FI107451B

FI107451B - A method for obtaining ICAM-1 (intercellular adhesion molecule) in substantially pure form

Info

Publication number: FI107451B
Application number: FI981097A
Authority: FI
Inventors: Robert Rothlein; Timothy A Springer; Steven D Marlin; Michael L Dustin
Original assignee: Dana Farber Cancer Inst Inc
Priority date: 1988-09-28
Filing date: 1998-05-18
Publication date: 2001-08-15
Also published as: DK128990A; AU679506B2; DK175362B1; FI102181B1; KR900701846A; HUT56120A; AU6319294A; FI981097A0; HU218904B; JPH03501861A; HU896074D0; FI102181B; DK128990D0; FI981097A; WO1990003400A1; FI902490A0; JP2976381B2; AU4412889A

Description

107451107451

Menetelmä ICAM-1 (solujen välisen kiinnikemolyylin) saamiseksi oleellisesti puhtaassa muodossa - Förfarande för att erhälla ICAM-1 (intermolekulära adhesionsmolekyler) i väsentligen ren formMethod for Obtaining ICAM-1 (Intercellular Adhesive Molecule) in Essentially Pure Form - Forms of ICAM-1 (Intermolecular Adhesion Molecule) i väsentligen ren form

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää ICAM-1 :n (solujen välinen kiinnikemo-lekyyli-1) saamiseksi oleellisesti puhtaassa, funktionaalisesti aktiivisessa muodossa, ja joka oleellisesti ei sisällä yleensä ihmisen ICAM-1 :n liittyviä, luonnossa esiintyviä proteiineja.The present invention relates to a process for obtaining ICAM-1 (intracellular adhesion molecule-1) in substantially pure, functionally active form and substantially free of naturally occurring naturally occurring human ICAM-1 related proteins.

Valkosolujen on käytettävä kiinnittymään solusubstraatteihin puolustaakseen oikealla tavalla isäntää vieraita hyökkääjiä kuten bakteereita tai viruksia vastaan. Erinomaisen katsauksen puolustusjärjestelmästä esittää Eisen, H.W. (“Microbiology”, 3. painos, Harper & Row, Filadelfia, PA.1980, ss. 290 - 295 ja 381 - 418). Niiden on käytettävä kiinnittymään endoteelisoluihin kyetäkseen siirtymään verenkierrosta käynnissä olevan tulehduksen esiintymiskohtiin. Lisäksi niiden tulee kiinnittyä antigeenin käsittäviin soluihin, jotta normaali spesifinen immuunivaste voisi tapahtua, ja lopuksi niiden tulee kiinnittyä tarkoituksenmukaisiin kohdesoluihin, jotta viruksen tartuttamissa soluissa tai kasvainsoluissa voisi tapahtua lyysi.White cells must be used to attach to cellular substrates in order to properly defend the host against foreign invaders such as bacteria or viruses. An excellent overview of the defense system is provided by Eisen, H.W. (Microbiology, 3rd ed., Harper & Row, Philadelphia, PA.1980, pp. 290-295 and 381-418). They must use to attach to endothelial cells in order to be able to migrate from the circulation to sites of ongoing inflammation. In addition, they must attach to antigen-containing cells in order for a normal specific immune response to occur, and finally they must attach to appropriate target cells for lysis in virus-infected cells or tumor cells.

««

• · «I• · «I

.·: ·. Vastikään tällaisten kiinnittymisien välitykseen osallistuvia valkosolupintamole- .···. kyylejä tunnistettiin käyttäen hybridoomateknologiaa. Suppeasti ottaen, tunnis- tettiin ihmisen T-solujen vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita (Davignon, D., et ai,. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 78 (1981) 4535 - 4539) sekä hiiren pernasoluja (Springer, T., et ai.. Eur.J.Immunol. 9 (1979) 301 - 306), jotka sitoutuivat valko- solupintoihin ja inhiboivat edellä kuvattuja kiinnitysliitteisiä funktioita (Springer, T., et ai.. Fed. Proc. 44 (1985) 2660 - 2663). Näiden vasta-aineiden tunnistamat « « " .···. molekyylit nimitettiin Mac-1:ksi ja imusolufunktioliitteiseksi antigeeniksi 1 • · · . *. (LFA-1). Mac-1 on heterodimeeri, jota esiintyy syöjäsolu-, jyvässolupinnoilla sekä suurien jyväsimusolujen pinnoilla. LFA-1 on heterodimeeri, jota esiintyy • · *; useimmilla imusoluilla (Springer, T.A. et ai.. Immunol.Rev. 68 (1982) 111 - 135).. ·: ·. Recently, white blood cell surface molecules involved in the transmission of such attachments. villi were identified using hybridoma technology. Briefly, monoclonal antibodies to human T cells (Davignon, D., et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 78: 4535-4539 (1981)) and mouse spleen cells (Springer, T.) were identified. , et al., Eur. J. Immunol. 9 (1979) 301-306) which bound to white cell surfaces and inhibited the attachment functions described above (Springer, T., et al., Fed. Proc. 44 (1985) 2660). - 2663). The molecules recognized by these antibodies were referred to as Mac-1 and lymphocyte function-associated antigen 1 · · ·. *. (LFA-1). Mac-1 is a heterodimer that occurs on cancer cell, granule cell surfaces, and large LFA-1 is a heterodimer present in most lymphocytes (Springer, TA et al., Immunol. Rev. 68: 111-135 (1982)).

: Nämä kaksi molekyyliä, sekä kolmas molekyyli, p150,95 (jonka kudosjakauma on samankaltainen kuin Mac-1 :n), osallistuvat solukiinnittymiseen (Keizer, G., et ai.. Eur.J.Immunol. 15 (19851 1142-1147).: These two molecules, as well as the third molecule, p150.95 (having a tissue distribution similar to that of Mac-1), are involved in cell attachment (Keizer, G., et al. Eur. J. Immunol. 15 (19851 1142-1147)). .

2 1074512 107451

Edellä kuvattujen valkosolumolekyylien todettiin kuuluvan sukulaisglykoproteii-nien ryhmään (Sanchez-Madrid, F. et ai.. J.Exper.Med. 158 (1983) 1785 - 1803; Keizer, G.D. et ai.. Eur.J.Immunol. 15 (1985Ί 1142 -1147). Tämä glykoproteiini-ryhmä koostuu heterodimeereistä, joissa on yksi alfa-ketjuja yksi beeta-ketju. Vaikka näiden antigeenien alfa-ketjut poikkeavat toisistaan, beeta-ketju todettiin erittäin säilyväksi (Sanchez-Madrid, F., et ai.. J.Exper.Med. 158 (1983) 1785 -1803). Glykoproteiiniryhmän (jota toisinaan kutsutaan “CD18:ksi”) beeta-ketjun molekyylipainoksi todettiin 95 kd:tä, kun taas alfa-ketjujen todettiin vaihtelevan 150 kd:stä 180 kd:hen (Springer, T.. Ted.Proc. 44 (1985) 2660-2663). Vaikka membraaniproteiinien alfa-alayksiköt eivät jää beeta-yksiköiden keskinäistä laajaa homologiaa, analysoimalla tarkasti glykoproteiinien alfa-alayksiköitä on ilmennyt, että niiden välillä on huomattavia yhtäläisyyksiä. Katsauksia LFA-1-sukuisten glykoproteiinien alfa- ja beeta-alayksiköiden samankaltaisuuksista esittävät Sanchez-Madrid, F., et ai.. (J.Exper. Med. 158 (1983) 586 - 602; J.Exper.Med 158 (1983) 1785 - 1803.The white blood cell molecules described above were found to belong to the family of related glycoproteins (Sanchez-Madrid, F. et al., J.Exper.Med. 158: 1785-1803 (1983); Keizer, GD et al., Eur. J. Immunol. 15 (1985) This group of glycoproteins consists of heterodimers with one alpha chain and one beta chain, although the alpha chains of these antigens differ, the beta chain was found to be highly conserved (Sanchez-Madrid, F., et al. 15: 1785-1803 (1983). The beta chain of the glycoprotein group (sometimes called "CD18") was found to have a molecular weight of 95 kd, while alpha chains ranged from 150 kd to 180 kd: (Springer, T .. Ted.Proc. 44 (1985) 2660-2663) Although alpha subunits of membrane proteins do not remain broadly homologous to the beta units, close analysis of the alpha subunits of glycoproteins has shown that there is considerable similarity between them. Reviews of LFA-1-related glycopr for similarities in alpha and beta subunits of proteinins, see Sanchez-Madrid, F., et al. (J.Exper. Med. 158: 586-602 (1983); J.Exper.Med 158, 1785-1803 (1983).

On tunnistettu ryhmä yksilöitä, jotka eivät kykene ilmentämään normaaleja määriä mitään tämän kiinnikeproteiiniryhmän jäsentä valkosolujensa solupinnoilla (Anderson, D.C. et ai.. Fed.Proc. 44 (1985) 2671 -2677: Anderson, D.C.. et ai.. J.Infect.Dis. 152 (1985) 668 - 689). Näiden potilaiden imusolut osoittivat in vitro samankaltaisia puutteita, kuin normaalit kanssahenkilöt, joiden LFA-1-ryhmä-.···. molekyylejä vastustivat vasta-aineet. Edelleen nämä yksilöt eivät kyenneet tuottamaan normaalia immuunivastetta, koska heidän solunsa eivät kyenneet • » kiinnittymään solusubstraatteihin (Anderson, D.C. et ai.. Fed.Proc. 44 (1985) 2671 - 2677; Anderson, D.C. et ai.. J.Infect.Dis. 152 (19851 668 - 6891. Nämä * · » tiedot osoittavat, että immuunireaktiot heikentyvät, kun imusolut eivät kykene kiinnittymään normaalilla tavalla LFA-1-ryhmän funktionaalisten kiinnikemole-.···. kyylien puuttumisen johdosta.A group of individuals have been identified who are unable to express normal amounts of any member of this adhesive protein group on the cell surfaces of their white blood cells (Anderson, DC et al. Fed. Proc. 44 (1985) 2671-2677: Anderson, DC. Et al. J.Infect.Dis 152: 668-689 (1985). The lymphocytes of these patients showed similar deficiencies in vitro to those of normal subjects with the LFA-1 group. ···. molecules were opposed by antibodies. Further, these individuals were unable to produce a normal immune response because their cells were unable to attach to cellular substrates (Anderson, DC et al., Fed. Proc. 44 (1985) 2671-2677; Anderson, DC et al., J.Infect.Dis 152 (19851 668-6891) These * · »data indicate that immune responses are impaired when lymphocytes are unable to attach normally due to the lack of functional LFA-1 moieties.

• · • · · Täten yhteenvetona, imusolujen kyky ylläpitää eläimen terveyttä ja elinkelpoisuutta edellyttää, että imusolut kykenevät kiinnittymään toisiin soluihin (kuten i V endoteelisoluihin). Tämän kiinnittymisen on todettu edellyttävän solu-solukon- V·: takteja, joihin liittyy spesifisiä reseptorimolekyylejä, joita esiintyy imusolujen solupinnoilla. Nämä reseptorit mahdollistavat imusolun kiinnittymisen muihin 3 107451 imusoluin tai endoteelisoluihin ja muihin ei-verisuonisoluihin. Solupinnan resep-torimolekyylit on todettu toisiaan hyvin likeisesti muistuttavaksi. Henkilöt, joiden imusoluilta puuttuvat nämä solupintareseptorimolekyylit, potevat kroonisia ja toistuvia tulehduksia, sekä muita kliinisiä oireita, mukaan lukien puutteelliset vasta-ainevasteet.Thus, in summary, the ability of lymphocytes to maintain animal health and viability requires that lymphocytes be able to attach to other cells (such as endothelial cells). This attachment has been found to require cell-to-cell V? -Cases involving specific receptor molecules found on the cell surfaces of lymphocytes. These receptors allow the lymphocyte to attach to other 3,107,451 lymphocytes or endothelial cells and other non-vascular cells. Cell surface receptor molecules have been found to be very similar to each other. Persons whose lymphocytes lack these cell surface receptor molecules suffer from chronic and recurrent inflammation and other clinical symptoms, including defective antibody responses.

Koska imusolukiinnittyminen liittyy prosessiin, jolla vieraskudos tunnistetaan ja hylätään, tämän prosessin ymmärtämisellä on huomattava merkitys elinsiirtojen, kudossiirtojen, yliherkkyyden ja kasvainopin aloilla.Because lymphocyte attachment is involved in the process of recognizing and rejecting foreign tissue, understanding this process is of considerable importance in the fields of transplantation, tissue transplantation, hypersensitivity, and tumor science.

Keksintö käsittää siis menetelmän ICAM-1 :n saamiseksi oleellisesti puhtaassa muodossa, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että se a) valmistetaan rekombinantti-DNA-molekyyli, joka kykenee koodaamaan ihmisen ICAM-1 :n funktionaalisesti aktiivisen molekyylin tai sen funktio-naalisesti aktiivisen johdannaisen, b) transformoidaan isäntäsolu mainitulla rekombinantti-DNA-molekyylillä, c) viljellään isäntäsolu olosuhteissa, jotka sallivat mainitun ICAM-1 :n tai sen funktionaalisesti aktiivisen johdannaisen ilmentämisen, ja d) eristetään ICAM-1 tai sen funktionaalinen johdannainen puhtaana, jok.a .; ·., sisältää ainakin yhden seuraavista polypeptideistä: (a) -V-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; (b) -X-G-S-V-L-V-T-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; :Y: (c) -L-L-G-l-E-T-P-L; (d) -F-L-T-V-Y-X-T; (e) -V-E-L-A-P-L-P; (f) -E-L-D-L-R-P-Q-G-L-E-L-F-E; (g) -L-N-P-T-V-T-Y-G-X-D-S-F-S-A-K; . \ (h) -S-F-P-A-P-N-V; 0) -l-r-g-e-k-e-i_; O') -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P; : ‘ ; (k) -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E; (l) -P-R-G-G-S; (m) -P-G-N-N-R-K; 4 107451 (n) -Q-E-D-S-Q-P-M; (o) -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S; (p) -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S; ja (q) -D-L-R-P-Q-G-L-E.The invention thus comprises a method of obtaining ICAM-1 in substantially pure form, characterized by: a) preparing a recombinant DNA molecule capable of encoding a functionally active molecule of ICAM-1 or a functionally active derivative thereof, b) transforming the host cell with said recombinant DNA molecule; c) culturing the host cell under conditions that permit expression of said ICAM-1 or a functionally active derivative thereof; and d) isolating ICAM-1 or a functional derivative thereof, pure; Contains at least one of the following polypeptides: (a) -V-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; (b) -X-G-S-V-L-V-T-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; Y: (c) -L-L-G-1-E-T-P-L; (d) -F-L-T-V-Y-X-T; (e) -V-E-L-A-P-L-P; (f) -E-L-D-L-R-P-Q-G-L-E-L-F-E; (g) -L-N-P-T-V-T-Y-G-X-D-S-F-S-A-K; . \ (h) -S-F-P-A-P-N-V; 0) -l-r-g-e-k-e-i_; O ') -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P; : '; (k) -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E; (l) -P-R-G-G-S; (m) -P-G-N-N-R-K; 4,107,451 (n) -Q-E-D-S-Q-P-M; (o) -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S; (p) -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S; and (q) -D-L-R-P-Q-G-L-E.

Kuviossa 1 esitetään diagrammin muodossa normaalin solun ja solun, jolta LFA-1 puuttuu, välinen kiinnittyminen.Figure 1 is a graph showing the attachment between a normal cell and a cell lacking LFA-1.

Kuviossa 2 esitetään diagrammina normaali/normaalisolukiinnitysprosessi.Figure 2 is a diagram showing the normal / normal cell attachment process.

Kuviossa 3 esitetään soluaggregaation kinetiikkaa 50 ng:n/ml PMA:ta puuttuessa (X) tai läsnäollessa (O).Figure 3 shows the kinetics of cell aggregation in the absence (X) or in the presence (50) of 50 ng / ml PMA.

Kuviossa 4 esitetään LFA-1-ja LFA-1+-solujen koaggregaatio. EBV:llä transformoituja soluja (104), jotka oli leimattu karboksifluoreseiinidiase-taatilla, kuvion mukaisesti, sekoitettiin 105 kpkseen ei-leimattuja autologisia soluja (umpinaiset pylväät) ja JY-soluja (avoimen pylväät) PMA:n läsnäollessa. 1,5 tunnin kuluttua leimatut solut, aggregaateissa tai vapaina, laskettiin käyttäen esimerkin 2 kvalitatiivista määritystä. Leimattujen solujen prosentuaalinen osuus aggregaateissa on merkitty. Esitetään yksi edustava koe kahdes- .···. ta suoritetusta.Figure 4 shows the coagulation of LFA-1 and LFA-1 + cells. EBV-transformed cells (104) labeled with carboxyfluorescein diacetate, as shown, were mixed with 105 kPa of unlabeled autologous cells (solid columns) and JY cells (open columns) in the presence of PMA. After 1.5 hours, labeled cells, in aggregates or free, were counted using the qualitative assay of Example 2. The percentage of labeled cells in the aggregates is indicated. One representative experiment is presented in duplicate ···. or accomplished.

• · ·• · ·

Kuviossa 5 esitetään ICAM-1 :n ja LFA-1 :n immuunisaostus JY-soIuista. JY- • · » soluista Triton X-100 lysaatteja (vyöhykkeet 1 ja 2) tai verrokki-lyysipuskuria (vyöhykkeet 3 ja 4) immuunisaostettiin vasta-aineel-la, joka kykenee sitoutumaan ICAM-1 :een (vyöhykkeet 1 ja 3), tai .···. vasta-aineilla, jotka kykenevät sitoutumaan LFA-1 :een (vyöhyk- • t · . *. keet 2 ja 4). Paneelissa A on esitetty tulokset pelkistävissä olo- • · · suhteissa; paneelissa B on esitetty tulokset, jotka saatiin ei-pelkis- • · T* tävissä olosuhteissa. Molekyylipainostandardit ajettiin vyöhyk- : *.: keessä S.Figure 5 shows the immunoprecipitation of ICAM-1 and LFA-1 from JY cells. Triton X-100 lysates (lanes 1 and 2) or control-lysis buffer (lanes 3 and 4) from JY cells were immunoprecipitated with antibody capable of binding to ICAM-1 (lanes 1 and 3), or . ···. antibodies capable of binding to LFA-1 (zones ·. *. tests 2 and 4). Panel A shows the results under reducing conditions; panel B shows the results obtained under non-reducing conditions. Molecular weight standards were run in zone: *: at S.

• · · • · 5 107451• · · • · 5 107451

Kuviossa 6 esitetään IL-1-ja gamma-interferonivaikutuksien ICAM-1-ilmen-nykseen ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluilla kinetiikkaa. Ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x 104 solua/0,32 cm2/kuoppa. IL-1 :tä (10 U/ml, umpinaiset ympyrät) tai yhdistelmä-gamma-interferonia (10 U/ml, avoimet neliöt) lisättiin, minkä jälkeen merkittynä ajankohtana määritysseos jäähdytettiin 4°C:seen ja suoritettiin epäsuoran sitoutumisen määritys Standardipoikkeama ei ylittänyt 10 %:ia.Figure 6 shows the kinetics of IL-1 and interferon-gamma effects on ICAM-1 expression in human skin connective tissue-forming cells. Human skin connective tissue formation cells were grown to a density of 8 x 10 4 cells / 0.32 cm 2 / well. IL-1 (10 U / ml, solid circles) or recombinant gamma interferon (10 U / ml, open squares) were added, followed by cooling of the assay mixture to 4 ° C at the indicated time and assay for indirect binding. 10%.

Kuviossa 7 esitetään IL-1- ja gamma-interferonivaikutuksien ICAM-1 :een pitoisuusriippuvuus. Ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x 104 solua/09,32 cm2/kuoppa. IL-2:ta (avoimet ympyrät), yhdistelmä-humaani-IL-1:tä (avoimet neliöt), yhdistelmä-hiiri-IL-1 :tä (umpinaiset neliöt), yhdistelmä-humaani-gamma-interferonia (umpinaiset ympyrät) ja yhdistelmä-beetainterferonia (avoimet kolmiot) lisättiin merkittynä laimennoksena ja seoksia inkuboitiin 4 tunnin ajan (IL-1) tai 16 tunnin ajan (beeta-ja gamma-interferoni). Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja nelinkertaisista määrityksistä; standardipoikkeama ei ylittänyt 10 %:ia.Figure 7 shows the concentration dependence of the effects of IL-1 and interferon gamma on ICAM-1. Human skin connective tissue formation cells were grown to a density of 8 x 10 4 cells / 09.32 cm 2 / well. IL-2 (open circles), recombinant human IL-1 (open squares), recombinant mouse IL-1 (solid squares), recombinant human gamma-interferon (closed circles), and recombinant beta interferon (open triangles) was added as a marked dilution and the mixtures were incubated for 4 hours (IL-1) or 16 hours (interferon beta and gamma). The results shown are the average of four times the assays; the standard deviation did not exceed 10%.

. :'. Kuviossa 8 esitetään ICAM-1 -cDNA:n nukleotidi- ja aminohapposekvenssi.. : '. Figure 8 shows the nucleotide and amino acid sequence of the ICAM-1 cDNA.

.··*. Ensimmäinen ATG on asemassa 58. Translatoidut sekvenssit, jotka vastaavat ICAM-1-trypsiinipeptidejä, on alleviivattu. Hydrofo-binen oletettu signaalipeptidi ja vastaavasti transmembraanisek-venssit on alleviivattu voimakkaasti. N-kytkentäglykosylaatiokoh- __ · dat on merkitty laatikkoon. Polyadenylaatiosignaali AATAAA ase-massa 2976 on merkitty yläpuolisella viivalla. HL-60-cDNA-kloo-nin sekvenssi on esitetty. Endoteelisolu-cDNA sekventoitiin lähes koko pituudeltaan ja siinä esiintyi vain vähäisiä poikkeamia.. ·· *. The first ATG is at position 58. The translated sequences corresponding to the ICAM-1 trypsin peptides are underlined. The hydrophobic putative signal peptide and transmembrane sequences, respectively, are strongly underlined. The N-linked glycosylation sites are marked in a box. The polyadenylation signal AATAAA at station mass 2976 is indicated by the above line. The sequence of the HL-60 cDNA clone is shown. The endothelial cell cDNA was sequenced over almost its entire length and exhibited only minor variations.

• · · IM · • ·• · · IM · • ·

Kuviossa 9 esitetään ICAM-1-homologia-alueet ja suhde immunoglobuliini- • · · • » » > ·* supergeeniryhmään. (A) 5 homologisen alueen rinnakkainasetus (Dl-5). Kaksi rinnakkain asettunutta jäännöstä tai useampi rinnakkain asettunut jäännös on merkitty laatikolla. Jäännökset, jotka 6 107451 olivat säilyneet kaksi kertaa tai useamman kerran NCAM-alueilla, sekä jäännökset, jotka olivat säilyneet C2- ja C1-sarja-alueilla, asetettiin ICAM-1:n sisäisten toistojen rinnalle. Ennakoitujen bee-ta-säikeiden sijainti ICAM-1-alueella on merkitty tankoviivoin ja pienillä kirjaimilla rinnakkainasetuksen päällä, ja beetasäikeiden tunnettu sijainti immunoglobuliini-C-alueilla on merkitty tankovii-voilla ja rinnakkainasetuksen alapuolisin suurin kirjaimin. Oletetun disuifidisilian asema ICAM-1-alueella on merkitty SS. (B-D) Prote-iinialueiden, jotka ovat ICAM-1-alueisiin nähden homologisia, rinnakkainasettelu; proteiinit asetettiin alustavasti rinnakkain suorittamalla haku NBRF-tietokannoissa FASTP-ohjelmaa käyttäen. Proteiinisekvenssit ovat MAG, NCAM, T-soIureseptori-alfa-alayk-sikkö-V-alue, IgM-myy-ketju ja alfa-1-B-glykoproteiini.Figure 9 shows regions of ICAM-1 homology and relationship to immunoglobulin supergene group. (A) Parallel alignment of 5 homologous regions (D1-5). Two or more co-located residues are indicated by a box. Residues that had remained 6,745,451 twice or more in the NCAM regions, and residues that had remained in the C2 and C1 series, were placed alongside the internal repeats of ICAM-1. The position of the predicted beta strands in the ICAM-1 region is indicated by the bar lines and small letters above the alignment, and the known position of the beta strands in the immunoglobulin C regions is indicated by the bar lines and upper case letters below the alignment. The position of the putative disulfide silicon in the ICAM-1 region is designated SS. (B-D) Alignment of protein regions homologous to ICAM-1 regions; proteins were provisionally aligned by searching NBRF databases using the FASTP program. Protein sequences include MAG, NCAM, T cell receptor alpha subunit V region, IgM my chain and alpha 1-B glycoprotein.

Kuviossa 10 on esitetty diagrammina ICAM-1 :n ja MAG:n sekundaarirakentei-den vertailu.Figure 10 is a diagrammatic comparison of ICAM-1 and MAG secondary structures.

Kuviossa 11 esitetään LFA-1 -positiivisia EBV-transformoituja B-varhaisimu-solusoluja, jotka sitoutuvat !CAM-1:een tasomembraaneissa.Figure 11 shows LFA-1-positive EBV-transformed B-early lymphocyte cells that bind to? CAM-1 on planar membranes.

Kuviossa 12 esitetään LFA-1 -positiivisia T-varhaisimusoluja ja T-lymfomasolu-ja sitoutumassa ICAM-1 :een muoviin sidotuissa rakkuloissa.Figure 12 shows LFA-1 positive T-early lymphocytes and T-lymphoma cells and binds to ICAM-1 in plastic-bound vesicles.

Kuviossa 13 esitetään JY-B-varhaisimusolun sitoutumisen ICAM-1 :een estymi-nen muoviin sidotuissa rakkuloissa esikäsiteltäessä solut tai rak- • · e kulat monoklonaalisilla vasta-aineilla.Figure 13 shows the inhibition of JY-B early lymphocyte binding to ICAM-1 in plastic-bound vesicles by pretreatment of cells or vesicles with monoclonal antibodies.

• ·• ·

Kuviossa 14 esitetään lämpötilan vaikutus T-varhaisimusolujen sitoutumiseen • · · . *. ICAM-1 :een muoviin sidotuissa rakkuloissa.Figure 14 shows the effect of temperature on the binding of T early neurons • · ·. *. ICAM-1 in plastic-bound blisters.

• · · • ♦ · • · · · ··» • · • ·• · · • ♦ · • · · ··· »• · • ·

Kuviossa 15 esitetään kaksivalenssisten kationien tarve T-varhaisimusolujen * .* sitoutumiselle ICAM-1 :een muoviin sidotuissa rakkuloissa.Figure 15 shows the need for divalent cations for the binding of early T cells *. * To ICAM-1 in plastic-bound vesicles.

• « 7 107451• «7 107451

Kuviossa 16 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena T-soluliitteisen antigeenin OKT3 tunnistukseen. ΌΚΤ3" merkitsee antigeenin lisäystä.Figure 16 shows the effect of anti-attachment antibodies on the ability of peripheral blood mononuclear cells to proliferate in response to recognition of the T cell-associated antigen OKT3. ΌΚΤ3 "represents the addition of antigen.

Kuviossa 17 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena ei-spesifisen T-solu-mitogeenin, konkavalliini-A:n, tunnistukseen. "CONA" merkitsee konkanavalliini-A:n lisäystä.Figure 17 shows the effect of anti-attachment antibodies on the ability of peripheral blood mononuclear cells to proliferate in response to the recognition of the non-specific T-cell mitogen, concavallin A. "CONA" means an increase in concanavallin A.

Kuviossa 18 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena avaimenreikä-malja-kotilohemosyaniiniantigeenin tunnistukseen. Avaimenreikämalja-kotilohemosyaniinin lisäys soluihin on merkitty "KLH".Figure 18 shows the effect of anchorage inhibiting antibodies on the ability of peripheral blood mononuclear cells to proliferate in response to the recognition of a keyhole-plate-cochlea-haemocyanin antigen. The addition of the keyhole cotyledon salmonocyanin to the cells is labeled "KLH".

Kuviossa 19 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena jäykkäkouristustoksoi-diantigeenin tunnistukseen. Jäykkäkouristustoksoidiantigeenin lisäys soluihin on merkitty "AGN".Figure 19 shows the effect of anchorage inhibiting antibodies on the ability of peripheral blood mononuclear cells to proliferate in response to tetanus toxoid antigen recognition. Addition of tetanus toxoid antigen to cells is designated "AGN".

Kuviossa 20 on esitetty monoklonaalisten vasta-aineiden RR1/1, R6.5, LB2 ja . ···. CL203 sitoutuminen ICAM-1 -deleetiomutantteihin.Figure 20 shows the monoclonal antibodies RR1 / 1, R6.5, LB2 and. ···. Binding of CL203 to ICAM-1 deletion mutants.

Kuviossa 21 esitetään ICAM-l-deieetiomutanttien sitoutuminen LFA-1:een.Figure 21 shows the binding of ICAM-1 deletion mutants to LFA-1.

• mm • « · • · m • · · ~ ·• mm • «· • · m • · · ~ ·

Kuviossa 22 esitetään ICAM-1-vastaisten monoklonaalisten vastaaineiden RRI/1, R6.5, LB2 ja CL203 tunnistamat epitoopit.Figure 22 shows the epitopes recognized by the monoclonal antibodies against ICAM-1 RRI / 1, R6.5, LB2 and CL203.

• · · • · • · » . Kuviossa 23 esitetään ICAM-1-alue-2-mutanttien sitoutumiskapasiteetti • · · :;i.: LFA-1 :een.• · · • · • »». Figure 23 shows the binding capacity of ICAM-1 region-2 mutants to LFA-1.

• » • · • · · : V Kuviossa 24 esitetään ICAM-1-alue-3-mutanttien sitoutumiskapasiteetti • · :«*‘i LFA-1 :een.Figure 24 shows the binding capacity of ICAM-1 region-3 mutants to LFA-1.

8 1074518 107451

Kuviossa 25 esitetään ICAM-1-alue-1-mutanttien sitoutumiskapasiteetti LFA-1:een.Figure 25 shows the binding capacity of ICAM-1 region-1 mutants to LFA-1.

Kuviossa 26 esitetään ICAM-aminopää-alueiden rinnakkaisasetus.Figure 26 shows a parallel alignment of the ICAM amino-terminal regions.

Keksinnössä käytettyä luontaista sitoutumisligandia kutsutaan nimellä "solujen välinen kiinnikemolekyyli-Γ tai "ICAM-1". ICAM-1 on 76 - 97 kd:n glykoproteiini. ICAM-1- ei ole heterodimeeri. ICAM-1 :n "funktionaalinen johdannainen" on yhdiste, jolla on biologista aktiivisuutta (joko funktionaalista tai rakenteellista), joka on oleellisesti samanlaista kuin !CAM-1:n biologinen aktiivisuus. Ilmaisun "funktionaaliset johdannaiset" piiriin tarkoitetaan kuuluviksi molekyylin "fragmentit", "variantit", "analogit" tai "kemialliset johdannaiset". Molekyylin, kuten ICAM-1:n, "fragmentilla" tarkoitetaan molekyylien mitä tahansa polypeptidialaryhmää. Erityisen edullisia ovat ICAM-1 :n fragmentit, joilla on ICAM-1-aktiivisuutta ja jotka ovat liukoisia (eli eivät ole sidottuja membraaniin). Molekyylin, kuten ICAM-1 :n, "variantilla" tarkoitetaan molekyyliä, joka on rakenteeltaan ja funktioltaan oleellisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen fragmentti. Molekyylin sanotaan olevan "oleellisesti samanlainen" kuin jokin toinen molekyyli, jos kyseisten kahden molekyylin rakenteet ovat oleellisesti samanlaiset tai jos kum-mailakin molekyylillä on samanlainen biologinen aktiivisuus. Täten edellyttäen, että kahdella molekyylillä on samanlainen aktiivisuus, niitä pidetään toistensa .' ‘ . variantteina ilmaisun tässä käytetyssä merkityksessä silloinkin, jos yhden mole- kyyleistä rakennetta ei esiinny toisessa, tai jos aminohappojäännössekvenssit eivät ole identtiset. Molekyylin kuten ICAM-1 :n "analogilla" tarkoitetaan molekyy-liä, joka on funktioltaan oleellisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen fragmentti. Tässä käytettynä molekyyliä kutsutaan toisen molekyylin "kemialli-seksi johdannaiseksi", jos se sisältää ylimääräisiä kemiallisia ryhmiä, jotka eivät .***. normaalisti kuulu molekyyliin. Tällaiset ryhmät voivat parantaa molekyylin liukoi- • · ♦ . \ suutta, imeytymistä, biologista puoliintumisikää jne. Ryhmät voivat vaihtoehtoi- • · « sesti alentaa molekyylin myrkyllisyyttä, poistaa tai heikentää molekyylin mahdol- • · *** lista epätoivottavaa sivuvaikutusta jne. Tällaisia vaikutuksia tuottamaan kykene- • * · • .* viä ryhmä julkistetaan käsikirjassa Remington's Pharmaceutical Sciences. 1980.The native binding ligand used in the invention is called "intercellular adhesion molecule Γ or" ICAM-1. ICAM-1 is a 76-97 kd glycoprotein. ICAM-1 is not a heterodimer. The "functional derivative" of ICAM-1 is a compound having a biological activity (either functional or structural) substantially similar to that of CAM-1. The term "functional derivatives" is intended to include "fragments", "variants", "analogs" or "chemical derivatives" of the molecule. A "fragment" of a molecule such as ICAM-1 is intended to mean any polypeptide subgroup of molecules. Particularly preferred are fragments of ICAM-1 which have ICAM-1 activity and are soluble (i.e., not bound to the membrane). , such as ICAM-1, means a molecule that is substantially similar in structure and function to either the entire molecule or a fragment thereof. an "substantially similar" to another molecule if the two molecules have substantially similar structures or if both molecules have similar biological activity. Thus, provided that the two molecules have similar activity, they are considered to be one another. ' '. as variants in the sense used herein, even if the molecular structure of one does not exist in the other, or if the amino acid residue sequences are not identical. By "analog" of a molecule such as ICAM-1 is meant a molecule that has substantially the same function as either the entire molecule or a fragment thereof. As used herein, a molecule is called a "chemical derivative" of another molecule if it contains additional chemical groups that do not. ***. normally included in the molecule. Such groups can enhance the solubility of the molecule. The group may alternatively reduce the toxicity of the molecule, eliminate or diminish the potential unwanted side effects of the molecule, etc. The group capable of producing such effects • * ***. published in Remington's Pharmaceutical Sciences. 1980.

• · :· *: "Toksiinijohdannais’-molekyylit muodostavat "kemiallisten johdannaisten" eri tyisluokan. "Toksiinijohdannais"-molekyyli on molekyyli (kuten ICAM-1 tai vasta- 107451 g aine), joka sisältää toksiiniryhmän. Tällaisen molekyylin sitoutuminen soluun tuo toksiiniryhmän lähelle solua ja edistää siten solun kuolemista. Voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa toksiiniryhmää; kuitenkin edullisesti käytetään sellaisia toksiineja kuten esimerkiksi risiinitoksiini, difteriatoksiini, radioisotooppitoksiinit, membraaniväylän muodostavat toksiinit jne. Menettelyitä tällaisten ryhmien kytkemiseksi molekyyliin tunnetaan alalla hyvin.• ·: · *: "Toxin derivative" molecules form a different class of "chemical derivatives." A "toxin derivative" molecule is a molecule (such as ICAM-1 or antibody 107451 g) that contains a toxin group. The binding of such a molecule to a cell brings the toxin group close. Any suitable group of toxins may be used, however, toxins such as, for example, ricin toxin, diphtheria toxin, radioisotopic toxins, membrane pathway toxins, etc. Procedures for linking such groups to a molecule are well known in the art.

Antigeenimolekyylit kuten ICAM-1 tai LFA-1-ryhmämolekyylit ilmentyvät luontaisesti imusolujen pinnalla. Täten jos tällaisia soluja viedään sopivaan eläimeen, esimerkiksi vatsaonteloon ruiskuttamalla jne., seurauksena on vasta-aineiden muodostuminen, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1 :een tai LFA-1-ryhmämo-lekyyleihin. Haluttaessa tällaisesta eläimestä voidaan ottaa seerumia ja käyttää sitä lähteenä polyklonaalisten vasta-aineiden saamiseksi, jotka kykenevät sitoutumaan näihin molekyyleihin. Edullisesti kuitenkin tällaisista eläimistä otetaan pernasoluja, jotka fuusioidaan myeloomasolulinjaan, minkä jälkeen näiden fuusiosolujen annetaan muodostaa hybridoomasolu, joka erittää monoklonaali-sia vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1 :een tai johonkin LFA-1-ryhmämolekyyliin.Antigenic molecules such as ICAM-1 or LFA-1 moieties are naturally expressed on the surface of lymphocytes. Thus, if such cells are introduced into a suitable animal, e.g., by intraperitoneal injection, etc., the formation of antibodies capable of binding to ICAM-1 or LFA-1 group molecules will result. If desired, serum from such an animal may be taken and used as a source for obtaining polyclonal antibodies capable of binding to these molecules. Preferably, however, such animals receive spleen cells which are fused to a myeloma cell line, after which these fusion cells are allowed to form a hybridoma cell that secretes monoclonal antibodies capable of binding to ICAM-1 or one of the LFA-1 group molecules.

t;... Edellä kuvatun mukaisesti saadut hybridoomasolut voidaan seuloa erilaisilla « . ’: ·; menetelmillä haluttujen hybridoomasolujen tunnistamiseksi, jotka erittävät vasta- ainetta, joka kykenee sitoutumaan joko ICAM-1 :een tai johonkin LFA-1-ryhmä- < · · .;..: molekyyliin. Edullisessa seulontamäärityksessä tällaiset molekyylit tunnistetaan niiden kyvystä inhiboida Epstein-Barrin viruksella transformoitujen solujen agg-regaatiota. Vasta-aineet, jotka kykenevät inhiboimaan tällaista aggregaatiota, seulotaan sitten edelleen sen määrittämiseksi, inhiboivatko ne mainittua aggre- ·;··: gaatiota sitoutumalla ICAM-1 :een vai LFA-1 -ryhmämolekyyliin. Tällaisessa seu- lonnassa voidaan käyttää mitä tahansa keinoa ICAM-1 :n erottamiseksi LFA-1- • « · . ryhmämolekyyleistä. Täten esimerkiksi vasta-aineen sitomaa antigeeniä voidaant; ... Hybridoma cells obtained as described above can be screened for different «. ': ·; methods for identifying desired hybridoma cells that secrete an antibody capable of binding either to ICAM-1 or to an LFA-1 group. In a preferred screening assay, such molecules are identified for their ability to inhibit the aggregation of cells transformed with Epstein-Barr virus. Antibodies capable of inhibiting such aggregation are then further screened to determine whether they inhibit said aggregation by binding to ICAM-1 or LFA-1 group molecule. In such screening, any means of separating ICAM-1 from LFA-1 can be used. ryhmämolekyyleistä. Thus, for example, antibody-bound antigen can be

• I I• I I

analysoida esimerkiksi immuunisaostamalla ja polyakryyliamidigeelielektrofo- • · reettisesti. Jos sidottu antigeeni kuuluu LFA-1 -ryhmämolekyyleihin, immuuni- • » · : ·' seostettu antigeeni todetaan dimeeriksi, kun taas jos sitoutunut antigeeni on » · · *· ICAM-1, vain yksi molekyylipainolaji on immuunisaostunut. Vaihtoehtoisesti on mahdollista erottaa ne vasta-aineet, jotka sitoutuvat LFA-1-ryhmämolekyyleihin, 10 107451 niistä, jotka sitoutuvat ICAM-1:een, seulomalla vasta-aineen kyvyn suhteen sitoutua sellaisiin soluihin, kuten jyvässolut, jotka ilmentävät LFA-1:n, mutta eivät ICAM-1 :tä. Vasta-aineen Qonka tiedetään inhiboivan solu-aggregaatiota) kyky sitoutua jyvässoluihin merkitsee, että vasta-aine kykenee sitoutumaan LFA-1 :een. Tällaisen sitoutumisen puuttuminen merkitsee vasta-ainetta, joka tunnistaa ICAM-1 :n. Vasta-aineen kyky sitoutua soluun kuten jyvässoluun voidaan todeta alan keskimääräistenkin taitajien tavanomaisesti käyttämin keinoin. Tällaisia keinoja ovat immuunimääritykset, solu-agglutinaatio, suodatinsitoutu-mistutkimukset, vasta-ainesaostus jne.for example, immunoprecipitation and polyacrylamide gel electrophoretically. If the bound antigen is a member of the LFA-1 group molecules, the immune antigen is detected as a dimer, whereas if the bound antigen is · · · * · ICAM-1, only one molecular weight species is immunoprecipitated. Alternatively, it is possible to discriminate between antibodies that bind to LFA-1 moiety molecules, 10 10 7451 from those that bind to ICAM-1 by screening the antibody for its ability to bind to cells such as granular cells expressing LFA-1, but not ICAM-1. The ability of antibody Qonka to inhibit cell aggregation) to bind to granule cells means that the antibody is capable of binding to LFA-1. The absence of such binding represents an antibody that recognizes ICAM-1. The ability of an antibody to bind to a cell, such as a granular cell, can be ascertained by conventional means well known to those of ordinary skill in the art. Such means include immunoassays, cellular agglutination, filter binding assays, antibody precipitation, etc.

Mainitut aggregaatio-vastaiset vasta-aineet voidaan vaihtoehtoisesti tunnistaa mittaamalla niiden kyky sitoutua differentiaalisesti soluihin, jotka ilmentävät ICAM-1:n (kuten aktivoituihin endoteelisoluihin), ja niiden kyvyttömyys sitoutua soluihin, jotka eivät ilmennä ICAM-1 :tä. Alan keskimääräisetkin taitajat havainnevat vaikeuksitta, että edeltäviä määrityksiä voidaan modifioida, tai ne voidaan suorittaa erilaisessa keskinäisessä järjestyksessä, jolloin saadaan lukuisia erilaisia mahdollisia seulontamäärityksiä, joista kullakin kyetään tunnistamaan tai erottamaan toisistaan ICAM-1 :een LFA-1 -ryhmämolekyylin asemesta sitoutumaan kykeneviä vasta-aineita.Alternatively, said anti-aggregation antibodies can be identified by measuring their ability to differentially bind to cells expressing ICAM-1 (such as activated endothelial cells) and their inability to bind to cells that do not express ICAM-1. It will be readily apparent to those of ordinary skill in the art that the preceding assays may be modified or carried out in a different order, resulting in a number of different possible screening assays, each capable of identifying or distinguishing between ICA-1 and LFA-1 group molecules. .

«I « I«I« I

Esillä olevan keksinnön mukaan saadut tulehdusvastaiset aineet voidaan saada .···. luontaisilla prosesseilla (kuten esimerkiksi indusoimalla eläin, kasvi, sieni, bak- « I · teeri, jne., tuottamaan ICAM-1 :n ei-immunoglobuliini-antagonistia, tai indusoi-maila eläin tuottamaan polyklonaalisia vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutu-maan ICAM-1 :een); synteettisillä menetelmillä (kuten esimerkiksi käyttäen •The anti-inflammatory agents obtained according to the present invention may be obtained. by natural processes (such as inducing an animal, plant, fungus, bacterium, etc., to produce a non-immunoglobulin antagonist of ICAM-1, or inducing an animal to produce polyclonal antibodies capable of binding ICAM-1); synthetic methods (such as using •

Merrifield-menetelmää polypeptidien syntetisoimiseksi ICAM-1 :n, ICAM-1 :n funktionaalisten johdannaisten tai ICAM-1 :n proteiini-antagonistien Qoko immu- .···. noglobuliini- tai ei-immunoglobuliini-) edelleen syntetisoimiseksi; hybridoomatek- 1«· . *. nologisesti (kuten esimerkiksi ICAM-T.een sitoutumaan kykenevien monoklo- • · · • * * '.‘λ* naalisten vasta-aineiden tuottamiseksi); tai yhdistelmä-DNA-teknisesti (kuten • · V esimerkiksi esillä olevan keksinnön mukaisten tulehdusvastaisten aineiden • · · : V tuottamiseksi erilaisissa isännissä (eli hiivassa, bakteereissa, sienissä, nisäkäs- * · V*: soluviljelmissä jne.) tai yhdistelmäplasmidi- tai virusvektoreista. Käytettävän menetelmän valinta riippuu sellaisista tekijöistä kuten kätevyys, haluttu saanto, „ 107451 jne. Välttämättä ei tarvitse käyttää vain yhtä edellä kuvattua menetelmää, prosessia tai tekniikkaa nimenomaisen tulehdusvastaisen aineen tuottamiseksi; edellä kuvattuja prosesseja, menetelmiä ja tekniikoita voidaan yhdistää jonkin nimenomaisen tulehdusvastaisen aineen saamiseksi.Merrifield Method for the Synthesis of Polypeptides by Qoko Immunization of ICAM-1, Functional Derivatives of ICAM-1 or ICAM-1 Protein Antagonists. noglobulin or non-immunoglobulin) for further synthesis; hybridomaek- 1 «·. *. biologically (such as for the production of monoclonal antibodies capable of binding to ICAM-T.?). or by recombinant DNA technology (such as · · V, for example, to produce anti-inflammatory agents of the present invention in various hosts (i.e., yeast, bacteria, fungi, mammalian * · V * in cell cultures, etc.) or recombinant plasmid or viral vectors The choice of method used will depend on factors such as convenience, desired yield, " 107,451, etc. It is not necessary to use only one of the methods, processes or techniques described above to produce a particular antiinflammatory agent;

A. LFA-1:n sitoutumisoarin flCAM-1) tunnistus 1. LFA-1-riippuvaisen aggregaation määrityksiäA. Identification of the LFA-1 Binding Oral FlCAM-1) 1. Assays for LFA-1-Dependent Aggregation

Monet Epstein-Barr-viruksella transformoidut solut osoittavat aggregaatiota.Many cells transformed with Epstein-Barr virus show aggregation.

Tätä aggregaatiota voidaan tehostaa forboliesterien läsnäololla. Tällaisen homo-tyyppisen aggregaation (eli aggregaation, johon liittyy vain yksi solutyyppi) todettiin salpautuvan LFA-1-vastaisilla vasta-ainella (Rothlein, R., et ai., J.Exper.Med. 163 (1986) 1132-1149), joka viite sisällytetään tähän viitteeksi. Täten LFA-1-riippuvaisen sitoutumisen laajuus voidaan määrittää määrittämällä spontaanin tai forboliesteririippuvaisen aggregaattimuodostuksen laajuus.This aggregation can be enhanced by the presence of phorbol esters. Such homo-type aggregation (i.e., aggregation involving only one cell type) was found to be blocked by anti-LFA-1 antibody (Rothlein, R., et al., J.Exper.Med. 163: 1132-1149 (1986)), which reference is incorporated herein by reference. Thus, the extent of LFA-1-dependent binding can be determined by determining the extent of spontaneous or phorbol ester-dependent aggregate formation.

LFA-1-riippuvaista aggregaatiota häiritsevä aine voidaan tunnistaa käyttämällä määritystä, jolla kyetään määrittämään, häiritseekö aine Epstein-Barr-viruksella «. transformoitujen solujen spontaania vai forboliesteririippuvaista aggregaatiota.An agent that interferes with LFA-1-dependent aggregation can be identified using an assay that can determine whether the agent interferes with Epstein-Barr virus. spontaneous or phorbol ester-dependent aggregation of transformed cells.

Tällaisessa määrityksessä voidaan käyttää useimpia Epstein-Barr-virus-trans- .«·. formoituja soluja, kunhan solut kykenevät ilmentämään LFA-1-reseptorimole- • · kyylin. Tällaisia soluja voidaan valmistaa Springerin, T.A., et ai., J.Exper.Med.Most of the Epstein-Barr virus trans- can be used in such an assay. formed cells as long as the cells are capable of expressing the LFA-1 receptor molecule. Such cells can be prepared by Springer, T.A., et al., J.Exper.Med.

160 (1984) 1901 -1918, joka viite sisällytetään tähän viitteeksi, tekniikalla. Vaik- « · · ka mitä tahansa tällaista solua voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukai- • · · . · sessa LFA-1-riippuvaisen sitoutumisen määrityksessä, edullisesti käytetään JY-solulinjasoluja (Terhosi, C.T., et ai., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 73 (1976) 910).160: 1901-1918 (1984), the disclosure of which is incorporated herein by reference. However, any such cell may be used in accordance with the present invention. In the LFA-1-dependent binding assay, JY cell line cells are preferably used (Terhosi, C.T., et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 73: 910 (1976)).

• · .··*. Soluja voidaan inkuboida missä tahansa sopivassa kasvualustassa; kuitenkin . \ edullisimmin soluja viljellään RPM11640 -kasvualustassa, jota on täydennetty • « · 10 %:lla vasikansikiöseerumia ja 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä (Gibco • ·• ·. ·· *. Cells may be incubated in any suitable medium; however. Most preferably, cells are cultured in RPM11640 medium supplemented with 10% calf fetal serum and 50 micrograms / ml gentamycin (Gibco)

Laboratories, NY). Soluja tulisi viljellä olosuhteissa, jotka sopivat nisäkässolu- : V lisäännytykseen (eli yleensä 37°C:n lämpötilassa, ilmakehässä, jossa on 5 % • · \*\: C02:ta, 95 %:n suhteellisessa ilman kosteudessa jne.).Laboratories, NY). Cells should be cultured under conditions suitable for mammalian cell proliferation (i.e., generally at 37 ° C, 5% · · * *: CO 2, 95% relative humidity, etc.).

12 107451 2. LFA-1 sitoutuu ICAM-1:een12 107451 2. LFA-1 binds to ICAM-1

On tunnistettu henkilöitä, joiden imusoluista puuttuu LFA-1 reseptorimolekyyli-ryhmä (Anderson, D.C., et ai.. Fed.Proc. 44 (1985) 2671 - 2677; Anderson, D.C., et ai.. J.Infect.Dis. 152 (1985) 668 - 689). Tällaisten yksilöiden sanotaan kärsivän valkosolukiinnitysvajauksesta (LAD). Tällaisten yksilöiden EBV-trans-formoidut solut eivät kykene aggregoitumaan, eivät spontaanisti eivätkä forboli-esterien läsnäollessa edellä kuvatussa aggregaatiomäärityksessä. Kun tällaisia soluja sekoitetaan LFA-1 :n ilmentäviin soluihin, todettiin aggregaatio (Rothlein, R., et ai.. J.Exper.Med. 163 (1986) 1132 -1149) (kuvio 1). Merkittävää on, että näitä aggregaatteja ei muodostunut, jos näitä soluja inkuboitiin LFA-1-vastaisten vasta-aineiden läsnäollessa. Täten vaikka aggregaatio edellytti LFA-1 :tä, LFA-1 -vajaiden solujen kyky muodostaa aggregaatteja LFA-1-pitoisten solujen kanssa osoitti, että LFA-1: n sitoutumispari ei ole LFA-1, vaan paremminkin aiemmin tuntemattomaksi jäänyt solukiinnikemolekyyli. Kuviossa 1 esitetään solukiinnit-tymisen mekanismi.Individuals whose lymphocytes lack the LFA-1 receptor molecule group have been identified (Anderson, DC, et al., Fed. Proc. 44, 2671-2677 (1985); Anderson, DC, et al., J.Infect.Dis. 152 ( 1985) 668-689). Such individuals are said to suffer from white cell attachment deficiency (LAD). EBV-transformed cells of such individuals are unable to aggregate, neither spontaneously nor in the presence of phorbol esters in the aggregation assay described above. When such cells were mixed with LFA-1 expressing cells, aggregation was observed (Rothlein, R., et al., J.Exper.Med. 163: 1132-1149 (1986)) (Figure 1). Significantly, these aggregates were not formed if these cells were incubated in the presence of anti-LFA-1 antibodies. Thus, although aggregation required LFA-1, the ability of LFA-1-deficient cells to form aggregates with LFA-1-containing cells indicated that the LFA-1 binding pair was not LFA-1 but rather a previously unknown cell adhesion molecule. Figure 1 shows the mechanism of cell attachment.

B. Solujen välinen kiinnikemolekvvli-1 (ICAM-1) >. Uusi solujen välinen kiinnikemolekyyli ICAM-1 tunnistettiin ja osittain karakteri- I I · 4 ]·:·. soitiin ensin Rothleinin, R.. et ai.. J.lmmunol. 137 (1986) 1270 -1274, joka viite ,···, sisällytetään tähän viitteeksi, menettelyn mukaan. ICAM-1-molekyylin toteami- seksi valmistettiin monoklonaalisia vasta-aineita hiirien pernasoluista, kun hiiriä oli immunoitu soluilla, jotka olivat peräisin yksilöistä, joiden LFA-1-ilmennys oli geneettisesti puutteellinen. Saadut vasta-aineet seulottiin niiden kyvyn suhteen inhiboida LFA-1 :n ilmentävien solujen aggregaatiota (kuvio 2). Yksityiskohtaises- ti ottaen, ICAM-1-molekyylin toteamiseksi hiiriä immunoitiin EBV-transformoi- .···. duilla B-soluilla, jotka oli saatu LAD-potilaista, jotka eivät ilmennä LFA-1-anti- ··· . ·. geeniä. Näistä eläimistä poistettiin sitten pernasolut, jotka fuusioitiin myelooma- • · · soluihin ja annettiin monoklonaalisia vasta-aineita tuottavien hybridoomasolujen t · *:*' muodostua. EBV-transformoituja B-soluja, jotka olivat peräisin normaaleista : yksilöistä, jotka ilmentävät LFA-1 :n, inkuboitiin sitten hybridoomasolun tuotta- • · man monoklonaalisen vasta-aineen läsnäollessa mahdollisen monoklonaalisen vasta-aineen tunnistamiseksi, joka kykenisi inhiboimaan EBV-transformoitujen 13 107451 B-solujen forboliesterivälitteisen, LFA-1-riippuvaisen spontaanin aggregaation. Koska hybridoomasolut saatiin soluista, jotka eivät olleet koskaan "tutustuneet" LFA-1-antigeeniin, LFA-1 :n vastaista monoklonaalista vasta-ainetta ei muodostunut. Täten mikä tahansa vasta-aine, jonka todetaan inhiboivan aggregaatiota, kykenee välttämättä sitoutumaan antigeeniin, joka vaikkakaan ei ole LFA-1 osallistuu LFA-1-kiinnitysprosessiin. Vaikka voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää tällaisten monoklonaalisten vasta-aineiden saamiseksi, edullisesti ICAM-1 :een sitoutuvia monoklonaalisia vasta-aineita hankitaan immunoimalla BALB/c-hiiriä käyttäen teitä ja aikatauluja, joita kuvaavat Rothlein, R., et ai. fj.lmmunol. 137 (1986) 1270 -1274), Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ääreisveren yksitumasolujen kanssa, jotka ovat peräisin yksilöistä, joilta puuttuu LFA-1. Tällaisia soluja julkistavat Springer, T.A., et ai. (J.Exper.Med. 160 (1984) 1901 -1918).B. Intercellular Adhesive Molecule-1 (ICAM-1)>. A novel intercellular adhesion molecule, ICAM-1, was identified and partially characterized. was first synthesized by Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986), which reference, ···, is incorporated herein by reference. To detect ICAM-1, monoclonal antibodies were prepared from mouse spleen cells after immunization with cells derived from individuals with genetically deficient LFA-1 expression. The resulting antibodies were screened for their ability to inhibit LFA-1-expressing cell aggregation (Figure 2). In detail, mice were immunized with EBV-transformed to detect ICAM-1. ···. two B cells obtained from LAD patients not expressing LFA-1 anti- ···. ·. gene. These animals were then removed from splenocytes, which were fused to myeloma cells and allowed to form t · *: * 'hybridoma cells producing monoclonal antibodies. EBV-transformed B cells from normal: individuals expressing LFA-1 were then incubated in the presence of a hybridoma cell-produced monoclonal antibody to identify a potential monoclonal antibody capable of inhibiting EBV-transformed B-cell phorbol ester-mediated, LFA-1-dependent spontaneous aggregation. Because the hybridoma cells were obtained from cells that had never "familiarized" with the LFA-1 antigen, no monoclonal antibody against LFA-1 was formed. Thus, any antibody that is found to inhibit aggregation may necessarily be capable of binding to an antigen that, although not LFA-1, is involved in the LFA-1 attachment process. Although any method can be used to obtain such monoclonal antibodies, preferably ICAM-1 binding monoclonal antibodies are obtained by immunizing BALB / c mice using the routes and schedules described by Rothlein, R., et al. fj.lmmunol. 137: 1270-1274 (1986)) with peripheral blood mononuclear cells transformed with Epstein-Barr virus from individuals lacking LFA-1. Such cells are disclosed by Springer, T.A., et al. (J.Exper.Med. 160 (1984) 1901-1918).

Edullisessa menetelmässä vasta-aineiden muodostamiseksi ja toteamiseksi, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1 :een, hiiriä immunoidaan joko EBV-trans-formoiduilla B-soluilla, jotka ilmentävät sekä ICAM-1 :n että LFA-1 :n, tai edullisemmin TNF-aktivoiduilla endoteelisoluilla, jotka ilmentävät ICAM-1 :n mutta eivät LFA-1 :tä. Edullisimmassa menetelmässä hybridoomasolujen muodostami-seksi, jotka tuottavat ICAM-1-vastaisia vasta-aineita, BALB/c-hiiri immunoitiin toisiaan seuraten JY-soluilia sekä differentioiduilla U937-soluilla (ATCC CRL-,···. 1593). Tällaisista eläimistä poistetaan pernasolut, jotka fuusioidaan myelooma- soluihin, ja annetaan vasta-ainetta tuottavien hybridoomasolujen muodostua. Vasta-aineet seulotaan niiden kyvyn suhteen inhiboida EBV-transformoidun • · solulinjan LFA-1-riippuvaista, forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, kuten JY- solujen, jotka ilmentävät sekä LFA-1-reseptorin että ICAM-1 :n. Kuten esittäneetIn a preferred method of generating and detecting antibodies capable of binding to ICAM-1, mice are immunized with either EBV-transformed B cells expressing both ICAM-1 and LFA-1, or more preferably, TNF-activated endothelial cells expressing ICAM-1 but not LFA-1. In the most preferred method of generating hybridoma cells that produce antibodies to ICAM-1, BALB / c mice were immunized sequentially with JY cells and with differentiated U937 cells (ATCC CRL, ···. 1593). Such animals remove spleen cells which are fused to myeloma cells and allow the production of antibody-producing hybridoma cells. Antibodies are screened for their ability to inhibit LFA-1-dependent, pholester ester-induced aggregation of the EBV-transformed cell line, such as JY cells expressing both LFA-1 receptor and ICAM-1. As suggested

Rothlein, R., et ai.. (J.lmmunol. 137 (1987) 1270 -1274), tällaista aggregaatiota .··. inhiboimaan kykeneviä vasta-aineita testataan sitten niiden kyvyn suhteen inhi- • · · . boida jonkin solulinjan forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, kuten SKW3:n • « * (Dustin, M., et ai.. J.Exoer.Med. 165 (1987) 672 - 692), jonka kykyä spontaanisti « · « * T aggregoitua forboliesterin läsnäollessa inhiboi vasta-aine, joka kykenee sitoutu- « · 1 : V maan LFA-1 :een, mutta eivät inhiboi ICAM-1-vastaiset vasta-aineet. Vasta-Rothlein, R., et al. (J. Immunol. 137: 1270-1277 (1987)). antibodies capable of inhibiting are then tested for their ability to inhibit • · ·. to stimulate pholester ester-induced aggregation of a cell line, such as SKW3 (Dustin, M., et al., J.Exoer.Med. 165: 672-692 (1987)), whose ability to spontaneously aggregate pholester ester in the presence of an antibody capable of binding to LFA-1 but not inhibiting anti-ICAM-1 antibodies. Only-

• I• I

aineet, jotka kykenevät inhiboimaan solujen kuten JY-solujen forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, mutta eivät kykene inhiboimaan solujen kuten SKW3- 14 107451 solujen forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, ovat todennäköisesti ICAM-1-vastaisia vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti vasta-aineet, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1:een, voidaan tunnistaa seulomalla vasta-aineiden suhteen, jotka kykenevät inhiboimaan LFA-1-riippuvaisen aggregaation LFA:n ilmentävissä soluissa (kuten JY-soluissa), mutta eivät kykene sitoutumaan soluihin, jotka ilmentävät LFA-1 :n mutta vain vähän tai ei lainkaan ICAM-1:tä (kuten normaalit jyvässolut) tai kykenevät sitoutumaan soluihin, jotka ilmentävät ICAM-1 :n mutta eivät LFA-1 :tä (kuten TNF-aktivoidut endoteelisolut). Toinen vaihtoehto on immuunisaostus soluista, jotka ilmentävät ICAM-1 :n, LFA-1 :n tai molemmat käyttäen vasta-aineita, jotka inhiboivat solujen, kuten JY-solujen, LFA-1-riippuvaista aggregaatiota, jolloin SDS-PAGE:lla tai vastaavalla menetelmällä määritetään vastaaineen saostaman molekyylin joitakin molekyyliominaisuuksia. Jos ominaisuus on sama kuin ICAM-1 :n vastaava, vasta-aine voidaan olettaa ICAM-1-vastaiseksi vasta-aineeksi.agents capable of inhibiting phorbol ester-induced aggregation of cells such as JY cells but unable to inhibit phorbol ester-induced aggregation of cells such as SKW3-14 107451 are likely anti-ICAM-1 antibodies. Alternatively, antibodies capable of binding to ICAM-1 may be identified by screening for antibodies that are capable of inhibiting LFA-1-dependent aggregation in LFA-expressing cells (such as JY cells) but unable to bind to cells that express LFA-1 but little or no ICAM-1 (such as normal granule cells) or are capable of binding to cells expressing ICAM-1 but not LFA-1 (such as TNF-activated endothelial cells). Another alternative is immunoprecipitation of cells expressing ICAM-1, LFA-1, or both using antibodies that inhibit LFA-1-dependent aggregation of cells such as JY cells, with SDS-PAGE or the like. The method determines some of the molecular properties of an antibody precipitated by an antibody. If the property is the same as that of ICAM-1, the antibody can be assumed to be an antibody to ICAM-1.

Käyttäen edellä kuvatulla tavalla valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita ICAM-1 -solupintamolekyyli puhdistettiin ja karakterisoitiin. ICAM-1 puhdistettiin ihmissoluista ja -kudoksesta käyttäen monoklonaalivasta-aine-affiniteetti-kroma-tografiaa. Tällaisessa menetelmässä ICAM-1 :n kanssa reagoiva monoklonaali-•, nen vasta-aine kytketään inerttiin kolonnimatriisiin. Tällaisen kytkennän saarni- seksi voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää; kuitenkin edullisesti käytetään « · « ,···, Oettgenin, H.C., et ai.. J.Biol.Chem. 259 (1984) 12034, menetelmää. Kun solu- • · lysaatti käytetään matriisin läpi, läsnä olevat ICAM-1-molekyylit adsorboituvat ja • « jäävät matriisiin. Muuttamalla kolonnin pH:ta tai ionipitoisuutta sitoutuneet • · · .··*. ICAM-1-molekyylit voidaan eluoida kolonnista. Vaikka mitä tahansa sopivaa • · · matriisia voidaan käyttää, edullisesti matriisimateriaalina käytetään Sepharose-geeliä (Pharmacia). Kolonnimatriisien muodostaminen ja niiden käyttö proteiinin • · .···. puhdistamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja.Using the monoclonal antibodies prepared as described above, the ICAM-1 cell surface molecule was purified and characterized. ICAM-1 was purified from human cells and tissue using monoclonal antibody affinity chromatography. In such a method, the monoclonal antibody reacting with ICAM-1 is coupled to an inert column matrix. Any method to prime such a coupling may be employed; however, it is preferred to use «·«, ···, Oettgen, H.C., et al. 259: 12034 (1984). When the cell lysate is applied through the matrix, the ICAM-1 molecules present are adsorbed and remain in the matrix. By changing the pH or ion concentration of the column, the bound · · ·. ·· *. ICAM-1 molecules can be eluted from the column. Although any suitable matrix may be used, preferably the matrix material is Sepharose gel (Pharmacia). Formation of Column Matrices and Their Use in Protein • ·. ···. for purification are well known in the art.

«·· • · • « ·«·· • · •« ·

Alan keskimääräistenkin taitajien hallitsemalla tavalla edellä kuvattuja määrityk- **:·’ siä voidaan käyttää yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka kykenevät heikentämään « * · : tai inhiboimaan solukiinnittymisen nopeutta tai laajuutta.In a manner well known to those of ordinary skill in the art, the assays described above may be used to identify compounds which are capable of attenuating or inhibiting the rate or extent of cell attachment.

• · « · · • · « w 15 107451 ICAM-l on solupintaglykoproteiini, joka ilmentyy ei-verta-muodostavi 11 a soluilla, kuten verisuonten endoteelisolut, kateenkorva-epiteelisolut, tietyt muut epiteelisolut ja sidekudosmuodostussolut, ja vertamuodostavilla soluilla kuten kudossyöjäsolut, mitogeenistimuloidut T-imusolu-emosolut, ja imusolmukkeen itukeskus-B-solut ja hermosolun tuojahaarakeso-luilla risoissa, imusolmukkeissa ja Peyerin imusolmukkeissa. ICAM-1 ilmentyy voimakkaasti verisuonen endoteelisoluilla T-solu-alueilla imusolmukkeissa ja risoissa, jotka osoittavat reaktiivista liikakasvua. ICAM-1 ilmentyy alhaisina määrinä ääreisveren imusoluissa. Joidenkin myelomonosyyttisolulinjojen forboliesteri-stimuloitu differentiaatio lisää voimakkaasti ICAM-l-ilmennystä. Täten ICAM-1 ilmentyy ensisijaisesti tulehduskohdissa, eikä ilmenny yleensä "hiljaisissa" soluissa. ICAM-1-ilmennys ihon sidekudosmuodostussoluilla kasvaa kolminkertaisesta viisinkertaiseksi sekä interleukiini-I:n että gamma-interferonin vaikutuksesta tasoilla 10 U/ml neljän ja vastaavasti 10 tunnin aikana. Induktio riippuu proteiini- ja mRNA-synteesistä ja on takautuva.ICAM-1 is a cell surface glycoprotein expressed on non-blood forming 11a cells such as vascular endothelial cells, thymus epithelial cells, certain other epithelial cells and connective tissue forming cells, and blood-forming cells such as T cells. lymphocyte stem cells, and lymph node germinal B cells, and nerve importing branch cells in the tonsils, lymph nodes, and Peyer's lymph nodes. ICAM-1 is strongly expressed on vascular endothelial cells in T cell regions in lymph nodes and in the tonsils, which show reactive hyperplasia. ICAM-1 is expressed in low levels in peripheral blood lymphocytes. Forbol ester-stimulated differentiation of some myelomonocyte cell lines strongly increases ICAM-1 expression. Thus, ICAM-1 is primarily expressed at sites of inflammation and is not generally expressed in "silent" cells. ICAM-1 expression on dermal connective tissue-forming cells increases from 3-fold to 5-fold with both interleukin-I and interferon-gamma at levels of 10 U / ml over four and 10 hours, respectively. Induction depends on protein and mRNA synthesis and is retroactive.

ICAM-1 osoittaa molekyylipainoheterogeniaa eri solutyypeissä, • < jolloin molekyylipaino on 97 kd:tä sidekudosmuodostussoluilla, « * · ‘ 114 kd:tä myel omonosyyttisolul in jal la U937, ja 90 kd:tä B- ·...·’ varhaisimusolul la JY. ICAM-l:n biosynteesiin on todettu liittyvän noin 73 kd:n solunsisäisen prekursorin. Tunikamysii-:V: nillä (joka inhiboi glykosylaatiota) käsittelemällä saatavan ei-N-glykosyloidun muodon molekyylipaino on 55 kd:tä.ICAM-1 demonstrates molecular weight heterogeneity in different cell types, with a molecular weight of 97 kd on connective tissue-forming cells, * * · ′ 114 kd on myelocytosis cells and λ la U937, and 90 kd on B- · ... · ′ in early cell JY . An approximately 73 kd intracellular precursor has been found to be involved in the biosynthesis of ICAM-1. The non-N-glycosylated form obtained by treatment with tunicamycin V (which inhibits glycosylation) has a molecular weight of 55 kd.

••

Forboliesterillä stimuloiduista U937-soluista tai sidekudos- * · · M muodostussoluista eristetyn ICAM-1:n pääasiallinen tuote on • · · • « · sama ja sen molekyylipaino on 60 kd:tä kemiallisen deglykosy- • · ·.· · laation jälkeen. ICAM-1-monoklonaalivasta-aineet häiritsevät fytohemagglutiniini-emosolujen kiinnittymistä solui in joihin, .·[·. joilta puuttuu LFA-1. Esikäsittelemällä sidekudosmuodostusso- • · · ] \ luja, mutta ei imusoluja, monoklonaalisilla vasta-aineilla, 16 107451 jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1:een, estetään imusolusi dekudosmuodostussolukiinnittyminen. Esikäsittel emä1lä imusoluja, mutta ei sidekudosmuodostussoluja, LFA-l-vastaisi1 la vasta-aineilla on todettu niinikään saatavan imusolu-sidekudos-muodostussolukiinnittymisen inhibitio.The major product of ICAM-1 isolated from phorbol ester-stimulated U937 cells or connective tissue * * · M formation cells is the same and has a molecular weight of 60 kd after chemical deglycosylation. ICAM-1 monoclonal antibodies interfere with the adherence of parental phytohemagglutinin cells to the cells, which. lacking LFA-1. By pre-treating connective tissue-forming cells, but not lymphocytes, with monoclonal antibodies, 16,107,451, which are capable of binding to ICAM-1, the lymphocytes are prevented from attaching to the tissue. Pretreatment of lymphocytes, but not connective tissue-forming cells, with anti-LFA-1 antibodies has also been found to result in inhibition of lymphocyte-tissue-forming cell attachment.

ICAM-1 on täten CD18-kompleksin sitoutumisligandi valkosoluilla. Se on indusoitavissa sidekudosmuodostussoluilla ja endotee-lisoluilla in vitro tulehdusvälittäji11ä kuten IL-l:llä, gamma-interferonilla ja kasvainnekroositekijäilä aikavälillä, joka sopii imusolujen suodattumiseen tulehdusvauriokohtiin in vivo (Dustin, M.L., et ai ,, J. Immunol 137 (1986) 245 - 254; Prober, J.S., et ai ., J.Immunol. 137 (1986) 1893 - 1896). Edelleen ICAM-1 ilmentyy ei-vertamuodostavi11 a soluilla, kuten verisuonten endoteelisolui1la, kateenkorvan epiteelisoluilla, muilla epiteelisoluilla ja sidekudosmuodostussolui11 a ja vertamuodostavi11 a soluilla kuten kudossyöjäsolui 11 a, mitogeenistimuloidui11 a T-imusolu-emosoluilla ja imusolmukkeen itukeskus-B-solui11 a ja hermosolun tuojahaarakesolui11 a risoissa, imusolmukkeissa ja Peyerin imusolmukkeissa (Dustin, M.L., et ai . . J. Immunol. 137 (1986) 245 - 254). ICAM-1 ilmentyy keratinosyyteillä hyvänlaatuisissa tulehdusvaurioissa kuten yliherkkyysihottuma, ihon jäkälätauti, tulehdustautiin liittyvä v ihottuma, nokkosrokko ja rakkulasairaus. Allergisissa ihoreaktioissa, jotka oli aiheutettu sivelemällä potilaan iholle hapteenia, jolle tämä on yliherkkä, ilmeni myös voimakas • · ;1j1. ICAM-1-ilmennys keratinosyytei 11 ä. Toisaalta myrkylliset iholaastarit iholla eivät aikaansaaneet ICAM-l-ilmennystä keratinosyyteil lä. ICAM-l:tä esiintyy keratinosyytei 11 ä, jotka ♦ · · on saatu kudosnäytteistä, jotka ovat peräisin erilaisiin • · · \ 1 ihohäiriötiloihin liittyvistä ihovaurioista, ja ICAM-ilmennys • · · indusoituu yliherkkyyslaastarikoevaurioissa, kun taas : keratinosyytit myrkkylaastarikoevaurioissa eivät ilmentäneet ICAM-1:tä.ICAM-1 is thus a binding ligand of the CD18 complex in leukocytes. It is inducible by connective tissue-forming cells and endothelial cells in vitro as inflammatory mediators such as IL-1, interferon gamma, and tumor necrosis factors, over a period suitable for infiltration of lymphocytes into inflammatory lesions in vivo (Dustin, ML, et al., J. Immunol. 254; Prober, J. S., et al., J. Immunol. 137 (1986) 1893-1896). Further, ICAM-1 is expressed on non-haematopoietic cells such as vascular endothelial cells, thymus epithelial cells, other epithelial cells, and connective tissue cells such as tissue alveoli, lymph nodes and Peyer's lymph nodes (Dustin, ML, et al., J. Immunol. 137: 245-254 (1986)). ICAM-1 is expressed on keratinocytes in benign inflammatory lesions such as hypersensitivity, lichen skin, inflammatory skin rash, urticaria and vesicular disease. Allergic skin reactions caused by the application of hapten to the patient's skin, to which he is hypersensitive, also showed severe • ·; ICAM-1 expression on keratinocytes. On the other hand, toxic dermal patches on the skin did not induce ICAM-1 expression on keratinocytes. ICAM-1 is present in 11 keratinocytes derived from tissue samples derived from skin lesions associated with various skin disorders, and ICAM expression • · · is induced in hypersensitivity patch test lesions, while: keratinocytes are non-toxic 1.

• · · i 1 t • 1 « 17 107451 ICAM-1 on täten solusubstraatti, johon imusolut voivat kiinnittyä, jolloin imusolut voivat migroitua tulehduskohtiin ja/tai suorittaa erilaisia efektorifunktioita, jotka myötävaikuttavat tähän tulehdukseen. Tällaisia funktioita ovat vasta-ainetuotanto, viruksen tartuttamien kohdesolujen lyysi jne. Tässä käytettynä ilmaisulla "tulehdus” tarkoitetaan sekä spesifisen että ei-spesifisen puolustusjärjestelmän reaktioita. Tässä käytettynä ilmaisulla "spesifinen puolustusjärjestelmä" tarkoitetaan immuunijärjestelmän osaa, joka reagoi spesifisten antigeenien läsnäoloon. Tulehduksen sanotaan olevan seurausta spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, jos tulehduksen aiheuttaa, tai sitä välittää, tai siihen liittyy spesifisen puolustusjärjestelmän reaktio. Esimerkkejä tulehduksesta, joka on seurausta spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, ovat vaste antigeeneille, kuten rubella-virukselle, autoimmuunisairaudet, viivästyneen tyypin T-soluvälitteinen yliherkkyysvaste (kuten esimerkiksi yksilöillä, joiden Mantaux-koe on "positiivinen"), jne.ICAM-1 is thus a cell substrate to which lymphocytes can attach, allowing lymphocytes to migrate to sites of inflammation and / or perform various effector functions that contribute to this inflammation. Such functions include antibody production, lysis of virus-infected target cells, etc. As used herein, the term "inflammation" refers to reactions of both a specific and a non-specific defense system. specific defense system response, if the inflammation is caused, mediated, or is accompanied by a specific defense system response. Examples of inflammation resulting from a specific defense system response are antigens such as rubella virus, autoimmune diseases, delayed-type T cell mediated , which have a "positive" Mantaux test), etc.

"Ei-spesifinen puolustusjärjestelmäreaktio" on vaste, jota välittävät valkosolut, joilta puuttuu immunologinen muisti.A "non-specific defense system response" is a response mediated by white blood cells lacking immunological memory.

< * " Tällaisia soluja ovat jyvässolut ja syöjäsolut. Tässä 1 käytettynä tulehduksen sanotaan olevan seurausta ei-spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, jos tulehduksen aiheuttaa, sitä välittää tai siihen liittyy ei-spesif isen puol ustus jär-jestelmän reaktio. Esimerkkejä tulehduksesta, jotka ovat ·*·*; ainakin osittain seurausta ei-spesif isen puolustusjärjestelmän reaktiosta, ovat tulehdus, joka liittyy tiloihin kuten: täysi-kasvuisen hengityksen vajaatoiminta (ARDS) tai moniel invauri ot, • · · jotka seuraavat verenmyrkytystä tai ulkoista tapaturmaa; sydän- • · · *. lihaksen tai muun kudoksen reperfuusiovaurio; akuutti munuais- • · : kerästen tulehdus; reaktiivinen niveltulehdus; ihotaudit, »•e joihin liittyy akuutteja tulehduksellisia komponentteja; .·[·. akuutti märkäinen aivokalvontulehdus tai muu keskushermoston • · » ' tulehdustila; lämpövaurio; hemodialyysi; leukafereesi; 18 107451 haavainen paksusuolen tulehdus; Crohnin sairaus; kuoliota aiheuttava suolistotulehdus; jyvässolu-transfuusioon liittyvät oireyhtymät; ja sytokiini-indusoitu myrkyllisyys.<* "Such cells are granule cells and cancer cells. As used herein, inflammation is said to be the result of a response by a non-specific defense system if the inflammation is caused, mediated or accompanied by a reaction by a non-specific defense system. • *; at least in part, the result of a non-specific defense system reaction, is inflammation associated with conditions such as: full-grown respiratory failure (ARDS) or multiple invasion, followed by blood poisoning or external injury; • reperfusion injury to muscle or other tissue; acute kidney • ·: inflammation of collections; reactive arthritis; skin diseases with acute inflammatory components; · [·. acute wet meningitis or other central nervous system inflammation; ; leukapheresis; 18 107451 ulcerative colitis, Crohn's rash; necrosis of the gut; necrosis syndrome associated with granule cell transfusion; and cytokine-induced toxicity.

5 Tämän keksinnön mukaan saatuja funktionaalisia ICAM-1-johdannaisia, ja erityisesti sellaiset johdannaiset, jotka käsittävät ICAM-1 :n fragmentteja tai mutanttivariantteja, joissa on alueet 1, 2 ja 3, voidaan käyttää tällaisten ei-spesifisen puolustusjärjestelmän reaktioiden hoidossa tai terapiassa. Edullisempia tällaiseen hoitoon tai terapiaan ovat ICAM-1-fragmentit tai -mutanttiva-10 riantit, jotka sisältävät ICAM-1 :n alueen 2. Edullisempia tällaiseen hoitoon tai terapiaan oat ICAM-1-fragmentit tai -mutanttivariantit, jotka sisältävät ICAM-1 :n alueen 1.Functional ICAM-1 derivatives obtained according to the present invention, and in particular those comprising ICAM-1 fragments or mutant variants having regions 1, 2 and 3, may be used in the treatment or therapy of such non-specific defense system reactions. More preferred for such treatment or therapy are ICAM-1 fragments or mutant variants containing ICAM-1 region 2. ICAM-1 fragments or mutant variants containing ICAM-1 are more preferred for such treatment or therapy. area 1.

Lisäksi esillä oleva keksintö tarkastelee ICAM-1 :n ja sen funktionaalisten joh-15 dannaisten käyttöä astman hoidossa.The present invention further contemplates the use of ICAM-1 and its functional derivatives in the treatment of asthma.

C. ICAM-1-geenin kloonausta ICAM-1 -geenin kloonaamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa lukuisista me-20 nettelyistä. Yhdessä tällaisessa menetelmässä analysoidaan kuljetinvektorikir-jasto, joka koostuu cDNA-inserteistä (jotka on saatu ICAM-1 :n ilmentävästä solusta), insertin läsnäolon suhteen, joka sisältää ICAM-1-geenin. Tällainen analyysi voidaan suorittaa transfektoimalla soluja vektorilla ja määrittämällä > · [’ sitten ICAM-1-ilmennys. Edullisen menetelmän mukaan tämän geenin kloonaa- 25 miseksi määritetään ICAM-1-molekyylin aminohapposekvenssi. Tämän tehtä- ; · · · e · ; . väri suorittamiseksi ICAM-1-proteiini voidaan puhdistaa ja analysoida I * * I · · automaattisella sekventoijalla. Vaihtoehtoisesti molekyyli voidaan fragmentoida • · syaanibromidilia, tai proteaaseilla kuten papaiinilla, kymotrypsiinillä tai tryp-siinillä (Oike, Y„ et ai.. J.Biol.Chem. 257 (19821 9751 - 9785; Liu, C., et ai..C. Cloning of the ICAM-1 Gene Any of a number of procedures may be used to clone the ICAM-1 gene. In one such method, a vector library of libraries consisting of cDNA inserts (obtained from an ICAM-1 expressing cell) is analyzed for the presence of an insert containing the ICAM-1 gene. Such an analysis can be performed by transfecting cells with a vector and determining> · ['then ICAM-1 expression. According to a preferred method, the amino acid sequence of the ICAM-1 molecule is determined to clone this gene. The task of this; · · · E ·; . to perform coloring, the ICAM-1 protein can be purified and analyzed by an I * * I · · automatic sequencer. Alternatively, the molecule may be fragmented with cyanobromidil, or with proteases such as papain, chymotrypsin or trypsin (Oike, Y. et al., J. Biol. Chem. 257 (19821, 9751-9785; Liu, C., et al.).

• · .···. 30 Int.J.Pept.Protein Res. 21 (1983) 209-215). Vaikka on mahdollista määrittää ICAM-1 :n aminohapposekvenssi kokonai- • · * « · · • · • · · • « • · «· · # » * • t · # · · I I I * • · • · · « · 107451 suudessaan, edullisesti määritetään molekyylin peptidifrag-menttien sekvenssi. Jos peptidit ovat pituudeltaan yli 10 aminohappoa, sekvenssi-informaatio on yleensä riittävä jonkin geenin kuten ICAM-l-geenin kloonaamiseksi.• ·. ···. 30 Int.J.Pept.Protein Res. 21: 209-215 (1983). Although it is possible to determine the amino acid sequence of ICAM-1 in its entirety, 107451 , preferably, the sequence of the peptide fragments of the molecule is determined. If the peptides are more than 10 amino acids in length, the sequence information is generally sufficient to clone a gene such as the ICAM-1 gene.

Aminohappojäännöksien sekvenssi peptidissä merkitään tässä joko käyttämällä niistä yleisesti käytettyä 3-kirjaimista merkintää tai niiden 1-kirjain merkintää. Luettelo näistä 3- ja 1-kirjainmerkinnöistä voidaan etsiä käsikirjoista, kuten Biochemistry, Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY, 1970. Kun tällainen sekvenssi on merkitty pystysuoraan, tarkoitetaan aminopään jäännöksen sijaitsevan luettelossa ylimpänä, ja peptidin karboksyylipään jäännöksen luettelossa alimpana. Vastaavasti kun merkintä on vaakasuorassa, tarkoitetaan aminopään olevan vasemmalla ja karboksyylipään puolestaan oikealla viimeisenä. Peptidin käsittämät aminohappojäännökset voidaan erottaa väliviivoilla. Näiden väliviivojen tarkoitus on yksinomaan selkeyttää sekvenssimerkinnän ulkoasua. Pelkästään havainnollistavana esimerkkinä aminohapposekvenssi, joka on merkitty: -Gly-Ala-Ser-Phe- «i c ( tarkoittaa, että Ala-jäännös on kytketty Gly:n karboksyyliryh- mään, ja että Ser-jäännös on kytketty Ala-jäännöksen karboksyy- li ryhmään ja Phe-jäännöksen aminoryhmään. Merkintä ilmoittaa ' ' edelleen, että aminohapposekvenssi sisältää tetrapeptidin Gly- ·.·.· ALa-Ser-Phe. Merkinnän tarkoitus ei ole rajata aminohapposek- ♦ · · i venssiä tähän yhteen tetrapeptidiin, vaan sen tarkoituksena on käsittää (1) tetrapeptidi, jossa yksi tai useampi aminohappo- j*;*: jäännös on kytketty joko amino- tai karboksyylipäätyyn, (2) • ♦ tetrapeptidi, jossa yksi tai useampi aminohappo jäännös on \ kytketty sekä amino- että karboksyylipäätyyn, (3) tetrapeptidi, * · · :·: ' joka ei käsitä ylimääräisiä aminohappo jäännöksiä.The sequence of the amino acid residues in the peptide is herein designated using either the commonly used 3-letter designation or their 1-letter designation. A list of these 3 and 1 alphanumeric characters can be found in manuals such as Biochemistry, Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY, 1970. When such a sequence is vertically labeled, the amino terminus residue is listed at the top and the carboxyl terminus residue at the bottom. . Similarly, when the marking is horizontal, the amino terminus is to the left and the carboxyl terminus to the right. The amino acid residues contained in the peptide can be separated by dashes. The purpose of these hyphens is solely to clarify the appearance of the sequence designation. By way of illustration only, the amino acid sequence designated: -Gly-Ala-Ser-Phe- (ic means that the Ala residue is linked to the carboxyl group of Gly, and that the Ser residue is linked to the carboxyl group of the Ala residue and the Phe residue, the designation further indicates that the amino acid sequence contains the tetrapeptide Gly- · · · · ALa-Ser-Phe. The purpose of the designation is not to limit the amino acid sequence ♦ · · i to this single tetrapeptide; (1) a tetrapeptide wherein one or more amino acid residues are linked to either the amino or carboxyl terminus, (2) • ♦ tetrapeptide wherein one or more amino acid residues are linked to both the amino and carboxyl terminus, (3) tetrapeptide, * · ·: ·: which does not contain additional amino acid residues.

• · · • · « · • « « :Y: Sitten kun yksi tai useampi sopiva peptidifragmentti on sekventoitu, tarkastellaan niitä koodittamaan kykeneviä DNA- 20 1 0 7 4 51 sekvenssejä. Geneettisen koodin degeneraattiluonteen johdosta jonkin tietyn aminohapon koodittamiseen voidaan käyttää useampaa kuin yhtä kodonia (Watson, Molecular Biology of the Gene, 3. painos, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977 , ss. 356 - 357). Peptidifragmentteja analysoidaan aminohapposekvenssien tunnistamiseksi, joita kykenevät koodittamaan oligonukleo-tidit, joiden degeneraatti-aste on alhaisin. Tämä suoritetaan edullisesti tunnistamalla sekvenssejä, jotka sisältävät aminohappoja, joita koodittaa vain yksi ainoa kodoni. Vaikka toisinaan tällaisia aminohapposekvenssejä voi koodittaa vain yksi oiigonukleotidi, useimmiten aminohapposekvenssin kykenee koodittamaan useampi kuin yksi samankaltaisten oligonukleoti-dien sarjasta. Tärkeätä on, että kun sarjan kaikki jäsenet sisältävät oiigonukleotideja, jotka kykenevät koodittamaan peptidifragmentin, ja täten sisältävät mahdollisesti saman nukleotidisekvenssin kuin geeni, joka koodittaa peptidifrag-menttia, vain yksi sarjan jäsen sisältää nukleotidisekvenssin, joka on identtinen tämän geenin nukleotidisekvenssiin nähden. Koska tämä jäsen esiintyy sarjassa, ja kykenee hybridoitumaan DNAthan jopa sajan muiden jäsenien läsnäollessa, on mahdollista käyttää ei-fraktioitua oiigonukleotidisarjaa samalla tavalla kuin käytettäisiin yksittäistä oligonukleotidia peptidiä koodittavan geenin kloonaamiseksi.Y: Once one or more suitable peptide fragments have been sequenced, DNA sequences capable of encoding them are contemplated. Due to the degenerate nature of the genetic code, more than one codon may be used to encode a particular amino acid (Watson, Molecular Biology of the Gene, 3rd edition, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977, pp. 356-357). Peptide fragments are analyzed to identify amino acid sequences capable of encoding oligonucleotides with the lowest degree of degeneracy. This is preferably accomplished by identifying sequences containing amino acids encoded by a single codon. While such amino acid sequences can sometimes be encoded by only one oligonucleotide, in most cases, the amino acid sequence is capable of being encoded by more than one set of similar oligonucleotides. Importantly, when all members of a set contain oligonucleotides capable of encoding a peptide fragment, and thus possibly contain the same nucleotide sequence as the gene encoding the peptide fragment, only one member of the set contains a nucleotide sequence identical to the nucleotide sequence of this gene. Because this member is in series, and is capable of hybridizing to DNA in the presence of up to one hundred other members, it is possible to use a non-fractionated oligonucleotide sequence in the same way as a single oligonucleotide would be used to clone a gene encoding a peptide.

Edellä kuvattuun nähden täysin analogisesti voidaan käyttää • · oligonukleotidia (tai oi igonukl eotidisar jaa) , jonka nukleoti- ··· *.· · disekvenssi komplementoi oligonukleotidisekvenssiä, tai sek-venssisarjaa, joka kykenee koodittamaan peptidifragmentin.In complete analogy to the above, an oligonucleotide (or oligonucleotide sequence) having a nucleotide sequence ··· * · · · complementing the oligonucleotide sequence, or a sequence sequence capable of encoding a peptide fragment may be used.

• · • · · • · · • · :*·*: Sopiva oi igonukl eotidi , tai sopivia oi igonukl eotidide ja, joka . kykene/jotka kykenevät koodittamaan ICAM-l-geenifragmentin, • · · **!.* (tai joka kykenee kömpiementoimaan tällaista oligonukleotidia, • « *·;·* tai oi igonukl eotidisar jaa) tunnistetaan (käyttäen edellä : : : kuvattua menettelyä), syntetisoidaan ja hybridoidaan alalla *:·*: hyvin tunnettuun tapaan DNA:hän tai edullisemmin cDNA-valmis- 21 107451 teeseen, joka on saatu ihmissoluista, jotka kykenevät ilmentämään ICAM-l-geenisekvenssejä. Nukleiinihappohybridoin-titekniikoita julkistavat Maniatis, T., et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Coldspring Harbor, NY, 1982, ja Haymes, B.D., et al♦. Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985, jotka viitteet liitetään tähän viitteiksi. Käytetty DNA- tai cDNA-lähde on edullisesti rikastettu ICAM-l-sekvenssien suhteen. Tällainen rikastuminen voidaan helpoimmin saada cDNA:sta, joka on saatu uuttamalla RNA soluista, joita on viljelty olosuhteissa, jotka indusoivat ICAM-l-synteesiä (kuten U937, jota kasvatetaan forboliesterin läsnäollessa, jne.).*: *: Suitable o igonucleotide, or suitable o igonucleotide and which. capable of encoding the ICAM-1 gene fragment, · · · **!. (or capable of encoding such an oligonucleotide, • «* ·; · * or oligonucleotide sequence) is identified (using the above procedure:): , is synthesized and hybridized in a manner well known in the art *: · *: to DNA, or more preferably, to cDNA preparation derived from human cells capable of expressing ICAM-1 gene sequences. Nucleic acid hybridization techniques are disclosed in Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Coldspring Harbor, NY, 1982, and Haymes, B.D., et al. Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985, the references of which are incorporated herein by reference. Preferably, the DNA or cDNA source used is enriched for ICAM-1 sequences. Such enrichment can most easily be obtained from cDNA obtained by extraction of RNA from cells cultured under conditions that induce ICAM-1 synthesis (such as U937 grown in the presence of phorbol ester, etc.).

Edellä kuvatuilla tai niiden kaltaisilla tekniikoilla on menestyksekkäästi kyetty kloonaamaan ihmisen aldehydidehydro-genaasigeenejä (Hsu, L.C., et ai. . Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82 (1985) 3771 - 3775), fibronektiinigeeni (Suzuki, S., et ai..Techniques described above or the like have successfully cloned human aldehyde dehydrogenase genes (Hsu, LC, et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82: 3771-3775 (1985)), the fibronectin gene (Suzuki, S., et al.) ..

Eur.J.Mol .Biol.Organ.J. 4 (1985) 2519 - 2524), ihmisen estro-geenireseptorigeeni (Walter, P., et ai ., Proc.Nat1.Acad.Sci.Eur.J.Mol .Biol.Organ.J. 4, 2519-2524 (1985)), the human estrogen receptor gene (Walter, P., et al., Proc.Nat1.Acad.Sci.

USA 82 (1985) 7889 - 7893), kudostyyppi-plasminogeeniaktivaat-torigeeni (Pennica, D., et ai . . Nature 301 (1983) 214 - 221) ja ihmisen istukan alkalisen fosfataasin kömpiementti-DNA (Kam, W., et ai., Proc.Natl.Acad.Sei. USA 82 (1985) 8715 - 8719).USA 82: 7889-7893 (1985), tissue-type plasminogen activator gene (Pennica, D., et al., Nature 301: 214-221 (1983)) and human placental alkaline phosphatase DNA (Kam, W., et al.). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8715-8719 (1985).

.. Edullisen vaihtoehtoisen tavan mukaan ICAM-l-geenin kloonaami- • · · *.* seksi valmistetaan ilmennysvektorikirjasto kloonaamalla DNA tai • · ♦ - *·* * edullisemmin cDNA ICAM-l:n ilmentämään kykenevästä solusta ilmennysvektoriin. Sitten kirjasto seulotaan jäseniensä • · V.: suhteen, jotka kykenevät ilmentämään proteiinin, joka sitoutuu • * · V · ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen, ja jolla on sellainen nuk- : .·. leotidisekvenssi, että se kykenee koodittamaan polypeptidejä, • · · ’♦··. joilla on sama aminohapposekvenssi kuin ICAM-l:llä tai ICAM-1- « · fragmenteilla.According to a preferred alternative method, an expression vector library is prepared by cloning DNA or • · ♦ - * · * * from a cell capable of expressing ICAM-1 into an expression vector for cloning the ICAM-1 gene. The library is then screened for its members, · · V: which are capable of expressing a protein that binds to • * · V · anti-ICAM-1 and has such a nucleus. leotide sequence for its ability to encode polypeptides, • · · '♦ ··. which have the same amino acid sequence as ICAM-1 or ICAM-1 ~ fragments.

• » • · · • · · • · *·"’· Kloonattu ICAM-l-geeni, joka on saatu edellä kuvatuilla 22 1 0 7 4 51 menetelmillä, voidaan toiminnallisesti kytkeä ilmennysvek-toriin, ja viedä bakteerisoluihin tai eukaryoottisiin soluihin ICAM-l-proteiiinin tuottamiseksi. Tekniikoita tällaisia suorituksia silmälläpitäen julkistavat Maniatis, T., et ai., supra. ja ne ovat alalla hyvin tunnettuja.The cloned ICAM-1 gene obtained by the methods described above 221 0 7 4 51 can be operably linked to an expression vector and introduced into bacterial or eukaryotic cells by ICAM- Techniques for such performances are disclosed by Maniatis, T., et al., supra., and are well known in the art.

D. LFA-l-riippuvaisen aggregaation määrityksien käyttöjäD. Uses of assays for LFA-1 dependent aggregation

Edellä kuvattua määritystä, jolla kyetään mittaamaan LFA-1-riippuvaista aggregaatiota, voidaan käyttää aineiden tunnistamiseksi, jotka toimivat antagonisteina inhiboiden LFÄ-1-riippuvaisen aggregaation astetta. Tällaiset antagonistit voivat toimia häiritsemällä LFA-l:n tai ICAM-l:n kykyä välittää aggregaatiota. Täten tällaisia aineita ovat immunoglobuliinit kuten vasta-aine, joka kykenee sitoutumaan joko LFA-l:een tai ICAM-l:een. Lisäksi ei-immunoglobuliini- (eli kemiallisia) aineita voidaan tutkia käyttäen edellä kuvattu määritystä sen määrittämiseksi, ovatko ne LFA-l-aggragaation antagonisteja.The assay described above, which is capable of measuring LFA-1-dependent aggregation, can be used to identify agents that act as antagonists by inhibiting the degree of LFA-1-dependent aggregation. Such antagonists may act by interfering with the ability of LFA-1 or ICAM-1 to mediate aggregation. Thus, such agents include immunoglobulins such as an antibody capable of binding to either LFA-1 or ICAM-1. In addition, non-immunoglobulin (i.e., chemical) agents can be assayed using the assay described above to determine whether they are antagonists of LFA-1 aggregation.

E. ICAK-l-reseptoriproteiineihin sitoutumaan kykenevien vasta- i”'·· aineiden käyttöjä I. Tulehdusvastaiset aineet • tili CD18-kompl eksi jäsenien vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet • · · inhiboivat valkosolujen monia kiinnitysriippuvaisia funktioita, • t · mukaanlukien sitoutuminen endoteeliin (Haskard, D., et ai., .. J. Immunol. 137 (1986) 2901 - 2906), homotyyppiset kiinnitty- • ♦ · 'ill miset (Rothlein, R. , et ai . , J.Exp.Med. 163 (1986) 1132 - • · · *·* ’ 1149), antigeeni- ja mitogeeni-indusoitu imusolujen lisään- i tyminen (Davignon, D. , et ai . , Proc.Nat 1, Acad. Sei . USA 78 ··* · (1981) 4535 - 4539), vasta-ainemuodostus (Fischer, A., et ai , I 11 J. Immunol. 136 (1986) 3198 - 3203), ja kaikkien valkosolujen • · · *'·* efektorifunktiot kuten sytotoksinen 1 yysiaktiivisuus T-soluilla (Krensky, A.M., et ai, J. Immunol. 132 (1984) 2180 - 2182), 23 107451 syöjäsoluilla (Strassman, G., et ai . , J. Immunol. 136 (1986) 4328 - 4333), ja kaikilla soluilla, jotka osallistuvat vasta-aiueriippuvaisiin solusytotoksisuusreaktioihin (Kohl, S., et ai .. J.Immunol. 133 (1984) 2972 - 2978). Kaikissa edeltävissä funktioissa vasta-aineet inhiboivat valkosolun kykyä kiinnittyä sopivaan solusubstraattiin, mikä puolestaan inhiboi lopputulosta.E. Uses of Antibodies capable of Binding to ICAK-1 Receptor Proteins I. Anti-Inflammatory Antibodies • Account Monoclonal Antibodies to Members of the CD18 Complex • · · Inhibit many anchorage-dependent functions of white blood cells, including t Haskard, D., et al., J. Immunol. 137 (1986) 2901-2906), homotypic attachments (Rothlein, R., et al., J.Exp.Med. 163). (1986) 1132-1994), antigen- and mitogen-induced proliferation of lymphocytes (Davignon, D., et al., Proc.Nat 1, Acad. Sci. USA 78 ·· * · 4535-4539 (1981), antibody formation (Fischer, A., et al., 11 J. Immunol. 136: 3198-3203 (1986)), and effector functions of all white blood cells, such as cytotoxic 1. lysine activity on T cells (Krensky, A.M., et al., J. Immunol. 132 (1984) 2180-2182), 23,107,451 on cancer cells (Strassman, G., et al., J. Immunol. 136 (1986) 4328-4333). , j a in all cells involved in antibody-dependent cellular cytotoxicity reactions (Kohl, S., et al., J. Immunol. 133: 2972-2978 (1984)). In all of the above functions, the antibodies inhibit the ability of the leukocyte to attach to a suitable cell substrate, which in turn inhibits the final result.

Kuten edellä esitetty ICMA-l-molekyylien sitoutuminen LFA-1-ryhmämolekyyleihin on ensiarvoisen merkityksellistä solukiin-nittymisessä. Kiinnitysprosessin välityksellä imusolut kykenevät jatkuvasti tarkkailemaan eläintä vieraiden antigeenien läsnäolon varalta. Vaikka nämä prosessit ovat normaalisti toivottavia, ne voivat niinikään aiheuttaa elinsiirrehyljintää, kudossiirrehyljintää ja monia autoimmuunisairauksia. Täten mikä tahansa keino, jolla kyettäisiin heikentämään tai inhiboimaan solukiinnitystä, olisi erittäin toivottava elinsiirre-, kudossiirrevastaanottajille sekä autoimmuunipotilaille.As discussed above, the binding of ICMA-1 molecules to LFA-1 moieties is of paramount importance for cell attachment. Through the attachment process, lymphocytes are able to continuously monitor the animal for the presence of foreign antigens. While these processes are normally desirable, they can also cause organ transplant rejection, tissue transplant rejection, and many autoimmune diseases. Thus, any means capable of attenuating or inhibiting cell attachment would be highly desirable for transplant, tissue transplant recipients, and autoimmune patients.

ICAM-l:een sitoutumaan kykenevät monoklonaaliset vasta-aineet t t sopivat erittäin hyvin tulehdusvastaisiksi aineiksi nisäkäskoh-Monoclonal antibodies capable of binding to ICAM-1 are very well suited as anti-inflammatory agents in mammals.

I I II I I

' teessä. Merkittävästi tällaiset aineet poikkeavat yleisistä tulehdusvastaisista aineita sikäli, että ne kykenevät selek- tiivisesti inhiboimaan kiinnittymistä, eivätkä tuota muita iY: sivuvaikutuksia, kuten myrkyllisyys munuaisille, joita tavataan • · ·*{*; tavanomaisilla aineilla. ICAM-l:een sitoutumaan kykeneviä « monoklonaalisiä vasta-aineita voidaan tämän vuoksi käyttää estämässä elin- tai kudoshyl jintää ja autoimmuunivasteiden • · · ’·. modifioimiseksi pelkäämättä tällaisia sivuvaikutuksia nisäkäs- • · · • t · kohteessa.'tea. Significantly, such agents differ from general antiinflammatory agents in that they are capable of selectively inhibiting adhesion and do not produce other γ: side effects, such as renal toxicity, which is found in · · · * {*; with conventional substances. Therefore, monoclonal antibodies capable of binding to ICAM-1 can be used to inhibit organ or tissue transplantation and autoimmune responses. without fear of such side effects in the mammalian subject.

• i • * · • t · ··· · ··* ί,,.ϊ Merkittävästi, käyttämällä ICAM-l:n tunnistamaan kykeneviä .V. monoklonaalisia vasta-aineita kyetään mahdollisesti suorit-• i • * · • t · ··· · ·· * ί ,,. Ϊ Significantly, using ICAM-1's capable .V. monoclonal antibodies can potentially be performed

I I II I I

tamaan elinsiirtoja jopa HLA-ei-yhteensopivien yksilöiden * « välillä.even between HLA-incompatible individuals * «.

24 107451 2. Viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktion suppressorit24 107451 2. Suppressors for Delayed Type Hypersensitivity Reaction

Koska ICAM-l-molekyylit ilmentyvät valtaosin tulehduskohdissa, kuten kohdissa, joissa esiintyy viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktio, ICAM-l-molekyyleihin sitoutumaan kykenevillä (erityisesti monoklonaalisilla) vasta-aineilla on terapeuttisia käyttömahdollisuuksia tällaisten reaktioiden heikentämiseksi tai eliminoimiseksi. Tätä terapeuttista käyttömahdollisuutta voidaan hyödyntää jommallakummalla kahdesta tavasta. Ensinnäkin koostumusta, joka sisältää ICAM-l-vastaista monoklonaalista vasta-ainetta, voidaan antaa potilaalle, jolla on viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktio. Esimerkkiksi tällaisia koostumuksia voidaan antaa yksilölle, joka on joutunut kosketuksiin antigeenien kuten myrkkymuratin, myrkkytammen jne., kanssa.Because ICAM-1 molecules are predominantly expressed at sites of inflammation, such as those exhibiting a delayed-type hypersensitivity reaction, antibodies (especially monoclonal) capable of binding to ICAM-1 have therapeutic potential to attenuate or eliminate such reactions. This therapeutic potential can be exploited in either of two ways. First, a composition comprising a monoclonal antibody to ICAM-1 can be administered to a patient with a delayed-type hypersensitivity reaction. For example, such compositions may be administered to an individual who has been in contact with antigens such as venom murine, venom oak, etc.

Toisessa suoritusmuodossa ICAM-l:een sitoutumaan kykenevää monoklonaalista vasta-ainetta annetaan potilaalle yhdessä antigeenin kanssa myöhemmän tulehdusreaktion estämiseksi. Täten antamalla ICAM-l:een sitoutuvan monoklonaalisen vasta-aineen ohella antigeeniä voidaan tilapäisesti saada yksilö sietämään , myöhempää altistusta tuolle antigeenille.In another embodiment, a monoclonal antibody capable of binding to ICAM-1 is administered to a patient in combination with an antigen to prevent a subsequent inflammatory reaction. Thus, the administration of an antigen in addition to the monoclonal antibody that binds to ICAM-1 can temporarily induce an individual to tolerate subsequent exposure to that antigen.

* I < ‘ 3. Terapia kroonisille tulehdussairauksille* I <'3. Therapy for chronic inflammatory diseases

Koska LAD-poti 1 aat, joilta puuttuu LFÄ-1, eivät tuota tuleh-dusvastetta, arvellaan, että LFA-l:n luontaisen ligandin, ICAM-l:n, antagonismi niinikään estää tul ehdusvasteen. ICAM-1-vastaisten vasta-aineiden kyky inhiboida tulehdusta on perusta niiden terapeuttiselle käytölle kroonisten tulehdussairauksien • · · • 4 ja autoimmuunisairauksien hoidossa, kuten punahukka, autoim- 4 4 4 muuni-kilpirauhastulehdus, kokeellinen aivojen ja selkäytimen 4 4 ! yliherkkyystulehdus (EAE) , multippeliskleroosi, Reynaudin 4 4 4 ·...* oireyhtymän tietyt muodot, nivelreuma, jne. Tällaisia vasta- .·.·. aineita voidaan käyttää terapiana myös hi 1 setystaudin hoidossa.Since LAD-1 deficient LFA-1 does not elicit an inflammatory response, it is believed that antagonism of the natural LFA-1 ligand, ICAM-1, also prevents an inflammatory response. The ability of anti-ICAM-1 antibodies to inhibit inflammation is the basis for their therapeutic use in the treatment of chronic inflammatory diseases, · · · • 4 and autoimmune diseases such as lupus, autoimmune 4 4 4, experimental brain and spinal cord 4 4! hypersensitivity inflammation (EAE), multiple sclerosis, certain forms of Reynaud's 4 4 4 · ... * syndrome, rheumatoid arthritis, etc. Such contraindications. the agents can also be used as therapy in the treatment of hypertension.

4 44 4

Yleensä ottaen ICAM-l:een sitoutumaan kykenveiä monoklonaalisia 4 4 vasta-aineita voidaan käyttää sellaisten sairauksien hoidossa, 25 107451 joita tällä hetkellä hoidetaan steroiditerapialla.In general, monoclonal 4? 4 capable of binding to ICAM-1 can be used in the treatment of diseases such as those currently being treated with steroid therapy.

4. Diagnostisia ja prognostisia käyttöjä4. Diagnostic and prognostic uses

Koska ICAM-1 ilmentyy pääasiassa tulehduskohdissa, ICAM-l:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää keinona tartunta- ja tulehduskohdan kuvantamiseksi tai visualisoimiseksi potilaassa- Tällaisessa käytössä monoklonaaliset vasta-aineet leimataan todettavalla leimalla, käyttäen radioisotooppeja, affiniteettileimoja (kuten biotiini, avidii-ni, jne.), fluoroivia leimoja, paramagneettisia atomeja jne. Menettelyt tällaisen leimaamisen suorittamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja. Vasta-aineiden kliinistä käyttöä diagnostisessa kuvantamisessa tarkastelevat Grossman, H.B.,Since ICAM-1 is predominantly expressed at sites of inflammation, monoclonal antibodies capable of binding to ICAM-1 can be used as a means of imaging or visualizing the site of infection and inflammation in a patient. In such use, monoclonal antibodies are labeled with a detectable label, using radioisotope, fluorescent labels, paramagnetic atoms, etc. Procedures for performing such labeling are well known in the art. The clinical use of antibodies in diagnostic imaging is reviewed by Grossman, H.B.

Urol.Clin.North Amer. 13 (1986) 465 - 474; Unger, E.C., et ai., Invest.Radioi 20 (1985) 693 - 700, ja Khaw, B.A., et ai♦, Science 209 (1980) 295 - 297.Urol.Clin.North Amer. 13: 465-474 (1986); Unger, E.C., et al., Invest.Radioi 20: 693-700 (1985), and Khaw, B.A., et al., Science 209: 295-297 (1980).

Tulehduksen läsnäolo voidaan niinikään todeta käyttämällä ,·, sitoutumisl igande ja, kuten mRNA, cDNA tai DNA, joka sitoutuu ICAM-l-geenisekvensseihin, tai ICAM-l-mRNA-sekvensseihin, ICAM-l:n ilmentävissä soluissa. Tekniikoita tällaisten hybridointi-“ määrityksien suorittamiseksi kuvaavat Maniatis, T. (supra.).The presence of inflammation can also be detected by the use of a binding ligand and, such as mRNA, cDNA or DNA that binds to ICAM-1 gene sequences or ICAM-1 mRNA sequences, in cells expressing ICAM-1. Techniques for performing such hybridization assays are described by Maniatis, T. (supra.).

« C l i • · Tällaisten todettavalla leimalla leimattujen vasta-aineiden « ·· . : sijaintipaikan toteaminen merkitsee tulehduskohtaa tai kasvainkehitystä. Yhdessä suoritusmuodossa tämä tulehduksen etsintä suoritetaan ottamalla kudos- tai verinäytteitä ja • 1 ;1·1; inkuboimalla tällaisia näytteitä todettavalla leimalla lei- .1. mattujen vasta-aineiden läsnäollessa. Edullisessa suoritus- • · · 2 2 · muodossa tämä tekniikka toteutetaan ei-invasiivisel la tavalla • « · • · ’···’ käyttäen magneettikuvannusta, fluorografiaa jne. Tällaista :Y: diagnostista koetta voidaan käyttää elinsiirrevastaanottajien ....: tarkkailemiseksi mahdollisen kudoshyl jinnän varhaisten merkkien varalta. Tällaisia määrityksiä voidaan suorittaa samoin 26 1 0 7 4 51 pyrittäessä määrittämään potilaan taipumus nivelreumaan tai muihin kroonisiin tulehdussairauksiin.«C l i • · With such detectable labeled antibodies« ··. : Locating indicates inflammation or tumor development. In one embodiment, this detection of inflammation is performed by taking tissue or blood samples and • 1; 1 · 1; incubating such samples with a detectable label. in the presence of mat antibodies. In a preferred embodiment, this technique is implemented in a non-invasive manner using magnetic imaging, fluorography, etc. Such: Y: A diagnostic test can be used to monitor the potential of transplant recipients ....: for early signs of tissue grafting. Such assays can also be performed to determine a patient's tendency to rheumatoid arthritis or other chronic inflammatory diseases.

5. Apuaine antigeenisen materiaalin antamiseksi terapeuttisessa tai diagnostisessa tarkoituksessaAn adjuvant for the administration of antigenic material for therapeutic or diagnostic purposes

Immuunivasteet terapeuttisille tai diagnostisille aineille kuten esimerkiksi nautainsuliini, interferoni, kudostyypin plasminogeeniaktivaattori tai hiiren monoklonaaliset vasta-aineet, heikentävät huomattavasti tällaisten aineiden terapeuttista tai diagnostista arvoa ja voivat itse asiassa aiheutta sairauksia kuten seerumisairauden. Tällaista tilannetta voidaan helpottaa käyttämällä tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita. Tässä suoritusmuodossa tällaisia vasta-aineita annettaisiin yhdessä terapeuttisen tai diagnostisen aineen kanssa. Vasta-aineita lisäämällä estetään vastaanottajaa tunnistamasta ainetta, jolloin vastaanottajaa estetään käynnistämästä sen vastaista immuunivastetta. Seurauksena tällaisen immuunivasteen puuttumisesta potilaalle voidaan antaa enemmän terapeuttista tai diagnostista ainetta.Immune responses to therapeutic or diagnostic agents such as bovine insulin, interferon, tissue-type plasminogen activator or murine monoclonal antibodies significantly reduce the therapeutic or diagnostic value of such agents and may in fact cause diseases such as serum disease. Such a situation can be alleviated by the use of antibodies of the present invention. In this embodiment, such antibodies would be administered in combination with a therapeutic or diagnostic agent. The addition of antibodies prevents the recipient from recognizing the agent, thereby preventing the recipient from triggering an immune response against it. As a result of the absence of such an immune response, more therapeutic or diagnostic agent may be administered to the patient.

F. Solujen välisen kiinnikemolekvvli-1:n (ICAM-1) käyttöjä ICAM-1 on LFA-l:n sitoutumispari. Sellaisena ICAM-1:tä tai sen • · funktionaalisia johdannaisia voidaan käyttää vastavuoroisesti vaihdettavasta LFA-l:een sitoutumaan kykenevien vasta-aineiden kanssa sairauden hoidossa. Täten liukoisessa muodossa tällaisia molekyylejä voidaan käyttää tulehduksen, elinhyl jinnän, siirre- • · hyi jinnän, jne., estämiseksi. ICAM-l:tä tai sen funktionaalisia ♦ « · johdannaisia voidaan käyttää vastaavalla tavalla ICAM- « m : vastaisina vasta-aineina terapeuttisten tai diagnostisten « · a aineiden immunogeenisyyden alentamiseksi. 1 teja voidaan käyttää ICAM-l:n tai LFA-l:n pinnoillaan ilmen- · · ICAM-1 :tä, sen funktionaalisia johdannaisia ja sen antagonis- • · 27 107451 tavien kasvainsolujen etäispesäkemuodostuksen tai lisääntymisen salpaami-seksi. Tällaisen päämäärän saavuttamiseksi voidaan käyttää lukuisia menetelmiä. Esimerkiksi vertamuodostavien solujen migraatio edellyttää LFA-1-ICAM- 1-sitoutumista. Tällaisen sitoutumisen antagonistit estävät siksi tämän migraa-5 tion ja salpaavat etäispesäkkeiden muodostamisen valkosolulinjojen kasvain-soluista. Vaihtoehtoisesti potilaalle voidaan antaa toksiinijohdannaismolekyyle-jä, jotka kykenevät sitoutumaan joko ICAM-1 :een tai LFA-1-ryhmämolekyyliin. Tällaisten toksiinijohdannaismolekyylien sitoutuessa käsvainsoluihin, jotka ilmentävät ICAM-1:n tai LFA-1-ryhmämolekyylin, toksiinin läsnäolo tappaa 10 kasvainsolun estäen siten kasvaimen kasvun.F. Uses of Intercellular Adhesive Molecule-1 (ICAM-1) ICAM-1 is a LFA-1 binding pair. As such, ICAM-1 or functional derivatives thereof may be used in the treatment of disease with reciprocally exchangeable LFA-1 antibodies. Thus, in soluble form, such molecules can be used to prevent inflammation, organ rejection, transplantation, etc. Similarly, ICAM-1 or its functional derivatives may be used as anti-ICAM antibodies to reduce the immunogenicity of therapeutic or diagnostic agents. 1 may be used to inhibit metastasis or proliferation of ICAM-1, its functional derivatives and its antagonistic tumor cells expressed on ICAM-1 or LFA-1 surfaces. Numerous methods can be used to achieve such an objective. For example, migration of hematopoietic cells requires LFA-1-ICAM-1 binding. Antagonists of such binding therefore inhibit this migration and block the formation of metastases from tumor cells of white blood cell lines. Alternatively, toxin derivative molecules capable of binding to either ICAM-1 or LFA-1 group molecule may be administered to the patient. When such toxin derivative molecules bind to spleen cells expressing ICAM-1 or the LFA-1 group molecule, the presence of the toxin kills 10 tumor cells, thereby inhibiting tumor growth.

C. ICAM-1-riippuvaisen kiinnittymisen ei-immunoalobuliini antagonistien käyttöjä 15 ICAM-1 -riippuvainen kiinnittyminen voidaan estää ei-immunoglobuliini-anta- gonisteilla, jotka kykenevät sitoutumaan joko ICAM-1 :een tai LFA-1:een. Yksi esimerkki ICAM-1 :n ei-immunoglobuliini-antagonistista on LFA-1. Esimerkki ei-immunoglobuliini-antagonistista, joka sitoutuu LFA-1 :een, on ICAM-1. Käyttämällä edellä kuvattuja määrityksiä voidaan tunnistaa ja puhdistaa muita ei-20 immunoglobulini-antagonisteja. ICAM-1-riippuvaisen kiinnittymisen ei-immuno-globuliini-antagonisteja voidaan käyttää samassa tarkoituksessa kuin LFA-1 -vastaisia vasta-aineita tai ICAM-1 -vastaisia vasta-aineita.C. Uses of ICAM-1 Dependent Non-Immunoglobulin Antagonist Adhesion Antagonists that are capable of binding to either ICAM-1 or LFA-1 can inhibit ICAM-1 dependent attachment. One example of a non-immunoglobulin antagonist of ICAM-1 is LFA-1. An example of a non-immunoglobulin antagonist that binds to LFA-1 is ICAM-1. Using the assays described above, other non-20 immunoglobulin antagonists can be identified and purified. Non-immunoglobulin antagonists of ICAM-1-dependent attachment may be used for the same purpose as anti-LFA-1 antibodies or anti-ICAM-1 antibodies.

• H. Tämän keksinnön mukaan saatujen koostumuksien antaminen « 25 ; · · · ICAM-1 :n terapeuttiset vaikutukset voidaan saada antamalla potilaalle ICAM-1- ( i · molekyyliä kokonaisuudessaan, tai sen mitä tahansa terapeuttisesti aktiivista I · · peptidifragmenttia.H. Administration of the compositions of this invention; · · · The therapeutic effects of ICAM-1 can be obtained by administering to the patient the entire ICAM-1 (i · molecule, or any therapeutically active I · · peptide fragment thereof).

« · · • · .'···. 30 ICAM-1 ja sen funktionaaliset johdannaiset voidaan saada joko synteettisesti, käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa tai proteolyyttisesti. ICAM-1 :n terapeut- • · · *:/.* tisia etuja voidaan lisätä käyttämällä ICAM-1 :n funktionaalisia johdannaisia, • « joihin on lisätty ylimääräisiä aminohappojäännöksiä kytkemisen kantajaan * · I I « « » · • I · · • * ♦ · * • «· • « 28 107451 helpottamiseksi tai ICAM-1:n aktiivisuuden tehostamiseksi. Tämän keksinnön piiriin tarkoitetaan edelleen kuuluvaksi ICAM-1 :n funktionaaliset johdannaiset, joista puuttuvat tietyt aminohappojäännökset, tai jotka sisältävät muutettuja aminohappojäännöksiä, kunhan tällaiset johdannaiset osoittavat kykyä vaikut-5 taa solukiinnitykseen.«· · • ·. '···. ICAM-1 and its functional derivatives can be obtained either synthetically, by recombinant DNA technology, or proteolytically. The therapeutic benefits of ICAM-1 can be enhanced by the use of functional derivatives of ICAM-1 with additional amino acid residues attached to the coupling carrier. ♦ · * • «· •« 28 107451 to facilitate or enhance ICAM-1 activity. Functional derivatives of ICAM-1 which lack certain amino acid residues or which contain altered amino acid residues are further encompassed within the scope of this invention as long as such derivatives demonstrate the ability to effect cell attachment.

Sekä esillä olevan keksinnön mukaan saadun ICAM-1-molekyylin sanotaan "oleellisesti ei sisältävän luontaisia epäpuhtauksia", jos sitä sisältävät valmisteet ovat oleellisesti vapaita materiaaleista, joiden yhteydessä näitä tuotteita 10 normaalisti ja luontaisesti esiintyy.Both the ICAM-1 molecule obtained according to the present invention are said to be "substantially free of natural impurities" if the preparations containing it are substantially free of the materials with which these products normally and naturally occur.

Annettaessa potilaalle ICAM-1 :tä (tai sen fragmenttia, varianttia tai johdannaista) vastaanottavalle potilaalle annetun aineen annostus vaihtelee riippuen tekijöistä kuten potilaan ikä, paino, pituus, sukupuoli, yleinen terveydentila, 15 aiempi sairaushistoria jne. Annettaessa potilaalle ICAM-1-molekyylejä tai niiden funktionaalisia johdannaisia, edullisesti tällaisia molekyylejä annetaan annostus, joka samoin on noin 1 pg/kg -10 mg/kg (potilaan ruumiinpainoa), vaikka voidaan antaa alempiakin tai korkeampiakin annostuksia. Kuten alla esitetään terapeuttisesti tehokasta annosta voidaan alentaa, jos LFA-1-vastai-20 sen vasta-aineen ohella annetaan ICAM-1-vastaista vasta-ainetta. Tässä käytettynä yhdistettä sanotaan annettavan toisen yhdisteen ohella, jos näiden kahden yhdisteen antaminen suoritetaan ajallisesti niin lähellä toisiaan, että kumpaakin yhdistettä voidaan todeta samanaikaisesti potilaan seerumista.When administering ICAM-1 (or a fragment, variant or derivative thereof) to a recipient, the dosage of the agent administered will vary depending upon factors such as age, weight, height, sex, general health, prior medical history, etc. When administering the ICAM-1 molecules or their functional derivatives, preferably such molecules, are administered in a dosage which is also about 1 pg / kg to 10 mg / kg (patient body weight) although lower or higher doses may be administered. As shown below, the therapeutically effective dose may be reduced if the anti-LFA-1 antibody is administered in addition to the anti-ICAM-1 antibody. As used herein, a compound is said to be administered in addition to another compound if the administration of the two compounds is performed over time so close that both compounds can be detected simultaneously in the patient's serum.

I · f · < * · < · 25 Sekä ICAM-1 :een sitoutumaan kykenevää vasta-ainetta että itse ICAM-1 :tä I t · · · ; . voidaan antaa potilaille laskimonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihonalaisesti, I I * ruoansulatuskanavan kautta tai sen ulkopuolisesti. Annettaessa vasta-aine tai * * · ' ICAM-1 ruiskuttamalla antaminen voidaan suorittaa jatkuvan nestesiirron väli- ...e tyksellä tai kerta- tai moniannoksena.I · f · <* · <· 25 Both ICAM-1-capable antibody and ICAM-1 itself I t · · ·; . can be administered to patients intravenously, intramuscularly, subcutaneously, via the II * digestive tract or externally. When administered by injection of antibody or * * · ICAM-1, administration can be accomplished by continuous fluid delivery or by single or multiple dose administration.

30 *·* Kyseisen keksinnön mukaan saatuja tulehdusvastaisia aineita on tarkoitus *;’·/ antaa vastaanottaville kohteille määrä, joka on riittävä tukahduttamaan tuleh- • · **:·" duksen. Määrän sanotaan olevan riittävä "tukahduttamaan" tulehduksen, jos • ♦ I · » • » · · • · · * · · 107451 aineen annostus, antotie jne. ovat riittävät heikentämään tai estämään tulehduksen.30 * · * The anti-inflammatory agents obtained according to the present invention are intended to *; ** provide the recipient subjects with an amount sufficient to suppress the inflammation • · **: · The amount is said to be sufficient to "suppress" the inflammation if • ♦ I 107451 dosages, routes of administration, etc., are sufficient to attenuate or prevent inflammation.

ICAM-1-vastainen vasta-aine tai sen fragmentti voidaan antaa joko yksinään 5 tai yhdistettynä yhteen tai useampaan immuunivastetta heikentävään aineeseen (erityisesti elin- tai kudossiirrevastaanottajalle). Tällainen yksi tai useampi yhdiste voidaan antaa "ennaltaehkäisevässä" tai "terapeuttisessa" tarkoituksessa. Annettaessa yhtä tai useampaa immuunivastetta heikentävää yhdistettä ennaltaehkäisevästi ne annetaan ennen minkään tulehdusvasteen tai -oireen 10 ilmenemistä (esimerkiksi ennen, samanaikaisesti kuin, sen jälkeen kun suoritetaan elin- tai kudossiirto mutta ennen kuin ilmenee oireita kudoshyljinnästä). Yhden tai useamman yhdisteen ennaltaehkäisevän antamisen tehtävänä on estää tai heikentää mahdollista myöhempää tulehdusvastetta (kuten esimerkiksi siirretyn elimen tai kudoksen hyljintää, jne.). Kun yhtä tai useampaa im-15 muunivastetta heikentävää yhdistettä annetaan terapeuttisesti, se/ne annetaan samanaikaisesti kuin (tai pian sen jälkeen kun) varsinainen tulehdusoire (kuten esimerkiksi elimen tai kudoksen hyljintä) käynnistyy (tai on käynnistynyt). Yhden tai useamman yhdisteen terapeuttisen annon tehtävänä on heikentää mahdollista tosiasiallista tulehdusta (kuten esimerkiksi siirretyn elimen tai 20 kudoksen hyljintä). Esillä olevan keksinnön mukaisia tulehdusvastaisia aineita voidaan täten antaa joko ennen tulehduksen käynnistymistä (kuten ennakoidun tulehduksen tukahduttamiseksi) tai tulehduksen käynnistymisen jälkeen.The anti-ICAM-1 antibody or fragment thereof may be administered alone or in combination with one or more immunosuppressive agents (particularly an organ or tissue transplant recipient). Such one or more compounds may be administered for "prophylactic" or "therapeutic" purposes. When one or more immunosuppressive compounds are administered prophylactically, they are administered prior to the onset of any inflammatory response or symptom 10 (e.g., before, concurrently, after organ or tissue transplantation, but before symptoms of tissue rejection occur). The prophylactic administration of one or more compounds serves to prevent or attenuate any subsequent inflammatory response (such as rejection of a transplanted organ or tissue, etc.). When therapeutically administered, one or more immunosuppressive compounds of the im-15 response are administered (or soon after) the actual inflammatory symptom (such as organ or tissue rejection) starts (or is triggered). The therapeutic administration of one or more compounds is intended to attenuate potential actual inflammation (such as rejection of a transplanted organ or tissue 20). The anti-inflammatory agents of the present invention can thus be administered either before the onset of inflammation (such as to suppress the anticipated inflammation) or after the onset of the inflammation.

Koostumuksen sanotaan olevan "farmakologisesti hyväksyttävä", jos vastaan-25 ottava potilas voi sietää sen annon. Tällaista ainetta sanotaan annettavan c < · · « | . "terapeuttisesti tehokas määrä", jos annettu määrä on fysiologisesti merkittävä.The composition is said to be "pharmacologically acceptable" if its administration can be tolerated by the recipient patient. Such a substance is said to be given c <· · «| . a "therapeutically effective amount" if the amount administered is physiologically significant.

I I II I I

*Aine on fysiologisesti merkittävä, jos seurauksena sen läsnäolosta todetaan* A substance is physiologically significant if it is detected as a result of its presence

« · I«· I

t · · * muutos vastaanottavan potilaan fysiologiassa.t · · * change in the physiology of the receiving patient.

* · · 4 * 30 Esillä olevan keksinnön mukaan saadut ICAM-1-molekyylit voidaan koostaa tunnetuilla menetelmillä farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostumuksien vai- • · ► mistamiseksi, jolloin näitä materiaaleja, tai niiden funktionaalisia johdannaisia, « · T yhdistetään seokseksi farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan. Sopivia • ♦ * ♦ · < « · • · » * » * • ♦ · • K • « 30 107451 kantajia ja niiden koostamista, mukaan lukien muut humaaniproteiinit, esim. humaaniseerumialbumiini, kuvataan esimerkiksi käsikirjassa "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. painos, Osol, A., toim. Mack, Easton PA, 1980. Farmaseuttisesti hyväksyttävän koostumuksen muodostamiseksi, joka soveltuu tehokkaaseen antoon, tällainen koostumus sisältää tehokkaan määrän ICAM-vastaista vasta-ainetta tai ICAM-1-molekyyliä, tai niiden jotain funktionaalista johdannaista, yhdessä sopivan määrän kantajaa kanssa.ICAM-1 molecules obtained according to the present invention may be formulated according to known methods for the preparation of pharmaceutically usable compositions, whereby these materials, or functional derivatives thereof, are combined in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable carriers and their composition, including other human proteins, e.g., human serum albumin, are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition. , Osol, A., eds. Mack, Easton PA, 1980. To form a pharmaceutically acceptable composition suitable for effective administration, such composition comprises an effective amount of an anti-ICAM antibody or ICAM-1 molecule, or a functional derivative thereof, together with an appropriate amount of a carrier.

Muita farmaseuttisia menetelmiä voidaan käyttää vaikutuksen keston kontrolloimiseksi. Kontrolloidun vapautumisen valmisteita voidaan saada käyttämällä polymeerejä ICAM-1-vastaisen vasta-aineen tai ICAM-1 :n, tai niiden funktionaalisten johdannaisten, kompleksoimiseksi tai absorboimiseksi. Kontrolloituun vapautumiseen voidaan päästä valitsemalla tarkoituksenmukaisia makromolekyylejä (esimerkiksi polyesterit, polyaminohapot, polyvinyylipyrrolidoni, etyleeni-vinyyliasetaatti, metyyliselluloosa, karboksimetyyliselluloosa, tai protamiinisul-faatti) ja makromolekyylien pitoisuuksia sekä menetelmiä niiden sisällyttämiseksi vapautumisen kontrolloimiseksi. Toinen mahdollinen menetelmä vaikutuksen keston säätelemiseksi käytettäessä kontrolloidun vapautumisen valmisteita on sisällyttää ICAM-1-vastainen vasta-aine tai ICAM-1-molekyylejä, tai niiden funktionaalisia johdannaisia, polymeerimateriaalihiukkasiin, jolloin materiaaleina tulevat kyseeseen polyesterit, polymaminohapot, hydrogeelit, poly(maitohappo) tai etyleenivinyyliasetaattikopolymeerit. Vaihtoehtoisesti sen sijaan että nämä aineet sisällytettäisiin polymeerihiukkasiin, on mahdollista sulkea nämä materiaalit mikrokapseleihin, jotka on valmistettu esimerkiksi koaservaatiotekniikoilla tai rajapintapolymeroinnilla, esimerkiksi hydroksimetyyliselluloosa- tai gelatiini-mikrokapseleihin ja vastaavasti poly(metyylimetasylaatti)mikrokapseleihin, tai kolloidisiin lääkekuljetusjärjestelmiin, esimerkiksi liposomeihin, albumiinimikro-palloihin, mikroemulsioihin, nanohiukkasiin ja nanokapseleihin tai makroemulsi-oihin. Tällaisia tekniikoita julkistetaan käsikirjassa "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1980.Other pharmaceutical methods may be used to control the duration of action. Controlled release preparations can be obtained using polymers to complex or absorb ICAM-1 antibody or ICAM-1, or functional derivatives thereof. Controlled release can be achieved by selecting appropriate macromolecules (e.g., polyesters, polyamino acids, polyvinylpyrrolidone, ethylene-vinyl acetate, methylcellulose, carboxymethylcellulose, or protamine sulphate), and concentrations of macromolecules and methods for their inclusion. Another possible method for controlling the duration of action when using controlled release formulations is to include the anti-ICAM-1 antibody or ICAM-1 molecules, or functional derivatives thereof, in the polymeric material particles, such as polyesters, polymamino acids, hydrogels, poly (lactic acid) or poly (lactic acid). . Alternatively, instead of incorporating these agents into the polymer particles, it is possible to encapsulate these materials in microcapsules made, for example, by coacervation techniques or interfacial polymerization, e.g. microemulsions, nanoparticles, and nanocapsules or macroemulsions. Such techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980.

Kuvattuamme nyt keksintöä yleisesti se tulee ymmärrettävämmäksi tutustumalla seuraaviin esimerkkeihin, jotka esitetään havainnollistamismielessä, jolloin 31 107451 niiden tarkoituksena ei ole rajoittaa esillä olevaa keksintöä, ellei siten nimenomaan mainittu.Having now described the invention in general terms, it will be more readily understood by reference to the following examples, which are provided by way of illustration, and are not intended to limit the present invention unless specifically stated.

ESIMERKKI 1 Nisäkässolujen viljelyEXAMPLE 1 Culture of mammalian cells

Yleensä ottaen esillä olevan keksinnön mukaisia EBV-transformoituja soluja ja hybridoomasoluja säilytettiin RPMI 1640--kasvualustassa, jota oli täydennetty pitoisuudella 20 mM L-glutamiinia, 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä ja 10 %:lla nautasikiö- (tai vasikansikiö-) seerumia. Soluja viljeltiin 37°C:ssa 5 % hiilidioksidia käsittävässä ilmakehässä 95 %:n ilman suhteellisessa kosteudessa.Generally, EBV-transformed cells and hybridoma cells of the present invention were stored in RPMI 1640 medium supplemented with 20 mM L-glutamine, 50 micrograms / ml gentamycin and 10% fetal bovine (or fetal calf) serum. Cells were cultured at 37 ° C in a 5% carbon dioxide atmosphere at 95% relative humidity.

Epstein-Barr-virus- (EBV-) transformanttien saamiseksi 106 kpl:ta T-soluja, joista oli poistettu ääreisveren yksitumasolut, millilitraa kohden RPMI 1640-kas-vualustaa, jota oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia (FCS) ja 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä, inkuboitiin 16 tunnin ajan B95-8-solujen EBV-pitoi-sella supernatantilla (Thorley-Lawson, D.A., et ai.. J.Exper.Med. 146 (1977) 495). 0,2 ml:n solu-eriä sijoitettiin 10 mikrotiitterilevykuoppaan. Kasvualustaa korvattiin RPMI 1640-kasvualustalla 0‘ota oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia ja 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä) kunnes havaittiin solukasvua. Soluja kasvoi useimmissa kuopissa ja niitä lisäännytettiin samassa kasvualustassa. Fytohemagglutiniini- (PHA-) emosoluja sijoitettiin pitoisuudeksi 106 so-lua/ml RPMI 1640 -kasvualustaan Göta oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia), joka sisälsi 1:800 laimennoksena PHA-P:tä (Difco Laboratories, Inc., Detroit, Ml). PHA-solulinjoja lisäännytettiin interleukiini-2:Ila (IL-2:lla) käsitellyssä kasvualustassa ja käsiteltiin viikoittain PHA:lla (Cantrell, D.A., et ai.. J.Exper.Med. 158 (1983) 1895).To obtain Epstein-Barr virus (EBV) transformants, 106 T-cell depleted peripheral blood mononuclear cells per ml of RPMI 1640 medium supplemented with 20% fetal calf serum (FCS) and 50 micrograms / of gentamycin was incubated for 16 hours with EBV-containing supernatant of B95-8 cells (Thorley-Lawson, DA, et al., J.Exper.Med. 146, 495 (1977)). 0.2 ml aliquots of cells were placed in 10 microtiter plate wells. The medium was replaced with RPMI 1640 medium supplemented with 20% fetal calf serum and 50 micrograms / ml gentamycin) until cell growth was observed. Cells grew in most wells and propagated in the same medium. Phytohemagglutinin (PHA) mother cells were plated at 106 cells / ml in RPMI 1640 medium (Göta supplemented with 20% fetal calf serum) containing 1: 800 dilution of PHA-P (Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI). ). PHA cell lines were propagated in medium treated with interleukin-2 (IL-2) and treated weekly with PHA (Cantrell, D.A., et al., J.Exper.Med. 158 (1895) 1895).

Edeltävän menettelyn julkisti Springer, T., et ai.. J.Exper.Med. 160 (1984) 1901 -1918, joka viite sisällytetään tähän viitteeksi. Edeltävällä menettelyllä saadut solut seulotaan sitten LFA-1-vastaisilla vasta-aineilla sen määrittämiseksi, ilmentävätkö ne LFA-1-antigeenin. Tällaisia vasta-aineita julkistavat Sanchez-Madrid, F., et ai.. J.Exper.Med. 158 (1983) 1785.The preceding procedure was disclosed by Springer, T., et al., J.Exper.Med. 160: 1901-1918 (1984), which reference is incorporated herein by reference. Cells obtained by the above procedure are then screened with anti-LFA-1 antibodies to determine whether they express LFA-1 antigen. Such antibodies are disclosed by Sanchez-Madrid, F., et al., J.Exper.Med. 158: 1785 (1983).

32 107451 ESIMERKKI 232 107451 EXAMPLE 2

Soluaggregaation ja -kiinnityksen määrityksiäAssays for cell aggregation and attachment

Solukiinnityksen asteen määrittämiseksi käytettiin aggregaatiomäärityksiä. Näissä määrityksissä käytetyt solulinjat pestiin kahdesti RPMI 1640-kasvualustalla, joka käsitti pitoisuuden 5 mM Hepes-puskuria (Sigma Chemical, Co., St. Louis), ja uudelleenlietettiin pitoisuudeksi 2 x 106 solua/ml. Tasapohjaisiin, 96 kuopan mikrotiitterilevyihin (n:o 3596, Costar, Cambridge, MA) lisättiin 50 mikrolitraa sopivaa monoklonaalivasta-ainesupernatanttia tai 50 mikrolitraa täydellistä kasvualustaa, joka sisälsi tai ei sisältänyt puhdistettuja monoklonaalisia vasta-aineita, 50 mikrolitraa täydellistä kasvualustaa, joka sisälsi 200 ng/ml forbolies-teri forbolimyristaattiasetaattia (PMA), ja 100 mikrolitraa soluja pitoisuudeksi 2 x 106 solua/ml täydellistä kasvualustaa. Tällöin loppupitoisuudeksi tuli 50 ng/ml PMA:ta ja 2 x 105 solua/kuoppa. Solujen annettiin laskeutua vapaasti, jolloin aggregaatio-aste arvosteltiin eri ajankohtina. Arvot vaihtelivat välillä 0 - 5+, jolloin 0 merkitsi, että oleellisesti lainkaan soluja ei ollut rykelmissä; 1+ merkitsi, että alle 10 % soluista oli aggregaateissa; 2+ merkitsi, että alle 50 % soluista oli aggregoitunut; 3+ merkitsi, että solut olivat 100 %:isesti pienissä, irtonaisissa rykelmissä; 4+ merkitsi, että solut olivat 100 %:isesti aggregoituneet suuremmiksi rykelmiksi; ja 5+ merkitsi, että solut olivat 100 %:isesti suurissa, hyvin tiiviissä rykelmissä. Kvantitatiivisemman arvion saamiseksi solukiinnityksestä reagens-seja ja soluja lisättiin 5 ml:n polystyreeniputkiin samassa järjestyksessä kuin edellä. Putket asetettiin telineessä kiertoravistelijaan 37°C:seen. Putkia ravisteltiin tunnin ajan noin 200 kierr./min kierrosnopeudella, minkä jälkeen 10 mikrolitraa solususpensiota sijoitettiin hemosytometriin ja kvantitoitiin vapaiden solujen lukumäärä. Aggregaatio-% laskettiin seuraavasta yhtälöstä: vapaiden solujen lukumäärä aggregaatio-% = 100 x (1-------------------------------------- käytettyjen solun lukumäärä Käytettyjen solujen lukumäärä edellisessä kaavassa on solujen lukumäärä milli-litrassa verrokkiputkisisältöä, joka sisälsi vain soluja ja täydellistä kasvualustaa ja jota ei inkuboitu. Vapaiden solujen lukumäärä edeltävässä yhtälössä on sama 33 107451 kuin ei-aggregoitujen solujen lukumäärä millilitrassa kokeessa käytettyä putki-sisältää. Edeltäviä menettelyitä on kuvannut Rothlein, R., et ai.. J.Exoer.Med. 163(1986) 1132 1149.Aggregation assays were used to determine the degree of cell attachment. The cell lines used in these assays were washed twice with RPMI 1640 medium containing 5 mM Hepes buffer (Sigma Chemical, Co., St. Louis) and resuspended to 2 x 10 6 cells / ml. Flat-bottom 96-well microtiter plates (No. 3596, Costar, Cambridge, MA) were supplemented with 50 microliters of the appropriate monoclonal antibody supernatant or 50 microliters of complete medium with or without purified monoclonal antibodies, 50 microliters of / ml forbolies titer of phorbol myristate acetate (PMA), and 100 microliters of cells to a concentration of 2 x 10 6 cells / ml of complete medium. This resulted in a final concentration of 50 ng / ml PMA and 2 x 10 5 cells / well. The cells were allowed to settle freely, and the degree of aggregation was judged at different times. Values ranged from 0 to 5+, with 0 indicating that there were essentially no cells in the clusters; 1+ indicated that less than 10% of the cells were in aggregates; 2+ indicated that less than 50% of the cells were aggregated; 3+ indicated that the cells were 100% in small, loose clusters; 4+ indicated that the cells were 100% aggregated into larger clusters; and 5+ indicated that the cells were 100% in large, very dense clusters. To obtain a more quantitative estimate of cell attachment, reagents and cells were added to 5 ml polystyrene tubes in the same order as above. The tubes were placed in a rack on a rotary shaker at 37 ° C. The tubes were shaken for one hour at about 200 rpm, after which 10 microliters of cell suspension was placed on a hemocytometer and the number of free cells was quantified. % Aggregation was calculated from the following equation:% free cells aggregation = 100 x (1 -------------------------------- ------ number of cells used The number of cells used in the above formula is the number of cells per milliliter of control tube contents containing only cells and complete medium and not incubated.The number of free cells in the above equation is the same as the number of non-aggregated cells. The previous procedures have been described by Rothlein, R., et al., J.Exoer.Med., 163: 1132-1496 (1986).

ESIMERKKI 3 LFA-1-riippuvainen solu-aggregaatioEXAMPLE 3 LFA-1-Dependent Cell Aggregation

Esimerkissä 2 kuvattua kvalitatiivista aggregaatiota mittaava määritys suoritettiin käyttäen Epstein-Barr-transformoitua solulinjaa JY. Lisättäessä PMA:ta kasvualustaan mikrotiitterilevyillä todettiin solu-aggregaatiota. Ajankuluvideonauhoi-tukset osoittivat, että JY-solut mikrotiitterilevyjen pohjalla olivat liikkuvia ja osoittivat aktiivista membraanin rypistymistä ja valejalkaliikettä. Naapurussolujen valejalkojen välinen kontakti johti usein solu-solukiinnittymiseen. Jos kiinnittyminen oli pitävä, solukontaktialue siirtyi uropodiin. Kontakti pystyttiin säilyttämään huolimatta kiivaasta soluliikehdinnästä ja solujen vedosta vastakkaisiin suuntiin. PMA:lla käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen solujen välinen pääasiallinen ero vaikutti olevan näiden kontaktien stabiilisuudessa kontaktien kerran muodostuttua.The qualitative aggregation assay described in Example 2 was performed using the Epstein-Barr transformed cell line JY. When PMA was added to the medium, microtiter plates showed cell aggregation. Time-lapse video recordings showed that JY cells at the bottom of microtiter plates were motile and showed active membrane wrinkling and false foot movement. Contact between false cells of neighboring cells often resulted in cell-to-cell attachment. If adhesion was stable, the cell contact region was transferred to the uropod. The contact was maintained despite intense cell movement and pulling of cells in opposite directions. The main difference between PMA treated and untreated cells appeared to be the stability of these contacts once established.

PMA.IIa muodostui solurykelmiä, jotka kasvoivat kooltaan sitä mukaa kun lisää soluja kiinnittyi niiden äärilaitamille.PMA formed clusters of cells that grew in size as more cells adhered to their extremes.

Toisena keinona kiinnityksen mittaamiseksi käytettiin esimerkissä 2 kuvattua kvantitatiivista määritystä. Solususpensioita ravistettiin 200 kierr./min kierrosno-peudella 2 tunnin ajan, minkä jälkeen ne siirrettiin hemosytometriin ja laskettiin sellaisten solujen lukumäärä, jotka eivät olleet aggregaateissa. PMA:n puuttuessa 42 % (SD = 20 %, N = 6) JY-soluista oli aggregaateissa 2 tunnin kuluttua, kun taas JY-soluista, joita oli inkuboitu identtisissä olosuhteissa 50 ng:lla/ml PMA:ta, 87 % (SI) = 8 %, N = 6) oli aggregaateissa. Aggregaation kineettisissä tutkimuksissa ilmeni, että PMA tehosti aggregaation nopeutta ja laajuutta kaikkina testattuina ajankohtina (kuvio 3).Another method for measuring attachment was the quantitative assay described in Example 2. The cell suspensions were shaken at 200 rpm for 2 hours, then transferred to a hemocytometer and counted for the number of non-aggregated cells. In the absence of PMA, 42% (SD = 20%, N = 6) of JY cells were aggregated after 2 hours, whereas 87% of JY cells incubated under identical conditions with 50 ng / ml PMA ) = 8%, N = 6) was present in the aggregates. Kinetic studies of aggregation showed that PMA enhanced the rate and extent of aggregation at all time points tested (Figure 3).

„ 107451 34 ESIMERKKI 4"107451 34 EXAMPLE 4

Solujen aggregaation inhibitio käyttäen LFA-1 -vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita LFA-1-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksien PMA-indusoi-tuun soluaggregaatioon tutkimiseksi näitä vasta-aineita lisättiin soluihin, joita inkuboitiin kuten esimerkin 2 mukaisessa kvalitatiivisessa aggregaatiomäärityk-sessä. Monoklonaalisten vasta-aineiden todettiin inhiboivan soluaggregaattien muodostusta PMA:n sekä läsnäollessa että toisaalta puuttuessa. Monoklonaalisten vasta-aineiden LFA-1-alfa-ketjun vastaiset sekä F(ab')2- että Fab'-frag-mentit kykenivät inhiboimaan soluaggregaatiota. Kun oleellisesti 100 % soluista muodosti aggregaatteja LFA-1-vastaisen vasta-aineen puuttuessa, alle 20 %:n soluista todettiin olevan aggregaateissa vasta-ainetta käytettäessä. Tämän kokeen tuloksia kuvaavat Rothlein, R., et ai. fJ.Exper.Med. 163 (1986) 1132 -1149).Inhibition of Cell Aggregation Using Anti-LFA-1 Monoclonal Antibodies To study the effects of anti-LFA-1 monoclonal antibodies on PMA-induced cell aggregation, these antibodies were added to cells incubated as in the qualitative aggregation assay of Example 2. Monoclonal antibodies were found to inhibit cellular aggregation in the presence and absence of PMA. Both the F (ab ') 2 and Fab' fragments against the LFA-1 alpha chain of monoclonal antibodies were able to inhibit cellular aggregation. While substantially 100% of the cells formed aggregates in the absence of anti-LFA-1 antibody, less than 20% of the cells were found to be aggregated when the antibody was used. The results of this experiment are described by Rothlein, R., et al. fJ.Exper.Med. 163: 1132-1149 (1986).

ESIMERKKI 5EXAMPLE 5

Soluaggregaatio edellyttää LFA-1-reseptorin läsnäoloa EBV-transformoituja varhaisimusoluja valmistettiin potilaista kuten kuvattu esimerkissä 1. Tällaiset solut seulottiin monoklonaalisia vasta-aineita vastaan, jotka kykenevät tunnistamaan LFA-1 :n, ja LFA-1 :n todettiin puuttuvan soluilta. Käytettiin esimerkissä 2 kuvattua kvalitatiivista aggregaatiomääritystä käyttäen edellä kuvattuja soluja, joista puuttuu LFA-1. Tällaiset solut eivät spontaanisti aggregoituneet edes PMA:n läsnäollessa.Cell Aggregation Requires Presence of LFA-1 Receptor EBV-transformed precursor cells were prepared from patients as described in Example 1. Such cells were screened for monoclonal antibodies capable of recognizing LFA-1, and LFA-1 was found to be absent from the cells. The qualitative aggregation assay described in Example 2 was used using cells described above lacking LFA-1. Such cells did not spontaneously aggregate even in the presence of PMA.

ESIMERKKI 6 !CAM-1:n löytäminenEXAMPLE 6 Finding CAM-1

Esimerkin 5 solut, joista puuttuu LFA-1, leimattiin karboksifluoreseiinidiasetaatil-la (Patarroyo, M., et ai.. Cell.lmmunol. 63 (1981) 237 - 248). Leimattuja soluja sekoitettiin suhteessa 1:10 autologisiin soluihin tai JY-soluihin ja määritettiin aggregaateissa olevien fluoreseiinilla leimattujen solujen prosentuaalinen osuus Rothleinin, R., et ai.. J.Exrper.Med. 163 (1986) 1132 -1149, menetelmän mu- 35 107451 kaan. Solujen, joista puuttui LFA-1, todettiin kykenevän ko-aggregoitumaan LFA-1 :n ilmentävien solujen kanssa (kuvio 4).Cells lacking LFA-1 in Example 5 were labeled with carboxyfluorescein diacetate (Patarroyo, M., et al. Cell. Immunol. 63: 237-248 (1981)). Labeled cells were mixed in a 1:10 ratio to autologous cells or JY cells and the percentage of fluorescein-labeled cells in the aggregates was determined according to Rothlein, R., et al., J.Exrper.Med. 163: 1132-1149 (1986), according to the method. Cells lacking LFA-1 were found to be able to co-aggregate with cells expressing LFA-1 (Figure 4).

Sen määrittämiseksi, oliko LFA-1 :IIä merkitystä vain aggregaattimuodostukses-sa vai (myös) niiden ylläpidossa, edellä kuvattuihin ennalta muodostettuihin aggregaatteihin lisättiin LFA-1 :een sitoutumaan kykeneviä vasta-aineita. Vasta-ainelisäyksen todettiin voimakkaasti rikkovan valmista aggregaattia. Ajankulu-videonauhoitus vahvisti, että monoklonaalisten vasta-aineiden lisääminen valmiisiin aggregaatteihin alkoi aiheuttaa rikkoontumista 2 tunnin kuluessa (taulukko 1). LFA-1-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden lisäämisen jälkeen valejalkaliikehdintä ja muutokset yksittäisten solujen aggregaateissa muodossa jatkuivat muuttumattomina. Yksittäisiä soluja erkani vähän kerrallaan aggregaatin laidalta; 8 tunnin kuluttua solut olivat valtaosin hajautuneet. Videoajankulu-nauhoituksen mukaan ennalta muodostettujen aggregaattien rikkoontuminen LFA-1 monoklonaalivasta-aineiden toimesta vaikutti ekvivalenttiselta aggregaa-tioprosessille LFA-1 -monoklonaalivasta-aineen puuttuessa ajassa taaksepäin.To determine whether LFA-1 was only relevant in aggregate formation or (also) in their maintenance, preformed aggregates described above were added to LFA-1 capable of binding. Antibody supplementation was found to strongly violate the ready aggregate. Time-lapse video recording confirmed that the addition of monoclonal antibodies to the ready aggregates began to induce disruption within 2 hours (Table 1). After the addition of the anti-LFA-1 monoclonal antibodies, the pseudo-foot movement and the changes in the aggregates of the individual cells in the form continued unchanged. The individual cells ruptured little by little on the edge of the aggregate; After 8 hours, the cells were predominantly lysed. According to the video time recording, the breakdown of the preformed aggregates by LFA-1 monoclonal antibodies appeared to be equivalent to the aggregation process in the absence of LFA-1 monoclonal antibody over time.

TAULUKKO 1 LFA-1-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kyky rikkoa ennalta muodostettuja PMA-indusoituja JY-soluaggregaatteja _Aaareaaatiolukema_TABLE 1 Ability of anti-LFA-1 monoclonal antibodies to break down preformed PMA-induced JY cell aggregates

Koe 2 ha 18 h_ _-mAb_+mAb 1 4+ 4+ 1+b 2 3+ 4+ 1+c 3 5+ 5+ 1+dExperiment 2 ha 18 h_ _-mAb_ + mAb 1 4+ 4+ 1 + b 2 3+ 4+ 1 + c 3 5+ 5+ 1 + d

Aggregaatio kvalitatiivisessa mikrotiitterilevymäärityksessä arvioitiin visuaalisesti. Kun LFA-1-vastaista vasta-ainetta oli läsnä koko määritysaikajakson, aggregaatio oli alle 1+.Aggregation in the qualitative microtiter plate assay was visually evaluated. When anti-LFA-1 antibody was present throughout the assay period, aggregation was less than 1+.

aAggregaation määrä juuri ennen monoklonaalivasta-ainelisäystä ajankohtana 2 tuntia.The amount of aAggregation just before the addition of the monoclonal antibody at 2 hours.

36 107451 bTS1/18 + TS1/22 CTS1/18 dTS1/22 ESIMERKKI 7 LFA-1-riippuvaisen aggregaation kaksivalenssisten ionien tarve LFA-1-riippuvaiset kiinnitykset sytotoksisten T-solujen ja kohteiden välillä edellyttävät magnesiumin läsnäoloa (Martz, E., J.Cell.Biol. 84 (1980) 584 - 598). PMA-indusoidun JY-soluaggregaation riippuvuutta kaksivalenssisesta kationista testattiin. JY-solut eivät aggregoituneet (käytettäessä esimerkin 2 määritystä) kasvualustassa, joka ei sisältänyt kalsium- tai magnesiumioneja. Kaksivalenssi-sen magnesiumin lisääminen tuki aggregaatiota niinkin alhaisena ionipitoisuute-na kuin 0,3 mM. Pelkästään kalsiumionien lisäämisellä oli vähäinen vaikutus. Kalsiumionien todettiin kuitenkin lisäävän magnesiumionien kykyä tukea PMA-indutoisua aggregaatiota. Kun kasvualustaan lisättiin pitoisuus 1,25 mM kal-siumioneja, niin alhaisten magnesiumionipitoisuuksien kuin 0,02 mM todettiin tukevan aggregaatiota. Nämä tulokset osoittavat, että solujen LFA-1 riippuvainen aggregaatio edellyttää magnesiumioneja ja että kalsiumionit, vaikkakin yksinään riittämättömiä, voivat vaikuttaa synergisesti magnesiumionien kanssa aggregaatiota edistäen.36 107451 bTS1 / 18 + TS1 / 22 CTS1 / 18 dTS1 / 22 EXAMPLE 7 Need for Divalent Ions of LFA-1-Dependent Aggregation LFA-1-dependent attachments between cytotoxic T cells and targets require the presence of magnesium (Martz, E., J. Cell Biol 84: 584-598 (1980). The dependence of PMA-induced JY cell aggregation on divalent cation was tested. The JY cells did not aggregate (using the assay of Example 2) in medium containing no calcium or magnesium ions. Addition of bivalent magnesium supported the aggregation at a ionic content as low as 0.3 mM. Addition of calcium ions alone had little effect. However, calcium ions were found to increase the ability of magnesium ions to support PMA-induced aggregation. When 1.25 mM calcium ions were added to the medium, low magnesium ion concentrations of 0.02 mM were found to support aggregation. These results indicate that LFA-1-dependent aggregation of cells requires magnesium ions, and that calcium ions, although insufficient on their own, can act synergistically with magnesium ions to promote aggregation.

ESIMERKKI 8EXAMPLE 8

Hybridoomasolujen eristys, jotka kykenevät ilmentämään ICAM-1-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita ICAM-1:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita eristettiin Rothleinin, R., et ai.. J.lmmunol. 137 (1986) 1270 - 1274, menetelmän mukaan, jolloin mainittu viite on sisällytetty tähän viitteeksi. Täten 3 BALB/c-hiirtä immu-noitiin vatsaontelonsisäisesti EBV-transformoiduilla ääreisveriyksitumasoluilla, jotka oli saatu yksilöstä, jolta puuttui LFA-1 (Springer, T.A., et ai.. J.Exper.Med.Isolation of hybridoma cells capable of expressing anti-ICAM-1 monoclonal antibodies Monoclonal antibodies capable of binding to ICAM-1 were isolated by Rothlein, R., et al., J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986), wherein said reference is incorporated herein by reference. Thus, 3 BALB / c mice were immunized intraperitoneally with EBV-transformed peripheral blood progenitor cells obtained from an individual lacking LFA-1 (Springer, T.A., et al., J.Exper.Med.

„ 107451"107451

OIOH

160 (184) 1901). Kussakin immunoinnissa käytettiin noin 107 solua kohden milli-litraa RPMI 1640-kasvualustaa. Immunointiruiskeet annettiin 45, 29 ja 4 päivää ennen kuin hiiristä otettiin pernasoluja haluttujen hybridoomasolulinjojen tuottamiseksi. Päivänä 3 ennen pernasolujen ottoa hiirille annettiin vielä 107 solua 0,15 ml:ssa kasvualustaa (laskimonsisäisesti).160 (184) 1901). About 107 cells per milliliter of RPMI 1640 medium were used for each immunization. Immunization injections were given 45, 29 and 4 days before spleen cells were harvested from mice to produce the desired hybridoma cell lines. On day 3, before spleen cells were harvested, mice were given another 107 cells in 0.15 ml medium (intravenous).

Edellä kuvatuista eläimistä eristetyt pernasolut fuusioitiin P3X73Ag8.653-mye-loomasoluihin suhteessa 4:1 Galfren, G., et ai.. Nature 266 (19771 550, menettelyn mukaan. Näytteitä saaduista hybridoomasoluista sijoitettiin 96 kuopan mikrotiitterilevyille. Hybridoomasupernatantit seulottiin aggregaatio-inhibition suhteen ja yksi inhiboiva hybridooma (testatusta 600 kuopasta) kloonattiin ja alakloonattiin käyttäen rajaavan laimentamisen tekniikkaa. Tämä alaklooni nimettiin RR1/1.1.1 :ksi (tästä eteenpäin merkitty "RR1/1").Spleen cells isolated from the animals described above were fused to P3X73Ag8.653 myeloma cells at a ratio of 4: 1 according to the procedure of Galfren, G., et al., Nature 266 (19771-550). Samples of the resulting hybridoma cells were plated on 96-well microtiter plates. one inhibitory hybridoma (of 600 wells tested) was cloned and subcloned using the limiting dilution technique, which was designated as RR1 / 1.1.1 (hereinafter referred to as "RR1 / 1").

Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 todettiin toistettavalla tavalla inhiboivan LFA-1:n ilmentävän solulinjan JY PMA:lla stimuloitua aggregaatiota. RR1/1-monoklonaalivasta-aine inhiboi aggregaatiota samanasteisesti, tai hieman vähemmän, kuin jotkut LFA-1-alfa-1-beeta-aIayksiköiden vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet. Sitä vastoin HLA:n, joka ilmentyy runsaasti JY-soIuilla, vastaiset verrokkimonoklonaalivasta-aineet eivät inhiboineet aggregaatiota. Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 sitoma antigeeni määritellään solujen väliseksi kiinnikemolekyyIi-1 :ksi (ICAM-1).Monoclonal antibody RR1 / 1 was found to reproducibly inhibit LFA-1 expressing cell line JY PMA-stimulated aggregation. The RR1 / 1 monoclonal antibody inhibits aggregation to the same degree, or slightly less, than some monoclonal antibodies to LFA-1 alpha-1 beta subunits. In contrast, control monoclonal antibodies to HLA, which is highly expressed on JY cells, did not inhibit aggregation. Antigen bound by monoclonal antibody RR1 / 1 is defined as intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1).

ESIMERKKI 9 ICAM-1-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö ICAM-1-molekyylin karakterisoimiseksi ICAM-1 :n luonteen määrittämiseksi ja erityisesti sen määrittämiseksi, poikke-siko ICAM-1 LFA-1:stä, soluproteiineja immuunisaostettiin käyttäen monoklo-naalista vasta-ainetta RR1/1. Immuunisaostus suoritettiin Rothleinin, R., et ai.EXAMPLE 9 Use of anti-ICAM-1 monoclonal antibodies to characterize ICAM-1 to determine the nature of ICAM-1, and in particular to determine whether ICAM-1 differed from LFA-1, cellular proteins were immunoprecipitated using a monoclonal antibody. substance RR1 / 1. Immunoprecipitation was performed by Rothlein, R., et al.

(J.Immunol. 137 (1986) 1270 -1274) menetelmän mukaan. JY-soIuihin tuotettiin lyysi niiden pitoisuudessa 5 x 107 solua/ml liuoksessa, jossa oli 1 % Triton x-100 -valmistetta, 0,14 M NaCI, 10 mM Tris, pH 8,0, ja juuri ennen käyttöä lisättävä 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, käyttäen 0,2 yksikköä/ml trypsiini-inhibiitto- 38 107451 ria aprotiini (lyysipuskurissa) 20 minuutin ajan 4°C:ssa. Lysaatteja sentrifugoitiin 10 000 x g:ssä 10 minuutin ajan, minkä jälkeen ne esikirkastettiin lisäämällä 50 %:isena suspensiona 50 mikrolitraa CNBr-aktivoitua, glysiinillä sammutettua Sepharose C1-4B -geeliä, jolloin käsittelyaika oli 1 tunti 4°C:ssa. Yksi millilitra lysaattia immuunisaostettiin lisäämällä 20 mikrolitraa 50 %:ista suspensiota, jossa oli monoklonaalista vasta-ainetta RR1/1 kytkettynä Sepharose C1-4B-hartsiin (1 mg/ml), jolloin käsittelyaika oli yön yli 4°C:ssa (Springer, T.A., et ai.. J.Exper.Med. 160 (1984) 1901). Sepharoseen sidottu monoklonaalinen vasta-aine valmistettiin käyttäen Sepharose C1-4B:n CNBr-aktivointia karbonaattipus-kurissa Marchin, S., et ai. (Anal.Biochem. 60 (1974) 149) menetelmän mukaan. Pestyillä immuunisakoilla suoritettiin SDS-PAGE ja hopeavärjäys Morrisseyn, J.H., Anal.Biochem. 117 (1981) 307, menettelyn mukaan.(J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)). LY cells were lysed at 5 x 10 7 cells / ml in 1% Triton x-100, 0.14 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride added just before use, using 0.2 units / ml trypsin inhibitor 38,107,451 aprotin (in lysis buffer) for 20 minutes at 4 ° C. The lysates were centrifuged at 10,000 x g for 10 minutes, followed by pre-clarification by adding 50 microliters of CNBr-activated glycine-quenched Sepharose C1-4B gel as a 50% suspension for 1 hour at 4 ° C. One milliliter of lysate was immunoprecipitated by the addition of 20 microliters of a 50% suspension of RR1 / 1 monoclonal antibody coupled to Sepharose C1-4B resin (1 mg / ml) for an overnight treatment at 4 ° C (Springer, TA). , et al., J.Exper.Med. 160: 1901 (1984). Sepharose-bound monoclonal antibody was prepared using CNBr activation of Sepharose C1-4B in carbonate buffer by Marchin, S., et al. (Anal. Biochem. 60 (1974) 149). Washed immune precipitates were subjected to SDS-PAGE and silver staining by Morrissey, J.H., Anal.Biochem. 117, 307 (1981).

Kun proteiineja oli eluoitu SDS-näytepuskurilla (Ho, M.K., et ai.. J.Biol.Chem. 258 (1983) 636=, 100°C:ssa, näytteet jaettiin puoliksi ja niillä suoritettiin elektro-foreesiajo (SDS-8 % PAGE) pelkistävissä (kuvio 5A) tai ei-pelkistävissä (kuvio 5B) olosuhteissa. Nauhat, joiden molekyylipaino on 50 kd:tä ja 25 kd:tä, vastaavat immunoglobuliinien monoklonaalivasta-aine-Sepharosesta raskasta ja kevyttä ketjua (kuvio 5A, vyöhyke 3). Havaittiin myös vaihtelevia määriä muita nauhoja 25 - 50 kd -painoalueella, mutta niitä ei esiintynyt sakoisssa, jotka olivat peräisin karvaisista leukemiasoluista, joista saatiin vain 90 kd:n molekyylipainonauha. LFA-1:n 177 kd:n alfa-alayksikön ja 95 kd:n beeta-alayksikön todettiin migroitu-van eri tavalla kuin ICAM-1 sekä pelkistävissä (kuvio 5A, vyöhyke 2) että ei-pel-kistävissä (kuvio 5B, vyöhyke 2) olosuhteissa.After eluting the proteins with SDS sample buffer (Ho, MK, et al., J. Biol. Chem. 258 (1983) 636 = 100 ° C), the samples were split in half and subjected to electrophoresis (SDS-8% PAGE). ) under reducing (Fig. 5A) or non-reducing (Fig. 5B) lanes of 50 kd and 25 kd molecular weight corresponding to the heavy and light chain of immunoglobulins monoclonal antibody-Sepharose (Fig. 5A, band 3). Various amounts of other bands were also observed in the 25 to 50 kd weight range but were not present in the fine hairy leukemia cells yielding only the 90 kd molecular weight band, 177 kd alpha subunit and 95 kd LFA-1. The beta subunit was found to migrate differently from ICAM-1 under both reducing (Figure 5A, zone 2) and non-reducing (Figure 5B, zone 2) conditions.

Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 vaikutuksen PHA-varhaisimusolu-aggre-gaatioon määrittämiseksi käytettiin esimerkissä 2 kuvattua kvantitatiivista aggre-gaatiomääritystä. Täten T-soluemosoluja stimuloitiin 4 päivän ajan PHA:lla, minkä jälkeen ne pestiin perusteellisesti ja kasvatettiin sitten 6 päivän ajan IL-2:lla käsitellyssä kasvualustassa. PHA:n todettiin sisäistyvän tämän 6 päivän mittaisen viljelyn aikana, ja se ei myötävaikuttanut aggregaatiomääritykseen. Kolmessa eri määrityksessä erilaisilla T-soluemosoluvalmisteilla ICAM-1 -mono-klonaalivasta-aineet inhiboivat aggregaatiota toistettavalla tavalla (taulukko 2).The quantitative aggregation assay described in Example 2 was used to determine the effect of the monoclonal antibody RR1 / 1 on PHA early cell aggregation. Thus, T cell mother cells were stimulated for 4 days with PHA, after which they were extensively washed and then grown for 6 days in IL-2 treated medium. PHA was found to be internalized during this 6 day culture and did not contribute to the aggregation assay. In three different assays with different T cell endocrine preparations, ICAM-1 monoclonal antibodies inhibit aggregation in a reproducible manner (Table 2).

39 107451 TAULUKKO 2 PMA-stimuloidun PHA-varhaisimusoluaggregaation inhibitio RRl/l-monoklonaalivasta-aineellaa % - %39 107451 TABLE 2 Inhibition of PMA-Stimulated PHA Early Cell Aggregation by RR1 / l Monoclonal Antibody% -%

Koe" PMA HAb Aggregaatit inhibitio b lc - Verrokki g + Verrokki 51 g + HIA-A,B 58 -14d + LFA-l-'alf a 31 39 + ICAM-1 31 39 2e - Verrokki >10 + Verrokki 78 0 + LFA-1—beta 17 78 r + ICAM-1 50 36 3f - — 7 + Verrokki 70 + HLA-A,B 80 -14 + LFA-3 83 -19 + LFA-l-alfa 2 97 + LFA-l-beta 3 95 + ICAM-1 34 51 « · · « < 4 · aPHÄ-indusoitujen varhaisimusolujen aggregaatio, jota : : stimuloitiin 50 ng:lla/ml PMA:ta, kvantitoitiin epäsuorasti 444 laskemalla mikroskoopin avulla ei-aggregoitujen solujen lukumäärä kuten kuvattu esimerkissä 2.Experiment "PMA HAb Aggregate Inhibition b lc - Control g + Control 51 g + HIA-A, B 58 -14d + LFA-1-'alf a 31 39 + ICAM-1 31 39 2e - Control> 10 + Control 78 0 + LFA-1-beta 17 78 r + ICAM-1 50 36 3f - - 7 + Control 70 + HLA-A, B 80 -14 + LFA-3 83 -19 + LFA-1-alpha 2 97 + LFA-1- beta 3 95 + ICAM-1 34 51? · · «<4 · aPHΔ-induced early cell aggregation by:: stimulated with 50 ng / ml PMA, indirectly quantified by 444 by counting the number of non-aggregated cells as described in the example 2.

• · · • · • · · * · 1 • · · bInhibitio-% verrattuna soluihin, joita käsiteltiin PMA:11a ja X63-monoklonaalivasta-aineella.% Inhibition compared to cells treated with PMA and X63 monoclonal antibody.

«ti • · · • · • · · • · · *·] ’ cAggregaatio mitattiin tunnin kuluttua siitä, kun oli samanai- • kaisesti lisätty monoklonaalinen vasta-aine ja PMA. Soluja »1» · ravisteltiin 175 kierr./min kierrosnopeudel 1 a.The cAggregation was measured one hour after the simultaneous addition of the monoclonal antibody and PMA. Cells »1» · were shaken at 175 rpm 1a.

• · » · • « 1 • \ Negatiivinen luku merkitsee aggregaation prosentuaalista tehostumista.A negative number indicates a percentage increase in aggregation.

107451 40 «Aggregaatio mitattiin tunnin kuluttua siitä, kun oli samanaikaisesti lisätty monoklonaalinen vasta-aine ja PMA. Soluja pelletoitiin 200 x g:ssä 1 min ajan, niitä inkuboitiin 37 °c:ssa 15 minuutin ajan,.minkä jälkeen ne uudelleenlietet-tiin varovaisesti ja ravisteltiin 45 minuutin ajan 100 kierr./ min kierrosnopeudel1 a.107451 40 The aggregation was measured one hour after the simultaneous addition of the monoclonal antibody and PMA. The cells were pelleted at 200 x g for 1 min, incubated at 37 ° C for 15 min, then gently resuspended and shaken for 45 min at 100 rpm.

fSoluja esikäsiteltiin PMA:Ha 4 tunnin ajan 37 °C:ssa. Sitten kun monoklonaalinen vasta-aine oli lisätty, putkien sisältöä inkuboitiin 37 °C:ssa ravistelematta 20 minuutin ajan ja sitten ravistellen 100 minuutin ajan 75 kierr./min kierrosnopeudel1 a.The cells were pretreated with PMA for 4 hours at 37 ° C. After the addition of the monoclonal antibody, the tube contents were incubated at 37 ° C without shaking for 20 minutes and then shaking for 100 minutes at 75 rpm.

LPA-1-monoklonaalivasta-aineet olivat toistettavalla tavalla voimakkaammin inhiboivia kuin ICAM-l-monoklonaalivasta-aineet, kun taas HLA A B - ja LPA-3-monoklonaalivasta-ainei11 a ei ollut vaikutusta. Nämä tulokset osoittavat, että testatuista monoklonaalisista vasta-aineista vain LFA-l:een tai ICAM-l:een sitoutumaan kykenevät kykenivät estämään solukiinnitystä.LPA-1 monoclonal antibodies were reproducibly more potent inhibitors than ICAM-1 monoclonal antibodies, whereas HLA A B and LPA-3 monoclonal antibodies had no effect. These results indicate that of the monoclonal antibodies tested, only those capable of binding to LFA-1 or ICAM-1 were able to inhibit cell attachment.

ESIMERKKI 10 4 at ICAM-l-vastaisen monokl onaal isen vasta-aineen valmistus a · a « i «EXAMPLE 10 Preparation of a monoclonal antibody to ICAM-1 a · a «i«

ImmunointiImmunization

I < I 1 II <I 1 I

4 i » Φ m · · ***** BALB/c-hiiri immunoitiin vatsaontel onsisäisesti (i.p.) ruiskut- • · · *.1 ’ tamalla 0,5 ml:n erinä 2 x 107 JY-solua RPMI-kasvualustassa 103 ja 24 päivää ennen fuusiota. Päivinä 4 ja 3 ennen fuusiota • · iti hiiriä immunoitiin i.p. 107 PMA-differentioidulla U937-solulla ; Γ: o,5 ml:ssa RPMI-kasvualustaa.4 i »Φ m · · ***** BALB / c mouse was immunized intraperitoneally (ip) by • · · * .1 'injection in 0.5 ml aliquots of 2 x 10 7 JY cells in RPMI medium 103 and 24 days before fusion. On days 4 and 3 prior to fusion, • · iti mice were immunized i.p. 107 PMA differentiated U937 cells; Γ, in 5 ml RPMI medium.

* • · * i · ’",1 U937-soluien differentiaatio « · • 1 *44 ίίί 13937-soluja (ATCC CRL-1593) dif f erentioitiin inkuboimalla niitä pitoisuutena 5 x 105/ml RPMl:ssä, joka sisälsi 10 % nautasikiö-seerumia, 1 %:n glutamiinia ja 50 mikrogrammaa/ml gentamysiiniä 107451 41 (täydellinen kasvualusta), joka sisälsi 2 ng/ml forboli-12-myristaattiasetaattia (PMÄ), steriilissä polypropyleenias-tiassa. Tämän inkuboinnin 3. päivänä puolet kasvualustatila-vuudesta poistettiin ja korvattiin tuoreella täydellisellä ja PMA:ta sisältävällä kasvualustalla. Päivänä 4 solut poistettiin, pestiin ja valmisteltiin immunointia silmälläpitäen.* * · * I · '", 1 U937 cell differentiation" · 1 * 44 ßίί 13937 cells (ATCC CRL-1593) were differentiated by incubation at 5 x 10 5 / ml in RPM1 containing 10% fetal bovine fetus. serum, 1% glutamine, and 50 micrograms / ml gentamycin 10745141 (complete medium) containing 2 ng / ml phorbol-12 myristate acetate (PMA) in a sterile polypropylene container On day 3 of this incubation, half the volume of medium was removed and replaced with fresh complete and PMA-containing medium On day 4 cells were removed, washed and prepared for immunization.

FuusioFusion

Immunoiduista hiiristä saadut pernasolut fuusioitiin P3x63 Ag8.653 -myeloomasoluihin suhteessa 4:1 Galfren et ai ., (Nature 266 (1977) 550) mukaan. Fuusioinnin jälkeen solut maljoitettiin 96 kuopan tasapohjaisiin mikrotiitterilevyihin pitoisuudeksi 105 pernasolua/kuoppa.Spleen cells from immunized mice were fused to P3x63 Ag8.653 myeloma cells in a ratio of 4: 1 according to Galfren et al., (Nature 266: 550, 1977). After fusion, cells were plated in 96-well flat bottom microtiter plates at 105 spleen cells / well.

ICAM-l-vastaisina positiivisten solujen valintaSelection of positive cells as anti-ICAM-1

Viikon kuluttua 50 mikrolitraa supernatanttia seulottiin esimerkin 2 mukaisessa kvalitatiivisessa määrityksessä käyttäen « · • " sekä JY- että SKW3-soluja aggregoituvina solutinjoina. Solut * supernatanteista, jotka inhiboivat JY-solu-aggregaatiota mutta eivät SKW3-solu-aggregaatiota, valittiin ja kloonattiin 2 ker-taan käyttäen rajaavan laimentamisen menetelmää.After one week, 50 microliters of supernatant was screened in the qualitative assay of Example 2 using both JY and SKW3 cells as aggregating cell lines. Cells * from supernatants that inhibited JY cell aggregation but not SKW3 cell aggregation were selected and using the limiting dilution method.

• · · • · · Tällä kokeella saatiin tunnistetuksi ja sittemmin kloonattiin • · · kolme erillistä hybridoomasolulinjaa, jotka tuottivat ICAM-1-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita. Näiden hybridoomasolu- • · · linjojen tuottamat vasta-aineet olivat IgG2a, IgG2b ja vastaa- • · · • · · vasti IgM. Hybridoomasolulinja, joka tuotti ICAM-l-vastaista : vasta-ainetta IgG2a, nimettiin nimellä R6’ 5 ,D6’E9,B2 . Edullisen hybridoomasolul in jän tuottama vasta-aine nimettiin nimellä R6'5'D6,E9,B2 (tässä nimellä "R6-5-D6") .Three separate hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies to ICAM-1 were identified and subsequently cloned. The antibodies produced by these hybridoma cell lines were IgG2a, IgG2b, and IgM, respectively. The hybridoma cell line that produced anti-ICAM-1: IgG2a antibody was named R6 '5, D6'E9, B2. The antibody produced by the preferred hybridoma cell was named R6-5'D6, E9, B2 (herein referred to as "R6-5-D6").

• · · • · 1 « 107451 42 ESIMERKKI 11 ICAM-l:n ilmennys ja säätely ICAM-l:n ilmentymisen mittaamiseksi kehitettiin radio-immuunimääritys. Tässä määrityksessä puhdistettua RRl/l:tä jodattiin käyttäen jodogeenia, jonka spesifinen aktiivisuus oli 10 mikrocurie-yksikköä/mikrogramma. Endoteelisoluja kasvatettiin 96 kuopan levyillä ja käsiteltiin kuten kuvattu kullekin kokeelle. Maljat jäähdytettiin 4 °C:seen sijoittamalla ne kylmähuoneeseen 0,5-1 tunniksi, eikä (siis) välittömästi jäihin. Solu-yksikerrokset pestiin 3x kylmällä täydellisellä kasvualustalla ja inkuboitiin sitten 30 minuutin ajan 4 °C:ssa 125I-RR1/1:i1ä. Solu-yksikerrokset pestiin sittten 3x täydellisellä kasvualustalla. Sitoutunut ^-251 vapautettiin käyttäen 0,1 N natriumhydroksidiliuosta ja laskettiin. ^-251-RRl/l:n spesifinen aktiivisuus säädettiin käyttäen ei-leimattua RRl/l:tä lineaarisen signaalin saamiseksi tässä tutkimuksessa tavatuilla antigeenitiheyksi11ä. Ei-spesifinen sitoutuminen määritettiin lOOOx ylimäärän ei-leimattua RRl/l:tä läsnäollessa ' " ja saatu arvo vähennettiin kokonaissitoutumisesta spesifisen ’ sitoutumisen saamiseksi.EXAMPLE 11 ICAM-1 Expression and Regulation A radio-immunoassay was developed to measure ICAM-1 expression. In this assay, purified RR1 / l was iodinated using iodogen with a specific activity of 10 microcurie units / microgram. Endothelial cells were grown in 96-well plates and treated as described for each experiment. The plates were cooled to 4 ° C by placing them in a cold room for 0.5-1 hours and not (i.e.) immediately on ice. The cell monolayers were washed 3x with cold complete medium and then incubated for 30 minutes at 4 ° C with 125I-RR1 / 1. The cell monolayers were then washed 3x with complete medium. The bound? -251 was released using 0.1 N sodium hydroxide solution and counted. The specific activity of β-251-RR1 / I was adjusted using non-labeled RR1 / I to obtain a linear signal at the antigen density observed in this study. Non-specific binding was determined in the presence of 10000 x excess of unlabeled RR1 / l and the value obtained was subtracted from total binding to obtain specific binding.

ICAM-l-ilmennys , edellä kuvatulla radioimmuunimäärityksel lä : : : mitattuna, kasvaa ihmisen napalaskimon endoteelisolui11 a • o (HUVEC) ja ihmisen alaraajan iholaskimon endoteelisolui 11 a (HSVEC) IL-l:n, TNF:n, LPS:n ja IFN-gamman vaikutuksesta (taulukko 3). Alaraajan iholaskimon endoteelisoluja käytettiin • · · !.! tässä tutkimuksessa napalaskimon endoteel isolui 11 a saatujen »44 »44 *, tuloksien varmistamiseksi viljellyissä suuren laskimon endo- ·,· · teelisoluissa, jotka oli saatu täysikasvuisen henkilön kudok- : : sesta. ICAM-l:n perusilmennys on 2x korkeampi alaraajan iholaskimon endoteelisolui 11 a kuin napalaskimon endoteeliso-luilla. Altistettaessa napalaskimon endoteelisolut yhdistelmä-IL-l-alfai 1 e, -IL-l-beetal1 e ja -TNF-gammal1 e ICAM-l-ilmennys kasvoi 10 - 20 kertaisesti. IL-l-alfa, TNF ja LPS olivat te- 107451 43 hokkainunat indusorit ja IL-1 oli vähemmän tehokas painosta laskettuna ja myös vasteen kyllästyspitoisuuksina (taulukko 3). IL-l-beeta pitoisuutena 100 ng/ml lisäsi ICAM-l-ilmennystä 9-kertaisesti HUVEC-soluilla ja 7,3-kertaisesti HSVEC-soluilla, jolloin puolimaksimaalinen kasvu saatiin pitoisuudella 15 ng/ml. rTNF pitoisuutena 50 ng/ml lisäsi ICAM-l-ilmennystä 16-kertaisesti HUVEC-soluilla ja 11-kertaisesti HSVEC-soluilla, jolloin puolimaksimaalinen vaikutus saatiin pitoisuudella 0,5 ng/ml. Interferoni-gamma tuotti merkittävän kasvun ICAM-1-ilmennykseen, joka oli 5,2-kertainen HUVEC-soluilla tai 3,5-kertainen HSVEC-soluilla, pitoisuudessa 10 000 U/ml. LPS:n vaikutus pitoisuutena 10 mikrogrammaa/ml oli samaa suuruusluokkaa kuin rTNF:n. Näiden välittäjien yhdistäminen pareittain johti additiivisiin tai additiivista hieman alhaisempiin vaikutuksiin ICAM-1-ilmennykseen (taulukko 3). Ristititraa-malla rTNF rIL-l-beetalla tai rlFN-gammal1 a ei saatu syner-gismiä näiden optimin alapuolisten tai optimaalisten pitoisuuksien välille.ICAM-1 expression, as measured by the radioimmunoassay described above::, is increased by human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and human lower limb skin endothelial cell 11a (HSVEC) IL-1, TNF, LPS and IFN. gamma (Table 3). Lower limb vein endothelial cells were used • · ·!.! in this study, the endothelium of the umbilical vein was isolated with a? 44? 44 * obtained to confirm the results in cultured large venous endo-, · · teak cells obtained from adult tissue. ICAM-1 has a basal expression of 2x higher endothelial cell 11a of lower limb skin vein than endothelial cells of umbilical vein. Upon exposure to the umbilical vein endothelial cells, the ICAM-1 expression of recombinant IL-1-alpha1e, -IL-1-beta-1e and -TNF-gamma1e increased 10-20-fold. IL-1-alpha, TNF, and LPS were the inducers of tefl 107451 43 and IL-1 was less effective in weight loss and also in response saturation concentrations (Table 3). IL-1 beta at 100 ng / ml increased ICAM-1 expression 9-fold in HUVEC cells and 7.3-fold in HSVEC cells, resulting in a half-maximal growth at 15 ng / ml. rTNF at 50 ng / ml increased ICAM-1 expression 16-fold in HUVEC cells and 11-fold in HSVEC cells, resulting in a half-maximal effect at 0.5 ng / ml. Interferon gamma produced a significant increase in ICAM-1 expression, which was 5.2-fold in HUVEC cells or 3.5-fold in HSVEC cells at 10,000 U / ml. The effect of LPS at a concentration of 10 micrograms / ml was of the same magnitude as that of rTNF. Pairing of these mediators resulted in additive or slightly lower than additive effects on ICAM-1 expression (Table 3). Cross-titration of rTNF with rIL-1-beta or rIFN-gamma1 did not produce synergism between these sub-optimal or optimal concentrations.

: *' Koska LPS nosti ICAM-l-ilmennystä endoteelisoluilla pitoi- ‘ suuksina, joita joskus esiintyy kasvualustassa, mahdollisuutta, '.(ΐ|ί että perus-ICAM-l-ilmennys johtuisi LPS:stä, tutkittiin.: * 'Because LPS increased the expression of ICAM-1 on endothelial cells at concentrations that sometimes occur in culture medium,' (että | ί that basic ICAM-1 expression would be due to LPS) was investigated.

*; Testattaessa useampia seerumieriä todettiin, että alhaisen j ; ; endotoksiinipitoisuuden käsittävä seerumi antoi 25 % alhai-semman ICAM-l-pohjailmennyksen. Kaikki tässä ilmoitetut • · · tulokset oli saatu endoteelisoluilla, joita kasvatettiin .. alhaisen endotoksiinipitoisuuden käsittävässä seerumissa.*; When testing several batches of serum, it was found that low j; ; serum with endotoxin content gave a 25% lower ICAM-1 base expression. All the results reported herein were obtained with endothelial cells grown in low endotoxin serum.

• · · 4 · «• · · 4 · «

Kuitenkin lisäämällä LPS:ää neutraloivaa antibioottia poly- ♦ · · *·) * myksiini-B pitoisuutena 10 mikrogrammaa/ml ICAM-1 -ilmennys : laski enää vain 25 % (taulukko 3). ICAM-l-ilmennyksen kasvuunHowever, the addition of LPS-neutralizing antibiotic poly-♦ · · * ·) * myxin B at a concentration of 10 micrograms / ml ICAM-1 expression: only decreased by 25% (Table 3). ICAM-1 expression

Ml · IL-l:llä tai TNF:llä käsiteltäessä ei vaikuttanut 10 mikro- • · * .*. gramman/ml polymyksiini-B: tä läsnäolo, mikä sopii yhteen näiden • ♦ « ' *. valmisteiden käsittämien alhaisten endotoksiinitasojen kanssa (taulukko 3).Treatment with M1 · IL-1 or TNF did not affect 10 micro- • *. *. gram / ml polymyxin B, which is compatible with these • ♦ «'*. with low endotoxin levels in the formulations (Table 3).

44 1 0 7 4 51 TAULUKKO 3 ICAM-l-vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet44 1 0 7 4 51 TABLE 3 Monoclonal Antibodies to ICAM-1

125j , spesifisesti· sidottu J125j, specifically · bound J

Tila (16 h) HUVEC HSVEC ' ( tuike/min. ) verrokki 603 + 11 - 1132 ±31 100 ng/ml rIL-1 beta 5680 + 633 9x 8320 ± 766 7.3x 50 ng/ml rIL-l-alfa 9910 + 538 16x 50 ng/ml rTNF alfa 9550 ± 1500 jgx 12690 +657 11.2x 10 /ig/ml LPS 9530 + 512 16x 10459 + 388 9.2x 10 ng/ml rlFN gamma 3120 + 308 5.2x 4002 ± 564 3.5x rIL-1 beta + rTNF 1469 + 1410 24x 16269 + 660 14x rIL-1 beta + LPS 13986 + 761 . 23x 10870 + 805 lOx rIL-1 beta + rlFN gamma 7849 + 601 13x 8401 +~390 7.4x rIi!r + 15364 ± 1241 24x 16141 + 1272 14x rTNF + rlFN gamma 13480 ± 1189 22x 13238 + 761 12x LPS + IFN gamma 10206 + 320 17x 10987 + 668 lOx polymytsiini B(10ug/ml) 480 + 23 polymytsiini B + rIL-1 5390~+ 97 llx - polymytsiini. B + rTNF 9785 + 389 20x v 1 1 /ig/ml^LPS 7598 + 432 13x .···. polymytsiini B + LPS 510 + 44 l.lxStatus (16 h) HUVEC HSVEC '(Scintillation / min) Control 603 + 11 - 1132 ± 31 100 ng / ml rIL-1 beta 5680 + 633 9x 8320 ± 766 7.3x 50 ng / ml rIL-1-alpha 9910 + 538 16x 50 ng / ml rTNF alpha 9550 ± 1500 jgx 12690 +657 11.2x 10 µg / ml LPS 9530 + 512 16x 10459 + 388 9.2x 10 ng / ml rlFN gamma 3120 + 308 5.2x 4002 ± 564 3.5x rIL- 1 beta + rTNF 1469 + 1410 24x 16269 + 660 14x rIL-1 beta + LPS 13986 + 761. 23x 10870 + 805 lOx rIL-1 beta + rlFN gamma 7849 + 601 13x 8401 + ~ 390 7.4x rIi! R + 15364 ± 1241 24x 16141 + 1272 14x rTNF + rlFN gamma 13480 ± 1189 22x 13238 + 761 12x LPS + IFN gamma 10206 + 320 17x 10987 + 668 10x Polymycin B (10 µg / ml) 480 + 23 Polymycin B + rIL-15 5390 ~ + 97 µl Polymycin. B + rTNF 9785 + 389 20x v 1 1 / ig / ml ^ LPS 7598 + 432 13x. ···. polymycin B + LPS 510 + 44 l.lx

1 « I1 «I

* * k • · · • · ··» • · · • · · • · :.V 1CAM-1-ilmennyksen säätäminen ylöspäin HVEC- ja HUVEC-soluilla • · · ’ - HUVEC- tai HSVEC-soluja mal joitetti in 96 kuopan levyille : suhteessa 1:3 yhteenkasvaneesta solu-yksikerroksesta ja • · * “*·] annettiin kasvaa yhteen. Sitten soluja käsiteltiin mainituilla « · Ί materiaaleilla tai kasvualustalla 16 tunnin ajan, minkä jälkeen • · suoritettiin RIA-määritys kuten menetelmien yhteydessä esitetty. Kaikki määrityslukemat ovat 4-kertaisista rinnakkaismäärityksistä.* * upward adjustment of .V 1CAM-1 expression on HVEC and HUVEC cells · · · - HUVEC or HSVEC cells were plated in 96 well plates: 1: 3 of a single cell monolayer and • · * “* ·] allowed to grow together. The cells were then treated with the said materials or medium for 16 hours, followed by an RIA assay as described in the methods. All assay readings are from 4-fold duplicate assays.

45 107451 ESIMERKKI 12 ICAM-l:n inter1eukini-1- ja gamma-interferoni -induktion kinetiikka45 107451 EXAMPLE 12 ICAM-1 Induction Kinetics of Inter1eukin-1 and Interferon-Gamma

Interleukiini-1:n ja gamma-interferonin vaikutuksien ICAM-1-ilmennykseen ihon sidekudosmuodostussoluilIa kinetiikkaa tutkittiin käyttäen vuohen 3-251-1 eimattua anti-hiiri-IgG-vasta-aine-sitoutumismääritystä, Dustin, M.L., et ai.The kinetics of the effects of interleukin-1 and interferon gamma on ICAM-1 expression in dermal connective tissue-forming cells were examined using a goat 3-251-1 unlabeled anti-mouse IgG antibody binding assay, Dustin, M.L., et al.

(J. Immunol, 137 (1986) 245 - 254; joka viite sisällytetään tähän viitteeksi). Tämän sitoutumismäärityksen suorittamiseksi ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin 96 kuopan mikrotiitterilevyllä tiheyteen 2 - 8 x 104 solua/kuoppa (0,32 cm2). Solut pestiin kahdesti RPMI 1640 -kasvualustalla, jota oli täydennetty kuten kuvattu esimerkissä 1. Solut pestiin vielä kerran Hankin tasapainoitetul1 a suolaliuoksella (HBSS), jossa oli pitoisuudet 10 mM Hepes, 0,05 % NaN3, ja 10 % 1ämpöinaktivoitua nautasikiöseerumia. Pesu tällä sitoutumis-puskurilla suoritettiin 4 °C:ssa. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 mikrolitraa edellä kuvattua sitoutumispuskuria ja 50 mikro-litraa sopivaa hybridoomasupernatanttia, jolloin negatiivisena ja positiivisena verrokkina käytettiin X63:ea ja vastaavasti W6/32:ta. Kuoppien sisältöä inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 °C:ssa samalla kevyesti ravistellen, minkä jälkeen kuopat pestiin kahdesti sitoutumispuskurilla ja toista vasta-ainetta, * · · vuohen 3.251-1 eimattua anti-hiiri-IgG:tä, lisättiin pitoisuus 50 • · · * nCi/100 mikrolitraa. Vuohen 3-251-leimattu hiirivastainen vasta-aine valmistettiin käyttäen Iodogen-valmistetta (Pierce) Frakerin, P.J. et ai. (Biochem. Biophys . Res . Commun. 80 (1978) • · · V · 849) menetelmän mukaan. 30 minuutin 4 °C:ssa kuluttua solut : pestiin kahdesti 200 mikrol itral 1 a sitoutumispuskuria ja iti i .···, solukerros tehtiin liukoiseksi lisäämällä 100 mikrolitraa 0,1 N • · ’·* natriumhydroksidiliuosta. Tämä ja 100 mikrolitran pesuerä • · • · · laskettiin Beckmanin malli 5500 gamma-laskijalla. Sitoutuneet spesifiset tuikkeet/min laskettiin kaavasta [tuiketta/min monoklonaalivasta-aineella] - [tuiketta/min X63:lla]. Kaikki 107451 46 vaiheet, mukaan lukien indusointi spesifisillä reagensseilla, suoritettiin 4-kertaisin rinnakkaismäärityksin.(J. Immunol. 137: 245-254 (1986); which reference is incorporated herein by reference). To perform this binding assay, human skin connective tissue formation cells were grown in a 96-well microtiter plate to a density of 2 to 8 x 10 4 cells / well (0.32 cm 2). Cells were washed twice with RPMI 1640 medium supplemented as described in Example 1. Cells were washed once more with Hank's Balanced Saline (HBSS) containing 10 mM Hepes, 0.05% NaN3, and 10% heat-inactivated bovine serum. Washing with this binding buffer was performed at 4 ° C. 50 microliters of the above binding buffer and 50 microliters of the appropriate hybridoma supernatant were added to each well, using X63 and W6 / 32 as the negative and positive controls, respectively. The contents of the wells were incubated for 30 minutes at 4 ° C with gentle shaking, after which the wells were washed twice with binding buffer, and a second antibody, * · · goat 3.251-1 unlabelled anti-mouse IgG was added at 50 · · · * nCi / 100 microliters. Goat 3-251-labeled anti-mouse antibody was prepared using Iodogen preparation (Pierce) by Fraker, P.J. et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 80 (1978) · V · 849). After 30 minutes at 4 ° C, the cells were washed twice with 200 microliters of binding buffer and sperm. ···, the cell layer was solubilized by adding 100 microliters of 0.1 N · · · · * sodium hydroxide solution. This batch of 100 microliters was counted on a Beckman model 5500 gamma counter. The specific scintillation bound / min was calculated from the formula [scintillation / min with monoclonal antibody] to [scintillation / min with X63]. All 107451 46 steps, including induction with specific reagents, were performed in 4-fold duplicate assays.

Interleukiini-1:n, jonka puoliintumisaika ICAM-l-induktiossa on 2 tuntia, vaikutus oli nopeampi kuin gamma-interferonin, jonka puoliintumisaika on 3,75 tuntia (kuvio 6). Aikakäyrä paluussa ICAM-1-1epotasoi11 e vaikutti riippuvan solusyklistä tai solu-kasvunopeudesta. Lepotilassa olevissa soluissa interleukiini-l:n ja gamma-interferonin vaikutukset ovat stabiileja 2-3 päivän ajan, kun taas log-faasiviljelmissä ICAM-1-ilmennys pysyttelee lähellä pohjatasoa 2 päivää näiden indusorien poistamisen jälkeen.The effect of interleukin-1 with a half-life of 2 hours in ICAM-1 induction was faster than that of interferon-gamma with a half-life of 3.75 hours (Figure 6). The time curve on the return to ICAM-1-depot appeared to be dependent on the cell cycle or cell growth rate. In dormant cells, the effects of interleukin-1 and interferon-gamma are stable for 2 to 3 days, whereas in log phase cultures, ICAM-1 expression remains near baseline for 2 days after removal of these inducers.

Kuviossa 7 on esitetty annos-vastekuvaajät ICAM-1-induktiol1 e yhdistelmä-hiiri- ja yhdistelmä-humaani-interleukiini-1:1lä ja yhdistelmä-humaani-gamma-interferonilla. Gamma-interferonilla ja interleukiini-1:11ä todettiin olevat samankaltaiset pitoi-suusriippuvuudet, jolloin vaikutukset pitoisuudessa 1 ng/ml olivat lähes identtiset. Humaani- ja hiiri-yhdistelmä-inter-leukiini-1:1 lä oli niinikään samankaltaiset kuvaajat, mutta ne ovat paljon vähemmän tehokkaita kuin humaani-interleukiini-1-valmisteet ICAM-l-ilmennyksen indusoinnissa.Figure 7 shows the dose response curves for ICAM-1 induction with recombinant mouse and recombinant human interleukin-1 and recombinant human gamma interferon. Interferon gamma and interleukin-1 were found to have similar concentration-dependencies with almost identical effects at 1 ng / ml. Human-murine recombinant interleukin-1 also had similar curves but is much less effective than human interleukin-1 preparations in inducing ICAM-1 expression.

Sykloheksamidi, joka inhiboi proteiinisynteesiä, ja aktinomy- « · · 1/. siini-D, joka inhiboi mRNA-synteesiä, tuhoavat sekä interleu- • * · • · · * kiini-l:n että gamma-interferonin vaikutukset ICAM-l-ilmen- nykseen sidekudosmuodostussoluilla (taulukko 4). Lisäksi • · · *·*.* tunikamysiini, joka inhiboi N-kytkenteistä glykosylaatiota, V* inhiboi interleukiini-1:n vaikutusta vain 43 %:lla. Nämä j tulokset osoittavat, että proteiini- ja mRNA-synteesi, mutta ei .···. N-kytkenteinen glykosylaatio, ovat edellytyksiä interleukiini- * · 1- ja gamma-interferoni-stimuloiduille ICAM-l-ilmennyksen *·*·* nousuille.Cyclohexamide, which inhibits protein synthesis, and actinomycin. S-D, which inhibits mRNA synthesis, abolishes the effects of both interleukin-1 and gamma-interferon on ICAM-1 expression on connective tissue-forming cells (Table 4). In addition, • · · * · *. * Tunicamycin, which inhibits N-linked glycosylation, V * inhibits the effect of interleukin-1 by only 43%. These results indicate that protein and mRNA synthesis, but not. ···. N-linked glycosylation are prerequisites for interleukin * · 1 and gamma interferon-stimulated increases in ICAM-1 expression * · * · *.

« ♦ 47 107451 TAULUKKO 4«♦ 47 107451 TABLE 4

Sykioheksimidin, aktinomysiini-D:n ja tunikamysiinin vaikutukset ICAM-l-induktioon IL-l:llä ja gamma-IFN:1lä ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluillaa ~ TTs : Γ T7-!Effects of cycloheximide, actinomycin D, and tunicamycin on induction of ICAM-1 by IL-1 and gamma-IFN on human skin connective tissue formation cells ~ TTs: Γ T7-!

Vuohen I-anti-hiiri-IgGGoat I-anti-mouse IgG

spesifinen sitoutuminen (tuike/ , mm.specific binding (scintillation /, mm.

Käsittely_anti-ICAH-1 Tnti-HLft-A. B.CProcessing_anti-ICAH-1 Tnti-HLft-A. B.C.

Verrokki (4 h) 1524 ± 140 11928 + 600 + sykloheksimidi 1513 + 210 10678 + 471 + aktinomysiini D 1590 + 46 12276 + 608 + tunikamysiini 1461 + 176 12340 + 940 IL 1 (10 U/ml) (4 h.) 4264 ± 249 12155 + 510 + sykloheksimidi · 1619 + 381 12676 + 446 + aktinomysiini D 1613 + 88 12294 + 123 + tunikamysiini 3084 + 113 13434 + 661 IFN-τ' (10 U/ml) (18 h) 4659 ± 109 23675 ± 500 + sykloheksimidi 1461 + 59 10675 + 800 + aktinomysiini D 1326 + 186 12089 + 550Control (4 h) 1524 ± 140 11928 + 600 + cycloheximide 1513 + 210 10678 + 471 + actinomycin D 1590 + 46 12276 + 608 + tunicamycin 1461 + 176 12340 + 940 IL 1 (10 U / ml) (4 h) 4264 ± 249 12155 + 510 + cycloheximide · 1619 + 381 12676 + 446 + actinomycin D 1613 + 88 12294 + 123 + tunicamycin 3084 + 113 13434 + 661 IFN-τ '(10 U / ml) (18h) 4659 ± 109 23675 ± 500 + cycloheximide 1461 + 59 10675 + 800 + actinomycin D 1326 + 186 12089 + 550

« i I · I«I I · I

* 4 ( 4 4 t* 4 (4 4 t

• · I• · I

i « · t I 4 f 1 4 4 4 1 » · · • · aIhmisen sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x • · · 104 solua/0,32 cm2 kuoppa. Käsittelyt suoritettiin 50 . . mikrolitran lopputilavuudessa, joka sisälsi mainitut 9 9 · *.1 reagenssit. Sykioheksimidiä, aktinomysiini-D : tä ja \1 1 tunikamysiinia lisättiin pitoisuus 20 mikrogrammaa/ml, 10 • mikro-M ja vastaavasti 2 mikrogrammaa/ml sytokiinien kanssa « · · « .**·. samanaikaisesti. Kaikki lukemat ovat keskiarvoja 4-kertaisista • · · rinnakkaismäärityksistä, +/- SD.Human fibroblasting cells were grown to a density of 8 x 10 4 cells / 0.32 cm 2 in a well. Treatments were performed 50. . in a final volume of microliter containing said 9 9 · * .1 reagents. Cycloheximide, actinomycin D and 1 l tunicamycin were added at a concentration of 20 µg / ml, 10 µM and 2 µg / ml, respectively, with the cytokines «· ·«. ** ·. simultaneously. All readings are averages of 4 × duplicate assays, +/- SD.

• · « • · · · 107451 48 ESIMERKKI 13 ICAM-l:n kudos jakauma107451 48 EXAMPLE 13 ICAM-1 Tissue Distribution

Kudosopi11iset tutkimukset suoritettiin käyttäen jäädytettyä humaani-elinkudosta ICÄM-l:n jakauman määrittämiseksi kateen-korvassa, imusolmukkeissa, suolessa, ihossa, munuaisissa ja maksassa. Tällaisen analyysin suorittamiseksi normaaleista ihmiskudoksista peräisin olevia jäädytettyjä kudosleikkeitä (paksuus 4 mikrometriä) kiinnitettiin asetonissa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen ne värjättiin monoklonaalisella vasta-aineella RR1/1 immunoperoksidaasitekniikaa käyttäen, jolloin suorituksessa käytettiin avidiini-biotiinikompleksimenetelmää (Vector Laboratories, Burlingame, CA), jota kuvaavat Cerf-Bensussan, N., et ai . (J. Immunol. 130 (1983) 2615). Vasta-aineella inkuboinnin jälkeen leikkeitä inkuboitiin toisiaan seuraten biotinyloidulla hevosen anti-hiiri-IgG:1lä ja avidiini-biotinyloiduilla peroksidaasikompleksei11 a. Leikkeet kastettiin lopuksi liuokseen, jossa oli 3-amino-9-etyylikar-,·, batsolia (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) I I 4 värireaktion kehittämiseksi. Leikkeitä kiinnitettiin sitten 4- < i i prosenttisessa formaldehydiliuoksessa 5 minuutin ajan, minkä jälkeen ne vastavärjättiin hematosykliinillä. Verrokkeina käytettiin leikkeitä, joita inkuboitiin ei-sukulaismonoklo-naal ivasta-ainei 11 a RRl/l-vasta-aineen asemesta.Histological studies were performed using frozen human organ tissue to determine the distribution of ICÄM-1 in the udder, lymph nodes, intestine, skin, kidneys and liver. To perform such an analysis, frozen sections of tissue from normal human tissues (4 micrometre thickness) were fixed in acetone for 10 minutes, then stained with RR1 / 1 monoclonal antibody using immunoperoxidase technique using the Avidin-Biotin Complex method, describe Cerf-Bensussan, N., et al. (J. Immunol. 130: 2615 (1983)). After incubation with antibody, sections were incubated sequentially with biotinylated equine anti-mouse IgG and avidin-biotinylated peroxidase complexes. The sections were finally dipped in a solution of 3-amino-9-ethylcarb, Inc., Milwaukee, WI) II 4 for color reaction development. The sections were then fixed in 4% formaldehyde solution for 5 minutes, after which they were counterstained with hematocycline. Sections incubated with non-related monoclonal antibody 11a instead of RR1 / I antibody were used as controls.

» · · • · · * · · ICAM-l:n jakauma todettiin hyvin samanlaiseksi kuin pääasial-lisen kudosyhteensopivuuskompleksin (MHC) luokka-II-antigee- • t ;*·*; nien. Suurin osa verisuonista (sekä pienistä että suurista) . *. kaikissa kudoksissa osoitti endoteelisolujen värjääntymistä • · · ··· * ICAM-l-vasta-aineel 1 a. Verisuonten endoteelivärjäys oli voi- « « · • · *···* makkaampaa follikkelien välisillä (parakortikaali-) alueilla :Y: imusolmukkeissa, risoissa ja Peyerin imusolmukkeissa kuin munuaisten, maksan ja normaalin ihon verisuonissa. Maksassa värjäys oli valtaosin rajoittunut hiussuonipoukamavuorisolui-hin; maksasolut ja endoteelisolut valtaosan porttilaskimoista 107451 49 ja -valtimoista seinämissä eivät olleet värjääntyneet.The distribution of ICAM-1 was found to be very similar to that of Major Tissue Compatibility Complex (MHC) Class II antigens; * · *; proteins. Most blood vessels (both small and large). *. in all tissues showed staining of endothelial cells with ICAM-1 antibody 1a. Vascular endothelial staining was more pronounced in the follicular (paracortical) areas: Y: in lymph nodes, in the tonsils and Peyer's lymph nodes as well as in the kidneys, liver and normal skin. Liver staining was largely limited to capillary cortex cells; liver cells and endothelial cells in the vast majority of portal veins 107451 49 and arteries in the walls had not been stained.

Kateenkorvaytimessä havaittiin suurien solujen diffuusia värjääntymistä ja dendriittinen värjäyskuvio. Korteksissa värjäyskuvio oli paikallinen ja ja pääasiassa dendriittinen. Kateenkorvasolut eivät värjääntyneet. fiäreisimukudoksessa sekundaaristen imurakkuloiden imusolmuke-itusolut olivat voimakkaasti värjääntyneet. Joissain imurakkuloissa värjäys-kuvio oli valtaosin dendriittinen, jolloin imusolujen näkyvää värjääntymistä ei ollut todettavissa. Havaittiin myös solujen heikkoa värjääntymistä vaippavyöhykkeellä. Lisäksi sytoplas-majatkeita käsittävät dendriittisolut (interdigitaatio-retikulosolut) ja pieni osuus imusoluista follikkelien välisillä tai parakortikaali-alueilla värjääntyivät ICAM-l:n sitovalla vasta-aineella.Diffuse staining of large cells and a dendritic staining pattern were observed in the thymus. In the cortex, the staining pattern was local and predominantly dendritic. The thymus cells did not stain. lymph node germ cells of secondary lymphocytes were severely stained in fetal lobe tissue. In some lymphoid cells, the staining pattern was predominantly dendritic, with no apparent staining of the lymphocytes. Slight staining of cells in the mantle band was also observed. In addition, dendritic cells (interdigitation reticulocytes) and cytoplasmic microvasculature and a small proportion of lymphocytes in the intercellular or paracortical regions were stained with ICAM-1 binding antibody.

Syöjäsoluja muistuttavat solut värjääntyivät imusolmukkeissa ja ohutsuolen keskikerroksessa. Useimpien tutkittujen elimien peruskudokseen hajaantuneet sidekudosmuodostussolujen kaltaiset (kierteen muotoiset) solut ja dendriittisolut värjääntyivät ICAM-l:n sitovalla vasta-aineella. Värjääntymistä ei havaittu Langerhans/indeterminanttisoluissa orvaskedessä . Vär jääntymistä • ‘ ei havaittu si 1eälihaskudoksessa.Phagocytes resemble the cells were stained in the lymph nodes and small intestine in the middle layer. Connective tissue-like (helical) cells and dendritic cells dispersed in the basal tissue of most organs examined were stained with ICAM-1 binding antibody. No staining was observed in Langerhans / indeterminant cells in the epidermis. No discoloration was observed in the myocardial tissue.

• « • · * • · · • · : Epiteelisolujen värjääntymistä todettiin toistettavalla tavalla risojen limakalvossa. Vaikka maksasolut, sappitiehytepiteeli, suolen epiteelisolut ja putkimaiset epiteelisolut munuaisissa • « eivät vär jääntyneet useimmissa tapauksissa, normaal imunuaisku-·_ dosleikkeet, jotka oli saatu munuaissolusyöpäliitteisestä * · t •J ! munuaisenpoistonäytteestä, osoittivat monien proksimaali-Repetitive staining of epithelial cells in the mucosa of the tonsils was observed. Although the liver cells, sappitiehytepiteeli, intestinal epithelial cells, and tubular epithelial cells in the kidney • «col jääntyneet do not, in most cases, normaal imunuaisku- · _ sections were obtained munuaissolusyöpäliitteisestä * · t • J! renal excision specimen showed many proximal

«•I«I •

putkisolujen ICAM-l-värjääntymistä. Nämä putkiepiteelisolut vär jääntyivät myös HLA-DR-vastaisel la si toutumisvasta-aineel 1 a.ICAM-1 staining of tubular cells. These tubular epithelial cells also stained with anti-HLA-DR binding antibody 1a.

* »* »

Yhteenvetona ICAM-1 ilmentyy ei-vertamuodostavilla soluilla kuten verisuonten endoteelisolut ja vertamuodostavi1la soluilla so 107451 kuten kudoksen syöjäsolut ja mitogeeni-stimuloidut T-imusolu-emosolut. ICAM-1:n todettiin ilmentyvän alhaisina pitoisuuksina ääreisveren imusoluilla.In summary, ICAM-1 is expressed on non-hematopoietic cells such as vascular endothelial cells and hematopoietic cells, i.e., 107451, such as tissue cancer cells and mitogen-stimulated T lymphocyte stem cells. ICAM-1 was found to be expressed at low concentrations in peripheral blood lymphocytes.

ESIMERKKI 14 ICAM-l:n puhdistaminen monoklonaalivasta-aine-affiniteettikromatografiallaEXAMPLE 14 Purification of ICAM-1 by Monoclonal Antibody Affinity Chromatography

Puhdistuksen vleiskaavio ICAM-1 puhdistettiin humaanisoluista tai -kudoksesta käyttäen monoklonaalivasta-aine-affiniteettikromatografiaa. Monoklonaa-linen vasta-aine, RR1/1, joka reagoi ICAM-l:n kanssa, puhdistettiin ensin ja kytkettiin sitten inerttiin koionnimatriisiin. Tätä vasta-ainetta kuvaavat Rothlein, R., et ai ., J. Immunol.Flow chart for purification ICAM-1 was purified from human cells or tissue using monoclonal antibody affinity chromatography. The monoclonal antibody, RR1 / 1, which reacts with ICAM-1, was first purified and then coupled to an inert clone matrix. This antibody is described by Rothlein, R., et al., J. Immunol.

137 (1986) 1270 - 1274, ja Dustin, M.L., et ai . (J.Immunol. 137 (1986) 245). ICAM-1 liuotettiin solumembraaneista tuottamalla soluihin lyysi ei-ionisessa pesuaineessa, Triton X-100, lähellä neutraalia olevassa pH:ssa. Liuenneen ICAM-l:n sisältävä solu-' lysaatti käytettiin sitten esikolonneissa, joiden tehtävänä oli poistaa materiaaleja, jotka sitoutuvat ei-spesifisesti kolonni- ‘ matriisimateriaaliin, ja sitten monoklonaalivasta-ainekolonni- 1(1’ matriisin läpi, jotta ICAM-1 saattoi sitoutua vasta-aineeseen.137: 1270-1274 (1986) and Dustin, M.L., et al. (J. Immunol. 137: 245 (1986)). ICAM-1 was solubilized from cell membranes by producing lysis in cells in a nonionic detergent, Triton X-100, at a pH near neutral. The cell lysate containing the dissolved ICAM-1 was then used in pre-columns designed to remove materials that bind non-specifically to the column matrix material and then through the monoclonal antibody column-1 (1 ') to allow ICAM-1 to bind antibody.

« ( i«(I

Sitten vasta-ainekolonni pestiin sarjalla pesuaine-pesupusku- • · · ·.· · reita, joiden pH kasvoi aina 11,0 :aan. Näiden pesujen aikana ICAM-1 pysyi sitoutuneena vasta-ainematriisiin, kun taas ei-sitoutuvia ja heikosti sitoutuneita epäpuhtauksia poistui.The antibody column was then washed with a series of detergent wash buffer with pH up to 11.0. During these washes, ICAM-1 remained bound to the antibody matrix, while non-binding and weakly bound impurities were removed.

· ·1;. Sitoutunut ICAM-1 eluoitiin sitten spesifisesti kolonnista . 1. käyttämällä pesuainepuskuria, jonka pH oli 12,5.· · 1 ;. Bound ICAM-1 was then specifically eluted from the column. 1. using a detergent buffer having a pH of 12.5.

• · · • · · • · · · · · • · ’···1 Monokl onaal isen vasta-aineen RR1/1 puhdistaminen ia kovalentti : kytkeminen Sepharose C1-4B -geeliin « · ICAM-l-vastainen monoklonaalinen vasta-aine RR1/1 puhdistettiin hybridooman käsittävien hiirien vatsaontelonesteestä tai hybri- 107451 51 doomaviljelmäsupernatan-teista tavanomaisilla tekniikoilla ammoniumsulfaatilla seostamalla ja käyttämällä proteiini-A-affiniteettikromatografiaa (Ey, et ai.. Immunochem. 15 (1978) 429). Puhdistettu IgG, tai rotan IgG:tä (Sigma Chemical Co.,Purification and Covalent Monoclonal Antibody RR1 / 1: Coupling to Sepharose C1-4B Gel «· Anti-ICAM-1 Monoclonal Antibody RR1 / 1 was purified from the peritoneal fluid or hybridoma mice containing hybridoma mice by conventional techniques of ammonium sulfate blending and using protein A affinity chromatography (Ey, et al., Immunochem. 15 (1978) 429). Purified IgG, or rat IgG (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO) kytkettiin kovalentisti Sepharose C1-4B -geeliin (Pharmacia, Upsala, Ruotsi) käyttäen muunnosta Marchin et ai. (Anal.Biochem. 60 (1974) 149) menetelmästä. Lyhyesti, Sepharose C1-4B pestiin tislatulla vedellä, aktivoitiin käyttäen 40 mg/ml CKBrrää 5 M kaiiumvetyfosfaatti1iuoksessa (pH noin 12) 5 minuutin ajan ja pestiin sitten perusteellisesti 0,1 mM kloorivetyhapolla 4 °C:ssa. Suodatettu aktivoitu Sepharose uudelleenlietettiin vastaavaan tilavuuteen puhdistettua vasta-ainetta (2 - 10 mg/ml 0,1 M natriumvetykarbonaattiliuoksessa, 0,1 M NaCl). Lietettä inkuboitiin 18 tunnin ajan 4 °C:ssa pyörittäen kevyesti ympäri. Sitten supernatantista tutkittiin ei-sitoutuneen vasta-aineen läsnäolo mittaamalla absorbanssi 280 nm:n aallonpituudella, ja aktivoidun Sepharosen jäljellä olevat reaktiiviset keskukset kyllästettiin lisäämällä glysiiniä pitoisuuteen 0,05 M. Kytkentäteho oli tavallisesti ' i c i·:, > 90 %.St. Louis, MO) was covalently coupled to a Sepharose C1-4B gel (Pharmacia, Uppsala, Sweden) using the modification of Marchin et al. (Anal. Biochem. 60, 149 (1974)). Briefly, Sepharose C1-4B was washed with distilled water, activated using 40 mg / ml CKBr in 5M potassium hydrogen phosphate solution (pH about 12) for 5 minutes and then thoroughly washed with 0.1 mM hydrochloric acid at 4 ° C. The filtered activated Sepharose was resuspended in an equal volume of purified antibody (2-10 mg / ml in 0.1 M sodium bicarbonate solution, 0.1 M NaCl). The slurry was incubated for 18 hours at 4 ° C with gentle rotation. The supernatant was then assayed for the presence of unbound antibody by measuring absorbance at 280 nm, and the remaining reactive centers of activated Sepharose were saturated by the addition of glycine to a concentration of 0.05 M. The coupling efficiency was usually 90%.

* * I 4 • ( "Ihmisen pernasta valmistettujen membraanien liuottaminen « I i I ( . , pesuaineel1 a • * t * · · • ·* * I 4 • ("Solubilization of Human Spleen Membranes« I i I (., With detergent a * * t * · · • ·

(M(M

*.* * Kaikki operaatiot suoritettiin 4 °C:ssa. Jäädytetyt ihmisen pernat (200 g:n fragmentteina), jotka oli saatu karvainen : solu-leukemiaa potevista potilaista, sulatettiin jäissä 200 mlrssa Tris-suolaliuosta (50 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH 7,4, 4 . °C), jossa oli pitoisuus 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia • · · *!!.’ (PMSF), 0,2 U/ral aprotiinia ja 5 mM jodoasetamidia. Kudos • · *·;*’ leikeltiin pieniksi palasiksi ja homogenoitiin 4 °C:ssa Tekmar- : tehohomogenisaattorissa. Tilavuus täytettiin sitten 300 ml:ksi ·:*·; lisäämällä Tris-suolaliuosta ja lisättiin 100 ml 10-%:ista*. * * All operations were performed at 4 ° C. Frozen human spleens (in 200 g fragments) obtained from hairy: patients with cell leukemia were thawed in ice in 200 ml of Tris saline (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, pH 7.4, 4 ° C). containing 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride · PMF (0.2 PM), 0.2 U / ml aprotin and 5 mM iodoacetamide. The tissue • · * ·; * 'was cut into small pieces and homogenized at 4 ° C in a Tekmar- power homogenizer. The volume was then filled to 300 ml ·: * ·; by adding Tris saline and 100 ml of 10% was added

Tween 40 - (polyoksietyleenisorbitaanimonopalmitaatti-) liuosta Tris-suolaliuoksessa, jolloin Tween 40 -valmisteen loppupitoi- 52 107451 suudeksi tuli 2,5 %.A solution of Tween 40 (polyoxyethylene sorbitan monopalmitate) in Tris saline to give a final concentration of Tween 40 of 10 5 107 451 was 2.5%.

Membraanien valmistamiseksi homogenaattia uutettiin käyttäen kolmea iskua Dounce-, tai edullisemmin Teflon Potter Elvejhem -homogenisaattorissa, minkä jälkeen sentrifugoitiin 1000 x g:ssä 15 minuutin ajan. Supernatantti otettiin talteen ja pellettiä uutettiin toistamiseen 200 ml :11a 2,5-%:ista Tween 40 -liuosta Tris-suolaliuoksessa. Seosta sentrifugoitiin 1000 x g:ssä 15 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantit kummastakin uutosta yhdistettiin ja niitä sentrifugoitiin 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan membraanien pel1etoimiseksi. Membraanit pestiin uudelleen-liettämällä 200 ml:aan Tris-suolaliuosta sentrifugoiden 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Membraanipel1etti uudel1eenlietettiin 200 ml:aan Tris-suolaliuosta ja homogenoitiin moottorikäyttöisessä homogenisaattorissa käyttäen Tef1on-survinta, kunnes liete oli tasaisen samea. Sitten tilavuus täytettiin 900 ml.'ksi lisäämällä Tris-suolaliuosta ja lisättiin N-lauroyylisarkosii-nia 1oppupitoisuuteen 1 %. Seosta sekoitettiin 4 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen ei-liukoinen materiaali pesuaine- I I ! "... lysaatissa poistettiin sentrif ugoimal la 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Sitten supernatanttiin lisättiin Triton X-100- I l I [ valmistetta 1oppupitoisuuteen 2 % ja lysaattia sekoitettiin 4 °C:ssa 1 tunnin ajan.To prepare membranes, the homogenate was extracted using three strokes in a Dounce, or more preferably Teflon Potter Elvejhem homogenizer, followed by centrifugation at 1000 x g for 15 minutes. The supernatant was recovered and the pellet was repeatedly extracted with 200 ml of 2.5% Tween 40 in Tris saline. The mixture was centrifuged at 1000 x g for 15 minutes, after which the supernatants from each extract were pooled and centrifuged at 150,000 x g for 1 hour to pellet the membranes. The membranes were washed by re-slurry in 200 mL of Tris saline by centrifugation at 150,000 x g for 1 hour. The membrane pellet was resuspended in 200 ml of Tris saline and homogenized in a motor-driven homogenizer using a Tef1on pestle until the slurry was uniformly cloudy. The volume was then filled to 900 ml by addition of Tris saline and N-lauroyl sarcosine was added to a final concentration of 1%. The mixture was stirred at 4 ° C for 30 minutes, after which the insoluble material in detergent! "... the lysate was removed by centrifugation at 150,000 x g for 1 hour. Then, Triton X-100 was added to the supernatant to a final concentration of 2% and the lysate was stirred at 4 ° C for 1 hour.

« 1 • ai • i « • « • · e V '* JY-B-varhaisimusol ui en pesuaine- liuotus«1 • ai • i« • «• · V '* JY-B Early Cells Detergent Dissolution

EBV-transf ormoitua B-varhaisimusolul in jaa JY kasvatettiin RPMIEBV-transfected B-early progenitor cell JY was grown in RPMI

• · 1640 -kasvualustassa, joka sisälsi pitoisuudet 10 % vasikansi-,·, kiöseerumia (FCS) ja 10 mM Hepes, solutiheyteen noin 0,8 - • » t ••j* 1,0 x 106 solua/ml . ICAM-l:n solupintailmennyksen lisäämiseksi * · *···’ lisättiin forboli-12-myristaatti-13-asetaattia (PMA:ta) « pitoisuuteen 25 ng/ml 8-12 tunniksi ennen kuin solut otettiin • · • :..j talteen. Viljelmiin lisättiin tällöin myös natriumvanadaattia (50 mikro-M). Solut pelletoitiin sentrifugoimal1 a 500 x g:ssä 10 minuutin ajan ja pestiin sitten kahdesti Hankin tasapainoi- 107451 53 tetulla suolaliuoksella (HBSS) uudelleenliettämällä ja sentrifugoimalla. Soluihin (noin 5 g 5 litrassa viljelmää) tuotettiin lyysi 50 ml:ssa lyysipuskuria (0,14 NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0, 1 % Triton X-100, 0,2 U/ml aprotiini, 1 mM PMSF, 50 mikro-M natriumvanadaatti) sekoittamalla 4 °C:ssa 30 minuutin ajan. Ei-lyysin läpikäyneet tumat ja ei-liukoinen jäte sentrifugoitiin eroon 10 000 x g:ssä 15 minuutissa, minkä jälkeen supernatanttia sentrifugoitiin 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan ja suodos suodatettiin Whatmanin 3 mm:n suodatinpaperin läpi.1640 medium containing 10% fetal calf serum (FCS) and 10 mM Hepes at a cell density of about 0.8 x 10 6 cells / ml. To increase the cell surface expression of ICAM-1, phorbol-12 myristate-13 acetate (PMA) was added to 25 ng / ml for 8-12 hours before the cells were harvested. recovered. Sodium vanadate (50 microM) was also added to the cultures. The cells were pelleted by centrifugation at 500 x g for 10 minutes and then washed twice with Hank's equilibrated 107451 53 saline (HBSS) by resuspension and centrifugation. Cells (approximately 5 g in 5 liters of culture) were lysed in 50 ml lysis buffer (0.14 NaCl, 50 mM Tris, pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.2 U / ml aprotin, 1 mM PMSF). 50 microM sodium vanadate) with stirring at 4 ° C for 30 minutes. The non-lysed nuclei and insoluble waste were centrifuged at 10,000 x g for 15 minutes, after which the supernatant was centrifuged at 150,000 x g for 1 hour and the filtrate was filtered through Whatman 3 mm filter paper.

ICAM-l:n affiniteettikromatografia silmälläpitäen rakennetutkimuksia ICÄM-l:n puhdistamiseksi suuressa mittakaavassa rakennetutkimuksissa käytettäväksi käytettiin kolonnia, jossa oli 10 ml RRl/l-Sepharose C1-4B -geeliä (kytkentä 2,5 mg vasta-ainetta/ ml geeliä) ja kahta esikolonnia, joissa oli 10 ml CNBr-aktivoitua, glysiinillä sammutettua Sepharose C1-4B -geeliä ja • · · rotta-IgG:tä kytkettynä Sepharose C1-4B -geeliin (2 mg/ml).ICAM-1 Affinity Chromatography for Structural Studies For purification of ICÄM-1 on a large scale, a column containing 10 ml of RR1 / 1-Sepharose C1-4B gel (coupling 2.5 mg antibody / ml gel) was used and two were used. precolumns containing 10 ml of CNBr-activated glycine-quenched Sepharose C1-4B gel and • · · rat IgG coupled to Sepharose C1-4B gel (2 mg / ml).

t « |t «|

Kolonnit kytkettiin sarjaksi ja esipestiin 10 koionniti 1 avuu- • « della lyysipuskuria, 10 kolonnitilavuudel la pH 12,5 -puskuria 107451 54The columns were connected in series and pre-washed with 10 columns of 1 lysis buffer, 10 column volumes of pH 12.5 buffer 107451 54

Triton X-100, ja 4) 50 mM trietyyliamiini, pH 11,0/0,1 % Triton X-100. Kaikki pesupuskurit sisälsivät pitoisuuden 1 mM PMSF ja 0,2 U/ml aprotiinia. Pesun jälkeen jäljelle jäänyt sitoutunut ICAM-1 eluoitiin 5 kolonnitilavuudella eluointipuskuria (50 mM trietyyliamiini/0,1 % Triton X-100/pH 12,5, 4 °C) virtausnopeudella 1 ml/3 min. Eluoitu ICAM-1 kerättiin 1 ml:n fraktioina ja neutraloitiin välittömästi lisäämällä 0,1 ml liuosta 1 M Tris, pH 6,7. ICAM-l:tä sisältävät fraktiot identifioitiin suorittamalla SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi 10 mikrolitran erille (Springer et ai., J.Exp.Med. 160 (1984) 1901), ja sen jälkeen hopeavärjäys (Morrissey, J.H., Anal .Biochem. 117 (1981) 307). Näissä olosuhteissa valtaosa ICAM-l:stä eluoitui noin 1 kolonnitilavuudessa ja sen puhtausaste oli yli 90 % hopealla värjätyistä elektroferogrammeista arvioiden (pääasiallinen epäpuhtaus oli pieni määrä IgG:tä, joka oli vuotanut affini-teettimatriisista). ICAM-l:tä sisältävät fraktiot yhdistettiin ja niitä konsentroitiin noin 20-kertaisesti käyttäen Centricon-30-mikrokonsentraattoreita (Amicon, Danvers, MA). Puhdistettu ICAM-1 kvantitoitiin suorittamalla Lowryn proteiinimääritys i i t * etanolilla saostetusta pool inäy tteestä : 200 g:sta ihmisenTriton X-100, and 4) 50 mM triethylamine, pH 11.0 / 0.1% Triton X-100. All wash buffers contained 1 mM PMSF and 0.2 U / ml aprotin. After washing, the residual bound ICAM-1 was eluted with 5 column volumes of elution buffer (50 mM triethylamine / 0.1% Triton X-100 / pH 12.5, 4 ° C) at a flow rate of 1 ml / 3 min. The eluted ICAM-1 was collected in 1 mL fractions and immediately neutralized by the addition of 0.1 mL of 1 M Tris pH 6.7. Fractions containing ICAM-1 were identified by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in 10 microliter aliquots (Springer et al., J.Exp.Med. 160 (1901) 1901) followed by silver staining (Morrissey, J.H., Anal. Biochem. 117 (1981) ) 307). Under these conditions, the vast majority of ICAM-1 eluted at about 1 column volume and had a purity of greater than 90% on silver-stained electropherograms (the main impurity was a small amount of IgG that had leaked from the affinity matrix). Fractions containing ICAM-1 were pooled and concentrated approximately 20-fold using Centricon-30 microconcentrators (Amicon, Danvers, MA). Purified ICAM-1 was quantified by performing a Lowry protein assay on a pooled sample of ethanol: 200 g human

i ( Ii (I

pernaa saatiin tuotettua noin 500 mikrogrammaa puhdasta ICAM-spleen produced about 500 micrograms of pure ICAM

I II I

l:tä.from.

4 I I I I I I4 I I I I I I

• ( « « « V.1 Noin 200 mikrogrammalla puhdistettua ICAM-1:tä suoritettiin• («« «V.1 About 200 micrograms purified ICAM-1 was performed

• M• M

V · toinen puhdistusvaihe käyttäen preparatiivista SDS-polyakryy- liamidigeelielektroforeesia. ICAM-1:tä vastaava nauha tehtiin :V: näkyväksi liottamalla geeliä 1 M kaiiumkloridi1iuoksessa. ICAM- o · ·1·1: l:n sisältävä geeli-alue leikattiin sitten irti ja sillä suori- . 1, tettiin elektroeluutio Hunkapi11 erin et ai., Meth.Enzymol. 91 • Il **;, (1983) 227 - 236, menetelmän mukaan. Puhdistetun proteiinin *···1 puhtausaste oli > 98 % SDS-PAGE:n ja hopeavärjäyksen nojalla :Y: pääteltynä.V · Second purification step using preparative SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The band corresponding to ICAM-1 was made: V: visible by soaking the gel in 1 M potassium chloride solution. The gel region containing the ICAM-1 · 1: 1 was then excised and applied directly. 1, electroelution was performed by Hunkapi11 Erin et al., Meth. Enzymol. 91, II **, 227-236 (1983). The purity of the purified protein * ··· 1 was> 98% by SDS-PAGE and silver staining: Y: inferred.

t · · 107451 55 ICAM-l:n affiniteettipuhdistus funktionaalisia tutkimuksia silmälläpitäen ICAM-1:tä käytettäväksi funktionaalisissa kokeissa puhdistettiin JY-solujen pesuainelysaateista edellä kuvatun mukaisesti, mutta pienemmässä mittakaavassa (1 ml:n kolonni, jossa RR1/1-Sepharosea), ja käyttäen seuraavia modifikaatioita. Kaikki liuokset sisälsivät pitoisuuden 50 mikro-M natriumvanadaattia. Kun kolonni oli pesty pH 11,0 -puskurilla, jossa oli 0,1 % Triton X-100 -valmistetta, kolonni pestiin jälleen viidellä kolonnitilavuudella samaa puskuria, joka sisälsi 1 %:n n-oktyyli-beeta-D-glukopyranosidia (oktyyliglukosidi) 0,1 %:n Triton X-100 -valmistetta asemesta. Oktyyliglukosidipesuaine korvaa ICAM-l:een sitoutuneen Triton X-100 -valmisteen ja vastoin kuin Triton X-100, se voidaan sittemmin poistaa dialysoimal1 a. ICAM-1 eluoitiin sitten pH 12,5 -puskurilla, jossa oli 1 % oktyyliglukosidia 0,1 %:n Triton X-100-valmis-tetta asemesta, minkä jälkeen se analysoitiin ja konsentroitiin kuten edellä kuvattu.t · · 107451 55 ICAM-1 affinity purification for functional assays ICAM-1 for use in functional assays was purified from JY cell detergent as described above, but on a smaller scale (1 ml column with RR1 / 1-Sepharosea), and using the following modifications. All solutions contained 50 microM sodium vanadate. After washing the column with pH 11.0 buffer containing 0.1% Triton X-100, the column was again washed with five column volumes of the same buffer containing 1% n-octyl-beta-D-glucopyranoside (octylglucoside) Instead of 0.1% Triton X-100. The octyl glucoside detergent replaces Triton X-100 bound to ICAM-1 and, unlike Triton X-100, can subsequently be removed by dialysis. ICAM-1 was then eluted with pH 12.5 buffer containing 1% octyl glucoside 0.1% Triton X-100, followed by analysis and concentration as described above.

« I«I

/:·, ESIMERKKI 15 · Puhdistetun ICAM-1 :n ominaisuudet ( ( i |^ Ihmisen pernasta puhdistettu ICAM-1 migroituu SDS-polyakryy- « · · *·*·* liamidigeeieissä leveänä nauhana, jonka Mr on 72 000 - 91 000./: ·, EXAMPLE 15 · Properties of purified ICAM-1 ((i | ^ Human spleen-purified ICAM-1 migrates on SDS-polyacrylic-liamide gels with a broad band of 72,000-91,000) .

• · · ·.* ' JY-soluista puhdistettu ICAM-1 migroituu myös leveänä nauhana, jonka Mr on 76 500 - 97 000. Nämä Mr-arvot ovat eri soluläh- ::: teistä immuunisaostetul1 e ICAM-l:lle ilmoitetulla alueella: • ·ICAM-1 purified from JY cells also migrates in a broad band of Mr 76,500 to 97,000. These Mr values are from different cell sources in the area reported to ICAM-1: • ·

Mr = 90 OOO JY-soluille, 114 000 myelomonosyyttisolulinjal le . *. U937, ja 97 000 sidekudosmuodostussolui 11 e (Dustin et ai..Mr = 90 OOO for JY cells, 114,000 myelomonocyte cell lines. *. U937, and 97,000 for connective tissue formation cells of 11 e (Dustin et al.

· · J.Immunol. 137 (1986) 245). Tämä laaja Mr-alue on katsottu johtuvaksi voimakkaasta mutta vaihtelevästä glykosylaatioas-: : : teestä. Ei-glykosyloidun prekursorin Mr on 55 000 (Dustin et.· · J. Immunol. 137: 245 (1986)). This broad Mr region is considered to be due to the potent but variable glycosylation pathway. The non-glycosylated precursor has a Mr of 55,000 (Dustin et al.

·;··: ai..·-.) · Joko JY-soluista tai ihmisen pernasta puhdistetulla proteiinilla on tallella sen antigeeniaktiivisuus, minkä 107451 56 osoittavat sen kyky sitoutua uudelleen alkuperäiseen affini-teettikolonniin ja immuunisaostuminen RRl/l-Sepharose-geelissä ja SDS-polyakryyliamidielektroforeesi.·; ··: ai .. · -.) · Protein purified from either JY cells or human spleen retains its antigenic activity, as demonstrated by its ability to re-bind to the original affinity column and immunoprecipitation on RR1 / l-Sepharose gel and SDS. -polyakryyliamidielektroforeesi.

ICAM-l-peptidifragmenttien tuottamiseksi noin 200 mikrogrammaa pelkistettiin käyttäen seosta 2 mM ditiotreitoli/2 % SDS, minkä jälkeen alkyloitiin käyttäen 5 mM jodietikkahappoa. Proteiini saostettiin etanolilla ja uudel1eenlluotettiin liuokseen 0,1 M NH4CO3/O,1 mM CaCl2/0,l % Zwittergent 3-14 (Calbiochem), minkä jälkeen sitä pilkottiin pitoisuudella 1 % w/w trypsiiniä 37 °C:ssa 4 tunnin ajan, minkä jälkeen pilkottiin edelleen 1 %:lla trypsiiniä 12 tunnin ajan 37 °C:ssa. Trypsiinipeptidit puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC:11ä käyttäen 0,4 x 15 cm:n C4-kolonnia (Vydac). Peptidit eluoitiin käyttäen lineaarista gradienttia 0 % - 60 % asetonitriili/0,l-%:inen trifluorietik-kahappo. Valituilla peptideillä suoritettiin sekvenssianalyysi kaasufaasi-mikrosekventorilla (Applied Biosystems). Tästä tutkimuksesta saatu sekvenssi-informaatio on esitetty taulukossa 5.To produce ICAM-1 peptide fragments, about 200 micrograms was reduced using 2 mM dithiothreitol / 2% SDS followed by alkylation using 5 mM iodoacetic acid. The protein was ethanol precipitated and reconstituted in 0.1 M NH4CO3 / O, 1 mM CaCl2 / 0.1% Zwittergent 3-14 (Calbiochem), followed by digestion with 1% w / w trypsin at 37 ° C for 4 hours, followed by further digestion with 1% trypsin for 12 hours at 37 ° C. Trypsin peptides were purified by reverse phase HPLC using a 0.4 x 15 cm C4 column (Vydac). Peptides were eluted using a linear gradient of 0% to 60% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid. Selected peptides were subjected to sequence analysis with a gas-phase micros sequencer (Applied Biosystems). The sequence information obtained from this study is shown in Table 5.

• » • · · • · « • · · • · · « · · • · * * · • · · • · • ti • · • · · • * · • · · · t * • » 107451 57 TAULUKKO 5 ICAM-1-1rypsiinipeptidi en aminohapposekvenssit Amino- Peptidi happo- ——----- j äännös__50a 50b 46a 46b X 45 K AA J U 0 Ml• »• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • ••••••••••• 107451 57 TABLE 5 ICAM Amino Acid Sequences for -1-1 Trypsin Peptide Amino-Peptide Acid ——————————————————————————————— 50a 50b 46a 46b X 45 K AA 0

1 [T/V] A (V/A) E V S LE ALV L1 [T / V] A (V / A) E V S LE ALV L

2 F S Q PEFNLGLTL/E2 F S Q PEFNLGLTL / E

3 L IT ALPPDSGL P/(G)3 L IT ALPPDSGL P / (G)

4 T SF AA TL VI P4 T SF AA TL VI P

5 V LP P P VR LE G/Y5 V LP P P VR LE G / Y

6YGL LNTPVT N/L6YGL LNTPVT N / L

7 P WP PVYQTP (N) 8 T P I I T/I G G C P/V (Q) 9 S F G (G) L - L S K (E) 10 E E (Q) - D E T (D)7 P WP PVYQTP (N) 8 T P I I T / I G G C P / V (Q) 9 S F G (G) L - L S K (E) 10 E E (Q) - D E T (D)

11 A S D/P K S L S11 A S D / P K S L S

12 G/S V V P F F C12 G / S V V P F F C

13 A T D Q S E D13 A T D Q S E D

14 G V W V/L A - Q14 G V W V / L A - Q

15 I K T P15 I K T P

16 SK16 SK

17 A17 A

18 P18 P

19 X19 X

: " 20 n: '20 n

:T: 21 L: T: 21 L

• · • · · • · • · · • · · ( ) = sekvenssi, jonka todennäköisyys on alhainen.() = Sequence with low probability.

• · [ ] = sekvenssi, jonka todennäköisyys on hyvin alhainen.• · [] = very low probability sequence.

• · · • / = merkitsee epäselvyyttä sekvenssissä; todennäköisin • · · :·ί : aminohappo on merkitty ensimmäiseksi.• · · • / = denotes sequence ambiguity; most likely • · ·: · ί: the amino acid is marked first.

» · · a = runsaasti esiintyvä peptidi b = vähän esiintyvä peptidi • · 107451 58 ESIMERKKI 16 ICAM-l-geenin kloonaus ICAM-l-geeni voidaan kloonata käyttäen mitä tahansa lukuisista eri menettelyistä. Esimerkiksi aminohapposekvenssi-informaatiota, joka saatiin sekventoimalla ICAM-1-trypsiinifragment-teja (taulukko 5), voidaan käyttää oiigonukleotidisekvenssin identifioimiseksi, joka vastaisi ICAM-l-geeniä. Vaihtoehtoisesti ICAM-l-geeni voidaan kloonata käyttäen ICAM-l-vastaista vasta-ainetta ICAM-1:tä tuottavien kloonien tunnistamiseksi.EXAMPLE 16 Cloning of the ICAM-1 gene The ICAM-1 gene can be cloned using any of a number of different procedures. For example, the amino acid sequence information obtained by sequencing ICAM-1 trypsin fragments (Table 5) can be used to identify an oligonucleotide sequence corresponding to the ICAM-1 gene. Alternatively, the ICAM-1 gene may be cloned using an anti-ICAM-1 antibody to identify clones producing ICAM-1.

ICAM-l-geenin kloonaaminen käyttämällä oligonukleotidikoettimia Geneettistä koodia (Watson, J.D., Molecular Biology of the Gene, 3. painos, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977) hyödyntäen voidaan tunnistaa yksi tai useampi erilainen oiigonukleotidi, joista kukin kykenee koodittamaan ICAM-1-trypsiinipeptidejä. Todennäköisyyttä sille, että tietty oiigonukleotidi on todella tosiasiallinen ICAM-l:tä koodittava sekvenssi, voidaan arvioida tarkastelemalla epänormaali ! 'emäsparimuodostus -suhteita ja tiheyttä, jolla tiettyä kodonia tosiasiallisesti käytetään (tietyn aminohapon koodittamiseksi) eukaryoottisissa soluissa. Tällaisia "kodonikäytäntösääntöjä" julkistavat Lathe, R. , et ai . , J .Mol ec. Biol . 183 (1985) 1 - 12.Cloning of the ICAM-1 gene using oligonucleotide probes Using the genetic code (Watson, JD, Molecular Biology of the Gene, 3rd edition, WA Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977), one or more different oligonucleotides, each capable of encode ICAM-1 trypsin peptides. The probability that a particular oligonucleotide is actually an actual coding sequence for ICAM-1 can be estimated by looking at the abnormal! 'base pairing' ratios and density at which a particular codon is actually used (to encode a particular amino acid) in eukaryotic cells. Such "codon codes" are disclosed by Lathe, R., et al. , J .Mol ec. Biol. 183: 1-12 (1985).

< < Käyttämällä Lathen "kodonikäytäntösääntöjä" tunnistetaan • · · yksittäinen oi igonukleotidi , tai oligonukleotidisar ja, joka • · · * * * * sisältää teoreettisen "todennäköisimmän' nukleotidisekvenssin (eli nukleotidisekvenssin, jonka runsaus on alhaisin), joka 0 · • · · *.*.· kykenee koodittamaan ICAM-l-trypsiinipeptidisekvensse jä .<<Using Lathe's "codon code rules" identifies a single oligonucleotide sequence, or oligonucleotide sequence, that contains a theoretical "most likely" nucleotide sequence (i.e., the lowest abundance nucleotide sequence) that is 0 · • · · * . *. · Is capable of encoding ICAM-1 trypsin peptide sequences.

• · · • · « • · « : Oi igonukl eotidia, tai oligonukleotidisar jaa, joka sisältää • · · • · · · .···. teoreettisen "todennäköisimmän" sekvenssin, joka kykenee • · *·* koodittamaan ICAM-l-fragmentteja, käytetään kömpiementoivan • « *.*.* oi igonukl eotidin tai oi igonukleotidisar jän sekvenssin tunnis- tamiseksi, joka kykenee hybridoitumaan "todennäköisimpään" sekvenssiin, tai sekvenssisarjaan. Tällaisen kömpiementoivan 59 107451 sekvenssin sisältävää oligonukleotidia voidaan käyttää koettimena ICAM-l-geenin tunnistamiseksi ja eristämiseksi (Maniatis, T., et ai ., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982.Ig ig ig: Ogonucleotide, or oligonucleotide sequence containing · • •... a theoretical "most probable" sequence capable of · · * · * encoding ICAM-1 fragments is used to identify a sequence of kö ento *. *. * * igonucleotide or idin igonucleotide sequence which is capable of hybridizing to the imp most probable, sequences therein. An oligonucleotide containing such a cumulative 59 107451 sequence can be used as a probe to identify and isolate the ICAM-1 gene (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982).

Kuten kuvattu osassa C, edellä, on mahdollista kloonata ICAM-1-geeni eukaryoottisista DNA-valmisteista, joiden arvellaan sisältävän tämän geenin. ICAM-l-proteiinia koodittavan geenin tunnistamiseksi ja kloonaamiseksi DNA-kirjasto seulotaan sen kyvyn suhteen hybridoitua edellä kuvattuihin oligonukleotidi-koettimiin. Koska on todennäköistä, että normaali diploidinen solu käsittää ICAM-l-geenistä vain kaksi kopiota, ja koska on mahdollista, että ICAM-l-geeniin saattaa sisältyä suuria ei-transkriboituvia välisekvenssejä (introneja), joita ei haluta kloonata, edullisesti ICAM-l:tä koodittavat sekvenssit eristetään cDNA-kirjastosta, joka on valmistettu mieluummin ICAM-l:tä tuottavan solun mRNA:sta kuin genomi-DNA:sta. Sopiva DNA- tai cDNA-valmiste pilkotaan entsymaattisesti tai rikotaan umpimähkään ja ligatoidaan yhdistelmävektoreihin. Sen jälkeen mitataan näiden yhdistelmävektoreiden kyky hybridoitua edellä kuvattui-hin oi igonukleotidikoettimiin. Menettelyitä hybridoinnin i suorittamiseksi esitetään esimerkiksi julkaisuissa Maniatis, T., Molecular Cloning - A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982, tai Haymes, B.T., et al.,As described in Section C, supra, it is possible to clone the ICAM-1 gene from eukaryotic DNA preparations thought to contain this gene. To identify and clone the gene encoding ICAM-1, the DNA library is screened for its ability to hybridize to the oligonucleotide probes described above. Because it is likely that a normal diploid cell will contain only two copies of the ICAM-1 gene, and because it is possible that the ICAM-1 gene may contain large non-transcriptionable intermediate sequences (introns) that are unwanted to be cloned, preferably ICAM-1: the coding sequences are isolated from a cDNA library prepared from ICAM-1 producing cell mRNA rather than genomic DNA. A suitable DNA or cDNA preparation is enzymatically cleaved or randomly ligated and ligated into recombinant vectors. The ability of these recombinant vectors to hybridize to the oligonucleotide probes described above is then measured. Procedures for performing hybridization i are described, for example, in Maniatis, T., Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982, or Haymes, B. T., et al.

« < 4 < I«<4 <I

. . Nucleic Acid Hybridization - A Practical Approach. IRL Press, • · · '·'·* Oxford, UK, 1985. Tällaiseen hybridoitumiseen kykeneviä • · · '·' * vektoreita analysoidaan sitten niiden sisältämien ICAM-1- sekvenssien määrän ja laadun määrittämiseksi. Vain tilastoi- • « listen näkökohtien nojalla jokin geeni, kuten ICAM-l-molekyy- • · * : Iin koodittava geeni, voitaisiin yksikäsitteisesti tunnistaa : ]·. (hybridointiseul onnal la) käyttäen vain 18 oligonukleotidia sisältävää oiigonukleotidikoetinta.. . Nucleic Acid Hybridization - A Practical Approach. IRL Press, Oxford, UK, 1985. Vectors capable of such hybridization are then analyzed to determine the amount and quality of the ICAM-1 sequences they contain. From a statistical point of view only, a gene, such as the gene encoding the ICAM-1 molecule, could be uniquely identified:] ·. (hybridization screen) using an oligonucleotide probe containing only 18 oligonucleotides.

*«« Täten yhteenvetona ICAM-l-peptidisekvenssien tosiasiallinen "·*: tunnistus mahdollistaa teoreettisen "todennäköisimmän" DNA- fin 107451 sekvenssin, tai tällaisten sekvenssien sarjan, joka kykenee koodittamaan tällaisen peptidin, tunnistuksen. Rakentamalla oiigonukleotidi, joka komplementoi tätä teoreettista sekvenssiä (tai rakentamalla oiigonukleotidisarja, joka komplementoi "todennäköisimpien" oiigonukleotidien sarjaa), saadaan DNA-molekyyli (tai DNA-molekyy1isarja), joka kykenee toimimaan koettimena ICÄM-l-geenin tunnistamiseksi ja eristämiseksi.* «« Thus, in summary, the actual "· * recognition of ICAM-1 peptide sequences allows for the identification of a theoretical" most probable "DNA 107451 sequence, or sequence of sequences capable of encoding such a peptide. By constructing an oligonuc by constructing a set of oligonucleotides that complement the set of "most probable" oligonucleotides), a DNA molecule (or series of DNA molecules) capable of serving as a probe for the identification and isolation of the ICAM-1 gene is obtained.

Käyttäen taulukon 5 mukaisia ICAM-l-peptidisekvenssejä oiigonukleotidin, jolla on "todennäköisin" sekvenssi, sekvenssi, joka kykenee koodittamaan AA- ja J-peptidejä, tunnistettiin (taulukko 6 ja vastaavasti 7). Näitä sekvenssejä kömpiementoivia oligonukleotideja syntetisoitiin ja puhdistettiin käytettäviksi koettimina ICAM-l-geenisekvenssien eristämiseksi. Sopivia koon suhteen valikoituja cDNA-kirjastoja muodostettiin poly(A)+-RNA:sta, joka oli peräisin PMA:lla indusoiduista HL-60-soluista tai PS-stimuloiduista napalaskimo-endoteelisoluista. Koon suhteen valikoitu cDNA-kirjasto valmistettiin käyttäen poly(A)+-RNA:ta, joka oli saatu PMÄ-indusoi-duista HL-60-soluista, Gublerin, U., et ai. (Gene 25 (1983) 263 - 269) ja Corbin, A., et ai fEMBO J. 6 (1987) 4023 -\ 4028), jotka viitteet sisällytetään tähän viitteiksi, ] menetelmän mukaan.Using the ICAM-1 peptide sequences of Table 5, the sequence of the oligonucleotide having the "most probable" sequence capable of encoding AA and J peptides was identified (Table 6 and 7, respectively). Cleavage-oligonucleotides of these sequences were synthesized and purified for use as probes to isolate ICAM-1 gene sequences. Suitable size-selected cDNA libraries were constructed from poly (A) + - RNA derived from PMA-induced HL-60 cells or PS-stimulated umbilical vein endothelial cells. A size-selected cDNA library was prepared using poly (A) + RNA from PMA-induced HL-60 cells, Gublerin, U., et al. (Gene 25: 263-269 (1983)) and Corbin, A., et al. FEMBO J. 6 (1987) 4023-4028), the references of which are incorporated herein by reference.

| Koon suhteen valikoitu cDNA-kirjasto valmistettiin käyttäen • * · *·*.* poly(A)+-RNA:ta, joka oli peräisin napalaskimo-endoteeliso- • · · *.* · luista, joita oli stimuloitu 4 tunnin ajan PS:llä, 5 mikro-grammaa/ml. RNA uutettiin homogenoimalla solut 4 M guanidine: niumisotiosyanaatissa ja uitrasentrifugoimal1 a supernatantti| A size-selected cDNA library was prepared using • * · * · *. * Poly (A) + - RNA derived from umbilical vein endothelial • · · *. * · Bones stimulated for 4 hours with PS: 5 micrograms / ml. RNA was extracted by homogenizing the cells in 4 M guanidine sodium isothiocyanate and centrifuging the supernatant.

CsCl-gradienttia käyttäen (Chirgwin, J.M., et ai. . Biochem. 18 . *. (1979) 5294 - 5299). Poly(A)+-RNÄ eristettiin kokonais-RNA- • · · **·/ 1 a jiseoksesta käyttämällä oiigo-(dT)-sei luloosakromatografiaa (tyyppi 3, Collaborative Research) (Aviv, H., et ai . ,Using a CsCl gradient (Chirgwin, J.M., et al., Biochem. 18 (1979) 5294-5999). Poly (A) + - RNA was isolated from total RNA- · · ** · / 1a mixture using oligo- (dT) -cellulose chromatography (Type 3, Collaborative Research) (Aviv, H., et al.,

Proc.Natl .Acad.Sci. USA 69 (1972) 1408 - 1412).Proc.Natl .Acad.Sci. USA 69: 1408-1412 (1972)).

ei 107451 TAULUKKO 6no 107451 TABLE 6

Oiigonukleotidi, joka kömpiementoi todennäköisintä nukleotidisekvenssiä, joka kykenee koodittamaan ICAM-l-AÄ-peptidin ICAM-ami- icAM-l-AA- Todennököis·5 n. AA- Komplemen- nohappo- peptidin koodit- toiva.sek- i äännös p p „ tava sekvens si_yens s ι 5' 3'An oligonucleotide that encapsulates the most likely nucleotide sequence capable of encoding the ICAM-1-AA peptide ICAM-aminoCAM-1-AA-probable · 5nA-complementary acid peptide coding sequence. sequence si_yens s ι 5 '3'

162 Glu G C162 Glu G C

A TThe T

G CG C

163 Leu C G163 Leu C G

T AT A

G CG C

164 Asp G C164 Asp G C

A TThe T

C GC G

165 Leu C G165 Leu C G

T AT A

G CG C

166 Arg C G166 Arg C G

G CG C

167 Pro C G167 Pro C G

C GC G

f'·· 168 Gin C Gf '·· 168 Gin C G

A T·The T ·

G CG C

169 Gly G C169 Gly G C

G CG C

* Q Q* Q Q

170 Leu C G170 Leu C G

T AT A

:.· : G C:. ·: G C

171 Glu G C171 Glu G C

A TThe T

:Y: G C: Y: G C

I.! 172 Leu C GI.! 172 Leu C G

V : T AA: T A

* G C* G C

I.:’: 173 Phe T AI .: ': 173 Phe T A

T AT A

174 Glu G C174 Glu G C

v.: A Tv .: T

·:··: G C·: ··: G C

3' 5' 62 107451 TAULUKKO 6 (jatk.) ICAM-ami- iCAM-l-AA- Todeanököisin. AA- Komplemen-nohappo- /h peptidin koodit- toiva.sek- jäännös pepoiai tava sekvenssi venssi3 '5' 62 107451 TABLE 6 (cont.) ICAM-AmiCAM-1-AA- To be exact. AA-Komplemenic acid / h peptide coding sequence residue sequencing sequence

175 Asn A T175 Asn A T

A TThe T

C GC G

176 Thr A T176 Thr A T

C GC G

177 Ser U A177 Ser U A

C GC G

AA

3' 5' I I c • 4 4 4 43 '5' I I c • 4 4 4 4

• · O• · O

• · «·» • · · « · « • * O • · • · · • · · • · e « * • · · • · « • · · · • t 107451 63 TAULUKKO 7• «« «* * o« i «* * o« i «*« i «* • i« t 107451 63 TABLE 7

Oligonukleotidi, joka komplementoi todennäköisintä nukleotidisekvenssiä, joka kykenee koodittamaan ICAM-1-J-peptidin 11 * · " . !»......~ i — ICAM-l-AA- Todennäköisin. AA- Komplemen-nohappo- tidi peptidin koodit- toiva.sek- jaannos F FL1U _tava sekvenssi_venssi 5' 3' .An oligonucleotide that complements the most likely nucleotide sequence capable of encoding the ICAM-1-J peptide 11 * · ".! ...... ~ - ICAM-1-AA- Most likely. - Secondary sequence portion F FL1U _ sequence sequence_ sequence 5 '3'.

19 Vai G C19 Or G C

T AT A

G CG C

20 Thr A T20 Thr A T

C GC G

21 Cys T A21 Cys T A

G CG C

C GC G

22 Ser T A22 Ser T A

C GC G

23 Thr A T23 Thr A T

C GC G

24 Ser T A24 Ser T A

C GC G

’·· C G'·· C G

25 Cys T A25 Cys T A

G CG C

T AT A

25 Asp G C25 Asp G C

A TThe T

C GC G

27 Gin C G27 Gin C G

• * ·• * ·

: : : AT::: AT

G CG C

28 Pro C G28 Pro C G

C GC G

,0 C G, 0 C G

: : : 29 Lys A T::: 29 Lys A T

A TThe T

: : : 3' 5' * · · « * ·« » · » * * 107451 64::: 3 '5' * · · «* ·« »·» * * 107451 64

Ensimmäinen cDNÄ-säie syntetisoitiin käyttäen 8 mikrogrammaa poly(A)+-RNA:ta, linnun myeloblastoosi-virus-käänteistransk-riptaasia (Life Sciences) ja oligo(dT)-aluketta. DNA-RNA-hybridi pilkottiin RN-aasi-H:1la (BRL) ja toinen säie syntetisoitiin käyttäen DNA-polymeraasi-I:tä (New England Biolabs). Tuote metyloitiin EcoRI-metylaasilla (New England Biolabs), ja tasaiseksi saatetut päät ligatoitiin EcoRI-liittäjiin (New England Biolabs), minkä jälkeen pilkottiin EcoRI:llä ja valikoitiin koon mukaan alhaisen sulamispisteen omaavassa agaroosigeelissä. Kooltaan suuremmat cDNA:t kuin 500 ep:tä ligatoitiin 1ambda-gtlO:een, jota oli edeltäpäin pilkottu EcoRI:llä ja defosforyloitu (Stratagene). Ligatointituote pakattiin sitten (Stratagene-kulta).The first cDNA strand was synthesized using 8 micrograms of poly (A) + RNA, avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (Life Sciences), and oligo (dT) primer. The DNA-RNA hybrid was digested with RNase H (BRL) and the second strand was synthesized using DNA polymerase I (New England Biolabs). The product was methylated with EcoRI methylase (New England Biolabs) and the flattened ends were ligated to EcoRI (New England Biolabs), followed by digestion with EcoRI and size selection on a low melting point agarose gel. CDNAs larger than 500 bp in size were ligated into 1 ambda -gt10 pre-digested with EcoRI and dephosphorylated (Stratagene). The ligation product was then packaged (Stratagene Gold).

Sitten napalaskimo-endoteelisolu- ja HL-60-cDNA-kirjastoja maljoitettiin pitoisuudeksi 20 000 pmy/150 mm:n malja. Yhdistelmä-DNA siirrettiin kaksinkertaisin rinnakkaismääri-tyksin nitroselluloosasuodattimille, denaturoitiin käyttäen 0,5 M NaOH/1,5 NaCl -liuosta, neutraloitiin lisäämällä 1 M Tris-puskuria, pH 7,5/1,5 M NaCl, ja paistettiin 80 °C:ssa 2 tunnin • " ajan (Benton, W.D., et ai., Science 196 (1977) 180 - 182).The umbilical vein endothelial cell and HL-60 cDNA libraries were then plated to a concentration of 20,000 cfu / 150 mm plate. The recombinant DNA was transferred in duplicate onto nitrocellulose filters, denatured using 0.5 M NaOH / 1.5 NaCl, neutralized by addition of 1 M Tris buffer, pH 7.5 / 1.5 M NaCl, and baked at 80 ° C: (Benton, WD, et al., Science 196: 180-182 (1977)).

V Suodattimet esihybridoitiin ja sitten hybridoitiin 5XSSC:ssä, joka sisälsi 5X Denhardtin liuosta, 50 mM NaPCU ja 1 mikro-'i"; gramman/ml 1ohensperma-DNA:ta. Esihydridointi suoritettiin 45 °C:ssa ja sen annettiin kestää 1 tunnin.V Filters were pre-hybridized and then hybridized in 5XSSC containing 5X Denhardt's solution, 50 mM NaPCU, and 1 micro-g / ml of 1ohensperm DNA. The pre-hydration was carried out at 45 ° C and allowed for 1 hour.

«·* • i ·«· * • i ·

Hybridoinnissa käytettiin 32 ep:n ('5-TTGGGCTGGTCACAG-GAGGTGGAGCAGGTGAC) tai 47 ep:n /5' -GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGG32 bp ('5-TTGGGCTGGTCACAG-GAGGTGGAGCAGGTGAC) or 47 bp / 5' -GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGG were used for hybridization

l.'.' GGCCGCAGGTCCAGCTC) ei-tieto-oligonukleotideja, joiden rakenne • · ·l. '.' GGCCGCAGGTCCAGCTC) non-knowledge oligonucleotides having the structure • · ·

perustui edellä kuvatulla tavalla ICAM-l-trypsiinipeptidiin Jwas based on ICAM-1-trypsin peptide J as described above

• · :.· · ja vastaavasti AA (taulukko 7 ja 6) (Lathe, R., J .Mol ec. Biol .And AA (Tables 7 and 6) (Lathe, R., J.Mol. Ec. Biol.

: : 183 (1985) 1 - 12). Oiiqonukleotidien päät leimattiin gamma- • 9 * —— (32P)ATP:llä käyttäen T4-polynukleotidikinaasia ja valmistajan • · · (New England Biolabs) suosittelemia olosuhteita. Suodattimia hybridoitiin yön yli, minkä jälkeen niitä pestiin kahdesti 65 107451 2XSSC/0,! % SDS -liuoksella 30 minuutin ajan 45 °C:ssa. Fagit eristettiin niistä pesäkkeistä, joissa oli tapahtunut hybri-doitumista, minkä jälkeen niitä puhdistettiin maljoittamal1 a ja seulomalla useaan kertaan.:: 183-112 (1985). The ends of the oligonucleotides were labeled with gamma-9 * —— (32 P) ATP using T4 polynucleotide kinase and conditions recommended by the manufacturer • · · (New England Biolabs). The filters were hybridized overnight and then washed twice with 65,107,451 2XSSC / 0. % SDS for 30 minutes at 45 ° C. The phages were isolated from colonies that had undergone hybridization, followed by purification by plating and screening several times.

ICAM-l-creenin kloonaaminen käyttämällä ICAM-l-vastaista vasta-ainetta ICAM-l-geeni voidaan vaihtoehtoisesti kloonata käyttämällä ICAM-l-vastaista vasta-ainetta. DNA:ta, tai edullisemmin cDNArta, uutetaan ja puhdistetaan ICÄM-l:n ilmentämään kykenevästä solusta. Puhdistettu cDNA fragmentoidaan (rikkomalla, endonukleaaseilla pilkkomalla, jne.) DNA- tai cDNA-fragmenttipoolin saamiseksi. Tämän poolin DNA- tai cDNA-fragmentit kloonataan sitten iImennysvektoriin ilmennysvekto-rigenomikirjaston tuottamiseksi, jonka jäsenistä kukin sisältää yksittäisen kloonatun DNA- tai cDNA-fragmentin.Alternatively, cloning of ICAM-1 creen using anti-ICAM-1 antibody The ICAM-1 gene may be cloned using anti-ICAM-1 antibody. DNA, or more preferably cDNA, is extracted and purified from a cell capable of expressing ICÄM-1. Purified cDNA is fragmented (by digestion, endonuclease digestion, etc.) to obtain a pool of DNA or cDNA fragment. The DNA or cDNA fragments of this pool are then cloned into an expression vector to produce an expression vector genome library, each of which contains a single cloned DNA or cDNA fragment.

ESIMERKKI 17 cDNA-kloonien analysointi Y Positiivisista klooneista saatu fagi-DNA pilkottiin EcoRIrllä ja sitä tutkittiin Southernin analysilla käyttäen yhden kloonin '·' cDNAita koettimena. Ristihybridoituvat maksimikoon omaavat • « cDNA-insertit aiakloonattiin plasmidivektorin pGEM4Z (Promega) : i : EcoRI-keskukseen. cDNA:n kummankin suunnan mukaan suuntautu- neena sisältävät HL-60-alakloonit tuhottiin pilkkomalla eksonukleaasi-III: 11a (Henikoff, S., Gene 28 (1984) 351 - 359) • · valmistajan (Erase-a-Base, Promega) suosituksia noudattaen.EXAMPLE 17 Analysis of cDNA Clones Y Phage DNA obtained from positive clones was digested with EcoRI and examined by Southern analysis using single clone '·' cDNAs as probe. Cross-hybridizing maximum size cDNA inserts were subcloned into the EcoRI site of the plasmid vector pGEM4Z (Promega). HL-60 subclones containing both directions of the cDNA were destroyed by digestion with exonuclease III (Henikoff, S., Gene 28: 351-359 (1984)). · Recommendations of the manufacturer (Erase-a-Base, Promega). in accordance with the.

« · · • Asteittain tuhotut cDNA:t kloonattiin sitten ja niille suori- • · • · · : tettiin dideoksinukleotidiket jupääsekventointi (Sanger, F. , et.The progressively destroyed cDNAs were then cloned and subjected to dideoxynucleotide tag sequencing (Sanger, F., et al.

• · · ai . , Proc . Natl . Acad. Sei . USA 74 (1977) 5463 - 5467) valmistajan (Seguenase, U.S. Biochemical) ohjeiden mukaan. HL-60-cDNA:n 5'- * · ja koodialueet sekventoitiin täydellisesti kummastakin • « säikeestä ja 3'-alue sekventoitiin noin 70-%:isesti kummastakin 107451 66 säikeestä. Edustava endoteeli-cDNA sekventoitiin lähes koko pituudeltaan "haulikko"-kloonaamal1 a 4 ep:n tunnistusrestrik-tioentsyymifragmentteja.• · · ai. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5477 (1977) according to the manufacturer (Seguenase, U.S. Biochemical). The 5 '* and coding regions of the HL-60 cDNA were completely sequenced from each of the strands and the 3' region was sequenced approximately 70% from each of the 107,451,66 strands. The representative endothelial cDNA was sequenced by almost a full length "shotgun" cloning of 4 bp recognition restriction enzyme fragments.

Määritettiin yhden HL-60- ja yhden endoteelisolu-cDNA:n cDNÄ-sekvenssi (kuvio 8). 3023 ep:n sekvenssi sisältää lyhyen 5'-ei-translatoituvan alueen ja 1,3 ep:n 3'-ei-translatoituvan alueen, jolloin asemassa 2966 sijaitsee konsensus-polyadeny-laatiosignaali. Pisin avoin lukualue alkaa ensimmäisestä ATG-kodonista asemassa 58 ja päättyy TGA-1opetuskolmikkoon asemassa 1653. Koska translatoitu aminohapposekvenssi ja kahdeksasta (8) eri trypsiinipeptidistä, kaikkiaan 91 aminohappoa (alleviivattu kuviossa 8), määritetyt sekvenssit olivat samankaltaiset, varmistui, että oli eristetty autenttisia ICAM-1-cDNÄ-klooneja. ICAM-l-trypsiinipeptidien aminohapposekvenssit on esitetty taulukossa 8.The cDNA sequence of one HL-60 and one endothelial cell cDNA was determined (Figure 8). The 3023 bp sequence contains a short 5'-untranslated region and a 1.3 bp 3'-untranslated region, with a consensus polyadenylation signal at position 2966. The longest open reading region begins at the first ATG codon at position 58 and ends at the TGA-1 training triad at position 1653. Since the translated amino acid sequence and eight (8) different trypsin peptides, 91 amino acids in total (underlined in Figure 8), the sequences determined were identical, -1 cDNA clones. The amino acid sequences of ICAM-1 trypsin peptides are shown in Table 8.

TAULUKKO 8 ICAM-l-trypsiinipeptidien aminohapposekvenssejä : " Peptidi Jäännäkset SekvenssiTABLE 8 Amino acid sequences of ICAM-1 trypsin peptides: "Peptide Residues Sequence

J 14-29 'XGSVLVTCSTSCDQPKJ 14-29 'XGSVLVTCSTSCDQPK

4 I4 I

·:·! U 30-39 L L G I E T P l (P) (K)· ·! U 30-39 L L G I E T P l (P) (K)

50 78-85 (T) F L T V Y X T50 78-85 (T) F L T V Y X T

*··* ··

*·* : X 89-95 VELAPLP* · *: X 89-95 VELAPLP

AA 161-182 X ELDLRPOGLE --AA 161-182 X ELDLRPOGLE -

:.V L F E X T S APXQL: .V L F E X T S APXQL

• · * • · «• · * • · «

*\ ’ K 232-246 LNPTVTYGXDSFSAK* \ 'K 232-246 LNPTVTYGXDSFSAK

• · *;·.· 45 282-295 S F P A P N V (T/I) L X K P Q (V/L) • · • · -- merkitsee, että sekvenssi jatkuu seuraavalla rivillä; alleviivattuja sekvenssejä käytettiin oiigonukleotidikoettimien valmistuksessa.• · *; ·. · 45 282-295 S F P A P N V (T / I) L X K P Q (V / L) • · • · - indicates that the sequence continues on the next line; the underlined sequences were used in the preparation of oligonucleotide probes.

107451 67107451 67

Hydrofobisuusanalyysin (Kyte, J., et al. , J.Molec.Biol . 157 (1982) 105 - 132) tuloksien mukaan läsnä on 27 jäännöksen signaalisekvenssi. +l-glutamiinin sijoitus sopii siihen, ettemme onnistuneet saamaan N-pääsekvenssiä kolmelle eri ICAM-1-proteiinivalmisteelle; glutamiini mahdollisesti syklisoituu pyroglutamiinihapoksi, jolloin muodostuu salvattu N-pää. Translatoitu sekvenssi 1 - 453 on voittopuolisesti hydrofii-linen, jolloin sen jälkeen seuraa 24 jäännöksen hydrofobinen oletettu membraanin läpäisevä alue. Tätä membraanin läpäisevää aluetta seuraa välittömästi useita varauksen käsittäviä jäännöksiä, jotka sijoittuvat 27 alueen oletetulle sytoplasma-alueel1 e.According to the results of the hydrophobicity analysis (Kyte, J., et al., J. Molec. Biol. 157: 105-132 (1982)), a signal sequence of 27 residues is present. The + 1-glutamine placement fits in with the failure to obtain the main N-sequence for three different ICAM-1 protein preparations; glutamine possibly cyclizes to pyroglutamic acid to form a blocked N-terminus. The translated sequence 1-453 is predominantly hydrophilic, followed by a hydrophobic putative membrane-permeable region of the 24 residues. This membrane-permeable region is immediately followed by multiple charge residues located in the putative cytoplasmic region of 27 regions.

Kypsälle polypeptidiketjul1 e ennustettu koko on 55 219 daltonia, mikä sopii oikein hyvin deglykosyloidul1 e ICAM-l:lle saatuun kokoon 55 000 (Dustin, M.L., et ai . . J. Immunol. 137 (1986) 245 - 254). Ennustetaan 8 N-kytkenteistä glykosylaatio-keskusta. Asparagiinin puuttuminen trypsiinipeptidisekvens-seistä kahdessa näistä keskuksista varmistaa niiden glykosy-laation ja solunulkoisen orientaation. Jos korkean mannoosipi-.·. toisuuden käsittävän N-kytkenteisen hiilihydraatin kooksi ole- tetaan 2500 daltonia, ICAM-l-prekursorin kokoennusteeksi saadaan 75 000 daltonia verrattuna havaittuun 73 000 daltoniin (Dustin, M.L., et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254). Kun • f 4 I ( korkean mannoosipitoisuuden käsittävä tuote on muutettu • · • 0 m kompleksiseksi hiilihydraatiksi, kypsän ICAM-l-glykoproteiinin ··· V1 koko on 76 - 114 kd:tä, solutyypin mukaan (Dustin, M.L., et ai .. J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254). Täten ICAM-1 on voimakkaasti glykosyloitu, mutta muutoin tyypillinen integraa-linen membraaniproteiini.The mature polypeptide chain has a predicted size of 55,219 daltons, which fits well with the deglycosylated ICAM-1 size of 55,000 (Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137, 245-254 (1986)). 8 N-linked glycosylation centers are predicted. The lack of asparagine in the trypsin peptide sequences at two of these centers ensures their glycosylation and extracellular orientation. If high levels of mannose. the size of the N-linked carbohydrate is assumed to be 2500 Daltons, the ICAM-1 precursor is estimated to be 75,000 Daltons compared to the observed 73,000 Daltons (Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137, 245-254 (1986)). When • f 4 I (a product with high mannose content has been converted to · · • 0 m complex carbohydrate, the mature ICAM-1 glycoprotein ··· V1 is 76 to 114 kd, according to cell type (Dustin, ML, et al.). J. Immunol. 137: 245-254 (1986)) Thus, ICAM-1 is a highly glycosylated but otherwise typical integral membrane protein.

« ♦ • · 1 • · « ·«· ·«♦ • · 1 • ·« · «· ·

• M• M

• · • · · • · · • · » * » > · • ♦ 68 107451 ESIMERKKI 18 ICÄM-1 on immunoglobuliinisupergeeniryhmän integriiniä sitova jäsen ICAM-l:n sisäiset toistot asetettiin rinnan käyttäen Microgenie-proteiinisuuntausohjelmaa (Queen, C., et ai.,EXAMPLE 18 ICÄM-1 is an integrin-binding member of the immunoglobulin supergene group, internal repeats of ICAM-1 were aligned in parallel using the Microgenie protein orientation program (Queen, C., et al.). .,

Nucl.Acid Res. 12 (1984) 581 - 599), ja tulosta tarkasteltiin. ICAM-1 astettiin IgM:n, N-CAM:in ja MÄG:in rinnalle käyttäen Microgenie- ja ÄLIGN-ohjelmaa (Dayhoff, M.O., et ai..Nucl.Acid Res. 12 (1984) 581-599) and the result was reviewed. ICAM-1 was stepped alongside IgM, N-CAM and MAG using the Microgenie and ÄLIGN software (Dayhoff, M.O., et al.

Meth.Enzymol. 91 (1983) 524 - 545). Neljässä proteiinisekvens-sitietokannassa, joita ylläpitää laitos the National Biomedical Research Foundation, suoritettiin atk-haut proteiinisekvenssi-yhtäläisyyksiä etsien Williamsin ja Pearsonin FASTP-ohjelmaa käyttäen (Lipman, D.J., et ai,, Science 227 (1985) 1435 -1439).Meth.Enzymol. 91: 524-545 (1983). Four protein sequence databases maintained by the National Biomedical Research Foundation performed computer searches for protein sequence similarities using the Williams and Pearson FASTP program (Lipman, D.J., et al., Science 227 (1985) 1435-1439).

Koska ICAM-1 on integriini-igandi sen kuuluminen immunoglobu-1iinisupergeeniryhmään oli odottamatonta. Kuitenkin tarkastelemalla ICAM-l-sekvenssiä todetaan, että se täyttää kaikki kriteerit, jotka asetetaan immunoglobuliinisupergeeniryhmään I kuulumiselle. Näitä kriteerejä puolestaan käsitellään alla.Because ICAM-1 is an integrin ligand, its membership in the immunoglobulin-1 supergroup was unexpected. However, examination of the ICAM-1 sequence shows that it fulfills all the criteria set for immunoglobulin supergene group I membership. These criteria, in turn, are discussed below.

< < « « 4 « • · « « ICAM-I:n soiunulkoinen alue kokonaisuudessaan koostuu 5 • « • · · homologisesta immunogl obul iinin kaltaisesta alueesta, jotka • i esitetään rinnakkain kuviossa 9A. Alueet 1-4 ovat pituudel- • · 1 taan 88, 97, 99 ja vastaavasti 99 jäännöstä, ja edustavat siten tyypillistä Ig-aluekokoa; alue 5 on typistynyt 68 jäännökseen. Suoritettaessa atk-haku NBRF-tietokannassa FASTP-ohjelmal1 a • 1 ♦ *·1·1 todettiin merkittäviä homologioita immunogl obul iinisupergeeni- • · · ’·1 ’ ryhmän jäseniin, mukaanlukien IgM- ja IgG-C-alueet, T-solure- • .·1: septori-al fa-alayksikön vaihtuva alue ja ai f a-l-beeta-glyko-··· · .1··. Proteiini (kuvio 9B - D) .The whole extracellular region of ICAM-I consists of 5 homologous immunoglobulin-like regions shown in parallel in Figure 9A. Regions 1-4 are 88, 97, 99 and 99 residues in length, respectively, and thus represent a typical Ig region size; area 5 is truncated to 68 residues. Significant homologues to members of the immunoglobulin supergene group, including IgM and IgG-C regions, T-cell- •. · 1: the variable region of the receptor subunit al-al fa and the alpha-beta-glyco- ··· · .1 ··. Protein (Fig. 9B-D).

• · 4 • · * · · *·1·’ Edeltävää informaatiota käyttäen ICAM-1 :n aminohapposekvenssiä * · verrattiin muiden immunoglobuliinisupergeeniryhmän jäsenien 69 107451 aminohapposekvensseihin.Using the above information, the amino acid sequence of ICAM-1 was compared to 69,107,451 amino acid sequences of other members of the immunoglobulin supergene family.

Toisistaan erotetaan kolmen tyyppisiä Ig-superryhmäalueita, V, Cl ja C2. Sekä V- että C-alueet koostuvat kahdesta beeta-levystä, jotka kytkee toisiinsa alueensisäinen disulfidisidos; V-alueet sisältävät 9 anti-paralleeli-beeta-säi'että, jolloin C-alueet puolestaan sisältävät 7. Pysyvät alueet jaettiin ryhmiksi Cl ja C2 kuviossa 9A esitettyjen tyypillisten jäännöksien nojalla. Cl-ryhmään kuuluu antigeenitunnistukseen liittyviä proteiineja. C2-ryhmään kuuluu useita Fc-reseptoreita ja proteiineja, jotka liittyvät solukiinnitykseen, mukaanlukien CD2, LFA-3, MAG ja NCAM. ICAM-l-alueiden todettiin olevan erittäin voimakkaasti homologisia C2-ryhmän alueisiin nähden, mikä osoitti ICAM-l:n tähän ryhmään; tämä heijastuu voimakkaampana samankaltaisuutena säilyviin jäännöksiin C2- kuin Cl-alueilla kuten esitetty beeta-säikeille B - F kuviossa 9.Three types of Ig supergroup regions, V, Cl and C2, are distinguished. Both the V and C regions are composed of two beta plates which interconnect the intracellular disulfide bond; The V regions contain 9 anti-parallel beta strands, whereas the C regions contain 7. The constant regions were divided into Cl and C2 according to the typical residues shown in Figure 9A. The Cl group includes proteins related to antigen recognition. The C2 group comprises a number of Fc receptors and proteins involved in cell attachment, including CD2, LFA-3, MAG and NCAM. ICAM-1 regions were found to be very homologous to C2 group regions, indicating ICAM-1 to this group; this is reflected by residuals of greater affinity in the C2 than Cl regions as shown for beta strands B to F in Figure 9.

Samoin ICAM-l-alueet asettuivat huomattavasti paremmin C2-alueiden beeta-säikeiden A ja G rinnalle kuin näiden säikeiden V- ja Cl-alueilla rinnalle, jolloin saatiin hyvä rinnanasetus kautta C2-alueen koko mitan. Rinnanasetukset C2-alueiden NCAM:sta, MAG:sta ja alfa-l-beeta-glykoproteiinista kanssa on ,'i esitetty kuvioissa 9B ja 9C; samankaltaisuus vaihteli 28 %:sta ,· 33 %:iin. Rinnanasetukset T-solureseptori-V-al f an kanssa, 27 %:n samankaltaisuus, ja IgM-C:n alue-3:n kanssa, 34 %:n « ( .. samankaltaisuus, on niinikään esitetty (kuviot 9B, 9D).Likewise, the ICAM-1 regions were much better aligned along the beta strands A and G of the C2 regions than the V and Cl regions of these strands, giving good breast alignment over the entire length of the C2 region. Breast alignments of C2 regions with NCAM, MAG, and alpha-1 beta glycoprotein are shown in Figures 9B and 9C; similarity ranged from 28% to · 33%. Breast alignment with T cell receptor V-alpha, 27% similarity, and IgM-C region-3, 34% «(.. similarity, are also shown (Figures 9B, 9D) .

• · · • · · • · • · · • · · *·* * Yksi immunoglobuliinialueiden tärkeimmistä ominaisuuksista ovat disulfidikytkenteiset kysteiinit, jotka yhdistävät sillalla B- • · ja F-beeta-säikeet, mikä stabiloi beeta-levyn "sandwich"- ··* ί.! ! muotoon; ICAM-l:ssä kysteiinit säilyvät kaikissa tapauksissa : lukuunottamatta alueen 4 säi’että f, jossa esiintyy leusiini, • · · ]*!·* joka on mahdollisesti kääntynyt "sandwich"-rakennetta kohden ja • · *; voi mahdollisesti stabiloida kontaktin, kuten esitetty joille- ♦ · kin muille V- ja C2-ryhmäalueille. Kysteiinien väliset etäi-syydet (43, 50, 52 ja 37 jäännöstä) ovat kuten kuvattu C2- VO 107451 ryhmäl1 e.One of the most important properties of the immunoglobulin regions is the disulfide-linked cysteines, which bridge the B • · and F-beta strands, which stabilizes the sandwich of the beta-sheet. · * Ί.! ! shape; In ICAM-1, cysteines are retained in all cases: except for the strand f of region 4, where leucine is present, which may have turned towards the "sandwich" structure and • · *; may possibly stabilize the contact, as shown for some other V and C2 group regions. The distances between the cysteines (residues 43, 50, 52 and 37) are as described in C2-VO 107451 group e.

Ketjunsisäisten disulfidisidoksien läsnäolon ICAM-l:ssä tutkimiseksi endoteelisolu-ICAM-1:1lä suoritettiin SDS-PAGE pelkistävissä ja toisaalta ei-pelkistävissä olosuhteissa. Endoteelisolu-ICAM-1:tä käytettiin, koska se osoittaa vähemmän glykosylaatio-heterogeniaa kuin JY- tai karvainen solu -perna-ICAM-1 ja koska siinä Mr~siirtymät ovat herkempiä. ICAM-1:tä puhdistettiin siten 16 tunnin LPS:llä (5 mikrogrammaa/ml) stimuloiduista napalaskimo-endoteelisoluviljelmistä immuno-affiniteettikromatografisesti kuten edellä kuvattu. Asetonilla saostettu ICAM-1 uudel1eenlietettiin näytepuskuriin (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680 - 685) käyttäen 0,25 % 2-merkaptoetanolia tai pitoisuutta 25 mM jodoasetamidi ja lämmitettiin 100 °C:seen 5 minuutiksi. Näytteillä suoritettiin SDS-PAGE 4670 -ajo ja hopeavärjäys 4613. Endoteelisolu-ICAM-1:n näennäinen Mr oli 100 kd:tä pelkistävissä olosuhteissa ja 96 kd:tä ei-pelkistävissä olosuhteissa, mikä viittaa voimakkaasti ketjunsisäisten disulfidien läsnäoloon natiivissa ICAM-l:ssä.To investigate the presence of intracellular disulfide bonds in ICAM-1, endothelial cell ICAM-1 was subjected to SDS-PAGE under reducing and on the other hand non-reducing conditions. Endothelial cell ICAM-1 was used because it shows less glycosylation heterogeneity than JY or hairy cell spleen ICAM-1 and because it is more sensitive to Mr transitions. Thus, ICAM-1 was purified from 16 h LPS (5 micrograms / ml) stimulated umbilical vein endothelial cell cultures by immuno affinity chromatography as described above. Acetone-precipitated ICAM-1 was resuspended in sample buffer (Laemmli, U.K., Nature 227: 680-685 (1970)) using 0.25% 2-mercaptoethanol or 25 mM iodoacetamide and warmed to 100 ° C for 5 minutes. Samples were subjected to SDS-PAGE 4670 run and silver staining 4613. The apparent Mr of endothelial cell ICAM-1 was 100 kd under reducing conditions and 96 kd under non-reducing conditions, which strongly indicates the presence of intracellular disulfides in native ICAM. .

.1. Käyttämällä primaarisekvenssiä sekundaari rakenteen ennusta- miseksi (Chou, P.Y., et ai. . Biochem. 13 (1974) 211 - 245) * i todettiin 7 ennakoitua beeta-säi ' että kussakin ICAM-1-.1. By using a primary sequence to predict secondary structure (Chou, P.Y., et al., Biochem. 13, 211-245 (1974)), 7 predicted beta sequences were found to be present in each ICAM-1.

II

alueessa, merkittyinä a - g kuviossa 9A ylhäällä, mikä täysin «1(11 ] / vastaa ennustetta immunoglobuliinialueesta ja vastaa säikeiden • · · *·’·* A - H asemia immunoglobuliineissa (kuvio 9A, alhaalla).in the region labeled a-g in Fig. 9A above, which is completely <1 (11) / consistent with the prediction of the immunoglobulin region and corresponds to the · · · * · '· * A-H positions of the filaments in immunoglobulins (Fig. 9A, bottom).

Iti • · · V " Alueelta 5 puuttuvat A- ja C-säikeet, mutta koska nämä muodostivat levyjen reunat, levyt voivat silti edelleen • · muodostua, mahdollisesti siten, että säie D asettuu säikeen C :T: paikalle, kuten esitetty joillekin muille C2-alueille; jolloin . karakteristinen disulfidisidos B- ja F-säikeiden välillä jäisi φ » « • » · "I.* ennalleen. Täten kriteerit, jotka koskevat aluekokoa, sekvens- • · *”* sihomologiaa, säilyviä kysteiinejä, jotka muodostavat oletetun ί .* i alueensisäisen disul f idisidoksen, disul f idisidoksien läsnäoloa •:”j ja ennustettua beeta-levyrakennetta, on kaikki täytetty silmäl- 71 107451 läpitäen ICAM-l:n lukemista immunoglobuliinisupergeeniryhmään.Iti · · · V ”Region 5 misses the A and C strands, but since these formed the edges of the boards, the boards may still be formed, possibly by the position of the thread D in the C: T position of the thread, as shown for some other C2s. whereby the characteristic disulfide bond between the B and F strands would remain φ »« • »·" I. * unchanged. Thus, the criteria for region size, sequence · · * ”* siomology, persistent cysteines that form the putative ß. * I for the presence of intrinsic disul f idic linkage, disul f idic linkages, and the predicted beta-plate structure are all fulfilled 71,107,451 passing through ICAM-1 reading into the immunoglobulin supergene group.

ICAM-l:n todettiin voimakkaimmin homologiseksi C2-sarjan glykoproteiineihin NCAM ja MAG nähden. Tämä on erityisen kiinnostavaa, koska sekä NCAM että MAG välittävät solu-solukiinnitystä. NCAM on tärkeä hermosolu-hermosolu- ja hermo-1ihasvuorovaikutuksissa (Cunningham, B.A., et ai.. Science 236 (1987) 799 - 806), kun taas MAG on merkityksellinen hermosolu-oligodendrosyytti- ja oligodendrosyytti-oligodendrosyyttivuo-rovaikutuksissa myelinaation aikana (Poltorak, M., et ai., J.Cell.Biol. 105 (1987) 1893 - 1899). NCAM:n ja MAG:n solupintailmennys tulee kehityksen myötä säädellyksi hermoston muodostuksen ja vastaavasti myelinaation aikana analogisesti ICAM-l:n säädeltyyn induktioon tulehduksen aikana nähden (Springer, T.A., et ai., Ann.Rev.Immunol. 5 (1987) 223 - 252). ICAM-1, NCAM (Cunnigham, B.A., et ai., Science 236 (1987) 799 -806) ja MAG (Salzer, J.L., et ai.. J.Cell.Biol. 104 (1987) 957 - 965) ovat samankaltaisia yleisrakenteeltaan sekä homologisia, koska kukin on integraalinen membraaniglykopro-teiini, joka koostuu viidestä C2-alueesta, jotka muodostavat N-. pään solunulkoisen alueen, vaikka NCAM:ssa jonkin verran yli- ' i määräistä ei-Ig-kaltäistä sekvenssiä esiintyy viimeisen C2- • C ( ' alueen ja transmembraanialueen välissä. ICAM-1 asettuu koko • t e • ( pituudeltaan mukaanlukien transmembraani- ja sytoplasma-alueet i '· ' MAG:n rinnalle, jolloin samankaltaisuus on 21 %; sama samankal-·,·,! taisuus-% todetaan verrattaessa ICAM-l:n ja NCAM-l:n viittä aluetta. Kuviossa 10 on esitetty diagrammina ICAM-1:n ja MAG:n sekundaarirakenteet. Vertaamalla aluekohtaisesti todetaan, että ICAM-1- ja NCAM-molekyylien sisäisten alueiden välisen homolo-gian aste (x +/- s.d.; 21 +/- 2,8 % ja vastaavasti 18,6 +/- • · · 3,8 %) vastaa homologiatasoa verrattaessa ICAM-l-alueita NCAM- * · i ja MAG-alueisiin (20,4 +/- 3,7 ja vastaavasti 21,9 +/- 2,7).ICAM-1 was found to be most homologous to C2 series glycoproteins NCAM and MAG. This is of particular interest since both NCAM and MAG mediate cell-to-cell attachment. NCAM is important in nerve cell-nerve cell and nerve-muscle interaction (Cunningham, BA, et al., Science 236: 799-806 (1987)), while MAG is important in nerve cell oligodendrocyte and oligodendrocyte oligodendrocyte interactions. M., et al., J. Cell Biol. 105 (1987) 1893-1899). Cell surface expression of NCAM and MAG is progressively regulated during nerve formation and myelination, respectively, analogous to the regulated induction of ICAM-1 during inflammation (Springer, TA, et al., Ann.Rev.Immunol. 5 (1987) 223- 252). ICAM-1, NCAM (Cunnigham, BA, et al., Science 236 (1987) 799-806) and MAG (Salzer, J.L., et al., J.Cell.Biol. 104 (1987) 957-965) are similar. as well as homologous since each is an integral membrane glycoprotein consisting of five C2 regions which form N-. the extracellular region of the head, although some excess of the non-Ig-like sequence in the NCAM occurs between the last C2- • C ('region and the transmembrane region. ICAM-1 settles across the • te • (including transmembrane and cytoplasmic regions i '·' parallel to MAG, with a similarity of 21%, the same% similarity is found when comparing the five regions of ICAM-1 and NCAM-1. 1 and MAG secondary structures Comparison on a region-by-region basis shows that the degree of homology between the ICAM-1 and NCAM internal regions (x +/- sd; 21 +/- 2.8% and 18.6 + respectively) / - · · · 3.8%) corresponds to the homology level when comparing ICAM-1 regions with NCAM-* · i and MAG regions (20.4 +/- 3.7 and 21.9 +/- 2.7, respectively).

• « · ·...· Vaikka löytyy todisteita siitä, että NCAM:n C-pää-alueil la tapahtuu vaihtoehtoista silmukoitumista (Cunnigham, B.A, et.Although there is evidence that alternative splicing occurs in the NCAM C major regions (Cunnigham, B.A, et al.

f · · ai. . Science 236 (1987) 799 - 806; Barthels, D., et ai . , • · 72 1 0 7 4 51 EMBO J. 6 (1987) 907 - 914), kuten myös MAG:n (Lai, C., et al. . Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84 (1987) 4377 - 4341), mitään todisteita tästä ei ole löydetty sekventoitaessa endoteeli- tai HL-60-ICAM-l-klooneja tai tutkittaessa ICAM-l-proteiinirunkoa ja -prekursoria eri solutyypeissä (Dustin, M.L., et ai..f · · ai. . Science 236: 799-806 (1987); Barthels, D., et al. , 721 0 7 4 51 EMBO J. 6: 907-914 (1987)) as well as MAG (Lai, C., et al. Proc. Nat.Acad.Sci. USA 84 (1987) 4377). 4341), no evidence of this has been found in sequencing endothelial or HL-60-ICAM-1 clones or in examining ICAM-1 protein backbone and precursor in various cell types (Dustin, ML, et al.

J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254).J. Immunol. 137: 245-254 (1986).

ICAM-1 toimii LFA-1:n ligandina imusoluvuorovaikutuksissa lukuisilla eri solutyypeillä. Imusolut sitoutuvat ICAM-l:een, joka on sisäistynyt keinotekoisiin membraanikaksikerroksiin, ja tämä edellyttää LFA-1:n läsnäoloa imusoluilla, mikä osoittaa suoraan LFA-l:n vuorovaikutuksen ICAM-l:n kanssa (Marlin, S.D., et ai., Cell 51 (1987) 813 - 819). LFA-1 on valkosoluintegriini eikä sillä ole mitään immunoglobuliinin kaltaisia piirteitä. Valkosoluintegriinit käsittävät yhden integriinialaluokan. Muut kaksi alaluokkaa välittävät soiu-matriisivuorovaikutuksia ja tunnistavat sekvenssin RGD 1igandeissaan, joita ovat fibronek-tiini, vitronektiini, kollageeni ja fibrinogeeni (Hynes, R.O., Cell 48 (1987) 549 - 554; Ruoslahti, E., et ai., Science 238 (1987) 491 - 497). Valkosoluintegriinit ilmentyvät vain valkosoluilla, ja osallistuvat solu-soluvuorovaikutuksiin,ICAM-1 acts as a ligand for LFA-1 in lymphocyte interactions in a variety of cell types. Lymphocytes bind to ICAM-1, which is internalized in artificial membrane bilayers and this requires the presence of LFA-1 in lymphocytes, which directly indicates the interaction of LFA-1 with ICAM-1 (Marlin, SD, et al., Cell 51: 813-819 (1987). LFA-1 is a white blood cell integrin and has no immunoglobulin-like features. White blood cell integrins comprise one class of integrins. The other two subclasses mediate cellular matrix interactions and recognize the sequence in their RGD 1 ligands, which are fibronectin, vitronectin, collagen and fibrinogen (Hynes, RO, Cell 48: 549-554 (1987); Ruoslahti, E., et al., Science 238 (1987)). 1987) 491-497). White cell integrins are expressed only in white cells and participate in cell-to-cell interactions,

I II I

: " jolloin ainoat tunnetut ligandit ovat ICAM-1 ja iC3b, joka on v : kömpiementtikomponentti-C3-fragmentti, joka ei osoita mitään !(ii< immunoglobuliinin kaltaisia piirteitä ja jonka tunnistaa Mac-1 '(Kishimoto, T.K., et ai . . Leukocyte Typing III; McMichael, M.: "wherein the only known ligands are ICAM-1 and iC3b, which is a v: cognate component C3 fragment that shows no! (ii <immunoglobulin-like features and is recognized by Mac-1 '(Kishimoto, TK, et al.). Leukocyte Typing III; McMichael, M.

(toim.), Springer-Verlag, New York (1987); Springer, T.A. , et.(eds.), Springer-Verlag, New York (1987); Springer, T.A. , et.

» · ai . , Ann Rev Immunol . 5 (1987) 223 - 252; Anderson, D.C., et.»· Ai. , Ann Rev Immunol. 5: 223-252 (1987); Anderson, D.C., et.

• · · ai., Ann.Rev.Med. 38 (1987) 175 - 194). Sekventointianalyysin . . perusteella saatuja LFA-1:n mahdollisesti tunnistamia ICAM-1- i t « 1• · · ai., Ann.Rev.Med. 38: 175-194 (1987). Sequencing analysis. . based on LFA-1, possibly identified by ICAM-1?

I · II · I

,1.1 sekvenssiin kuuluvia peptidejä on esitetty taulukossa 9., Peptides belonging to SEQ ID NO: 1.1 are shown in Table 9.

* 1 · # « · • · » ♦ · • « · « · · «* 1 · # «· • ·» ♦ · • «·« · · «

Ml * · • · · «Ml * · • · · «

I · II · I

107451 73 TAULUKKO 9 ICAM-l-sekvenssiin sisältyviä peptidejä, jotka LFA-1 mahdollisesti tunnistaa -L-R-G-E-K-E-L- -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P- -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E- -P-R-G-G-S- -P-G-N-N-R-K- -Q-E-D-S-Q-P-M- -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S- -R-R-O-H-H-G-A-N-F-S- -D-L-R-P-Q-G-L-E- ICAM-1 on ensimmäinen esimerkki immunoglobuliinisupergeeni-ryhmäjäsenestä, joka sitoutuu integriiniin. Vaikka molemmat nämä ryhmät esittävät tärkeää osaa solukiinnityksessä, niiden välisen vuorovaikutuksen toteaminen oli odottamatonta. Sitä vastoin vuorovaikutukset immunoglobuliinigeenisuperryhmän puitteissa ovat varsin tavallisia. On varsin mahdollista, että * · • *' myöhemmin löydetään lisää esimerkkejä integriini- ja immuno- V · globoliiniryhmien välisistä vuorovaikutuksista. LFA-1 tunnistaa ICÄM-l:stä poikkeavan ligandin (Springer, T.A. , et ai . .107451 73 TABLE 9 Peptides in the ICAM-1 sequence identified by LFA-1 as possibly -LRGEKEL- -RGEKELKREP- -LRGEKELKREPAVGEPAE- -PRGGS- -PGNNRK- -QEDSQPM- -TPERVELAPLPS- -RGH- an example of an immunoglobulin supergene group member that binds to integrin. Although both of these groups play an important role in cell attachment, finding an interaction between them was unexpected. In contrast, interactions within the immunoglobulin gene superfamily are quite common. It is quite possible that further examples of interactions between the integrin and immunoglobulin V · globins will be found later. LFA-1 recognizes a ligand other than ICΔM-1 (Springer, T.A., et al.

Ί": Ann.Rev. Immunol. 5 (1987) 223 - 252) ja valkosoluintegriiniΊ ": Ann.Rev. Immunol. 5: 223-252 (1987)) and white blood cell integrin

Mac-1 tunnistaa C3bi:stä poikkeavan ligandin neutrofiili- • · ;’j*. neutrofiilikiinnityksessä (Anderson, D.C., et ai . . Ann.Rev.Med.Mac-1 recognizes a non-C3bi-related ligand in neutrophils. neutrophil attachment (Anderson, D.C., et al. Ann.Rev.Med.

* 38 (1987) 175 - 194). Lisäksi puhdistetut MAGrtä sisältävät rakkulat sitoutuvat MAG-pitoisiin hermoviejähaarakkeisiin, joten MAG:n on kyettävä heterofiiliseen vuorovaikutukseen • · · • · · *. jonkin nimenomaisen reseptorin kanssa (Poltorak, M., et ai,, J.Cell.Biol. 105 (1987) 1893 - 1899).38: 175-194 (1987). In addition, purified MAG-containing vesicles bind to MAG-containing nerve branching branches, so MAG must be capable of heterophilic interaction • · · • · · *. with a particular receptor (Poltorak, M., et al., J. Cell.Biol. 105 (1987) 1893-1899).

Ml • ·Ml • ·

IMIM

NCAM:n osuuden hermosolu-hermosolu- ja hermosolu-1ihassoluvuo- * · · ". rovaikutuksissa on esitetty johtuvan homofiilisistä NCAM-NCAM- 107451 74 vuorovaikutuksista (Cunnigham, B.A., et ai., Science 236 (1987) 799 - 806). MAG:n tärkeä rooli Schwannin solujen, jotka ympäröivät hermosolujen pitkää haaraketta myeliinitupen muodostuksen aikana, viereisten käänteiden välisissä vuorovaikutuksissa johtuu mahdollisesti vuorovaikutuksesta jonkin nimenomaisen reseptorin kanssa, tai homofiilisistä MAG-MAG-vuorovaikutuk-sista. Homologia NCAM:iin nähden ja alue-aluevuorovaikutuksien taajaan toistuva esiintyminen immunoglobuliinisupergeeniryhmässä nostaa esiin mahdollisuuden, että ICAM-1 mahdollisesti osallistuu homofiilisiin vuorovaikutuksiin sekä ICAM-l-LFA-1-heterofiilisiin vuorovaikutuksiin. Kuitenkin B-varhaisimuso-lujen, jotka kanssailmentävät samanlaisia LFA-1- ja ICAM-1-tiheyksiä, sitoutuminen ICAM-1:een keinotekoisissa faaseissa tai solu-yksikerroksissa voidaan estää täysin esikäsittelemäl1ä B-varhaisimusoluja LFA-l-MAb:11ä, kun taas kiinnitykseen ei vaikuta B-varhaisimusolujen esikäsittely ICÄM-l-MAb:llä. Esi-käsittelemällä yksikerrosta ICAM-l-MAb:11ä tuhotaan sitoutuminen täysin (Dustin, M.L., et ai ., J. Immunol. 137 (1986) 245 -254; Marlin, S.D., et ai .. Cell 51 (1987) 813 - 819). Nämä löydökset osoittavat, että jos ICÄM-l-homofii1ivuorovaikutuk- /. _ siä lainkaan esiintyy, niiden täytyy olla heikompia kuin < heterof ii liset LFA-1-vuorovaikutukset.The role of NCAM in nerve-to-cell and nerve-cell-muscle cell-mediated interactions is reported to be due to homophilic NCAM-NCAM-107451 74 interactions (Cunnigham, BA, et al., Science 236: 799-806 (1987)). MAG The important role of Schwann cells surrounding the long branch of nerve cells during myelin sheath formation, possibly due to interaction with a particular receptor, or homophilic MAG-MAG interactions and repeats of NCAM. in the immunoglobulin supergene group raises the possibility that ICAM-1 may be involved in homophilic interactions as well as heterophilic interactions with ICAM-1 However, the binding of early B cells that co-express similar LFA-1 and ICAM-1 densities in artificial phases or cell monolayers can be inhibited completely pretreating B-early cells with LFA-1-MAb, while attachment is not affected by pretreating B-early cells with ICA1-MAb. Pretreatment with a single layer of ICAM-1-MAb completely destroys the binding (Dustin, ML, et al., J. Immunol. 137: 245-254 (1986); Marlin, SD, et al., Cell 51: 813-7 (1987)). 819). These findings indicate that if ICAM-1-homophilic interactions. if any, they must be weaker than <heterophilic LFA-1 interactions.

• « i e • «• «i e •«

Mahdollisuus, että vaikosoluintegriinit tunnistavat ligandeja [ pohjimmaltaan täysin erilaisella tavalla, sopii 180 jäännöksen • » · ’·*·* sekvenssin läsnäoloon niiden ai f a-al yksiköissä , jolla sekvens- • I* *.* · sillä saattaa olla merkitystä 1 igandisitoutumisessa ja jota ei esiinny RGD:n tunnistavissa integriineissä (Corbi, A., et ai., : EMBO J 6 (1987) 4023 - 4028). Vaikka Mac-l:n on esitetty tunnistavan iC3b-5086 : ssa esiintyvän RGD-sekvenssin, ICAM-1 :een .ei sisälly RGD-sekvenssiä (kuvio 8). Tämä sopii yhteen fibro- II· *“,* nektiinipeptidin GRGDSP ja verrqkkipeptidin GRGESP kyvyttömyy- *··'* den kanssa inhiboida ICAM-l-LFA-l-kiinnitystä (Marlin, S.D., et.The possibility that goblet cell integrins recognize ligands [basically in a completely different way fits into the presence of 180 residues • »· '· * · * in their ai f a-al units, which may have a role in 1 IgG binding and which is not found in integrins recognizing RGD (Corbi, A., et al., EMBO J 6: 4023-4028 (1987)). Although Mac-1 is shown to recognize the RGD sequence present in iC3b-5086, ICAM-1 does not contain the RGD sequence (Figure 8). This is consistent with the inability of the fibrin II · *, * nectin peptide GRGDSP and the control peptide GRGESP to inhibit ICAM-1-LFA-1 attachment (Marlin, S.D., et al.

:V: ai ., Cell 51 (1987) 813 - 819). Kuitenkin sukulaissekvenssit ♦;··· kuten PRGGS ja RGEKE esiintyvät ICAM-1 :ssä alueilla, joiden 107451 75 ennustetaan muodostavat silmukan alueen 2 beeta-säikeiden a ja b väliin ja vastaavasti alueen 2 säikeiden c ja d väliin (kuvio 9) ja jotka täten ovat saatavilla tunnistusta varten. Kiinnostavaa on, että homologinen MAG-molekyyli sisältää RGD-sekvens-sin alueiden 1 ja 2 välillä (Poltorak, M., et ai ., J. Cel 1.Biol 105 (1987) 1893 - 1899; Salzer, J.L., et ai ., J.Cell.Biol. 104 (1987) 957 - 965).: V: al., Cell 51: 813-819 (1987). However, related sequences ♦; ··· such as PRGGS and RGEKE occur in ICAM-1 in the regions whose 107451 75 are predicted to form a loop between the beta strands a and b of strand 2 and between strands c and d of strand 2 respectively (Fig. 9). are available for identification. Interestingly, the homologous MAG molecule contains an RGD sequence between regions 1 and 2 (Poltorak, M., et al., J. Cel. Biol. 105 (1987) 1893-1899; Salzer, JL, et al. , Cell Cell Biol. 104: 957-965 (1987).

ESIMERKKI 19EXAMPLE 19

Southern- ja Northern-blot-määrityksetSouthern and Northern blots

Southernin blot-määritykset suoritettiin käyttäen 5 mikrogrammaa genomi-DNA:ta, joka oli uutettu kolmesta solulinjasta: BL2, Burkittin 1ymfomasolui inja (lahja Dr. Gilbert Lenoirilta); JY ja Er-LCL, jotka ovat EBV-transformoituja B-varhaisimusolusolu-1 injoja.Southern blots were performed using 5 micrograms of genomic DNA extracted from three cell lines: BL2, Burkitt's lymphoma cells (gift from Dr. Gilbert Lenoir); JY and Er-LCL, which are EBV-transformed B-early cell line-1 injectors.

DNA:t pilkottiin 5X valmistajan (New England Biolabs) suosittelemalla määrällä BamHIrtä ja EcoRl:tä. Pilkkomistuotteilla suoritettiin elektroforeesiajo 0,8-%:isessa agaroosigeelissä, minkä jälkeen DNA:t siirrettiin nylonkal voi le (Zeta Probe, BioRad) . Suodatin esihybridoitiin ja sitten hybridoitiin ,· noudatten vakiomenettelyitä käyttäen ICAM-cDNA:ta, joka oli ( peräisin HL-60:stä ja leimattu ai fa-(32P)dXTP:ei 11ä . , satunnaisalukemuodostusta käyttäen (Boehringer Mannheim).The DNAs were digested with BamHI and EcoR1 as recommended by the 5X manufacturer (New England Biolabs). The digestion products were subjected to electrophoresis on a 0.8% agarose gel, after which the DNAs were transferred to nylon gel (Zeta Probe, BioRad). The filter was pre-hybridized and then hybridized, following standard procedures using ICAM cDNA (derived from HL-60 and labeled with alpha (32 P) dXTP) using random priming (Boehringer Mannheim).

• · · *.* Northern-blot-määritykset suoritettiin käyttäen 20 mikrogrammaa • · ·Northern blots were performed using 20 micrograms.

*·* kokonais-RNA: ta tai 6 mikrogrammaa poly(A)+~RNA:ta. RNA* · * Total RNA or 6 micrograms of poly (A) + ~ RNA. RNA

denaturoitiin ja sillä suoritettiin elektroforeesi-ajo 1 % • « ·.*.· agaroosi-formaldehydigeelissä, minkä jälkeen tuotteet • · · : siirrettiin sähköisesti Zeta Probe -kalvolle. Suodattimia : .·. esihybridoitiin ja sitten hybridoitiin kuten aiemmin kuvattu • · · ”1/ (Staunton, D.E., et ai., EMBO J. 6 (1987) 3695 - 3701) käyttäen HL-60-cDNA-koetinta, joka käsitti 32P-leimattuja oligonukleoti-dikoettimia (kuvattu edellä).denatured and subjected to an electrophoresis run on a 1% agarose-formaldehyde gel, followed by electrophoresis on a Zeta Probe membrane. Filters:. was pre-hybridized and then hybridized as previously described. (Staunton, DE, et al., EMBO J. 6: 3695-3701 (1987)) using an HL-60 cDNA probe comprising 32 P-labeled oligonucleotide dip (described above).

76 10745176 107451

Southernin blot-määrityksissä käyttäen 3 ep:n cDNA-koetinta ja genomi-DNA:ta, joka oli pilkottu BamHI:llä ja EcoRI:llä, esiintyi yksittäinen pääasiallinen hybridoituva fragmentti, jonka koko oli 20 ja vastaavasti 8 ep:tä, mikä viittaa yksittäiseen geeniin ja siihen, että suurin osa kooditiedosta sisältyy 8 ep:n palaseen. Kolmen eri solulinjan blot-määrityk-sissä ei ilmennyt mitään restriktiofragmenttipolymorfiaan viittaavaa.Southern blots using a 3 bp cDNA probe and genomic DNA digested with BamHI and EcoRI showed a single major hybridizing fragment of 20 and 8 bp respectively, indicating a single gene and the fact that most of the code information is contained in an 8 bp fragment. Blot assays of three different cell lines revealed no evidence of restriction fragment polymorphism.

ESIMERKKI 20 ICÄM-i-geenin ilmennys "Ilmennysvektori" on vektori, joka (johtuen sopivien transkriptio- ja/tai translaatiosäätösekvenssien läsnäolosta) kykenee ilmentämään DNA- tai (cDNÄ-) molekyylin, joka on kloonattu vektoriin, ja siten tuottamaan polypeptidin tai proteiinin. Kloonatut sekvenssit ilmentyvät, kun ilmennys-vektori viedään sopivaan isäntäsoluun. Jos käytetään proka-ryoottista ilmennysvektoria, sopiva isäntäsolu olisi mikä tahansa prokaryoottinen solu, joka kykenee ilmentämään kloonattuja sekvenssejä. Vastaavasti jos käytetään euka-ryoottista ilmennysvektoria, sopiva isäntäsolu olisi mikä ! tahansa eukaryoottinen solu, joka kykenee ilmentämään ' kloonattuja sekvenssejä. Tärkeätä on, että koska euka- ryoottinen DNA saattaa sisältää välisekvenssejä ja koska ’·*.* prokaryoottiset solut eivät kykene oikealla tavalla pro- • · · V ’ sessoimaan tällaisia sekvenssejä, edullisesti käytetään cDNA:ta, joka on peräisin solusta, joka kykenee ilmentämään :V: ICAM-l:n, prokaryoottinen genomi-ilmennysvektorikirjaston • · muodostamiseksi. Menettelyitä cDNA:n valmistamiseksi ja . *. genomikirjaston tuottamiseksi julkistavat Maniatis, T., et ai.EXAMPLE 20 Expression of the ICÄM-i gene An "expression vector" is a vector which (due to the presence of appropriate transcription and / or translation control sequences) is capable of expressing a DNA or (cDNA) molecule cloned into a vector and thereby producing a polypeptide or protein. Cloned sequences are expressed when the expression vector is introduced into a suitable host cell. If a prokaryotic expression vector is used, a suitable host cell would be any prokaryotic cell capable of expressing the cloned sequences. Similarly, if a eukaryotic expression vector is used, a suitable host cell would be what! any eukaryotic cell capable of expressing cloned sequences. Importantly, because eukaryotic DNA may contain intervening sequences and because '· *. * Prokaryotic cells are not capable of properly processing such sequences, cDNA from a cell capable of expressing is preferably used. : V: For the construction of ICAM-1, a prokaryotic genomic expression vector library. Procedures for the preparation of cDNA; and. *. for the production of a genomic library are disclosed by Maniatis, T., et al.

• · · (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor • · *·*·* Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982)).(Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982).

• · « 4 4 ·;·.· Edellä kuvatun ilmennysvektorigenomikirjaston avulla muodos- 107451 tetaan isäntäsolupankki (jolloin jokainen solu sisältää kirjaston yhden jäsenen). Ilmennysvektori voidaan viedä isäntäsoluun millä tahansa lukuisista eri tavoista (eli transformoimalla, transfektoimalla, protoplastifuusiolla, elektroporaatiolla jne.). Ilmennysvektoripitoisten solujen muodostamaa pankkia 1isäännytetään kloonaamalla ja sen jäsenet määritetään yksittäin (immuunimääritystä käyttäen) sen määrittämiseksi, tuottavatko ne proteiinia, joka kykenee sitoutumaan ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen.The expression vector genome library described above is used to construct a 107451 host cell bank (where each cell contains one member of the library). The expression vector can be introduced into the host cell by any number of different means (i.e., transformation, transfection, protoplast fusion, electroporation, etc.). The library of expression vector-containing cells is introduced by cloning and its members are individually determined (by immunoassay) to determine whether they produce a protein capable of binding to an anti-ICAM-1 antibody.

Niiden solujen ilmennysvektoreita, jotka tuottavat ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen sitoutumaan kykenevää proteiinia, analysoidaan sitten edelleen sen määrittämiseksi, ilmentävätkö ne (ja siten sisältävät mainitun) ICAM-l-geenin kokonaisuudessaan, ilmentävätkö ne (ja siten sisältävät) vain ICAM-l-geeni-fragmentin, vai ilmentävätkö ne (ja siten sisältävät) geenin, jonka tuote, vaikkakin immunologisesti ICAM-l-sukuinen, ei ole ICAM-1. Vaikka tällainen analyysi voidaan suoritta millä tahansa kätevällä tavalla, edullisesti määritetään ilmennysvek-toriin kloonatun DNA- tai cDNA-fragmentin nukleotidisekvenssi. Näitä nukleotidisekvenssejä tutkitaan sitten sen määrittämiseksi, kykenevätkö ne koodittamaan polypeptidejä, joilla on sama aminohapposekvenssi kuin ICAM-1:n trypsiinipilkkomisfrag-menteilla (taulukko 5).The expression vectors of the cells that produce the protein capable of binding to the anti-ICAM-1 antibody are then further analyzed to determine whether they (and thus include the said) ICAM-1 gene as a whole, and (and thus) contain only ICAM-1 gene, or whether they express (and thus contain) a gene whose product, although immunologically related to ICAM-1, is not ICAM-1. While such analysis can be performed by any convenient means, preferably the nucleotide sequence of the DNA or cDNA fragment cloned into the expression vector is determined. These nucleotide sequences are then examined to determine whether they are capable of encoding polypeptides having the same amino acid sequence as the trypsin cleavage fragments of ICAM-1 (Table 5).

• · » '·*·' I lmennysvektori, joka sisältää ICAM-l-geeniä koodittavan DNA- • · » *.* ’ tai cDNA-molekyylin, voidaan siten tunnistaa (i) kyvystä ohjata proteiinin ilmennystä, joka kykenee sitoutumaan ICAM-l-vastai- • * seen vasta-aineeseen; ja (ii) nukleotidisekvenssm läsnäolosta, :*Γ; joka kykenee koodittamaan kutakin ICAM-l-trypsiinifragmenttia.An expression vector containing a DNA encoding an ICAM-1 gene or a cDNA molecule can thus be recognized (i) by its ability to direct expression of a protein capable of binding to ICAM-1. -antibody antibody; and (ii) the nucleotide sequence of the presence: * Γ; which is capable of encoding each ICAM-1 trypsin fragment.

• . Tällaisen iImennysvektoriin kloonattu DNA-molekyyli voidaan • « * ’**.* poistaa ilmennysvektorista ja eristää puhtaana.•. Such a DNA molecule cloned into an expression vector can be removed from the expression vector and isolated in pure form.

• · • · • « · « ♦ « • · « « * 78 1 0 7 4 51 ESIMERKKI 21• · • · • «·« ♦ «• ·« «* 78 1 0 7 4 51 EXAMPLE 21

Puhdistetun ICAM-l:n funktionaalisia aktiivisuuksiaFunctional activities of purified ICAM-1

Soluissa ICAM-1 toimii normaalisti pintaproteiinina, joka liittyy solumembraaniin. Tämän vuoksi puhdistetun ICAM-1:n funktiota tutkittiin sen jälkeen, kun molekyyli oli rekonstruoitu keinotekoisiin lipidimembraaneihin (liposomeihin tai rakkuloihin) liuottamalla proteiini pesuaineeseen liuotettuihin lipideihin, minkä jälkeen pesuaine poistettiin dialysoi-malla. ICAM-1, joka oli puhdistettu JY-soluista ja eluoitu pesuaine-oktyyliglukosidiin kuten edellä kuvattu, rekonsti-tuoitiin rakkuloihin, ja ICAM-l:n sisältävät rakkulat fuusioitiin 1asipääli1evyihin tai muovisiin viljelykuoppiin, jotta proteiiniin sitoutuvat solut kyettäisiin toteamaan.In cells, ICAM-1 normally functions as a surface protein associated with the cell membrane. Therefore, the function of purified ICAM-1 was investigated after reconstitution of the molecule with artificial lipid membranes (liposomes or vesicles) by dissolving the protein in lipid-dissolved detergent, followed by dialysis to remove the detergent. ICAM-1, purified from JY cells and eluted with detergent-octylglucoside as described above, was reconstituted in the vesicles, and the vesicles containing ICAM-1 were fused in 1-well plates or plastic culture wells to assure protein-binding cells.

Tasomembraanien ia muoviin sidottujen rakkuloiden valmistusManufacture of planar membranes and plastic-bound blisters

Rakkuloita valmistettiin Gayn et ai. (J. Immunol. 136 (1986) 2026) menetelmällä. Lyhyesti, munafosfatidyylikoliinia ja kolesterolia liuotettiin kloroformiin ja sekoitettiin . moolisuhteessa 7:2. Lipidiseos kuivattiin ohueksi kalvoksi pyörittämällä typpikaasuvirrassa ja sitä kylmäkuivattiin sitten • 4 i tunnin ajan viimeistenkin kloroformi jäämien poistamiseksi.Blisters were prepared by the method of Gay et al. (J. Immunol. 136: 2026 (1986)). Briefly, egg phosphatidylcholine and cholesterol were dissolved in chloroform and mixed. in a 7: 2 molar ratio. The lipid mixture was dried to a thin film by rotation in a stream of nitrogen gas and then freeze-dried for • 4 hours, at the latest, to remove residual chloroform.

"··' Lipidikalvo liuotettiin sitten liuokseen 1 % oktyyliglukosi- di/0,14 M NaCl/20 mM Tris (pH 7,2) 1 oppupitoisuuteen 0,1 mM f osf atidyyl ikol iini . Noin 10 mikrogrammaa puhdistettua ICAM-:l : l:tä tai humaani-glykoforiinia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) verrokkimembraaniglykoproteiinina lisättiin kohden kutakin millilitraa liuotettuja lipidejä. Proteiini-lipidi-pesuaine-liuosta dialysoitiin sitten 4 °C:ssa käyttäen 3 vaihtoa ja 200 • · · • tilavuutta liuosta 20 mM Tris/0,14 M NaCl, pH 7,2, ja yhtä • » : vaihtoa HBSS:ää.The lipid film was then dissolved in 1% octyl glucoside / 0.14 M NaCl / 20 mM Tris (pH 7.2) 1 at a concentration of 0.1 mM phosphatyl icoline. Approximately 10 micrograms of purified ICAM-1: 1 or human glycophorin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) as control membrane glycoprotein was added per ml of dissolved lipids, and the protein-lipid detergent solution was then dialyzed at 4 ° C using 200 shifts and 200 ° C. volume of 20 mM Tris / 0.14 M NaCl, pH 7.2, and one change in HBSS.

• · « * · • · »»»• · «* · •» »»

Tasomembraaneia valmistettiin Brianin et ai . , t · » 'Plane membranes were prepared by Brian et al. , t · »'

Proc . Nat 1 . Acad . Sei . USA 81 (1984) 6159, menetelmällä.Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 81: 6159 (1984).

107451 79107451 79

Lasipääli1evyjä (halkaisija 11 mm) keitettiin 15 minuutin ajan 1:6 laimennoksessa 7X pesuaineliuosta (Linbro), minkä jälkeen niitä pestiin yön yli tislatussa vedessä ja liotettiin sitten 70-%:isessa etanoliliuoksessa sekä kuivattiin ilmassa. 80 mikrolitran pisara rakkulaliuosta, joka sisälsi joko ICAM-l:tä tai glykoforiinia, sijoitettiin kuoppien pohjalle 24 kuopan rykelmälevylle, ja valmistetut lasilevyt asetettiin varovaisesti niiden päälle. Noin 20 - 30 minuutin inkuboinnin huoneenlämpötilassa jälkeen kuopat täytettiin HBSSrllä ja päälilevyt käännettiin, jolloin tasomembraani tuli ylöspäin. Kuoppia pestiin sitten runsaalla määrällä HBSS:ää ei-sitoutu-neiden rakkuloiden poistamiseksi. Tasomembraanipintaa varottiin altistamasta ilmalle.Glass cover plates (11 mm diameter) were boiled for 15 minutes in a 1: 6 dilution of 7X detergent solution (Linbro), then washed overnight in distilled water and then soaked in 70% ethanol solution and air dried. An 80 microliter drop of blister solution containing either ICAM-1 or glycophorin was placed at the bottom of the wells in a 24-well cluster plate, and the prepared glass slides were carefully placed over them. After incubation for about 20-30 minutes at room temperature, the wells were filled with HBSS and the coverslips were inverted to expose the planar membrane. The wells were then washed with copious amounts of HBSS to remove non-bound vesicles. The planar membrane surface was cautioned against exposure to air.

Lasipintoihin fuusioiduilla tasomembraanei1 la suoritettujen kokeiden puitteissa ICAM-l:tä sisältävien rakkuloiden todettiin sitoutuvan suoraan monikuoppa-kudosviljelylevyjen muovipintaan ja säilyttävän funktionaalisen aktiivisuutensa, minkä osoitti spesifinen solusitoutuminen. Tällaisia rakkuloita kutsutaan tästä eteenpäin "muoviin sidotuiksi rakkuloiksi" (PBV), koska .·, muoviin sidottujen lipidirakkuloiden luonnetta ei ole selvi- • « · |... tetty. Muoviin sidotut rakkulat valmistettiin lisäämällä 30 mikrolitraa rakkulasuspensiota suoraan kuoppien pohjalle 96In experiments with glass membrane fused flat membranes, ICAM-1-containing vesicles were found to bind directly to the plastic surface of multi-well tissue culture plates and retain their functional activity as demonstrated by specific cell binding. Such blisters are hereinafter referred to as "plastic-bound blisters" (PBV), because the nature of the plastic-bound lipid vesicles has not been elucidated. The plastic-bound vesicles were prepared by adding 30 microliters of the vesicle suspension directly to the bottom of the wells 96

« I«I

kuopan kudosviljelmälevyillä (Falcon), minkä jälkeen levyjäwell tissue culture plates (Falcon) followed by plates

• « · < I• «· <I

| ' inkuboitiin ja kuopat pestiin kuten kuvattu tasomembraanei11 e.| were incubated and the wells were washed as described in flat membranes.

• · · • · · • · • · · V * SolukiinnitvsmääritvksetV * Cell Attachment Specifications

Solukiinnitysmääritykset tasomembraaneja tai muoviin sidottuja • · :*·*: rakkuloita käyttäen suoritettiin oleellisessa mielessä samalla . tavalla lukuunottamatta, että soluluvut ja tilavuudet PBV- • · « määrityksissä olivat 1/5 tasomembraanimäärityksissä käyte- ’···* tyistä.Cell attachment assays using planar membranes or plastic bound • ·: * · *: vesicles were performed essentially. except that the cell numbers and volumes in PBV assays were 1/5 of those used in the level membrane assays.

• · · • · · ·;··· T-imusoluja normaaleista verrokeista ja potilaasta, joka poti 80 107451 valkosolukiinitysvajausta (LAD) eikä siis kyennyt ilmentämään LFA-l:tä (Anderson, D.C., et ai . . J. Infect.Dis. 152 (1985) 668), valmistettiin viljelemällä ääreisveren yksitumasoluja 1 mikrogrammalla/ml konkanavalliini-A:ta (Con-A) RPMI 1640-kasvualustassa, jota oli täydennetty 20 %:lla FCS:tä, pitoisuutena 5 x 105/ml 3 päivän ajan. Sitten solut pestiin kahdesti RPMI:llä ja kerran 5 mM metyyli-alfa-D-mannopyrano-sidiliuolsella 1ektiinijäämän poistamiseksi solupinnalta. Solut kasvatettiin RPMI/20 % FCS:ssä, joka sisälsi 1 ng:n/ml yhdis-telmä-IL-2:ta, ja niitä käytettiin 10. - 22. päivänä kasvatuksen aloittamisesta.T lymphocytes from normal controls and from a patient who had 80,107,451 white blood cell kinase deficiency (LAD) and was therefore unable to express LFA-1 (Anderson, DC, et al., J. Infect.Dis). 152: 668 (1985)) were prepared by culturing peripheral blood mononuclear cells with 1 microgram / ml concanavallin A (Con-A) in RPMI 1640 medium supplemented with 20% FCS at 5 x 10 5 / ml for 3 days. I drive. The cells were then washed twice with RPMI and once with 5 mM methyl alpha-D-mannopyranoic acid solution to remove the 1ectin residue on the cell surface. Cells were grown in RPMI / 20% FCS containing 1 ng / ml recombinant IL-2 and used on day 10-22 of culture initiation.

Solusitoutumisen tasomembraaneihin tai PBV:hen toteamiseksi Con-A-emosoluja, T-1ymfoma-SKW3-soiuja ja EBV-transformoituja B-varhaisimusolusolulinja-JY-soluja (LFA-l-positiivinen) ja LFA-l-vajaan varhaisimusolulinjän (BBN) soluja (jotka oli saatu potilaasta 1, Springer, T.A., et ai., J.Exper.Med. 160 (1986) 1901 - 1918) leimattiin radioaktiivisesti inkuboimalla 1 x 107 solua 1 ml kohden RPMI-1640/10 % FCS:ää 100 mikrocurie-yksiköllä Na5lCrO<:ää tunnin ajan 37 °C:ssa, minkä jälkeen ne . pestiin 4 kertaan RPMI 1640 -kasvualustalla ei-sisäistyneen <it leiman poistamiseksi. Monoklonaalivasta-ainekokeissa soluja tai ’ muoviin sidottuja rakkuloita esikäsitel tiin 20 mikrogrammal- la/ml puhdistettua vasta-ainetta RPMI-1640/10 % FCS:ssä 4 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen niitä pestiin 4 kertaan • · ϊ,ί,ϊ ei-sitoutuneen vasta-aineen poistamiseksi. Kokeissa, joissa tutkittiiin kaksivalenssisten kationien vaikutuksia solusitou-tumiseen, solut pestiin vain kerran HBSS:llä, joka ei sisäl-tänyt Ca2 + -, Mg2 + -ioneja mutta sisälsi 10 % dialysoitua FCS:ää, ja CaCl:ää ja MgClrää lisättiin merkittyihin pitoisuuksiin.For detection of cellular binding to membranes or PBV, Con-A parent cells, T-1 lymphoma SKW3 cells and EBV-transformed B-early cell line-JY (LFA-1 positive) and LFA-1-deficient early cell line (BBN) cells obtained from patient 1, Springer, TA, et al., J.Exper.Med. 160 (1901-1918) (1986) were radiolabeled by incubating 1 x 10 7 cells per ml with RPMI-1640/10% FCS in 100 microcurie. Na5ClCO <for one hour at 37 ° C followed by. was washed 4 times with RPMI 1640 medium to remove non-internalized label. In monoclonal antibody assays, cells or 'plastic-bound vesicles were pretreated with 20 micrograms / ml purified antibody in RPMI-1640/10% FCS at 4 ° C for 30 minutes, followed by 4 washes • · ϊ, ί , ϊ to remove non-bound antibody. In experiments that examined the effects of divalent cations on cell binding, cells were washed only once with HBSS, which did not contain Ca 2+, Mg 2+ ions, but contained 10% dialyzed FCS, and CaCl and MgCl 2 were added to the labeled concentrations. .

t t ·t t ·

Kaikissa kokeissa soluja ja tasomembraaneja tai PBV:tä esitä- « · : sapainoitettiin sopivassa lämpötilassa (4 °C, 22 °C, tai 37 °C) • · t sopivassa määrityspuskurissa).In all experiments, cells and platelets or PBV were pre-weighed at the appropriate temperature (4 ° C, 22 ° C, or 37 ° C) in suitable assay buffer).

• · ·• · ·

• · I• · I

Solusitoutumisen puhdistettuun ICAM-l:een mittaamiseksi 5lCr- 81 107451 leimattuja soluja (2 x 105 EBV-transformanttia tasomembraani-määrityksissä; 1 x 105 EBV-transformanttia tai SKW3-solua, 2 x 155 Con-A-emosolua PBV-määrityksissä) sentrifugoitiin 2 minuutin ajan 25 x g:ssä tasomembraaneihin tai PBVrhen, minkä jälkeen inkuboitiin 4 °C:ssa, 22 °C:ssa tai 37 °C:ssa tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen ei-sitoutuneet solut poistettiin suorittamalla 8 kierrosta, joilla täytettiin ja imettiin pois puskuri, joka oli tasapainoitettu sopivaan lämpötilaan. Sitoutuneet solut kvantitoitiin liuottamalla kuoppasisällöt liuoksella 0,1 N NaOH/1 % Triton X-100, ja laskemalla gamma-laskijassa. Prosentuaalinen solusitoutuminen määritettiin jakamalla tuikkeet/min sitoutuneista soluista käytetyllä soluiiitteisel1ä tuiketta/min -arvolla. Tasomembraanikokeissa käytettyjä tuikkeita/min -arvoa korjattiin siten, että otettiin huomiooon päälilevyjen pinta-alan suhde vi1jelykuoppien pinta-alaan.To measure cell binding to purified ICAM-1, 5Cr-81 107451 labeled cells (2 x 105 EBV transformants in flat-membrane assays; 1 x 105 EBV transformants or SKW3 cells, 2 x 155 Con-A parent cells in PBV assays) were centrifuged at for 25 minutes at 25 xg in flat membranes or PBV, followed by incubation at 4 ° C, 22 ° C or 37 ° C for 1 hour. After incubation, unbound cells were removed by performing 8 rounds of loading and aspirating buffer equilibrated to the appropriate temperature. Bound cells were quantitated by dissolving the wells in 0.1 N NaOH / 1% Triton X-100 and counting in a gamma counter. Percent cellular binding was determined by dividing the scintillation / min from the bound cells by the cellular scintillation / min value used. The scintillation / min value used in planar membrane experiments was corrected to take into account the ratio of the surface area of the top plates to the area of the wells.

Näissä määrityksissä EBV-transformoidut B-varhaisimusolut, SKW3-T-lymfomasolut ja Con-A-T-imusoluemosolut sitoutuivat spesifisesti ICAM-l:een keinotekoisilla membraanei11 a (kuviot 11 ja 12). Sitoutuminen oli spesifinen, koska solut sitoutuivat hyvin huonosti verrokkitasomembraaneihin tai rakkuloihin, jotka sisälsivät ekvivalenttisia määriä toista humaanisolupintaglyko-proteiinia, glykoforiinia. Lisäksi LFA-l-positiiviset EBV-transf ormantit ja Con-A-emosolut sitoutuivat, kun taas niiden ' LFA-l-negatiiviset vastineet eivät sitoutuneet mainittavassa määrin, mikä osoittaa, että sitoutuminen oli riippuvaista LFA- ··· ! ·’ 1 l:n läsnäolosta soluilla.In these assays, EBV-transformed B-early lymphocytes, SKW3-T lymphoma cells, and Con-A-T lymphocytes bound specifically to ICAM-1 on artificial membranes (Figures 11 and 12). The binding was specific because the cells were very poorly bound to control level membranes or vesicles containing equivalent amounts of another human cell surface glycoprotein, glycophorin. In addition, LFA-1-positive EBV transformants and Con-A parent cells bound, whereas their 'LFA-1-negative counterparts did not bind significantly, indicating that the binding was LFA- ···! · The presence of 1 l on the cells.

♦ :V: Sekä solusitoutumisen spesifisyys että riippuvuus solu-LFA- • · l:stä vahvistettiin monoklonaalisilla vasta-aineilla suori- • · · tetuissa salpauskokeissa (kuvio 13). JY-solujen sitoutuminen • · · : pystyttiin estämään 97-%:isesti kun ICAM-l-pitoiset PBV: t • » · '...* esikäsitel tiin ICAM-l-vastaisel la monokl onaal isel la vasta- aineella RR1/1. Esikäsittelemäl 1 ä soluja samalla vasta-aineella ....: oli vähäinen vaikutus. Sitä vastoin LFA-l-vastainen monoklonaa- • ♦ 82 107451 linen vasta-ainen TS1/18 esti sitoutumisen 96-%:isesti, mutta vain silloin kun solut, ei PBV, esikäsiteltiin. Verrokkivasta-aineella T2/9, joka reagoi LFA-3:n kanssa (toinen imusolupinta-antigeeni), ei ollut merkittävää inhiboivaa vaikutusta, kun joko solut tai PBV oli esikäsitelty. Tämä koe osoittaa, että keinomembraaneissa itse ICAM-1, eikä jokin vähäinen epäpuhtaus, välittää havaittua solukiinnittymistä ja että kiinnittyminen on riippuvainen LFA-l:n läsnäolosta sitovalla solulla.♦: V: Both the specificity of cell binding and the dependence on cell-LFA- • · 1 were confirmed in monoclonal antibody blocking experiments (Fig. 13). Binding of JY cells • · ·: prevented by 97% when ICAM-1 containing PBVs were pretreated with anti-ICAM-1 la monoclonal antibody RR1 / 1 . Pretreatment of cells with the same antibody .... had little effect. In contrast, the anti-LFA-1 monoclonal antibody TS1 / 18 blocked binding by 96%, but only when cells, not PBV, were pretreated. The control antibody T2 / 9, which reacts with LFA-3 (another lymphocyte surface antigen), had no significant inhibitory effect when either cells or PBV were pretreated. This experiment demonstrates that, in artificial membranes, ICAM-1 itself, rather than some minor impurity, mediates the observed cell attachment and that attachment is dependent on the presence of LFA-1 on the binding cell.

Solujen sitoutuminen ICAM-1:een keinomembraaneilla osoitti niinikään kahta muuta LFA-l-riippuvaisen kiinnitys järjestelmän ominaisuutta: lämpötilariippuvuus ja kaksivalenssisten kationien tarve. Kuten esitetty kuviossa 14, Con-A-emosolut sitoutuivat ICAM-l:een PBVreissä erittäin tehokkaasti 37°C:ssa, osittain 22 °C:ssa ja hyvin heikosti 4 °C:ssa. Kuten esitetty kuviossa 15, sitoutuminen oli täysin riippuvainen kaksivalens-sisten kationien läsnäolosta. Fysiologisissa pitoisuuksissa Mg2 + yksinään oli riittävä maksimaaliselle solusitoutumiselle, kun taas Ca2+ yksinään aikaansai hyvin alhaisia sitoutumista-soja. Kuitenkin maksimaalinen sitoutuminen saatiin Mg2+:lla . l/10:na normaalista pitoisuudesta kun siihen oli yhdistetty 4 · « β e *<(i Ca2+:aa, jonka vaikutus oli synergistinen.The binding of cells to ICAM-1 by artificial membranes also showed two other features of the LFA-1-dependent attachment system: temperature dependence and the need for divalent cations. As shown in Figure 14, Con-A parent cells bound to ICAM-1 in PBVs very efficiently at 37 ° C, partially at 22 ° C, and very poorly at 4 ° C. As shown in Figure 15, the binding was completely dependent on the presence of divalent cations. At physiological concentrations, Mg 2+ alone was sufficient for maximal cell binding, whereas Ca 2+ alone produced very low binding salts. However, maximal binding was obtained with Mg 2+. l / 10 of the normal concentration when combined with 4 × β e * <(i Ca 2+) with a synergistic effect.

• * « 1 I « « • 9 9• * «1 I« «• 9 9

Yhteenvetona solusitoutumisen puhdistettuun ICAM-1: een, joka on 4 *·" sisällytetty keinomembraaneihin, spesifisyys, monoklonaalisi11 a • f ί.ί.ϊ vasta-aineilla saatu spesifinen inhibitio ja 1 ämpöti 1 ariippu- :T: vuus sekä riippuvuus kaksivalenssisista kationeista osoittavat, että ICAM-1 on LFA-l-riippuvaisen kiinnitys järjestelmän spesi- .*.% finen ligandi.In summary, specific binding, specific inhibition of monoclonal antibodies and 1 µm of 1 binding to purified ICAM-1, incorporated into artificial membranes, and 1 µm: dependence on divalent cations. that ICAM-1 is a specific ligand for the LFA-1-dependent attachment system.

• · • · · • · · • · · ESIMERKKI 22 Ι.ί ί ICAM-l:n ja HLA-DR:n ilmennys yliherkkyys- ja • · · myrkky 1 aas tarikoereakt ioissa • » • · · • · e • *EXAMPLE 22 Expression of ICAM-1 and HLA-DR in Hypersensitivity and • · Toxicant 1 Year Tumor Reactions

Viiden normaalin yksilön iho-otoksia tutkittiin niiden ICAM-1- 83 1 0 7 4 51 ja HLA-DR-ilmennyksen osalta. Todettiin, että kun endoteeli-solut joissain verisuonissa tavallisesti ilmensivät ICÄM-l:n, ICÄM-1 ei ilmentynyt normaalista ihosta otetuilla keratinosyy-teillä. HLA-DR-värjääntymistä ei todettu yhdelläkään keratoni-syytillä, joka peräisin oli normaali-ihonäytteestä. Sitten tutkittiin ICAM-1- ja luokka-II-antigeenien ilmennyksen kinetiikkaa soluilla, jotka oli saatu yliherkkyys- tai myrkkyvaikutusihovaurionäytteistä. Todettiin, että puolella kuudesta tutkitusta yksilöstä oli keratinosyyttejä, jotka ilmensivät ICÄM-l:n, neljän tunnin kuluttua hapteenin levittämisestä (taulukko 10). ICAM-l:n keratinosyytei11 ään ilmentävien yksilöiden prosentuaalinen osuus kasvoi altistusajan hapteenille funktiona, jolloin myös keratinosyyttiä kohden värjääntymisintensiteetti - joka osoitti ICAM-1-ilmennyksen lisääntymistä - kasvoi ajankohtaan 48 tuntia asti. Itse asiassa tänä ajankohtana tietty osuus keratinosyyteistä kaikissa kudosnäytteissä värjääntyi positiivisesti ICAM-1:11ä. Ajankohtana 72 tuntia (24 tuntia sen jälkeen kun hapteeni oli poistettu) 7 kahdeksasta yksilöstä ilmensi edelleen ICAM-l:n keratinosyytei1lään, jolloin kuitenkin ICAM-1:n ilmennys yhdellä yksilöllä poistui ajankohtien 48 ja 72 tuntia välillä.Skin samples from five normal individuals were examined for their ICAM-1-83107461 and HLA-DR expression. It was found that when endothelial cells normally expressed ICÄM-1 in some blood vessels, ICÄM-1 was not expressed on normal skin-derived keratinocytes. HLA-DR staining was not detected with any keratone charge from a normal skin sample. The kinetics of the expression of ICAM-1 and class II antigens in cells obtained from hypersensitivity or toxicity lesions were then examined. It was found that half of the six individuals examined had keratinocytes expressing ICÄM-1, four hours after hapten application (Table 10). The percentage of individuals expressing ICAM-1 on keratinocytes increased as a function of exposure time to hapten, whereby also the staining intensity per keratinocyte - which showed an increase in ICAM-1 expression - increased up to 48 hours. In fact, at this time, a certain percentage of keratinocytes in all tissue samples were positively stained with ICAM-1. At 72 hours (24 hours after the hapten was removed), 7 of the 8 individuals continued to express ICAM-1 on their keratinocytes, however, the expression of ICAM-1 in one individual disappeared between 48 and 72 hours.

4 < ( < i ( « l I l I I ( « · · • · · • · · • · · • · · • · • · · • · « • · • · · • · · • · • · ·4 <(<i {«l I l I I (« · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

• I I• I I

• · e a a a a a a a a a • aa 84 107451 TAULUKKO 10 ICAM-1- ja HLÄ-DR-induktion kinetiikka keratinosyyteillä yliherkkyys1 aastarikoenäytteistäTABLE 10 Kinetics of ICAM-1 and HLÄ-DR Induction by Keratinocytes in Hypersensitivity1 from Annual Fat Samples

Aika laasta- Kudos- . r rin asetuk- näytteitä ICAM-1 HLA-DR ICAM-1& sen jälkeen (kpl) vain vain (h)Time to devour- Tissue-. r rin setup samples ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 & after (pcs) only (h)

Normaali iho 5000Normal skin 5000

Yliherkkyys- laastarikoe 4 5 3a 0 0 8 9 3 0 0 24 8 7 0 0 48b 8 5 0 3 72 8 6 0 1 aNäytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä , keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt.Hypersensitivity patch test 4 5 3a 0 0 8 9 3 0 0 24 8 7 0 0 48b 8 5 0 3 72 8 6 0 1 aSamples were considered positive if at least small keratinocyte clusters were discolored.

a a • " bKaikki laastarit poistettiin tänä ajankohtana.a a • "bAll patches were removed at this time.

• a « a a < a • « a• a «a a <a •« a

Kudosopi 11 isesti ICAM-l-värjääntymiskuvio keratinosyytei 11 ä kudosnäytteistä, jotka otettiin neljän tunnin kuluttua : hapteenin levittämisestä, oli tavallisesti pieninä rykelminä.Hepatoplasty ICAM-1 staining pattern on keratinocytes 11 tissue samples taken after 4 hours: application of hapten was usually in small clusters.

Ajankohtana 48 tuntia ICAM-1 ilmentyi valtaosan keratinosyy-teistä pinnalla, jolloin minkäänlaista eroa ei havaittu vaurion keski- ja äärialueiden välillä. Värjääntymisen intensiteetti • · « aleni keratinosyyttien lähestyessä ihon sarveiskerrosta. Tämä » · « *. todettiin sekä vaurioiden keski- että äärialueilta otetuissa • · ·.· : kudosnäytteissä. Samoin tänä ajankohtana laastarikoe oli posi- ! : tiivinen (vuotamista, punoitusta ja rakkuloita). ICAM-l-ilmen- nyksessä ei havaittu mitään eroa käytettäessä herkillä yksi- • 4 · loilla eri hapteeneja. Keratinosyyttien ohella ICAM-1 ilmentyi • 4 107451 85 myös joillakin yksitumasolui1 la ja endoteelisoluilla vaurio-kohdassa .At 48 hours, ICAM-1 was expressed on the majority of keratinocytes on the surface, whereby no difference was observed between the central and peripheral regions of the lesion. The intensity of staining • · «decreased as keratinocytes approached the stratum corneum. This »·« *. was found in both mid and peripheral lesions • · ·. ·: tissue samples. Similarly, at this time the patch test was a posi-! : tight (bleeding, redness and blisters). No difference was observed in ICAM-1 expression when using different hapten in sensitive individuals. In addition to keratinocytes, ICAM-1 was also expressed on some mononuclear cells and endothelial cells at the lesion site.

HLA-DR-ilmennys keratinosyytei1lä yliherkkyysihovaurioissa oli vähemmän yleistä kuin ICÄM-l:n. Yhdelläkään tutkituista yksilöistä ei ollut vaurioita, joissa keratinosyytit värjääntyivät positiivisesti HLA-DR:lle, aina ajankohtaan 24 tuntia asti hapteenin käyttämisestä. Itse asiassa vain neljässä kudosnäytteessä oli keratinosyyttejä, jotka ilmensivät HLA-DR:n, eikä yhdessäkään kudosnäytteessä ollut keratinosyyttejä, jotka olisivat positiivisia HLA-DR:11 e mutta eivät ICAM-l:lle (taulukko 10).HLA-DR expression by keratinocytes in lesions of hypersensitivity was less common than that of ICÄM-1. None of the individuals studied had lesions in which keratinocytes were positively stained for HLA-DR until 24 hours after application of the hapten. In fact, only four tissue samples contained keratinocytes expressing HLA-DR, and none of the tissue samples had keratinocytes positive for HLA-DR but not for ICAM-1 (Table 10).

Vastoin kuin y1iherkkyyslaastarikoevauriossa, myrkkylaastari-koevauriossa, joka oli indusoitu krotoniöljyllä tai natrium-lauryylisulfaatilla, esiintyi keratinosyyttejä, jotka osoittivat vain vähän, jos ollenkaan ICAM-l:tä pinnoillaan kaikkina testattuina ajankohtina (taulukko 11). Itse asiassa 48 tunnin kuluttua laastarin asettamisesta, joka ajankohta oli optimaalinen ICAM-l-ilmennyksel1 e yliherkkyyslaastarikoeyksilöillä, , vain yhdellä 14 myrkkylaastarikoehenkilöstä oli ICAM-l:n '· " ilmentäviä keratinosyytte jä vaurioissaan. Samoin vastoin kuin yliherkkyyslaastarikoenäytteissä, myrkkylaastarikoevaurioissa keratinosyyteillä ei ilmentynyt lainkaan HLA-DR:ää.In contrast to the hypersensitivity patch test lesion, the toxic patch test lesion induced by croton oil or sodium lauryl sulfate showed keratinocytes that showed little if any ICAM-1 on their surfaces at all times tested (Table 11). In fact, 48 hours after application of the patch, which was the optimal time for ICAM-1 expression in hypersensitivity patches, only one of the 14 toxic patch subjects had ICAM-1 '' expressing keratinocytes in their lesions. -DR added.

Nämä tulokset osoittavat, että ICAM-1 ilmentyy immuunipohjäi-sessa tulehduksessa mutta ei myrkkypohjäisessä tulehduksessa, t ja täten ICAM-l-ilmennystä voidaan käyttää immuunipohjäisen ja myrkkypoh jäisen tulehduksen erottamiseksi toisistaan, kuten • · · akuutin munuaisten toiminnan heikkenemisen munuaissiirtopoti- • · · laissa tunnistamiseksi, koska on vaikeata määrätä, johtuuko • · : toiminnan heikkeneminen hyljinnästä tai immuunivastetta hei- • · · ;...ί kentävän terapeuttisen aineen myrkkyvaikutuksista munuaiseen.These results indicate that ICAM-1 is expressed in immune-based inflammation but not in toxic-based inflammation, t and thus ICAM-1 expression can be used to distinguish between immuno-based and toxic-based inflammation, such as • · · acute renal failure · to identify whether it is difficult to determine if the impairment is due to the renal toxicity of the rejection or immune response.

Ottamalla kudosnäyte ja määrittämällä ICAM-l-ilmennyksen ylös-säätö voidaan erottaa toisistaan immuunipoh jäinen hyljintä ja 86 107451 ei-immuunipöhjäinen myrkkyreaktio.By taking a tissue sample and determining the up-regulation of ICAM-1 expression, an immune-based rejection and 86,107,451 non-immune-toxic reactions can be distinguished.

TAULUKKO 11 ICAM-1- ja HLA-DR-induktion kinetiikka keratinosyytei11ä myrkky1 aastarikoenäytteistäTABLE 11 Kinetics of induction of ICAM-1 and HLA-DR by keratinocytes from poison1 annual test specimens

Aika laas- Kudos- tarin ase- näytteitä tuksen jäi- (kpl) · ICAH-1 HLA-DR ICAM-1 &Time Plasma Tissue Weapon Samples Tube Ice (PCS) · ICAH-1 HLA-DR ICAM-1 &

keen (h) vain vain HIA-DRkeen (h) HIA-DR only

4 4 0 0 0 8 3 la 0 0 24 3 1 0 0 48° 14 1 0 0 72 3 1 0 0 aNäytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt. bKaikki laastarit poistettiin tänä ajankohtana.4 4 0 0 0 8 3 Sat 0 0 24 3 1 0 0 48 ° 14 1 0 0 72 3 1 0 0 aSamples were considered positive if at least small keratinocyte clusters had stained. bAll patches were removed at this time.

ESIMERKKI 23 ICAM-1- ja HLA-DR-ilmennys hyvänlaatuisissa ihosairauksissa i.:.: Soluista, jotka oli otettu eri tyyppisiä ihon tulehdussairauk- :T: siä potevien potilaiden ihovaurionäytteistä, tutkittiin niiden ICAM-1- ja HLA-DR-ilmennys. Osa keratinosyyteistä näytteissä, jotka olivat peräisin yliherkkyyskosketusihottumasta, rakkula- • « ihottuman kaltaisesta ihottumasta/rakkulaihottumasta ja ihon * « « punajäkälätaudista, ilmensivät ICAM-1:n. Ihon punajäkälätau- • · : tinäytteet osoittivat voimakkainta vär jääntymistä, jolloin • ♦ · kuvio oli samankaltainen tai jopa voimakkaampi kuin se, joka havaittiin 48 tunnin yliherkkyyslaastarikoenäytteil lä (taulukko 12). Yhtäpitävästi tuloksien kanssa, jotka saatiin yliherkkyys- 87 107 451 1aastarikokeessa, intensiivisin ICAM-l-värjääntyminen todettiin kohdissa, joissa oli tapahtunut voimakasta yksitumasoluvuota-mista. Lisäksi 8 tutkituista 11 punajäkälätautinäytteestä oli positiivista HLA-DR-ilmennykselle keratinosyyteillä.EXAMPLE 23 Expression of ICAM-1 and HLA-DR in Benign Skin Diseases i.:.: Cells taken from skin lesion samples of patients with different types of skin inflammatory diseases were examined for their ICAM-1 and HLA-DR expression. Some of the keratinocytes in samples from hypersensitivity contact dermatitis, vesicle-like rash / blistering and dermal lichen erythema expressed ICAM-1. Skin red lichen plaque samples showed the strongest discoloration, showing a pattern similar to or even stronger than that observed with the 48-hour hypersensitivity patch samples (Table 12). Consistent with the results obtained in the Hypersensitivity 87,107,451 1a-patch assay, the most intense ICAM-1 staining was observed at sites where there was strong mononuclear cell proliferation. In addition, 8 of the 11 red lichen samples tested positive for HLA-DR expression on keratinocytes.

ICAM-1-ilmennys keratinosyyteillä, jotka oli saatu tulehdus-ihottumaa tai nokkosrokkoa potevien potilaiden kudosnäytteistä, oli vähemmän ilmeinen. Vain neljällä tutkituista 7 potilaasta, joilla oli jompikumpi näistä sairauksista, oli keratinosyyt-tejä, jotka ilmensivät ICAM-l:n vauriokohdassa. HLA-DR-iImen-nystä tavattiin vain yhdellä potilaalla ja se esiintyi ICAM-l:n yhteydessä.The expression of ICAM-1 in keratinocytes obtained from tissue samples from patients with inflammatory dermatitis or urticaria was less evident. Only four of the 7 patients studied who had either of these diseases had keratinocytes that expressed ICAM-1 at the site of injury. HLA-DR lymphoma was observed in only one patient and occurred in association with ICAM-1.

Endoteelisolut ja osa yksitumasoluvuodosta kaikista tutkituista hyvänlaatuisista ihon tulehdussairauksista ilmensivät ICAM-l:n vaihtelevissä määrin.Endothelial cells and some of the mononuclear cell bleeds exhibited varying levels of ICAM-1 in all of the benign skin inflammatory diseases studied.

t l l lt l l l

> t I> t I

I I .I I.

• · · • · • · · • · · I · · • · • ♦ · • · « ·· • · · • · » • · • · · • ♦ · • · · · • · ·• · I I I I I · • ♦ ♦ ♦ «« «♦« «« ««

* V* V

• · • « « • · · • · · « « es 107451 TAULUKKO 12 ICAM-l:n ja HLA-DR:n ilmennys keratinosyyteillä,jotka ovat peräisin hyvänlaatuisista ihosairauksistaTABLE 12 Expression of ICAM-1 and HLA-DR by Keratinocytes from Benign Skin Diseases

Diagnoosi Tapauksia ICAM-1 HLA-DR ICAM-1&Diagnosis Cases ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 &

(kpl) vain' vain HLA-DR(pcs) only 'HLA-DR only

Yliherkkyys- kontakti-ihot- - 0 2 tuma ö 0 “Punajäkälä- ^1 3 0 8 tautiHypersensitivity- contact-skin- - 0 2 nucleus 0 'red lichen- ^ 1 3 0 8 disease

Rakkulaihottuman kalainen/rakku- 2-2 0 0 laihottumaBluetongue / bladder 2-2 0 0 obesity

Tulehdusihottuma 3 2 0 ^Inflammatory dermatitis 3 2 0 ^

Nokkosrokko 4 1 0 1 aNäytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli vär jääntynyt.Hives 4 1 0 1 aSamples were considered positive if at least small keratinocyte clusters were discolored.

ESIMERKKI 24 ICAM-1:n ilmennys keratinosyytei11ä, jotka • · 4 *·*.* ovat peräisin hi 1 setystauti-ihovaurioista • · · • · « • · s e ICAM-l-ilmennystä ihonäytteissä, jotka olivat viidestä hilse- :V: tystautia potevasta potilaasta, tutkittiin ennen PUVA-hoidon • · j*·*· käynnistämistä ja ajoittain hoitojakson aikana. Näytteitä . *. otettiin 5 potilaasta, jotka sairastivat kudosopillisesti ··· : vahvistettuna tavanomaista hilsetystautia. Näytteet otettiin ·«* sarjana ennen PUVA-hoidon aloittamista ja sen aikana ilmoitet-tuna ajankohtana. PUVA:aa annettiin 3-4 kertaa viikossa. Näytteet otettiin viideltä potilaalta hi 1 setystautipesäkkeiden e o 89 107451 äärialueilta, minkä ohella näytteitä otettiin kliinisesti normaalista ihosta neljältä näistä potilaista.EXAMPLE 24 Expression of ICAM-1 by Keratinocytes, • · 4 * · *. * Derived from Histochemical Dermal Lesions • · · · · · · IC50-1 in Skin Samples of Five Dandruff: V: patients with comorbidities were examined before and during treatment with PUVA. Samples. *. 5 patients with histopathologic ···: confirmed conventional dandruff disease were taken. Samples were taken in a · «* series before and during PUVA treatment at the indicated time. PUVA was given 3-4 times a week. Five patients were sampled from the periphery of colonic hysterectomy eo 89 107451, and four of these patients were clinically normal skin.

Vastaotetut ihokudosnäytteet jäädytettiin ja varastoitiin nestetyppeen. Kuuden mikronin kryostaattiviipaleita kuivattiin ilmassa yön yli huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen niitä kiinnitettiin asetonissa 10 minuutin ajan ja sitten joko värjättiin välittömästi tai käärittiin alumiinikalvoon ja varastoitiin -80 °C:seen värjäämiseen asti.The received skin tissue samples were frozen and stored in liquid nitrogen. Six micron cryostat slices were air dried overnight at room temperature, then fixed in acetone for 10 minutes and then either stained immediately or wrapped in aluminum foil and stored at -80 ° C until staining.

Värjääminen suoritettiin seuraavasti. Viipaleita inkuboitiin monoklonaalisilla vasta-ainella ja värjättiin kolmivaiheisella immunoperoksidaasimenetelmällä (Stein, H., et ai., Adv.Cancer Res. 42 (1984) 67 - 147) käyttäen diaminobentsidiini-vety-peroksidi-substraattia. Positiivisina verrokkeina ICAM-1 ja HLA-DR-värjääntymisel1 e käytettiin risoja ja imusolmukkeita Negatiivisina verrokkeina toimivat primaarivasta-aineen puuttuessa värjätyt kudosnäytteet.Staining was performed as follows. The slices were incubated with the monoclonal antibody and stained by the three-step immunoperoxidase method (Stein, H., et al., Adv.Cancer Res. 42: 67-147 (1984)) using a diaminobenzidine-hydrogen peroxide substrate. Tissues and lymph nodes were used as positive controls for ICAM-1 and HLA-DR staining. Tissue samples stained in the absence of primary antibody served as negative controls.

HLA-DR:n vastaiset monokonaaliset vasta-aineet hankittiin Becton Dickinson -valmistajalta (Mountainview, Kalifornia). Monoklonaalinen ICAM-l-vastainen vasta-aine oli R6-5-D6.Monoclonal antibodies against HLA-DR were purchased from Becton Dickinson (Mountainview, California). The monoclonal anti-ICAM-1 antibody was R6-5-D6.

, Peroksidaasikonjugoitu kaniinin anti-hiiri-Ig ja peroksidaa- ' sikonjugoitu sian anti-kaniini-Ig hankittiin Dakapatts-valmis- , .. tajalta, Kööpenhamina, Tanska. Diaminobentsidiini-tetrahydro- *;[;1 kloridi hankittiin Sigma-valmistajalta (St. Louis, MO)., Peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse Ig and peroxidase-conjugated porcine anti-rabbit Ig were purchased from Dakapatts, Copenhagen, Denmark. Diaminobenzidine-tetrahydro- [1] chloride was purchased from Sigma (St. Louis, MO).

• · · • ♦ ·• · · • ♦ ·

Tutkimuksen tulokset osoittavat, että endoteelisolut joissain • · verisuonissa ilmentävät ICAM-l:n sekä sairaassa että normaa- • · · lissa ihossa, mutta värjäyksen intensiteetti ja ICAM-l:n 1· ilmentävien verisuonien lukumäärä oli kasvanut hi 1setystauti- • · · ihovaurioissa. Lisäksi ICAM-l:n ilmennyskuvio keratinosyytei 1 -·;1 lä, jotka olivat hoitamattomista hiIsetystauti-ihovaurioista viidestä potilaasta, vaihteli vain hyvin pienien solurykelmien vär jääntymisestä moniin vär jääntyneisiin keratinosyytteihin .The results of the study show that endothelial cells in some blood vessels express ICAM-1 in both diseased and normal skin, but the intensity of staining and the number of blood vessels expressing ICAM-1 1 · · in skin lesions were increased. . In addition, the expression pattern of ICAM-1 on keratinocytes 1-1 of 5 patients with untreated ischemic skin lesions varied only from very small cell clustering to many stained keratinocytes.

107451 90 PUVA-hoidon aikana ICAM-l-iImennys kahdella potilaista (potilaat 2 ja 3) osoitti merkittävää vähenemistä, joka edelsi tai tapahtui samanaikaisesti kuin kliininen toipuminen (taulukko 13). Potilailla 1, 4 ja 5 oli laskuja ja nousuja ICÄM-l-ilmen-nyksessä PUVA-hoidon aikana, jotka korreloivat kliinisiin toipumisiin ja vastaavasti uudelleensairastumisiin. ICAM-1-ilmennystä ei esiintynyt normaalista ihosta saaduilla keratino-syyteillä ennen PUVA-hoitoa tai sen jälkeen. Tämä osoittaa, että PUVA ei indusoi ICAM-l:tä normaalin ihon keratinosyy-teillä.107451 90 During treatment with PUVA, ICAM-1 dilution in two patients (Patients 2 and 3) showed a significant reduction that preceded or occurred at the time of clinical recovery (Table 13). Patients 1, 4 and 5 had decreases and increases in ICAM-1 expression during PUVA treatment, which correlated with clinical recovery and re-morbidity, respectively. ICAM-1 expression did not occur with normal skin keratinocytes before or after PUVA treatment. This indicates that PUVA does not induce ICAM-1 on normal skin keratinocytes.

Huomion arvoinen oli havinto, että yksitumasoluvuodon tiheys korreloi ICAM-l-ilmennyksen määrään keratinosyytei11ä. Tämä koski sekä yksitumasolujen määrän laskua vaurioissa PUVA-hoidon aikana, jolloin myös ICAM-l-iImennys heikkeni, sekä yksitumasolujen lukumäärän kasvuun PUVA-hoidon aikana, jolloin ICAM-l-iImennys keratinosyytei11ä oli selvempi. Endoteelisolut ja ihon yksitumasolut olivat niinikään ICAM-l-positiivisia. Kliinisesti normaalissa ihossa ICAM-l-iImennys rajoittui endoteelisoluihin, jolloin keratinosyytit eivät 1eimaantuneet.Of note was the observation that the density of mononuclear cell leakage correlated with the amount of ICAM-1 expression on keratinocytes. This involved both a decrease in the number of mononuclear cells in the lesions during PUVA treatment, whereby also ICAM-1 depletion was reduced, and an increase in the number of mononuclear cells during the PUVA treatment, where the ICAM-1 lysis in keratinocytes was more pronounced. Endothelial cells and skin mononuclear cells were also ICAM-1 positive. In clinically normal skin, ICAM-1 expression was restricted to endothelial cells, with no keratinocytes being labeled.

« « i « « HLA-DR:n ilmennys keratinosyy tei 11 ä vaihteli. Ei löytynytThe expression of HLA-DR in keratinocytes varied. Was not found

» I I»I I

yhtään HLA-DR-positiivista kudosnäytettä, joka ei ollut myös • i ICAM-l-positiivinen.no HLA-DR positive tissue samples that were also not • ICAM-1 positive.

• < « · I• <«· I

I I t I II I t I I

*·*.* Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että ennen hoitoa ICAM- • · · V : 1-ilmennys on ilmeistä keratinosyytei11ä ja korreloi tiheään yksitumasoluvuotoon. PUVA-hoidon aikana todetaan selvä ICAM-1- • » ϊ värjääntymisen lasku samanaikaisesti, kun tapahtuu kliinistä paranemista. Kudosopi 11 isesti ihovuoto niinikään väheni. Kun .kliininen uudel1eensairastuminen hoidon aikana oli ilmeinen, • · « * · « ICAM-l-iImennys keratinosyytei11ä kasvoi , kuten kasvoi myös ihovuodon tiheys. Kun hoidon aikana havaitiin kliinistä ::: toipumista, tapahtui samanaikaisesti keratinosyyttien ICAM-1- ·;·· värjääntymisessä alenemista kuten myös ihovuodossa laskua.* · *. * In summary, these results indicate that pre-treatment ICAM • · · V: 1 expression is evident on keratinocytes and correlates with dense mononuclear cell bleeding. During PUVA treatment, a clear decrease in ICAM-1 • »ϊ staining is observed with clinical healing. Hepatoplasty 11 also reduced skin bleeding. When clinical reappearance during treatment was evident, ICAM-1 expression on keratinocytes increased, as did the frequency of skin bleeding. When a clinical recovery was observed during treatment, there was a concurrent decrease in keratinocyte ICAM-1 · · ·· staining as well as a decrease in skin bleeding.

9i 107451 Täten ICAM-1-ilmennys keratinosyyteillä korreloi ihon yksitu-masoluvuodon tiheyteen. Nämä tulokset osoittavat, että kliinisenä vasteena PUVA-hoitoon tapahtui selvä lasku ICAM-1-ilmennnyksessä keratinosyyteillä samanaikaisesti, kun tapahtui kohtuullisempi vähennys yksitumasolujen määrässä. Tämä osoittaa, että ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä on vastuussa ihovuodon käynnistämisestä ja ylläpidosta ja että PUVA-hoito säätää alaspäin ICAM-1:tä, mikä puolestaan heikentää ihovuotoa ja tulehdusvastetta. Tulokset osoittavat myös, että HLA-DR-ilmennys keratinosyyteillä vaihteli PUVA-hoidon aikana.9i 107451 Thus, expression of ICAM-1 on keratinocytes correlates with the density of skin mononuclear cells. These results indicate that, in clinical response to PUVA, there was a clear decrease in ICAM-1 expression on keratinocytes, with a more moderate reduction in the number of mononuclear cells. This demonstrates that the expression of ICAM-1 on keratinocytes is responsible for initiating and maintaining skin leakage, and that PUVA treatment down-regulates ICAM-1, which in turn decreases skin leakage and inflammatory response. The results also show that HLA-DR expression on keratinocytes varied during PUVA treatment.

ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä hilsetystautiin liittyvissä vaurioissa korreloi vaurion kliiniseen vakavuuteen sekä ihon-vuodon määrään. Täten ICAM-1 esittää keskeistä osaa hilsetys-taudissa, jolloin sen ilmennyksen ja/tai vuorovaikutuksen CD18-kompleksin yksitumasolujen kanssa inhiboinnista tullaan saamaan tämän sairauden tehokas hoito. Lisäksi ICAM-l-ilmennyksen tarkkailusta keratinosyyteillä tullaan saamaan tehokas apuväline hilsetystaudin diagnoosiin ja prognoosiin, sekä terapian etenemisen arviointiin.ICAM-1 expression on keratinocytes in lesions associated with dandruff correlates with the clinical severity of the lesion and the extent of skin leakage. Thus, ICAM-1 plays a central role in dandruff, whereby inhibiting its expression and / or interaction with the mononuclear cells of the CD18 complex will provide an effective treatment for this disease. In addition, monitoring of ICAM-1 expression on keratinocytes will provide an effective tool for diagnosis and prognosis of dandruff and for assessing the progress of therapy.

<<

• · I• · I

« « « • t«« «• t

• I• I

• « « « I• «« «I

• · 1 • · · • · • · · • · · • · · • · » · · • · · • · ··· • · · • · · • · • · · ♦ « · ··· · ··· • · ♦ · • « « « · • · · 92 107451 TAULUKKO 13 ICAM-1-ilmennys keratinosyytei11ä hi 1setystautivaurioissa (PS) ja kliinisesti normaalissa ihossa (N) ajan funktiona ennen PUVA-hoidon aloittamista ja sen aikana· 1 · 1 1 1 1 1 1 ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ · TABLE 13 ICAM-1 Expression in Keratinocytes in Hemorrhagic Disease (PS) and Clinically Normal Skin (N) as a function of Time Before and During PUVA Treatment

Ajankohta Potilas n:o ennen PUVA- . . 5 hoitoa tai 1 L 0Date Patient No. before PUVA. . 5 treatments or 1 L 0

sen aikana ps PS N PS N PS N PS Nduring it ps ps n ps n ps n ps n

0 ++-++-++- +++ - 1 päivä + 1 viikko + + - - -++- + 1 2 3 o 2 viikkoa ++ +-+-+- 3 viikkoa ++ * 0 4 viikkoa ++ + - ++ * 1 5-6 viikkoa - - o 7 viikkoa (++) {+) +++ - ★ 1 ]0 viikkoa (+) · » • · • · · 2 V ·' +++ Paljon positiivisia keratinosyyttejä ++ Kohtuullisesti positiivisia keratinosyyttejä + Paikallisesti positiivisia keratinosyyttejä • · ( + ) Hajaantuneesti vain hyvin vähän positiivisia keratinosyyttejä • » t 3 « ~ Ei positiivista värjääntymistä • ·· ·1 ’...· 1 Kliininen toipuminen :V.‘ ° Kliininen uudel 1 eensairastuminen • « 93 1 0 7 4 51 ESIMERKKI 25 ICAM-1:n ja HLA-DR:n ilmennys pahanlaatuisissa ihosairauksissa0 ++ - ++ - ++ - +++ - 1 day + 1 week + + - - - ++ - + 1 2 3 o 2 weeks ++ + - + - + - 3 weeks ++ * 0 4 weeks ++ + - ++ * 1 5-6 weeks - - o 7 weeks (++) {+) +++ - ★ 1] 0 weeks (+) · »• · • · 2 V · '+++ Lots of positive keratinocytes ++ Moderately positive keratinocytes + Locally positive keratinocytes • · (+) Only very few positive keratinocytes dispersed • »t 3« ~ No positive staining • ·· · 1 '... · 1 Clinical recovery: V.' ° Clinical New 1 Prognosis • «93 1 0 7 4 51 EXAMPLE 25 Expression of ICAM-1 and HLA-DR in Malignant Skin Diseases

Vauriokohtiin hyvänlaatuisissa ihosairauksissa verrattuna ICAM-1-ilmennys keratinosyyteillä pahanlaatuisissa ihovauriokohdissa oli huomattavasti vaihtelevampi (taulukko 14). Tutkituista 23:sta ihon T-solulymfomasta ICAM-l-positiivisia keratinosyyt-tejä todettiin vain 14 tapauksessa. Keratinosyyteillä, jotka olivat peräisin mycosis fungoides -vaurionäytteistä, oli taipumus menettää ICAM-l-ilmennyksensä taudin jatkovaiheissa. Kuitenkin ICÄM-l-ilmennystä todettiin vaihtelevassa osuudessa yksitumasoluvuotoa useimmista ihon T-solulymfomavaurioista. Tutkituista jäljellä olevista lymfomista neljällä kahdeksasta oli ICAM-l:n ilmentäviä keratinosyyttejä. Tutkituista 29 potilaasta, joilla oli pahanlaatuisia ihosairauksia, viidellä oli keratinosyyttejä, jotka ilmensivät HLA-DR:n ilmentämättä ICAM-l:tä (taulukko 14).Compared to lesions in benign skin lesions, the expression of ICAM-1 on keratinocytes in malignant lesions was significantly more variable (Table 14). Of the 23 skin T cell lymphomas examined, ICAM-1 positive keratinocytes were found in only 14 cases. Keratinocytes derived from mycosis fungoides lesion samples tended to lose their ICAM-1 expression in the advanced stages of the disease. However, ICÄM-1 expression was found in varying proportions of mononuclear cells from most skin T-cell lymphoma lesions. Four of the eight remaining lymphomas examined had keratinocytes expressing ICAM-1. Of the 29 patients studied with malignant skin diseases, five had keratinocytes expressing HLA-DR without expressing ICAM-1 (Table 14).

• · ·• · ·

• « I• «I

• · ·• · ·

• « I• «I

« I < • ««I <•«

• I• I

* « · « • · v · · • 1 · • · • ♦ · • 1 · • · · • · • · · • · · • ·* «·« • · v · · • 1 · • • • ♦ · • 1 · • · · · · · · · ·

• M• M

• · ·• · ·

» I I»I I

• 1 * · · t · I • · · · * · · • · • · * · » • · * · · • · · * · · » 1 · • · 94 1 0 7 4 51 TAULUKKO 14 ICAM-1:n ja HLA-DR:n ilmennys keratinosyytei11ä, jotka olivat peräisin pahanlaatuisista ihosairauksista• 1 * · · t · I • · · · * • • • * 94 1 0 7 4 51 TABLE 14 ICAM-1: and HLA-DR in keratinocytes derived from malignant skin diseases

Tapauksia ICAM-1 HLA-DR ICAM-1&Cases ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 &

Diagnoosi (kpl) vain vain HLA-DRDiagnosis (pcs) only for HLA-DR

CTCL, MFI 8 la 0 4 CTCL, MFII-III 10 1 2 5 CTCL, SS 3102 CTCL, suuri solu 2 0 2 0 CBCL 2 0 0 1CTCL, MFI 8 la 0 4 CTCL, MFII-III 10 1 2 5 CTCL, SS 3102 CTCL, Large Cell 2 0 2 0 CBCL 2 0 0 1

Ihon leukemia 3 li 1Skin leukemia 3 li 1

Histiosytoosi-X 1 0 0 0 aNäytteet katsottiin posiitiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt.Histocytosis-X 1 0 0 0 aSamples were considered positive if at least small keratinocyte clusters were discolored.

i i ci i c

I t t • II t t • I

‘' ESIMERKKI 2 6 ICAM-l-vastaisten vasta-aineiden vaikutus ihmisen ääreisveren i'' EXAMPLE 2 6 Effect of Anti-ICAM-1 Antibodies on Human Peripheral Blood i

« « * I I«« * I I

yksitumasolujen lisääntymiseen • · ( • · ♦ • · ··* ·.· · Ihmisen ääreisveren yksitumasolut indusoituvat lisääntymään antigeeni- tai mitogeeni1äsnäolon ja -tunnistuksen seurauksena. Tietyt molekyylit, kuten mitogeeni konkanaval 1 iini-A, tai T- • · soluihin sitoutuva vasta-aine OKT3, aiheuttavat ääreisveren .\ yksitumasolujen ei-spesifistä lisääntymistä.mononuclear cells proliferate as a result of the presence and recognition of antigen or mitogen. Certain molecules, such as mitogen concanaval 1 -inin A, or T-cell binding antibody. substance OKT3, induce non-specific proliferation of peripheral blood.

♦ · · • · · ··· · ··· • ·♦ · · • · · ··· · ··· · ·

Ihmisen ääreisveren yksitumasolut ovat heterogeenisiä siinä :V: mielessä, että ne koostuvat soiu-alapopulaatioista, jotka kykenevät tunnistamaan spesifisiä antigeenejä. Kun ääreisveren 95 1 0 7 4 51 yksitumasolu, joka kykenee tunnistamaan tietyn spesifisen antigeenin, tapaa tuon antigeenin, vastaavan yksitumasolu-alapopulaation lisääntyminen indusoituu. Jäykkäkouristus-toksiini ja avaimenreikä-maljakotilohemosyaaniini ovat esimerkkejä antigeeneistä, jotka ääreisveren yksitumasolu-alapopulaatiot tunnistavat, mutta joita kaikki ääreisveren yksitumasolut eivät tunnista kerkistyneissä yksilöissä.Human peripheral blood mononuclear cells are heterogeneous in the sense that they consist of cell subpopulations that are capable of recognizing specific antigens. When a peripheral blood 95 1 0 7 4 51 mononuclear cell capable of recognizing a specific antigen encounters that antigen, an increase in the corresponding mononuclear cell subpopulation is induced. Tetanus toxin and keyhole ventricle hemocyanin are examples of antigens recognized by peripheral blood mononuclear cell subpopulations but not recognized by all peripheral blood mononuclear cells in accelerated individuals.

Tutkittiin ICAM-l-vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen R6-5-D6 kykyä estää ihmisen ääreisveren yksitumasolujen lisäänty-misvasteet järjestelmissä, joiden tiedetään edellyttävän solu-soi ukiinnityksiä.The ability of anti-ICAM-1 monoclonal antibody R6-5-D6 to inhibit human peripheral blood mononuclear cell proliferation responses in systems known to require cellular attachments was examined.

Ääreisveren yksitumasoluja puhdistettiin Ficol1-Pague-(Pharmacia) gradientteja käyttäen valmistajan ohjeiden mukaan. Rajafaasi otettiin talteen ja solut pestiin kolmeen kertaan RPMI 1640 -kasvualustalla, minkä jälkeen niitä viljeltiin tasapohjaisilla 96 kuopan mikrotiitterilevyillä pitoisuutena 106 solua/ml RPMI 1640 -kasvualustassa, jota oli täydennetty 10 %:lla nautasikiöseerumia, pitoisuudella 2 mM glutamiini ja gentamysiinilla (50 mikrogrammaa/ml) .Peripheral blood mononuclear cells were purified using Ficol1-Pague (Pharmacia) gradients according to the manufacturer's instructions. The cut-off phase was harvested and the cells were washed three times with RPMI 1640 medium and then cultured in flat-bottom 96-well microtiter plates at 10 6 cells / ml in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 50 mM / ml glutam ml).

< I I<I I

Antigeeni, joko T-solumitogeeni, konkanavalliini-A (0,25 mikrogrammaa/ml); T-soluja sitova vasta-aine, OKT3 (0,001 ( t mikrogrammaa/ml); avaimenreikä-mal jakoti 1 o-hemosyaniini (10 * · · *.* g/ml) tai jäykkäkouristustoksiini (1:100 laimennos lähteestä) • · « ’·’ lisättiin soluihin, joita viljeltiin kuten edellä kuvattu joko ICAM-vastaisen vasta-aineen (R6-5-D6; 1oppupitoisuus 5 g/ml) • · ·.·.· läsnäollessa tai vastaavasti puuttuessa. Soluja viljeltiin 3,5 » · · : päivän ajan (konkanaval 1 iini-A-koe), 2,5 päivän ajan (0KT3-koe) : .·. tai 5,5 päivän ajan (avaimenreikä-mal jakotilo-hemosyaniini- • · · .·*·[ sekä jäykkäkouristustoksiinikokeet), minkä jälkeen kokeet • · Ί* päätettiin.Antigen, either T cell mitogen, Concanavallin A (0.25 micrograms / ml); T-cell binding antibody, OKT3 (0.001 (t micrograms / ml); keyhole dispensed with 1O-hemocyanin (10 * · · *. * G / ml) or tetanus toxin (1: 100 dilution from source) • · « '·' Was added to cells cultured as described above in the presence or absence of either anti-ICAM antibody (R6-5-D6; final concentration 5 g / ml). ·: For one day (concanaval 1inin A test), for 2.5 days (0KT3 test):. · Or for 5.5 days (keyhole split-state hemocyanin • · ·. · * · [ and tetanus toxin tests), after which the tests were terminated.

• · · • · · • · 18 tuntia ennen kokeen päättämistä viljelmiin lisättiin 2,5 96 107451 mikrocurie-yksikköä 3H-tymidiiniä. Solu jakaantuminen määritettiin mittaamalla tymidiinin siirtyminen ääreisveren yksitumasolujen DNA:han. Siirtynyt tymidiini kerättiin ja laskettiin nestetuikelaskijassa (Merluzzi et ai.. JImmunol.18 hours before the end of the experiment, 2.5 96 107451 microcurie units of 3 H-thymidine were added to the cultures. Cell division was determined by measuring the migration of thymidine to the DNA of peripheral blood mononuclear cells. The displaced thymidine was collected and counted in a liquid scintillation counter (Merluzzi et al.

139 (1987) 166 - 168). Näiden kokeiden tulokset on esitetty kuviossa 16 (konkanavalliini-A-koe), kuviossa 17 (OKT3-koe), kuviossa 18 (avaimenreikä-maljakoti1o-hemosyaniinikoe) ja kuviossa 19 (jäykkäkouristustoksiinikoe).139: 166-168 (1987). The results of these experiments are shown in Fig. 16 (Concanavallin A test), Fig. 17 (OKT3 assay), Fig. 18 (Keyhole-Vessel Home-Hemocyanin assay) and Fig. 19 (tetanus toxin assay).

Todettiin, että ICAM-l-vastainen vasta-aine inhiboi lisään-tymisvasteita ei-spesifisel1 e T-solumitogeeni11 e, Con-A; ei-spesifiselle T-soluliitteiselle antigeenille, OKT-3; ja spesifisille antigeeneille, avaimenreikä-maljakoti1o-hemosyaniini ja jäykkäkouristustoksiini; yksitumasoluissa. Inhibitio ICAM-1-vastaisel1 a vasta-aineella oli verrattavissa inhibitioon LFA-l-vastaisel1 a vasta-aineella, mikä viittaa siihen, että ICAM-1 on LFÄ-l:n funktionaalinen ligandi ja että ICAM-l-antagonismi inhiboi spesifisen puolustusjärjestelmän vastei ta.It was found that the anti-ICAM-1 antibody inhibited reproductive responses to non-specific T-cell mitogen, Con-A; non-specific T cell-associated antigen, OKT-3; and for specific antigens, keyhole-vial bag-10-hemocyanin and tetanus toxin; mononuclear cells. Inhibition of anti-ICAM-1 antibody was comparable to inhibition of anti-LFA-1 antibody, suggesting that ICAM-1 is a functional ligand for LFA-1 and that ICAM-1 antagonism inhibits the response of a specific defense system. ta.

ESIMERKKI 27 ICÄM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus ,···, sekaimusolureaktioon * i * . , Kuten edellä esitetty, ICAM-1 on välttämätön tehokkaille • · · ·];* soluvuorovaikutuksil 1 e immuunivasteissa, joita välittää LFA-1- II* ·* riippuvainen solukiinnitys. ICAM-l:n induktio immuunivasteiden yhteydessä tai tulehdussairaudessa mahdollistaa valkosolujen vuorovaikutuksen toistensa sekä endoteelisolujen kanssa.EXAMPLE 27 Effect of anti-ICÄM-1 antibody, ···, on mixed cell reaction * i *. , As discussed above, ICAM-1 is essential for potent cellular interactions in immune responses mediated by LFA-1- II * · * dependent cell attachment. Induction of ICAM-1 in connection with immune responses or in inflammatory disease allows white blood cells to interact with each other and with endothelial cells.

• · · • · · * · i : Kun kahdesta ei-sukulaisyksilöstä peräisin olevia imusoluja • · · ’**.* viljellään toistensa läsnäollessa, havaitaan imusolujen • · *’* emosolumuodostusta ja solu jakaantumista. Tämä vaste - yhden ·.·.* imusolupopulaation vaste toisen imusolupopulaation läsnäoloon - tunnetaan sekaimusolureaktiona (MLR), ja se on analoginen 97 1 0 7 4 51 imusolujen vasteeseen mitogeenia lisättäessä (Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, Klein, J., John Wiley & Sons, NY, 1982, ss. 453 - 458).When lymphocytes from two non-related individuals are cultured in the presence of each other, lymphocyte formation and cell division are observed in lymphocytes. This response - the response of one lymphocyte population to the presence of another lymphocyte population - is known as the Mixed Cell Response (MLR) and is analogous to the response of 97 1 0 7 4 51 lymphocytes upon addition of mitogen (Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, Klein, J.). , John Wiley & Sons, NY, 1982, pp. 453-458).

Suoritettiin kokeita ICAM-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksen humaani-MLR:ään määrittämiseksi. Nämä kokeet suoritettiin seuraavasti, fiäreisverta otettiin normaaleista terveistä luovuttajista laskimosta punktoimalla. Veri kerättiin hepariinilla käsiteltyihin koeputkiin, joissa sitä laimennettiin 1:1 huoneenlämpötilassa Puck's G - (Gibco) tasapainotetulla suolaliuoksella (BSS). Veriseos (20 ml) asetettiin kerrokseksi 15 ml:lie Ficoll/Hypaque-tiheysgra-dienttia (Pharmacia, tiheys = 1,078, huoneenlämpötilassa) ja sentrifugoitiin 1000 x g:ssä 20 minuutin ajan. Rajafaasi otettiin sitten talteen ja pestiin 3X Puck's G -valmisteella. Solut laskettiin hemasytometrissä ja uudelleenlietettiin RPMI 1640 -kasvualustaan (Gibco), joka sisälsi 0,5 % gentamysiiniä, pitoisuuden 1 mM L-glutamiinia (Gibco) ja 5 % 1ämpöinaktivoitua (56 °C, 30 min.) humaani-AB-seerumia (Flow Laboratories) (johon kasvualustaan tästä eteenpäin viitataan "RPMI-kasvualustana").Experiments were performed to determine the effect of anti-ICAM monoclonal antibodies on human MLR. These experiments were performed as follows, femoral blood was drawn from normal healthy donors by puncture. Blood was collected in heparin-treated test tubes where it was diluted 1: 1 at room temperature with Puck's G - (Gibco) Balanced Saline (BSS). The blood mixture (20 mL) was layered in 15 mL of a Ficoll / Hypaque density gradient (Pharmacia, density = 1.078, at room temperature) and centrifuged at 1000 x g for 20 minutes. The cut-off phase was then recovered and washed with 3X Puck's G. Cells were counted in a hemacytometer and resuspended in RPMI 1640 medium (Gibco) containing 0.5% gentamycin, 1 mM L-glutamine (Gibco) and 5% heat-inactivated (56 ° C, 30 min.) Human AB serum (Flow). Laboratories) (hereinafter referred to as "RPMI medium").

* » ♦ « · « [... Näissä kokeissa käytettiin hiiren ICAM-l-vastaista vasta- ainetta (R6-5-D6). Kaikkia monokl onaal isiä vasta-aineita (jotka valmistettiin vatsaontelonesteestä Jackson ImmunoResearch • « « < t ‘ ' Laboratories -laboratoriossa, Boston, MA) käytettiin puhdis-\V tettuina IgG-valmisteina.* »♦« · «[... In these experiments, a murine anti-ICAM-1 antibody (R6-5-D6) was used. All monoclonal antibodies (prepared from intraperitoneal fluid at Jackson ImmunoResearch Laboratory, Boston, MA) were used as purified IgG preparations.

• I» • · · • · « fiäreisveren yksitumasoluja (PBMC) viljeltiin kasvualustassa : pitoisuutena 6,25 x 105 solua/ml Linbron pyöreäpohjäisi 11 a :*·*: mikrotiitterilevyi 1 lä (# 76-013-05). Toisesta luovuttajasta . saatuja stimulaattorisoluja säteilytettiin 1000 R:llä, minkä •*j/ jälkeen niitä viljeltiin vastesolujen kanssa samana pitois-’·.·* uutena. Viljelmän kokonaistilavuus oli 0,2 ml. Verrokkeina :V: toimivat vastesolut yksinään sekä stimulaattorisolut yksinään.Femoral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured in medium at 6.25 x 10 5 cells / ml in a Linbro round bottom 11a: * · *: microtiter plate 1 (# 76-013-05). Another donor. the resulting stimulator cells were irradiated at 1000R, then cultured at the same concentration as the response cells. The total volume of the culture was 0.2 ml. As controls: V: Response cells alone and stimulator cells alone.

Vil jelymal jo ja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 % C02:ta sisältävässä 98 107451 kostutetussa ilmakehässä 5 päivän ajan. Kuoppia sykäytettiin 0,5 mikrocurie-yksikön pitoisuudella tritioitua tymidiiniä (3HT) (New England Nuclear) viljelyn 18 viimeisen tunnin aikana. Joissain tapauksissa suoritettiin kaksisuuntainen MLR. Menettelyjärjestys oli sama lukuunottamatta, että toisen luovuttajan soluja ei inaktivoitu säteilyttämällä.The culture mill was already incubated at 37 ° C in 5% CO 2 containing 98,107,451 in a humidified atmosphere for 5 days. The wells were pulsed with 0.5 microcurie units of tritiated thymidine (3HT) (New England Nuclear) for the last 18 hours of culture. In some cases, a bidirectional MLR was performed. The order of the procedure was the same except that the cells of the second donor were not inactivated by irradiation.

Solut otettiin talteen lasikuitusuodattimille käyttäen automaattista näytekerääjää (Skatron, Norja), minkä jälkeen ne huuhdottiin vedellä ja metanolilla. Suodattimia kuivattiin uunissa, minkä jälkeen ne laskettiin Aquasol-nesteessä Beckmanin (LS-3801) nestetuikelaskijalla. Tulokset ilmaistaan keskimääräisenä tuiketta/min-arvona +/- s.d. kuudesta eri vi1jelmästä.Cells were harvested on glass fiber filters using an automatic sample collector (Skatron, Norway) and then rinsed with water and methanol. The filters were oven dried and then counted in Aquasol liquid on a Beckman (LS-3801) liquid scintillation counter. The results are expressed as mean twilight / min +/- s.d. from six different programs.

Taulukosta 15 ilmenee, että puhdistetut ICAM-l-vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet inhiboivat MLR:ää annosriippuvaisella tavalla, jolloin merkittävää suppressiota ilmeni pitoisuudella 20 ng/ml. Puhdistetulla hiiri-IgG:1lä oli vain vähäinen tai ei lainkaan suppressiivista vaikutusta. MLR:n . suppressiota ICAM-l-vastaisel1 a monoklonaalisella vasta- aineella tapahtuu, kun vasta-aine lisätään viljelyn ensim-’· ‘ mäisten 24 tunnin aikana (taulukko 16).Table 15 shows that purified anti-ICAM-1 monoclonal antibodies inhibited MLR in a dose-dependent manner, with significant suppression at 20 ng / ml. Purified mouse IgG had little or no suppressive effect. MLR. suppression with anti-ICAM-1 monoclonal antibody occurs when the antibody is added during the first 24 hours of culture (Table 16).

• i • · 1 • · · • · • · · • · · • t • · o » · · • I · « · · « · · • « « · · • · · « · · e « « « • · • · · · · 99 1 0 7 4 51 TAULUKKO 15 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus yksisuuntaiseen imusolureaktioon . : — ; “ 3 , . . ~ "• i • · 1 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • I • • · · · · 99 1 0 7 4 51 TABLE 15 Effect of Anti-ICAM-1 Antibody on One-Way Lymphoid Reaction. : -; “3,. . ~ "

Stimulaatto- HT-surtyminenStimulatory-HT depression

Vastesolut risolut13 Vasta-ainec (tuiketta/min. ) 445d + 143 + - 148 ± 17 + - - 698+72 + + - 42,626 ± 1,579 + + mlgG (10.0 (iq) 36,882 ± 1,823 (147.) + + mlgG ( 0.4 ^g) 35,500 ± 1,383 (177.) + + mlgG ( 0.02 pg) 42,815 + 1,246 ( 0%) + + R6-5-D6 (10.0 /xg) 8,250 + 520 (81%) + + R6-5-D6 ( 0.4 /xgj 16,142 + 858 (627.) + + R6-5-D6 ( 0.03 μq) 28,844 ± 1,780 (327.) « « • · · • · · • · · • · · aVastesoluja 6,25 x 105 kpl/ml bStimulaattorisoluja 6,25 x 105 kpl/ml, säteilytetty 1000 R:llä cICAM-l-vastainen puhdistettu monoklonaalinen vasta-aine (R6-5- • « « D6) tai puhdistettu hiiri-IgG (mlgG), 1oppupitoisuudet • · : (mikrogrammaa/ml) .Counter-Cell Ris Cells13 Antibody (Scintillation / min) 445d + 143 + - 148 ± 17 + - - 698 + 72 ++ + - 42,626 ± 1.579 + + mlgG (10.0 (iq) 36.882 ± 1.823 (147) + + mlgG ( 0.4 ^ g) 35,500 ± 1.383 (177) + + mlgG (0.02 pg) 42.815 + 1.246 (0%) + + R6-5-D6 (10.0 / xg) 8.250 + 520 (81%) + + R6-5- D6 (0.4 / xgj 16.142 + 858 (627.) + + R6-5-D6 (0.03 μq) 28.844 ± 1.780 (327.) «« • · · • · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · units / ml bStimulator cells 6.25 x 105 units / ml, irradiated with 1000 R purified monoclonal antibody to cICAM-1 (R6-5 - «« D6) or purified mouse IgG (mlgG), final concentrations • · : (micrograms / ml).

^Keskiarvo +/- s.d. 5-6 viljelmästä; luvut sulkeissa .·.·. ilmoittavat MLR:n prosentuaalisen inhibition.^ Mean +/- s.d. 5-6 cultures; figures in parentheses. report the percentage inhibition of MLR.

100 107451 TAULUKKO 16 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen 1isäysajankohta 3 ; .100 107451 TABLE 16 Anti-ICAM-1 Antibody 1 Insertion Time 3; .

H-siirtyminenH-shift

Ra S& Lis'äysc~ (tuiketta/min.)Ra S & Lis'äysc ~ (Twilight / min.)

Kasvualustan tai vasta-aineen lisäysajankohta__ Päivä 0_Päivä 1_Päivä 2 " kasvualusta 205^ ± 14 476 ± 132 247 ± 75 + kasvualusta 189 ± 16 nde nd + " kasvualusta 1,860 ± 615 nd nd + + kasvualusta 41,063 ± 2,940 45,955 ± 2,947 50,943 ± 3,072 + + R6-5-D6 17,781 ± 1,293 38,409 ± 1,681 47,308 ± 2,089 (57%}f (16%) (7%) «1 I < _ ___ 1 < ett· • · * • · · • · :T; aVasteso!uja 6,25 x 10$ kpl/ml bStimulaattorisoluja 6,25 x 10$ kpl/ml, säteilytetty 1000 R:llä :*:*j kasvualustaa tai ICAM-l-vastaista puhdistettua monokl onaal ista • « vasta-ainetta (R6-5-D6) pitoisuutena 10 mikrogrammaa/ml • lisättiin päivästä 0 24 tunnin välein.Medium or Antibody Addition Date__ Day 0_Day 1_Day 2 "Medium 205 ^ ± 14,476 ± 132,247 ± 75 + Medium 189 ± 16 nde nd +" Medium 1,860 ± 615 nd nd + + Medium 41,063 ± 2,940 45.955 ± 2.947 50,943 ± 3.072 + + R6-5-D6 17,781 ± 1,293 38,409 ± 1,681 47,308 ± 2,089 (57%} f (16%) (7%) «1 I <_ ___ 1 <ett · • * * · · · ·: T; aVasteso New 6.25 x 10 $ / ml bStimulator cells 6.25 x 10 $ / ml, irradiated at 1000 R: *: * medium or purified monoclonal antibody to ICAM-1 (R6) -5-D6) at a concentration of 10 micrograms / ml was added from day 0 at 24 hour intervals.

: ^Keskiarvo +/- s.d. 4-6 viljelmästä; • · · ·,,,· end = ei määritetty fProsentuaalinen inhibitio » « * 101 107451: ^ Mean +/- s.d. 4-6 cultures; • · · · ,,, · end = not determined f Percent inhibition »« * 101 107451

Yhteenvetona ICAM-l-vastaisen vasta-aineen kyky inhiboida MLR:ää osoittaa, että ICAM-l-vastaisi11 a monoklonaalisi11 a vasta-aineilla on terapeuttista käyttöä akuutissa siirre-hyljinnässä. ICAM-l-vastaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla on niinikään terapeuttista käyttöä liittyvissä immuuni(järjestelmä)välitteisissä häiriöissä, jotka ovat riippuvaisia LFA-1/ICAM-l-säätöisistä solu-soluvuorovai-kutuksista.In summary, the ability of an anti-ICAM-1 antibody to inhibit MLR indicates that anti-ICAM-1 monoclonal antibodies have therapeutic use in acute graft rejection. Anti-ICAM-1 monoclonal antibodies also have therapeutic use in immune (systemic) mediated disorders that are dependent on LFA-1 / ICAM-1 regulated cell-cell interactions.

Tässä kuvatut kokeet osoittavat, että ICAM-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden lisääminen inhiboi sekaimusolureaktiota (MLR), kun ne lisättiin reaktion ensimmäisten 24 tunnin kuluessa. Lisäksi ICAM-1 säätyy ylöspäin ihmisen ääreisveren monosyyteissä in vitro -viljelyssä.The experiments described herein show that the addition of anti-ICAM-1 monoclonal antibodies inhibits the mixed cell reaction (MLR) when added during the first 24 hours of the reaction. In addition, ICAM-1 is upregulated in human peripheral blood monocytes in vitro culture.

Lisäksi todettiin, että ICAM-1 ei ilmenny lepotilassa olevilla ihmisen ääreisveren imusoluilla tai monosyyteillä. ICAM-1 säätyy ylös yksinään viljellyillä monosyyteillä sekä soluilla, joita viljellään yhdessä ei-sukulaisluovuttajasolujen kanssa, sekaimusolureaktiossa, jolloin mittaukset suoritetaan käyttäen tavanomaisia virtaussytometria-analyyseja. Tätä ICAM-l:n * i ylössäätöä monosyytei 11 ä voidaan käyttää tulehdusindikaatto-rina; erityisesti, jos ICAM-1 ilmentyy tuoreilla monosyyteil lä, jotka ovat peräisin yksilöistä, jotka potevat akuuttia tai kroonista tulehdusta.It was further found that ICAM-1 is not expressed on dormant human peripheral blood lymphocytes or monocytes. ICAM-1 is upregulated in monocytes cultured alone and in cells co-cultured with non-related donor cells in a mixed cell reaction, whereby measurements are performed using conventional flow cytometry assays. This upregulation of ICAM-1 * i by monocytes 11 can be used as an inflammation indicator; especially if ICAM-1 is expressed on fresh monocytes from individuals with acute or chronic inflammation.

• « ♦ 1 1 • · · • · ICAM-l:n spesifisyys aktivoiduille monosyyteil 1 e ja ICAM-l-vastaisen vasta-aineen kyky inhiboida MLR:ää viittaavat siihen, että ICAM-l-vastaisil la monoklonaalisilla vasta-aineilla on « « · • · diagnostisia ja terapeuttisia käyttömahdollisuuksia akuutin * · « siirrehyljinnän ja liittyvien immuuni(järjestelmä)välitteisten : häiriöiden yhteydessä, jotka edellyttävät solu-soluvuorovaiku- tuksia.The specificity of ICAM-1 on activated monocytes 1e and the ability of anti-ICAM-1 antibody to inhibit MLR suggest that anti-ICAM-1 monoclonal antibodies have a < Diagnostic and therapeutic applications in acute * · «transplant rejection and related immune (system) mediated: disorders that require cell-to-cell interactions.

t 102 107451 ESIMERKKI 28 ICAM-l-vastaisten ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden yhteisannon synergiavaikutuksett 102 107451 EXAMPLE 28 Synergistic effects of the combined production of anti-ICAM-1 and anti-LFA-1 antibodies

Kuten esitetty esimerkissä 27, MLR:ää inhiboi ICAM-l-vastainen vasta-aine. MLR:ää voi inhiboida myös LFÄ-l-vastainen vasta-aine. Sen määrittämiseksi, onko ICAM-l-vastaisten ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden yhteisannolla tehostava, eli synergistinen vaikutus, suoritettiin MLR-määritys (kuten kuvattu esimerkissä 27) eri pitoisuuksien näitä kahta vasta-ainetta läsnäollessa.As shown in Example 27, MLR is inhibited by anti-ICAM-1 antibody. MLR may also be inhibited by an anti-LFÄ-1 antibody. To determine whether the co-administration of anti-ICAM-1 and anti-LFA-1 antibodies had a potentiating or synergistic effect, an MLR assay (as described in Example 27) was performed in the presence of different concentrations of these two antibodies.

Tässä MLR-kokeessa ilmeni, että ICAM-1-vastaisen vasta-aineen ja LFA-l-vastaisen vasta-aineen yhdistelmä - pitoisuuksina, joissa kumpikaan vasta-aine yksinään ei erityisesti inhiboi MLR:ää - oli merkittävästi tehokkaampi MLR-vasteen inhiboin-nissa (taulukko 17). Tämä tulos osoittaa, että terapioilla, joissa lisäksi annetaan ICAM-l-vastaista vasta-ainetta (tai niiden fragmentteja) ja LFA-l-vastaista vasta-ainetta (tai niiden fragmentteja), on kapasiteettia tuottaa tehokkaampi , tulehdusvastainen hoito. Tällaista tehostettua terapiaa käyttämällä voidaan antaa alhaisempia vasta-aine-annoksia, kuin mitkä muutoin olisivat terapeuttisesti tehokkaita, millä on merkitystä olosuhteissa, joissa yksittäisten vasta-aineiden • korkeat pitoisuudet indusoivat anti-idiotyyppivasteen.This MLR assay showed that the combination of anti-ICAM-1 antibody and anti-LFA-1 antibody - at concentrations where neither antibody alone specifically inhibits MLR - was significantly more effective in inhibiting the MLR response. (Table 17). This result demonstrates that therapies, in addition to which are administered anti-ICAM-1 antibody (or fragments thereof) and anti-LFA-1 antibody (or fragments thereof), have the capacity to produce a more effective anti-inflammatory treatment. Using such enhanced therapy, lower doses of the antibody may be administered than would otherwise be therapeutically effective, which is relevant in circumstances where high concentrations of individual antibodies induce an anti-idiotype response.

I ( 4 0» • · · • · * · · • » · « · · 0 » o • · · 4 · · • » • · » * · ·I {4 0 »• · · • * * · •» · «· · 0» o • · · 4 · · • »• •» * •.

« 1 I«1 I

• · • · · • 40 • · · 4 444 • · • « « · φ 103 107451 TAULUKKO 17• • • • • 40 • · · 4 444 • · • «« · φ 103 107451 TABLE 17

Vaihtelevien anti-ICAM-1- ja anti-LFA-1- (R3.1-) annoksien vaikutus sekaimusolureaktioonEffect of varying doses of anti-ICAM-1 and anti-LFA-1 (R3.1) on the mixed cell reaction

Inhibitio-%inhibition%

Pitoisuus (tig/ml)Concentration (tig / ml)

Anti-ICAM-1 (R6-5-D6) ' Anti-LFA-1 0 .004 .02 .1 .5 2.5 0.0 0 7 31 54 69 70 0.0008 1 7 28 48 62 71 0.004 0 13 30 50 64 72 * 0.02 29 38 64 75 84 86 0.1 92.5 90 91 92 92 92 0.5 93 90 90 92 93 91 « t 11 ESIMERKKI 29Anti-ICAM-1 (R6-5-D6) 'Anti-LFA-1 0 .004 .02 .1 .5 2.5 0.0 0 7 31 54 69 70 0.0008 1 7 28 48 62 71 0.004 0 13 30 50 64 72 * 0.02 29 38 64 75 84 86 0.1 92.5 90 91 92 92 92 0.5 93 90 90 92 93 91 «t 11 EXAMPLE 29

Optimaalisen alittavien anti-ICAM-l-annoksien ja < < i < .For sub-optimal doses of anti-ICAM-1 and <<i <.

‘ muiden immuunivastetta heikentävien aineiden • < :.v yhdistetyn annon additiiviset vaikutukset MLR:ään • · · • · · • · ·'Additive Effects of MLM on Combined Administration of Other Immune Response Agents • <: .v

Kuten esitetty esimerkissä 28, MLR:ää inhiboivat ICAM-1-vastaisten ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden yhdistelmät. Sen * · määrittämiseksi, olisiko myös anti-ICAM-1 :n ja muiden immuunivastetta heikentävien aineiden [kuten deksametasoni, atsatio- • · · Mί priini, sykiosporiini-A ja steroidit (kuten esimerkiksi • · · ·...· prednisoni jne.)] yhteisannolla tehostuneita vaikutuksia, suoritettiin MLR-määrityksiä käyttäen optimaalista alhaisempina ....: pitoisuuksina (eli pitoisuuksina, jotka ovat alhaisempia kuin 104 107451 se optimaalinen pitoisuus, jona ainetta yksinään annettaisiin kohteelle) R6-5-D6:ta yhdessä muiden immuunivastetta heikentävien aineiden kanssa, jolloin menettelysuoritus oli kuten esimerkissä 27.As shown in Example 28, MLR is inhibited by combinations of anti-ICAM-1 and anti-LFA-1 antibodies. To determine if anti-ICAM-1 and other immunosuppressive agents [such as dexamethasone, azathioprotein, cyclosporin A, and steroids (such as • · · · ... · prednisone, etc.) would also be present. )] with co-administration of potentiated effects, were performed using MLR assays at sub-optimal levels of .... (i.e., concentrations below 104 107451 the optimal concentration at which the agent alone would be administered) to R6-5-D6 in combination with other immunosuppressive agents. with substances whereby the procedure was as in Example 27.

Tulokset osoittavat, että R6-5-D6:n inhiboivat vaikutukset ovat vähintäänkin additiivisia suboptimaalisten annoksien deksame-tasonia (taulukko 18), atsatiopriinia (taulukko 19) ja syklo-sporiini-A:ta (taulukko 20) inhibitiovaikutuksiin. Tämä viittaa siihen, että ICAM-l-vastaisilla vasta-aineilla voi olla vaikutusta pyrittäessä alentamaan tunnettujen immuunivastetta heikentävien aineiden välttämättömiä annoksia, jolloin näiden myrkylliset sivuvaikutukset vähenevät. Käytettäessä ICAM-1-vastaista vasta-ainetta (tai sen fragmenttia) tällaiseen immunivasteheikennykseen pääsemiseksi, on mahdollista yhdistää vasta-aineen (tai sen fragmentin) antaminen joko yhteen ylimääräiseen immuunivastetta heikentävään aineeseen tai useamman kuin yhden immuunivastetta heikentävän aineen yhdistelmään.The results show that the inhibitory effects of R6-5-D6 are at least additive to the inhibitory effects of suboptimal doses of dexamethasone (Table 18), azathioprine (Table 19) and cyclosporin A (Table 20). This suggests that anti-ICAM-1 antibodies may have an effect in lowering the necessary doses of known immunosuppressive agents, thereby reducing their toxic side effects. Using an anti-ICAM-1 antibody (or fragment thereof) to achieve such an immune response attenuation, it is possible to combine administration of the antibody (or fragment thereof) with either one additional immunosuppressant or a combination of more than one immunosuppressant.

• I• I

• » i i f 4 »• »i i f 4»

• * * 4 I• * * 4 I

• « • · ♦ • ♦ ♦ • « • ♦ ♦ • · · • · · ♦ · • « ♦ • « · • « ·»» • I · • · * • · • · · • ♦ · • · · · • · · • · • · • · * • o * « « « • · 105 107451 TAULUKKO 18• «• · ♦ • ♦ ♦ •« • ♦ ♦ • · • I I I I I I I I I * I I I I I I I • · · • • • • • * * o * «« «• · 105 107451 TABLE 18

Anti-ICAM-l:n ja deksametasonin vaikutus humaani-MLR:ään 3 . .Effect of anti-ICAM-1 and dexamethasone on human MLR 3. .

Inhibiittori H-surto , ,/ η\ (tuiketta/ Inhibitio-%Inhibitor H-surcharge,, / η \ (Twig / Inhibition%

Ryhmä (ng(/ml) min.)Group (ng (/ ml) min)

Kasvualusta _ 255Medium _ 255

Stimulaattorit (S) _ jqjStimulators (S) _ jqj

Vastetuottajat (R) a ari R x S _ 341199 R x S R6-5-D5 (8) 26,224 23 R x S Dex (50) 14,158 59 R x S R6-5-D6 (8) + Dex (50) 7,759 77 . . .Responsible Producers (Rs) Ari R x S _ 341199 R x S R6-5-D5 (8) 26,224 23 R x S Dex (50) 14,158 59 R x S R6-5-D6 (8) + Dex (50) 7,759 77. . .

Dex: deksametasoni I | • · · • · • · · • · · • « · • · • · · • · · • · • · · • · « • · · * • · • · · • « « « · · · • · · • · • · • « « · 1 1 » 106 107451 TAULUKKO 19Dex: Dexamethasone I | • • • • • • • • • • • • • • • • ••••••••••••••••••••••••••••• · • · • «« · 1 1 »106 107451 TABLE 19

Anti-ICAM-1:n ja atsatiopriinin vaikutus humaani-MLR:ään __ _ —Effect of anti-ICAM-1 and azathioprine on human MLR __ _ -

Inhibiittori H-surto ·......Inhibitor H-surto · ......

Ryhmä , , (tuiketta/ Inhibitio -s _(ng(ml) min.)Group,, (Scintillation / Inhibition -s _ (ng (ml) min.)

Kasvulusta . 78Growth. 78

Stimulattorit iS) - 174Stimulators iS) - 174

Vastettuottajat (R) " R x S - ^’5/0 R x S R6-5-D6 (8) 44,374 11 R x S Atsatiopriini (1) 42,710 14 R x S R6-5-D6 (8) +' Atsatiopriini 34,246 31 ,v _(1) __ • 1 e • · · • · • · · • · · • · · • 0 • · · • 1 · • · ··» • 1 · • e « » • · • · · t · I • · · · • 1 · • e • 9 • 1 · « · 107 107451 TAULUKKO 20Responsible Producers (R) "R x S - ^ '5/0 R x S R6-5-D6 (8) 44,374 11 R x S Azathioprine (1) 42,710 14 R x S R6-5-D6 (8) +' Azathioprine 34,246 31, v _ (1) __ • 1 e • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · T · I • · · · 1 · • e • 9 • 1 · «· 107 107451 TABLE 20

Anti-ICAM-1:n ja syklosporiini-A:n vaikutus humaani-MLR:ään 3 H-surtoEffect of anti-ICAM-1 and cyclosporin A on human MLR 3 H-surge

Ryhmä Inhibiittori (tuiketta/ Inhibitio-% ._(ng/rol) _min )___Group Inhibitor (Twig / Inhibition% ._ (ng / rol) _min) ___

KasvualustaBreeding ground

Stimulattorit (S) _ 206Stimulators (S) _ 206

Vastetuottajat (R) _ g07 R x S - 31,640 R x S R6-5-D6 (8) 26,282 17 R x S CyA (10) 23,617 25 R x S R6-5-D6 (8) + CyA (10) 19,204 39Responsive Producers (R) _ g07 R x S - 31,640 R x S R6-5-D6 (8) 26,282 17 R x S CyA (10) 23,617 25 R x S R6-5-D6 (8) + CyA (10) 19,204 39

CyA: syklosporiini-ACyA: cyclosporin A

ESIMERKKI 30 t 1 ti t ; ‘ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus saman lajin toisesta i t yksilöstä siirrettyjen elimien hyljinnän tukahduttamisessa « « < 1 **'ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutuksen osoittamiseksi • < V.* siirretyn allogeenisen elimen hyljinnän tukahduttamisessa :J : Cynomolgus-apinoihin siirrettiin munuaisia toisesta saman lajin yksilöstä menetelmän mukaan, jota ovat kuvanneet Cosimi et ai. (Transplant.Proc. 13 (1981) 499 - 503) sillä modifikaatiolla, • · että nukutusaineina käytettiin valiumia ja ketamiinia.EXAMPLE 30 t 1 ti t; Effect of anti-ICAM-1 antibody in suppressing organ rejection from another IT specimen of the same species «« <1 ** »To demonstrate effect of anti-ICAM-1 antibody • <V. * in suppressing transplanted allogeneic organ rejection: J: Cynomolgus kidneys were transplanted from another individual of the same species according to the method described by Cosimi et al. (Transplant.Proc. 13: 499-503 (1981)) with the modification that valium and ketamine were used as anesthetics.

• · · • · : Täten munuaisensiirto suoritettiin oleellisesti seuraavasti.• · · • ·: Thus, kidney transplantation was performed essentially as follows.

···· · ·

Heterotrooppisia munuaissiirtoja suoritettiin 3 - 5 kg:n « .V. painoisille Cynomolgus-apinoille, oleellisesti kuten kuvannut [I; Marquet (Marquet et ai.. Medical Primatoloov. osa II, Basel, • · 10* 107451Heterotrophic kidney transplants were performed at 3-5 kg. for weighty Cynomolgus monkeys, essentially as described in [I; Marquet (Marquet et al., Medical Primatoloov. Part II, Basel, • 10 * 107451

Karger, 1972, s. 125), kun apinat oli ensin nukutettu valiumilla ja ketamiinilla. Luovuttajan munuaissuoniin rakennettiin yhdyshaarat, joissa toisen rakenteen pää oli yhdistetty toisen sivuun, aortta- tai onttolaskimopalaseen, käyttäen 7-0 Prolene -ommelta. Luovuttajan virtsanjohdin spatuloitiin ja istutettiin virtsarakkoon ekstravesikaalisen lähestymistavan mukaan (Taguchi, Y., et ai.. Dausset et ai. (toim.): Advances in Transplantation. Baltimore, Williams & Wilkins, 1968, s. 393) Munuaisfunktiota arvioitiin viikoittain tai kahdesti viikossa määrittämällä seerumikreatiniini. Lisäksi otettiin tajaan siirrenäytteitä kudosopillista tarkastelua varten ja kaikille kokeessa kuolleille vastaanottajille suoritettiin täydelliset ruumiinavaukset. Useimmissa vastaanottajissa suoritettiin molemminpuolinen munuaispoisto siirtoajankohtana ja myöhemmän virtsamyrkytyksestä johtuvan kuoleman ajankohta katsottiin siirreselviämisen 1oppuajankohdaksi. Joissain vastaanottajissa siirtoajankohtena suoritettiin yksipuolinen natiivi munuaisen poisto ia vastapuolinen virtsarakkosidonta. Kun tapahtui siirteen hylkimistä, autologisen virtsanjohtimen ommel poistettiin, jolloin . seurauksena oli normaalin munuaisfunktion palautuminen ja ·’ ' mahdollisuus jatkaa vastaanottaja-eläimen immunologista tarkkailua.125, when monkeys were first anesthetized with valium and ketamine. The donor kidney veins were made with junctions where the end of one structure was connected to the other side, aortic or hollow vein, using a 7-0 Prolene stitch. The donor ureter was spatulated and implanted in the bladder according to an extravesical approach (Taguchi, Y., et al., Dausset et al. (Ed.): Advances in Transplantation. Baltimore, Williams & Wilkins, 1968, p. 393). Renal function was evaluated weekly or biweekly. by determining serum creatinine. In addition, graft specimens were collected for histological examination and complete autopsies were performed on all deceased recipients. Most recipients underwent bilateral renal transplantation at the time of transplantation and the time of subsequent death from urinary poisoning was considered as the end point of transplant survival. Some recipients underwent unilateral native kidney removal and counterpart bladder binding at the time of transplantation. When graft rejection occurred, the autologous ureter was sutured to remove. this resulted in the restoration of normal renal function and the ability to continue immunological monitoring of the recipient animal.

Monoklonaalista vasta-ainetta R6-5-D6 annettiin päivittäin 12 « « päivän ajan alkaen kaksi päivää ennen siirtoa annoksena 1-2 rog/kg/päivä. Seerumin kreatiniinitasot määritettiin ajoittain hyljinnän tarkkailemiseksi. ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus samasta lajista saadun munuaisen hyljintään • · · immuunijärjestelmän toimesta on esitetty taulukossa 21.Monoclonal antibody R6-5-D6 was administered daily for 12 days starting two days prior to transplantation at a dose of 1-2 Rog / kg / day. Serum creatinine levels were periodically determined to monitor rejection. The effect of the anti-ICAM-1 antibody on renal rejection of the same species by the immune system is shown in Table 21.

• i t • · < · » • · · • · · * • · · • · • * · « • · ♦ · · « « · ♦ « « · 107451 109 TAULUKKO 21 R6-5-D6:n aktiivisuus saman lajin yksilöstä siirretyn munuaisen selviytymiseen suojatoimenpiteitä käytettäessä Cynomolgus-apinassa» „ _ , .. . Selviämispäivä• it · <»• 107 107 107 107 107 107 45 107 45 107451 109 TABLE 21 Activity of R6-5-D6 in an individual of the same species transplanted kidney survival using protective measures in Cynomolgus monkey »„ _, ... Selviämispäivä

Apina R6-5-D6-annos (mg/kg) käsittelyn jälkeen ·. Verrokki 1 8Monkey R6-5-D6 dose (mg / kg) after treatment. Reference 1 8

Verrokki 2 _Control 2 _

Verrokki 3 . ]1Control 3. ] 1

Verrokki 4 . 10Control 4. 10

Verrokki 5 9Control 5 9

Verrokki 6 10 M15 1.0 20 M19 1.0 7b M17 1.0 30 M2 5 1.5 29 M23 1.0 11° M27 2.0 34 M7 0.5 22Control 6 10 M15 1.0 20 M19 1.0 7b M17 1.0 30 M2 5 1.5 29 M23 1.0 11 ° M27 2.0 34 M7 0.5 22

Mil 0.5 26 M10 0.5 22 M8 0.5 26d I i II l . „ I I !Mil 0.5 26 M10 0.5 22 M8 0.5 26d I i II l. "I I!

• I• I

« 4 ( »Apinoille annettiin R6-5-D6:ta 12 perättäisenä päivänä alkaen '·"· 2 päivää ennen siirtoa.«4 (» Monkeys were given R6-5-D6 for 12 consecutive days starting on '·' · 2 days before transfer.

• I 4 • · · • · bKuolinsyy tuntematon; todisteita piilevästä malariasta löytyi.• I 4 • · · • · bDeath cause unknown; evidence of latent malaria was found.

.·.·. cKuolinsyy munuaiskuolio.. ·. ·. cDeath cause Kidney necrosis.

• · · • ·• · · • ·

Ml • · « • · · dEläin oli edelleen elossa 15. elokuuta 1988.Ml The animal was still alive on August 15, 1988.

• t• t

I I II I I

« · c III · • · ·«· C III · • · ·

Tulokset osoittavat, että R6-5-D6 pidensi tehokkaasti apinoiden elinikää, joihin oli siirretty munuainen saman lajin toisesta • * · yksilöstä.The results show that R6-5-D6 efficiently prolonged the life span of monkeys transplanted with another kidney of the same species.

uo 107451 ESIMERKKI 31 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus siirrettyjen elimien akuutin hyljinnän tukahduttamisessaEXAMPLE 31 Effect of anti-ICAM-1 antibody on suppressing acute rejection of transplanted organs

Sen osoittamiseksi, että ICAM-l-vastainen vasta-aine on tehokas siirrehyljinnän akuutissa mallissa, R6-5-D6:ta testattiin myös terapeuttisessa tai akuutissa munuaisenhyljintämallissa. Tässä mallissa apinan munuaisia siirrettiin (käyttäen esimerkissä 30 kuvattua menettelyjärjestelyä), ja niille annettiin toimenpide-ajankohdan molemmin puolin 15 mg/kg syklosporiini-A:ta (CyA) i.m. kunnes päästiin stabiiliin munuaisfunktioon. Sitten CyA-annosta alennettiin kahdesti viikossa 2,5 mg:n/kg välein, kunnes hyjintää ilmeni, minkä osoitti veren kreatiniinitasojen nousu. Tällöin R6-5-D6:ta annettiin 10 päivän ajan ja eloon-jäänti-aikaa tarkkailtiin. Tärkeätä on huomata, että tässä menettelyjärjestelyssä CyA-annos pysyy suboptimaalisena, koska se ei muutu sen jälkeen, kun akuutti hyijintävaihe on käynnistynyt. Tässä mallissa kudosopilliset verrokit (N=5), joilla ei käytetä vasta-ainesuojaa, selviävät 5-14 päivän ajan hyijintävaiheen käynnistymisestä. Tähän mennessä kuusi eläintä . on testattu käyttäen R6-5-D6:ta tämä menettelyjärjestelyn • t mukaan (taulukko 22). Kaksi näistä eläimistä on edelleen elossa < I ( '·' ' (M12, 31 päivää; ja M5, 47 päivää laskettuna R6-5-D6:nTo demonstrate that the anti-ICAM-1 antibody is effective in the acute transplant rejection model, R6-5-D6 was also tested in a therapeutic or acute renal rejection model. In this model, monkey kidneys were transplanted (using the protocol described in Example 30) and given 15 mg / kg of cyclosporin A (CyA) i.m. on both sides of the procedure. until stable renal function was achieved. The CyA dose was then reduced twice weekly at 2.5 mg / kg until clotting occurred, as evidenced by an increase in blood creatinine levels. At this time, R6-5-D6 was administered for 10 days and survival time was monitored. It is important to note that in this protocol, the dose of CyA remains suboptimal because it does not change after the acute sweating phase has begun. In this model, tissue-matched controls (N = 5) without antibody protection survive for 5-14 days after initiation of the sweating phase. So far, six animals. has been tested using R6-5-D6 according to this protocol (t) (Table 22). Two of these animals are still alive <I ('·' '(M12, 31 days; and M5, 47 days calculated at R6-5-D6).

I II I

annosta). Kaksi eläintä eli 38 ja vastaavasti 55 päivää R6-5- *:“i D6-terapian käynnistämisestä ja kaksi eläimistä kuoli muista syistä kuin akuutin hyljinnän seurauksena (yksi eläin kuoli ;1Γ: CyA-myrkkyvaikutuksiin ja toinen kuoli, kun sille annettiin • nukutuksessa R6-5-D6:ta). Tämä malli muistuttaa (edellisiä) likeisemmin kliinistä tilannetta, jossa R6-5-D6:ta alunperin • · ♦ • · ,1j\ annettaisiin.doses). Two animals, 38 and 55 days, respectively, R6-5- *: “i after initiation of D6 therapy and two animals died due to causes other than acute rejection (one animal died; 1Γ: CyA toxic and the other died when given R6 under anesthesia). -5-D6 s). This model more closely resembles (previous) the clinical situation in which R6-5-D6 was originally administered.

• · t ♦ • · • ♦ ♦ • · · • M ·• · t ♦ • · • ♦ ♦ • · · • M ·

• M• M

• 1 • 1 « · · • · « I I • · · • · ♦ t » > · • 9 in 107451 TAULUKKO 22 R6-5-D6-aktiivisuus saman lajin toisesta yksilöstä siirretyn munuaisen selviämisen pidentämisessä terapeuttisissa menettelyjärjestelyissä Cynomolgus-apinassa* b Selviämispäivä9 in 107451 TABLE 22 Activity of R6-5-D6 in Prolongation of Transplantation of Kidney Transplant from Another Specimen of the Same Species in Cynomolgus Monkey * b Survival Date

Apina Hyijintävaihe päivänä käsittelyn jälkeen 14-98 5-14 M24 41 38 M21 34 4d M3 41 55 M9 12 lle M12 37 >31 f M5 26 >47f • · «Apinoille annettiin 1-2 mg/kg R6-5-D6:ta 10 perättäisenä päivänä hyljinnän alkamisesta laskettuna. bPäivä, jona kreatiniinitasot kohosivat seurauksena CyÄ-annostuksen alentamisesta ja jona R6-5-D6-hoito aloitettiin.Monkey Sweating Step On Day After Treatment 14-98 5-14 M24 41 38 M21 34 4d M3 41 55 M9 12 M12 37> 31 f M5 26> 47f • · «Monkeys were given 1-2 mg / kg R6-5-D6 10 consecutive days from the start of rejection. bThe day when the creatinine levels increased as a result of the lowering of the dose of CyÄ and the start of R6-5-D6 treatment.

• · · «Viisi eläintä testattiin käyttäen edellä kuvattua • · · terapeuttista menettelyjärjestelyä lukuunottamatta, ettei käytetty suojaterapiaa. "Selviämispäiviä käsittelyn jälkeen” on • · » · · *.*.* seiviämispäivien lukumäärä laskettuna kreatiniinitasojen • · · ·.· * kohoamisen alkamisesta.• · · «Five animals were tested using the above procedure, except that no protective therapy was used. "Survival Days After Treatment" is the number of days to elapse when creatinine levels start rising.

: dEläin kuoli nukutuksessa; kreatiniini tasot olivat alhaiset.: dThe animal died of anesthesia; creatinine levels were low.

• · · • · · · .···. «Eläin kuoli CyA-myrkkyvaikutuksiin; kreatiniini tasot olivat • · *·* alhaiset.• · · • · · ·. ···. «Animal Dies To CyA Toxic; creatinine levels were • · * · * low.

» · *.*.* fEläin oli edelleen elossa 15. elokuuta 1988.»· *. *. * FThe animal was still alive on August 15, 1988.

112 107451 ESIMERKKI 32112 107451 EXAMPLE 32

Typistettyjen ICAM-1-johdannaisten geneettinen rakentaminen ja ilmennysGenetic construction and expression of truncated ICAM-1 derivatives

Luontaisessa tilassaan ICAM-1 on solumembraaniin sitoutunut proteiini, joka sisältää viidestä immunoglobuliinin kaltaisesta alueesta koostuvan solunulkoisen alueen, transmembraanialueen ja sytoplasma-alueen. Halusimme rakentaa ICAM-1:n funktionaalisia johdannaisia, joista puuttuu transmembraanialue ja/tai sytoplasma-alue, liukoisen, erittyvän ICAM-l-muodon saamiseksi. Nämä funktionaaliset johdannaiset rakennettiin ICAM-l-geenin oligonukleotidi-ohjatulla mutatoinilla, minkä jälkeen mutant-tigeeni ilmennettiin transfektoimalla se apinasoluihin.In its natural state, ICAM-1 is a cell membrane-bound protein that contains an extracellular region, a transmembrane region, and a cytoplasmic region consisting of five immunoglobulin-like regions. We wanted to construct functional derivatives of ICAM-1 lacking the transmembrane region and / or the cytoplasmic region to obtain a soluble, secreted form of ICAM-1. These functional derivatives were constructed by oligonucleotide-directed mutation of the ICAM-1 gene, followed by expression of the Mutant gene by transfection into monkey cells.

ICAM-l-geenimutantteja, jotka käsittivät aminohapposubsti-tuutioita ja/tai typistettyjä johdannaisia, muodostettiin Kunkelin, T., (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82 (1985) 488 - 492) menetelmän mukaan. ICAM-l-cDNA valmistettiin kuten edellä kuvattu ja sitä pilkottiin restriktioendonukleaasei1 la Sali ja Kpnl, minkä jälkeen saatu 1,8 ep:n DNA-fragmentti alakloonat-tiin plasmidivektoriin CDM8 (Seed, B., et ai. Proc.Natl.Acad. Sei. USA 84 (1987) 3365 - 3369). Tällä pCD1.8C:ksi nimetyllä Y rakenteella transformoitiin sitten E. coli dut-,unq--kanta.ICAM-1 gene mutants comprising amino acid substitutions and / or truncated derivatives were generated according to the method of Kunkel, T., (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82: 488-492 (1985)). The ICAM-1 cDNA was prepared as described above and digested with restriction endonucleases SalI and KpnI, followed by the substitution of the resulting 1.8 bp DNA fragment into the plasmid vector CDM8 (Seed, B., et al. Proc.Natl.Acad. Sci. USA 84: 3365-3369 (1987). This Y construct, designated pCD1.8C, was then transformed with an E. coli dut, unq strain.

'' Transformanteista saatiin talteen yksisäikeinen urasiilipi- toinen templaatti käyttämällä avustajafagi R408 - (StratageneR) • · tartutusta. Sitten muodostettiin mutantti-ICAM-l-cDNA-säikeitä « · · : : : alustamalla toisen säikeen synteesi oligonukleotidilla, joka sisälsi ei-yhteensopivia emäspareja, ja transformoimalla sitten .V. unq+-isäntä (MC1061/P3) saadulla heterodupleksilla. Mutantit • ® eristettiin seulomalla juuri muodostettujen, mutanttioligonuk- » · « leotidin mukanaan tuomien endonukleaasirestriktiokeskuksien « · • · · : suhteen. Mutantti-ICAM-l-proteiini ilmennettiin transfektoi- maila Cos-7-soluja mutantti-DNA: 1 la eukaryoottisessa ilmennys-vektorissa CDM8 käyttäen DEAE-dekstraanivakiomenettelyitä * » (Selden, R.F., et ai. , Current Protocols in Molecular Biology • · 113 107451 (Ausubel, F.M., et ai.. toim.), ss. 9.2.1.-9.2.6. (1987).'' Transformants were recovered with a single-stranded uracil-containing template using infection with helper R408 - (Stratagene®). Mutant ICAM-1 cDNA strands were then generated by initializing the second strand synthesis with an oligonucleotide containing incompatible base pairs and then transforming .V. unq + host (MC1061 / P3) with the resulting heteroduplex. Mutants • ® were isolated by screening for newly created endonuclease restriction sites, introduced by the mutant oligonucleotide. Mutant ICAM-1 protein was expressed by transfecting Cos-7 cells with mutant DNA in eukaryotic expression vector CDM8 using DEAE-dextran constant procedures * (Selden, RF, et al., Current Protocols in Molecular Biology. 107451 (Ausubel, FM, et al., Eds.), Pp. 9.2.1-9.2.6 (1987).

Valmistettiin typistetty ICAM-l:n funktionaalinen johdannainen, josta puuttuivat transmembraani- ja sytoplasma-alueet, mutta joka sisälsi kaikki viisi immunoglobuliinin kaltaista aluetta käsittävän solunulkoisen alueen. 30 ep:n mutanttioligonukleo-tidia (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) käyttäen muutettiin aminohappojen tyrosiini (Y) ja glutamiinihappo (E) kodonit asemissa 452 ja vastaavasti 453 fenyylialaniiniksi (F) ja translaation lopetuskodoniksi (TAG). Mutantti eristettiin yksittäisen Xbal-restriktiokeskuksensa nojalla ja nimettiin ,,Y452E/F/TAG".A truncated functional derivative of ICAM-1, lacking transmembrane and cytoplasmic regions but containing all five extracellular regions of immunoglobulin-like regions, was prepared. Using a 30 bp mutant oligonucleotide (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC), the codons for the tyrosine (Y) and glutamic acid (E) amino acids at positions 452 and 453 respectively were changed to phenylalanine (F) and TAG (TAG). The mutant was isolated by its single Xba I restriction site and designated "Y452E / F / TAG".

Mutanttiproteiinin ilmentämiseksi COS-soluja transfektoitiin kolmella mutanttialakloonilla ("2, #7 ja #8). Kolmen päivän kuluttua transfektoinnista näillä kolmella mutanttialakloonilla viljelmäsupernatantteja ja solulysaattia analysoitiin immuuni- saostamalla ICAM-l-vastaisella monoklonaalisella vasta- aineella RR1/1 ja SDS-PAGE:1 la. ICAM-1 saostettiin mutantti- alaklooneilla #2 ja #8 transfektoitujen solujen viljelmäsuper- natanteista, mutta ei näiden solujen pesuainelysaateista.To express the mutant protein, COS cells were transfected with three mutant clones ("2, # 7, and # 8). 1a. ICAM-1 was precipitated from culture supernatants of cells transfected with mutant subclones # 2 and # 8, but not from the detergents of these cells.

Vi 1 jelmäsupernatantista todetun ICÄM-l:n molekyylipaino oli noin 6 kd:tä alhaisempi kuin ICAM-1:n membraanimuodon, mikä sopii mutantti-DNA:1 le ennakoituun kokoon. Täten tämä ICÄM-l:n ‘‘ funktionaalinen johdannainen erittyy liukoisena proteiinina.The molecular weight of IC1M-1 detected in the Vi1 culture supernatant was about 6 kd lower than the membrane form of ICAM-1, which is consistent with the predicted size of the mutant DNA. Thus, this functional derivative of ICÄM-1 is secreted as a soluble protein.

• ·• ·

Sitä vastoin ICAM-1 ei immuuni saostunut natiivilla ICAM-1: llä -/· : transf ektoitujen solujen verrokkivil jelmäsupernatanteista, mikä osoittaa, että ICAM-1:n membraanimuoto ei erity Cos-soluista.In contrast, ICAM-1 was not immunoprecipitated from control culture supernatants of native ICAM-1-transfected cells, indicating that the membrane form of ICAM-1 is not secreted from Cos cells.

.·.·. Lisäksi ICAM-1 :tä ei immuunisaostunut negatiivisena verrokkina • · toimineiden valetransfektoitujen solujen sen paremmin viljel- • · « mäsupernatanteista kuin solulysaateistakaan.. ·. ·. In addition, ICAM-1 was not immunoprecipitated either from cultured supernatants or from cell lysates of fake transfected cells that served as negative controls.

• · · • · · • « · · • · · ·...’ Transf ektoitujen solujen erittämä typistetty ICAM-1 puhdistet- tiin immunoaf finiteettikromatograf isesti ICAM-1: Ile spesifi-....: sellä vasta-aineella (R6-5-D6), minkä jälkeen sen funktionaa- 114 107451 lista aktiivisuutta testattiin solusitoutumismäärityksellä. Valmisteita, jotka sisälsivät natiivia ICAM-l:tä tai typistettyä, erittyvää muotoa, puhdistettiin pesuaineoktyyligluko-sidin läsnäollessa, minkä jälkeen niitä laimennettiin loppu-pitoisuuteen 0,25 % oktyyliglukosidia (joka pitoisuus alittaa pesuaineen kriittisen misellipitoisuuden). Näiden ICAM-1-valmisteiden annettiin sitoutua muovisten, 96 kuopan kuoppa-levyjen (Nunc) kuoppapintoihin kiinteään faasiin sidotun ICAM-l:n saamiseksi. Ei-sitoutunut materiaali pestiin pois, minkä jälkeen todettiin, että noin 75 - 80 % ja vastaavasti 83 - 88 % SKW-3-soluista, jotka käsittivät solupinnoillaan LFA-l:n, sitoutui spesifisesti ICAM-l:n natiiviin ja typistettyyn muotoon. Nämä tulokset osoittavat, että ICAM-l:n erittyvällä, typistetyllä ja liukoisella funktionaalisella johdannaisella oli tallella sekä immunologinen reaktiivisuus että kyky välittää ICAM-l-riippuvaista kiinnittymistä, jotka ominaisuudet ovat karakteristisia natiiville ICÄM-1:lie.The truncated ICAM-1 secreted by the transfected cells was purified by immunoaffinity chromatography with an antibody specific for ICAM-1 (R6). -5-D6), after which its functional activity was tested in a cell binding assay. Formulations containing native ICAM-1 or truncated excreted form were purified in the presence of detergent octyl glucoside, then diluted to a final concentration of 0.25% octyl glucoside (which is below the critical micelle concentration of detergent). These ICAM-1 preparations were allowed to bind to the well surfaces of plastic 96-well well plates (Nunc) to obtain ICAM-1 bound to the solid phase. The non-bound material was washed away, after which it was found that about 75-80% and 83-88%, respectively, of SKW-3 cells comprising LFA-1 on their cell surfaces bound specifically to the native and truncated form of ICAM-1. These results demonstrate that the secreted, truncated, and soluble functional derivative of ICAM-1 retained both immunological reactivity and the ability to mediate ICAM-1-dependent attachment, characteristics of which are native to ICAM-1.

Funktionaalinen ICAM-1-johdannainen, josta puuttuu vain sytoplasma-alue, valmistettiin samankaltaisilla menetelmillä. Aminohapon 476 (Y) vaihtamiseksi TAG-translaatiolopetuskodo-*,,, niksi käytettiin 25 ep:n oligonukleotidia (TC AGC ACG TAC CTCA functional ICAM-1 derivative lacking only the cytoplasmic region was prepared by similar methods. A 25 bp oligonucleotide (TC AGC ACG TAC CTC) was used to replace amino acid 476 (Y) with the TAG translation stop codon.

TAG AAC CGC CA). Mutantti nimettiin "Y476/TAG". Immuunisaosta-maila ja suorittamalla SDS-PAGE Cos-soluilla, jotka oli trans-fektoitu mutantilla, todettiin ICAM-1:n membraaniin sitoutunut • * muoto, jonka molekyylipaino oli noin 3 kd:tä alhaisempi kuin natiivin ICAM-1 :n. Mutantilla transfektoitujen Cos-solujen epäsuoralla immunofluresenssilla todettiin samankaltainen täplikäs värjääntymiskuvio kuin LPSillä stimuloiduilla humaani- • m endoteelisoluilla ilmennetyn natiivin ICAM-l:n. Lopuksi mu- • · · tantti-DNA:1la transfektoidut solut sitoutuivat spesifisesti • · · : puhdistettuun LFA-l:een muovipinnoilla samaan tapaan kuin « · · ·...· natiivilla ICAM-l-DNA: 1 la transf ektoidut Cos-solut (taulukko 23).TAG AAC CGC CA). The mutant was named "Y476 / TAG". Immunoprecipitation clubs and SDS-PAGE on Cos cells transfected with the mutant showed a membrane-bound? * Form of ICAM-1 with a molecular weight of about 3 kd lower than that of native ICAM-1. Indirect immunofluorescence of mutant transfected Cos cells showed a similar spotted staining pattern to native ICAM-1 expressed on LPS-stimulated human endothelial cells. Finally, cells transfected with mutant DNA · · · specifically bound to purified LFA-1 on plastic surfaces in the same way as Cos · transfected with native ICAM-1 DNA. cells (Table 23).

* · « 115 107451 TAULUKKO 23 ICAM-l:n tai funktionaalisen ICAM-1-johdannaisen ilmentävien solujen kyky sitoutua LFA-l:een LFA-l:een sitoutuvien, ICAM-1:n ilmentävien solujen %-osuus, kun läsnä on:_ TRANSFEKTOINTI Ei vasta-ainetta RR1/1* · «115 107451 TABLE 23 Ability of ICAM-1 or ICAM-1 Derivative Expressing Cells to Bind to LFA-1 The percentage of ICAM-1 expressing cells that bind to LFA-1 in the presence of: _ TRANSFECTING No antibody RR1 / 1

Vale- 0 0Invalid 0 0

Natiivi ICAM-1 20 0 Y47 6/TAG 20 0 ESIMERKKI 33 ICAM-1:n funktionaalisten alueiden kartoitus ICAM-1:tä tutkittaessa ilmeni, että molekyyli käsittää 7 aluetta. Näistä alueista viisi on solunulkoista (jolloin lähinnä solupintaa on alue 1 ja kauimpana solupinnasta on alue 1), yksi alue on transmembraanialue ja edelleen yksi alue on sytoplasma-alue (eli on solun sisällä). Sen määrittämiseksi, ' - mitkä alueet myötävaikuttavat ICAM-1:n kykyyn sitoutua LFA- l:een, voidaan käyttää epitooppikartoitustutkimuksia.Native ICAM-1 20 0 Y47 6 / TAG 20 0 EXAMPLE 33 Mapping of Functional Regions of ICAM-1 Examination of ICAM-1 revealed that the molecule comprises 7 regions. Five of these regions are extracellular (with region 1 closest to the cell surface and region 1 farthest from the cell surface), one region is the transmembrane region, and another region is the cytoplasmic region (i.e., within the cell). To determine which regions contribute to the ability of ICAM-1 to bind to LFA-1, epitope mapping studies may be used.

• · ϊίί Tällaisten kokeiden suorittamiseksi valmistetaan erilaisia • · deleetiomutantteja, joiden kyky sitoutua LFA-l:een karakte-risoidaan. Vaihtoehtoisesti tutkimukset voidaan suorittaa käyttäen ICAM-vastaista vasta-ainetta, jonka tiedetään » » häiritsevän ICÄM-l:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Esimerkkejä • · · tällaisista sopivista vasta-aineista ovat RR1/1 (Rothlein, R., • · : et ai. . J. Immunol. 137 (1986) 1270 - 1274); R6.5 (Springer, • · · T.A., et ai. , US-hakemusjulkaisu sarjan:o 07/250,446), LB-2 (Clark, E.A., et ai. . Leukocyte Typing I. A. Bernard, et ai. . toim. , Springer-Verlag, 1984, ss. 339 - 346) tai CL203 116 107451 (Staunton, D.E., et ai., Cell 56 (1989) 849 - 853).To carry out such experiments, various deletion mutants are prepared which are characterized by their ability to bind to LFA-1. Alternatively, assays may be performed using an anti-ICAM antibody known to interfere with the ability of ICÄM-1 to bind to LFA-1. Examples of such suitable antibodies include RR1 / 1 (Rothlein, R., et al., J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)); R6.5 (Springer, · · · TA, et al., U.S. Patent Application Serial No. 07 / 250,446), LB-2 (Clark, EA, et al., Leukocyte Typing IA Bernard, et al., Eds. Springer-Verlag, 1984, pp. 339-346) or CL203 116 107451 (Staunton, DE, et al., Cell 56: 849-853 (1989)).

ICAM-l-deleetiomutantteja voidaan muodostaa millä tahansa lukuisista eri tavoista. Edullisesti tällaisia mutantteja muodostetaan kuitenkain paikkaohjautuvalla mutatoinnilla tai muutoin yhdistelmägeeniteknisesti (kuten rakentamalla ICAM-1:n ilmentäviä geenisekvenssejä, joista tiettyjä proteiinialueita koodattavat sekvenssit on eliminoitu. Menettelyt, jotka soveltuvat tällaisten mutanttien tuottamiseen, ovat alalla hyvin tunnettuja. Tällaisia menettelyitä käyttäen valmistettiin kolme ICAM-l-deleetiomutanttia. Ensimmäisestä mutantista puuttuvat aminohappojäännökset F185 - P284 (eli alue 3 on del etoitu). Toisesta mutantista puuttuvat aminohappojäännökset P284 - R451 (eli alueiden 4 ja 5 deleetio). Kolmannesta mutantista puuttuvat Y476:n jälkeiset aminohappojäännökset (eli sytoplasma-alueen deleetio). Näiden tutkimusten tuloksista ilmenee, että alueet 1, 2 ja 3 liittyvät pääasiassa ICAM-l:n ja ICAM-l-vastaisen vasta-aineen tai LFÄ-l:n välisiin vuorovaikutuksiin.The ICAM-1 deletion mutants can be generated in any number of different ways. Preferably, however, such mutants are generated by site-directed mutation or otherwise by recombinant gene engineering (such as constructing ICAM-1-expressing gene sequences from which sequences encoding certain protein regions have been eliminated. Procedures suitable for producing such mutants are well known in the art. The first mutant lacks the amino acid residues F185 - P284 (i.e., deletion of region 3) The second mutant lacks the amino acid residues P284 - R451 (i.e. deletion of regions 4 and 5). The results of these studies indicate that Zones 1, 2 and 3 are mainly involved in interactions between ICAM-1 and anti-ICAM-1 antibody or LFÄ-1.

ESIMERKKI 34 ICAM-1:ssä suoritettujen mutatointien vaikutus < < < LFA-l-si toutumiseenEXAMPLE 34 Effect of Mutations in ICAM-1 on <<<LFA-1-si morbidity

« I«I

ICAM-l:n kyvyn olla vuorovaikutuksessa ja sitoutua LFA-l:een • · välittävät ICAM-l-aminohappojäännökset, jotka sijaitsevat ICAM- « · · : 1-molekyylin alueilla 1 (kuviot 8, 9 ja 10). Tällaisiin vuoro vaikutuksiin myötävaikuttavat kuitenkin ICAM-l:n alueilla 2 ja :V: 3 sijaitsevat aminohapot. Täten esillä olevan keksinnön mukai- • · siin edullisiin funktionaalisiin johdannaisiin lukeutuvat « . *. liukoiset ICAM-l-molekyylifragmentit, jotka sisältävät ICAM-1- • · e ’·;/ alueet 1, 2 ja 3. Edullisempia ovat liukoiset ICAM-l-molekyy- *♦··* 1 if ragmentit, jotka sisältävät ICAM-l-alueet 1 ja 2. Edulli- :Y; simpia ovat liukoiset ICAM-l-molekyylifragmentit, jotka « · sisältävät ICAM-1:n alueen 1. ICAM-l:n ja LFA-l:n väliseen 117 107451 vuorovaikutukseen osallistuvat useat aminohappojäännökset ensimmäiseltä ICAM-l-alueelta. Näiden aminohappojen korvaaminen muilla aminohapoilla muuttaa ICÄM-l:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Nämä aminohappojäännökset ja mainitut substituutiot on esitetty kuviossa 25. Kuviossa 25 esitetään myös tällaisten mutatointien vaikutukset saadun mutantti-ICAM-l-molekyylin kykyyn sitoutua LFA-l:een. Kuvioissa 23 - 25 jäännökset on merkitty aminohappojen yksikirjainkoodilla, jota seuraa jäännöksen asema ICAM-l-molekyyIissä. Täten esimerkiksi "E90" tarkoittaa glutamiinihappojäännöstä ICÄM-l:n asemassa 90. Vastaavasti "E90V" tarkoittaa dipeptidiä, joka koostuu glutamiinihappojäännöksestä asemassa 90 ja väliini jäännöksestä asemassa 91. Substituutiosekvenssi on merkitty vinoviivan ("/") oikealle puolelle. ICAM-l:n jäännökset V4, R13, Q27, Q58 ja D60S61 osallistuvat LFA-l-sitoutumiseen.The ability of ICAM-1 to interact and bind to LFA-1 is mediated by the ICAM-1 amino acid residues located in regions 1 of the ICAM-1 ·: 1 molecule (Figures 8, 9 and 10). However, amino acids located in ICAM-1 regions 2 and: V: 3 contribute to such interactions. Thus, preferred functional derivatives of the present invention include. *. soluble ICAM-1 molecule fragments containing ICAM-1- • · e '· / regions 1, 2 and 3. Soluble ICAM-1 molecule fragments containing ICAM-1 are preferred. Zones 1 and 2. Preferred: Y; mimics are soluble ICAM-1 molecule fragments which contain region 1 of ICAM-1 and 117 107451 involved in the interaction between ICAM-1 and LFA-1 from the first region of ICAM-1. Replacement of these amino acids with other amino acids alters the ability of ICÄM-1 to bind to LFA-1. These amino acid residues and said substitutions are shown in Figure 25. Figure 25 also shows the effects of such mutations on the ability of the resulting mutant ICAM-1 to bind to LFA-1. In Figures 23-25, the residues are designated by the single-letter amino acid code followed by the position of the residue in the ICAM-1 molecule. Thus, for example, "E90" means a glutamic acid residue at position 90 of ICÄM-1. Similarly, "E90V" refers to a dipeptide consisting of a glutamic acid residue at position 90 and a spacer residue at position 91. The substitution sequence is indicated to the right of the slash ("/"). Residues V4, R13, Q27, Q58 and D60S61 of ICAM-1 are involved in LFA-1 binding.

Näiden aminohappojen korvaaminen muutti ICAM-l:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Esimerkiksi korvaamalla V4 G:llä saadaan mutantti-ICAM-l-molekyyli, joka kykenee huonommin sitoutumaan LFÄ-l:een (kuvio 25). Korvaamalla ICAM-l:n R13-jäännös E:llä saadaan ,·, mutanttimolekyyli, jolla on huomattavasti vähemmän kykyä sitoutua LFA-l:een (kuvio 25). Korvaamalla ICAM-l:n Q58-jäännös H:lla saadaan mutanttimolekyyli, jolla on oleellisesti '··' normaali kyky sitoutua LFA-l:een (kuvio 25). Korvaamalla ICÄM-l:n D60S-jäännökset KL:llä saadaan mutanttimolekyyli, jolla on • · oleellisesti vähemmän kykyä sitoutua LFA-l:een (kuvio 25).Substitution of these amino acids altered the ability of ICAM-1 to bind to LFA-1. For example, replacement of V4 with G yields a mutant ICAM-1 molecule which is less capable of binding to LFΔ-1 (Figure 25). Replacement of the R13 residue of ICAM-1 with E yields, ·, a mutant molecule with significantly less ability to bind to LFA-1 (Figure 25). Replacing the Q58 residue of ICAM-1 with H yields a mutant molecule with essentially '··' normal ability to bind to LFA-1 (Figure 25). Replacing D60S residues of ICΔM-1 with KL yields a mutant molecule that has • · substantially less ability to bind to LFA-1 (Figure 25).

• · · « · ·• · · «· ·

Toisen alueen glykosylaatiokeskukset liittyvät niinikään LFA-1-sitoutumiseen (kuvio 23). Korvaamalla N103 K: 11a, tai A155NSecondary glycosylation centers are also involved in LFA-1 binding (Figure 23). By replacing N103 with K, or A155N

• · SV:llä, saadaan mutantti-lCAM-1-molekyyli, joka oleellisesti ei . *. kykene sitoutumaan LFA-l:een. Sitä vastoin glykosylaatiokes- • · ♦ ··[ · kuksen N175 korvaaminen A: 11a ei ilmeisesti oleellisesti *···* vaikuttanut mutantti-ICÄM-1:n kykyyn sitoutua LFA-l:een.SV, a mutant 1CAM-1 molecule is obtained which is substantially non-existent. *. able to bind to LFA-1. In contrast, the replacement of N175 by A with glycosylation inhibitors apparently did not significantly * ··· * affect the ability of mutant ICΔM-1 to bind to LFA-1.

....: Kolmannen ICAM-l-alueen mutaatiot eivät sanottavasti muuttaneet 118 107451 ICAM-1:n LFA-l-sitoutumista (kuvio 24).....: Mutations in the third ICAM-1 region did not significantly alter the 118 107451 LFA-1 binding of ICAM-1 (Figure 24).

ESIMERKKI 35 ICAM-l-multimeerejä, joiden biologinen puoliintumisaika-affiniteetti ja "seiviämiskyky" ovat kasvaneetEXAMPLE 35 ICAM-1 Multimers with Increased Biological Half-Affinity and "Cleavage"

Rakennetaan kimeerisiä molekyylejä, joissa ICAM-l:n alueet 1 ja 2 ovat kiinnittyneet immunoglobuliinin raskaan ketjun sarana-alueelle. Edullisissa rakenteissa ICAM-l:n alueen 2 C-pää on kiinnitetty immunoglobuliinin raskas ketju -geenisegmenttiin, joka on sarana-alueeseen nähden välittömästi N-pään puolella, jolloin segmentin jousto voi siirtyä sarana-alueeseen. ICAM-1-alueet 1 ja 2 korvaavat täten vasta-aineen Fab-fragmentin. Kiinnittämällä rakenne IgG-luokan raskaisiin ketjuihin ja eläinsoluissa sitten tuottamalla saadaan kimeerinen molekyyli. Tuotettaessa molekyylejä, jotka sisältävät IgArsta tai IgM:stä peräisin olevia raskaita ketjuja, saadaan molekyylejä, joiden multimeria-aste on korkeampi, jolloin ne sisältävät 2-12 ICAM-l-molekyyliä. Yhteisilmaisemalla J-ketjugeeni eläinsoluissa, jotka tuottavat kimeerisiä ICAM-l-raskasketjumole-.·, kyylejä, saadaan kootuksi oikealla tavalla IgA- ja IgM- multimeerejä, jolloin saadaan pääasiassa IgA-molekyylejä, jotka • « « sisältävät 4-6 ICAM-l-molekyyliä, ja IgM-mol ekyyl e jä, jotka *···[ sisältävät noin 10 ICAM-l-molekyyliä. Näillä kimeerisillä ‘ ' molekyyleillä saattaa olla useita hyviä puolia. Ensinnäkin Ig- • · molekyylit on suunniteltu pitkäikäisiksi verenkierrossa, mikä • · · : mahdollisesti nostaa biologista puoliintumisaikaa.Chimeric molecules are constructed in which regions 1 and 2 of ICAM-1 are attached to the hinge region of the immunoglobulin heavy chain. In preferred embodiments, the C-terminus of ICAM-1 region 2 is attached to an immunoglobulin heavy chain gene segment immediately adjacent to the hinge region at the N-terminus, whereby the elasticity of the segment can be transferred to the hinge region. ICAM-1 regions 1 and 2 thus replace the Fab fragment of the antibody. By attaching the structure to IgG-class heavy chains and then producing in animal cells, a chimeric molecule is obtained. The production of molecules containing heavy chains derived from IgA or IgM results in higher molecular weight molecules containing 2-12 ICAM-1 molecules. By co-expressing the J-chain gene in animal cells producing chimeric ICAM-1 heavy chain moles, IgA and IgM multimers are correctly assembled, yielding mainly IgA molecules containing 4-6 ICAM-1- molecules, and IgM molecules that * ··· [contain about 10 ICAM-1 molecules. These chimeric '' molecules may have several advantages. First of all, Ig- • · molecules are designed to be long-lived in the bloodstream, which may · · · potentially increase the biological half-life.

Lisäksi näiden rakennettujen molekyylien multimeeriluonne • · ·*sallii niiden olla vuorovaikutuksessa korkeammalla affinitee- , ·. tiliä nuhaviruksen sekä solupinta-LFA-1:n kanssa, terapiayh- • » · •*j · teydestä riippuen, jolloin se yhdistelmäproteiinimäärä, joka on « « annettava tehokkaan annoksen saamiseksi, laskee voimakkaasti. ;Y; IgA ja IgM ovat erittäin glykosyloituja molekyylejä, joita i · normaalisti esiintyy limakalvoeritteissä esimerkiksi nenässä.In addition, the multimeric nature of these constructed molecules • · · * allows them to interact with a higher affinity, ·. account with rhinitis virus and cell surface LFA-1, depending on the therapeutic combination, whereby the amount of recombinant protein required to obtain an effective dose is greatly reduced. Y; IgA and IgM are highly glycosylated molecules that are normally found in mucosal secretions such as the nose.

119 107451119 107451

Niiden erittäin hydrofiilinen luonne edistää niiden sitomien bakteerien ja viruksien pysymistä limakalvolla, jolloin viimemainittujen kiinnittyminen soluihin sekä epiteelisolumemb-raaniesteen läpäisy estyvät. Täten niiden terapeuttinen teho on mahdollisesti kasvanut. IgM ja erityisesti IgA ovat stabiileja limakalvoympäristöissä ja ne voivat nostaa ICAM-l-rakenteiden stabiilisuutta. Jos tällaista funktionaalista ICÄM-1-johdannaista annetaan verenkiertoon, tämä mahdollisesti niinikään kasvattaa biologista puoliintumisaikaa. IgA ei kiinnitä komplementtia ja olisi täten ihanteellinen sovellutuksissa, joissa mainittu olisi kohtalokasta. Jos halutaan IgG-H-ketjukimeerejä, voitaisiin mutatoida komplementin kiinnitykseen sekä Fc-reseptorivuorovaikutuksiin osallistuvia alueita.Their highly hydrophilic nature promotes the retention of the bacteria and viruses they bind to the mucous membrane, thereby preventing the latter from attaching to cells and penetrating the epithelial cell membrane barrier. Thus, their therapeutic efficacy may have increased. IgM, and in particular IgA, are stable in mucosal environments and can increase the stability of ICAM-1 structures. If such a functional ICA1-1 derivative is administered to the bloodstream, it may also increase the biological half-life. IgA does not fix complement and would thus be ideal for applications where the latter is fatal. If IgG-H chain chimeras are desired, the regions involved in complement attachment and Fc receptor interactions could be mutated.

ESIMERKKI 36 ICAM-l-mutanttien muodostus Oiioonukleotidiohjattu mutatointi ICAM-l-cDNA:n koodialue 1,8 ep:n SaiI-Kpnl-fragmentissa alakloonattiin ilmennysvektoriin CDMB (Seed, B., et ai..EXAMPLE 36 Construction of ICAM-1 Mutants Oionic Nucleotide-Directed Mutation The coding region of the ICAM-1 cDNA in a 1.8 bp SaiI-Kpn1 fragment was subcloned into the expression vector CDMB (Seed, B., et al.).

·* " Proc.Natl .Acad. Sei. USA 84 (1987) 3365 - 3369). Kunkelin, T., (Proc.Natl .Acad.Sci. USA 82 (1985) 488 - 492) menetelmän ja Stauntonin, D., et ai. , (Staunton, D.E. , et ai. . Cell 52 (1988) 925 - 933) modifikaatioiden mukaan tämän rakenteen (pCD1.8) :V: avulla muodostettiin yksisäikeinen urasiilipitoinen templaatti käytettäväksi oligonukleotidiohjatussa mutatoinnissa.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365-3369 (1987)). Kunkelin, T., (Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82 (1985) 488-492) and Staunton, D. , et al., (Staunton, DE, et al., Cell 52 (1988) 925-933), this structure (pCD1.8): V was used to generate a single-stranded uracil-containing template for use in oligonucleotide-directed mutation.

.·.·. Suupeasti, pCD1.8:lla transformoitiin E. coli -kanta XS127.. ·. ·. Mildly, pCD1.8 transformed E. coli strain XS127.

Yksittäisiä pesäkkeitä kasvatettiin 1 ml:ssa Luria-liemi- (LB-) • · · • · « *. kasvualustaa (Difco), joka sisälsi 13 mikrogrammaa/ml ampisil- • * :.· * liinia ja 8 mikrogrammaa/ml tetrasykliiniä, lähelle kyllästys- i": pistettä. 100 mikrolitraan viljelmää tartutettiin R408-avusta- .·]·. jafagi (Stratagene) monikerta- (10) tartutuksena (MOI), minkä • · « '. jälkeen lisättiin 10 ml LB-kasvualustaa, joka sisälsi ampisil- 120 107451 liinia ja tetrasykliiniä, ja kasvatettiin 16 tunnin ajan 37 °C:ssa. Viljelmää sentrifugoitiin 10 000 kierr./min kierros-nopeudella 1 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantti suodatettiin 0,22 mikro-m:n suodattimella ja fagisuspensiolla tartutettiin E. coli -kanta BW313/P3, joka maljoitettiin sitten LB-agar-kasvualusta- (Difco) maljapinnoille, jolloin kasvualustaa oli täydennetty ampisilliinilla ja tetrasykliini!lä. Pesäkkeet noukittiin ja niitä kasvatettiin 1 ml:ssa LB-kasvualustaa, jossa oli ampisilliinia ja tetrasykliiniä, lähelle kyllästyspistettä, minkä jälkeen viljelmiin tartutettiin avustajafagi MOI 10 -tartutuksena. Sitten viljelytilavuus nostettiin 250 ml:ksi ja soluja viljeltiin yön yli. Yksisäikei-nen DNA eristettiin vakioilisella fagiuutolla.Individual colonies were grown in 1 ml of Luria broth (LB) • · · • · «*. medium (Difco) containing 13 micrograms / ml ampicillin * *. · * line and 8 micrograms / ml tetracycline close to saturation "point. 100 microliters of culture was inoculated with R408-aid. ·] ·. Stratagene) as a multiple (10) infection (MOI) followed by the addition of 10 ml of LB medium containing ampisil-120 107451 line and tetracycline and grown for 16 hours at 37 ° C. 000 rpm for 1 minute, after which the supernatant was filtered with a 0.22 micro-m filter and the phage suspension inoculated with E. coli strain BW313 / P3, which was then plated on LB agar medium (Difco) plates. colonies were harvested and grown in 1 ml of LB medium containing ampicillin and tetracycline close to the saturation point, followed by inoculation of the auxiliary phage. MOI 10. The culture volume was then increased to 250 ml and the cells were cultured overnight. The single-stranded DNA was isolated by constant phage extraction.

Mutanttioligonukleotidit fosforyloitiin ja niitä käytettiin pCD1.8-templaatin ohella toisen säikeen synteesireaktiossa (Staunton, D., et ai ., Cell 52 (1988) 925 - 933).Mutant oligonucleotides were phosphorylated and used in addition to the pCD1.8 template in the second strand synthesis reaction (Staunton, D., et al., Cell 52: 925-933 (1988)).

Transfektointi COS-soluja siirrostettiin 10 cm:n kudosviljelmämaljoihin « 4 4 sellainen määrä, että viljelmä olisi 50-%:isesti yhteenkasvanutTransfection COS cells were inoculated into 10 cm tissue culture plates at a volume of 50% culture growth.

« « I«« I

16 - 24 tunnissa. Sitten COS-solut pestiin kerran TBS:llä ja I ( inkuboitiin 4 tunnin ajan 4 ml :11a RPMIrtä, joka sisälsi 10 % t • «tl * ' seerumia (Collaborative), 5 mikrogrammaa/ml klorokiinia, 3 • · ·.·.* mikrogrammaa mutanttiplasmidia ja 200 mikrogrammaa DEAE- : dekstraanisulfaattia. Sitten solut pestiin 10 % DMSO/PBS:llä ja sen jälkeen PBS:llä, minkä jälkeen niitä viljeltiin 16 tunnin ajan kasvualustassa. Kasvualusta korvattiin tuoreella kasvu- · alustalla ja ajankohtana 48 tuntia tartutuksesta COS-solut lietettiin trypsiini/EDTA- (Gibco) käsittelyllä ja jaettiin 2, • · · ί·ί · 10 cm:n maljoihin sekä 24 kuopan kudosvil jelmälevyil le HRV- • · · :...· sitoutumista varten. Ajankohtana 72 tuntia solut otettiin talteen 10 cm:n maljoista käyttäen 5 mM EDTA/HBSS:ää ja niitä käsiteltiin silmälläpitäen kiinnittämistä LFA-l-päällysteiseen 121 107451 muoviin ja immunofluoresenssimääritystä.16 to 24 hours. The COS cells were then washed once with TBS and I (incubated for 4 hours in 4 ml RPMI containing 10% t / ml serum (Collaborative), 5 micrograms / ml chloroquine, 3 · · ·. * micrograms of mutant plasmid and 200 micrograms of DEAE-: dextran sulfate The cells were then washed with 10% DMSO / PBS followed by PBS and then cultured for 16 hours in culture medium replaced with fresh medium and 48 hours after infection with COS. cells were slurried with trypsin / EDTA (Gibco) treatment and plated in 2, 10 cm plates, and 24-well tissue culture plates for HRV binding. were harvested from 10 cm plates using 5 mM EDTA / HBSS and processed for attachment to LFA-1 coated 121,107,451 resins and immunofluorescence assay.

LFA-1:n ia HRV:n sitoutuminen LFA-1 puhdistettiin SKW-3-lysaateista immunoaffiniteettikroma-tografisesti TS2/4-LFA-l-MAb-Sepharose -geelissä ja eluoitiin pH:ssa 11,5 2 mM MgCl2in ja 1 %:n oktyyliglukosidia läsnäollessa. LFA-1 (10 mikrogrammaa/200 mikrolitraa/6 cm:n malja) sidottiin bakteriologisiin petrimaljoihin laimentamalla pitoisuuteen 0,1 % oktyyliglukosidia PBS:ssä (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos), joka sisälsi 2 mM MgCl2, ja inkuboi-malla yön yli 4 °C:ssa. Maljat salvattiin l-%:isella BSA-liuoksella (nautaseerumialbumiini-) ja varastoitiin PBS:ssä, joka sisälsi pitoisuudet 2 mM MgCl2, 0,2 % BSA:ta, 0,025 % atsidia ja 50 mikrogrammaa/ml gentamysiiniä.LFA-1 and HRV Binding LFA-1 was purified from SKW-3 lysates by immunoaffinity chromatography on TS2 / 4-LFA-1-MAb-Sepharose gel and eluted at pH 11.5 with 2 mM MgCl2 and 1%: n octylglucoside. LFA-1 (10 micrograms / 200 microlitres / 6 cm dish) was bound to bacteriological petri dishes by diluting with 0.1% octyl glucoside in PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM MgCl 2 and incubating overnight at 4 ° C. :in. The plates were blocked with 1% BSA (bovine serum albumin) and stored in PBS containing 2 mM MgCl 2, 0.2% BSA, 0.025% azide and 50 micrograms / ml gentamycin.

5lCr-leimattuja COS-soluja PBS:ssä, joka sisälsi 5 % FCS:ää (vasikansikiöseerumia), 2 mM MgCl2, 0,025 % atsidia (puskuri), inkuboitiin lisäten 5 mikrogrammaa/ml RRl/l:tä ja R6.5:tä, tai mainittua lisäystä suorittamatta, LFA-l-päällysteisillä mikrotiitterilevyillä 25 °C:ssa 1 tunnin ajan. Ei-kiinnittyneet " solut poistettiin pesemällä 3 kertaan puskurilla. Kiinnittyneet5Cr-labeled COS cells in PBS containing 5% FCS (fetal calf serum), 2 mM MgCl2, 0.025% azide (buffer) were incubated with the addition of 5 micrograms / ml RR1 / L and R6.5, or without making said addition, on LFA-1 coated microtiter plates at 25 ° C for 1 hour. Non-adherent cells were removed by washing 3 times with buffer. Adherent

' I I'I I

V · solut eluoitiin lisäämällä EDTA:ta pitoisuuteen 10 mM ja suoritettiin gamma-laskenta.V · cells were eluted by adding EDTA to 10 mM and gamma counting was performed.

« · I ( ;«· I (;

•V: TULOKSET• V: RESULTS

• · • · · • · « 9 · *• · • · · · «9 · *

On tunnistettu ICAM-l-vastaisia vasta-aineita kuten RR1/1, ..... R6.5, LB-2 tai CL203. Jos nämä vasta-aineet kykenevät estämään • · « l.l ICAM-l-funktion, ne välttämättä kykenevät sitoutumaan johonkin • « · tiettyyn kohtaan ICÄM-l-molekyylissä, joka on tärkeä myös ICAM- m · ... · 1-funktiolle. Täten valmistamlla edellä kuvattuja ICAM-1- deleetiomutantteja ja määrittämällä, missä määrin ICAM-1- ./.. vastaiset vasta-aineet kykenevät sitoutumaan deleetioon, • · » voidaan määrittää, ovatko deletoidut alueet tärkeitä • « 122 1 0 7 4 51 funktiolle.Antibodies to ICAM-1 such as RR1 / 1, ..... R6.5, LB-2 or CL203 have been identified. If these antibodies are able to inhibit the ICAM-1 function, they may be able to bind to a particular site in the ICAM-1 molecule, which is also important for the ICAM-1 function. Thus, by preparing the above-described ICAM-1- / deletion mutants and determining the extent to which antibodies to ICAM-1- / I are capable of binding to the deletion, it is possible to determine whether the deleted regions are important for the function.

ICAM-1 on integraalinen membraaniproteiini, jonka solunulkoisen alueen ennustetaan koostuvan viidestä Ig:n kaltaisesta C-alueesta. LFA-l-sitoutumiseen osallistuvien alueiden tunnistamiseksi alue 3 ja alueet 4 ja 5 (karboksyylipää) deletoitiin oligonukleotidiohjattua mutatointia käyttäen, minkä jälkeen ne ilmennettiin COS-soluissa ja suoritettiin funktionaalisia kokeita. Lisäksi sytoplasma-alue kokonaisuudessaan deletoitiin sen mahdollisen vaikutuksen ICAM-1-vuorovaikutuksiin todentamiseksi. Kuten ennakoitu sytoplasma-alue deleetio, Y476/*, ei osoittanut RR1/1-, R6.5-, LB-2- ja CL203-reaktiivisuuden menetystä, kun puolestaan alueen 3, F185 - R451, deleetion seurauksena CL203-reaktiivisuus vastaavasti laski (kuvio 20). Täten CL203-epitooppi sijaitsee ilmeisesti alueella 4 kun taas RR1/1, R6.5 ja LB-2 vaikuttavat sijaitsevan 2 aminopää-alueella.ICAM-1 is an integral membrane protein whose extracellular region is predicted to consist of five Ig-like C regions. To identify the regions involved in LFA-1 binding, region 3 and regions 4 and 5 (carboxyl terminus) were deleted using oligonucleotide-directed mutation, followed by expression in COS cells and functional assays. In addition, the entire cytoplasmic region was deleted to verify its potential effect on ICAM-1 interactions. As the predicted cytoplasmic region deletion, Y476 / *, showed no loss of RR1 / 1, R6.5, LB-2, and CL203 reactivity, whereas the deletion of region 3, F185 - R451, resulted in a corresponding decrease in CL203 reactivity ( Figure 20). Thus, the CL203 epitope appears to be located in region 4, while RR1 / 1, R6.5 and LB-2 appear to be located in the 2 amino-terminal region.

Kaikki 3 deleetiomutanttia osoittavat villityypin LFA-1-kiinnitystasoja (kuvio 21). Aminohapposubstituutioita muodostettiin myös alueiden 1, 2 ja 3 ennakoituihin beeta-,< käänteisiin, rakenteet ilmennettiin COS-soluissa ja niiden I funktionaalisuutta testattiin. R6.5-epitooppi paikannettiin ‘ täten sekvenssiin E111GGA alueessa 2, ja siihen saattaa i i j , niinikään liittyä E39 alueella 1, kun taas RR1/1 ja LB-2 * e • · s *·*.' kumpikin ovat riippuvaisia R13:sta alueella 1 (kuvio 22).All 3 deletion mutants show wild-type LFA-1 attachment levels (Figure 21). Amino acid substitutions were also made at the predicted beta, <RTIgt; 1, </RTI> 2 and 3 regions, constructs were expressed in COS cells and tested for I functionality. The R6.5 epitope was thus 'located in sequence E111GGA in region 2, and may also be associated with E39 in region 1, while RR1 / 1 and LB-2 * e * · s * · *.' both are dependent on R13 in region 1 (Figure 22).

• · · V · Lisäksi RRl/l-sitoutumista alentavat mutaatiot sekvenssissä D71GQS. Mutaatioiden seurauksena, jotka eliminoivat N-kytkentäglykosylaatiokeskuksia N103:ssa ja N165:ssä, RRl/l:n, • » R6.5:n ja LB-2:n LFA-l-HRV-sitoutuminen laskee. Nämä mutaatiot . *. ilmeisesti vaikuttavat prosessointiin siten, että muodostuu * · · *“/ ICAM-l-dimeerejä.• · · V · In addition, mutations in the sequence D71GQS reduce RR1 / l binding. As a result of the mutations that eliminate N-linked glycosylation centers in N103 and N165, the LFA-1-HRV binding of RR1 / 1, • → R6.5 and LB-2 is decreased. These mutations. *. apparently affect processing to form * · · * “/ ICAM-1 dimers.

• « • e• «• e

• · D• · D

» :Y: Muiden mutaatioiden alueilla 2 tai 3 seurauksena LFA-1- • « ·;·· kiinnitys ei muuttunut (kuviot 23 ja 24). Alueen 1 aminohapot 123 107451 R13 ja D60 kumpikin osallistuvat LFÄ-l-sitoutumiseen (kuvio 25).»: Y: As a result of other mutations in regions 2 or 3, the attachment of LFA-1- •« ·; ·· did not change (Figures 23 and 24). The amino acids 123 107451 R13 and D60 of region 1 each participate in LFΔ-1 binding (Figure 25).

Täten LFA-1:n ja HRV:n sitoutuminen vaikuttaa olevan ICAM-l:n Ig-kaltäisen alueen aminopään funktio. Kuviossa 26 esitetään ICAM-aminopää-alueiden rinnakkainasettelu.Thus, binding of LFA-1 and HRV appears to be a function of the amino terminus of the Ig-like region of ICAM-1. Figure 26 shows the alignment of the ICAM amino-terminal regions.

Vaikka keksintöä on kuvattu liittyen sen spesifisiin suoritusmuotoihin, tulee huomata, että siihen voidaan tehdä muita modifikaatioita, jolloin tämän hakemuksen tarkoituksena on kattaa keksinnön kaikki muunnokset, käytöt tai sovellutukset, jotka yleensä ottaen noudattavat keksinnön periaatteita ja poikkeavat tästä julkaisusta tavalla, joka pysyttelee keksinnön koskeman alan tunnetun tai tavanomaisen käytännön puitteissa ja johon voidaan soveltaa tässä edellä esitettyjä oleellisia ominaispiirteitä oheisten patenttivaatimuksien kattaman alueen puitteissa.While the invention has been described in connection with specific embodiments thereof, it should be noted that other modifications may be made thereto, the object of which is to cover all modifications, uses or applications of the invention which generally follow the principles of the invention and depart from this disclosure. within the known or conventional practice and to which the essential features set forth hereinabove can be applied within the scope of the appended claims.

4 < < ( t e i « < « < · i • · • ♦ ♦ • · 1 • · ♦ 1· • Φ · • · · • · • ♦ · • · 1 • · • « « • « · • · · • · • · · • ♦ · ·«· · • · · « · « « « 4 m · • « 1 • · · • · ·4 <<{tei «<« <· i • · • ♦ ♦ • · 1 • · ♦ 1 · • Φ • 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 • · ♦ ♦ · «4 4 m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m 4 4 m m 4 4

Claims

1. Förfarande för framställning av en förening, som är en human funktionellt aktiv ICAM-1 molekyl (intermolekylär adhesionsmolekyl) eller dessa funktionella 5 de rivat, kännetecknat därav, att a) en rekombinant-DNA-molekyl framställs, som förmar koda en human funktionellt aktiv ICAM-1 molekyl eller dessa funktionellt aktiva derivat, b) en värdcell transformeras med nämnda rekombinant-DNA-molekyl, c) värdcellen odlas under förhallanden, som möjliggör exprimering av nämnda 10 ICAM-1 eller dessa funktionellt aktiva derivat, ooh d) ren ICAM-1 eller dessa funktionella derivat isoleras, som innehäller ätmins-tone en av följande poiypeptider: (a) -V-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; 15 (b) -X-G-S-V-L-V-T-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; (c) -L-L-G-l-E-T-P-L; (d) -F-L-T-V-Y-X-T; (e) -V-E-L-A-P-L-P; (f) -E-L-D-L-R-P-Q-G-L-E-L-F-E; 20 (g) -L-N-P-T-V-T-Y-G-X-D-S-F-S-A-K; (h) -S-F-P-A-P-N-V; .« (i) -L-R-G-E-K-E-L; G) -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P; (k) -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E; 25 (I) -P-R-G-G-S; # · · (m) -P-G-N-N-R-K; (n) -Q-E-D-S-Q-P-M; - · · (o) -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S; (p) -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S; och 30 (q) -D-L-R-P-Q-G-L-E. 4 « 4 i 4 4« 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 414 4 4 4 4 4 128 107451A process for the preparation of a compound which is a human functionally active ICAM-1 molecule (intermolecular adhesion molecule) or these functional degrades, characterized in that a) a recombinant DNA molecule is produced which is capable of encoding a human functionally (b) a host cell is transformed with said recombinant DNA molecule; (c) the host cell is cultured under conditions which allow expression of said ICAM-1 or these functionally active derivatives, and d) pure ICAM-1 or these functional derivatives are isolated, which contain the dietary tone of one of the following polypeptides: (a) -VTCSTSCDQPK; (B) -X-G-S-V-L-V-T-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; (c) -L-L-G-1-E-T-P-L; (d) -F-L-T-V-Y-X-T; (e) -V-E-L-A-P-L-P; (f) -E-L-D-L-R-P-Q-G-L-E-L-F-E; (G) -L-N-P-T-V-T-Y-G-X-D-S-F-S-A-K; (h) -S-F-P-A-P-N-V; . «(I) -L-R-G-E-K-E-L; G) -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P; (k) -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E; (I) -P-R-G-G-S; # · · (M) -P-G-N-N-R-K; (n) -Q-E-D-S-Q-P-M; - · · (o) -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S; (p) -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S; and (q) -D-L-R-P-Q-G-L-E. 4 «4 i 4 4« 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 414 4 4 4 4 4 128 107451

2. Förfarande för framställning av en förening, som är en human funktionellt aktiv ICAM-1 molekyl (intermolekylär adhesionsmolekyl) eller dessa funktionella derivat, kännetecknat därav, att a) en rekombinant-DNA-molekyl framställs, som innehäller en nukleotidsek- 5 vens enligt figur 8, och som förmär koda en human funktionellt aktiv ICAM-1 molekyl eller dessa funktionellt aktiva derivat, b) en värdcell transformeras med nämnda rekombinant-DNA-molekyl, c) värdcellen odlas under förhällanden, som möjliggör exprimering av nämnda ICAM-1 eller dessa funktionellt aktiva derivat, och 10 d) ren ICAM-1 eller dessa funktionella derivat isoleras, som innehäller ätmins-tone en av följande polypeptider: (a) -V-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; (b) -X-G-S-V-L-V-T-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; 15 (c) -L-L-G-l-E-T-P-L; (d) -F-L-T-V-Y-X-T; (e) -V-E-L-A-P-L-P; (f) -E-L-D-L-R-P-Q-G-L-E-L-F-E; (g) -L-N-P-T-V-T-Y-G-X-D-S-F-S-A-K; 20 (h) -S-F-P-A-P-N-V; (i) -L-R-G-E-K-E-L; (j) -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P; (k) -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E; (l) -P-R-G-G-S; I t ( 25 (m) -P-G-N-N-R-K; (n) -Q-E-D-S-Q-P-M; (o) -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S; .*··. (p) -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S; ja « (q) -D-L-R-P-Q-G-L-E. ♦ · · :::.r 30 ‘‘l*'2. A process for preparing a compound which is a human functionally active ICAM-1 molecule (intermolecular adhesion molecule) or these functional derivatives, characterized in that a) a recombinant DNA molecule is prepared which contains a nucleotide sequence of Figure 8, and which encode a human functionally active ICAM-1 molecule or these functionally active derivatives, b) a host cell is transformed with said recombinant DNA molecule, c) the host cell is cultured under conditions which allow expression of said ICAM-1 or these functionally active derivatives, and d) isolating pure ICAM-1 or these functional derivatives containing the dietary tone of one of the following polypeptides: (a) -VTCSTSCDQPK; (b) -X-G-S-V-L-V-T-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K; (C) -L-L-G-1-E-T-P-L; (d) -F-L-T-V-Y-X-T; (e) -V-E-L-A-P-L-P; (f) -E-L-D-L-R-P-Q-G-L-E-L-F-E; (g) -L-N-P-T-V-T-Y-G-X-D-S-F-S-A-K; (H) -S-F-P-A-P-N-V; (i) -L-R-G-E-K-E-L; (j) -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P; (k) -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E; (l) -P-R-G-G-S; In t (25 (m) -PGNNRK; (n) -QEDSQPM; (o) -TPERVELAPLPS;. * ··. (P) -RRDHHGANFS; yes «(q) -DLRPQGLE. ♦ · · :::. R 30 '' L * '

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknat därav, att den fram- i* · : '.: ställda föreningen är ett fragment av human ICAM-1. « « ψ « « » ( I • · 129 1074513. A method according to claim 1 or 2, characterized in that the compound prepared is a fragment of human ICAM-1. «« Ψ «« »(I • · 129 107451

4. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknat därav, att den fram-ställda föreningen är en variant eller ett fragment av ICAM-1, och innehaller förändrade aminosyragrupper.Process according to claim 1 or 2, characterized in that the compound prepared is a variant or fragment of ICAM-1, and contains altered amino acid groups.

5 5. Förfarande enligt nagot av föregäende patentkrav, kännetecknat därav, att den framställda föreningen är ett kemiskt derivat av human ICAM-1, dessa fragment eller variant. » • · 1 4 1 « • · 4 « 1 * I · I I I » t 4 • 4 • » • · · m · · • · # · · Λ · · *«·«1 • · • a « • · 9 t · · • • · « · · • · · I I I i i 4 I 1 t t i I I « I ( 1 I « I I I « « • I · « ·5. A process according to any preceding claim, characterized in that the compound prepared is a chemical derivative of human ICAM-1, these fragments or variant. »• · 1 4 1« • · 4 «1 * I · III» t 4 • 4 • »• · · m · · • · # · · Λ · · *« · «1 • · • a« • · 9 t · · • • • «« · • • · III ii 4 I 1 tti II «I (1 I« III «« • I · «·