FI106034B - Process for preparing a therapeutically useful mixture of sulfated oligosaccharides - Google Patents

Abstract

A mixture of sulphated oligosaccharides which are components of heparin. At least 70 % has a molar mass of 5400-7800 daltons, and at least 5 % has a molar mass of over 6900 daltons.

Description

1 1060341 106034

Menetelmä sulfafcoitujen polysakkaridien terapeuttisesti käyttökelpoisen seoksen valmistamiseksi Tämä keksintö koskee pienimolekyylisten polysakka-5 ridien alaa. Se koskee erityisesti menetelmää oligosakkaridi valmisteiden valmistamiseksi, joilla on erinomaiset farmakologiset ja antitromboottiset vaikutukset.This invention relates to a small molecule of polysaccharides. In particular, it relates to a process for the preparation of oligosaccharide preparations having excellent pharmacological and antithrombotic effects.

Yleensä antiromboottiset käsittelyt jaetaan kahteen suureen ainekategoriaan, nimittäin antikogulantteihin ja 10 trombosyyttien aggregoitumista estäviin aineisiin.Generally, anti-rhombic treatments are divided into two major categories of substances, namely, anticogulants and anti-platelet aggregation inhibitors.

Antikoagulanttien joukosta anti-K-vitamiiniyhdis-teet muodostavat hyvin tärkeän ryhmän. Koska nämä yhdisteet vaikuttavat hyvin oraalisesti, niiden käytöllä on monia indikaatioita. Kuitenkin niiden käyttöä rajoittavat 15 vielä monet haitat ja etenkin verenvuotoriskit, joita joskus esiintyy, ja vaikeus soveltaa annostusta pitkäaikaiseen käyttöön.Among the anticoagulants, anti-vitamin K compounds form a very important group. Because of their very oral activity, these compounds exhibit many indications. However, their use is still limited by the many disadvantages, especially the risks of bleeding that sometimes occur, and the difficulty of applying the dosage for long-term use.

Hepariinit muodostavat toisen antikoagulanttien “ .r kategorian. Ne ovat biologisesti vaikuttavia aineita, joi- • · 20 ta saadaan oligosakkarideista muodostuvista glykosamino-glukaanien sukuisista aineista, joiden oligosakkaridien ketjujen pituus ja sulfatoitumisaste vaihtelee. Tarkemmin sanottuna fraktioimattomasta hepariinista muodostuvien ketjujen molekyylipaino jakautuu yleensä 2 000 ja 40 000 25 daltonin välille. Hepariineja käytetään erityyppisten veritulppien, etenkin laskimoveritulppien estämiseen tai hoitoon, mahdollisesti yhdistämällä muihin hoitoihin.Heparins form another category of anticoagulants. They are biologically active substances derived from oligosaccharide related glycosaminoglycans, which vary in oligosaccharide chain length and degree of sulfation. More specifically, the molecular weight of the chains formed from unfractionated heparin is generally in the range of 2,000 to 40,000 25 Daltons. Heparins are used to prevent or treat different types of blood clots, especially venous thrombosis, possibly in combination with other treatments.

Hepariinien haitta on niiden suuri hyytymistä estävä vaikutus, joka voi aiheuttaa verenvuotoja, ja niiden 30 herkkyys tietyille veren inhibiittoreille, kuten trombosyyttien faktori 4:lle, mikä aiheuttaa suhteellisen suurten annosten käytön.The disadvantage of heparins is their high anticoagulant activity, which can cause bleeding, and their sensitivity to certain blood inhibitors, such as platelet factor 4, leading to the use of relatively high doses.

Toisaalta hepariinit ovat hyvin heterogeenisiä yhdisteitä. Siten on hyvin vaikea arvioida niiden vaikutus-35 mekanismia, määrittää kunkin komponentin osuus hepariinin 2 106034 kokonaisvaikutuksesta, ja tämän takia lisätä antitromboot-tista vaikutusta lisäämättä sivuvaikutuksia. Luonnontieteellisen tietämyksen kehittyminen tällä alalla on paljastanut, että näiden oligosakkaridien biologiset ominaisuu-5 det eli vaikutukset veren hyytymiseen in vivo sekä farmakologiset ominaisuudet vaihtelevat niiden molekyylikoon mukaan.On the other hand, heparins are very heterogeneous compounds. Thus, it is very difficult to evaluate their mechanism of action, to determine the contribution of each component to the total 10,103,034 of heparin, and therefore to increase the antithrombotic effect without increasing the side effects. The development of scientific knowledge in the art has revealed that the biological properties of these oligosaccharides, i.e., their effects on blood coagulation in vivo and their pharmacological properties, vary according to their molecular size.

Ensimmäiseksi ratkaisuksi edellä mainittuihin haittoihin on saatu pienimolekyylisillä hepariineilla. Nämä 10 hepariinit ovat sulfatoitujen oligosakkaridien seoksia, joiden molekyylipainot jakautuvat yleensä 2 000 - 10 000 daltonin välille. Näitä hepariineja valmistetaan fraktioimalla hepariinin oligosakkaridiketjuja (esimerkiksi geeli-suodatuksella Barrowcliffin et ai. mukaan, Thrombosis 15 research 12 (1977) 27 - 36) tai fragmentoimalla (depolyme-roimalla) hepariinin oligosakkaridiketjuja kemiallisilla aineilla tai entsymaattisesti. Erityisesti depolymerointia on kuvattu käsittelemällä hepariinin esteriä vahvan emäksen läsnä ollessa (EP-patentti nro 40 144). Se voidaan 20 suorittaa myös käsittelmällä hepariinia typpihapokkeella tai heparinaasin reaktiolla (EP-patentti nro 64 452). Näillä eri menetelmillä saadaan oligosakkaridiseoksia, joilla on hepariinin polysakkaridiosien yleinen rakenne mutta joiden keskimääräinen molekyylipaino on pienempi. 25 Nämä muutokset merkitsevät yleensä parempaa biologista soveltuvuutta ja pienempää vaikutusta verenvuotoon frak-tioimattomaan hepariinin verrattuna.The first solution to the above-mentioned drawbacks has been obtained with small molecule heparins. These heparins are mixtures of sulfated oligosaccharides with molecular weights generally ranging from 2,000 to 10,000 daltons. These heparins are prepared by fractionating the heparin oligosaccharide chains (e.g., by gel filtration according to Barrowcliff et al., Thrombosis 15 research 12: 27-36 (1977)) or by fragmenting (depolymerizing) the heparin oligosaccharide chains by chemical agents or enzymatically. In particular, depolymerization has been described by treating an heparin ester in the presence of a strong base (EP Patent No. 40,144). It may also be carried out by treatment of heparin with nitric acid or by reaction of heparinase (EP Patent No. 64,452). These various methods provide oligosaccharide mixtures which have the general structure of polysaccharide moieties of heparin but which have a lower molecular weight. These changes generally imply improved bioavailability and reduced effect on bleeding compared to unfractionated heparin.

Aivan erityisesti tutkijat ovat pääasiallisesti suuntautuneet tutkimaan erilaisia hepariiniseoksia, joiden 30 oligosakkaridiketjut ovat hyvin lyhyitä. Siten EP-patentti nro 27 089 osoittaa, että hepariinista peräisin olevilla oligosakkaridiseoksilla, jotka eivät sisällä enempää kuin 8 sakkaridiyksikköä, on hepariinia parempi spesifinen antitromboottinen aktiivisuus. Samalla tavalla on valmis-35 tettu heksasakkarideja ja niiden antitromboottisia ominai- 106034 suuksia on tutkittu (EP-patentti nro 64 452) . Voidaan vielä mainita aivan äskettäiset EP-patentit nro 84 999 ja 301 618, jotka koskevat hepariinista peräisin olevia polysakkarideja, kuten heksa, penta- ja tetrasakkarideja.In particular, researchers are mainly focused on studying various mixtures of heparin with very short oligosaccharide chains. Thus, European Patent No. 27,089 shows that oligosaccharide mixtures derived from heparin containing no more than 8 saccharide units have a specific antithrombotic activity better than heparin. Similarly, hexaccharides have been prepared and their antithrombotic properties have been studied (EP Patent No. 64,452). Mention may also be made of the most recent European Patent Nos. 84,999 and 301,618, which concern polysaccharides derived from heparin, such as hexa, penta and tetrasaccharides.

5 Kuitenkin tähän asti kuvatuilla yhdisteillä ei ole voitu kokonaan tyydyttävästi ratkaista hepariineihin liittyviä ongelmia. Erityisesti pienimolekyylisillä heparii-neilla on useimmiten 6 kertaa pienempi inhiboiva vaikutus trombiiniin (anti Ila-aktiivisuuteen) kuin hepariinilla. 10 Kokeellisesti klassisella veritulppamallilla, kutenHowever, the compounds described so far have not completely satisfactorily resolved the problems associated with heparins. In particular, small molecule heparins generally have a 6-fold lower inhibitory effect on thrombin (anti-IIa activity) than heparin. 10 Experimentally with a classic blood clot model such as

Wesslerin mallilla kanilla antitromboottiset annokset ovat hyvin paljon suuremmat kuin hepariinilla.In the Wessler model, antithrombotic doses are very much higher in rabbits than in heparin.

Hakija on nyt osoittanut, että natiiveista tai de-polymeroiduista hepariineista on mahdollista valmistaa 15 oligosakkaridiseoksia, joilla on erinomaiset biologiset ja farmakologiset ominaisuudet ja siksi paremmat terapeuttiset mahdollisuudet.The Applicant has now shown that it is possible to prepare mixtures of native or de-polymerized heparins with excellent biological and pharmacological properties and therefore better therapeutic potential.

Hakija on odottamatta itse asiassa havainnut, että ' kun valmistetaan oligosakkaridiseos, jonka molekyylipaino- • · 20 jakautumalle on tunnusomaista, että vähintään 70 % sulfa- toiduista oligosakkarideista on molekyylipainoltaan 5 400- 7 800 daltöniä ja vähintään 5 % sulfatoiduista oligosakkarideista on molekyylipainoltaan yli 6 900 dalto-nia ja että niiden anti Ila-aktiivisuus on suurempi kuin 25 noin 60 IU/mg ja mieluiten yhtä suuri tai suurempi kuin noin 70 IU/mg, tällä preparaatilla on saatu säilymään hyvän biologisen sopivuuden tarjoamat edut ja häviävän pienet vaikutukset pienimolekyylisten hepariinien aiheuttamaan verenvuotoon, mutta sillä on lisäksi etuna kasvanut 30 inhiboiva vaikutus trombiiniin ja suurempi antitrombootti-nen vaikutus, jonka vaikutuksen kesto on ainakin yhtä suu- •« ri.In fact, the Applicant has unexpectedly found that when preparing an oligosaccharide mixture having a molecular weight distribution, • at least 70% of the sulphated oligosaccharides have a molecular weight of 5,400-7,800 Daltons and at least 5% of the sulphated oligosaccharides have a molecular weight of over 6,900 daltone, and having an anti-Ila activity of greater than 25 about 60 IU / mg, and preferably equal to or greater than about 70 IU / mg, this preparation has retained the benefits of good bioavailability and negligible effects on bleeding from small molecule heparins , but also has the advantage of an increased inhibitory effect on thrombin and a greater antithrombotic effect with a duration of action of at least equal magnitude.

Keksinnön kohteena on menetelmä sulfatoitujen oligosakkaridien terapeuttisesti käyttökelpoisen seoksen. 35 valmistamiseksi, joilla oligosakkarideilla on hepariinin oligosakkaridirakenneosien yleinen rakenne, ja joka seos 4 106034 sisältää ainakin 70 % oligosakkarideja, joiden mole- kyylipaino on 5 400 - 7 800 daltöniä, ainakin 5 % oli gosakkarideja, joiden molekyylipaino on yli 6 900 dal-tonia, ja jonka anti-IIa-aktiivisuus on suurempi kuin noin 5 60 IU/mg. Menetelmälle on tunnusomaista, että hepariinia tai depolymeroitua hepariinia fraktioidaan geelisuodatuksella.The present invention relates to a process for the use of a therapeutically useful mixture of sulfated oligosaccharides. For the preparation of 35 oligosaccharides having the general structure of heparin oligosaccharide moieties, which blend 4,106,034 contains at least 70% oligosaccharides having a molecular weight of 5,400-7,800 Daltons, at least 5% were gosaccharides having a molecular weight of more than 6,900 daltons, and having an anti-IIa activity of greater than about 5 60 IU / mg. The process is characterized in that the heparin or depolymerized heparin is fractionated by gel filtration.

Tällainen seos yhdistää ensimmäistä kertaa frak-tioimattoman hepariinin ja pienimolekyylisen hepariinin 10 edut.Such a blend combines for the first time the advantages of unfractionated heparin and small molecule heparin.

Natiiviin hepariiniin verrattuna keksinnön mukai-seesti valmistetulla seoksella on lisäksi vähäisempi herkkyys veren inhibiittoreihin, kuten trombosyyttien faktori 4:een, mikä lisää niiden terapeuttisia käyttömahdollisuuk-15 siä.In addition, compared to native heparin, the composition prepared according to the invention has a lower sensitivity to blood inhibitors such as platelet factor 4, which increases their therapeutic potential.

Muita keksinnön mukaisesti valmistetun seoksen etuja ovat etenkin tiettyjen ei-toivottujen sivuvaikutusten, kuten trombosytopeenisen vaikutuksen väheneminen. Eräs hepariinijohdannaisten tunnettujen seosten haitoista 20 on trombosyyttien lukumäärän väheneminen, minkä ne voivat aiheuttaa. Tämä ei-toivottu vaikutus vähenee voimakkaasti, kun käytetään keksinnön seosta.Other advantages of the composition according to the invention are, in particular, the reduction of certain undesirable side effects, such as thrombocytopenic activity. One of the disadvantages of known mixtures of heparin derivatives is the reduction in the number of platelets they may cause. This undesirable effect is greatly reduced when the composition of the invention is used.

Edellä mainittujen ominaisuuksien perusteella niitä voidaan käyttää erityisen tuloksellisesti farmakologiassa, 25 etenkin ehkäistäessä ja hoidettaessa laskimo- tai valtimo- veritulppia. Lisäksi pitäisi voida käyttää suurempia annoksia in vivo kasvattamatta verenvuotojen riskiä.Based on the above properties, they can be used particularly effectively in pharmacology, particularly in the prevention and treatment of venous or arterial thromboembolism. In addition, higher doses should be used in vivo without increasing the risk of bleeding.

Erityisesti keksinnön mukaisesti valmistetut seokset sisältävät ainakin 10 % oligosakkarideja, joiden mole-30 kyylipaino on suurempi kuin 6900 daltonia.In particular, the compositions prepared according to the invention contain at least 10% oligosaccharides having a Mole-30 molecular weight greater than 6,900 daltons.

Toisaalta keksinnön mukaisesti valmistetut parhaat seokset sisältävät 70 % oligosakkarideja, joiden molekyylipaino on 5 700 - 7 500 daltonia.On the other hand, the best blends prepared according to the invention contain 70% oligosaccharides having a molecular weight of 5,700 to 7,500 daltons.

Vielä erityisesti keksinnön mukaisesti valmistetut 35 seokset sisältävät ainakin 60 % oligosakkarideja, joiden molekyylipaino on 5 700 - 6 900 daltonia.Still more particularly, the blends prepared according to the invention contain at least 60% oligosaccharides having a molecular weight of 5,700 to 6,900 daltons.

% 106034% 106034

Toisaalta keksinnön mukaisesti valmistettujen seosten anti-IIa-aktiivisuus on edullisesti pienempi kuin niiden anti-Xa-aktiivisuus.On the other hand, the compositions prepared according to the invention preferably have a lower anti-Xa activity than their anti-Xa activity.

Eräässä hyvässä toteutuksessa keksinnön mukaisesti 5 valmistetut seokset ovat erityisesti depolymeroidun hepa-riinin fraktioita. Kuten edellä on kuvattu, depolymeroitua hepariinia voidaan valmistaa millä tahansa tunnetulla kemiallisella tekniikalla, entsymaattisesti tai muuten, jotka alan ammattimies tuntee hepariinin oligosak-10 karidiketjujen fragmentoimiseksi. Erityisesti EP-paten- teissa nro 40 144, 64 452, 37 319 tai 337 327 kuvatut menetelmät sopivat keksintöön.In one good embodiment, the compositions prepared according to the invention are in particular fractions of depolymerized heparin. As described above, depolymerized heparin may be prepared by any known chemical technique, enzymatically or otherwise, known to those skilled in the art for fragmenting oligosaccharide 10 chains of heparin. In particular, the methods described in European Patent Nos. 40,144, 64,452, 37,319 or 337,327 are suitable for the invention.

Vielä aivan erityisesti keksinnön mukaisesti valmistetut seokset ovat muodostuneet oligosakkarideista, 15 joiden 2-0-sulfo-4-enopyranoosiuronihappo on jommassakum- massa päässä.Still more particularly, the mixtures prepared according to the invention are composed of oligosaccharides having 2-O-sulfo-4-enopyranose uronic acid at either end.

Eräs erityisen edullinen seos on muodostunut hepariinin fraktiosta, joka on syntynyt depolymeroimalla hepariinin esteriä emäksellä.One particularly preferred mixture is formed from the fraction of heparin formed by depolymerization of the heparin ester with a base.

• · ' 20 Keksinnön mukaisessa menetelmässä on useita para metrejä, joita kontrolloimalla voidaan kalibroida lopullisen seoksen molekyylipaino ja -jakautuma. Nämä parametrit ovat etenkin eluentin ionivahvuus ja käytetyn kantajan luonne.The process of the invention has a number of parameters which, by controlling, can be used to calibrate the molecular weight and distribution of the final mixture. These parameters are in particular the ionic strength of the eluent and the nature of the carrier used.

25 Aivan erityisesti fraktioinnille on tunnusomaista, että suoritetaan peräkkäisiä vaiheita, joissa (i) lähtöaineena käytetty hepariini tai depolymeroitu hepariini liuotetaan eluenttiin, (ii) näin saatu liuos ajetaan pylvään läpi, joka sisältää ainakin kiinteää kantajaa geelisuoda-30 tuksen suorittamiseksi ja joka on tasapainotettu samalla eluantilla ja (iii) otetaan talteen halutun molekyylipai-non omaavat fraktiot.Particularly, the fractionation is characterized by performing sequential steps of (i) dissolving the starting heparin or depolymerized heparin in the eluent, (ii) passing the solution thus obtained through a column containing at least a solid support for gel filtration and equilibrated at the same time. and (iii) recovering the fractions of the desired molecular weight.

Eräässä keksinnön erityisessä toteutustavassa läh-töainehepariinina käytetään depolymeroitua hepariinia. 35 Sellaista hepariinia voidaan valmistaa EP-patenteissa nro 6 106034 40 144, 64 452, 37 319 tai 337 327 kuvattuja menetelmiä käyttäen.In one particular embodiment of the invention depolymerized heparin is used as the starting material heparin. Such heparin can be prepared using the methods described in European Patent Nos. 6,106,034,40,144, 64,452, 37,319, or 337,327.

Vielä kaikkein mieluiten käytetään depolymeroitua hepariinia, joka on valmistettu saattamalla emäs reagoi-5 maan hepariinin esterin kanssa, kuten esimerkiksi EP-pa-tentissa nro 40 144 kuvatulla tekniikalla. Erityisesti de-polymerointi voidaan suorittaa vesiliuoksessa tai inertis-sä orgaanisessa liuottimessa orgaanisen tai epäorgaanisen emäksen reaktiolla, kuten esimerkiksi natrium- tai kalium-10 hydroksidilla, alkaalimetallikarbonaatilla tai tertiaari-sellä amiinilla (trietyyliamiinilla, trietyleenidiamiinil-la, jne.). Emäksen reaktiolla esterin kanssa voidaan suorittaa hepariinin osittainen ja kontrolloitu depolymeroin-ti muuttamatta sen yleistä rakennetta.Most preferably, depolymerized heparin prepared by reacting the base with an ester of heparin is used, such as by the technique described in EP-A-40,144. In particular, the polymerization may be carried out in aqueous solution or in an inert organic solvent by reaction of an organic or inorganic base such as sodium or potassium hydroxide, an alkali metal carbonate or a tertiary amine (triethylamine, triethylenediamine, etc.). By reacting the base with the ester, partial and controlled depolymerization of heparin can be carried out without altering its general structure.

15 Keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttökelpoisena eluenttina voidaan mainita erityyppiset suolaliuokset, kuten natriumkloridiliuokset. Hakija on kuitenkin osoittanut, että ominaisuuksiltaan parhaiden fraktioiden valmistamiseksi on erityisen edullista suorittaa fraktiointi 20 käyttämällä eluanttia, joiksi on valittu fosfaattipusku-reita, kuten etenkin kaliumfosfaatti-, natriumfosfaatti-tai NH4H2P04-puskureita. On vielä mahdollista käyttää NaCl04- tai NH4'N03-liuoksia, joilla saadaan seoksia, joiden ominaispiirteet ovat erinomaisia.As the eluent useful in the process of the invention, different types of saline solutions, such as sodium chloride solutions, may be mentioned. However, the Applicant has shown that it is particularly advantageous to carry out fractionation 20 using eluants selected from phosphate buffers such as, for example, potassium phosphate, sodium phosphate or NH4H2PO4 buffers in order to obtain the best-performing fractions. It is still possible to use solutions of NaClO4 or NH4'NO3 to provide mixtures having excellent properties.

25 Eluentin konsentraatio ja siis sen ionivahvuus so vitetaan halutun lopullisen seoksen mukaan. Etenkin eluan-tin konsentraatio on edullisesti pienempi kuin 1 M ja vielä erityisen mielellään 0,1 - 0,5 M.The concentration of the eluent, and thus its ionic strength, is adjusted according to the desired final mixture. In particular, the eluent preferably has a concentration of less than 1 M and still more preferably 0.1 to 0.5 M.

Kun käytetään fosfaattipuskuria, on erityisen 30 edullista käyttää 0,2 M lähellä olevia konsentraatioita.When using a phosphate buffer, it is particularly preferred to use concentrations close to 0.2 M.

Keksinnön mukaisen menetelmän toisessa vaiheessa • i käytetty kantaja valitaan yleensä lähtöseoksen keskimääräisen molekyylipainon (natiivi, depolymeroitu hepa-riini..), halutun lopullisen tuotteen ja lähtöseoksen 35 käyttäytymisen mukaan käytetyssä eluentissa. Kantajana käytetään edullisesti polyakryyliamidi-agaroosi-tyyppistä 7 106034 geeliä. Esimerkkeinä voidaan mainita geelit AcA 54, AcA 202, Sephadex G25 tai G50 tai vielä Biogel P30, joilla saadaan hyviä tuloksia.The carrier used in the second step of the process of the invention is generally selected according to the average molecular weight of the starting mixture (native, depolymerized heparin ..), the desired final product and the behavior of the starting mixture 35 in the eluent used. Polyacrylamide-agarose type 7106034 gel is preferably used as a carrier. Examples include AcA 54, AcA 202, Sephadex G25 or G50 gels or even Biogel P30 gels which give good results.

Ensimmäisessä keksinnön mukaisen menetelmän 5 erityisen edullisessa toteutustavassa fraktioinnin toisessa vaiheessa kiinteä kantaja jaetaan useiksi sarjaan kytketyiksi pylväiksi. Tämän keksinnön muunnelman mukaan voidaan geelisuodatuksessa käyttää suuria lopullisia määriä kantajaa ilman entisen tekniikan haittoja, nimit-10 täin huomattavia kokoonpainumisilmiöitä. Tällä tavalla erotus on paljon parempi, myös suurilla molekyylipainoil-la, yhdellä ainoalla fraktioinnilla, ja kantajat on helpompi regeneroida.In a first particularly preferred embodiment of the process 5 according to the invention, the second stage of fractionation divides the solid support into several columns connected in series. According to a variant of the present invention, large final amounts of carrier can be used for gel filtration without the disadvantages of the prior art, namely, remarkable collapse phenomena. In this way, the separation is much better, even at high molecular weights, with a single fractionation, and the carriers are easier to regenerate.

Käytettyjen pylväiden lukumäärän alan ammattimies 15 sovittaa käytetyn geelin tilavuuden ja luonteen mukaan niin, että saadaan paras tasapaino erotuksen tehokkuuden ja geelin kokoonpainumisen turmiollisen vaikutuksen välillä .The number of columns used will be adjusted by the skilled artisan according to the volume and nature of the gel used to obtain the best balance between the efficiency of the separation and the deleterious effect of gel shrinkage.

Käytännön syistä toteutuksessa käytetään yleensä 20 menetelmän toisessa vaiheessa pylväitten lukumäärää, joka on mieluiten pienempi kuin 20.For practical reasons, in the second stage of the process, the number of columns, preferably less than 20, is usually used in the second step of the process.

Kuvaavana esimerkkinä 40 litraa AcA 202:a voidaan jakaa 10:een 4 litran pylvääseen tai 130 litraa 10:een 13 litran pylvääseen.As an illustrative example, 40 liters of AcA 202 can be divided into 10 4 liter columns or 130 liters into 10 13 liter columns.

25 Eräässä toisessa erityisen edullisessa keksinnön mukaisen menetelmän toteutustavassa käytetään fraktioinnin toisen vaiheen aikana peräkkäin ainakin kahdentyyppisiä kantajia, joiden erotusominaisuudet ovat erilaiset. Tällä keksinnön muunnelmalla voidaan saada parempilaatuinen 30 lopullinen fraktiointi.In another particularly preferred embodiment of the process of the invention, at least two types of carriers having different resolution properties are used sequentially during the second fractionation step. This variant of the invention can provide better quality final fractionation.

Fraktiointi voidaan suorittaa esimerkiksi seuraa-vassa järjestyksessä geeleillä: AcA 202 - AcA 54 - AcAThe fractionation may be carried out, for example, on the following gels: AcA 202 to AcA 54 to AcA

202 .202.

Keksinnön parhaaksi toteuttamiseksi on tärkeää 35 käyttää suurta määrää geeliä niin, että erotus on parempi • 106034 ja tulos on homogeenisempi. Ottamalla huomioon tämän tyyppisissä geelisuodatuksissa käytettävät melko hitaat eluu-tionopeudet geelin tilavuus pitää sovittaa erotettavan tuotteen määrän mukaan niin, että saadaan paras tasapaino 5 erotuksen ja pituussuuntaan tapahtuvan diffuusiovaikutuk-sen välillä.For best practice of the invention, it is important to use a large amount of gel so that the resolution is 106034 and the result is more homogeneous. Given the relatively slow elution rates used in this type of gel filtration, the volume of the gel should be adapted to the amount of product to be separated to obtain the best balance between the separation and the longitudinal diffusion effect.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä suhde lähtöaineen hepariini (g)/ geelin tilavuus (1) on edullisesti pienempi kuin 2 ja vielä mieluiten 0,5 - 1,5.In the process of the invention, the ratio of starting material heparin (g) to gel volume (1) is preferably less than 2 and more preferably 0.5 to 1.5.

10 Edellä määriteltyä seosta voidaan käyttää vaikut tavana aineena farmaseuttisissa valmisteissa. Tällaista valmistetta voidaan käyttää erityisen edullisesti profy-laktisesti tai hoidettaessa tai ehkäistäessä odottamattomia veritulppia. Tarkemmin sitä voidaan käyttää: 15 - ehkäistäessä laskimoveritulppia riskitilanteissa, - ehkäistäessä valtimoissa odottamattomia veritulppia, etenkin sydäninfarktien tapauksissa, - leikkausten jälkihoidossa ehkäistäessä laskimove-ritulppia kirurgisilla potilailla, tai vielä, 20 - estettäessä veritulppia kirurgisissa meteriaa- leissa.The mixture as defined above can be used as an active ingredient in pharmaceutical preparations. Such a preparation can be used particularly advantageously for prophylactic treatment or for the treatment or prevention of unexpected blood clots. More specifically, it can be used for: 15 - Preventing venous thromboembolism in risk situations, - Preventing unexpected blood thromboembolism in arteries, especially in myocardial infarction, - Post-operative prevention of venous thromboembolism in surgical patients, or more, 20 - Preventing blood thromboembolic surgery.

Tätä keksintöä kuvataan tarkemmin seuraavien esimerkkien avulla, joita tulee pitää kuvaavina eikä rajoittavina. Näissä esimerkeissä seosten fysikaalis-kemialli-25 set, biologiset ja farmakologiset ominaispiirteet on määritetty seuraavilla tekniikoilla:The present invention will be further described by the following examples, which are to be considered as illustrative and not limiting. In these examples, the physico-chemical, biological and pharmacological properties of the mixtures have been determined by the following techniques:

Molekyylipaino ja molekyylipainojakautumaMolecular weight and molecular weight distribution

Yhdisteiden molekyylipainot ja molekyylipainojakau-tumat on määritetty korkeapainenestekromatografiällä kah-30 della sarjaan kytketyllä pylväällä, esimerkiksi kaupallisilla nimillä myytävillä pylväillä TSK G3000 XL ja TSKThe molecular weights and molecular weight distributions of the compounds are determined by high performance liquid chromatography on two serially connected columns, for example the TSK G3000 XL and TSK columns sold under their trade names.

• · G2000 XL, jotka on kytketty refraktometriseen detektoriin.• · G2000 XL connected to a refractometric detector.

Käytetty eluentti on 0,5 M litiumnitraatti ja nopeus on 0,6 ml/min. Systeemi on kalibroitu monodispers-35 seillä standardeilla, joita on valmistettu fraktioimalla 9 106034 enoksapariinia (Pharmuka) ekskluusiokromatografialla aga-roosi-polyakryyliamidilla (IBF) tekniikalla, jonka ovat kuvanneet Barrowcliffe et ai., Thromb. Res., 12, 27 - 36 (1977 - 78) tai D.A. Lane et ai., Thromb. Res. £6, 257 -5 271 (1977 - 78). Tulokset on laskettu ohjelman GPC6 avul la (Perkin Elmer).The eluent used is 0.5 M lithium nitrate and the rate is 0.6 ml / min. The system has been calibrated with monodispers-35 by standards prepared by fractionation of 9106034 enoxaparin (Pharmuka) by exclusive chromatography on agarose polyacrylamide (IBF), as described by Barrowcliffe et al., Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) or D.A. Lane et al., Thromb. Res. £ 6, 257 -5,271 (1977-78). Results are calculated using GPC6 software (Perkin Elmer).

Anti-Xa-aktiivisuus Käytetyn tekniikan ovat kuvanneet Teien A. N. ja Lie M. julkaisussa Thrombosis research 10 (1977) 399 - 410 10 käyttäen standardina ensimmäistä kansainvälistä pienimolekyylisten hepariinien standardia (WHO LMWH1).Anti-Xa Activity The technique used has been described by Teien A.N. and Lie M. in Thrombosis research 10 (1979) 399-41010 using the first international standard for small molecule heparins (WHO LMWH1).

Anti-IIa-aktiivisuus Käytetyn tekniikan ovat kuvanneet Anderson L. O. et ai. julkaisussa Thrombosis research 15 (1979) 531 - 541 15 käyttäen standardina ensimmäistä kansainvälistä pienimolekyylisten hepariinien standardia (WHO LMWH1).Anti-IIa Activity The technique used is described by Anderson L. O. et al. in Thrombosis research 15, 531-541 (1979), using the first International Standard for Small Molecular Heparins (WHO LMWH1).

APTTAPTT

Käytetty tekniikka on "Actimat" (Bio Merieux), ku-,:. ten se ovat Bell W.N. ja Alton H. G. kuvanneet julkaisussa 20 Nature 174 (1954) 880 - 881.The technique used is "Actimat" (Bio Merieux), ku -,:. there it is, Bell W.N. and Alton H. G., 20 Nature 174 (1954) 880-881.

Kanin laskimoveritulppa Käytetty tekniikka on sama kuin S. Wesslerin julkaisussa Journal of Clinical investigation 34 (1955) 647 -651.Rabbit Venous Blood Plug The technique used is the same as that described by S. Wessler in Journal of Clinical Investigation 34 (1955) 647 -651.

25 Veren vuotoaika rotalla Käytetty tekniikka on sama kuin M. Palm. et ai. kuvaama julkaisussa Thrombosis and haemostasis 64(1) (1990) 127 - 132.25 Blood bleeding time in rat The technique used is that of M. Palm. et al. Thrombosis and Haemostasis 64 (1) 127-132 (1990).

Kuvien teksti 30 Kuvio 1: APTT-aktiivisuus in vitro humaaniplasmassa - keksinnön mukaisilla seoksilla verrattuna muihin heparii- neihin.Text of the Figures Figure 1: In vitro APTT activity in human plasma - mixtures of the invention compared to other heparins.

Kuvio 2: (a ja b): keksinnön mukaisten seosten an-ti-Xa-aktiivisuuden kinetiikka kanilla: vertailu toiseen 35 pienimolekyyliseen hepariiniin.Figure 2: (a and b): Kinetics of anti-Xa activity in rabbits of the compositions of the invention: comparison with another 35 small molecule heparin.

10 10603410 106034

Kuvio 3 (a ja b): keksinnön mukaisten seosten anti-Ila-aktiivisuuden kinetiikka kanilla: vertailu toiseen pienimolekyyliseen hepariiniin.Figure 3 (a and b): Kinetics of anti-IIa activity in rabbits of the compositions of the invention: comparison with another small molecule heparin.

Esimerkki 1: Depolymeroidun hepariinin valmistus 5 Liuokseen, jossa on 10 g natriumheparinaattia 100 ml:ssa vettä, lisätään liuos, jossa on 25 g bentseto-niumkloridia 125 ml:ssa vettä. Saatu yhdiste suodatetaan huoneenlämpötilassa, pestään vedellä ja kuivataan sitten. 15 g näin saatua bentsetoniumheparinaattia liuotetaan 10 75 ml:aan metyleenikloridia, johon lisätään 15 ml bentsyy- likloridia. Liuosta kuumennetaan 25 - 35 °C:n lämpötilassa 25 tuntia. Sitten lisätään 90 ml 10 % natriumasetaatti-liuosta metanolissa, suodatetaan, pestään metanolilla ja kuivataan. 10 g hepariinin bentsyyliesteriä, jota on val-15 mistettu edellä kuvatuissa olosuhteissa, liuotetaan nat-riumsuolan muodossa 250 ml:aan vettä. Tähän noin 60 °C:ssa kuumennettuun liuokseen lisätään 0,9 g natriumhydroksidia. Lämpötila pidetään 1 h 30 min noin 60 °C:ssa ja reaktio-seos jäähdytetään sitten noin 20 °C:seen ja neutraloidaan 20 lisäämällä laimeata kloorivetyhappoa. Sitten liuoksen NaCl-konsentraatio säädetään 10 %:ksi ja yhdiste saostuu 750 ml:sta metanolia, se suodatetaan ja kuivataan.Example 1: Preparation of Depolymerized Heparin 5 To a solution of 10 g of sodium heparinate in 100 ml of water is added a solution of 25 g of benzonium chloride in 125 ml of water. The resulting compound is filtered at room temperature, washed with water and then dried. 15 g of the benzetonium heparinate thus obtained are dissolved in 10 75 ml of methylene chloride, to which 15 ml of benzyl chloride are added. The solution is heated at 25-35 ° C for 25 hours. 90 ml of a 10% sodium acetate solution in methanol are then added, filtered, washed with methanol and dried. 10 g of the heparin benzyl ester prepared under the conditions described above are dissolved in 250 ml of water in the form of the sodium salt. To this solution heated at about 60 ° C is added 0.9 g of sodium hydroxide. The temperature is maintained for 1 h 30 min at about 60 ° C and the reaction mixture is then cooled to about 20 ° C and neutralized by the addition of dilute hydrochloric acid. The solution is then adjusted to 10% NaCl and the compound precipitated from 750 ml of methanol, filtered and dried.

Esimerkki 2: Ml-seoksen valmistus 10 halkaisijaltaan 100 mm:n ja korkeudeltaan 50 cm 25 pylvästä, joista kukin sisältää 4 litraa AcA 202 geeliä (geeli on polyakryyliamidi-agaroosipalloina, joiden halkaisija on 60 - 140 pm), käytetään sarjaan kytkettyinä fraktioimaan: liuos, joka sisältää 30 g esimerkissä 1 kuvatuissa 30 olosuhteissa depolymeroitua hepariinia, pannaan ensimmäi- sen pylvään päähän ja eluoidaan liikuuvalla faasilla, joka on muodostunut 0,2 M KH2P04-liuoksesta, 300 ml/h nopeudella. Fraktiot kerätään kymmenennen pylvään päästä.Example 2: Preparation of Mixture 10 10 columns of 100 mm diameter and 50 cm height, each containing 4 liters of AcA 202 gel (gel in the form of polyacrylamide agarose spheres 60-140 µm in diameter) used in series to fractionate: solution containing 30 g of heparin depolymerized under the conditions described in Example 1 is applied to the end of the first column and eluted with a mobile phase consisting of 0.2 M KH 2 PO 4 at 300 ml / h. Fractions are collected at the end of the tenth column.

Tällä käsittelyllä voidaan erottaa tehokkaasti oli-35 gosakkaridiketjuja toisistaan molekyylipainonsa perusteel- 11 106034 la ja kerätä sitten seokseksi, jolla on halutut ominaispiirteet. Näin on saatu Ml-seos, jonka fysikaalis-kemial-liset ja biologiset ominaisuudet on annettu taulukossa 1.This treatment can efficiently separate the oligo-35 gosaccharide chains by their molecular weight and then collect them into a mixture having the desired characteristics. An Mixture Mixture is obtained, the physicochemical and biological properties of which are given in Table 1.

Esimerkki 3: M2-seoksen valmistus 5 M2-seos valmistetttiin esimerkissä 2 kuvatun frak- tiointiprotokollan mukaisesti käyttämällä 50 g depolyme-roitua hepariinia.Example 3: Preparation of M2 Mixture 5 The M2 mixture was prepared according to the fractionation protocol described in Example 2 using 50 g depolymerized heparin.

M2-seoksen fysikaalis-kemialliset ja biologiset ominaispiirteet in vitro on annettu taulukossa 1.The physico-chemical and biological characteristics of the M2 mixture in vitro are given in Table 1.

10 Esimerkki 4: M4- ja M5-seoksen valmistus M5-seos valmistettiin esimerkissä 2 kuvatun frak-tiointiprotokollan mukaisesti käyttämällä 30 g depolyme-roitua hepariinia, mutta käyttämällä 10 pylvästä, joiden halkaisija oli 9 cm ja korkeus 50 cm.Example 4: Preparation of M4 and M5 Mixture The M5 mixture was prepared according to the fractionation protocol described in Example 2 using 30 g depolymerized heparin but using 10 columns 9 cm in diameter and 50 cm high.

15 M6-seos valmistettiin ensimmäisellä fraktioinnilla esimerkin 2 mukaista protokollaa noudattaen käyttämällä lähtöaineena 150 g depolymeroitua hepariinia 10 pylväässä, joiden halkaisija oli 18 cm ja korkeus 50 cm, liikku-van faasin nopeus oli 1,1 1/h. Kiinnostavat fraktiot poo-20 lättiin ja oligosakkaridit saostettiin lisäämällä metano-lia. Talteenotettu kiinteä aine liuotettiin sitten ja fraktioitiin uudelleen samassa kromatografiasysteemissä. Fraktiot kerättiin kymmenennen pylvään päästä.The M6 mixture was prepared by first fractionation following the protocol of Example 2 using 150 g depolymerized heparin as starting material in 10 columns 18 cm in diameter and 50 cm high, with a mobile phase speed of 1.1 L / h. The fractions of interest were pooled and the oligosaccharides precipitated by the addition of methanol. The recovered solid was then dissolved and re-fractionated in the same chromatography system. Fractions were collected at the end of the tenth column.

M5- ja M6-seosten fysikaalis-kemialliset ja biolo-25 giset ominaisuudet in vitro on annettu taulukossa 1.The in vitro physicochemical and biological properties of the M5 and M6 mixtures are given in Table 1.

Esimerkki 5: Vertailuesimerkki: M3-seoksen ja M4-seoksen valmistus M3-seos valmistettiin esimerkissä 2 kuvatun frak-tiointiprotokollan mukaisesti. M4-seos, esimerkin 2 mukai-30 se protokollan fraktionnin tuloksena, saatiin sekoittamal-'la fraktio, joka eluoitui 5530 daltonin kohdalla (63 %) ja fraktio, joka eluoitui 7770 daltonin kohdalla (37 %) M3- ja M4-seosten fysikaalis-kemialliset ja biologiset ominaispiirteet in vitro on annettu taulukossa 1.Example 5: Comparative Example: Preparation of M3 Mixture and M4 Mixture M3 was prepared according to the fractionation protocol described in Example 2. The M4 blend, as a result of the protocol fractionation of Example 2, was obtained by mixing the fraction eluting at 5530 Dalton (63%) and the fraction eluting at 7770 Dalton (37%) with the physical mixture of M3 and M4. the chemical and biological characteristics in vitro are given in Table 1.

12 10603412 106034

Esimerkki 6: Keksinnön mukaisten seosten APTT-ak-tiivisuustutkimus humaaniplasmallaExample 6: APTT Activity Assay in Human Plasmas of Mixtures of the Invention

Saadut tulokset on esitetty kuvassa 1. Ne osoittavat selvästi, että keksinnön mukaiset seokset (Ml-seos) 5 muuttavat APTT:tä in vitro humaaniplasmalla paljon voimakkaammin kuin fraktioimaton hepariini.The results obtained are shown in Figure 1. They clearly show that the inventive compositions (Mixture) 5 convert APTT to human plasma much more potently than unfractionated heparin.

Taulukko 1 seos Ml M2 Ex. 1 M3 M4 M5 M6 10________Table 1 Mixture M1 M2 Ex. 1 M3 M4 M5 M6 10________

Keskimääräinen M1Q 634() 4280 5550 6360 6420 6780 molekyylipainoAverage M1Q 634 () 4280 5550 6360 6420 6780 molecular weight

Molekyylipaino-jakautuma (% MP) - > 7500 1 5,5 9 0 22 3,5 3,5 *: -7200+300 12,5 15 3,5 0 10,5 16,75 35,25 20 “ - 6600±300 47 30,5 5 9 10 37,5 50,75 - 6000+300 35 32,5 6,5 30 19,5 31,75 9,5 - 5400±300 4,5 13,5 7,5 40,5 25 9,5 1 25 -<5100 0 3 68,5 20,5 13 1 0,1Molecular Weight Distribution (% MP) -> 7500 1 5.5 9 0 22 3.5 3.5 *: -7200 + 300 12.5 15 3.5 0 10.5 16.75 35.25 20 "- 6600 ± 300 47 30.5 5 9 10 37.5 50.75 - 6000 + 300 35 32.5 6.5 30 19.5 31.75 9.5 - 5400 ± 300 4.5 13.5 7.5 40 , 5 25 9.5 1 25 - <5100 0 3 68.5 20.5 13 1 0.1

Aktiivisuus in vitro 30 - anti Xa 109 127 94,25 116,6 130 126 106 -antilla 75 80 27,75 41,8 78 68 70 13 106034In Vitro Activity 30 - Anti Xa 109 127 94.25 116.6 130 126 106 Antibody 75 80 27.75 41.8 78 68 70 13 106034

Esimerkki 7: Anti-Xa ja anti-IIa-aktiivisuuksien kinetiikkatutkimus kanilla Tämä tutkimus suoritettiin seuraavan protokollan mukaisesti: 5 - kanit: uusi-seelantilaisia (3,5 kg) - injektoitu tilavuus: subkutaanisesti: 0,5 ml/kg (vatsan alueelle) - verenotto: 3 ml verta otettiin 3,1% natriumsit-raattiliuökseen (1/10) korvan keskusvaltimon kohdalta ajan 10 hetkinä 0 min, 45 min, 90 min, 3h, 4h, 6h, 8h.Example 7: Kinetic study of anti-Xa and anti-IIa activities in rabbits This study was performed according to the following protocol: 5 - rabbits: New Zealand (3.5 kg) - injected volume: subcutaneous: 0.5 ml / kg (intraperitoneal) - Blood collection: 3 ml of blood was drawn in 3.1% sodium citrate solution (1/10) at the central ear artery for 10 minutes at 0 min, 45 min, 90 min, 3h, 4h, 6h, 8h.

Kun anti-Xa-annokset ovat yhtä suuria, keksinnön mukaisten seosten Ml, M5 ja M6 tai esimerkin 1 mukaisen depolymeroidun hepariinin subkutaanisen annostuksen jälkeen kanille saadaan anti-Xa- ja anti-IIa-aktiivisuudet 15 plasmassa, jotka ovat: - yhdensuuntaisia ja verrattavissa anti-Xa:hän (kuvio 1), - paljon suurempia keksinnön mukaisella seoksella anti-IIa-aktiivisuuden suhteen (kuvio 3).At equal doses of anti-Xa, following subcutaneous administration of the formulations M1, M5, and M6 of the invention or depolymerized heparin of Example 1, rabbits exhibit anti-Xa and anti-IIa activities in plasma that are: -Xa: he (Fig. 1), - much larger with the inventive mixture for anti-IIa activity (Fig. 3).

20 Sama vertailu suoritettuna M4-seoksen suhteen, joka on kuvattu esimerkissä 5, osoittaa, että plasman anti-Xa-aktiivisuudet pysyvät yhdensuuntaisina, mutta ero on hyvin suuri anti-IIa-aktiivisuudessa (kuviot 2 ja 3).The same comparison made with the M4 alloy described in Example 5 shows that plasma anti-Xa activities remain parallel but the difference is very large in anti-IIa activity (Figures 2 and 3).

Nämä tulokset osoittavat siis, että yllättävästi 25 keksinnön mukaisilla seoksilla on jatkuvia, kestäviä ja korkeita anti-Xa- ja anti-IIa-aktiivisuuksia in vivo. Nämä seokset ovat siten erityisen edullisia fraktioimattomaan hepariiniin verrattuna, jonka anti-Xa- ja anti-IIa-aktii-visuudet ovat in vivo hyvin lyhytkestoisia, mutta myös 30 verrattuna entisellä tekniikalla valmistettuihin pienimo-' lekyylisiin hepariineihin, joiden anti-IIa-aktiivisuus in vivo on hyvin lyhytkestoinen.Thus, these results demonstrate that, surprisingly, the compositions of the invention exhibit continuous, stable and high anti-Xa and anti-IIa activities in vivo. These mixtures are thus particularly advantageous over unfractionated heparin, which has very short in vivo anti-Xa and anti-IIa activities, but also compared to the prior art low molecular weight heparins having in vivo anti-IIa activity. is very short duration.

14 10603414 106034

Esimerkki 8: Keksinnön seosten aktiivisuustutkimus laskimoveritulppaan kanilla suonensisäisen injektion jälkeenExample 8: Activity study of compositions of the invention in venous thrombus after intravenous injection

Taulukkoon 2 on koottu saadut tulokset. Tämä tau-5 lukko osoittaa, että M3-seos (esimerkki 4), jonka molekyy-lipainojakautuma on erilainen kuin patenttivaatimuksessa esitetty, ja depolymeroitu hepariini (esimerkki 1) ovat vähemmän aktiivisia kuin keksinnön mukainen Ml-seos. Erityisesti tämän anti-IIa-aktiivisuus on selvästi suurempi. 10 Esimerkki 9: Keksinnön mukaisten seosten aktiivi- suustutkimus in vivo keksinnön mukaisilla seoksilla las-kimoveritulpaan kanilla subkutaanisen injektion jälkeenTable 2 summarizes the results obtained. This tau-5 lock indicates that the M3 mixture (Example 4) with a different molecular weight distribution than the one claimed and the depolymerized heparin (Example 1) are less active than the M1 composition of the invention. In particular, its anti-IIa activity is markedly higher. Example 9: In vivo study of the activity of the compositions of the invention with the compositions of the invention after subcutaneous injection in a rabbit vein

Saadut tulokset on koottu taulukoihin 3 ja 4. Nämä taulukot osoittavat, että Ml, M5 ja M6-seokset ovat aktii-15 visempia kuin aikaisemman tekniikan depolymeroitu hepariini (esimerkki 1) ja että niiden vaikutuksen kesto on vähintään sama.The results obtained are summarized in Tables 3 and 4. These tables show that Mixtures M1, M5 and M6 are more active than prior art depolymerized heparin (Example 1) and have at least the same duration of action.

Esimerkki 10: Aktiivisuustutkimus in vivo rotan .. veren vuotoaikaan 20 Taulukossa 5 esitetyt tulokset osoittavat selväs ti, että keksinnön mukaiset seokset (joita esitetään» Ml-, M5 ja M6-seoksilla) saavat aikaan vähemmän verenvuotoa kuin muut pienimolekyyliset hepariinit. Annetut tulokset vastaavat vuotoajan lisääntymistä verrattuna kontrolliar-25 voihin. Vertailun vuoksi 2 mg/kg hepariinia aiheuttaa vuotoajan lisääntymisen 13:een.Example 10: In vivo activity study on rat blood bleeding time The results shown in Table 5 clearly show that the compositions of the invention (represented by Mixtures M1, M5 and M6) cause less bleeding than other small molecule heparins. The results given correspond to an increase in bleeding time compared to control butter. By comparison, 2 mg / kg heparin causes an increase in bleeding time to 13.

Taulukko 5Table 5

Annos/Yhdiste Ml M5 M6 Ex. 1 M4 30 • ' 4 mg/kg 1,07±0,4 4±1,1 8,6±3.6 8 mg/kg 3,0+0,7 4,0+0,5 9,6+1,8 7,9+2,1 33,7±8 is 106034Dose / Compound M1 M5 M6 Ex. 1 M4 30 • '4 mg / kg 1.07 ± 0.4 4 ± 1.1 8.6 ± 3.6 8 mg / kg 3.0 + 0.7 4.0 + 0.5 9.6 + 1, 8 7.9 + 2.1 33.7 ± 8 is 106034

. I—I. I-I

8 +» +j t" oo C O O O 00 o ^; S' O -H C\) ^ X H -18 + »+ j t" oo C O O O 00 o ^; S 'O -H C \) ^ X H -1

ifi 4J ___ *J_Jifi 4J ___ * J_J

tn in ^ Λ; >-i ^ Λ; m tttn in ^ Λ; > -i ^ Λ; m tt

t ^ m "jj S n o II in o IIt ^ m «jj S n o II in o II

<-l ,-* -oc *OC<-l, - * -oc * OC

in o © t> ~ iQ Ή Λ, -H _ t/ϊ * ·· _, (M __ 00 w ί. Ä Γ"· JJ OO «-H OO fn Λ l?lf £ ® ® « - 3 S 8 S- g li sf tf° ° S s? S 11 11 TT~ lO oo il VO 00 ^ o o oin o © t> ~ iQ Ή Λ, -H _ t / ϊ * ·· _, (M __ 00 w ί. Ä Γ "· JJ OO« -H OO fn Λ l? lf £ ® ® «- 3 S. 8 S- g li sf tf ° ° S s? S 11 11 TT ~ lO oo il VO 00 ^ ooo

<-<ΓΊ O0 “ί,ΪΓτ Ον o ΙΌ O<- <ΓΊ O0 “ί, ΪΓτ Ον o ΙΌ O

rtee M N _> <H * x a R - o' ° o ° «---- R £ -H so Ή m -n oo t^oo ir os m ιό cv) 2® in ro i-i in t" ό o ® ortee MN _> <H * xa R - o '° o ° «---- R £ -H so Ή m -n oo t ^ oo and os m ιό cv) 2® in ro ii in t« ό o ® o

Cv] - t'- m - ~Cv] - t'- m - ~

Γ"· *-H _· OΓ „· * -H _ · O

CM O OCM O O

<N ______<N ______

' O'Oh

M (\jM (\ j

% w E g % o' -H OS% w E g% o '-H OS

g S Pp 00 +) ^ * 2 ® ... S w _ 1-1 tn o o 5 S 'T-o JL o H? en'®.» m ° a - ^ SS 8 «2___«___£____ S -h ^ +i ^ Ä 4J 00 CO ^ <M og S Pp 00 +) ^ * 2 ® ... S w _ 1-1 tn o o 5 S 'T-o JL o H? en'®. " m ° a - ^ SS 8 «2 ___« ___ £ ____ S -h ^ + i ^ Ä 4J 00 CO ^ <M o

O__ ^ *£i On O Ό OO__ ^ * £ i On O Ό O

O O CM ro d-ί Tv o lv •cvTR.® m" o ° o*° ^ m m n o in oo 10____O O CM ro d-ί Tv o lv • cvTR.® m «o ° o * ° ^ m m n o in oo 10____

•rj D P• rj D P

Λ4 >-i <— . * X in in - +i+i :. P cv) r- oo ^ov % φ «' cJ _ +i m >g en R ^ o t» ^ m o Ό o ov cv) o o cv) co en «. o » « h «g*S·® ^ ° ° W £ j2 <$ c3 c~~ m ^____ CC _ ^ ^ R- -H -H _ *" m o f5 © © o in-H £- o ^ o o o _. “ m -* v—' _> « o o -s o *» es oo s CO Csl o o ι-l o “v. - ,·> .. m m oo «O___ _ . ö : e i ieΛ4> -i <-. * X in - + i + i :. P cv) r- oo ^ ov% φ «'cJ _ + i m> g en R ^ o t» ^ m o Ό o ov cv) o o cv) co en «. o »« h «g * S · ® ^ ° ° W £ j2 <$ c3 c ~~ m ^ ____ CC _ ^ ^ R- -H -H _ *« mo f5 © © o in-H £ - o ^ ooo _. "m - * v— '_>« oo -so * "es oo s CO Csl oo ι-lo" v. -, ·> .. mm oo «O___ _. ö: ei ie

•H Id « -H |(Ö iid X• H Id «-H | {Ö iid X

+) X K id «d -h «d I I+) X K id «d -h« d I I

e Dj S <U S ·Η -h 3 3 & +J -M Id e x id P d e he Dj S <U S · Η -h 3 3 & + J -M Id e x id P d e h

<0 3 H >1 C < H<0 3 H> 1 C <H

Pe P H HPe P H H

(D J? c «d -H JS C C{D J? C «d -H JS C C

w ^ e co 3 2w ^ e co 3 2

X >i (D ·η P g SX> i {D · η P g S

hn 0 P -rl C U5 Mhn 0 P -rl C U5 M

S1 e ω to >i e » ι-i id idS1 e ω to> i e »ι-i id

Sv C ^ ^ >1 idlldnH^ r-l Ί | a xpofe o».Sv C ^ ^> 1 idlldnH ^ r-l Ί | a xpofe o ».

106034 16 o _106034 16 o _

CM M- CMCM M-CM

id r o o _ •Η O ” O M" £ in _ +1 z S +1 " +t '1 2 oa m o o oZ N3 o g - -.-ro .-cm m- o o cm 8-5 Sfo«L 3 cm-o—L®. 00* o- o-id Roo _ • Η O ”OM" £ in _ +1 z S +1 "+ t '1 2 oa moo oZ N3 og - -.- ro.-cm m- oo cm 8-5 Sfo« L 3 cm- No-L®. 00 * o- o-

g CM i—< I—I »-li—IVOtko COg CM i— <I — I »-li — IVOtko CO

£P bO „ s. g .3 ^ tn o i; 4J +1 o +1.-,+1.-,.£ P bO „s. G .3 ^ tn o i; 4J +1 o +1 .-, + 1.-,.

S M B 2¾ o co 00 n 0' !Q *-< o m o S a 1$ 2 o σ\ 10 o o M- ./ m ό m _- 1 o|P N§ oVS §°§t§ oo-10 V . o-° o-° h >—1 ^ -ri o tn 1 σ. ot m % &S M B 2¾ o co 00 n 0 '! Q * - <o m o S a 1 $ 2 o σ \ 10 o o M- ./ m ό m _- 1 o | P N§ oVS § ° §t§ oo-10 V. o- ° o- ° h> —1 ^ -ri o tn 1 σ. ot m% &

S g CM ι-t i—t O 1—1 O CM OS g CM ι-t i — t O 1—1 O CM O

5 O OO CO OOOOO +l o o 00 o 00 m cm o g +1 +| + O rf r-T 0“ 3“ 00 co~ o- o tQ. T-ι o in o goro m ^ ooVO) vo o- £.0 O.S ro“£ O- °o5 O OO CO OOOOO + l o o 00 o 00 m cm o g +1 + | + O rf r-T 0 „3„ 00 co ~ o- o tQ. T-ι o in o Goro m ^ ooVO) vo o- £ .0 O.S ro «£ O- ° o

g COg CO

in co Ιϋ CX O r-1in co Ιϋ CX O r-1

<0 -H MO O O<0 -H MO O O

o ϋ Tl M yo O o- £ s o 10 +l 2 +1 +1 3 m bp o c Q-ro 00 o in o o cm r- ζ: h EE «‘g §οοΊ ^-σΓ<*°ιη iff J- o S H p p B CO 00 ro O' H CM O H__CM_______ g* , *-< 1-1 S m in ai 5 cm f-- .h ir.o ϋ Tl M yo O o £ £ 10 + l 2 +1 +1 3 m bp oc Q-ro 00 o in oo cm r- ζ: h EE «'g §οοΊ ^ -σΓ <* ° ιη iff J - o SH pp B CO 00 ro O 'H CM O H__CM_______ g *, * - <1-1 S m in ai 5 cm f-- .h ir.

; >H M" C''· -t-l Ή o +1 in +1 co . ω cr-v CM o 3 o s2o‘!0; > H M "C '' · -t-l Ή o +1 in +1 co. Ω cr-v CM o 3 o s2o '! 0

• H II II S 3 O CO 10 O O ^‘nC W °0 H[O• H II II S 3 O CO 10 O O ^ 'nC W ° 0 H [O

m rtrt N c o η 00 O CM o 00 3 ^ V o 0 o o M X B ί οοο'Ί S.c^R.cm-^ ^ a ö ._ 6 m 00 co o t O cm ro *-» ^----------- ·?§ .3 S _ -«„,8 -h 0+1«m rtrt N co η 00 O CM o 00 3 ^ V o 0 oo MXB ί οοο'Ί Sc ^ R.cm- ^ ^ a ö ._ 6 m 00 co ot O cm ro * - »^ ----- ------ ·? § .3 S _ - «„, 8 -h 0 + 1 «

O 3 S n-ι o <-> CMc^oiC. S 1—1 Ό OO 3 S n-ι o <-> CMc ^ oiC. S 1-1 Ό O

^2 Q-fO CO OOOOTf ^cm" V ^ ^ o o"^ 2 Q-fO CO OOOOTf ^ cm "V ^^ o o"

S o 00--I Rco-^S.d' 10 a OOS o 00 - I Rco- ^ S.d '10 a OO

g CO 00 CO O ·—I Tf O 1—Ig CO 00 CO O · —I Tf O 1 —I

... ; ^...; ^

j 00000000Sj 00000000S

7¾ r-it^ooovot^aN^I7¾ r-it ^ ooovot ^ aN ^ I

u OOfOCMHCOtOONO1^1 ^u OOfOCMHCOtOONO1 ^ 1 ^

Jj Γ^Ό^Όι—« O CO Ό O 0 £ r-l r-< ro H (\) g_____^_____ bO bO S «ö tdJj Γ ^ Ό ^ Όι— «O CO Ό O 0 £ r-l r- <ro H (\) g _____ ^ _____ bO bO S« ö td

^ V W M+J Id H^ V W M + J Id H

5. S· w ud 0 X h ID ID o ««e ·—1 1 15. S · w ud 0 X h ID ID o «« e · —1 1 1

* 1-^ h—I β Ή SH 1 H *H* 1- ^ h — I β Ή SH 1 H * H

*’ cd cd hO *H +1 -P 9 0 1 -P -M* 'Cd cd hO * H +1 -P 9 0 1 -P -M

v< id tnx qq id ci, o a> 3·η rt <3 v| ·rt ·rt bO c > +J H aine •inecP ö n -P «e ö ev <id tnx qq id ci, and a> 3 · η rt <3 v | · Rt · rt bO c> + J H ain • inecP ö n -P «e ö e

< <? <? C ^ idCCiöEiö A<<? <? C ^ idCCiöEiö A

g -H0)(UH>ig g P, Λ<Ό·ΉΓΗ4-ω en 1 +j tno3C-H>iid idg -H0) (UH> ig g P, Λ <Ό · ΉΓΗ4-ω en 1 + j tno3C-H> iid id

ι,νΐ-Ρ ‘>1 ai -P id o >1 h iHι, νΐ-Ρ '> 1 ai -P id o> 1 h iH

n o 11) >1 X Crs X-r-iJ Oi Oin o 11)> 1 X Crs X-r-iJ Oi Oi

< G tn K<G tn K

17 106034 (β17 106034 {β

Tf OTf O

3 S' (MOO ° S3 S '(MOO ° S

S 3S 3

•H•B

ε o σ> to 0ε o σ> to 0

<U NO<U NO

to (β Sto {β S

1 -H -1 -H -

VO 4-) o OOVO 4-) o OO

s 3 o ’“im'O n n. oo 2 o oo^roTfOogOfo+l c O m^CM ^ cm oo ™ •Η CM Tt β O' o ^ cr> __flj_____ __ P £5s 3 o '"im'O n n. oo 2 o oo ^ roTfOogOfo + l c O m ^ CM ^ cm oo ™ • Η CM Tt β O' o ^ cr> __flj_____ __ P £ 5

rr p Orr p O

8 a O in 2* m 2 -5 ^ tno^ooo 3 ε 4 +1 ^ 3 0 °l . (tj σ> oo EH --------- ·- · · ·8 a O in 2 * m 2 -5 ^ tno ^ ooo 3 ε 4 +1 ^ 3 0 ° l. (tj σ> oo EH --------- · - · · ·

COC/O

• · · «J co to -H rf• · · «J co to -H rf

§ ΰ <= -t. Πί «1 Λ Λ ^ °1 _ TJ M§ ΰ <= -t. Πί «1 Λ Λ ^ ° 1 _ TJ M

to 3 o O0oor~tn000fo0 +l ^s· t 3 O CM C"· CM 00 ΓΟ ^ 5 fi CM On S *H * ε Ό ra o σ> ,_| 1—tto 3 o O0oor ~ tn000fo0 + l ^ s · t 3 O CM C "· CM 00 ΓΟ ^ 5 fi CM On S * H * ε Ό ra o σ>, _ | 1 — t

.*· . M CM. * ·. M CM

n (On CM CM C~ OO O +l\0 tJ A**»** ^ _ <ίΪΓ U NO Ό Is O O O CO °0.Ο +J Cl N H in OO (M Tt C »—I r4 H H CM 4f- i§______ O'n (On CM CM C ~ OO O + l \ 0 tJ A ** »** ^ _ <ίΪΓ U NO Ό Is OOO CO ° 0.Ο + J Cl NH in OO {M Tt C» —I r4 HH CM 4f- i§ ______ O '

Ai D O «0 M C S H +4 •H W «0 3Ai D O «0 M C S H +4 • H W« 0 3

.. to (0 UI 1(0 rM.. to {0 UI 1 {0 rM

. o a ε·Η .* C +13 0'. o a ε · Η. * C +13 0 '

• C r; C X• C r; C X

id (0 c (O O 3-H .id {0 c {O O 3 -H.

Λί +) > r-l φιιβ •>H (0 «0 «0 ex έ ns e «ε I ^ Ή φ *—I ^ •-M J-> ^ -HH+) 4-) >i tO C-H>- C >i 0) (0 0>Λί +)> rl φιιβ •> H (0 «0« 0 ex έ ns e «ε I ^ Ή φ * —I ^ • -M J-> ^ -HH +) 4-)> i tO CH> - C> i 0) (0 0>

(3 KW WnC(3 KW WnC

Claims (14)

1. Förfarande för framställning av en terapeutiskt användbar blandning av sulfaterade oligosackarider med en 5 allmän struktur av oligosackaridstrukturdelar av heparin, vilken blandning innehäller ätminstone 70 % oligosackarider med en molekylvikt av 5 400 - 7 800 dalton, ätminstone 5 % oligosackarider med en molekylvikt over 6 900 dalton och vilken har en anti-IIa-aktivitet större än ca 60 io IU/mg, kännetecknat därav, att heparin eller depolymeriserat heparin fraktioneras med gelfiltrering.A process for preparing a therapeutically useful mixture of sulfated oligosaccharides with a general structure of oligosaccharide structural portions of heparin, which mixture contains at least 70% oligosaccharides having a molecular weight of 5,400-7,800 daltons, at least 5% oligosaccharides with a molecular weight 900 daltons and having an anti-IIa activity greater than about 60 µl IU / mg, characterized in that heparin or depolymerized heparin is fractionated by gel filtration. 2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat därav, att man framställer en blandning, som innehäller ätminstone 70 % oligosackarider med en mo- 15 lekylvikt av 5 700 - 7500 dalton.Process according to Claim 1, characterized in that a mixture containing at least 70% oligosaccharides with a molecular weight of 5,700-7500 daltons is prepared. 3. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat därav, att man framställer en blandning, som innehäller ätminstone 60 % oligosackarider med en mo-lekylvikt av 5 700 - 6900 dalton. 203. A process according to claim 2, characterized in that a mixture containing at least 60% oligosaccharides having a molecular weight of 5 700-6900 daltons is prepared. 20 4. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-3, kännetecknat därav, att man framställer en blandning, som innehäller ätminstone 10 % oligosackarider med en molekylvikt större än 6 900 dalton.Process according to any of claims 1-3, characterized in that a mixture containing at least 10% oligosaccharides with a molecular weight greater than 6 900 daltons is prepared. 5. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-4, : 25 kännetecknat därav, att man framställer en blandning, som har en anti-IIa-aktivitet större eller lika stor som ca 70 IU/mg.Process according to any one of claims 1-4, characterized in that a mixture having an anti-IIa activity greater than or equal to about 70 IU / mg is prepared. 6. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-5, kännetecknat därav, att man framställer en 30 blandning, som härstammar frän en heparinfraktion.Process according to any of claims 1-5, characterized in that a mixture is obtained which is derived from a heparin fraction. • · :* 7. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-5, kännetecknat därav, att man framställer en blandning, som härstammar frän en fraktion av depolymeriserat heparin. 35A process according to any of claims 1-5, characterized in that a mixture is obtained which is derived from a fraction of depolymerized heparin. 35 8. Förfarande enligt patentkrav 7, känne tecknat därav, att man framställer en blandning, 21 106034 som bestär av oligosackarider, vilka har 2-0-sulfo-4-eno-pyranosuronsyra i nägondera ändan.8. A process according to claim 7, characterized in that a mixture consisting of oligosaccharides having 2-O-sulfo-4-enopyranosuronic acid at the lower end is prepared. 9. Förfarande enligt patentkrav 8, kanne-t e c k n a t därav, att man framställer en blandning, 5 som innehäller en heparinfraktion, vilken depolymeriserats genom att omsätta en bas med en ester av heparin.9. A process according to claim 8, wherein a mixture containing a heparin fraction is depolymerized by reacting a base with an ester of heparin. 10. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-9, kännetecknat därav, att fraktioneringen omfattar successiva steg, där (i) heparin eller depolymeriserat ίο heparin loses i en eluent, (ii) den sä erhällna lösningen leds genom en kolonn, som innehäller en fast bärare för gelfiltrering och som pä förhand balanserats med samma eluent och (iii) fraktionerna med önskad molekylvikt till-varatages. 15Process according to any one of claims 1-9, characterized in that the fractionation comprises successive steps in which (i) heparin or depolymerized or heparin is dissolved in an eluent, (ii) the so obtained solution is passed through a column containing a solid carrier for gel filtration and pre-balanced with the same eluent and (iii) recovering the fractions of the desired molecular weight. 15 11. Förfarande enligt patentkrav 10, känne- t e c k a t därav, att man använder depolymeriserat heparin .11. A process according to claim 10, characterized in that depolymerized heparin is used. 12. Förfarande enligt patentkrav 11, känne- *· t e c k n a t därav, att man använder depolymeriserat he- • · 20 parin, som framställts genom att omsätta en bas med en ester av heparin.12. A process according to claim 11, characterized in that depolymerized heparin is prepared which is prepared by reacting a base with an ester of heparin. 13. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat därav, att i andra fraktioneringssteget uppdelas bäraren i flera kolonner, som kopplats i serie. >·1 25Method according to claim 10, characterized in that in the second fractionation step the carrier is divided into several columns, which are connected in series. > · 1 25 14. Förf arande enligt patentkrav 10, känne tecknat därav, att andra steget utförs genom suc-cessiv användning av ätminstone tvä typers bärare med oli-ka separeringsegenskaper. ·14. A method according to claim 10, characterized in that the second step is carried out by the successive use of at least two types of carriers with different separation properties. ·