinien kanssa « · · « .**·. samanaikaisesti. Kaikki lukemat ovat keskiarvoja 4-kertaisista • · · rinnakkaismäärityksistä, +/- SD.

• · « • · · · 107451 48 ESIMERKKI 13 ICAM-l:n kudos jakauma

Kudosopi11iset tutkimukset suoritettiin käyttäen jäädytettyä humaani-elinkudosta ICÄM-l:n jakauman määrittämiseksi kateen-korvassa, imusolmukkeissa, suolessa, ihossa, munuaisissa ja maksassa. Tällaisen analyysin suorittamiseksi normaaleista ihmiskudoksista peräisin olevia jäädytettyjä kudosleikkeitä (paksuus 4 mikrometriä) kiinnitettiin asetonissa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen ne värjättiin monoklonaalisella vasta-aineella RR1/1 immunoperoksidaasitekniikaa käyttäen, jolloin suorituksessa käytettiin avidiini-biotiinikompleksimenetelmää (Vector Laboratories, Burlingame, CA), jota kuvaavat Cerf-Bensussan, N., et ai . (J. Immunol. 130 (1983) 2615). Vasta-aineella inkuboinnin jälkeen leikkeitä inkuboitiin toisiaan seuraten biotinyloidulla hevosen anti-hiiri-IgG:1lä ja avidiini-biotinyloiduilla peroksidaasikompleksei11 a. Leikkeet kastettiin lopuksi liuokseen, jossa oli 3-amino-9-etyylikar-,·, batsolia (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) I I 4 värireaktion kehittämiseksi. Leikkeitä kiinnitettiin sitten 4- < i i prosenttisessa formaldehydiliuoksessa 5 minuutin ajan, minkä jälkeen ne vastavärjättiin hematosykliinillä. Verrokkeina käytettiin leikkeitä, joita inkuboitiin ei-sukulaismonoklo-naal ivasta-ainei 11 a RRl/l-vasta-aineen asemesta.

» · · • · · * · · ICAM-l:n jakauma todettiin hyvin samanlaiseksi kuin pääasial-lisen kudosyhteensopivuuskompleksin (MHC) luokka-II-antigee- • t ;*·*; nien. Suurin osa verisuonista (sekä pienistä että suurista) . *. kaikissa kudoksissa osoitti endoteelisolujen värjääntymistä • · · ··· * ICAM-l-vasta-aineel 1 a. Verisuonten endoteelivärjäys oli voi- « « · • · *···* makkaampaa follikkelien välisillä (parakortikaali-) alueilla :Y: imusolmukkeissa, risoissa ja Peyerin imusolmukkeissa kuin munuaisten, maksan ja normaalin ihon verisuonissa. Maksassa värjäys oli valtaosin rajoittunut hiussuonipoukamavuorisolui-hin; maksasolut ja endoteelisolut valtaosan porttilaskimoista 107451 49 ja -valtimoista seinämissä eivät olleet värjääntyneet.

Kateenkorvaytimessä havaittiin suurien solujen diffuusia värjääntymistä ja dendriittinen värjäyskuvio. Korteksissa värjäyskuvio oli paikallinen ja ja pääasiassa dendriittinen. Kateenkorvasolut eivät värjääntyneet. fiäreisimukudoksessa sekundaaristen imurakkuloiden imusolmuke-itusolut olivat voimakkaasti värjääntyneet. Joissain imurakkuloissa värjäys-kuvio oli valtaosin dendriittinen, jolloin imusolujen näkyvää värjääntymistä ei ollut todettavissa. Havaittiin myös solujen heikkoa värjääntymistä vaippavyöhykkeellä. Lisäksi sytoplas-majatkeita käsittävät dendriittisolut (interdigitaatio-retikulosolut) ja pieni osuus imusoluista follikkelien välisillä tai parakortikaali-alueilla värjääntyivät ICAM-l:n sitovalla vasta-aineella.

Syöjäsoluja muistuttavat solut värjääntyivät imusolmukkeissa ja ohutsuolen keskikerroksessa. Useimpien tutkittujen elimien peruskudokseen hajaantuneet sidekudosmuodostussolujen kaltaiset (kierteen muotoiset) solut ja dendriittisolut värjääntyivät ICAM-l:n sitovalla vasta-aineella. Värjääntymistä ei havaittu Langerhans/indeterminanttisoluissa orvaskedessä . Vär jääntymistä • ‘ ei havaittu si 1eälihaskudoksessa.

• « • · * • · · • · : Epiteelisolujen värjääntymistä todettiin toistettavalla tavalla risojen limakalvossa. Vaikka maksasolut, sappitiehytepiteeli, suolen epiteelisolut ja putkimaiset epiteelisolut munuaisissa • « eivät vär jääntyneet useimmissa tapauksissa, normaal imunuaisku-·_ dosleikkeet, jotka oli saatu munuaissolusyöpäliitteisestä * · t •J ! munuaisenpoistonäytteestä, osoittivat monien proksimaali-

«•I

putkisolujen ICAM-l-värjääntymistä. Nämä putkiepiteelisolut vär jääntyivät myös HLA-DR-vastaisel la si toutumisvasta-aineel 1 a.

* »

Yhteenvetona ICAM-1 ilmentyy ei-vertamuodostavilla soluilla kuten verisuonten endoteelisolut ja vertamuodostavi1la soluilla so 107451 kuten kudoksen syöjäsolut ja mitogeeni-stimuloidut T-imusolu-emosolut. ICAM-1:n todettiin ilmentyvän alhaisina pitoisuuksina ääreisveren imusoluilla.

ESIMERKKI 14 ICAM-l:n puhdistaminen monoklonaalivasta-aine-affiniteettikromatografialla

Puhdistuksen vleiskaavio ICAM-1 puhdistettiin humaanisoluista tai -kudoksesta käyttäen monoklonaalivasta-aine-affiniteettikromatografiaa. Monoklonaa-linen vasta-aine, RR1/1, joka reagoi ICAM-l:n kanssa, puhdistettiin ensin ja kytkettiin sitten inerttiin koionnimatriisiin. Tätä vasta-ainetta kuvaavat Rothlein, R., et ai ., J. Immunol.

137 (1986) 1270 - 1274, ja Dustin, M.L., et ai . (J.Immunol. 137 (1986) 245). ICAM-1 liuotettiin solumembraaneista tuottamalla soluihin lyysi ei-ionisessa pesuaineessa, Triton X-100, lähellä neutraalia olevassa pH:ssa. Liuenneen ICAM-l:n sisältävä solu-' lysaatti käytettiin sitten esikolonneissa, joiden tehtävänä oli poistaa materiaaleja, jotka sitoutuvat ei-spesifisesti kolonni- ‘ matriisimateriaaliin, ja sitten monoklonaalivasta-ainekolonni- 1(1’ matriisin läpi, jotta ICAM-1 saattoi sitoutua vasta-aineeseen.

« ( i

Sitten vasta-ainekolonni pestiin sarjalla pesuaine-pesupusku- • · · ·.· · reita, joiden pH kasvoi aina 11,0 :aan. Näiden pesujen aikana ICAM-1 pysyi sitoutuneena vasta-ainematriisiin, kun taas ei-sitoutuvia ja heikosti sitoutuneita epäpuhtauksia poistui.

· ·1;. Sitoutunut ICAM-1 eluoitiin sitten spesifisesti kolonnista . 1. käyttämällä pesuainepuskuria, jonka pH oli 12,5.

• · · • · · • · · · · · • · ’···1 Monokl onaal isen vasta-aineen RR1/1 puhdistaminen ia kovalentti : kytkeminen Sepharose C1-4B -geeliin « · ICAM-l-vastainen monoklonaalinen vasta-aine RR1/1 puhdistettiin hybridooman käsittävien hiirien vatsaontelonesteestä tai hybri- 107451 51 doomaviljelmäsupernatan-teista tavanomaisilla tekniikoilla ammoniumsulfaatilla seostamalla ja käyttämällä proteiini-A-affiniteettikromatografiaa (Ey, et ai.. Immunochem. 15 (1978) 429). Puhdistettu IgG, tai rotan IgG:tä (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO) kytkettiin kovalentisti Sepharose C1-4B -geeliin (Pharmacia, Upsala, Ruotsi) käyttäen muunnosta Marchin et ai. (Anal.Biochem. 60 (1974) 149) menetelmästä. Lyhyesti, Sepharose C1-4B pestiin tislatulla vedellä, aktivoitiin käyttäen 40 mg/ml CKBrrää 5 M kaiiumvetyfosfaatti1iuoksessa (pH noin 12) 5 minuutin ajan ja pestiin sitten perusteellisesti 0,1 mM kloorivetyhapolla 4 °C:ssa. Suodatettu aktivoitu Sepharose uudelleenlietettiin vastaavaan tilavuuteen puhdistettua vasta-ainetta (2 - 10 mg/ml 0,1 M natriumvetykarbonaattiliuoksessa, 0,1 M NaCl). Lietettä inkuboitiin 18 tunnin ajan 4 °C:ssa pyörittäen kevyesti ympäri. Sitten supernatantista tutkittiin ei-sitoutuneen vasta-aineen läsnäolo mittaamalla absorbanssi 280 nm:n aallonpituudella, ja aktivoidun Sepharosen jäljellä olevat reaktiiviset keskukset kyllästettiin lisäämällä glysiiniä pitoisuuteen 0,05 M. Kytkentäteho oli tavallisesti ' i c i·:, > 90 %.

* * I 4 • ( "Ihmisen pernasta valmistettujen membraanien liuottaminen « I i I ( . , pesuaineel1 a • * t * · · • ·

(M

*.* * Kaikki operaatiot suoritettiin 4 °C:ssa. Jäädytetyt ihmisen pernat (200 g:n fragmentteina), jotka oli saatu karvainen : solu-leukemiaa potevista potilaista, sulatettiin jäissä 200 mlrssa Tris-suolaliuosta (50 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH 7,4, 4 . °C), jossa oli pitoisuus 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia • · · *!!.’ (PMSF), 0,2 U/ral aprotiinia ja 5 mM jodoasetamidia. Kudos • · *·;*’ leikeltiin pieniksi palasiksi ja homogenoitiin 4 °C:ssa Tekmar- : tehohomogenisaattorissa. Tilavuus täytettiin sitten 300 ml:ksi ·:*·; lisäämällä Tris-suolaliuosta ja lisättiin 100 ml 10-%:ista

Tween 40 - (polyoksietyleenisorbitaanimonopalmitaatti-) liuosta Tris-suolaliuoksessa, jolloin Tween 40 -valmisteen loppupitoi- 52 107451 suudeksi tuli 2,5 %.

Membraanien valmistamiseksi homogenaattia uutettiin käyttäen kolmea iskua Dounce-, tai edullisemmin Teflon Potter Elvejhem -homogenisaattorissa, minkä jälkeen sentrifugoitiin 1000 x g:ssä 15 minuutin ajan. Supernatantti otettiin talteen ja pellettiä uutettiin toistamiseen 200 ml :11a 2,5-%:ista Tween 40 -liuosta Tris-suolaliuoksessa. Seosta sentrifugoitiin 1000 x g:ssä 15 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantit kummastakin uutosta yhdistettiin ja niitä sentrifugoitiin 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan membraanien pel1etoimiseksi. Membraanit pestiin uudelleen-liettämällä 200 ml:aan Tris-suolaliuosta sentrifugoiden 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Membraanipel1etti uudel1eenlietettiin 200 ml:aan Tris-suolaliuosta ja homogenoitiin moottorikäyttöisessä homogenisaattorissa käyttäen Tef1on-survinta, kunnes liete oli tasaisen samea. Sitten tilavuus täytettiin 900 ml.'ksi lisäämällä Tris-suolaliuosta ja lisättiin N-lauroyylisarkosii-nia 1oppupitoisuuteen 1 %. Seosta sekoitettiin 4 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen ei-liukoinen materiaali pesuaine- I I ! "... lysaatissa poistettiin sentrif ugoimal la 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Sitten supernatanttiin lisättiin Triton X-100- I l I [ valmistetta 1oppupitoisuuteen 2 % ja lysaattia sekoitettiin 4 °C:ssa 1 tunnin ajan.

« 1 • ai • i « • « • · e V '* JY-B-varhaisimusol ui en pesuaine- liuotus

EBV-transf ormoitua B-varhaisimusolul in jaa JY kasvatettiin RPMI

• · 1640 -kasvualustassa, joka sisälsi pitoisuudet 10 % vasikansi-,·, kiöseerumia (FCS) ja 10 mM Hepes, solutiheyteen noin 0,8 - • » t ••j* 1,0 x 106 solua/ml . ICAM-l:n solupintailmennyksen lisäämiseksi * · *···’ lisättiin forboli-12-myristaatti-13-asetaattia (PMA:ta) « pitoisuuteen 25 ng/ml 8-12 tunniksi ennen kuin solut otettiin • · • :..j talteen. Viljelmiin lisättiin tällöin myös natriumvanadaattia (50 mikro-M). Solut pelletoitiin sentrifugoimal1 a 500 x g:ssä 10 minuutin ajan ja pestiin sitten kahdesti Hankin tasapainoi- 107451 53 tetulla suolaliuoksella (HBSS) uudelleenliettämällä ja sentrifugoimalla. Soluihin (noin 5 g 5 litrassa viljelmää) tuotettiin lyysi 50 ml:ssa lyysipuskuria (0,14 NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0, 1 % Triton X-100, 0,2 U/ml aprotiini, 1 mM PMSF, 50 mikro-M natriumvanadaatti) sekoittamalla 4 °C:ssa 30 minuutin ajan. Ei-lyysin läpikäyneet tumat ja ei-liukoinen jäte sentrifugoitiin eroon 10 000 x g:ssä 15 minuutissa, minkä jälkeen supernatanttia sentrifugoitiin 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan ja suodos suodatettiin Whatmanin 3 mm:n suodatinpaperin läpi.

ICAM-l:n affiniteettikromatografia silmälläpitäen rakennetutkimuksia ICÄM-l:n puhdistamiseksi suuressa mittakaavassa rakennetutkimuksissa käytettäväksi käytettiin kolonnia, jossa oli 10 ml RRl/l-Sepharose C1-4B -geeliä (kytkentä 2,5 mg vasta-ainetta/ ml geeliä) ja kahta esikolonnia, joissa oli 10 ml CNBr-aktivoitua, glysiinillä sammutettua Sepharose C1-4B -geeliä ja • · · rotta-IgG:tä kytkettynä Sepharose C1-4B -geeliin (2 mg/ml).

t « |

Kolonnit kytkettiin sarjaksi ja esipestiin 10 koionniti 1 avuu- • « della lyysipuskuria, 10 kolonnitilavuudel la pH 12,5 -puskuria 107451 54

Triton X-100, ja 4) 50 mM trietyyliamiini, pH 11,0/0,1 % Triton X-100. Kaikki pesupuskurit sisälsivät pitoisuuden 1 mM PMSF ja 0,2 U/ml aprotiinia. Pesun jälkeen jäljelle jäänyt sitoutunut ICAM-1 eluoitiin 5 kolonnitilavuudella eluointipuskuria (50 mM trietyyliamiini/0,1 % Triton X-100/pH 12,5, 4 °C) virtausnopeudella 1 ml/3 min. Eluoitu ICAM-1 kerättiin 1 ml:n fraktioina ja neutraloitiin välittömästi lisäämällä 0,1 ml liuosta 1 M Tris, pH 6,7. ICAM-l:tä sisältävät fraktiot identifioitiin suorittamalla SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi 10 mikrolitran erille (Springer et ai., J.Exp.Med. 160 (1984) 1901), ja sen jälkeen hopeavärjäys (Morrissey, J.H., Anal .Biochem. 117 (1981) 307). Näissä olosuhteissa valtaosa ICAM-l:stä eluoitui noin 1 kolonnitilavuudessa ja sen puhtausaste oli yli 90 % hopealla värjätyistä elektroferogrammeista arvioiden (pääasiallinen epäpuhtaus oli pieni määrä IgG:tä, joka oli vuotanut affini-teettimatriisista). ICAM-l:tä sisältävät fraktiot yhdistettiin ja niitä konsentroitiin noin 20-kertaisesti käyttäen Centricon-30-mikrokonsentraattoreita (Amicon, Danvers, MA). Puhdistettu ICAM-1 kvantitoitiin suorittamalla Lowryn proteiinimääritys i i t * etanolilla saostetusta pool inäy tteestä : 200 g:sta ihmisen

i ( I

pernaa saatiin tuotettua noin 500 mikrogrammaa puhdasta ICAM-

I I

l:tä.

4 I I I I I I

• ( « « « V.1 Noin 200 mikrogrammalla puhdistettua ICAM-1:tä suoritettiin

• M

V · toinen puhdistusvaihe käyttäen preparatiivista SDS-polyakryy- liamidigeelielektroforeesia. ICAM-1:tä vastaava nauha tehtiin :V: näkyväksi liottamalla geeliä 1 M kaiiumkloridi1iuoksessa. ICAM- o · ·1·1: l:n sisältävä geeli-alue leikattiin sitten irti ja sillä suori- . 1, tettiin elektroeluutio Hunkapi11 erin et ai., Meth.Enzymol. 91 • Il **;, (1983) 227 - 236, menetelmän mukaan. Puhdistetun proteiinin *···1 puhtausaste oli > 98 % SDS-PAGE:n ja hopeavärjäyksen nojalla :Y: pääteltynä.

t · · 107451 55 ICAM-l:n affiniteettipuhdistus funktionaalisia tutkimuksia silmälläpitäen ICAM-1:tä käytettäväksi funktionaalisissa kokeissa puhdistettiin JY-solujen pesuainelysaateista edellä kuvatun mukaisesti, mutta pienemmässä mittakaavassa (1 ml:n kolonni, jossa RR1/1-Sepharosea), ja käyttäen seuraavia modifikaatioita. Kaikki liuokset sisälsivät pitoisuuden 50 mikro-M natriumvanadaattia. Kun kolonni oli pesty pH 11,0 -puskurilla, jossa oli 0,1 % Triton X-100 -valmistetta, kolonni pestiin jälleen viidellä kolonnitilavuudella samaa puskuria, joka sisälsi 1 %:n n-oktyyli-beeta-D-glukopyranosidia (oktyyliglukosidi) 0,1 %:n Triton X-100 -valmistetta asemesta. Oktyyliglukosidipesuaine korvaa ICAM-l:een sitoutuneen Triton X-100 -valmisteen ja vastoin kuin Triton X-100, se voidaan sittemmin poistaa dialysoimal1 a. ICAM-1 eluoitiin sitten pH 12,5 -puskurilla, jossa oli 1 % oktyyliglukosidia 0,1 %:n Triton X-100-valmis-tetta asemesta, minkä jälkeen se analysoitiin ja konsentroitiin kuten edellä kuvattu.

« I

/:·, ESIMERKKI 15 · Puhdistetun ICAM-1 :n ominaisuudet ( ( i |^ Ihmisen pernasta puhdistettu ICAM-1 migroituu SDS-polyakryy- « · · *·*·* liamidigeeieissä leveänä nauhana, jonka Mr on 72 000 - 91 000.

• · · ·.* ' JY-soluista puhdistettu ICAM-1 migroituu myös leveänä nauhana, jonka Mr on 76 500 - 97 000. Nämä Mr-arvot ovat eri soluläh- ::: teistä immuunisaostetul1 e ICAM-l:lle ilmoitetulla alueella: • ·

Mr = 90 OOO JY-soluille, 114 000 myelomonosyyttisolulinjal le . *. U937, ja 97 000 sidekudosmuodostussolui 11 e (Dustin et ai..

· · J.Immunol. 137 (1986) 245). Tämä laaja Mr-alue on katsottu johtuvaksi voimakkaasta mutta vaihtelevästä glykosylaatioas-: : : teestä. Ei-glykosyloidun prekursorin Mr on 55 000 (Dustin et.

·;··: ai..·-.) · Joko JY-soluista tai ihmisen pernasta puhdistetulla proteiinilla on tallella sen antigeeniaktiivisuus, minkä 107451 56 osoittavat sen kyky sitoutua uudelleen alkuperäiseen affini-teettikolonniin ja immuunisaostuminen RRl/l-Sepharose-geelissä ja SDS-polyakryyliamidielektroforeesi.

ICAM-l-peptidifragmenttien tuottamiseksi noin 200 mikrogrammaa pelkistettiin käyttäen seosta 2 mM ditiotreitoli/2 % SDS, minkä jälkeen alkyloitiin käyttäen 5 mM jodietikkahappoa. Proteiini saostettiin etanolilla ja uudel1eenlluotettiin liuokseen 0,1 M NH4CO3/O,1 mM CaCl2/0,l % Zwittergent 3-14 (Calbiochem), minkä jälkeen sitä pilkottiin pitoisuudella 1 % w/w trypsiiniä 37 °C:ssa 4 tunnin ajan, minkä jälkeen pilkottiin edelleen 1 %:lla trypsiiniä 12 tunnin ajan 37 °C:ssa. Trypsiinipeptidit puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC:11ä käyttäen 0,4 x 15 cm:n C4-kolonnia (Vydac). Peptidit eluoitiin käyttäen lineaarista gradienttia 0 % - 60 % asetonitriili/0,l-%:inen trifluorietik-kahappo. Valituilla peptideillä suoritettiin sekvenssianalyysi kaasufaasi-mikrosekventorilla (Applied Biosystems). Tästä tutkimuksesta saatu sekvenssi-informaatio on esitetty taulukossa 5.

• » • · · • · « • · · • · · « · · • · * * · • · · • · • ti • · • · · • * · • · · · t * • » 107451 57 TAULUKKO 5 ICAM-1-1rypsiinipeptidi en aminohapposekvenssit Amino- Peptidi happo- ——----- j äännös__50a 50b 46a 46b X 45 K AA J U 0 Ml

1 [T/V] A (V/A) E V S LE ALV L

2 F S Q PEFNLGLTL/E

3 L IT ALPPDSGL P/(G)

4 T SF AA TL VI P

5 V LP P P VR LE G/Y

6YGL LNTPVT N/L

7 P WP PVYQTP (N) 8 T P I I T/I G G C P/V (Q) 9 S F G (G) L - L S K (E) 10 E E (Q) - D E T (D)

11 A S D/P K S L S

12 G/S V V P F F C

13 A T D Q S E D

14 G V W V/L A - Q

15 I K T P

16 SK

17 A

18 P

19 X

: " 20 n

:T: 21 L

• · • · · • · • · · • · · ( ) = sekvenssi, jonka todennäköisyys on alhainen.

• · [ ] = sekvenssi, jonka todennäköisyys on hyvin alhainen.

• · · • / = merkitsee epäselvyyttä sekvenssissä; todennäköisin • · · :·ί : aminohappo on merkitty ensimmäiseksi.

» · · a = runsaasti esiintyvä peptidi b = vähän esiintyvä peptidi • · 107451 58 ESIMERKKI 16 ICAM-l-geenin kloonaus ICAM-l-geeni voidaan kloonata käyttäen mitä tahansa lukuisista eri menettelyistä. Esimerkiksi aminohapposekvenssi-informaatiota, joka saatiin sekventoimalla ICAM-1-trypsiinifragment-teja (taulukko 5), voidaan käyttää oiigonukleotidisekvenssin identifioimiseksi, joka vastaisi ICAM-l-geeniä. Vaihtoehtoisesti ICAM-l-geeni voidaan kloonata käyttäen ICAM-l-vastaista vasta-ainetta ICAM-1:tä tuottavien kloonien tunnistamiseksi.

ICAM-l-geenin kloonaaminen käyttämällä oligonukleotidikoettimia Geneettistä koodia (Watson, J.D., Molecular Biology of the Gene, 3. painos, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977) hyödyntäen voidaan tunnistaa yksi tai useampi erilainen oiigonukleotidi, joista kukin kykenee koodittamaan ICAM-1-trypsiinipeptidejä. Todennäköisyyttä sille, että tietty oiigonukleotidi on todella tosiasiallinen ICAM-l:tä koodittava sekvenssi, voidaan arvioida tarkastelemalla epänormaali ! 'emäsparimuodostus -suhteita ja tiheyttä, jolla tiettyä kodonia tosiasiallisesti käytetään (tietyn aminohapon koodittamiseksi) eukaryoottisissa soluissa. Tällaisia "kodonikäytäntösääntöjä" julkistavat Lathe, R. , et ai . , J .Mol ec. Biol . 183 (1985) 1 - 12.

< < Käyttämällä Lathen "kodonikäytäntösääntöjä" tunnistetaan • · · yksittäinen oi igonukleotidi , tai oligonukleotidisar ja, joka • · · * * * * sisältää teoreettisen "todennäköisimmän' nukleotidisekvenssin (eli nukleotidisekvenssin, jonka runsaus on alhaisin), joka 0 · • · · *.*.· kykenee koodittamaan ICAM-l-trypsiinipeptidisekvensse jä .

• · · • · « • · « : Oi igonukl eotidia, tai oligonukleotidisar jaa, joka sisältää • · · • · · · .···. teoreettisen "todennäköisimmän" sekvenssin, joka kykenee • · *·* koodittamaan ICAM-l-fragmentteja, käytetään kömpiementoivan • « *.*.* oi igonukl eotidin tai oi igonukleotidisar jän sekvenssin tunnis- tamiseksi, joka kykenee hybridoitumaan "todennäköisimpään" sekvenssiin, tai sekvenssisarjaan. Tällaisen kömpiementoivan 59 107451 sekvenssin sisältävää oligonukleotidia voidaan käyttää koettimena ICAM-l-geenin tunnistamiseksi ja eristämiseksi (Maniatis, T., et ai ., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982.

Kuten kuvattu osassa C, edellä, on mahdollista kloonata ICAM-1-geeni eukaryoottisista DNA-valmisteista, joiden arvellaan sisältävän tämän geenin. ICAM-l-proteiinia koodittavan geenin tunnistamiseksi ja kloonaamiseksi DNA-kirjasto seulotaan sen kyvyn suhteen hybridoitua edellä kuvattuihin oligonukleotidi-koettimiin. Koska on todennäköistä, että normaali diploidinen solu käsittää ICAM-l-geenistä vain kaksi kopiota, ja koska on mahdollista, että ICAM-l-geeniin saattaa sisältyä suuria ei-transkriboituvia välisekvenssejä (introneja), joita ei haluta kloonata, edullisesti ICAM-l:tä koodittavat sekvenssit eristetään cDNA-kirjastosta, joka on valmistettu mieluummin ICAM-l:tä tuottavan solun mRNA:sta kuin genomi-DNA:sta. Sopiva DNA- tai cDNA-valmiste pilkotaan entsymaattisesti tai rikotaan umpimähkään ja ligatoidaan yhdistelmävektoreihin. Sen jälkeen mitataan näiden yhdistelmävektoreiden kyky hybridoitua edellä kuvattui-hin oi igonukleotidikoettimiin. Menettelyitä hybridoinnin i suorittamiseksi esitetään esimerkiksi julkaisuissa Maniatis, T., Molecular Cloning - A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982, tai Haymes, B.T., et al.,

« < 4 < I

. . Nucleic Acid Hybridization - A Practical Approach. IRL Press, • · · '·'·* Oxford, UK, 1985. Tällaiseen hybridoitumiseen kykeneviä • · · '·' * vektoreita analysoidaan sitten niiden sisältämien ICAM-1- sekvenssien määrän ja laadun määrittämiseksi. Vain tilastoi- • « listen näkökohtien nojalla jokin geeni, kuten ICAM-l-molekyy- • · * : Iin koodittava geeni, voitaisiin yksikäsitteisesti tunnistaa : ]·. (hybridointiseul onnal la) käyttäen vain 18 oligonukleotidia sisältävää oiigonukleotidikoetinta.

*«« Täten yhteenvetona ICAM-l-peptidisekvenssien tosiasiallinen "·*: tunnistus mahdollistaa teoreettisen "todennäköisimmän" DNA- fin 107451 sekvenssin, tai tällaisten sekvenssien sarjan, joka kykenee koodittamaan tällaisen peptidin, tunnistuksen. Rakentamalla oiigonukleotidi, joka komplementoi tätä teoreettista sekvenssiä (tai rakentamalla oiigonukleotidisarja, joka komplementoi "todennäköisimpien" oiigonukleotidien sarjaa), saadaan DNA-molekyyli (tai DNA-molekyy1isarja), joka kykenee toimimaan koettimena ICÄM-l-geenin tunnistamiseksi ja eristämiseksi.

Käyttäen taulukon 5 mukaisia ICAM-l-peptidisekvenssejä oiigonukleotidin, jolla on "todennäköisin" sekvenssi, sekvenssi, joka kykenee koodittamaan AA- ja J-peptidejä, tunnistettiin (taulukko 6 ja vastaavasti 7). Näitä sekvenssejä kömpiementoivia oligonukleotideja syntetisoitiin ja puhdistettiin käytettäviksi koettimina ICAM-l-geenisekvenssien eristämiseksi. Sopivia koon suhteen valikoituja cDNA-kirjastoja muodostettiin poly(A)+-RNA:sta, joka oli peräisin PMA:lla indusoiduista HL-60-soluista tai PS-stimuloiduista napalaskimo-endoteelisoluista. Koon suhteen valikoitu cDNA-kirjasto valmistettiin käyttäen poly(A)+-RNA:ta, joka oli saatu PMÄ-indusoi-duista HL-60-soluista, Gublerin, U., et ai. (Gene 25 (1983) 263 - 269) ja Corbin, A., et ai fEMBO J. 6 (1987) 4023 -\ 4028), jotka viitteet sisällytetään tähän viitteiksi, ] menetelmän mukaan.

| Koon suhteen valikoitu cDNA-kirjasto valmistettiin käyttäen • * · *·*.* poly(A)+-RNA:ta, joka oli peräisin napalaskimo-endoteeliso- • · · *.* · luista, joita oli stimuloitu 4 tunnin ajan PS:llä, 5 mikro-grammaa/ml. RNA uutettiin homogenoimalla solut 4 M guanidine: niumisotiosyanaatissa ja uitrasentrifugoimal1 a supernatantti

CsCl-gradienttia käyttäen (Chirgwin, J.M., et ai. . Biochem. 18 . *. (1979) 5294 - 5299). Poly(A)+-RNÄ eristettiin kokonais-RNA- • · · **·/ 1 a jiseoksesta käyttämällä oiigo-(dT)-sei luloosakromatografiaa (tyyppi 3, Collaborative Research) (Aviv, H., et ai . ,

Proc.Natl .Acad.Sci. USA 69 (1972) 1408 - 1412).

ei 107451 TAULUKKO 6

Oiigonukleotidi, joka kömpiementoi todennäköisintä nukleotidisekvenssiä, joka kykenee koodittamaan ICAM-l-AÄ-peptidin ICAM-ami- icAM-l-AA- Todennököis·5 n. AA- Komplemen- nohappo- peptidin koodit- toiva.sek- i äännös p p „ tava sekvens si_yens s ι 5' 3'

162 Glu G C

A T

G C

163 Leu C G

T A

G C

164 Asp G C

A T

C G

165 Leu C G

T A

G C

166 Arg C G

G C

G C

167 Pro C G

C G

C G

f'·· 168 Gin C G

A T·

G C

169 Gly G C

G C

* Q Q

170 Leu C G

T A

:.· : G C

171 Glu G C

A T

:Y: G C

I.! 172 Leu C G

V : T A

* G C

I.:’: 173 Phe T A

T A

T A

174 Glu G C

v.: A T

·:··: G C

3' 5' 62 107451 TAULUKKO 6 (jatk.) ICAM-ami- iCAM-l-AA- Todeanököisin. AA- Komplemen-nohappo- /h peptidin koodit- toiva.sek- jäännös pepoiai tava sekvenssi venssi

175 Asn A T

A T

C G

176 Thr A T

C G

C G

177 Ser U A

C G

A

3' 5' I I c • 4 4 4 4

• · O

• · «·» • · · « · « • * O • · • · · • · · • · e « * • · · • · « • · · · • t 107451 63 TAULUKKO 7

Oligonukleotidi, joka komplementoi todennäköisintä nukleotidisekvenssiä, joka kykenee koodittamaan ICAM-1-J-peptidin 11 * · " . !»......~ i — ICAM-l-AA- Todennäköisin. AA- Komplemen-nohappo- tidi peptidin koodit- toiva.sek- jaannos F FL1U _tava sekvenssi_venssi 5' 3' .

19 Vai G C

T A

G C

20 Thr A T

C G

C G

21 Cys T A

G C

C G

22 Ser T A

C G

C G

23 Thr A T

C G

C G

24 Ser T A

C G

’·· C G

25 Cys T A

G C

T A

25 Asp G C

A T

C G

27 Gin C G

• * ·

: : : AT

G C

28 Pro C G

C G

,0 C G

: : : 29 Lys A T

A T

: : : 3' 5' * · · « * ·« » · » * * 107451 64

Ensimmäinen cDNÄ-säie syntetisoitiin käyttäen 8 mikrogrammaa poly(A)+-RNA:ta, linnun myeloblastoosi-virus-käänteistransk-riptaasia (Life Sciences) ja oligo(dT)-aluketta. DNA-RNA-hybridi pilkottiin RN-aasi-H:1la (BRL) ja toinen säie syntetisoitiin käyttäen DNA-polymeraasi-I:tä (New England Biolabs). Tuote metyloitiin EcoRI-metylaasilla (New England Biolabs), ja tasaiseksi saatetut päät ligatoitiin EcoRI-liittäjiin (New England Biolabs), minkä jälkeen pilkottiin EcoRI:llä ja valikoitiin koon mukaan alhaisen sulamispisteen omaavassa agaroosigeelissä. Kooltaan suuremmat cDNA:t kuin 500 ep:tä ligatoitiin 1ambda-gtlO:een, jota oli edeltäpäin pilkottu EcoRI:llä ja defosforyloitu (Stratagene). Ligatointituote pakattiin sitten (Stratagene-kulta).

Sitten napalaskimo-endoteelisolu- ja HL-60-cDNA-kirjastoja maljoitettiin pitoisuudeksi 20 000 pmy/150 mm:n malja. Yhdistelmä-DNA siirrettiin kaksinkertaisin rinnakkaismääri-tyksin nitroselluloosasuodattimille, denaturoitiin käyttäen 0,5 M NaOH/1,5 NaCl -liuosta, neutraloitiin lisäämällä 1 M Tris-puskuria, pH 7,5/1,5 M NaCl, ja paistettiin 80 °C:ssa 2 tunnin • " ajan (Benton, W.D., et ai., Science 196 (1977) 180 - 182).

V Suodattimet esihybridoitiin ja sitten hybridoitiin 5XSSC:ssä, joka sisälsi 5X Denhardtin liuosta, 50 mM NaPCU ja 1 mikro-'i"; gramman/ml 1ohensperma-DNA:ta. Esihydridointi suoritettiin 45 °C:ssa ja sen annettiin kestää 1 tunnin.

«·* • i ·

Hybridoinnissa käytettiin 32 ep:n ('5-TTGGGCTGGTCACAG-GAGGTGGAGCAGGTGAC) tai 47 ep:n /5' -GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGG

l.'.' GGCCGCAGGTCCAGCTC) ei-tieto-oligonukleotideja, joiden rakenne • · ·

perustui edellä kuvatulla tavalla ICAM-l-trypsiinipeptidiin J

• · :.· · ja vastaavasti AA (taulukko 7 ja 6) (Lathe, R., J .Mol ec. Biol .

: : 183 (1985) 1 - 12). Oiiqonukleotidien päät leimattiin gamma- • 9 * —— (32P)ATP:llä käyttäen T4-polynukleotidikinaasia ja valmistajan • · · (New England Biolabs) suosittelemia olosuhteita. Suodattimia hybridoitiin yön yli, minkä jälkeen niitä pestiin kahdesti 65 107451 2XSSC/0,! % SDS -liuoksella 30 minuutin ajan 45 °C:ssa. Fagit eristettiin niistä pesäkkeistä, joissa oli tapahtunut hybri-doitumista, minkä jälkeen niitä puhdistettiin maljoittamal1 a ja seulomalla useaan kertaan.

ICAM-l-creenin kloonaaminen käyttämällä ICAM-l-vastaista vasta-ainetta ICAM-l-geeni voidaan vaihtoehtoisesti kloonata käyttämällä ICAM-l-vastaista vasta-ainetta. DNA:ta, tai edullisemmin cDNArta, uutetaan ja puhdistetaan ICÄM-l:n ilmentämään kykenevästä solusta. Puhdistettu cDNA fragmentoidaan (rikkomalla, endonukleaaseilla pilkkomalla, jne.) DNA- tai cDNA-fragmenttipoolin saamiseksi. Tämän poolin DNA- tai cDNA-fragmentit kloonataan sitten iImennysvektoriin ilmennysvekto-rigenomikirjaston tuottamiseksi, jonka jäsenistä kukin sisältää yksittäisen kloonatun DNA- tai cDNA-fragmentin.

ESIMERKKI 17 cDNA-kloonien analysointi Y Positiivisista klooneista saatu fagi-DNA pilkottiin EcoRIrllä ja sitä tutkittiin Southernin analysilla käyttäen yhden kloonin '·' cDNAita koettimena. Ristihybridoituvat maksimikoon omaavat • « cDNA-insertit aiakloonattiin plasmidivektorin pGEM4Z (Promega) : i : EcoRI-keskukseen. cDNA:n kummankin suunnan mukaan suuntautu- neena sisältävät HL-60-alakloonit tuhottiin pilkkomalla eksonukleaasi-III: 11a (Henikoff, S., Gene 28 (1984) 351 - 359) • · valmistajan (Erase-a-Base, Promega) suosituksia noudattaen.

« · · • Asteittain tuhotut cDNA:t kloonattiin sitten ja niille suori- • · • · · : tettiin dideoksinukleotidiket jupääsekventointi (Sanger, F. , et.

• · · ai . , Proc . Natl . Acad. Sei . USA 74 (1977) 5463 - 5467) valmistajan (Seguenase, U.S. Biochemical) ohjeiden mukaan. HL-60-cDNA:n 5'- * · ja koodialueet sekventoitiin täydellisesti kummastakin • « säikeestä ja 3'-alue sekventoitiin noin 70-%:isesti kummastakin 107451 66 säikeestä. Edustava endoteeli-cDNA sekventoitiin lähes koko pituudeltaan "haulikko"-kloonaamal1 a 4 ep:n tunnistusrestrik-tioentsyymifragmentteja.

Määritettiin yhden HL-60- ja yhden endoteelisolu-cDNA:n cDNÄ-sekvenssi (kuvio 8). 3023 ep:n sekvenssi sisältää lyhyen 5'-ei-translatoituvan alueen ja 1,3 ep:n 3'-ei-translatoituvan alueen, jolloin asemassa 2966 sijaitsee konsensus-polyadeny-laatiosignaali. Pisin avoin lukualue alkaa ensimmäisestä ATG-kodonista asemassa 58 ja päättyy TGA-1opetuskolmikkoon asemassa 1653. Koska translatoitu aminohapposekvenssi ja kahdeksasta (8) eri trypsiinipeptidistä, kaikkiaan 91 aminohappoa (alleviivattu kuviossa 8), määritetyt sekvenssit olivat samankaltaiset, varmistui, että oli eristetty autenttisia ICAM-1-cDNÄ-klooneja. ICAM-l-trypsiinipeptidien aminohapposekvenssit on esitetty taulukossa 8.

TAULUKKO 8 ICAM-l-trypsiinipeptidien aminohapposekvenssejä : " Peptidi Jäännäkset Sekvenssi

J 14-29 'XGSVLVTCSTSCDQPK

4 I

·:·! U 30-39 L L G I E T P l (P) (K)

50 78-85 (T) F L T V Y X T

*··

*·* : X 89-95 VELAPLP

AA 161-182 X ELDLRPOGLE --

:.V L F E X T S APXQL

• · * • · «

*\ ’ K 232-246 LNPTVTYGXDSFSAK

• · *;·.· 45 282-295 S F P A P N V (T/I) L X K P Q (V/L) • · • · -- merkitsee, että sekvenssi jatkuu seuraavalla rivillä; alleviivattuja sekvenssejä käytettiin oiigonukleotidikoettimien valmistuksessa.

107451 67

Hydrofobisuusanalyysin (Kyte, J., et al. , J.Molec.Biol . 157 (1982) 105 - 132) tuloksien mukaan läsnä on 27 jäännöksen signaalisekvenssi. +l-glutamiinin sijoitus sopii siihen, ettemme onnistuneet saamaan N-pääsekvenssiä kolmelle eri ICAM-1-proteiinivalmisteelle; glutamiini mahdollisesti syklisoituu pyroglutamiinihapoksi, jolloin muodostuu salvattu N-pää. Translatoitu sekvenssi 1 - 453 on voittopuolisesti hydrofii-linen, jolloin sen jälkeen seuraa 24 jäännöksen hydrofobinen oletettu membraanin läpäisevä alue. Tätä membraanin läpäisevää aluetta seuraa välittömästi useita varauksen käsittäviä jäännöksiä, jotka sijoittuvat 27 alueen oletetulle sytoplasma-alueel1 e.

Kypsälle polypeptidiketjul1 e ennustettu koko on 55 219 daltonia, mikä sopii oikein hyvin deglykosyloidul1 e ICAM-l:lle saatuun kokoon 55 000 (Dustin, M.L., et ai . . J. Immunol. 137 (1986) 245 - 254). Ennustetaan 8 N-kytkenteistä glykosylaatio-keskusta. Asparagiinin puuttuminen trypsiinipeptidisekvens-seistä kahdessa näistä keskuksista varmistaa niiden glykosy-laation ja solunulkoisen orientaation. Jos korkean mannoosipi-.·. toisuuden käsittävän N-kytkenteisen hiilihydraatin kooksi ole- tetaan 2500 daltonia, ICAM-l-prekursorin kokoennusteeksi saadaan 75 000 daltonia verrattuna havaittuun 73 000 daltoniin (Dustin, M.L., et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254). Kun • f 4 I ( korkean mannoosipitoisuuden käsittävä tuote on muutettu • · • 0 m kompleksiseksi hiilihydraatiksi, kypsän ICAM-l-glykoproteiinin ··· V1 koko on 76 - 114 kd:tä, solutyypin mukaan (Dustin, M.L., et ai .. J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254). Täten ICAM-1 on voimakkaasti glykosyloitu, mutta muutoin tyypillinen integraa-linen membraaniproteiini.

« ♦ • · 1 • · « ·«· ·

• M

• · • · · • · · • · » * » > · • ♦ 68 107451 ESIMERKKI 18 ICÄM-1 on immunoglobuliinisupergeeniryhmän integriiniä sitova jäsen ICAM-l:n sisäiset toistot asetettiin rinnan käyttäen Microgenie-proteiinisuuntausohjelmaa (Queen, C., et ai.,

Nucl.Acid Res. 12 (1984) 581 - 599), ja tulosta tarkasteltiin. ICAM-1 astettiin IgM:n, N-CAM:in ja MÄG:in rinnalle käyttäen Microgenie- ja ÄLIGN-ohjelmaa (Dayhoff, M.O., et ai..

Meth.Enzymol. 91 (1983) 524 - 545). Neljässä proteiinisekvens-sitietokannassa, joita ylläpitää laitos the National Biomedical Research Foundation, suoritettiin atk-haut proteiinisekvenssi-yhtäläisyyksiä etsien Williamsin ja Pearsonin FASTP-ohjelmaa käyttäen (Lipman, D.J., et ai,, Science 227 (1985) 1435 -1439).

Koska ICAM-1 on integriini-igandi sen kuuluminen immunoglobu-1iinisupergeeniryhmään oli odottamatonta. Kuitenkin tarkastelemalla ICAM-l-sekvenssiä todetaan, että se täyttää kaikki kriteerit, jotka asetetaan immunoglobuliinisupergeeniryhmään I kuulumiselle. Näitä kriteerejä puolestaan käsitellään alla.

< < « « 4 « • · « « ICAM-I:n soiunulkoinen alue kokonaisuudessaan koostuu 5 • « • · · homologisesta immunogl obul iinin kaltaisesta alueesta, jotka • i esitetään rinnakkain kuviossa 9A. Alueet 1-4 ovat pituudel- • · 1 taan 88, 97, 99 ja vastaavasti 99 jäännöstä, ja edustavat siten tyypillistä Ig-aluekokoa; alue 5 on typistynyt 68 jäännökseen. Suoritettaessa atk-haku NBRF-tietokannassa FASTP-ohjelmal1 a • 1 ♦ *·1·1 todettiin merkittäviä homologioita immunogl obul iinisupergeeni- • · · ’·1 ’ ryhmän jäseniin, mukaanlukien IgM- ja IgG-C-alueet, T-solure- • .·1: septori-al fa-alayksikön vaihtuva alue ja ai f a-l-beeta-glyko-··· · .1··. Proteiini (kuvio 9B - D) .

• · 4 • · * · · *·1·’ Edeltävää informaatiota käyttäen ICAM-1 :n aminohapposekvenssiä * · verrattiin muiden immunoglobuliinisupergeeniryhmän jäsenien 69 107451 aminohapposekvensseihin.

Toisistaan erotetaan kolmen tyyppisiä Ig-superryhmäalueita, V, Cl ja C2. Sekä V- että C-alueet koostuvat kahdesta beeta-levystä, jotka kytkee toisiinsa alueensisäinen disulfidisidos; V-alueet sisältävät 9 anti-paralleeli-beeta-säi'että, jolloin C-alueet puolestaan sisältävät 7. Pysyvät alueet jaettiin ryhmiksi Cl ja C2 kuviossa 9A esitettyjen tyypillisten jäännöksien nojalla. Cl-ryhmään kuuluu antigeenitunnistukseen liittyviä proteiineja. C2-ryhmään kuuluu useita Fc-reseptoreita ja proteiineja, jotka liittyvät solukiinnitykseen, mukaanlukien CD2, LFA-3, MAG ja NCAM. ICAM-l-alueiden todettiin olevan erittäin voimakkaasti homologisia C2-ryhmän alueisiin nähden, mikä osoitti ICAM-l:n tähän ryhmään; tämä heijastuu voimakkaampana samankaltaisuutena säilyviin jäännöksiin C2- kuin Cl-alueilla kuten esitetty beeta-säikeille B - F kuviossa 9.

Samoin ICAM-l-alueet asettuivat huomattavasti paremmin C2-alueiden beeta-säikeiden A ja G rinnalle kuin näiden säikeiden V- ja Cl-alueilla rinnalle, jolloin saatiin hyvä rinnanasetus kautta C2-alueen koko mitan. Rinnanasetukset C2-alueiden NCAM:sta, MAG:sta ja alfa-l-beeta-glykoproteiinista kanssa on ,'i esitetty kuvioissa 9B ja 9C; samankaltaisuus vaihteli 28 %:sta ,· 33 %:iin. Rinnanasetukset T-solureseptori-V-al f an kanssa, 27 %:n samankaltaisuus, ja IgM-C:n alue-3:n kanssa, 34 %:n « ( .. samankaltaisuus, on niinikään esitetty (kuviot 9B, 9D).

• · · • · · • · • · · • · · *·* * Yksi immunoglobuliinialueiden tärkeimmistä ominaisuuksista ovat disulfidikytkenteiset kysteiinit, jotka yhdistävät sillalla B- • · ja F-beeta-säikeet, mikä stabiloi beeta-levyn "sandwich"- ··* ί.! ! muotoon; ICAM-l:ssä kysteiinit säilyvät kaikissa tapauksissa : lukuunottamatta alueen 4 säi’että f, jossa esiintyy leusiini, • · · ]*!·* joka on mahdollisesti kääntynyt "sandwich"-rakennetta kohden ja • · *; voi mahdollisesti stabiloida kontaktin, kuten esitetty joille- ♦ · kin muille V- ja C2-ryhmäalueille. Kysteiinien väliset etäi-syydet (43, 50, 52 ja 37 jäännöstä) ovat kuten kuvattu C2- VO 107451 ryhmäl1 e.

Ketjunsisäisten disulfidisidoksien läsnäolon ICAM-l:ssä tutkimiseksi endoteelisolu-ICAM-1:1lä suoritettiin SDS-PAGE pelkistävissä ja toisaalta ei-pelkistävissä olosuhteissa. Endoteelisolu-ICAM-1:tä käytettiin, koska se osoittaa vähemmän glykosylaatio-heterogeniaa kuin JY- tai karvainen solu -perna-ICAM-1 ja koska siinä Mr~siirtymät ovat herkempiä. ICAM-1:tä puhdistettiin siten 16 tunnin LPS:llä (5 mikrogrammaa/ml) stimuloiduista napalaskimo-endoteelisoluviljelmistä immuno-affiniteettikromatografisesti kuten edellä kuvattu. Asetonilla saostettu ICAM-1 uudel1eenlietettiin näytepuskuriin (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680 - 685) käyttäen 0,25 % 2-merkaptoetanolia tai pitoisuutta 25 mM jodoasetamidi ja lämmitettiin 100 °C:seen 5 minuutiksi. Näytteillä suoritettiin SDS-PAGE 4670 -ajo ja hopeavärjäys 4613. Endoteelisolu-ICAM-1:n näennäinen Mr oli 100 kd:tä pelkistävissä olosuhteissa ja 96 kd:tä ei-pelkistävissä olosuhteissa, mikä viittaa voimakkaasti ketjunsisäisten disulfidien läsnäoloon natiivissa ICAM-l:ssä.

.1. Käyttämällä primaarisekvenssiä sekundaari rakenteen ennusta- miseksi (Chou, P.Y., et ai. . Biochem. 13 (1974) 211 - 245) * i todettiin 7 ennakoitua beeta-säi ' että kussakin ICAM-1-

I

alueessa, merkittyinä a - g kuviossa 9A ylhäällä, mikä täysin «1(11 ] / vastaa ennustetta immunoglobuliinialueesta ja vastaa säikeiden • · · *·’·* A - H asemia immunoglobuliineissa (kuvio 9A, alhaalla).

Iti • · · V " Alueelta 5 puuttuvat A- ja C-säikeet, mutta koska nämä muodostivat levyjen reunat, levyt voivat silti edelleen • · muodostua, mahdollisesti siten, että säie D asettuu säikeen C :T: paikalle, kuten esitetty joillekin muille C2-alueille; jolloin . karakteristinen disulfidisidos B- ja F-säikeiden välillä jäisi φ » « • » · "I.* ennalleen. Täten kriteerit, jotka koskevat aluekokoa, sekvens- • · *”* sihomologiaa, säilyviä kysteiinejä, jotka muodostavat oletetun ί .* i alueensisäisen disul f idisidoksen, disul f idisidoksien läsnäoloa •:”j ja ennustettua beeta-levyrakennetta, on kaikki täytetty silmäl- 71 107451 läpitäen ICAM-l:n lukemista immunoglobuliinisupergeeniryhmään.

ICAM-l:n todettiin voimakkaimmin homologiseksi C2-sarjan glykoproteiineihin NCAM ja MAG nähden. Tämä on erityisen kiinnostavaa, koska sekä NCAM että MAG välittävät solu-solukiinnitystä. NCAM on tärkeä hermosolu-hermosolu- ja hermo-1ihasvuorovaikutuksissa (Cunningham, B.A., et ai.. Science 236 (1987) 799 - 806), kun taas MAG on merkityksellinen hermosolu-oligodendrosyytti- ja oligodendrosyytti-oligodendrosyyttivuo-rovaikutuksissa myelinaation aikana (Poltorak, M., et ai., J.Cell.Biol. 105 (1987) 1893 - 1899). NCAM:n ja MAG:n solupintailmennys tulee kehityksen myötä säädellyksi hermoston muodostuksen ja vastaavasti myelinaation aikana analogisesti ICAM-l:n säädeltyyn induktioon tulehduksen aikana nähden (Springer, T.A., et ai., Ann.Rev.Immunol. 5 (1987) 223 - 252). ICAM-1, NCAM (Cunnigham, B.A., et ai., Science 236 (1987) 799 -806) ja MAG (Salzer, J.L., et ai.. J.Cell.Biol. 104 (1987) 957 - 965) ovat samankaltaisia yleisrakenteeltaan sekä homologisia, koska kukin on integraalinen membraaniglykopro-teiini, joka koostuu viidestä C2-alueesta, jotka muodostavat N-. pään solunulkoisen alueen, vaikka NCAM:ssa jonkin verran yli- ' i määräistä ei-Ig-kaltäistä sekvenssiä esiintyy viimeisen C2- • C ( ' alueen ja transmembraanialueen välissä. ICAM-1 asettuu koko • t e • ( pituudeltaan mukaanlukien transmembraani- ja sytoplasma-alueet i '· ' MAG:n rinnalle, jolloin samankaltaisuus on 21 %; sama samankal-·,·,! taisuus-% todetaan verrattaessa ICAM-l:n ja NCAM-l:n viittä aluetta. Kuviossa 10 on esitetty diagrammina ICAM-1:n ja MAG:n sekundaarirakenteet. Vertaamalla aluekohtaisesti todetaan, että ICAM-1- ja NCAM-molekyylien sisäisten alueiden välisen homolo-gian aste (x +/- s.d.; 21 +/- 2,8 % ja vastaavasti 18,6 +/- • · · 3,8 %) vastaa homologiatasoa verrattaessa ICAM-l-alueita NCAM- * · i ja MAG-alueisiin (20,4 +/- 3,7 ja vastaavasti 21,9 +/- 2,7).

• « · ·...· Vaikka löytyy todisteita siitä, että NCAM:n C-pää-alueil la tapahtuu vaihtoehtoista silmukoitumista (Cunnigham, B.A, et.

f · · ai. . Science 236 (1987) 799 - 806; Barthels, D., et ai . , • · 72 1 0 7 4 51 EMBO J. 6 (1987) 907 - 914), kuten myös MAG:n (Lai, C., et al. . Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84 (1987) 4377 - 4341), mitään todisteita tästä ei ole löydetty sekventoitaessa endoteeli- tai HL-60-ICAM-l-klooneja tai tutkittaessa ICAM-l-proteiinirunkoa ja -prekursoria eri solutyypeissä (Dustin, M.L., et ai..

J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254).

ICAM-1 toimii LFA-1:n ligandina imusoluvuorovaikutuksissa lukuisilla eri solutyypeillä. Imusolut sitoutuvat ICAM-l:een, joka on sisäistynyt keinotekoisiin membraanikaksikerroksiin, ja tämä edellyttää LFA-1:n läsnäoloa imusoluilla, mikä osoittaa suoraan LFA-l:n vuorovaikutuksen ICAM-l:n kanssa (Marlin, S.D., et ai., Cell 51 (1987) 813 - 819). LFA-1 on valkosoluintegriini eikä sillä ole mitään immunoglobuliinin kaltaisia piirteitä. Valkosoluintegriinit käsittävät yhden integriinialaluokan. Muut kaksi alaluokkaa välittävät soiu-matriisivuorovaikutuksia ja tunnistavat sekvenssin RGD 1igandeissaan, joita ovat fibronek-tiini, vitronektiini, kollageeni ja fibrinogeeni (Hynes, R.O., Cell 48 (1987) 549 - 554; Ruoslahti, E., et ai., Science 238 (1987) 491 - 497). Valkosoluintegriinit ilmentyvät vain valkosoluilla, ja osallistuvat solu-soluvuorovaikutuksiin,

I I

: " jolloin ainoat tunnetut ligandit ovat ICAM-1 ja iC3b, joka on v : kömpiementtikomponentti-C3-fragmentti, joka ei osoita mitään !(ii< immunoglobuliinin kaltaisia piirteitä ja jonka tunnistaa Mac-1 '(Kishimoto, T.K., et ai . . Leukocyte Typing III; McMichael, M.

(toim.), Springer-Verlag, New York (1987); Springer, T.A. , et.

» · ai . , Ann Rev Immunol . 5 (1987) 223 - 252; Anderson, D.C., et.

• · · ai., Ann.Rev.Med. 38 (1987) 175 - 194). Sekventointianalyysin . . perusteella saatuja LFA-1:n mahdollisesti tunnistamia ICAM-1- i t « 1

I · I

,1.1 sekvenssiin kuuluvia peptidejä on esitetty taulukossa 9.

* 1 · # « · • · » ♦ · • « · « · · «

Ml * · • · · «

I · I

107451 73 TAULUKKO 9 ICAM-l-sekvenssiin sisältyviä peptidejä, jotka LFA-1 mahdollisesti tunnistaa -L-R-G-E-K-E-L- -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P- -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E- -P-R-G-G-S- -P-G-N-N-R-K- -Q-E-D-S-Q-P-M- -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S- -R-R-O-H-H-G-A-N-F-S- -D-L-R-P-Q-G-L-E- ICAM-1 on ensimmäinen esimerkki immunoglobuliinisupergeeni-ryhmäjäsenestä, joka sitoutuu integriiniin. Vaikka molemmat nämä ryhmät esittävät tärkeää osaa solukiinnityksessä, niiden välisen vuorovaikutuksen toteaminen oli odottamatonta. Sitä vastoin vuorovaikutukset immunoglobuliinigeenisuperryhmän puitteissa ovat varsin tavallisia. On varsin mahdollista, että * · • *' myöhemmin löydetään lisää esimerkkejä integriini- ja immuno- V · globoliiniryhmien välisistä vuorovaikutuksista. LFA-1 tunnistaa ICÄM-l:stä poikkeavan ligandin (Springer, T.A. , et ai . .

Ί": Ann.Rev. Immunol. 5 (1987) 223 - 252) ja valkosoluintegriini

Mac-1 tunnistaa C3bi:stä poikkeavan ligandin neutrofiili- • · ;’j*. neutrofiilikiinnityksessä (Anderson, D.C., et ai . . Ann.Rev.Med.

* 38 (1987) 175 - 194). Lisäksi puhdistetut MAGrtä sisältävät rakkulat sitoutuvat MAG-pitoisiin hermoviejähaarakkeisiin, joten MAG:n on kyettävä heterofiiliseen vuorovaikutukseen • · · • · · *. jonkin nimenomaisen reseptorin kanssa (Poltorak, M., et ai,, J.Cell.Biol. 105 (1987) 1893 - 1899).

Ml • ·

IM

NCAM:n osuuden hermosolu-hermosolu- ja hermosolu-1ihassoluvuo- * · · ". rovaikutuksissa on esitetty johtuvan homofiilisistä NCAM-NCAM- 107451 74 vuorovaikutuksista (Cunnigham, B.A., et ai., Science 236 (1987) 799 - 806). MAG:n tärkeä rooli Schwannin solujen, jotka ympäröivät hermosolujen pitkää haaraketta myeliinitupen muodostuksen aikana, viereisten käänteiden välisissä vuorovaikutuksissa johtuu mahdollisesti vuorovaikutuksesta jonkin nimenomaisen reseptorin kanssa, tai homofiilisistä MAG-MAG-vuorovaikutuk-sista. Homologia NCAM:iin nähden ja alue-aluevuorovaikutuksien taajaan toistuva esiintyminen immunoglobuliinisupergeeniryhmässä nostaa esiin mahdollisuuden, että ICAM-1 mahdollisesti osallistuu homofiilisiin vuorovaikutuksiin sekä ICAM-l-LFA-1-heterofiilisiin vuorovaikutuksiin. Kuitenkin B-varhaisimuso-lujen, jotka kanssailmentävät samanlaisia LFA-1- ja ICAM-1-tiheyksiä, sitoutuminen ICAM-1:een keinotekoisissa faaseissa tai solu-yksikerroksissa voidaan estää täysin esikäsittelemäl1ä B-varhaisimusoluja LFA-l-MAb:11ä, kun taas kiinnitykseen ei vaikuta B-varhaisimusolujen esikäsittely ICÄM-l-MAb:llä. Esi-käsittelemällä yksikerrosta ICAM-l-MAb:11ä tuhotaan sitoutuminen täysin (Dustin, M.L., et ai ., J. Immunol. 137 (1986) 245 -254; Marlin, S.D., et ai .. Cell 51 (1987) 813 - 819). Nämä löydökset osoittavat, että jos ICÄM-l-homofii1ivuorovaikutuk- /. _ siä lainkaan esiintyy, niiden täytyy olla heikompia kuin < heterof ii liset LFA-1-vuorovaikutukset.

• « i e • «

Mahdollisuus, että vaikosoluintegriinit tunnistavat ligandeja [ pohjimmaltaan täysin erilaisella tavalla, sopii 180 jäännöksen • » · ’·*·* sekvenssin läsnäoloon niiden ai f a-al yksiköissä , jolla sekvens- • I* *.* · sillä saattaa olla merkitystä 1 igandisitoutumisessa ja jota ei esiinny RGD:n tunnistavissa integriineissä (Corbi, A., et ai., : EMBO J 6 (1987) 4023 - 4028). Vaikka Mac-l:n on esitetty tunnistavan iC3b-5086 : ssa esiintyvän RGD-sekvenssin, ICAM-1 :een .ei sisälly RGD-sekvenssiä (kuvio 8). Tämä sopii yhteen fibro- II· *“,* nektiinipeptidin GRGDSP ja verrqkkipeptidin GRGESP kyvyttömyy- *··'* den kanssa inhiboida ICAM-l-LFA-l-kiinnitystä (Marlin, S.D., et.

:V: ai ., Cell 51 (1987) 813 - 819). Kuitenkin sukulaissekvenssit ♦;··· kuten PRGGS ja RGEKE esiintyvät ICAM-1 :ssä alueilla, joiden 107451 75 ennustetaan muodostavat silmukan alueen 2 beeta-säikeiden a ja b väliin ja vastaavasti alueen 2 säikeiden c ja d väliin (kuvio 9) ja jotka täten ovat saatavilla tunnistusta varten. Kiinnostavaa on, että homologinen MAG-molekyyli sisältää RGD-sekvens-sin alueiden 1 ja 2 välillä (Poltorak, M., et ai ., J. Cel 1.Biol 105 (1987) 1893 - 1899; Salzer, J.L., et ai ., J.Cell.Biol. 104 (1987) 957 - 965).

ESIMERKKI 19

Southern- ja Northern-blot-määritykset

Southernin blot-määritykset suoritettiin käyttäen 5 mikrogrammaa genomi-DNA:ta, joka oli uutettu kolmesta solulinjasta: BL2, Burkittin 1ymfomasolui inja (lahja Dr. Gilbert Lenoirilta); JY ja Er-LCL, jotka ovat EBV-transformoituja B-varhaisimusolusolu-1 injoja.

DNA:t pilkottiin 5X valmistajan (New England Biolabs) suosittelemalla määrällä BamHIrtä ja EcoRl:tä. Pilkkomistuotteilla suoritettiin elektroforeesiajo 0,8-%:isessa agaroosigeelissä, minkä jälkeen DNA:t siirrettiin nylonkal voi le (Zeta Probe, BioRad) . Suodatin esihybridoitiin ja sitten hybridoitiin ,· noudatten vakiomenettelyitä käyttäen ICAM-cDNA:ta, joka oli ( peräisin HL-60:stä ja leimattu ai fa-(32P)dXTP:ei 11ä . , satunnaisalukemuodostusta käyttäen (Boehringer Mannheim).

• · · *.* Northern-blot-määritykset suoritettiin käyttäen 20 mikrogrammaa • · ·

*·* kokonais-RNA: ta tai 6 mikrogrammaa poly(A)+~RNA:ta. RNA

denaturoitiin ja sillä suoritettiin elektroforeesi-ajo 1 % • « ·.*.· agaroosi-formaldehydigeelissä, minkä jälkeen tuotteet • · · : siirrettiin sähköisesti Zeta Probe -kalvolle. Suodattimia : .·. esihybridoitiin ja sitten hybridoitiin kuten aiemmin kuvattu • · · ”1/ (Staunton, D.E., et ai., EMBO J. 6 (1987) 3695 - 3701) käyttäen HL-60-cDNA-koetinta, joka käsitti 32P-leimattuja oligonukleoti-dikoettimia (kuvattu edellä).

76 107451

Southernin blot-määrityksissä käyttäen 3 ep:n cDNA-koetinta ja genomi-DNA:ta, joka oli pilkottu BamHI:llä ja EcoRI:llä, esiintyi yksittäinen pääasiallinen hybridoituva fragmentti, jonka koko oli 20 ja vastaavasti 8 ep:tä, mikä viittaa yksittäiseen geeniin ja siihen, että suurin osa kooditiedosta sisältyy 8 ep:n palaseen. Kolmen eri solulinjan blot-määrityk-sissä ei ilmennyt mitään restriktiofragmenttipolymorfiaan viittaavaa.

ESIMERKKI 20 ICÄM-i-geenin ilmennys "Ilmennysvektori" on vektori, joka (johtuen sopivien transkriptio- ja/tai translaatiosäätösekvenssien läsnäolosta) kykenee ilmentämään DNA- tai (cDNÄ-) molekyylin, joka on kloonattu vektoriin, ja siten tuottamaan polypeptidin tai proteiinin. Kloonatut sekvenssit ilmentyvät, kun ilmennys-vektori viedään sopivaan isäntäsoluun. Jos käytetään proka-ryoottista ilmennysvektoria, sopiva isäntäsolu olisi mikä tahansa prokaryoottinen solu, joka kykenee ilmentämään kloonattuja sekvenssejä. Vastaavasti jos käytetään euka-ryoottista ilmennysvektoria, sopiva isäntäsolu olisi mikä ! tahansa eukaryoottinen solu, joka kykenee ilmentämään ' kloonattuja sekvenssejä. Tärkeätä on, että koska euka- ryoottinen DNA saattaa sisältää välisekvenssejä ja koska ’·*.* prokaryoottiset solut eivät kykene oikealla tavalla pro- • · · V ’ sessoimaan tällaisia sekvenssejä, edullisesti käytetään cDNA:ta, joka on peräisin solusta, joka kykenee ilmentämään :V: ICAM-l:n, prokaryoottinen genomi-ilmennysvektorikirjaston • · muodostamiseksi. Menettelyitä cDNA:n valmistamiseksi ja . *. genomikirjaston tuottamiseksi julkistavat Maniatis, T., et ai.

• · · (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor • · *·*·* Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982)).

• · « 4 4 ·;·.· Edellä kuvatun ilmennysvektorigenomikirjaston avulla muodos- 107451 tetaan isäntäsolupankki (jolloin jokainen solu sisältää kirjaston yhden jäsenen). Ilmennysvektori voidaan viedä isäntäsoluun millä tahansa lukuisista eri tavoista (eli transformoimalla, transfektoimalla, protoplastifuusiolla, elektroporaatiolla jne.). Ilmennysvektoripitoisten solujen muodostamaa pankkia 1isäännytetään kloonaamalla ja sen jäsenet määritetään yksittäin (immuunimääritystä käyttäen) sen määrittämiseksi, tuottavatko ne proteiinia, joka kykenee sitoutumaan ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen.

Niiden solujen ilmennysvektoreita, jotka tuottavat ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen sitoutumaan kykenevää proteiinia, analysoidaan sitten edelleen sen määrittämiseksi, ilmentävätkö ne (ja siten sisältävät mainitun) ICAM-l-geenin kokonaisuudessaan, ilmentävätkö ne (ja siten sisältävät) vain ICAM-l-geeni-fragmentin, vai ilmentävätkö ne (ja siten sisältävät) geenin, jonka tuote, vaikkakin immunologisesti ICAM-l-sukuinen, ei ole ICAM-1. Vaikka tällainen analyysi voidaan suoritta millä tahansa kätevällä tavalla, edullisesti määritetään ilmennysvek-toriin kloonatun DNA- tai cDNA-fragmentin nukleotidisekvenssi. Näitä nukleotidisekvenssejä tutkitaan sitten sen määrittämiseksi, kykenevätkö ne koodittamaan polypeptidejä, joilla on sama aminohapposekvenssi kuin ICAM-1:n trypsiinipilkkomisfrag-menteilla (taulukko 5).

• · » '·*·' I lmennysvektori, joka sisältää ICAM-l-geeniä koodittavan DNA- • · » *.* ’ tai cDNA-molekyylin, voidaan siten tunnistaa (i) kyvystä ohjata proteiinin ilmennystä, joka kykenee sitoutumaan ICAM-l-vastai- • * seen vasta-aineeseen; ja (ii) nukleotidisekvenssm läsnäolosta, :*Γ; joka kykenee koodittamaan kutakin ICAM-l-trypsiinifragmenttia.

• . Tällaisen iImennysvektoriin kloonattu DNA-molekyyli voidaan • « * ’**.* poistaa ilmennysvektorista ja eristää puhtaana.

• · • · • « · « ♦ « • · « « * 78 1 0 7 4 51 ESIMERKKI 21

Puhdistetun ICAM-l:n funktionaalisia aktiivisuuksia

Soluissa ICAM-1 toimii normaalisti pintaproteiinina, joka liittyy solumembraaniin. Tämän vuoksi puhdistetun ICAM-1:n funktiota tutkittiin sen jälkeen, kun molekyyli oli rekonstruoitu keinotekoisiin lipidimembraaneihin (liposomeihin tai rakkuloihin) liuottamalla proteiini pesuaineeseen liuotettuihin lipideihin, minkä jälkeen pesuaine poistettiin dialysoi-malla. ICAM-1, joka oli puhdistettu JY-soluista ja eluoitu pesuaine-oktyyliglukosidiin kuten edellä kuvattu, rekonsti-tuoitiin rakkuloihin, ja ICAM-l:n sisältävät rakkulat fuusioitiin 1asipääli1evyihin tai muovisiin viljelykuoppiin, jotta proteiiniin sitoutuvat solut kyettäisiin toteamaan.

Tasomembraanien ia muoviin sidottujen rakkuloiden valmistus

Rakkuloita valmistettiin Gayn et ai. (J. Immunol. 136 (1986) 2026) menetelmällä. Lyhyesti, munafosfatidyylikoliinia ja kolesterolia liuotettiin kloroformiin ja sekoitettiin . moolisuhteessa 7:2. Lipidiseos kuivattiin ohueksi kalvoksi pyörittämällä typpikaasuvirrassa ja sitä kylmäkuivattiin sitten • 4 i tunnin ajan viimeistenkin kloroformi jäämien poistamiseksi.

"··' Lipidikalvo liuotettiin sitten liuokseen 1 % oktyyliglukosi- di/0,14 M NaCl/20 mM Tris (pH 7,2) 1 oppupitoisuuteen 0,1 mM f osf atidyyl ikol iini . Noin 10 mikrogrammaa puhdistettua ICAM-:l : l:tä tai humaani-glykoforiinia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) verrokkimembraaniglykoproteiinina lisättiin kohden kutakin millilitraa liuotettuja lipidejä. Proteiini-lipidi-pesuaine-liuosta dialysoitiin sitten 4 °C:ssa käyttäen 3 vaihtoa ja 200 • · · • tilavuutta liuosta 20 mM Tris/0,14 M NaCl, pH 7,2, ja yhtä • » : vaihtoa HBSS:ää.

• · « * · • · »»»

Tasomembraaneia valmistettiin Brianin et ai . , t · » '

Proc . Nat 1 . Acad . Sei . USA 81 (1984) 6159, menetelmällä.

107451 79

Lasipääli1evyjä (halkaisija 11 mm) keitettiin 15 minuutin ajan 1:6 laimennoksessa 7X pesuaineliuosta (Linbro), minkä jälkeen niitä pestiin yön yli tislatussa vedessä ja liotettiin sitten 70-%:isessa etanoliliuoksessa sekä kuivattiin ilmassa. 80 mikrolitran pisara rakkulaliuosta, joka sisälsi joko ICAM-l:tä tai glykoforiinia, sijoitettiin kuoppien pohjalle 24 kuopan rykelmälevylle, ja valmistetut lasilevyt asetettiin varovaisesti niiden päälle. Noin 20 - 30 minuutin inkuboinnin huoneenlämpötilassa jälkeen kuopat täytettiin HBSSrllä ja päälilevyt käännettiin, jolloin tasomembraani tuli ylöspäin. Kuoppia pestiin sitten runsaalla määrällä HBSS:ää ei-sitoutu-neiden rakkuloiden poistamiseksi. Tasomembraanipintaa varottiin altistamasta ilmalle.

Lasipintoihin fuusioiduilla tasomembraanei1 la suoritettujen kokeiden puitteissa ICAM-l:tä sisältävien rakkuloiden todettiin sitoutuvan suoraan monikuoppa-kudosviljelylevyjen muovipintaan ja säilyttävän funktionaalisen aktiivisuutensa, minkä osoitti spesifinen solusitoutuminen. Tällaisia rakkuloita kutsutaan tästä eteenpäin "muoviin sidotuiksi rakkuloiksi" (PBV), koska .·, muoviin sidottujen lipidirakkuloiden luonnetta ei ole selvi- • « · |... tetty. Muoviin sidotut rakkulat valmistettiin lisäämällä 30 mikrolitraa rakkulasuspensiota suoraan kuoppien pohjalle 96

« I

kuopan kudosviljelmälevyillä (Falcon), minkä jälkeen levyjä

• « · < I

| ' inkuboitiin ja kuopat pestiin kuten kuvattu tasomembraanei11 e.

• · · • · · • · • · · V * Solukiinnitvsmääritvkset

Solukiinnitysmääritykset tasomembraaneja tai muoviin sidottuja • · :*·*: rakkuloita käyttäen suoritettiin oleellisessa mielessä samalla . tavalla lukuunottamatta, että soluluvut ja tilavuudet PBV- • · « määrityksissä olivat 1/5 tasomembraanimäärityksissä käyte- ’···* tyistä.

• · · • · · ·;··· T-imusoluja normaaleista verrokeista ja potilaasta, joka poti 80 107451 valkosolukiinitysvajausta (LAD) eikä siis kyennyt ilmentämään LFA-l:tä (Anderson, D.C., et ai . . J. Infect.Dis. 152 (1985) 668), valmistettiin viljelemällä ääreisveren yksitumasoluja 1 mikrogrammalla/ml konkanavalliini-A:ta (Con-A) RPMI 1640-kasvualustassa, jota oli täydennetty 20 %:lla FCS:tä, pitoisuutena 5 x 105/ml 3 päivän ajan. Sitten solut pestiin kahdesti RPMI:llä ja kerran 5 mM metyyli-alfa-D-mannopyrano-sidiliuolsella 1ektiinijäämän poistamiseksi solupinnalta. Solut kasvatettiin RPMI/20 % FCS:ssä, joka sisälsi 1 ng:n/ml yhdis-telmä-IL-2:ta, ja niitä käytettiin 10. - 22. päivänä kasvatuksen aloittamisesta.

Solusitoutumisen tasomembraaneihin tai PBV:hen toteamiseksi Con-A-emosoluja, T-1ymfoma-SKW3-soiuja ja EBV-transformoituja B-varhaisimusolusolulinja-JY-soluja (LFA-l-positiivinen) ja LFA-l-vajaan varhaisimusolulinjän (BBN) soluja (jotka oli saatu potilaasta 1, Springer, T.A., et ai., J.Exper.Med. 160 (1986) 1901 - 1918) leimattiin radioaktiivisesti inkuboimalla 1 x 107 solua 1 ml kohden RPMI-1640/10 % FCS:ää 100 mikrocurie-yksiköllä Na5lCrO<:ää tunnin ajan 37 °C:ssa, minkä jälkeen ne . pestiin 4 kertaan RPMI 1640 -kasvualustalla ei-sisäistyneen <it leiman poistamiseksi. Monoklonaalivasta-ainekokeissa soluja tai ’ muoviin sidottuja rakkuloita esikäsitel tiin 20 mikrogrammal- la/ml puhdistettua vasta-ainetta RPMI-1640/10 % FCS:ssä 4 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen niitä pestiin 4 kertaan • · ϊ,ί,ϊ ei-sitoutuneen vasta-aineen poistamiseksi. Kokeissa, joissa tutkittiiin kaksivalenssisten kationien vaikutuksia solusitou-tumiseen, solut pestiin vain kerran HBSS:llä, joka ei sisäl-tänyt Ca2 + -, Mg2 + -ioneja mutta sisälsi 10 % dialysoitua FCS:ää, ja CaCl:ää ja MgClrää lisättiin merkittyihin pitoisuuksiin.

t t ·

Kaikissa kokeissa soluja ja tasomembraaneja tai PBV:tä esitä- « · : sapainoitettiin sopivassa lämpötilassa (4 °C, 22 °C, tai 37 °C) • · t sopivassa määrityspuskurissa).

• · ·

• · I

Solusitoutumisen puhdistettuun ICAM-l:een mittaamiseksi 5lCr- 81 107451 leimattuja soluja (2 x 105 EBV-transformanttia tasomembraani-määrityksissä; 1 x 105 EBV-transformanttia tai SKW3-solua, 2 x 155 Con-A-emosolua PBV-määrityksissä) sentrifugoitiin 2 minuutin ajan 25 x g:ssä tasomembraaneihin tai PBVrhen, minkä jälkeen inkuboitiin 4 °C:ssa, 22 °C:ssa tai 37 °C:ssa tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen ei-sitoutuneet solut poistettiin suorittamalla 8 kierrosta, joilla täytettiin ja imettiin pois puskuri, joka oli tasapainoitettu sopivaan lämpötilaan. Sitoutuneet solut kvantitoitiin liuottamalla kuoppasisällöt liuoksella 0,1 N NaOH/1 % Triton X-100, ja laskemalla gamma-laskijassa. Prosentuaalinen solusitoutuminen määritettiin jakamalla tuikkeet/min sitoutuneista soluista käytetyllä soluiiitteisel1ä tuiketta/min -arvolla. Tasomembraanikokeissa käytettyjä tuikkeita/min -arvoa korjattiin siten, että otettiin huomiooon päälilevyjen pinta-alan suhde vi1jelykuoppien pinta-alaan.

Näissä määrityksissä EBV-transformoidut B-varhaisimusolut, SKW3-T-lymfomasolut ja Con-A-T-imusoluemosolut sitoutuivat spesifisesti ICAM-l:een keinotekoisilla membraanei11 a (kuviot 11 ja 12). Sitoutuminen oli spesifinen, koska solut sitoutuivat hyvin huonosti verrokkitasomembraaneihin tai rakkuloihin, jotka sisälsivät ekvivalenttisia määriä toista humaanisolupintaglyko-proteiinia, glykoforiinia. Lisäksi LFA-l-positiiviset EBV-transf ormantit ja Con-A-emosolut sitoutuivat, kun taas niiden ' LFA-l-negatiiviset vastineet eivät sitoutuneet mainittavassa määrin, mikä osoittaa, että sitoutuminen oli riippuvaista LFA- ··· ! ·’ 1 l:n läsnäolosta soluilla.

♦ :V: Sekä solusitoutumisen spesifisyys että riippuvuus solu-LFA- • · l:stä vahvistettiin monoklonaalisilla vasta-aineilla suori- • · · tetuissa salpauskokeissa (kuvio 13). JY-solujen sitoutuminen • · · : pystyttiin estämään 97-%:isesti kun ICAM-l-pitoiset PBV: t • » · '...* esikäsitel tiin ICAM-l-vastaisel la monokl onaal isel la vasta- aineella RR1/1. Esikäsittelemäl 1 ä soluja samalla vasta-aineella ....: oli vähäinen vaikutus. Sitä vastoin LFA-l-vastainen monoklonaa- • ♦ 82 107451 linen vasta-ainen TS1/18 esti sitoutumisen 96-%:isesti, mutta vain silloin kun solut, ei PBV, esikäsiteltiin. Verrokkivasta-aineella T2/9, joka reagoi LFA-3:n kanssa (toinen imusolupinta-antigeeni), ei ollut merkittävää inhiboivaa vaikutusta, kun joko solut tai PBV oli esikäsitelty. Tämä koe osoittaa, että keinomembraaneissa itse ICAM-1, eikä jokin vähäinen epäpuhtaus, välittää havaittua solukiinnittymistä ja että kiinnittyminen on riippuvainen LFA-l:n läsnäolosta sitovalla solulla.

Solujen sitoutuminen ICAM-1:een keinomembraaneilla osoitti niinikään kahta muuta LFA-l-riippuvaisen kiinnitys järjestelmän ominaisuutta: lämpötilariippuvuus ja kaksivalenssisten kationien tarve. Kuten esitetty kuviossa 14, Con-A-emosolut sitoutuivat ICAM-l:een PBVreissä erittäin tehokkaasti 37°C:ssa, osittain 22 °C:ssa ja hyvin heikosti 4 °C:ssa. Kuten esitetty kuviossa 15, sitoutuminen oli täysin riippuvainen kaksivalens-sisten kationien läsnäolosta. Fysiologisissa pitoisuuksissa Mg2 + yksinään oli riittävä maksimaaliselle solusitoutumiselle, kun taas Ca2+ yksinään aikaansai hyvin alhaisia sitoutumista-soja. Kuitenkin maksimaalinen sitoutuminen saatiin Mg2+:lla . l/10:na normaalista pitoisuudesta kun siihen oli yhdistetty 4 · « β e *<(i Ca2+:aa, jonka vaikutus oli synergistinen.

• * « 1 I « « • 9 9

Yhteenvetona solusitoutumisen puhdistettuun ICAM-1: een, joka on 4 *·" sisällytetty keinomembraaneihin, spesifisyys, monoklonaalisi11 a • f ί.ί.ϊ vasta-aineilla saatu spesifinen inhibitio ja 1 ämpöti 1 ariippu- :T: vuus sekä riippuvuus kaksivalenssisista kationeista osoittavat, että ICAM-1 on LFA-l-riippuvaisen kiinnitys järjestelmän spesi- .*.% finen ligandi.

• · • · · • · · • · · ESIMERKKI 22 Ι.ί ί ICAM-l:n ja HLA-DR:n ilmennys yliherkkyys- ja • · · myrkky 1 aas tarikoereakt ioissa • » • · · • · e • *

Viiden normaalin yksilön iho-otoksia tutkittiin niiden ICAM-1- 83 1 0 7 4 51 ja HLA-DR-ilmennyksen osalta. Todettiin, että kun endoteeli-solut joissain verisuonissa tavallisesti ilmensivät ICÄM-l:n, ICÄM-1 ei ilmentynyt normaalista ihosta otetuilla keratinosyy-teillä. HLA-DR-värjääntymistä ei todettu yhdelläkään keratoni-syytillä, joka peräisin oli normaali-ihonäytteestä. Sitten tutkittiin ICAM-1- ja luokka-II-antigeenien ilmennyksen kinetiikkaa soluilla, jotka oli saatu yliherkkyys- tai myrkkyvaikutusihovaurionäytteistä. Todettiin, että puolella kuudesta tutkitusta yksilöstä oli keratinosyyttejä, jotka ilmensivät ICÄM-l:n, neljän tunnin kuluttua hapteenin levittämisestä (taulukko 10). ICAM-l:n keratinosyytei11 ään ilmentävien yksilöiden prosentuaalinen osuus kasvoi altistusajan hapteenille funktiona, jolloin myös keratinosyyttiä kohden värjääntymisintensiteetti - joka osoitti ICAM-1-ilmennyksen lisääntymistä - kasvoi ajankohtaan 48 tuntia asti. Itse asiassa tänä ajankohtana tietty osuus keratinosyyteistä kaikissa kudosnäytteissä värjääntyi positiivisesti ICAM-1:11ä. Ajankohtana 72 tuntia (24 tuntia sen jälkeen kun hapteeni oli poistettu) 7 kahdeksasta yksilöstä ilmensi edelleen ICAM-l:n keratinosyytei1lään, jolloin kuitenkin ICAM-1:n ilmennys yhdellä yksilöllä poistui ajankohtien 48 ja 72 tuntia välillä.

4 < ( < i ( « l I l I I ( « · · • · · • · · • · · • · · • · • · · • · « • · • · · • · · • · • · ·

• I I

• · e a a a a a a a a a • aa 84 107451 TAULUKKO 10 ICAM-1- ja HLÄ-DR-induktion kinetiikka keratinosyyteillä yliherkkyys1 aastarikoenäytteistä

Aika laasta- Kudos- . r rin asetuk- näytteitä ICAM-1 HLA-DR ICAM-1& sen jälkeen (kpl) vain vain (h)

Normaali iho 5000

Yliherkkyys- laastarikoe 4 5 3a 0 0 8 9 3 0 0 24 8 7 0 0 48b 8 5 0 3 72 8 6 0 1 aNäytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä , keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt.

a a • " bKaikki laastarit poistettiin tänä ajankohtana.

• a « a a < a • « a

Kudosopi 11 isesti ICAM-l-värjääntymiskuvio keratinosyytei 11 ä kudosnäytteistä, jotka otettiin neljän tunnin kuluttua : hapteenin levittämisestä, oli tavallisesti pieninä rykelminä.

Ajankohtana 48 tuntia ICAM-1 ilmentyi valtaosan keratinosyy-teistä pinnalla, jolloin minkäänlaista eroa ei havaittu vaurion keski- ja äärialueiden välillä. Värjääntymisen intensiteetti • · « aleni keratinosyyttien lähestyessä ihon sarveiskerrosta. Tämä » · « *. todettiin sekä vaurioiden keski- että äärialueilta otetuissa • · ·.· : kudosnäytteissä. Samoin tänä ajankohtana laastarikoe oli posi- ! : tiivinen (vuotamista, punoitusta ja rakkuloita). ICAM-l-ilmen- nyksessä ei havaittu mitään eroa käytettäessä herkillä yksi- • 4 · loilla eri hapteeneja. Keratinosyyttien ohella ICAM-1 ilmentyi • 4 107451 85 myös joillakin yksitumasolui1 la ja endoteelisoluilla vaurio-kohdassa .

HLA-DR-ilmennys keratinosyytei1lä yliherkkyysihovaurioissa oli vähemmän yleistä kuin ICÄM-l:n. Yhdelläkään tutkituista yksilöistä ei ollut vaurioita, joissa keratinosyytit värjääntyivät positiivisesti HLA-DR:lle, aina ajankohtaan 24 tuntia asti hapteenin käyttämisestä. Itse asiassa vain neljässä kudosnäytteessä oli keratinosyyttejä, jotka ilmensivät HLA-DR:n, eikä yhdessäkään kudosnäytteessä ollut keratinosyyttejä, jotka olisivat positiivisia HLA-DR:11 e mutta eivät ICAM-l:lle (taulukko 10).

Vastoin kuin y1iherkkyyslaastarikoevauriossa, myrkkylaastari-koevauriossa, joka oli indusoitu krotoniöljyllä tai natrium-lauryylisulfaatilla, esiintyi keratinosyyttejä, jotka osoittivat vain vähän, jos ollenkaan ICAM-l:tä pinnoillaan kaikkina testattuina ajankohtina (taulukko 11). Itse asiassa 48 tunnin kuluttua laastarin asettamisesta, joka ajankohta oli optimaalinen ICAM-l-ilmennyksel1 e yliherkkyyslaastarikoeyksilöillä, , vain yhdellä 14 myrkkylaastarikoehenkilöstä oli ICAM-l:n '· " ilmentäviä keratinosyytte jä vaurioissaan. Samoin vastoin kuin yliherkkyyslaastarikoenäytteissä, myrkkylaastarikoevaurioissa keratinosyyteillä ei ilmentynyt lainkaan HLA-DR:ää.

Nämä tulokset osoittavat, että ICAM-1 ilmentyy immuunipohjäi-sessa tulehduksessa mutta ei myrkkypohjäisessä tulehduksessa, t ja täten ICAM-l-ilmennystä voidaan käyttää immuunipohjäisen ja myrkkypoh jäisen tulehduksen erottamiseksi toisistaan, kuten • · · akuutin munuaisten toiminnan heikkenemisen munuaissiirtopoti- • · · laissa tunnistamiseksi, koska on vaikeata määrätä, johtuuko • · : toiminnan heikkeneminen hyljinnästä tai immuunivastetta hei- • · · ;...ί kentävän terapeuttisen aineen myrkkyvaikutuksista munuaiseen.

Ottamalla kudosnäyte ja määrittämällä ICAM-l-ilmennyksen ylös-säätö voidaan erottaa toisistaan immuunipoh jäinen hyljintä ja 86 107451 ei-immuunipöhjäinen myrkkyreaktio.

TAULUKKO 11 ICAM-1- ja HLA-DR-induktion kinetiikka keratinosyytei11ä myrkky1 aastarikoenäytteistä

Aika laas- Kudos- tarin ase- näytteitä tuksen jäi- (kpl) · ICAH-1 HLA-DR ICAM-1 &

keen (h) vain vain HIA-DR

4 4 0 0 0 8 3 la 0 0 24 3 1 0 0 48° 14 1 0 0 72 3 1 0 0 aNäytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt. bKaikki laastarit poistettiin tänä ajankohtana.

ESIMERKKI 23 ICAM-1- ja HLA-DR-ilmennys hyvänlaatuisissa ihosairauksissa i.:.: Soluista, jotka oli otettu eri tyyppisiä ihon tulehdussairauk- :T: siä potevien potilaiden ihovaurionäytteistä, tutkittiin niiden ICAM-1- ja HLA-DR-ilmennys. Osa keratinosyyteistä näytteissä, jotka olivat peräisin yliherkkyyskosketusihottumasta, rakkula- • « ihottuman kaltaisesta ihottumasta/rakkulaihottumasta ja ihon * « « punajäkälätaudista, ilmensivät ICAM-1:n. Ihon punajäkälätau- • · : tinäytteet osoittivat voimakkainta vär jääntymistä, jolloin • ♦ · kuvio oli samankaltainen tai jopa voimakkaampi kuin se, joka havaittiin 48 tunnin yliherkkyyslaastarikoenäytteil lä (taulukko 12). Yhtäpitävästi tuloksien kanssa, jotka saatiin yliherkkyys- 87 107 451 1aastarikokeessa, intensiivisin ICAM-l-värjääntyminen todettiin kohdissa, joissa oli tapahtunut voimakasta yksitumasoluvuota-mista. Lisäksi 8 tutkituista 11 punajäkälätautinäytteestä oli positiivista HLA-DR-ilmennykselle keratinosyyteillä.

ICAM-1-ilmennys keratinosyyteillä, jotka oli saatu tulehdus-ihottumaa tai nokkosrokkoa potevien potilaiden kudosnäytteistä, oli vähemmän ilmeinen. Vain neljällä tutkituista 7 potilaasta, joilla oli jompikumpi näistä sairauksista, oli keratinosyyt-tejä, jotka ilmensivät ICAM-l:n vauriokohdassa. HLA-DR-iImen-nystä tavattiin vain yhdellä potilaalla ja se esiintyi ICAM-l:n yhteydessä.

Endoteelisolut ja osa yksitumasoluvuodosta kaikista tutkituista hyvänlaatuisista ihon tulehdussairauksista ilmensivät ICAM-l:n vaihtelevissä määrin.

t l l l

> t I

I I .

• · · • · • · · • · · I · · • · • ♦ · • · « ·· • · · • · » • · • · · • ♦ · • · · · • · ·

* V

• · • « « • · · • · · « « es 107451 TAULUKKO 12 ICAM-l:n ja HLA-DR:n ilmennys keratinosyyteillä,jotka ovat peräisin hyvänlaatuisista ihosairauksista

Diagnoosi Tapauksia ICAM-1 HLA-DR ICAM-1&

(kpl) vain' vain HLA-DR

Yliherkkyys- kontakti-ihot- - 0 2 tuma ö 0 “Punajäkälä- ^1 3 0 8 tauti

Rakkulaihottuman kalainen/rakku- 2-2 0 0 laihottuma

Tulehdusihottuma 3 2 0 ^

Nokkosrokko 4 1 0 1 aNäytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli vär jääntynyt.

ESIMERKKI 24 ICAM-1:n ilmennys keratinosyytei11ä, jotka • · 4 *·*.* ovat peräisin hi 1 setystauti-ihovaurioista • · · • · « • · s e ICAM-l-ilmennystä ihonäytteissä, jotka olivat viidestä hilse- :V: tystautia potevasta potilaasta, tutkittiin ennen PUVA-hoidon • · j*·*· käynnistämistä ja ajoittain hoitojakson aikana. Näytteitä . *. otettiin 5 potilaasta, jotka sairastivat kudosopillisesti ··· : vahvistettuna tavanomaista hilsetystautia. Näytteet otettiin ·«* sarjana ennen PUVA-hoidon aloittamista ja sen aikana ilmoitet-tuna ajankohtana. PUVA:aa annettiin 3-4 kertaa viikossa. Näytteet otettiin viideltä potilaalta hi 1 setystautipesäkkeiden e o 89 107451 äärialueilta, minkä ohella näytteitä otettiin kliinisesti normaalista ihosta neljältä näistä potilaista.

Vastaotetut ihokudosnäytteet jäädytettiin ja varastoitiin nestetyppeen. Kuuden mikronin kryostaattiviipaleita kuivattiin ilmassa yön yli huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen niitä kiinnitettiin asetonissa 10 minuutin ajan ja sitten joko värjättiin välittömästi tai käärittiin alumiinikalvoon ja varastoitiin -80 °C:seen värjäämiseen asti.

Värjääminen suoritettiin seuraavasti. Viipaleita inkuboitiin monoklonaalisilla vasta-ainella ja värjättiin kolmivaiheisella immunoperoksidaasimenetelmällä (Stein, H., et ai., Adv.Cancer Res. 42 (1984) 67 - 147) käyttäen diaminobentsidiini-vety-peroksidi-substraattia. Positiivisina verrokkeina ICAM-1 ja HLA-DR-värjääntymisel1 e käytettiin risoja ja imusolmukkeita Negatiivisina verrokkeina toimivat primaarivasta-aineen puuttuessa värjätyt kudosnäytteet.

HLA-DR:n vastaiset monokonaaliset vasta-aineet hankittiin Becton Dickinson -valmistajalta (Mountainview, Kalifornia). Monoklonaalinen ICAM-l-vastainen vasta-aine oli R6-5-D6.

, Peroksidaasikonjugoitu kaniinin anti-hiiri-Ig ja peroksidaa- ' sikonjugoitu sian anti-kaniini-Ig hankittiin Dakapatts-valmis- , .. tajalta, Kööpenhamina, Tanska. Diaminobentsidiini-tetrahydro- *;[;1 kloridi hankittiin Sigma-valmistajalta (St. Louis, MO).

• · · • ♦ ·

Tutkimuksen tulokset osoittavat, että endoteelisolut joissain • · verisuonissa ilmentävät ICAM-l:n sekä sairaassa että normaa- • · · lissa ihossa, mutta värjäyksen intensiteetti ja ICAM-l:n 1· ilmentävien verisuonien lukumäärä oli kasvanut hi 1setystauti- • · · ihovaurioissa. Lisäksi ICAM-l:n ilmennyskuvio keratinosyytei 1 -·;1 lä, jotka olivat hoitamattomista hiIsetystauti-ihovaurioista viidestä potilaasta, vaihteli vain hyvin pienien solurykelmien vär jääntymisestä moniin vär jääntyneisiin keratinosyytteihin .

107451 90 PUVA-hoidon aikana ICAM-l-iImennys kahdella potilaista (potilaat 2 ja 3) osoitti merkittävää vähenemistä, joka edelsi tai tapahtui samanaikaisesti kuin kliininen toipuminen (taulukko 13). Potilailla 1, 4 ja 5 oli laskuja ja nousuja ICÄM-l-ilmen-nyksessä PUVA-hoidon aikana, jotka korreloivat kliinisiin toipumisiin ja vastaavasti uudelleensairastumisiin. ICAM-1-ilmennystä ei esiintynyt normaalista ihosta saaduilla keratino-syyteillä ennen PUVA-hoitoa tai sen jälkeen. Tämä osoittaa, että PUVA ei indusoi ICAM-l:tä normaalin ihon keratinosyy-teillä.

Huomion arvoinen oli havinto, että yksitumasoluvuodon tiheys korreloi ICAM-l-ilmennyksen määrään keratinosyytei11ä. Tämä koski sekä yksitumasolujen määrän laskua vaurioissa PUVA-hoidon aikana, jolloin myös ICAM-l-iImennys heikkeni, sekä yksitumasolujen lukumäärän kasvuun PUVA-hoidon aikana, jolloin ICAM-l-iImennys keratinosyytei11ä oli selvempi. Endoteelisolut ja ihon yksitumasolut olivat niinikään ICAM-l-positiivisia. Kliinisesti normaalissa ihossa ICAM-l-iImennys rajoittui endoteelisoluihin, jolloin keratinosyytit eivät 1eimaantuneet.

« « i « « HLA-DR:n ilmennys keratinosyy tei 11 ä vaihteli. Ei löytynyt

» I I

yhtään HLA-DR-positiivista kudosnäytettä, joka ei ollut myös • i ICAM-l-positiivinen.

• < « · I

I I t I I

*·*.* Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että ennen hoitoa ICAM- • · · V : 1-ilmennys on ilmeistä keratinosyytei11ä ja korreloi tiheään yksitumasoluvuotoon. PUVA-hoidon aikana todetaan selvä ICAM-1- • » ϊ värjääntymisen lasku samanaikaisesti, kun tapahtuu kliinistä paranemista. Kudosopi 11 isesti ihovuoto niinikään väheni. Kun .kliininen uudel1eensairastuminen hoidon aikana oli ilmeinen, • · « * · « ICAM-l-iImennys keratinosyytei11ä kasvoi , kuten kasvoi myös ihovuodon tiheys. Kun hoidon aikana havaitiin kliinistä ::: toipumista, tapahtui samanaikaisesti keratinosyyttien ICAM-1- ·;·· värjääntymisessä alenemista kuten myös ihovuodossa laskua.

9i 107451 Täten ICAM-1-ilmennys keratinosyyteillä korreloi ihon yksitu-masoluvuodon tiheyteen. Nämä tulokset osoittavat, että kliinisenä vasteena PUVA-hoitoon tapahtui selvä lasku ICAM-1-ilmennnyksessä keratinosyyteillä samanaikaisesti, kun tapahtui kohtuullisempi vähennys yksitumasolujen määrässä. Tämä osoittaa, että ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä on vastuussa ihovuodon käynnistämisestä ja ylläpidosta ja että PUVA-hoito säätää alaspäin ICAM-1:tä, mikä puolestaan heikentää ihovuotoa ja tulehdusvastetta. Tulokset osoittavat myös, että HLA-DR-ilmennys keratinosyyteillä vaihteli PUVA-hoidon aikana.

ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä hilsetystautiin liittyvissä vaurioissa korreloi vaurion kliiniseen vakavuuteen sekä ihon-vuodon määrään. Täten ICAM-1 esittää keskeistä osaa hilsetys-taudissa, jolloin sen ilmennyksen ja/tai vuorovaikutuksen CD18-kompleksin yksitumasolujen kanssa inhiboinnista tullaan saamaan tämän sairauden tehokas hoito. Lisäksi ICAM-l-ilmennyksen tarkkailusta keratinosyyteillä tullaan saamaan tehokas apuväline hilsetystaudin diagnoosiin ja prognoosiin, sekä terapian etenemisen arviointiin.

<

• · I

« « « • t

• I

• « « « I

• · 1 • · · • · • · · • · · • · · • · » · · • · · • · ··· • · · • · · • · • · · ♦ « · ··· · ··· • · ♦ · • « « « · • · · 92 107451 TAULUKKO 13 ICAM-1-ilmennys keratinosyytei11ä hi 1setystautivaurioissa (PS) ja kliinisesti normaalissa ihossa (N) ajan funktiona ennen PUVA-hoidon aloittamista ja sen aikana

Ajankohta Potilas n:o ennen PUVA- . . 5 hoitoa tai 1 L 0

sen aikana ps PS N PS N PS N PS N

0 ++-++-++- +++ - 1 päivä + 1 viikko + + - - -++- + 1 2 3 o 2 viikkoa ++ +-+-+- 3 viikkoa ++ * 0 4 viikkoa ++ + - ++ * 1 5-6 viikkoa - - o 7 viikkoa (++) {+) +++ - ★ 1 ]0 viikkoa (+) · » • · • · · 2 V ·' +++ Paljon positiivisia keratinosyyttejä ++ Kohtuullisesti positiivisia keratinosyyttejä + Paikallisesti positiivisia keratinosyyttejä • · ( + ) Hajaantuneesti vain hyvin vähän positiivisia keratinosyyttejä • » t 3 « ~ Ei positiivista värjääntymistä • ·· ·1 ’...· 1 Kliininen toipuminen :V.‘ ° Kliininen uudel 1 eensairastuminen • « 93 1 0 7 4 51 ESIMERKKI 25 ICAM-1:n ja HLA-DR:n ilmennys pahanlaatuisissa ihosairauksissa

Vauriokohtiin hyvänlaatuisissa ihosairauksissa verrattuna ICAM-1-ilmennys keratinosyyteillä pahanlaatuisissa ihovauriokohdissa oli huomattavasti vaihtelevampi (taulukko 14). Tutkituista 23:sta ihon T-solulymfomasta ICAM-l-positiivisia keratinosyyt-tejä todettiin vain 14 tapauksessa. Keratinosyyteillä, jotka olivat peräisin mycosis fungoides -vaurionäytteistä, oli taipumus menettää ICAM-l-ilmennyksensä taudin jatkovaiheissa. Kuitenkin ICÄM-l-ilmennystä todettiin vaihtelevassa osuudessa yksitumasoluvuotoa useimmista ihon T-solulymfomavaurioista. Tutkituista jäljellä olevista lymfomista neljällä kahdeksasta oli ICAM-l:n ilmentäviä keratinosyyttejä. Tutkituista 29 potilaasta, joilla oli pahanlaatuisia ihosairauksia, viidellä oli keratinosyyttejä, jotka ilmensivät HLA-DR:n ilmentämättä ICAM-l:tä (taulukko 14).

• · ·

• « I

• · ·

• « I

« I < • «

• I

* « · « • · v · · • 1 · • · • ♦ · • 1 · • · · • · • · · • · · • ·

• M

• · ·

» I I

• 1 * · · t · I • · · · * · · • · • · * · » • · * · · • · · * · · » 1 · • · 94 1 0 7 4 51 TAULUKKO 14 ICAM-1:n ja HLA-DR:n ilmennys keratinosyytei11ä, jotka olivat peräisin pahanlaatuisista ihosairauksista

Tapauksia ICAM-1 HLA-DR ICAM-1&

Diagnoosi (kpl) vain vain HLA-DR

CTCL, MFI 8 la 0 4 CTCL, MFII-III 10 1 2 5 CTCL, SS 3102 CTCL, suuri solu 2 0 2 0 CBCL 2 0 0 1

Ihon leukemia 3 li 1

Histiosytoosi-X 1 0 0 0 aNäytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt.

i i c

I t t • I

‘' ESIMERKKI 2 6 ICAM-l-vastaisten vasta-aineiden vaikutus ihmisen ääreisveren i

« « * I I

yksitumasolujen lisääntymiseen • · ( • · ♦ • · ··* ·.· · Ihmisen ääreisveren yksitumasolut indusoituvat lisääntymään antigeeni- tai mitogeeni1äsnäolon ja -tunnistuksen seurauksena. Tietyt molekyylit, kuten mitogeeni konkanaval 1 iini-A, tai T- • · soluihin sitoutuva vasta-aine OKT3, aiheuttavat ääreisveren .\ yksitumasolujen ei-spesifistä lisääntymistä.

♦ · · • · · ··· · ··· • ·

Ihmisen ääreisveren yksitumasolut ovat heterogeenisiä siinä :V: mielessä, että ne koostuvat soiu-alapopulaatioista, jotka kykenevät tunnistamaan spesifisiä antigeenejä. Kun ääreisveren 95 1 0 7 4 51 yksitumasolu, joka kykenee tunnistamaan tietyn spesifisen antigeenin, tapaa tuon antigeenin, vastaavan yksitumasolu-alapopulaation lisääntyminen indusoituu. Jäykkäkouristus-toksiini ja avaimenreikä-maljakotilohemosyaaniini ovat esimerkkejä antigeeneistä, jotka ääreisveren yksitumasolu-alapopulaatiot tunnistavat, mutta joita kaikki ääreisveren yksitumasolut eivät tunnista kerkistyneissä yksilöissä.

Tutkittiin ICAM-l-vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen R6-5-D6 kykyä estää ihmisen ääreisveren yksitumasolujen lisäänty-misvasteet järjestelmissä, joiden tiedetään edellyttävän solu-soi ukiinnityksiä.

Ääreisveren yksitumasoluja puhdistettiin Ficol1-Pague-(Pharmacia) gradientteja käyttäen valmistajan ohjeiden mukaan. Rajafaasi otettiin talteen ja solut pestiin kolmeen kertaan RPMI 1640 -kasvualustalla, minkä jälkeen niitä viljeltiin tasapohjaisilla 96 kuopan mikrotiitterilevyillä pitoisuutena 106 solua/ml RPMI 1640 -kasvualustassa, jota oli täydennetty 10 %:lla nautasikiöseerumia, pitoisuudella 2 mM glutamiini ja gentamysiinilla (50 mikrogrammaa/ml) .

< I I

Antigeeni, joko T-solumitogeeni, konkanavalliini-A (0,25 mikrogrammaa/ml); T-soluja sitova vasta-aine, OKT3 (0,001 ( t mikrogrammaa/ml); avaimenreikä-mal jakoti 1 o-hemosyaniini (10 * · · *.* g/ml) tai jäykkäkouristustoksiini (1:100 laimennos lähteestä) • · « ’·’ lisättiin soluihin, joita viljeltiin kuten edellä kuvattu joko ICAM-vastaisen vasta-aineen (R6-5-D6; 1oppupitoisuus 5 g/ml) • · ·.·.· läsnäollessa tai vastaavasti puuttuessa. Soluja viljeltiin 3,5 » · · : päivän ajan (konkanaval 1 iini-A-koe), 2,5 päivän ajan (0KT3-koe) : .·. tai 5,5 päivän ajan (avaimenreikä-mal jakotilo-hemosyaniini- • · · .·*·[ sekä jäykkäkouristustoksiinikokeet), minkä jälkeen kokeet • · Ί* päätettiin.

• · · • · · • · 18 tuntia ennen kokeen päättämistä viljelmiin lisättiin 2,5 96 107451 mikrocurie-yksikköä 3H-tymidiiniä. Solu jakaantuminen määritettiin mittaamalla tymidiinin siirtyminen ääreisveren yksitumasolujen DNA:han. Siirtynyt tymidiini kerättiin ja laskettiin nestetuikelaskijassa (Merluzzi et ai.. JImmunol.

139 (1987) 166 - 168). Näiden kokeiden tulokset on esitetty kuviossa 16 (konkanavalliini-A-koe), kuviossa 17 (OKT3-koe), kuviossa 18 (avaimenreikä-maljakoti1o-hemosyaniinikoe) ja kuviossa 19 (jäykkäkouristustoksiinikoe).

Todettiin, että ICAM-l-vastainen vasta-aine inhiboi lisään-tymisvasteita ei-spesifisel1 e T-solumitogeeni11 e, Con-A; ei-spesifiselle T-soluliitteiselle antigeenille, OKT-3; ja spesifisille antigeeneille, avaimenreikä-maljakoti1o-hemosyaniini ja jäykkäkouristustoksiini; yksitumasoluissa. Inhibitio ICAM-1-vastaisel1 a vasta-aineella oli verrattavissa inhibitioon LFA-l-vastaisel1 a vasta-aineella, mikä viittaa siihen, että ICAM-1 on LFÄ-l:n funktionaalinen ligandi ja että ICAM-l-antagonismi inhiboi spesifisen puolustusjärjestelmän vastei ta.

ESIMERKKI 27 ICÄM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus ,···, sekaimusolureaktioon * i * . , Kuten edellä esitetty, ICAM-1 on välttämätön tehokkaille • · · ·];* soluvuorovaikutuksil 1 e immuunivasteissa, joita välittää LFA-1- II* ·* riippuvainen solukiinnitys. ICAM-l:n induktio immuunivasteiden yhteydessä tai tulehdussairaudessa mahdollistaa valkosolujen vuorovaikutuksen toistensa sekä endoteelisolujen kanssa.

• · · • · · * · i : Kun kahdesta ei-sukulaisyksilöstä peräisin olevia imusoluja • · · ’**.* viljellään toistensa läsnäollessa, havaitaan imusolujen • · *’* emosolumuodostusta ja solu jakaantumista. Tämä vaste - yhden ·.·.* imusolupopulaation vaste toisen imusolupopulaation läsnäoloon - tunnetaan sekaimusolureaktiona (MLR), ja se on analoginen 97 1 0 7 4 51 imusolujen vasteeseen mitogeenia lisättäessä (Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, Klein, J., John Wiley & Sons, NY, 1982, ss. 453 - 458).

Suoritettiin kokeita ICAM-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksen humaani-MLR:ään määrittämiseksi. Nämä kokeet suoritettiin seuraavasti, fiäreisverta otettiin normaaleista terveistä luovuttajista laskimosta punktoimalla. Veri kerättiin hepariinilla käsiteltyihin koeputkiin, joissa sitä laimennettiin 1:1 huoneenlämpötilassa Puck's G - (Gibco) tasapainotetulla suolaliuoksella (BSS). Veriseos (20 ml) asetettiin kerrokseksi 15 ml:lie Ficoll/Hypaque-tiheysgra-dienttia (Pharmacia, tiheys = 1,078, huoneenlämpötilassa) ja sentrifugoitiin 1000 x g:ssä 20 minuutin ajan. Rajafaasi otettiin sitten talteen ja pestiin 3X Puck's G -valmisteella. Solut laskettiin hemasytometrissä ja uudelleenlietettiin RPMI 1640 -kasvualustaan (Gibco), joka sisälsi 0,5 % gentamysiiniä, pitoisuuden 1 mM L-glutamiinia (Gibco) ja 5 % 1ämpöinaktivoitua (56 °C, 30 min.) humaani-AB-seerumia (Flow Laboratories) (johon kasvualustaan tästä eteenpäin viitataan "RPMI-kasvualustana").

* » ♦ « · « [... Näissä kokeissa käytettiin hiiren ICAM-l-vastaista vasta- ainetta (R6-5-D6). Kaikkia monokl onaal isiä vasta-aineita (jotka valmistettiin vatsaontelonesteestä Jackson ImmunoResearch • « « < t ‘ ' Laboratories -laboratoriossa, Boston, MA) käytettiin puhdis-\V tettuina IgG-valmisteina.

• I» • · · • · « fiäreisveren yksitumasoluja (PBMC) viljeltiin kasvualustassa : pitoisuutena 6,25 x 105 solua/ml Linbron pyöreäpohjäisi 11 a :*·*: mikrotiitterilevyi 1 lä (# 76-013-05). Toisesta luovuttajasta . saatuja stimulaattorisoluja säteilytettiin 1000 R:llä, minkä •*j/ jälkeen niitä viljeltiin vastesolujen kanssa samana pitois-’·.·* uutena. Viljelmän kokonaistilavuus oli 0,2 ml. Verrokkeina :V: toimivat vastesolut yksinään sekä stimulaattorisolut yksinään.

Vil jelymal jo ja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 % C02:ta sisältävässä 98 107451 kostutetussa ilmakehässä 5 päivän ajan. Kuoppia sykäytettiin 0,5 mikrocurie-yksikön pitoisuudella tritioitua tymidiiniä (3HT) (New England Nuclear) viljelyn 18 viimeisen tunnin aikana. Joissain tapauksissa suoritettiin kaksisuuntainen MLR. Menettelyjärjestys oli sama lukuunottamatta, että toisen luovuttajan soluja ei inaktivoitu säteilyttämällä.

Solut otettiin talteen lasikuitusuodattimille käyttäen automaattista näytekerääjää (Skatron, Norja), minkä jälkeen ne huuhdottiin vedellä ja metanolilla. Suodattimia kuivattiin uunissa, minkä jälkeen ne laskettiin Aquasol-nesteessä Beckmanin (LS-3801) nestetuikelaskijalla. Tulokset ilmaistaan keskimääräisenä tuiketta/min-arvona +/- s.d. kuudesta eri vi1jelmästä.

Taulukosta 15 ilmenee, että puhdistetut ICAM-l-vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet inhiboivat MLR:ää annosriippuvaisella tavalla, jolloin merkittävää suppressiota ilmeni pitoisuudella 20 ng/ml. Puhdistetulla hiiri-IgG:1lä oli vain vähäinen tai ei lainkaan suppressiivista vaikutusta. MLR:n . suppressiota ICAM-l-vastaisel1 a monoklonaalisella vasta- aineella tapahtuu, kun vasta-aine lisätään viljelyn ensim-’· ‘ mäisten 24 tunnin aikana (taulukko 16).

• i • · 1 • · · • · • · · • · · • t • · o » · · • I · « · · « · · • « « · · • · · « · · e « « « • · • · · · · 99 1 0 7 4 51 TAULUKKO 15 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus yksisuuntaiseen imusolureaktioon . : — ; “ 3 , . . ~ "

Stimulaatto- HT-surtyminen

Vastesolut risolut13 Vasta-ainec (tuiketta/min. ) 445d + 143 + - 148 ± 17 + - - 698+72 + + - 42,626 ± 1,579 + + mlgG (10.0 (iq) 36,882 ± 1,823 (147.) + + mlgG ( 0.4 ^g) 35,500 ± 1,383 (177.) + + mlgG ( 0.02 pg) 42,815 + 1,246 ( 0%) + + R6-5-D6 (10.0 /xg) 8,250 + 520 (81%) + + R6-5-D6 ( 0.4 /xgj 16,142 + 858 (627.) + + R6-5-D6 ( 0.03 μq) 28,844 ± 1,780 (327.) « « • · · • · · • · · • · · aVastesoluja 6,25 x 105 kpl/ml bStimulaattorisoluja 6,25 x 105 kpl/ml, säteilytetty 1000 R:llä cICAM-l-vastainen puhdistettu monoklonaalinen vasta-aine (R6-5- • « « D6) tai puhdistettu hiiri-IgG (mlgG), 1oppupitoisuudet • · : (mikrogrammaa/ml) .

^Keskiarvo +/- s.d. 5-6 viljelmästä; luvut sulkeissa .·.·. ilmoittavat MLR:n prosentuaalisen inhibition.

100 107451 TAULUKKO 16 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen 1isäysajankohta 3 ; .

H-siirtyminen

Ra S& Lis'äysc~ (tuiketta/min.)

Kasvualustan tai vasta-aineen lisäysajankohta__ Päivä 0_Päivä 1_Päivä 2 " kasvualusta 205^ ± 14 476 ± 132 247 ± 75 + kasvualusta 189 ± 16 nde nd + " kasvualusta 1,860 ± 615 nd nd + + kasvualusta 41,063 ± 2,940 45,955 ± 2,947 50,943 ± 3,072 + + R6-5-D6 17,781 ± 1,293 38,409 ± 1,681 47,308 ± 2,089 (57%}f (16%) (7%) «1 I < _ ___ 1 < ett· • · * • · · • · :T; aVasteso!uja 6,25 x 10$ kpl/ml bStimulaattorisoluja 6,25 x 10$ kpl/ml, säteilytetty 1000 R:llä :*:*j kasvualustaa tai ICAM-l-vastaista puhdistettua monokl onaal ista • « vasta-ainetta (R6-5-D6) pitoisuutena 10 mikrogrammaa/ml • lisättiin päivästä 0 24 tunnin välein.

: ^Keskiarvo +/- s.d. 4-6 viljelmästä; • · · ·,,,· end = ei määritetty fProsentuaalinen inhibitio » « * 101 107451

Yhteenvetona ICAM-l-vastaisen vasta-aineen kyky inhiboida MLR:ää osoittaa, että ICAM-l-vastaisi11 a monoklonaalisi11 a vasta-aineilla on terapeuttista käyttöä akuutissa siirre-hyljinnässä. ICAM-l-vastaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla on niinikään terapeuttista käyttöä liittyvissä immuuni(järjestelmä)välitteisissä häiriöissä, jotka ovat riippuvaisia LFA-1/ICAM-l-säätöisistä solu-soluvuorovai-kutuksista.

Tässä kuvatut kokeet osoittavat, että ICAM-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden lisääminen inhiboi sekaimusolureaktiota (MLR), kun ne lisättiin reaktion ensimmäisten 24 tunnin kuluessa. Lisäksi ICAM-1 säätyy ylöspäin ihmisen ääreisveren monosyyteissä in vitro -viljelyssä.

Lisäksi todettiin, että ICAM-1 ei ilmenny lepotilassa olevilla ihmisen ääreisveren imusoluilla tai monosyyteillä. ICAM-1 säätyy ylös yksinään viljellyillä monosyyteillä sekä soluilla, joita viljellään yhdessä ei-sukulaisluovuttajasolujen kanssa, sekaimusolureaktiossa, jolloin mittaukset suoritetaan käyttäen tavanomaisia virtaussytometria-analyyseja. Tätä ICAM-l:n * i ylössäätöä monosyytei 11 ä voidaan käyttää tulehdusindikaatto-rina; erityisesti, jos ICAM-1 ilmentyy tuoreilla monosyyteil lä, jotka ovat peräisin yksilöistä, jotka potevat akuuttia tai kroonista tulehdusta.

• « ♦ 1 1 • · · • · ICAM-l:n spesifisyys aktivoiduille monosyyteil 1 e ja ICAM-l-vastaisen vasta-aineen kyky inhiboida MLR:ää viittaavat siihen, että ICAM-l-vastaisil la monoklonaalisilla vasta-aineilla on « « · • · diagnostisia ja terapeuttisia käyttömahdollisuuksia akuutin * · « siirrehyljinnän ja liittyvien immuuni(järjestelmä)välitteisten : häiriöiden yhteydessä, jotka edellyttävät solu-soluvuorovaiku- tuksia.

t 102 107451 ESIMERKKI 28 ICAM-l-vastaisten ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden yhteisannon synergiavaikutukset

Kuten esitetty esimerkissä 27, MLR:ää inhiboi ICAM-l-vastainen vasta-aine. MLR:ää voi inhiboida myös LFÄ-l-vastainen vasta-aine. Sen määrittämiseksi, onko ICAM-l-vastaisten ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden yhteisannolla tehostava, eli synergistinen vaikutus, suoritettiin MLR-määritys (kuten kuvattu esimerkissä 27) eri pitoisuuksien näitä kahta vasta-ainetta läsnäollessa.

Tässä MLR-kokeessa ilmeni, että ICAM-1-vastaisen vasta-aineen ja LFA-l-vastaisen vasta-aineen yhdistelmä - pitoisuuksina, joissa kumpikaan vasta-aine yksinään ei erityisesti inhiboi MLR:ää - oli merkittävästi tehokkaampi MLR-vasteen inhiboin-nissa (taulukko 17). Tämä tulos osoittaa, että terapioilla, joissa lisäksi annetaan ICAM-l-vastaista vasta-ainetta (tai niiden fragmentteja) ja LFA-l-vastaista vasta-ainetta (tai niiden fragmentteja), on kapasiteettia tuottaa tehokkaampi , tulehdusvastainen hoito. Tällaista tehostettua terapiaa käyttämällä voidaan antaa alhaisempia vasta-aine-annoksia, kuin mitkä muutoin olisivat terapeuttisesti tehokkaita, millä on merkitystä olosuhteissa, joissa yksittäisten vasta-aineiden • korkeat pitoisuudet indusoivat anti-idiotyyppivasteen.

I ( 4 0» • · · • · * · · • » · « · · 0 » o • · · 4 · · • » • · » * · ·

« 1 I

• · • · · • 40 • · · 4 444 • · • « « · φ 103 107451 TAULUKKO 17

Vaihtelevien anti-ICAM-1- ja anti-LFA-1- (R3.1-) annoksien vaikutus sekaimusolureaktioon

Inhibitio-%

Pitoisuus (tig/ml)

Anti-ICAM-1 (R6-5-D6) ' Anti-LFA-1 0 .004 .02 .1 .5 2.5 0.0 0 7 31 54 69 70 0.0008 1 7 28 48 62 71 0.004 0 13 30 50 64 72 * 0.02 29 38 64 75 84 86 0.1 92.5 90 91 92 92 92 0.5 93 90 90 92 93 91 « t 11 ESIMERKKI 29

Optimaalisen alittavien anti-ICAM-l-annoksien ja < < i < .

‘ muiden immuunivastetta heikentävien aineiden • < :.v yhdistetyn annon additiiviset vaikutukset MLR:ään • · · • · · • · ·

Kuten esitetty esimerkissä 28, MLR:ää inhiboivat ICAM-1-vastaisten ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden yhdistelmät. Sen * · määrittämiseksi, olisiko myös anti-ICAM-1 :n ja muiden immuunivastetta heikentävien aineiden [kuten deksametasoni, atsatio- • · · Mί priini, sykiosporiini-A ja steroidit (kuten esimerkiksi • · · ·...· prednisoni jne.)] yhteisannolla tehostuneita vaikutuksia, suoritettiin MLR-määrityksiä käyttäen optimaalista alhaisempina ....: pitoisuuksina (eli pitoisuuksina, jotka ovat alhaisempia kuin 104 107451 se optimaalinen pitoisuus, jona ainetta yksinään annettaisiin kohteelle) R6-5-D6:ta yhdessä muiden immuunivastetta heikentävien aineiden kanssa, jolloin menettelysuoritus oli kuten esimerkissä 27.

Tulokset osoittavat, että R6-5-D6:n inhiboivat vaikutukset ovat vähintäänkin additiivisia suboptimaalisten annoksien deksame-tasonia (taulukko 18), atsatiopriinia (taulukko 19) ja syklo-sporiini-A:ta (taulukko 20) inhibitiovaikutuksiin. Tämä viittaa siihen, että ICAM-l-vastaisilla vasta-aineilla voi olla vaikutusta pyrittäessä alentamaan tunnettujen immuunivastetta heikentävien aineiden välttämättömiä annoksia, jolloin näiden myrkylliset sivuvaikutukset vähenevät. Käytettäessä ICAM-1-vastaista vasta-ainetta (tai sen fragmenttia) tällaiseen immunivasteheikennykseen pääsemiseksi, on mahdollista yhdistää vasta-aineen (tai sen fragmentin) antaminen joko yhteen ylimääräiseen immuunivastetta heikentävään aineeseen tai useamman kuin yhden immuunivastetta heikentävän aineen yhdistelmään.

• I

• » i i f 4 »

• * * 4 I

• « • · ♦ • ♦ ♦ • « • ♦ ♦ • · · • · · ♦ · • « ♦ • « · • « ·»» • I · • · * • · • · · • ♦ · • · · · • · · • · • · • · * • o * « « « • · 105 107451 TAULUKKO 18

Anti-ICAM-l:n ja deksametasonin vaikutus humaani-MLR:ään 3 . .

Inhibiittori H-surto , ,/ η\ (tuiketta/ Inhibitio-%

Ryhmä (ng(/ml) min.)

Kasvualusta _ 255

Stimulaattorit (S) _ jqj

Vastetuottajat (R) a ari R x S _ 341199 R x S R6-5-D5 (8) 26,224 23 R x S Dex (50) 14,158 59 R x S R6-5-D6 (8) + Dex (50) 7,759 77 . . .

Dex: deksametasoni I | • · · • · • · · • · · • « · • · • · · • · · • · • · · • · « • · · * • · • · · • « « « · · · • · · • · • · • « « · 1 1 » 106 107451 TAULUKKO 19

Anti-ICAM-1:n ja atsatiopriinin vaikutus humaani-MLR:ään __ _ —

Inhibiittori H-surto ·......

Ryhmä , , (tuiketta/ Inhibitio -s _(ng(ml) min.)

Kasvulusta . 78

Stimulattorit iS) - 174

Vastettuottajat (R) " R x S - ^’5/0 R x S R6-5-D6 (8) 44,374 11 R x S Atsatiopriini (1) 42,710 14 R x S R6-5-D6 (8) +' Atsatiopriini 34,246 31 ,v _(1) __ • 1 e • · · • · • · · • · · • · · • 0 • · · • 1 · • · ··» • 1 · • e « » • · • · · t · I • · · · • 1 · • e • 9 • 1 · « · 107 107451 TAULUKKO 20

Anti-ICAM-1:n ja syklosporiini-A:n vaikutus humaani-MLR:ään 3 H-surto

Ryhmä Inhibiittori (tuiketta/ Inhibitio-% ._(ng/rol) _min )___

Kasvualusta

Stimulattorit (S) _ 206

Vastetuottajat (R) _ g07 R x S - 31,640 R x S R6-5-D6 (8) 26,282 17 R x S CyA (10) 23,617 25 R x S R6-5-D6 (8) + CyA (10) 19,204 39

CyA: syklosporiini-A

ESIMERKKI 30 t 1 ti t ; ‘ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus saman lajin toisesta i t yksilöstä siirrettyjen elimien hyljinnän tukahduttamisessa « « < 1 **'ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutuksen osoittamiseksi • < V.* siirretyn allogeenisen elimen hyljinnän tukahduttamisessa :J : Cynomolgus-apinoihin siirrettiin munuaisia toisesta saman lajin yksilöstä menetelmän mukaan, jota ovat kuvanneet Cosimi et ai. (Transplant.Proc. 13 (1981) 499 - 503) sillä modifikaatiolla, • · että nukutusaineina käytettiin valiumia ja ketamiinia.

• · · • · : Täten munuaisensiirto suoritettiin oleellisesti seuraavasti.

···

Heterotrooppisia munuaissiirtoja suoritettiin 3 - 5 kg:n « .V. painoisille Cynomolgus-apinoille, oleellisesti kuten kuvannut [I; Marquet (Marquet et ai.. Medical Primatoloov. osa II, Basel, • · 10* 107451

Karger, 1972, s. 125), kun apinat oli ensin nukutettu valiumilla ja ketamiinilla. Luovuttajan munuaissuoniin rakennettiin yhdyshaarat, joissa toisen rakenteen pää oli yhdistetty toisen sivuun, aortta- tai onttolaskimopalaseen, käyttäen 7-0 Prolene -ommelta. Luovuttajan virtsanjohdin spatuloitiin ja istutettiin virtsarakkoon ekstravesikaalisen lähestymistavan mukaan (Taguchi, Y., et ai.. Dausset et ai. (toim.): Advances in Transplantation. Baltimore, Williams & Wilkins, 1968, s. 393) Munuaisfunktiota arvioitiin viikoittain tai kahdesti viikossa määrittämällä seerumikreatiniini. Lisäksi otettiin tajaan siirrenäytteitä kudosopillista tarkastelua varten ja kaikille kokeessa kuolleille vastaanottajille suoritettiin täydelliset ruumiinavaukset. Useimmissa vastaanottajissa suoritettiin molemminpuolinen munuaispoisto siirtoajankohtana ja myöhemmän virtsamyrkytyksestä johtuvan kuoleman ajankohta katsottiin siirreselviämisen 1oppuajankohdaksi. Joissain vastaanottajissa siirtoajankohtena suoritettiin yksipuolinen natiivi munuaisen poisto ia vastapuolinen virtsarakkosidonta. Kun tapahtui siirteen hylkimistä, autologisen virtsanjohtimen ommel poistettiin, jolloin . seurauksena oli normaalin munuaisfunktion palautuminen ja ·’ ' mahdollisuus jatkaa vastaanottaja-eläimen immunologista tarkkailua.

Monoklonaalista vasta-ainetta R6-5-D6 annettiin päivittäin 12 « « päivän ajan alkaen kaksi päivää ennen siirtoa annoksena 1-2 rog/kg/päivä. Seerumin kreatiniinitasot määritettiin ajoittain hyljinnän tarkkailemiseksi. ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus samasta lajista saadun munuaisen hyljintään • · · immuunijärjestelmän toimesta on esitetty taulukossa 21.

• i t • · < · » • · · • · · * • · · • · • * · « • · ♦ · · « « · ♦ « « · 107451 109 TAULUKKO 21 R6-5-D6:n aktiivisuus saman lajin yksilöstä siirretyn munuaisen selviytymiseen suojatoimenpiteitä käytettäessä Cynomolgus-apinassa» „ _ , .. . Selviämispäivä

Apina R6-5-D6-annos (mg/kg) käsittelyn jälkeen ·. Verrokki 1 8

Verrokki 2 _

Verrokki 3 . ]1

Verrokki 4 . 10

Verrokki 5 9

Verrokki 6 10 M15 1.0 20 M19 1.0 7b M17 1.0 30 M2 5 1.5 29 M23 1.0 11° M27 2.0 34 M7 0.5 22

Mil 0.5 26 M10 0.5 22 M8 0.5 26d I i II l . „ I I !

• I

« 4 ( »Apinoille annettiin R6-5-D6:ta 12 perättäisenä päivänä alkaen '·"· 2 päivää ennen siirtoa.

• I 4 • · · • · bKuolinsyy tuntematon; todisteita piilevästä malariasta löytyi.

.·.·. cKuolinsyy munuaiskuolio.

• · · • ·

Ml • · « • · · dEläin oli edelleen elossa 15. elokuuta 1988.

• t

I I I

« · c III · • · ·

Tulokset osoittavat, että R6-5-D6 pidensi tehokkaasti apinoiden elinikää, joihin oli siirretty munuainen saman lajin toisesta • * · yksilöstä.

uo 107451 ESIMERKKI 31 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus siirrettyjen elimien akuutin hyljinnän tukahduttamisessa

Sen osoittamiseksi, että ICAM-l-vastainen vasta-aine on tehokas siirrehyljinnän akuutissa mallissa, R6-5-D6:ta testattiin myös terapeuttisessa tai akuutissa munuaisenhyljintämallissa. Tässä mallissa apinan munuaisia siirrettiin (käyttäen esimerkissä 30 kuvattua menettelyjärjestelyä), ja niille annettiin toimenpide-ajankohdan molemmin puolin 15 mg/kg syklosporiini-A:ta (CyA) i.m. kunnes päästiin stabiiliin munuaisfunktioon. Sitten CyA-annosta alennettiin kahdesti viikossa 2,5 mg:n/kg välein, kunnes hyjintää ilmeni, minkä osoitti veren kreatiniinitasojen nousu. Tällöin R6-5-D6:ta annettiin 10 päivän ajan ja eloon-jäänti-aikaa tarkkailtiin. Tärkeätä on huomata, että tässä menettelyjärjestelyssä CyA-annos pysyy suboptimaalisena, koska se ei muutu sen jälkeen, kun akuutti hyijintävaihe on käynnistynyt. Tässä mallissa kudosopilliset verrokit (N=5), joilla ei käytetä vasta-ainesuojaa, selviävät 5-14 päivän ajan hyijintävaiheen käynnistymisestä. Tähän mennessä kuusi eläintä . on testattu käyttäen R6-5-D6:ta tämä menettelyjärjestelyn • t mukaan (taulukko 22). Kaksi näistä eläimistä on edelleen elossa < I ( '·' ' (M12, 31 päivää; ja M5, 47 päivää laskettuna R6-5-D6:n

I I

annosta). Kaksi eläintä eli 38 ja vastaavasti 55 päivää R6-5- *:“i D6-terapian käynnistämisestä ja kaksi eläimistä kuoli muista syistä kuin akuutin hyljinnän seurauksena (yksi eläin kuoli ;1Γ: CyA-myrkkyvaikutuksiin ja toinen kuoli, kun sille annettiin • nukutuksessa R6-5-D6:ta). Tämä malli muistuttaa (edellisiä) likeisemmin kliinistä tilannetta, jossa R6-5-D6:ta alunperin • · ♦ • · ,1j\ annettaisiin.

• · t ♦ • · • ♦ ♦ • · · • M ·

• M

• 1 • 1 « · · • · « I I • · · • · ♦ t » > · • 9 in 107451 TAULUKKO 22 R6-5-D6-aktiivisuus saman lajin toisesta yksilöstä siirretyn munuaisen selviämisen pidentämisessä terapeuttisissa menettelyjärjestelyissä Cynomolgus-apinassa* b Selviämispäivä

Apina Hyijintävaihe päivänä käsittelyn jälkeen 14-98 5-14 M24 41 38 M21 34 4d M3 41 55 M9 12 lle M12 37 >31 f M5 26 >47f • · «Apinoille annettiin 1-2 mg/kg R6-5-D6:ta 10 perättäisenä päivänä hyljinnän alkamisesta laskettuna. bPäivä, jona kreatiniinitasot kohosivat seurauksena CyÄ-annostuksen alentamisesta ja jona R6-5-D6-hoito aloitettiin.

• · · «Viisi eläintä testattiin käyttäen edellä kuvattua • · · terapeuttista menettelyjärjestelyä lukuunottamatta, ettei käytetty suojaterapiaa. "Selviämispäiviä käsittelyn jälkeen” on • · » · · *.*.* seiviämispäivien lukumäärä laskettuna kreatiniinitasojen • · · ·.· * kohoamisen alkamisesta.

: dEläin kuoli nukutuksessa; kreatiniini tasot olivat alhaiset.

• · · • · · · .···. «Eläin kuoli CyA-myrkkyvaikutuksiin; kreatiniini tasot olivat • · *·* alhaiset.

» · *.*.* fEläin oli edelleen elossa 15. elokuuta 1988.

112 107451 ESIMERKKI 32

Typistettyjen ICAM-1-johdannaisten geneettinen rakentaminen ja ilmennys

Luontaisessa tilassaan ICAM-1 on solumembraaniin sitoutunut proteiini, joka sisältää viidestä immunoglobuliinin kaltaisesta alueesta koostuvan solunulkoisen alueen, transmembraanialueen ja sytoplasma-alueen. Halusimme rakentaa ICAM-1:n funktionaalisia johdannaisia, joista puuttuu transmembraanialue ja/tai sytoplasma-alue, liukoisen, erittyvän ICAM-l-muodon saamiseksi. Nämä funktionaaliset johdannaiset rakennettiin ICAM-l-geenin oligonukleotidi-ohjatulla mutatoinilla, minkä jälkeen mutant-tigeeni ilmennettiin transfektoimalla se apinasoluihin.

ICAM-l-geenimutantteja, jotka käsittivät aminohapposubsti-tuutioita ja/tai typistettyjä johdannaisia, muodostettiin Kunkelin, T., (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82 (1985) 488 - 492) menetelmän mukaan. ICAM-l-cDNA valmistettiin kuten edellä kuvattu ja sitä pilkottiin restriktioendonukleaasei1 la Sali ja Kpnl, minkä jälkeen saatu 1,8 ep:n DNA-fragmentti alakloonat-tiin plasmidivektoriin CDM8 (Seed, B., et ai. Proc.Natl.Acad. Sei. USA 84 (1987) 3365 - 3369). Tällä pCD1.8C:ksi nimetyllä Y rakenteella transformoitiin sitten E. coli dut-,unq--kanta.

'' Transformanteista saatiin talteen yksisäikeinen urasiilipi- toinen templaatti käyttämällä avustajafagi R408 - (StratageneR) • · tartutusta. Sitten muodostettiin mutantti-ICAM-l-cDNA-säikeitä « · · : : : alustamalla toisen säikeen synteesi oligonukleotidilla, joka sisälsi ei-yhteensopivia emäspareja, ja transformoimalla sitten .V. unq+-isäntä (MC1061/P3) saadulla heterodupleksilla. Mutantit • ® eristettiin seulomalla juuri muodostettujen, mutanttioligonuk- » · « leotidin mukanaan tuomien endonukleaasirestriktiokeskuksien « · • · · : suhteen. Mutantti-ICAM-l-proteiini ilmennettiin transfektoi- maila Cos-7-soluja mutantti-DNA: 1 la eukaryoottisessa ilmennys-vektorissa CDM8 käyttäen DEAE-dekstraanivakiomenettelyitä * » (Selden, R.F., et ai. , Current Protocols in Molecular Biology • · 113 107451 (Ausubel, F.M., et ai.. toim.), ss. 9.2.1.-9.2.6. (1987).

Valmistettiin typistetty ICAM-l:n funktionaalinen johdannainen, josta puuttuivat transmembraani- ja sytoplasma-alueet, mutta joka sisälsi kaikki viisi immunoglobuliinin kaltaista aluetta käsittävän solunulkoisen alueen. 30 ep:n mutanttioligonukleo-tidia (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) käyttäen muutettiin aminohappojen tyrosiini (Y) ja glutamiinihappo (E) kodonit asemissa 452 ja vastaavasti 453 fenyylialaniiniksi (F) ja translaation lopetuskodoniksi (TAG). Mutantti eristettiin yksittäisen Xbal-restriktiokeskuksensa nojalla ja nimettiin ,,Y452E/F/TAG".

Mutanttiproteiinin ilmentämiseksi COS-soluja transfektoitiin kolmella mutanttialakloonilla ("2, #7 ja #8). Kolmen päivän kuluttua transfektoinnista näillä kolmella mutanttialakloonilla viljelmäsupernatantteja ja solulysaattia analysoitiin immuuni- saostamalla ICAM-l-vastaisella monoklonaalisella vasta- aineella RR1/1 ja SDS-PAGE:1 la. ICAM-1 saostettiin mutantti- alaklooneilla #2 ja #8 transfektoitujen solujen viljelmäsuper- natanteista, mutta ei näiden solujen pesuainelysaateista.

Vi 1 jelmäsupernatantista todetun ICÄM-l:n molekyylipaino oli noin 6 kd:tä alhaisempi kuin ICAM-1:n membraanimuodon, mikä sopii mutantti-DNA:1 le ennakoituun kokoon. Täten tämä ICÄM-l:n ‘‘ funktionaalinen johdannainen erittyy liukoisena proteiinina.

• ·

Sitä vastoin ICAM-1 ei immuuni saostunut natiivilla ICAM-1: llä -/· : transf ektoitujen solujen verrokkivil jelmäsupernatanteista, mikä osoittaa, että ICAM-1:n membraanimuoto ei erity Cos-soluista.

.·.·. Lisäksi ICAM-1 :tä ei immuunisaostunut negatiivisena verrokkina • · toimineiden valetransfektoitujen solujen sen paremmin viljel- • · « mäsupernatanteista kuin solulysaateistakaan.

• · · • · · • « · · • · · ·...’ Transf ektoitujen solujen erittämä typistetty ICAM-1 puhdistet- tiin immunoaf finiteettikromatograf isesti ICAM-1: Ile spesifi-....: sellä vasta-aineella (R6-5-D6), minkä jälkeen sen funktionaa- 114 107451 lista aktiivisuutta testattiin solusitoutumismäärityksellä. Valmisteita, jotka sisälsivät natiivia ICAM-l:tä tai typistettyä, erittyvää muotoa, puhdistettiin pesuaineoktyyligluko-sidin läsnäollessa, minkä jälkeen niitä laimennettiin loppu-pitoisuuteen 0,25 % oktyyliglukosidia (joka pitoisuus alittaa pesuaineen kriittisen misellipitoisuuden). Näiden ICAM-1-valmisteiden annettiin sitoutua muovisten, 96 kuopan kuoppa-levyjen (Nunc) kuoppapintoihin kiinteään faasiin sidotun ICAM-l:n saamiseksi. Ei-sitoutunut materiaali pestiin pois, minkä jälkeen todettiin, että noin 75 - 80 % ja vastaavasti 83 - 88 % SKW-3-soluista, jotka käsittivät solupinnoillaan LFA-l:n, sitoutui spesifisesti ICAM-l:n natiiviin ja typistettyyn muotoon. Nämä tulokset osoittavat, että ICAM-l:n erittyvällä, typistetyllä ja liukoisella funktionaalisella johdannaisella oli tallella sekä immunologinen reaktiivisuus että kyky välittää ICAM-l-riippuvaista kiinnittymistä, jotka ominaisuudet ovat karakteristisia natiiville ICÄM-1:lie.

Funktionaalinen ICAM-1-johdannainen, josta puuttuu vain sytoplasma-alue, valmistettiin samankaltaisilla menetelmillä. Aminohapon 476 (Y) vaihtamiseksi TAG-translaatiolopetuskodo-*,,, niksi käytettiin 25 ep:n oligonukleotidia (TC AGC ACG TAC CTC

TAG AAC CGC CA). Mutantti nimettiin "Y476/TAG". Immuunisaosta-maila ja suorittamalla SDS-PAGE Cos-soluilla, jotka oli trans-fektoitu mutantilla, todettiin ICAM-1:n membraaniin sitoutunut • * muoto, jonka molekyylipaino oli noin 3 kd:tä alhaisempi kuin natiivin ICAM-1 :n. Mutantilla transfektoitujen Cos-solujen epäsuoralla immunofluresenssilla todettiin samankaltainen täplikäs värjääntymiskuvio kuin LPSillä stimuloiduilla humaani- • m endoteelisoluilla ilmennetyn natiivin ICAM-l:n. Lopuksi mu- • · · tantti-DNA:1la transfektoidut solut sitoutuivat spesifisesti • · · : puhdistettuun LFA-l:een muovipinnoilla samaan tapaan kuin « · · ·...· natiivilla ICAM-l-DNA: 1 la transf ektoidut Cos-solut (taulukko 23).

* · « 115 107451 TAULUKKO 23 ICAM-l:n tai funktionaalisen ICAM-1-johdannaisen ilmentävien solujen kyky sitoutua LFA-l:een LFA-l:een sitoutuvien, ICAM-1:n ilmentävien solujen %-osuus, kun läsnä on:_ TRANSFEKTOINTI Ei vasta-ainetta RR1/1

Vale- 0 0

Natiivi ICAM-1 20 0 Y47 6/TAG 20 0 ESIMERKKI 33 ICAM-1:n funktionaalisten alueiden kartoitus ICAM-1:tä tutkittaessa ilmeni, että molekyyli käsittää 7 aluetta. Näistä alueista viisi on solunulkoista (jolloin lähinnä solupintaa on alue 1 ja kauimpana solupinnasta on alue 1), yksi alue on transmembraanialue ja edelleen yksi alue on sytoplasma-alue (eli on solun sisällä). Sen määrittämiseksi, ' - mitkä alueet myötävaikuttavat ICAM-1:n kykyyn sitoutua LFA- l:een, voidaan käyttää epitooppikartoitustutkimuksia.

• · ϊίί Tällaisten kokeiden suorittamiseksi valmistetaan erilaisia • · deleetiomutantteja, joiden kyky sitoutua LFA-l:een karakte-risoidaan. Vaihtoehtoisesti tutkimukset voidaan suorittaa käyttäen ICAM-vastaista vasta-ainetta, jonka tiedetään » » häiritsevän ICÄM-l:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Esimerkkejä • · · tällaisista sopivista vasta-aineista ovat RR1/1 (Rothlein, R., • · : et ai. . J. Immunol. 137 (1986) 1270 - 1274); R6.5 (Springer, • · · T.A., et ai. , US-hakemusjulkaisu sarjan:o 07/250,446), LB-2 (Clark, E.A., et ai. . Leukocyte Typing I. A. Bernard, et ai. . toim. , Springer-Verlag, 1984, ss. 339 - 346) tai CL203 116 107451 (Staunton, D.E., et ai., Cell 56 (1989) 849 - 853).

ICAM-l-deleetiomutantteja voidaan muodostaa millä tahansa lukuisista eri tavoista. Edullisesti tällaisia mutantteja muodostetaan kuitenkain paikkaohjautuvalla mutatoinnilla tai muutoin yhdistelmägeeniteknisesti (kuten rakentamalla ICAM-1:n ilmentäviä geenisekvenssejä, joista tiettyjä proteiinialueita koodattavat sekvenssit on eliminoitu. Menettelyt, jotka soveltuvat tällaisten mutanttien tuottamiseen, ovat alalla hyvin tunnettuja. Tällaisia menettelyitä käyttäen valmistettiin kolme ICAM-l-deleetiomutanttia. Ensimmäisestä mutantista puuttuvat aminohappojäännökset F185 - P284 (eli alue 3 on del etoitu). Toisesta mutantista puuttuvat aminohappojäännökset P284 - R451 (eli alueiden 4 ja 5 deleetio). Kolmannesta mutantista puuttuvat Y476:n jälkeiset aminohappojäännökset (eli sytoplasma-alueen deleetio). Näiden tutkimusten tuloksista ilmenee, että alueet 1, 2 ja 3 liittyvät pääasiassa ICAM-l:n ja ICAM-l-vastaisen vasta-aineen tai LFÄ-l:n välisiin vuorovaikutuksiin.

ESIMERKKI 34 ICAM-1:ssä suoritettujen mutatointien vaikutus < < < LFA-l-si toutumiseen

« I

ICAM-l:n kyvyn olla vuorovaikutuksessa ja sitoutua LFA-l:een • · välittävät ICAM-l-aminohappojäännökset, jotka sijaitsevat ICAM- « · · : 1-molekyylin alueilla 1 (kuviot 8, 9 ja 10). Tällaisiin vuoro vaikutuksiin myötävaikuttavat kuitenkin ICAM-l:n alueilla 2 ja :V: 3 sijaitsevat aminohapot. Täten esillä olevan keksinnön mukai- • · siin edullisiin funktionaalisiin johdannaisiin lukeutuvat « . *. liukoiset ICAM-l-molekyylifragmentit, jotka sisältävät ICAM-1- • · e ’·;/ alueet 1, 2 ja 3. Edullisempia ovat liukoiset ICAM-l-molekyy- *♦··* 1 if ragmentit, jotka sisältävät ICAM-l-alueet 1 ja 2. Edulli- :Y; simpia ovat liukoiset ICAM-l-molekyylifragmentit, jotka « · sisältävät ICAM-1:n alueen 1. ICAM-l:n ja LFA-l:n väliseen 117 107451 vuorovaikutukseen osallistuvat useat aminohappojäännökset ensimmäiseltä ICAM-l-alueelta. Näiden aminohappojen korvaaminen muilla aminohapoilla muuttaa ICÄM-l:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Nämä aminohappojäännökset ja mainitut substituutiot on esitetty kuviossa 25. Kuviossa 25 esitetään myös tällaisten mutatointien vaikutukset saadun mutantti-ICAM-l-molekyylin kykyyn sitoutua LFA-l:een. Kuvioissa 23 - 25 jäännökset on merkitty aminohappojen yksikirjainkoodilla, jota seuraa jäännöksen asema ICAM-l-molekyyIissä. Täten esimerkiksi "E90" tarkoittaa glutamiinihappojäännöstä ICÄM-l:n asemassa 90. Vastaavasti "E90V" tarkoittaa dipeptidiä, joka koostuu glutamiinihappojäännöksestä asemassa 90 ja väliini jäännöksestä asemassa 91. Substituutiosekvenssi on merkitty vinoviivan ("/") oikealle puolelle. ICAM-l:n jäännökset V4, R13, Q27, Q58 ja D60S61 osallistuvat LFA-l-sitoutumiseen.

Näiden aminohappojen korvaaminen muutti ICAM-l:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Esimerkiksi korvaamalla V4 G:llä saadaan mutantti-ICAM-l-molekyyli, joka kykenee huonommin sitoutumaan LFÄ-l:een (kuvio 25). Korvaamalla ICAM-l:n R13-jäännös E:llä saadaan ,·, mutanttimolekyyli, jolla on huomattavasti vähemmän kykyä sitoutua LFA-l:een (kuvio 25). Korvaamalla ICAM-l:n Q58-jäännös H:lla saadaan mutanttimolekyyli, jolla on oleellisesti '··' normaali kyky sitoutua LFA-l:een (kuvio 25). Korvaamalla ICÄM-l:n D60S-jäännökset KL:llä saadaan mutanttimolekyyli, jolla on • · oleellisesti vähemmän kykyä sitoutua LFA-l:een (kuvio 25).

• · · « · ·

Toisen alueen glykosylaatiokeskukset liittyvät niinikään LFA-1-sitoutumiseen (kuvio 23). Korvaamalla N103 K: 11a, tai A155N

• · SV:llä, saadaan mutantti-lCAM-1-molekyyli, joka oleellisesti ei . *. kykene sitoutumaan LFA-l:een. Sitä vastoin glykosylaatiokes- • · ♦ ··[ · kuksen N175 korvaaminen A: 11a ei ilmeisesti oleellisesti *···* vaikuttanut mutantti-ICÄM-1:n kykyyn sitoutua LFA-l:een.

....: Kolmannen ICAM-l-alueen mutaatiot eivät sanottavasti muuttaneet 118 107451 ICAM-1:n LFA-l-sitoutumista (kuvio 24).

ESIMERKKI 35 ICAM-l-multimeerejä, joiden biologinen puoliintumisaika-affiniteetti ja "seiviämiskyky" ovat kasvaneet

Rakennetaan kimeerisiä molekyylejä, joissa ICAM-l:n alueet 1 ja 2 ovat kiinnittyneet immunoglobuliinin raskaan ketjun sarana-alueelle. Edullisissa rakenteissa ICAM-l:n alueen 2 C-pää on kiinnitetty immunoglobuliinin raskas ketju -geenisegmenttiin, joka on sarana-alueeseen nähden välittömästi N-pään puolella, jolloin segmentin jousto voi siirtyä sarana-alueeseen. ICAM-1-alueet 1 ja 2 korvaavat täten vasta-aineen Fab-fragmentin. Kiinnittämällä rakenne IgG-luokan raskaisiin ketjuihin ja eläinsoluissa sitten tuottamalla saadaan kimeerinen molekyyli. Tuotettaessa molekyylejä, jotka sisältävät IgArsta tai IgM:stä peräisin olevia raskaita ketjuja, saadaan molekyylejä, joiden multimeria-aste on korkeampi, jolloin ne sisältävät 2-12 ICAM-l-molekyyliä. Yhteisilmaisemalla J-ketjugeeni eläinsoluissa, jotka tuottavat kimeerisiä ICAM-l-raskasketjumole-.·, kyylejä, saadaan kootuksi oikealla tavalla IgA- ja IgM- multimeerejä, jolloin saadaan pääasiassa IgA-molekyylejä, jotka • « « sisältävät 4-6 ICAM-l-molekyyliä, ja IgM-mol ekyyl e jä, jotka *···[ sisältävät noin 10 ICAM-l-molekyyliä. Näillä kimeerisillä ‘ ' molekyyleillä saattaa olla useita hyviä puolia. Ensinnäkin Ig- • · molekyylit on suunniteltu pitkäikäisiksi verenkierrossa, mikä • · · : mahdollisesti nostaa biologista puoliintumisaikaa.

Lisäksi näiden rakennettujen molekyylien multimeeriluonne • · ·*sallii niiden olla vuorovaikutuksessa korkeammalla affinitee- , ·. tiliä nuhaviruksen sekä solupinta-LFA-1:n kanssa, terapiayh- • » · •*j · teydestä riippuen, jolloin se yhdistelmäproteiinimäärä, joka on « « annettava tehokkaan annoksen saamiseksi, laskee voimakkaasti. ;Y; IgA ja IgM ovat erittäin glykosyloituja molekyylejä, joita i · normaalisti esiintyy limakalvoeritteissä esimerkiksi nenässä.

119 107451

Niiden erittäin hydrofiilinen luonne edistää niiden sitomien bakteerien ja viruksien pysymistä limakalvolla, jolloin viimemainittujen kiinnittyminen soluihin sekä epiteelisolumemb-raaniesteen läpäisy estyvät. Täten niiden terapeuttinen teho on mahdollisesti kasvanut. IgM ja erityisesti IgA ovat stabiileja limakalvoympäristöissä ja ne voivat nostaa ICAM-l-rakenteiden stabiilisuutta. Jos tällaista funktionaalista ICÄM-1-johdannaista annetaan verenkiertoon, tämä mahdollisesti niinikään kasvattaa biologista puoliintumisaikaa. IgA ei kiinnitä komplementtia ja olisi täten ihanteellinen sovellutuksissa, joissa mainittu olisi kohtalokasta. Jos halutaan IgG-H-ketjukimeerejä, voitaisiin mutatoida komplementin kiinnitykseen sekä Fc-reseptorivuorovaikutuksiin osallistuvia alueita.

ESIMERKKI 36 ICAM-l-mutanttien muodostus Oiioonukleotidiohjattu mutatointi ICAM-l-cDNA:n koodialue 1,8 ep:n SaiI-Kpnl-fragmentissa alakloonattiin ilmennysvektoriin CDMB (Seed, B., et ai..

·* " Proc.Natl .Acad. Sei. USA 84 (1987) 3365 - 3369). Kunkelin, T., (Proc.Natl .Acad.Sci. USA 82 (1985) 488 - 492) menetelmän ja Stauntonin, D., et ai. , (Staunton, D.E. , et ai. . Cell 52 (1988) 925 - 933) modifikaatioiden mukaan tämän rakenteen (pCD1.8) :V: avulla muodostettiin yksisäikeinen urasiilipitoinen templaatti käytettäväksi oligonukleotidiohjatussa mutatoinnissa.

.·.·. Suupeasti, pCD1.8:lla transformoitiin E. coli -kanta XS127.

Yksittäisiä pesäkkeitä kasvatettiin 1 ml:ssa Luria-liemi- (LB-) • · · • · « *. kasvualustaa (Difco), joka sisälsi 13 mikrogrammaa/ml ampisil- • * :.· * liinia ja 8 mikrogrammaa/ml tetrasykliiniä, lähelle kyllästys- i": pistettä. 100 mikrolitraan viljelmää tartutettiin R408-avusta- .·]·. jafagi (Stratagene) monikerta- (10) tartutuksena (MOI), minkä • · « '. jälkeen lisättiin 10 ml LB-kasvualustaa, joka sisälsi ampisil- 120 107451 liinia ja tetrasykliiniä, ja kasvatettiin 16 tunnin ajan 37 °C:ssa. Viljelmää sentrifugoitiin 10 000 kierr./min kierros-nopeudella 1 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantti suodatettiin 0,22 mikro-m:n suodattimella ja fagisuspensiolla tartutettiin E. coli -kanta BW313/P3, joka maljoitettiin sitten LB-agar-kasvualusta- (Difco) maljapinnoille, jolloin kasvualustaa oli täydennetty ampisilliinilla ja tetrasykliini!lä. Pesäkkeet noukittiin ja niitä kasvatettiin 1 ml:ssa LB-kasvualustaa, jossa oli ampisilliinia ja tetrasykliiniä, lähelle kyllästyspistettä, minkä jälkeen viljelmiin tartutettiin avustajafagi MOI 10 -tartutuksena. Sitten viljelytilavuus nostettiin 250 ml:ksi ja soluja viljeltiin yön yli. Yksisäikei-nen DNA eristettiin vakioilisella fagiuutolla.

Mutanttioligonukleotidit fosforyloitiin ja niitä käytettiin pCD1.8-templaatin ohella toisen säikeen synteesireaktiossa (Staunton, D., et ai ., Cell 52 (1988) 925 - 933).

Transfektointi COS-soluja siirrostettiin 10 cm:n kudosviljelmämaljoihin « 4 4 sellainen määrä, että viljelmä olisi 50-%:isesti yhteenkasvanut

« « I

16 - 24 tunnissa. Sitten COS-solut pestiin kerran TBS:llä ja I ( inkuboitiin 4 tunnin ajan 4 ml :11a RPMIrtä, joka sisälsi 10 % t • «tl * ' seerumia (Collaborative), 5 mikrogrammaa/ml klorokiinia, 3 • · ·.·.* mikrogrammaa mutanttiplasmidia ja 200 mikrogrammaa DEAE- : dekstraanisulfaattia. Sitten solut pestiin 10 % DMSO/PBS:llä ja sen jälkeen PBS:llä, minkä jälkeen niitä viljeltiin 16 tunnin ajan kasvualustassa. Kasvualusta korvattiin tuoreella kasvu- · alustalla ja ajankohtana 48 tuntia tartutuksesta COS-solut lietettiin trypsiini/EDTA- (Gibco) käsittelyllä ja jaettiin 2, • · · ί·ί · 10 cm:n maljoihin sekä 24 kuopan kudosvil jelmälevyil le HRV- • · · :...· sitoutumista varten. Ajankohtana 72 tuntia solut otettiin talteen 10 cm:n maljoista käyttäen 5 mM EDTA/HBSS:ää ja niitä käsiteltiin silmälläpitäen kiinnittämistä LFA-l-päällysteiseen 121 107451 muoviin ja immunofluoresenssimääritystä.

LFA-1:n ia HRV:n sitoutuminen LFA-1 puhdistettiin SKW-3-lysaateista immunoaffiniteettikroma-tografisesti TS2/4-LFA-l-MAb-Sepharose -geelissä ja eluoitiin pH:ssa 11,5 2 mM MgCl2in ja 1 %:n oktyyliglukosidia läsnäollessa. LFA-1 (10 mikrogrammaa/200 mikrolitraa/6 cm:n malja) sidottiin bakteriologisiin petrimaljoihin laimentamalla pitoisuuteen 0,1 % oktyyliglukosidia PBS:ssä (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos), joka sisälsi 2 mM MgCl2, ja inkuboi-malla yön yli 4 °C:ssa. Maljat salvattiin l-%:isella BSA-liuoksella (nautaseerumialbumiini-) ja varastoitiin PBS:ssä, joka sisälsi pitoisuudet 2 mM MgCl2, 0,2 % BSA:ta, 0,025 % atsidia ja 50 mikrogrammaa/ml gentamysiiniä.

5lCr-leimattuja COS-soluja PBS:ssä, joka sisälsi 5 % FCS:ää (vasikansikiöseerumia), 2 mM MgCl2, 0,025 % atsidia (puskuri), inkuboitiin lisäten 5 mikrogrammaa/ml RRl/l:tä ja R6.5:tä, tai mainittua lisäystä suorittamatta, LFA-l-päällysteisillä mikrotiitterilevyillä 25 °C:ssa 1 tunnin ajan. Ei-kiinnittyneet " solut poistettiin pesemällä 3 kertaan puskurilla. Kiinnittyneet

' I I

V · solut eluoitiin lisäämällä EDTA:ta pitoisuuteen 10 mM ja suoritettiin gamma-laskenta.

« · I ( ;

•V: TULOKSET

• · • · · • · « 9 · *

On tunnistettu ICAM-l-vastaisia vasta-aineita kuten RR1/1, ..... R6.5, LB-2 tai CL203. Jos nämä vasta-aineet kykenevät estämään • · « l.l ICAM-l-funktion, ne välttämättä kykenevät sitoutumaan johonkin • « · tiettyyn kohtaan ICÄM-l-molekyylissä, joka on tärkeä myös ICAM- m · ... · 1-funktiolle. Täten valmistamlla edellä kuvattuja ICAM-1- deleetiomutantteja ja määrittämällä, missä määrin ICAM-1- ./.. vastaiset vasta-aineet kykenevät sitoutumaan deleetioon, • · » voidaan määrittää, ovatko deletoidut alueet tärkeitä • « 122 1 0 7 4 51 funktiolle.

ICAM-1 on integraalinen membraaniproteiini, jonka solunulkoisen alueen ennustetaan koostuvan viidestä Ig:n kaltaisesta C-alueesta. LFA-l-sitoutumiseen osallistuvien alueiden tunnistamiseksi alue 3 ja alueet 4 ja 5 (karboksyylipää) deletoitiin oligonukleotidiohjattua mutatointia käyttäen, minkä jälkeen ne ilmennettiin COS-soluissa ja suoritettiin funktionaalisia kokeita. Lisäksi sytoplasma-alue kokonaisuudessaan deletoitiin sen mahdollisen vaikutuksen ICAM-1-vuorovaikutuksiin todentamiseksi. Kuten ennakoitu sytoplasma-alue deleetio, Y476/*, ei osoittanut RR1/1-, R6.5-, LB-2- ja CL203-reaktiivisuuden menetystä, kun puolestaan alueen 3, F185 - R451, deleetion seurauksena CL203-reaktiivisuus vastaavasti laski (kuvio 20). Täten CL203-epitooppi sijaitsee ilmeisesti alueella 4 kun taas RR1/1, R6.5 ja LB-2 vaikuttavat sijaitsevan 2 aminopää-alueella.

Kaikki 3 deleetiomutanttia osoittavat villityypin LFA-1-kiinnitystasoja (kuvio 21). Aminohapposubstituutioita muodostettiin myös alueiden 1, 2 ja 3 ennakoituihin beeta-,< käänteisiin, rakenteet ilmennettiin COS-soluissa ja niiden I funktionaalisuutta testattiin. R6.5-epitooppi paikannettiin ‘ täten sekvenssiin E111GGA alueessa 2, ja siihen saattaa i i j , niinikään liittyä E39 alueella 1, kun taas RR1/1 ja LB-2 * e • · s *·*.' kumpikin ovat riippuvaisia R13:sta alueella 1 (kuvio 22).

• · · V · Lisäksi RRl/l-sitoutumista alentavat mutaatiot sekvenssissä D71GQS. Mutaatioiden seurauksena, jotka eliminoivat N-kytkentäglykosylaatiokeskuksia N103:ssa ja N165:ssä, RRl/l:n, • » R6.5:n ja LB-2:n LFA-l-HRV-sitoutuminen laskee. Nämä mutaatiot . *. ilmeisesti vaikuttavat prosessointiin siten, että muodostuu * · · *“/ ICAM-l-dimeerejä.

• « • e

• · D

» :Y: Muiden mutaatioiden alueilla 2 tai 3 seurauksena LFA-1- • « ·;·· kiinnitys ei muuttunut (kuviot 23 ja 24). Alueen 1 aminohapot 123 107451 R13 ja D60 kumpikin osallistuvat LFÄ-l-sitoutumiseen (kuvio 25).

Täten LFA-1:n ja HRV:n sitoutuminen vaikuttaa olevan ICAM-l:n Ig-kaltäisen alueen aminopään funktio. Kuviossa 26 esitetään ICAM-aminopää-alueiden rinnakkainasettelu.

Vaikka keksintöä on kuvattu liittyen sen spesifisiin suoritusmuotoihin, tulee huomata, että siihen voidaan tehdä muita modifikaatioita, jolloin tämän hakemuksen tarkoituksena on kattaa keksinnön kaikki muunnokset, käytöt tai sovellutukset, jotka yleensä ottaen noudattavat keksinnön periaatteita ja poikkeavat tästä julkaisusta tavalla, joka pysyttelee keksinnön koskeman alan tunnetun tai tavanomaisen käytännön puitteissa ja johon voidaan soveltaa tässä edellä esitettyjä oleellisia ominaispiirteitä oheisten patenttivaatimuksien kattaman alueen puitteissa.

4 < < ( t e i « < « < · i • · • ♦ ♦ • · 1 • · ♦ 1· • Φ · • · · • · • ♦ · • · 1 • · • « « • « · • · · • · • · · • ♦ · ·«· · • · · « · « « « 4 m · • « 1 • · · • · ·

Claims (5)

124 107451

1. Menetelmä yhdisteen valmistamiseksi, joka on funktionaalinen aktiivinen ihmisen ICAM-1:n molekyyli (solujen välinen kiinnikemolekyyli) tai sen funktionaalinen johdannainen, tunnettu siitä, että a) valmistetaan rekombinantti-DNA-molekyyli, joka kykenee koodaamaan ihmisen ICAM-1:n funktionaalisesti aktiivisen molekyylin tai sen funktionaa- _ lisesti aktiivisen johdannaisen, b) transformoidaan isäntäsolu mainitulla rekombinantti-DNA-molekyylillä, c) viljellään isäntäsolu olosuhteissa, jotka sallivat mainitun ICAM-1 :n tai sen funktionaalisesti aktiivisen johdannaisen ilmentämisen, ja d) eristetään ICAM-1 tai sen funktionaalinen johdannainen puhtaana, joka sisältää ainakin yhden seuraavista polypeptideistä: (a) -V-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; (b) -X-G-S-V-L-V-T-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; (c) -L-L-G-i-E-T-P-L; (d) -F-L-T-V-Y-X-T; (e) -V-E-L-A-P-L-P; (f) -E-L-D-L-R-P-Q-G-L-E-L-F-E; !·:·. (g) -L-N-P-T-V-T-Y-G-X-D-S-F-S-A-K; (h) -S-F-P-A-P-N-V; .!!!: (i) -L-R-G-E-K-E-L; 0) -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P; (k) -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E; (l) -P-R-G-G-S; (m) -P-G-N-N-R-K; . (n) -Q-E-D-S-Q-P-M; . (o) -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S; • · · ::i.; (p) -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S; ja • · (q) -D-L-R-P-Q-G-L-E. «« · « « • · • « · • · 125 107451

2. Menetelmä yhdisteen valmistamiseksi, joka on funktionaalisesti aktiivisen ihmisen ICAM-1:n molekyyli (solujen välinen kiinnikemolekyyli) tai sen funktionaalinen johdannainen, tunnettu siitä, että a) valmistetaan rekombinantti-DNA-molekyyli, joka sisältää kuvan 8 mukaisen nukleotidisekvenssin, joka kykenee koodaamaan ihmisen ICAM-1 :n funktionaalisesti aktiivisen molekyylin tai sen funktionaalisesti aktiivisen johdannaisen, b) transformoidaan isäntäsolun mainitulla rekombinantti-DNA-molekyylillä, c) viljellään isäntäsolua olosuhteissa, jotka sallivat mainitun ICAM-1 :n tai sen funktionaalisesti aktiivisen johdannaisen ilmentämisen, ja d) eristetään ICAM-1 tai sen funktionaalinen johdannainen puhtaana, joka sisältää ainakin yhden seuraavista polypeptideistä: (a) -V-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; (b) -X-G-S-V-L-V-T-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; (c) -L-L-G-l-E-T-P-L; (d) -F-L-T-V-Y-X-T; (e) -V-E-L-A-P-L-P; (f) -E-L-D-L-R-P-Q-G-L-E-L-F-E; (g) -L-N-P-T-V-T-Y-G-X-D-S-F-S-A-K; (h) -S-F-P-A-P-N-V; (i) -L-R-G-E-K-E-L; (j) -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P; (k) -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E; • · · (l) -P-R-G-G-S; * · · (m) -P-G-N-N-R-K; (n) -Q-E-D-S-Q-P-M; .···. (o) -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S; (p) -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S; ja ·;:/ (q) -D-L-R-P-Q-G-L-E. • « • « • · · : 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmis- « « tettu yhdiste on fragmentti ihmisen ICAM-1 :stä. 107451

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettu yhdiste on ICAM-1:n muunnos tai fragmentti, ja sisältää muunnettuja aminohapporyhmiä.

5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettu yhdiste on ihmisen ICAM-1:n, sen fragmentin tai muunnoksen kemiallinen johdannainen. • · • e · • · · • · • « · • · · « · · • · • « « • · • · · • · • · · • · · • o « « • « • · · • · • · 1 « 127 107451