FI104424B - Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI104424B FI104424B FI922612A FI922612A FI104424B FI 104424 B FI104424 B FI 104424B FI 922612 A FI922612 A FI 922612A FI 922612 A FI922612 A FI 922612A FI 104424 B FI104424 B FI 104424B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- oncostatin
- amino acid
- mutant
- att
- mutants
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/204—IL-6
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
104424
Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi Tämä menetelmä koskee onkostatiini M -mutantteja ja -analogeja, joilla on onkosta- > 5 tiini-bioaktiivisuutta, deleetio-, substituutio-, insertio- ja prosessointimutantit mu kaan luettuina. Tämän keksinnön onkostatiini M -mutantit voivat olla hyödyllisiä saamaan esiin onkostatiini M -indusoituja biologisia vasteita suuremmassa tai pienemmässä määrin kuin natiivi onkostatiini M. Keksintöä kuvataan esimerkein, joissa valmistetaan ja luonnehditaan suuri määrä onkostatiini M -mutantteja.
10
Onkostatiini M, joka on alunperin tunnistettu sen inhibitiovaikutuksista ihmisen kasvainsolulinjoihin, eristettiin ensin forboli-12-myristaatti-13-asetaatti- (PMA) indusoiduista ihmisen histolyyttisistä lymfoomasoluista (Zarling et ai., 1986, Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 83:9739-9743) ja aktivoiduista T-lymfosyyteistä (Brown et 15 ai., 1987, J. Immunol. 139: 2977-2983). Molekyyli on lämpö-ja happostabiili proteiini, joka koostuu yksittäisestä polypeptidiketjusta Mr = 28 000. Kuten muut luonnollisesti esiintyvät kasvusäätelijät, onkostatiini M:llä on runsaasti biologisia aktiviteettejä. Joissakin ihmisen kasvainsolulinjoissa havaitaan kasvun inhibitiota, mutta ei kaikissa. Päinvastoin, joidenkin normaalien fibroplastien, kuten ihmisen esinah-20 kan fibroplastien tai WI-38-solujen kasvu stimuloituu altistettaessa onkostatiini M:lle (Zarling et ai., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:9739-9743).
Onkostatiinigeeni on kloonattuja sekvensoitu ja rekombinanttiseen onkostatiini M:n aktiivista muotoa on äskettäin ekspressoitu nisäkässoluissa (samanaikaisesti haussa : 25 oleva US-hakemus 144 574, jätetty 15. tammikuuta 1988, joka on liitetty tähän viit teeksi kokonaisuudessaan). Onkostatiini M:n valmis muoto on glykoproteiini, jossa on 228 aminohappoa, joista 5 on kysteiinijohdannaista. Proteiinilla on äärimmäisen hydrofiilinen karboksiterminaalinen domeeni. Vaikka onkostatiini M ei rakenteellisesti muistuta toisia tunnettuja sytokiinejä, sen mRNA sisältää alueen, jossa on 30 runsaasti AU:ta sen 3' ei-transloidussa päässä. Tämä alue onkostatiini M -lähetissä > \ on homologinen monissa sytokiineissä, lymfokiineissä ja muissa kasvusäätelymole- kyyleissä olevan alueen kanssa, antaen olettaa geeniekspressiolle yhteistä säätelyta-» paa. Onkostatiini M:n solureseptori on löydetty lukuisista nisäkässoluista. Tärkein 1 onkostatiini M -reseptorimolekyyli on spesifinen proteiini, jonka Mr=150 000- : 35 160 000 (Linsley et ai., 1989, J. Biol. Chem. 264:6528-6532). " Tämä keksintö koskee uusia menetelmiä onkostatiini M:n deleetio-, prosessointi-, insertio- ja/tai substituutiomutanttien valmistamiseksi. Hakemuksessa esitetään 2 104424 myös onkostatiini M -mutanttien ekspressiota rekombinaatiosysteemeissä. Mukana on myös koostumuksia, joilla on onkostatiini M:n sitoutumisalueen sekundäärinen rakenne ja jotka kykenevät spesifisesti sitoutumaan onkostatiini M -reseptoriin. Onkostatiini M -mutantteja voidaan valmistaa transformoimalla isäntäsolu ekspres- ( 5 siovektorilla, jossa on DNA-sekvenssi, joka koodaa toivottua onkostatiini M -mu-tanttipolypeptidiä, kasvattamalla transformoitua isäntäsolua ekspressoimaan ekso-geenistä DNA-sekvenssiä ja keräämällä tuloksena oleva onkostatiini M -mutantti-polypeptidi solulysaatista tai konditioidusta kasvualustasta. Onkostatiini M-mutant-tipolypeptideillä saattaa olla muuttunut biologinen aktiivisuus verrattuna luonnon 10 onkostatiini M:ään, erityisesti kasvua inhiboiva aktiivisuus. Koostumukset saattavat olla hyödyllisiä mm. mukautettaessa uudiskasvusolun lisääntymistä.
Kuvioi. Kaavamainen esitys aminohapposekvenssistä ja onkostatiini M:n toiminnallisista alueista. Aminohapot on merkitty standardi yksi-kirjainkoodilla.
15
Kuvio 2. C-terminaali-deleetio onkostatiini M -mutanttien kasvuinhibition aktiivisuus.
Kuvio 3. Kysteiinin kasvuinhibition aktiivisuus seriinionkostatiini M -mutanttei-20 hin.
Tämä keksintö koskee onkostatiini M -mutanttien, joissa on onkostatiini M -bioak-tiivisuutta valmistusmenetelmiä. Keksintö perustuu osittain olennaisten onkostatiini M:n toiminnallisten domeenien selvittämiseen ja havaintoon, että tietyt mutaatiot · 25 eivät vain säilyä, vaan joissakin tapauksissa merkittävästi lisäävät biologista aktiivi suutta. Keksintöä kuvataan esimerkein, joissa valmistetaan erilaisia deleetio-, prosessointi-, insertio- ja substituutiomutantti onkostatiini M -polypeptidejä ja luonnehditaan käyttämällä rekombinantti DNA-mutageneesiä ja ekspressiotekniikkoja.
30 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
: > 1 • ·
Spesifisessä suoritusmuodossa valmistetaan onkostatiini M -deleetiomutantteja, joista on poistettu osa tai kaikki natiivin onkostatiinin karboksiterminaaliset 42 aminohappoa. Mikä tahansa aminohapoista asemasta 186 lähtien, se mukaan luettuna, 35 karboksiterminaaliseen jäännöskohtaan 227, se mukaan luettuna onkostatiini M:n rakenteessa (kuvio 1) voidaan deletoida tuottamaan biologisesti aktiivisia onkostatiini M -mutantteja. Näillä onkostatiini M -deleetiomutanteilla ei ole vain biologista 3 104424 aktiivisuutta, vaan useat ovat merkittävästi aktiivisempia kuin natiivit onkostatiini M -lajit.
Toisessa suoritusmuodossa valmistetaan onkostatiini M -substituutiomutantteja, 5 joissa ainakin yksi natiivin onkostatiini M:n kysteiinijäännöksistä korvataan aminohapolla, joka on muu kuin kysteiini, edullisesti seriini. Hakijoiden substituutio-mutageneesitutkimukset ovat paljastaneet, että kahdessa natiivissa onkostatiini M:n sekundäärisessä rakenteessa läsnä olevasta disulfidisidoksista vain yhtä kysteiini-jäännösten 49 ja 167 välissä olevaa vaaditaan onkostatiini M -bioaktiivisuuteen.
10 Siksi koska disulfidisidoksen eliminoiminen kysteiinien välillä jäännösasemissa 6 ja 127 ei ole toiminnallisesti vaurioittavaa, onkostatiini M -mutantit, jotka eivät kykene muodostamaan tuota disulfidisidosta, ovat siitä huolimatta biologisesti aktiivisia ja toiminnallisesti kasvua mukauttavia polypeptidejä. Kuten seuraavissa esimerkeissä kuvataan täydellisemmin, sellaiset bioaktiiviset onkostatiini M -substituutiomutantit 15 voidaan valmistaa korvaamalla toinen tai molemmat kysteiinijäännökset, jotka ottavat osaa tähän "ei-olennaiseen" disulfidisidokseen. Lisäksi, kysteiinijäännös asemassa 80 voidaan korvata ilman, että uhrataan biologista aktiivisuutta. Keksinnön onkostatiini M -substituutiomutanteilla voi olla etuja verrattuna natiiviin onkostatiini M:ään mitä tulee niiden valmistukseen, formulointiin farmaseuttisiksi koostumuk-20 siksi ja/tai kykyyn vaikuttaa toivottuun biologiseen vasteeseen. Esimerkiksi sellaisia onkostatiinisubstituutiomutantteja voidaan manipuloida niin, että matkitaan tai todella eliminoidaan disulfidisidoksen suunnittelemattomuuden mahdollisuus ja mitkä tahansa seurauksena olevat sekundääriset rakenteelliset vääristymät.
·’ 25 Tämän keksinnön edellä mainitut ja muut suoritusmuodot kuvataan seuraavilla esi merkeillä, jotka ovat tyypillisiä hakijan tutkimuksille ja havainnoille ottaen huomioon keksinnön onkostatiini M -mutanttien valmistuksen ja käytön. Näiden tutkimusten ja havaintojen seurauksena on tunnistettu onkostatiini M -rakenteen erilaisia piirteitä, joita täytyy tai pitäisi säilyttää toiminnallisen eheyden säilyttämiseksi ja 30 olisi otettava huomioon, kun valmistetaan keksinnön onkostatiini M -mutantteja.
·: Tässä suhteessa toiminnallisesti tärkeitä sekvenssejä esiintyy kautta onkostatiini M
-polypeptidin eivätkä ne rajoitu yksittäiseen domeeniin. Esimerkiksi skanning-delee-tio- ja insertiomutageneesi tunnistaa aminohappojäännösten 22-36 ja 44-77 olevan olennaisia biologiselle aktiivisuudelle. Myöskään C-terminaalisten jäännösten delee-35 tio asemaan 186 ei tuhoa biologista aktiivisuutta, mutta mutanteilla, joilta puuttuu aminohapot 185-182, ei ole aktiivisuutta. Muihin sekvensseihin, jotka ovat tärkeitä 1 onkostatiini M:n kasvuinhibitiolle ja reseptorin sitomisaktiivisuudelle, kuuluvat 4 104424 jäännökset 118-121 ja 178-181, jotka sekvenssit saattavat olla olennaisia oikealle prosessoinnille ja/tai nisäkässolujen onkostatiini M- ja onkostatiini M -mutanttieri-tykselle, koska onkostatiini M -mutantteja, joilta puuttuivat nämä sekvenssit, ei voitu havaita. Samalla lailla, asparagiinijäännöksen säilyttäminen asemassa 71 saat- i 5 taa olla tarpeellista täydelle bioaktiivisuudelle ja/tai erittämiselle nisäkässoluista.
Voimakkaasti amfifiilinen alue esiintyy onkostatiini M:n C-terminuksessa C167:n ja peptidin pilkkomiskohdan Rl96 välissä. Substituoimalla fenyylialaniinit asemassa 176 ja 184 glysiinillä tuhoutuu aktiviteetti, mutta substituoimalla histidiinit asemissa 10 171, 174 ja 178 glysiinillä ei ole vaikutusta biologiseen toimintaan.
Karboksi- ja aminopäiden läheistä fysikaalista assosiaatiota saattaa esiintyä, kuten voidaan olettaa aminoterminaalisten epitooppien blokkauksella joissakin, mutta ei kaikissa, karboksiterminaalisissa deleetiomutanteissa.
15
Onkostatiini M -mutantit ja niiden analogit voidaan valmistaa modifioimalla natiivia onkostatiini M -polypeptidiä itsessään, rekombinantti-DNA-tekniikoilla ja kemiallisilla synteettisillä tekniikoilla, kuten kiinteän faasin peptidisynteesillä.
20 Kohteena olevan keksinnön mukaisesti saadaan uusia DNA-rakenteita ja uusia polypeptidikoostumuksia, joissa on ainakin yksi onkostatiini M -aktiviteetti. Aktiviteettien absoluuttinen määrä voi olla korkeampi tai alhaisempi kuin natiivin onkostatiini M:n. Polypeptideihin, joilla on onkostatiini M -aktiivisuutta, kuuluvat onkostatiini M:n deleetiomutanttiproteiinit, joissa on ainakin pääpiirteittäin koko C-' 25 terminaalinen alue deletoitu, samoin kuin mutanttiproteiinit, joilla on sama sekun däärinen rakenne kuin natiivin onkostatiini M:n sitoutumiskohdalla. Plasmidiraken-teita, joissa on DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat toivottuja polypeptidejä, joilla on onkostatiini M -aktiviteettiä, käytetään transformoimaan isäntäsolu, jota on kasvatettu ekspressoimaan toivottua polypeptidiä. Transformoitua isäntäsolua kasvate-30 taan sitten ekspressoimaan insertoitua DNA-sekvenssiä. Isäntäsolu voi olla joko ·: eukaryoottinen tai prokaryoottinen solu.
« 5 104424
Ihmisen onkostatiini Millä on seuraava aminohapposekvenssi: 10 20 30 A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V -L-L-G-Q-L-Q-K-Q-T -D-L-M-Q-D-T-S-R-L-5 40 50 60 L-D-P-Y-I-R-I-Q-G-L-D-V-P-K-L-R-E-H-C-R-E-R-P-G-A-F-P-S-E-E- 70 80 90 T-L-R-G-L-G-R-R-G-F-L-Q-T-L-N-A-T-L-G-C-V-L-H-R-L-A-D-L-E-Q- ‘ loo no 120 ; 10 R-L-P-K-A-Q-D-L-E-R-S-G-L-N-I-E-D-L-E-K-L-Q-M-A-R-P-N-I-L-G- 130 140 150 L-R-N-N-I-Y-C-M-A-Q-L-L-D-N-S-D-T-A-E-P-T-K-A-G-R-G-A-S-Q-P- l 160 170 180 : P-T-P-T-P-A-S-D-A-F-Q-R-K-L-E-G-C-R-F-L-H-G-Y-H-R-F-M-H-S-V-15 190 200 210 G-R-V-F-S-K-W-G-E-S-P-N-R-S-R-R-H-S-P-H-Q-A-L-R-K-G-V-R-R-T- * 220 227 Γ
R-P-S-R-K-G-K-R-L-M-T-R-G-Q-L-P-R
20 Aminohapoille käytetään yksikirjaimisia lyhenteitä ja niillä on seuraava merkitys: 2 A=alaniini; R=arginiini; N=asparagiini; D=aspartiinihappo; C=kysteiini; A=gluta-miini; E=glutamiinihappo; G=glysiini; H=histidiini; I=isoleusiini; L=leusiini; _ K=lysiini; M=metioniini; F=fenyylialaniini; P=proliini S=seriini; T=treoniini, W=tryptofaani; Y=tyrosiini; ja V=valiini.
••25
Onkostatiini M:ää luonnehditaan lisää sillä, että sen molekyylipaino on noin 32-36 I
kD, kuten määritettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla pelkistävissä tai ei-pel-kistävissä olosuhteissa. Eristetyn onkostatiini M:n aktiiviset valmisteet sisältävät seoksen, jossa on runsaasti mannoosia ja kompleksi N -sitoutunut oligosakkaridi. “ 30 Kuitenkin ei-giykosyloidut onkostatiini M -valmisteet säilyttävät solun kasvua mo- g : duloivan aktiivisuuden.
Onkostatiini M:ää luonnehditaan myös sen aktiivisuudella tiettyjä solukantoja vas- :
taan. Onkostatiini M stimuloi ihmisen normaalien fibroplastien lisääntymistä, josta I
35 esimerkkinä W138 ja WI26, ja inhiboi kasvainsolujen, kuten A375, HBT10, A549 ja SK-MEL28, lisääntymistä ja voi lisätä pesäkkeitä muodostavien solujen kasvua = normaalista luuytimestä. Siltä puuttuu kuitenkin sytotoksinen aktiivisuus WI26 ja _ 6 104424 WI38 ihmisen fibroplasteja ja hiiren L929-soluja vastaan, jotka ovat sensitiivisiä tuumorinekroosifaktoria vastaan, ja γ-interferonisensitiivinen ihmisen tuumorisolu- ♦ linja. Onkostatiini M ei inhiboi ihmisen normaaleja T-lymfosyytteja eikä inhiboi granulosyyttistä/myelosyyttistä pesäkkeen muodostusta luuydinsoluista pitoisuuk-5 sissa, jotka ovat 100 GIA yksikköön/ml. Lisäksi se ei estä ihmisen lisääntyviä tai sytotoksisia T-soluvasteita leukosyyttiseosten viljelmäreaktioissa (MLC) pitoisuuksissa 500 GIA yksikköä/ml. Onkostatiini M on stabiili kohtalaisille hapoille ja emäksille ja lämpökäsittelylle 56 °C:ssa.
10 Tässä esitettyihin polypeptideihin kuuluu erilaisia polypeptidiryhmiä, joilla jokaisella on se yhteinen piirre, että polypeptideillä luonnehditaan olevan vähintään yksi luonteenomainen onkostatiini M-piirre. Ryhmillä on ne yhteiset piirteet, että ne ovat onkostatiini M:n tai polypeptidien, joilla on sama sekundäärinen rakenne kuin natii-vin onkostatiini M:n sitomisalueella, deleetio-mutantteja, prosessointimutantteja tai 15 substituutiomutantteja. Polypeptideissä voi myös olla mutaation yhdistelmiä, joihin on liittynyt suuri määrä substituutio-, deleetio-, prosessointi-ja/tai insertiomutaatioi-ta. Polypeptideillä on vähintään yksi biologisesti aktiivinen sekvenssi, joka on esimerkiksi immunoreaktiivinen tai kykenee sitomaan reseptorin, jolloin sellainen sekvenssi voi kilpailla natiivin onkostatiini M:n kanssa biologisesta ominaisuudesta.
20
Seuraavia kuvauksia käytetään: "Deleetiomutanteilta" puuttuu kokonaan tai osa onkostatiini M C-terminaalisesta alueesta.
: : 25 "Substituutiomutantit" ovat onkostatiini M -mutantteja, joissa yksi aminohappo on korvattu toisella aminohapolla. Erityisen kiinnostavia ovat sulfhydryyliryhmien, jotka ovat tarpeettomia biologiselle aktiivisuudelle, substituutiot. Sellaisiin mutaatioihin voi kuulua kysteiinijäännöksen substituutio toisella varauksettomalla amino-30 hapolla, kuten seriini, glysiini, freoniini ja sen kaltaiset, joilla on varausominai-: suuksia ja tilaa täyttäviä ominaisuuksia samalla tavoin kuin kysteiinillä ja erityisesti seriinillä.
' "Prosessointimutantit" ovat mutantteja, joissa proteolyyttinen pilkkomiskohta onko- j 35 statiini M -polypeptidissä on mutatoitu siten, että valmiin polypeptidin prosessointi j on estetty. Tämä muutos saattaa johtaa molekyyliin, jolla on muuttunut biologinen • i 7 104424 aktiviteetti. Esimerkkeihin sellaisista prosessointikohdista kuuluvat aminohappo- '· jäännökset 195 ja 196. | "Insertiomutantit" ovat mutantteja, joissa kodonit, jotka koodaavat aminohapposek-5 venssiä glysiini-alaniini-glysiini, on laitettu DNA-sekvenssin alueille, joiden uskotaan koodaavan aminohappoja, joilla on tärkeä toiminnallinen merkitys. Esimerkkeihin kuuuluvat insertiot, jotka on asetettu aminohappoasemien 5 ja 6, 76 ja 77, 103 ja 104, ja 139 ja 140 väliin.
10 Polypeptideissä on myös polypeptidejä, joissa polypeptidin sitomisalueen sekundaarinen rakenne on ainakin olennaisesti sama kuin natiivin onkostatiini M:n sitomis-alue. "Sitomisalueella" tarkoitetaan natiivin onkostatiini M:n aluetta C-terminuk-sessa ja aluetta N-terminuksessa, jotka tuodaan lähekkäin disulfidisillalla C49-C167 (katso kuvio 1), joka osa molekyylistä kykenee sitoutumaan spesifisesti onkostatiini ? 15 M -reseptorimolekyyliin erittäin tehokkaasti. Sitomisaluetta luonnehditaan sillä, että siinä on amfifaattinen heliksi C-terminuksen alueella, erityisesti alue, jossa on ami- ; nohapot 168-195. "Amfifaattisella heliksillä" tarkoitetaan aluetta, jossa on hydrofobiset aminohappojäännökset yhdellä sivulla ja hydrofiiliset jäännökset toisella.
Heliksissä on yleensä noin 30-50 %, yleensä noin 40 %, hydrofobisia aminohappo- 20 ja, esimerkiksi väliini, fenalaniini, metioniini, leusiini ja sen kaltaiset; noin 30-50 % hydrofiilisiä aminohappoja, yleensä noin 40 %, esimerkiksi tyrosiini, lysiini, arginii- : ni, histidiini ja sen kaltaiset; ja noin 10-40 %, yleensä 20 %, aminohappoja, joissa ei ole ainakaan olennaisesti hydrofobista tai hydrofiilistä luonnetta, esimerkiksi seriini, = glysiini ja sen kaltaiset. Niihin kuuluvat polypeptidit, joissa polypeptidin primääri- " ·' 25 nen rakenne C-terminaalisella alueella kykenee ylläpitämään sekundääristä raken netta vesipitoisessa liuoksessa, erityisesti fysiologinen suolaliuos tai sen kaltaiset, jossa sekundäärinen rakenne on ainakin olennaisesti samanlainen kuin natiivin r onkostatiini M:n samanlaisissa olosuhteissa.
30 Polypeptidin aminohapposekvenssi voi olla sama tai erilainen kuin natiivin onkosta- f , · t t ( r *: tiim M:n, tavallisesti samanlainen. Milloin rakenne on erilainen, substituutiot voi- : daan tehdä substituoimalla yksi hydrofobinen aminohappo toisella ja/tai yksi hydro- ; tiilinen aminohappo toisella, erityisesti aminohappo, jolla on samanlaiset varaus- r ominaisuudet ja tilaa täyttävät luonteenominaisuudet niin, että ainakin olennaisesti ! 35 ylläpidetään sekundääristä rakennetta ja onkostatiini M -reseptorispesifistä sitomis-
kykyä. Onkostatiini M -reseptoriin sitoutuneen polypeptidin aktiivisuuden ei tarvitse T
i 8 104424 olla sama kuin natiivin onkostatiini M:n ja ne voi olla onkostatiini M:n agonisti tai antagonisti, kokonaan tai osittain.
"Biologiseen aktiivisuuteen" tarkoitetaan kuuluvaksi solukasvua moduloiva aktiivi-5 suus, immunologinen ristiinreagoituvuus luonnollisesti esiintyvän ihmisen onko-statiini M:n kanssa tai onkostatiini M -reseptorisitomisen korkea affiniteetti. "Solu-kasvua moduloivalla aktiviteetilla" tarkoitetaan luonnollisesti esiintyvän onkostatiini M:n biologista aktiivisuutta, johon kuuluu uudiskasvusolujen kasvun inhibitio ja normaalien solujen kasvun stimulaatio, veren muodostumiseen liittyvän systeemin 10 solut mukaan luettuina. Solukasvua moduloiva aktiivisuus voi olla erilainen kuin . luonnollisesti esiintyvällä onkostatiini Millä, tavallisesti vähentynyt. "Biologisesti aktiivisella sekvenssillä" tarkoitetaan aminohapposekvenssiä, joka muodostaa täys-pitkän polypeptidin. "Immunologisella ristiinreagoivuudella" tarkoitetaan, että vasta-aine, jonka tämän keksinnön uusi polypeptidi on indusoinut, on spesifisesti sitoutu-15 nut koskemattomaan onkostatiini Miään, ainakin kun onkostatiini M on natiivissa tilassa ja että onkostatiinin vasta-aine sitoutuu spesifisesti uuteen peptidiin, jossa onkostatiini Millä ja uudella polypeptidillä on yhteinen epitooppinen kohta.
i "Onkostatiini M -reseptorilla" tarkoitetaan sitoutumiskohtaa solun, joka spesifisesti 20 sitoo onkostatiini Min suurella affiniteetilla, pinnalla, sitoutumisen ollessa tyydytetty eikä rakenteellisesti erilaisten polypeptidien inhiboima. "Analogilla" tarkoitetaan yhdisteitä, joilla on ainakin yksi biologinen aktiviteetti, joka vastaa onkostatiini Min aktiviteettia ja mukaan luetaan aminohapposekvenssi, joka on olennaisesti ekvivalentti ainakin osan onkostatiini Min aminohapposekvenssin kanssa. Analo-• 25 geilla voi olla enemmän tai vähemmän aminohappoja verrattuna natiiviin onkostatii ni Miään.
Erilaisia onkostatiini M -mutantteja ja analogeja voidaan valmistaa käyttämällä lähtömateriaalina luonnollisesti esiintyvää tai rekombinanttista onkostatiini M:ää.
30 Onkostatiini M:ää voidaan saada luonnonlähteistä, erityisesti kasvualustasta, johon on liitetty mukaan sopiva indusori, kuten ingenoli tai forboli, ja konditoitu solulin-jalla (U937), joka on johdettu ihmisen histolyyttisestä lymfoomasta (Sundström ja 1 Nilsson, 1976, Inter. J. Cancer 17: 565-577) tai mitogeenista, kuten fytohemoglutii- ni (PHA), ja konditioitu normaaleilla ihmisen perifeerisillä veren lymfosyyteillä 35 (PBL). Onkostatiini M -mutantit ja -analogit voidaan puhdistaa niin, että niissä ei ainakaan olennaisesti ole solukomponentteja, käyttämällä erilaisia alalla hyvin tunnettuja puhdistustekniikkoja: liuotinuutto, geelinläpäisykromatografia, käänteisfaasi-
q 104424 I
HPLC, elektroforeesi tai sen kaltaiset mukaan luettuina, mutta ei niihin rajoittuen. Onkostatiini M:n C-terminus deleetiomutantteja voidaan saada täyspitkän onkosta-tiini M:n proteolyyttisellä pilkkomisella, minkä jälkeen karboksiterminus katkaistaan ainakin yksi aminohappo kerrallaan. Täyspitkästä onkostatiini M:stä voidaan 5 deletoida molekyylin koko C-terminaaliosa. "C-terminaalisella osalla" tarkoitetaan aminohappoja 186-227 (kuvio 1).
Onkostatiini M:n deleetiomutantit, prosessointimutantit ja substituutiomutantit voi- - daan myös valmistaa rekombinaatio-DNA-tekniikoilla. Tekniikat, joilla onkostatiini 10 M:ää eristetään, ovat alalla tunnettuja: synteesi, genomisesta DNA:sta eristäminen, valmistus cDNA:sta tai niiden yhdistelmät mukaan luettuina. Erilaiset tekniikat DNA:n manipuloimiseksi ovat hyvin tunnettuja ja niihin kuuluvat restriktiopilkko-minen, rakenteen osittainen poisto, ligaatio, in vitro -mutageneesi, alukekorjaus ja polylinkkerit ja adapterit ja sen kaltaiset. Ks: Maniatis et ai., Molecular Cloning, 15 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982). Yleisesti menetelmä koostuu cDNA-kirjaston rakentamisesta ja seulomisesta soluista, jotka syntetisoivat onkostatiini M:ää, kuten histolyyttiset lymfoomasolut (U937) tai PBL. *
Joko mRNA:ta koodaavan onkostatiini M:n määritystä käyttämällä koetinta tai määrittämällä onkostatiini M:n ekspressiota, sitten seulomalla vasta-aineilla onko-20 Stariini M:n ristiinreagoivan peptidifragmentin havaitsemiseksi tai sen kaltaista voi- : daan käyttää.
Kun kerran on tunnistettu cDNA, jossa on onkostatiini M:ää koodaava sekvenssi, voidaan rakennegeenissä tehdä toivotut modifikaatiot usealla tavalla. Modifikaa-:· 25 tioihin voivat kuulua deleetiot, insertiot, niiden yhdistelmät, samoin kuin substituu tiot, kuten edellä on kuvattu. Muutoksiin, kuten deleetiot, voi kuulua C-terminaa-linen alue, erityisesti alue, joka koodaa aminohappoja 186 läpi C-terminuksen.
Deleetiot voidaan tehdä lukuisin ammattimiehen tuntemin tavoin, mm. entsymaatti- “ 30 sesti pilkkomalla täyspitkä onkostatiini M-cDNA, minkä jälkeen modifioidaan ja li- _
: goidaan puhdistetut fragmentit, tai kohdennetulla mutageneesillä, erityisesti loop- I
out-mutageneesillä, kuten Kramer et ai., kuvaavat, Nucl. Acids Res. (1984) 12:9441-9456.
35 Kohteena olevan keksinnön tarkoituksia varten erilaiset aminohapot voidaan jakaa lukuisiin alaluokkiin. Seuraava taulukko osoittaa alaluokat: = 10 104424 alifaattinen neutraali
ei-polaarinen G A P V LI
polaarinen S T C M N Q
5 hapan D E
emäksinen K R
aromaattinen FHYW
"Konservatiivisella substituutiolla" tarkoitetaan, että aminohapot samasta alaluo-10 kasta (so. joko neutraali alifaattinen, hapan alifaattinen, emäksinen alifaattinen tai aromaattinen), erityisemmin samaa polaarisuutta, substituoidaan toisistaan. Haluttaessa aminohapot, joilla on 2-4 hiiliatomia tai 5-6 hiiliatomia, kuvaavat monomee-riryhmittymiä alifaattisessa alaluokassa.
15 Suurimolekyylipainoisia polypeptidejä voidaan valmistaa liittämällä yksi polypepti-difragmentti suurempaan immunogeeniseen polypeptidikantajaan, jolloin saadaan immunogeenisuutta. Esimerkkejä sellaisista proteiinikantajista ovat naudan seerumi-albumiini, avaimenreikämaljakotilo-hemosyaani (KLH) ja sen kaltaiset. Nämä kon-jugoidut polypeptidit ovat hyödyllisiä indusoimaan vasta-aineita sopivassa isäntä-20 organismissa. Vasta-aineita voidaan käyttää määrittämään onkostatiini M:n läsnäolo ja/tai konsentraatio kehon nesteissä - jonka läsnäoloa voidaan edelleen käyttää apuna havaitsemaan kasvainsolun läsnäoloa - sitoutumaan onkostatiini M:ään ja täten moduloimaan sen aktiviteettia ja puhdistamaan onkostatiini M, kuten käyttämällä affiniteettipylväässä. Täten saatua geeniä voidaan sitten manipuloida usealla alalla " 25 tunnetulla tavalla ekspressoitumisen saamiseksi. Sekä prokaryoottisia että euka- ryoottisia isäntiä voidaan käyttää, ja niihin kuuluvat bakteerit, hiiva, hyönteissolut ja nisäkässolut, esim. E. coli, COS-solut, CHO-solut, apinan munuaissolut ja silkkiäis-toukan solut (sf9). Siksi silloin kun geeniä on tarkoitus ekspressoida isännässä, joka tunnistaa onkostatiini M:n villityypin transkriptionaaliset ja translationaaliset sääte-30 lyalueet, koko geeni sen villityypin 5'- ja 3'-säätelyalueiden kanssa voidaan viedä : sopivaan ekspressiovektoriin. On olemassa erilaisia ekspressiovektoreita, jotka käyt tävät replikaatiosysteemejä nisäkäsviruksista, kuten Simian virus 40, adenovirus, naudan papilloomavirus, vacciniavirus, hyönteisen baculovirus, jne. Nämä replikaa-tiosysteemit on kehitetty, jotta saadaan markkerit, jotka sallivat transfektanttien se-35 lektion, samoin kuin saadaan sopivia restriktiokohtia, joihin geeni voidaan insertoi-da.
11 104424
Kun geeniä on tarkoitus ekspressoida isännässä, joka ei tunnista luonnostaan esiintyviä villityypin transkriptionaalisia ja translationaalisia säätelyalueita, tarvitaan lisää manipulaatiota. Lukuisia 3'-transkriptionaalisia säätelyalueita tunnetaan sopivasti ja voidaan insertoida myötävirtaan lopetuskodonista. Ei-koodaava 5'-alue vas-5 taviltaan rakennegeenistä voidaan poistaa endonukleaasirestriktiolla, Bal31 tois-toleikkauksella tai sen kaltaisella. Vaihtoehtoisesti silloin kun sopiva restriktiokohta on läsnä lähellä rakennegeenin 5'-terminusta, rakennegeeni voidaan restriktoida ja käyttää adaptoria liittämään rakennegeeni promoottorialueeseen, jossa adaptori järjestää kadonneet rakennegeenin nukleotidit.
10
Erilaisia strategioita voidaan käyttää toimittamaan ekspressiokasettia, jossa on transkription 5'-3'-suunnassa transkriptionaalinen säätelyalue ja translationaalinen aloitusalue, jossa voi myös olla säätelysekvenssit, jotka sallivat säätelyn induktion; rakennegeeni aloitusalueen transkriptionaalisen ja translationaalisen kontrollin alai-15 sena; ja translationaaliset ja transkriptionaan set terminaatioalueet. Ekspressiokase-tissa voi lisäksi olla signaalisekvenssejä bakteriofagista tai bakteerigeeneistä, jotka antavat ekspressiotuotteelle stabiiliuden ja erityssignaalisekvenssit, jotka huolehtivat ekspressiotuotteen erityksestä, samoin kuin markkerigeenit.
20 Aloitus- ja lopetusalueet ovat toiminnallisia isäntäsolussa ja voivat olla joko homologisia (johdettu alkuperäisestä isännästä) tai heterologisia (johdettu vieraasta lähteestä) tai synteettisiä DNA-sekvenssejä. Ekspressiokasetti voi täten olla kokonaan tai osittain johdettu luonnollisista lähteistä ja joko kokonaan tai osittain johdettu lähteistä, jotka ovat homologisia isäntäsolun kanssa tai heterologisia isäntäsolun 25 kanssa. Keksinnön erilaiset DNA-rakenteet (DNA-sekvenssit, vektorit, plasmidit, ekspressiokasetit) ovat eristetyt ja/tai puhdistetut tai syntetisoidut ja eivät täten ole "luonnollisesti esiintyviä".
Optimaalista geeniekspressiota varten nukleotidisekvenssien, jotka ympäröivät 30 translationaalista aloituskodonia ATG, on havaittu olevan tärkeitä eläinsoluissa. Esi- .
I merkiksi Kozak, Microbiol. Reviews (1983)47:1-45, on tutkinut laajalti näiden alueiden vaikutusta polypeptidien, kuten insuliini COS-soluissa, ekspressioon. Täten voi olla tarpeellista modifioida aloituskohtaa ympäröiviä nukleotidisekvenssejä.
Tämä voidaan tehdä kohdennetulla mutageneesillä tai fuusioimalla eksogeeninen 35 geeni suuresti ekspressoidun geenin aloitusalueeseen.
12 104424
Valaisevat transkriptionaaliset säätelyalueet tai promoottorit sisältävät, bakteereilla, β-gal-promoottorin, lambda-vasen ja -oikea promoottorit, trp- ja lac-promoottorit, trp-lac-fuusiopromoottorin, jne; hiivalla glykolyyttiset entsyymipromoottorit, kuten ADH-I- ja-II-promoottorit, GPK-promoottori ja PGI-promoottori, TRP-promoottori, 5 jne.; nisäkässoluilla varhaiset ja myöhäiset SV40-promoottorit, suuremmat myöhäiset adenoviruspromoottorit, jne.
Milloin transkriptionaalisessa säätelyalueessa on lisäksi säätelysekvenssejä, jotka sallivat rakennegeenin ekspression olevan moduloitavissa, esim. ravinteiden tai ek-10 spressiotuotteiden läsnäololla tai puuttumisella kasvualustassa, lämpötilalla jne., säätelysekvenssissä voi olla bakteriofagi-lambda-PL-promoottori yhdessä bakterio-fagi-lambda-0L-operaattorin kanssa ja lämpötilasensitiivinen CI857-repressori, esimerkiksi huolehtimaan rakennegeenin lämpötilasensitiivisestä ekspressiosta. Promoottorin säätely saavutetaan repressorin ja operaattorin välisellä vuorovaikutuk-15 sella.
Eukaryoottisissa soluissa säätelysekvensseissä voi olla esimerkiksi cytomegalovirus vahvistajasekvenssi, joka voi olla fuusioitunut promoottorisekvenssiin, kuten SV40-promoottori, muodostaen kimeerisen promoottorin, tai insertoitunut muualle 20 ekspressiokasetissa, edullisesti promoottorisekvenssin tiiviiseen läheisyyteen. Rakennegeenin ekspressiota voidaan myös amplifioida, esimerkiksi ligoimalla tandemissa dominoivan amplifioitavan geneettisen markkerin geeni 5' tai 3' rakennegee-niin ja kasvattamalla isäntäsoluja selektiivisissä olosuhteissa. Esimerkki amplifioita-vasta geenistä on dihydrofolaattireduktaasigeeni (dhfr), jonka ekspressiota voidaan 1 :* 25 lisätä soluissa, jotka on tehty resistenteiksi metotreksaatille (mtx), folaattiantagonis- ti.
Erityisen kiinnostavia ovat ekspressiokasetit, jotka kykenevät ekspressoimaan onko-statiini M:ää, joka käyttää lac-operaattori-promoottoria, tac-promoottoria tai lambda 30 PL-promoottori-OL-operaattoria ja lämpötilasensitiivistä repressoria, erityisesti λ-Cro, lac- tai N-geeni-ribosomisitomiskohdan yhteydessä. Rakennegeeni on liittynyt ; myötävirtaan ribosomin sitomiskohdasta niin, että se on transkriptionaan sen säätely- alueen ja translationaalisen säätelyalueen säätelykontrollin alaisena. Tämä on kuvattu USSN 264 098:ssa, jätetty lokakuun 28. 1988, joka esitys on liitetty tähän viit-35 teeksi.
• « 13 104424
Ekspressiotuotteen stabiilius voidaan saavuttaa suorittamalla fuusioituneen proteiinin, jossa on N-terminaalisia aminohappoja, esimerkiksi bakteriofagi-lambda-N-geenistä tai -Cro-geenistä tai bakteerien alkalisesta fosfataasigeenistä, synteesi. Sig-naalisekvenssi on vastavirtaan ja lulukuraamissa rakennegeeniin nähden. Kiin-5 nostaviin signaalisekvensseihin kuuluu noin 8 - noin 15, edullisesti noin 15 - noin 25 N-terminaalista aminohappoa prokaryoottisesta geenistä, esimerkiksi bakterio-fagi-lambda-N-geeni tai -Cro-geeni tai bakteerin alkalinen fosfataasigeeni. Katso esimerkiksi USSN 264 098, jätetty lokakuun 28. 1988.
i 10 Lisäksi fuusioitunut geeni voidaan valmistaa järjestämällä 5'-sekvenssi rakennegeeniin, joka koodaa erityssignaalia ja prosessointisignaalia. Valaiseviin erityssig-naaleihin kuuluvat penisillinaasin, a-faktorin, immunoglobuliinien, T-soluresepto-rien, ulompien membraaniproteiinien, seerumialbumiinin, insuliinin, ruoansulatuskanavan entsyymien, β-transformoivan kasvutekijän ja sen kaltaisten erittävät _ 15 signaalit. Fuusioimalla erittävä signaali oikeaan lukuraamiin rakennegeenin kanssa valmis onkostatiini M tai analogi saatetaan erittää alustaan. Ks. esim. USSN 144 574, jätetty tammikuun 15. 1988, joka esitys on liitetty tähän viitteeksi.
Ainakin yksi lisäaminohappo voidaan insertoida rakennegeenin ja signaalisekvens-20 sin väliin, välissä olevan (olevien) aminohapon (aminohappojen) huolehtiessa esimerkiksi entsymaattisesta tai kemiallisesta pilkkomiskohdasta fuusioproteiinin pilkkomista varten. Vaihtoehtoisesti fuusioproteiinilla, joka koostuu signaalisekvenssis- : tä ja rakennegeenituotteesta, saattaa olla käyttöä ilman valmiin polypeptidin pilkkomista.
25
Ekspressiokasetti voi olla replikaatiosysteemissä episomaalista säilyttämistä varten " sopivassa soluisännässä tai se voi olla ilman replikaatiosysteemiä, jolloin se saattaa integroitua isännän genomiin. DNA voidaan viedä isäntään tunnetuilla tekniikoilla, 17 kuten transformaatio, transfektio käyttämällä kalsiumfosfaattisaostettua DNA:ta, 30 elektroporaatio, transfektio rekombinanttiviruksella, DNA:n mikroinjektio soluihin 'l tai sen kaltaiset.
Kun rakennegeeni kerran on viety sopivaan isäntään, isäntää voidaan kasvattaa ekspressoimaan rakennegeeniä. Isäntäsolua voidaan kasvattaa erittäin tiheäksi sopi-35 vassa alustassa. Kun promoottori on indusoituva, kuten prokaryoottisessa systeemissä, käytetään permissiivisiä olosuhteita, esimerkiksi lämpötilan muutos, näännyttä-
• 2_I
: minen tai ylimäärä metabolista tuotetta tai ravinnetta tai sen kaltaista. Nisäkässys- 14 104424 teemissä, jossa käytetään amplifioitavaa geeniä tandemissa rakennegeenin kanssa, voidaan käyttää sopivia keinoja amplifiointiin.
Kun suoritetaan eritys, voidaan ekspressiotuote, joko fuusioitunut tai ei-fuusioitu-5 nut, eristää kasvualustasta tavanomaisin keinoin. Kun eritystä ei suoriteta, voidaan isäntäsolut kerätä ja lyysata tavanomaisten ehtojen mukaisesti. Sitten toivottu tuote eristetään ja puhdistetaan tunnettujen tekniikkojen mukaisesti, kuten kromatografia, elektroforeesi, liuotinuutto tai sen kaltaiset.
10 Rekombinanttituotteet voivat olla glykosyloituneita tai ei-glykosyloituneita, ja niillä voi olla villityypin tai muu glykosylaatio. Yleensä glykosylaatio ei eroa enempää kuin noin 50 %, tavallisesti ei enempää kuin noin 20 % villityypin glykosylaatiosta. Glykosylaation määrä riippuu osittain erityisen peptidin sekvenssistä, samoin kuin organismista, jossa sitä tuotetaan. Täten tuotteiden ekspressointi R coli -soluissa 15 johtaa glykosyloimattomaan tuotteeseen ja tuotteen ekspressio hyönteissoluissa johtaa yleensä vähempään glykosylaatioon kuin tuotteen ekspressio nisäkässoluissa.
5.1. Onkostatiini M -mutanttien ja -analogien käytöt 20 Onkostatiini M -mutantti- ja -analogipolypeptidejä ja niiden koostumuksia voidaan käyttää tekemään vasta-aineita, joilla voi olla käyttöä in vivo tai in vitro. Vasta-aineet voidaan valmistaa tavanomaisin tavoin, joko käyttämällä kohteen polypepti-diä immunogeeninä ja injektoimalla polypeptidi nisäkäsisäntään, esim. hiiri, lehmä, vuohi, lammas, kani, jne., erityisesti adjuvantin kanssa, esim. Freundin täydellinen □ · : 25 adjuvantti, alumiinihydroksidigeeli tai sen kaltaiset. Isännästä voidaan sitten ottaa veri, ja veri käytetään polyklonaalisten vasta-aineiden eristämiseen tai hiiren tapauksessa perifeeriset veren lymfosyytit tai pernaan liittyvät lymfosyytit (B-solut) käytet-
J
tiin fuusioon sopivan myeloomasolun kanssa tekemään kromosomit kuolemattomiksi kohteen yhdisteille spesifisten vasta-aineiden monoklonaalista eks-pressiota var-30 ten. Voidaan valmistaa joko polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita.
I i is Onkostatiini M -mutantteja, -analogeja ja niiden koostumuksia voidaan käyttää li- gandeina havaitsemaan onkostatiini M -reseptorien läsnäolo. Tällä tavalla solut voi-daan erottaa onkostatiini M -reseptorien läsnäolon ja tiheyden mukaisesti tarkkaile-, 35 maila erilaisten yhdisteiden vaikutusta sellaisiin reseptoreihin samoin kuin määrit tämällä annetun solun sensitiivisyys tietyn onkostatiini M -mutantin tai -analogin vaikutuksiin. Lisäksi peptidit, joilla uskotaan olevan onkostatiini M:n kaltaista bio- 15 104424 logista aktivisuutta, voidaan arvioida vertaamalla niiden kykyä sitoutua onkostatiini M -reseptoriin luonnollisesti esiintyvän onkostatiini M:n kyvyn kanssa. Yleisesti testipeptidit voidaan arvioida inkuboimalla testipeptidiä yhdessä leimatun onkostatiini M:n tai muun peptidin kanssa, joka sitoutuu suurella affiniteetilla onkostatiini 5 M -reseptoriin valmisteen kanssa, jossa on onkostatiini M -reseptoreita, ja havaitsemalla leimatun onkostatiini M:n sitoutumisen inhibition määrä, kuten seuraavissa esimerkeissä kuvataan. Sen arvioiminen, ovatko testipeptidit, jotka sitoutuvat reseptoriin, onkostatiini M -agonisteja vai -antagonisteja, voidaan sitten tehdä havaitsemalla niiden vaikutus biologiseen toimintaan, joka liittyy onkostatiini M:ään, esi-10 merkiksi kasvainsolujen kasvun inhibitio, kuten seuraavissa esimerkeissä kuvataan.
Onkostatiini M -mutantteja, -analogeja ja niiden koostumuksia voidaan käyttää neo-plastisten tilojen laajan kirjon käsittelyyn, kuten karsinoomat, sarkoomat, melanoomat, lymfoomat, leukemiat, jotka voivat vaikuttaa suureen määrään elimiä, kuten I
15 veri, keuhkot, nisäelimeen, eturauhanen, suoli, maksa, sydän, iho, haima, aivot, jne.
Niitä voidaan antaa in vivo injektoimalla, haavansisäisesti, vatsakalvon sisäisesti, ihonalaisesti tai millä muulla tahansa sopivalla antotavalla. Antomuoto voi olla missä tahansa fysiologisesti hyväksyttävässä kantajassa, kuten steriloitu vesi, fos-faattipuskuroitu suolaliuos, suolaliuos, vesipitoinen etanoli, jne. Kohteena olevaa 20 yhdistettä voidaan käyttää in vitro eliminoimaan pahanlaatuisia soluja luuytimestä autologista luuytimen siirronnaista varten tai inhiboimaan tai eliminoimaan pahanlaatuisten solujen lisääntymistä toisessa kudoksessa, esim. veri, ennen reinfuusiota. I
Koostumuksia voidaan myös käyttää antagonisteina onkostatiini M:n indusoimalle Kaposin sarkooman kasvua stimuloivalle aktiivisuudelle tai stimuloimaan DNA-25 replikaatiota ICS-soluissa muuttamalla ne sensitiivisemmiksi kemoterapeuttisia lääkkeitä vastaan.
Onkostatiini M -mutantteja, -analogeja ja niiden koostumuksia voidaan käyttää : veren muodostumiseen liittyvän systeemin häiriöiden käsittelyyn, etenkin keinoilla,
30 joissa stimuloidaan verisolujen muodostumista potilaissa, joilla on tukahdutettu I
luuydin-toiminta, esimerkiksi potilaat, joilla on aplastinen anemia, peritty tai hankittu immuunikato tai potilaissa, jotka saavat radioterapiaa tai kemoterapiaa. = *
Onkostatiini M -mutantteja, -analogeja ja niiden koostumuksia käytetään myös lu-35 kuisten haavojen käsittelyssä, sisältäen olennaisesti kaikki ihoon liittyvät haavat, sarveiskalvoon liittyvät haavat ja kehon epiteelillä reunustettujen onttojen elinten vauriot. Käsittelyä varten sopiviin haavoihin kuuluvat ne, jotka seuraavat vauriosta, 16 104424 kuten palovammat, hiertymät, viillot ja sen kaltaiset, samoin kuin kirurgisista proseduureista, kuten kirurginen avaaminen ja ihon siirtäminen. Muihin olosuhteisiin, jotka ovat sopivia käsiteltäviksi tämän keksinnön koostumuksilla, ovat krooniset olotilat, kuten krooniset haavat, sokeritautiin liittyvät haavat ja muut ei-parantuvat 5 (kudosravitsemukselliset) olotilat. Kohteena olevat yhdisteet voidaan liittää fysiologisesti hyväksyttäviin kantajiin käytettäväksi vahingoittuneeseen alueeseen. Kantajien luonne voi vaihdella laajasti ja riippuu käytön aiotusta sijainnista. Iholle käytettäväksi on voide tai voiteen perusaine tavallisesti edullista, sopivia emäksiä ovat lanoliini, Silvadene (Marion) (erityisesti palohaavojen hoitamiseen), Aquaphor 10 (Duke Laboratories, South Norwalk, Conneticut) ja sen kaltaiset. Jos toivottua, on mahdollista liittää onkostatiini M -analogi- tai -mutanttikoostumukset siteisiin ja muihin haavan sidontatarvikkeisiin huolehtimaan haavan jatkuvasta altistamisesta peptidille. Aerosolisovellutuksia voidaan myös käyttää.
15 Polypeptidin konsentraatio ei ole kriittinen käsittelykoostumuksessa. Polypeptidiä on läsnä epiteelisolun lisääntymistä indusoiva määrä. Koostumusta käytetään paikallisesti vahingoittuneeseen alueeseen, tyypillisesti silmätippoina silmään tai voiteina, voiteina tai liuoksina iholle. Silmien tapauksessa usein toistuva käsittely on toivottavaa, tavallisesti lisätään 4 h väliajoin tai tiheämmin. Iholle on toivottavaa 20 käsittelykoostumuksen jatkuva ylläpito vahingoittuneella alueella parantumisen aikana,jolloin hoitokoostumusta käytetään 2-4 kertaa päivässä tai useammin.
Kohteena olevat koostumukset voidaan formuloida lukuisilla tavoilla, myös liposo-mien onteloihin, erityisesti silloin kun liposomien on tarkoitus sisältää molekyylejä, 25 jotka on kohdistettu tiettyjä neoplastisia soluja kohti, esim. vasta-aineita, ei-hajoavia partikkelimatriiseja ja sen kaltaisia. Muita komponentteja voidaan liittää formu-laatioihin, kuten puskureja, stabilisaattoreja, surfaktantteja, biosidija, jne. Näistä komponenteista on runsaasti valaisevia esimerkkejä kirjallisuudessa eikä niitä tarvitse erityisesti kuvata tässä.
30
Seuraavissa esimerkeissä saadut tulokset osoittavat, että jotkin mutanttionkostatiini M -polypeptidit säilyttävät bioaktiivisuuden ja joissakin tapauksissa niillä on lisääntynyt bioaktiivisuus. Koostumuksia, joissa on sellaisia mutantteja, voidaan käyttää solulisääntymisen säätelyyn sekä in vivo että in vitro, kuten viljelmässä, valkosolu-35 jen erottamisessa luovutetusta verestä, ehkäisevissä ja terapeuttisissa sovellutuksissa in vivo, jne. Eräs erityinen sovellutus koskee biologisesti aktiivisten onkostatiini M -mutanttipolypeptidien käyttöä käsittelemään soluja autologista luuydinsiirrän- 17 104424 näistä varten inhiboimalla kasvainsolujen kasvun luuytimessä ja stimuloimalla pesäkesolun muodostusta. Toinen spesifinen sovellutus koskee onkostatiini M -mu· tanttien käyttöä stimuloimaan epiteelisolujen kasvua täten edistäen haavan parantumista. Lisäksi mutanttipolypeptidejä voidaan käyttää immunogeeneinä indusoi-5 maan vasta-aineen muodostumista. Indusoituja vasta-aineita voidaan käyttää titraa-maan kehon nesteissä läsnä olevia onkostatiini M -tasoja ja/tai moduloimaan faktorin aktiivisuutta sitoutumalla siihen.
Vaikka keksintöä kuvataan joiltakin osin yksityiskohtaisesti kuvaavalla tavalla, on 10 ammattimiehille ilman muuta selvää, että tiettyjä muutoksia ja modifikaatioita voidaan tehdä ilman että erotaan liitteenä olevien patenttivaatimusten hengestä ja tarkoituksesta. Seuraavat esimerkit annetaan valaisevassa eikä rajoittavassa tarkoituksessa.
15 6. Esimerkki
Onkostatiini M -mutanttien ekspressio ja luonnehtiminen 6.1. Materiaalit ja menetelmät 6.1.1. Soluviljelmä 20 A375 melanooma-, H2981- ja COS-soluja kasvatettiin Dulbecco's Modified Eagle alustalla (DMEM), johon oli lisätty 10 % naudan sikiön seerumia (FBS).
6.1.2. Kasvuinhibitiomääritys 25 Kasvuinhibitioaktiivisuus (GIA) mitattiin värin sitomismäärityksellä. A375-mela-noomasolut (3-4 x 103) ympättiin 0,1 ml:n tilavuudessa DMEM:ää, jossa oli 10 % naudan sikiön seerumia (FBS) 96 kaivon mikrotiitterimaljoille. Lisättiin erilaisia :
onkostatiini M -konsentraatioita 0,1 ml tilavuudessa ja inkubointia 37 °C:ssa jatkettiin 72 h. Kasvatusviljelmä poistettiin, solut värjättiin kristallivioletilla ja suhteel-30 linen solulisääntyminen määritettiin mittaamalla sidottu väri mikrotiitterimaljaluki- F
jalla (Genetic Systems Corp., Seattle, WA) absorbanssilla 590 nm:ssä. Solulisäänty-mistä onkostatiini M:n läsnäollessa verrattiin lisääntymiseen käsittelemättömissä näytteissä ja ilmaistaan maksimikasvun inhibition prosenttiosuutena. Näytteet määritettiin kaksoiskappaleina tai kolmoiskappaleina. Onkostatiini M:n GIA-yksiköt 35 määritettiin inhibitiokäyristä ja kuvataan sinä proteiinimääränä, joka tarvitaan inhi- I
boimaan 50 %:lla A375-solujen kasvua standardimäärityksessä. Kun GIA-yksiköt Γ 18 104424 normalisoitiin proteiinikonsentraatiolle, vaihtelukerroin normalisoiduille arvoille oli yleensä <20 %.
6.1.3. Radioreseptorimääritys 5 H2981-solut ympättiin 1-3 x 105/cm tiheytenä 48 kaivon muovimaljoille 16-24 h ennen onkostatiini M -käsittelyä. Yksikerroksisia inkuboitiin 125I-onkostatiini M:n kanssa (20 ng/ml, 0,7 nM) 0,1 ml tilavuudessa sitomispuskuria (Linsley et ai., 1986, Biochemistry 25: 2978-2986), jossa oli kasvavat määrät onkostatiini M:ää tai mu-10 tanttionkostatiini M:ää. Sitomisreaktioita suoritettiin 2-4 h 23 °C:ssa. Ei-spesifistä sitoutumista mitattiin 50-100-kertaisen ylimäärän leimaamattoman onkostatiini M:n läsnäollessa. Spesifinen sitominen laskettiin vähentämällä radioaktiivisuus, joka oli sitoutunut ylimäärän leimaamattoman onkostatiini M:n läsnäollessa, kokonaissitou-tumisesta ja yleensä vaihteli 70-95 % kokonaissitoutumisesta. Vaihtelu toistettujen 15 määritysten välillä oli yleensä vähemmän kuin 10 %. Radioreseptorimääritysyksiköt (RRA-yksiköt) määritettiin inhibitiokäyristä, jotka saatiin leimaamattoman onkostatiini M:n kasvavien määrien läsnäollessa. Yksi RRA-yksikkö kuvataan siksi onkostatiini M -määräksi, joka vaaditaan 50 % 125I-onkostatiini M -sitomisen inhibitioon standardimäärityksessä.
20
Spesifiset aktiivisuusarvot, jotka laskettiin GIA:na tai RRA:na (yksikköä/mg) vaih-telivat kokeiden välillä jopa kaksinkertaisesti. Kokeen sisällä spesifiset aktiivisuus-muuntelut vaihtelivat 15-30 % johtuen suureksi osaksi muuntelusta immunoreaktii-visen proteiinin määrän paljouden määrittämisessä kasvatusalustassa. Suhteelliset 25 spesifiset aktiviteettiarvot osoittavat mutantin spesifisen aktiivisuuden prosentin suhteessa rekombinantti "villityypin" onkostatiini M:n spesifiseen aktiivisuuteen. Johdettu vaihtelukerroin suhteelliselle spesifiselle aktiivisuudelle vaihteli 22-45 %, laskettuna neliöjuuren keskiarvona. Mutaatioiden, jotka johtivat suhteellisiin spesifisiin aktiivisuusarvoihin, jotka olivat vähemmän kuin 10 % rekombinanttisen 30 "villityypin" onkostatiini M:stä, katsotaan menettäneen biologista aktiivisuutta.
6.1.4. Radioimmunomääritys
Viljely alusta, jossa ei ollut seerumia, laimennettiin DM-EM:ään, lisättiin ditiotreito-35 lia 10 mM:n konsentraatioksi ja proteiinit denaturoitiin keittämällä. Tämä käsittely lisää onkostatiini M:n myöhempää immunoreaktiivisuutta. Sitten tehtiin käsitellyn ; alustan sarjalaimennukset nitroselluloosamembraanille slot-blot-laitteen läpi 19 104424
(Millipore). Sitten membraaneille tehtiin immunoblotting-analyysi, kuten on ku- I
vattu (Linsley et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:356-360) käyttämällä ' , » · < , inc anti-6-19-antiseerumia (Section 6. 1.5., infra) ja I-proteiini A:ta havaitsemiseen. Standardikäyrät tehtiin käyttämällä puhdistettua onkostatiini M:ää, joka oli laimen-5 nettu alustaan, jossa ei ollut seerumia, valetransfektoiduista soluista. Juovien intensiivisyydet autoradiogrammeilla mitattiin skanning-densitometrillä ja onkostatiini M ! -määrä alustassa transfektoiduista soluista määritettiin vertaamalla standardikäyriin.
Useimmissa tapauksissa onkostatiini M -määrät, jotka mitatttiin useissa alustalai- , mennuksissa, jotka antoivat vyöhykevoimakkuuksia standardikäyrän lineaariselta 10 osalta, olivat keskiarvoja; näiden mittausten vaihtelukertoimet olivat yleensä < 10%.
6.1.5. Antiseerumit 15 Peptidit, jotka vastasivat onkostatiini M:n aminohappoja 6-19 ja 206-218 (kuvio 1) syntetisoitiin kiinteän faasin tekniikoilla. Peptidit konjugoitiin naudan immuno-globuliiniin (peptidit 6-19) tai avaimenreikäkotilon hemosyaniiniin (peptidit 206-218) ja kanit immunisoitiin kuten kuvattiin (Gentry et ai., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 3418-3427; Linsley et ai., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 356-360). Anti-6-20 19:ta varten käytettiin 1:1 seerumien seosta kahdesta immunisoidusta kanista.
6.1.6. COS-solutransfektiot COS-solut transfektoitiin onkostatiini M -mutanttia koodaavilla plasmideilla, kuten 25 kuvattiin (Malik, et ai., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 2847-2853). 24 h transfektion jälkeen lisättiin alustaa, jossa ei ollut seerumia ja soluja inkuboitiin 37 °C:ssa vielä 48 h. Konditioitu alusta kerättiin ja analysoitiin.
6.2. Ekspressioplasmidien rakentaminen 30 «
Malik et ai., 1989 Mol. Cell. Biol. 9: 2847-2853, kuvaavat onkostatiini M cDNA- : ekspressioplasmidin, pSPOM. Linsley et ai., 1989, J. Biol. Chem. 264: 4282-89, ‘ kuvaavat ekspressioplasmidin, jossa sekvenssi, joka koodaa onkostatiini M -signaa- lisekvenssiä, korvataan sekvenssillä, joka koodaa simian TGF-βΙ -signaalipeptidiä 35 (tässä viitattu pP-OM:na).
9 20 104424 6.2.1. Deleetiomutanttirakenteet
Onkostatiini M -deleetiomutantit (lopetuskodoni-insertiomutantit) Δ182-227, Δ183-227, Δ184-227, Δ186-227, Δ187-227, Δ188-227, Δ189-227, Δ190-227, Δ195-227 ja 5 Dl96-227 rakennettiin PCR-amplifikaatiolla 3'-oligonukleotidialukkeilla, jotka koo-daavat lopetuskodonia, ja kloonauskohdan kanssa. Mutantit Δ191 ja Δ185 rakennettiin rajoitetulla eksonukleaasipilkkomisella (Henikoff, 1984 Gene 28: 351-359) onkostatiini M:n koodausalueen 3'-päästä. Lyhyesti, onkostatiini M cDNA alakloo-nattiin plasmidiin pSP64 (Promega), linearisoitiin läheltä cDNA:n 3'-päätä ja sille 10 tehtiin rajoitettu pilkkominen eksonukleaasi 111:11a. Pilkottujen cDNA:n 3'-päät tehtiin tylpiksi Klenowin DNA polymeraasi I -fragmentilla. Tylpistetyt cDNA:t leikattiin pois pSP64:stä manipuloidusta Hindlll-kohdasta 37 emästä 5' translaation aloituskohtaan ja kloonattiin HindIII-Xho 1 -pilkottuun 7tH3MPY:hyn (Stamenkovic, 1989, EMBO J.) käyttämällä synteettisiä oligonukleotidilinkkereitä : 15 TAGGTGAATGATCAC ja TCGAGTGATCATTCACCTA, jotka koodaavat lope- tuskodoneita jokaisessa lukuraamissa ja niissä on yliriippuva pää, joka on komplementaarinen Xhol-restriktiokohdan kanssa. Yksittäiset kloonit, joilla on lopetusko-donit vietynä asemiin 183 ja 190 (Δ183-227 ja Δ190-227) tunnistettiin DNA-sek-venssianalyysillä. Muut deleetiomutantit valmistettiin samalla lailla.
20
Useita onkostatiini M -deleetiomutantteja (Δ44-47, Δ87-89, Δ118-121, Δ152-155 ja Δ178-181) rakennettiin lisää käyttämällä silmukointi-deleetiomenetelmää (Kramer et ai., supra). Mutanttirakenteet alakloonattiin Hindlll-XhoI-kohtaan pH3MPY:llä, seulottiin restriktioanalyysillä ja varmistettiin sekvensoimalla koko koodausalue.
25 6.2.2. Prosessointimutanttien rakentaminen
Mutanttikloonit G195 ja G196 rakennettiin oligonukleotidi-kohdistetulla mutage-neesillä käyttämällä kaupallisia tarvikkeita (Amersham). Huonosti yhteen sopivia 30 oligonukleotidejä, jotka ohjaavat arginiinijäännösten muuttumisen asemissa 195 tai 196 glysiiniksi, syntetisoitiin ja käytettiin kuten toimittaja yksityiskohtaisesti esitti rakentamaan mutanttiklooneja. Kloonien G195 ja G196 mutatoitujen alueiden sekvenssi vahvistettiin DNA-sekvenssianalyysillä.
35 Mutanttiklooni G195 rakennettiin modifioimalla oligonukleotidimutageneesiprose-duuria. Uudelleen polymerisoinnin ja aukollisen M13-faagi-DNA:n ligaation jälkeen amplifioitiin onkostatiini M cDNA käyttämällä Tac-polymeraasiketjureaktiota (Per- 21 104424 kin Elmer Cetus), käyttämällä M13 yleisiä eteenpäin suunnattuja ja käänteisaluk-keita. Sitten amplifioitu cDNA alakloonattiin HindlH-XhoI-pilkottuun pH3MPY:hyn ja mutanttikloonit tunnistettiin restriktioanalyysillä ja/tai DNA-sek-vensoinnilla. Sitten mutatoidut koodausalueet varmistettiin sekvenssianalyysillä.
5 G195:n sekvenssianalyysi paljasti, että onkostatiini M:n toinen aminohappo (alanii- ni) oli vaihdettu valimiksi mutageneesin aikana tapahtuneen toisen mutaation seurauksena. G196 puhdistettiin kahdella kierroksella kaksivaiheista proseduuria, joka koostui ensimmäisestä käänteisfaasikromatografiavaiheesta, minkä jälkeen oli koko-fraktiointi.
10 6.2.3. Substituutiomutanttirakenteet
Mutanttikloonit S5, S49, S80, S127 S167 ja S6/S167 rakennettiin oligonukleotidi-mutageneesillä, kuten kappaleessa 6.2.2, supra, kuvattiin. Huonosti yhteen sopivia 15 oligonukleotidejä, jotka ohjaavat kysteiinien muuttumista asemissa 6, 49, 80, 127, 167 ja 6 + 167, syntetisoitiin ja käytettiin rakentamaan mutanttiklooneja. Mutantti-rakenteet alakloonattiin pH3MPY:n Hindlll-XhoI-kohtaan. Saatujen kloonien mutatoidut koodausalueet vahvistettiin DNA-sekvensointianalyysillä.
20 6.2.4. Insertiomutanttien rakentaminen
Mutanttikloonit GAG6, GAG77, GAG14 ja GAG140 rakennettiin oligonukleotidi-kohdistetulla in vitro -mutageneesillä, kuten kappaleessa 6.2.2, supra, kuvattiin. Mutanttirakenteet alakloonattiin pH3MPY:n Hindlll-XhoI-kohtaan. Mutatoidut koo- : 25 dausalueet vahvistettiin DNA-sekvensointianalyysillä.
6.3. Onkostatiini M -mutanttien bioaktiivisuus 6.3.1 Deleetio- ja prosessointimutantit 30 COS-solujen alusta, jossa ei ollut seerumia, transfektoitiin plasmideilla, jotka koo- ~ dasivat prosessointimutantteja G195 ja G196 (kappale 6.2.2, supra) ja deleetio-mutantti Δ195 ja Δ190 (kappale 6.2.1., supra) -kloonit analysoitiin immunoblotting- i analyysillä.
35 Solut, jotka oli transfektoitu näillä mutantteja koodaavilla rakenteilla, tuottivat pro- 1 teiineja, jotka reagoivat anti-6-19-seerumin kanssa. Immunoreaktiiviset proteiinit, joita tuotettiin G195:llä ja G196.11a, kulkivat yhdessä Mr36000-proteiinin kanssa, 22 104424 joka oli pSPOM-transfektoiduista soluista (kappale 7, infra), kun taas Δ195 ja Δ196 tuottivat proteiineja, jotka kulkivat lähempänä Mr32000-proteiinia. Kun anti-208-219-seerumia käytettiin analyysiin, havaittiin Mr36000-muoto G195-ja G196-trans-fektoiduista soluista, mutta Δ195 ja Δ190 tuottamat proteiinit epäonnistuivat reagoi-5 maan. Täten tuomalla pistemutaatioita mahdolliseen prosessointikohtaan estettiin Mr32000-muodon akkumulaatio, kun taas deleetiomutaatiot juuri vastavirtaan tästä kohdasta estivät onkostatiini M Mr36000-muodon akkumulaation.
Nämä tulokset antavat olettaa, että ero onkostatiini M Mr36000- ja Mr32000-muo-10 tojen välillä johtuu proteolyyttisestä prosessoinnista trypsiinin kaltaisessa kohdassa, ; joka alkaa asemasta 193, tai sen lähellä.
Onkostatiini M:n prosessointi-resistenssien mutanttimuotojen (G195 ja G196) biologista aktiivisuutta verrattiin mutanttiproteiinien kanssa, jotka läheisesti vastasivat 15 kooltaan onkostatiini M:n Mr32000-muotoa (Δ190 ja Δ182). Tätä koetta varten käsittelemättömästä konditioidusta transfektoiduista soluista saadusta alustasta, jossa ei ollut seerumia, testattiin GIA- ja RRA-aktiivisuudet, kuten kuvattiin kappaleessa 6.1.2. ja 6.1.3., vastaavasti. Onkostatiini M -konsentraatiot määritettiin ra-dioimmunomäärityksellä, kuten kuvattiin kappaleessa 6.1.4. Kuten taulukossa I 20 nähdään GIA-ja RRA-aktiviteettien suhteet Δ190:11ε ja Δ195 :lle olivat 10-20-kertaa korkeammat kuin G195:n ja G196:n. Alusta soluista, jotka oli transfektoitu mutan-tilla 182, ei antanut merkittävää aktiivisuutta kummassakaan määrityksessä, osoittaen että C-terminaalinen alue jäännöksestä 182-190 oli olennainen sekä kasvua inhiboivalle että sitomisaktiivisuuksille. Alusta pSPOM (kappale 7, infra) -transfek-25 toiduista soluista antoi keskimääräisiä aktiivisuussuhteita, jotka olivat yhdenmukaisia kahden onkostatiini M -muodon, joilla oli erilaiset aktiivisuudet, läsnäolon kanssa tässä näytteessä. Nämä havainnot osoittavat, että onkostatiini M:n mutanttimuodoilla, joita ei ole prosessoitu (G195 ja G196), on vähemmän GIA-aktiivisuutta kuin lyhennetyillä Mr32000-muodoilla (Δ 182 ja Δ190).
30 * · i 23 104424
Taulukko I
Onkostatiini M:n mutanttimuodoilla on erilaiset suhteelliset kasvuinhibitio- ja sito-misaktiivisuudet 5 Näyte GIA-aktiivisuus1 RRA-aktiivisuus1 Suhde2 pSPOM 11,7 (27,2) 2,6 (6,1) 4,5 Δ 195-227 61,7 (74,3) 3,2 (3,8) 19,5 10 Δ 190-227 20,0 (21,7) 0,9 (1,0) 22,5
Δ 182-227 0,02 (0,06) <0,02 (<0,06) N/A
G196 6,6 (8,0) 11,2 (13,5) 0,6 G195 5,0 (8,8) 5,3 (9,3) 0,9 15 Käsittelemättömästä COS-solujen, jotka oli transfektoitu osoitetuilla plasmideilla, alustasta, jossa ei ollut seerumia, testattiin kasvuinhibitio (GIA)- ja radioreseptori (RRA) -aktiivisuudet, kuten esimerkissä 1 kuvattiin. Onkostatiini M -konsentraatiot määritettiin radioimmunomäärityksellä, kuten esimerkissä 1 kuvattiin; konsentraatiot vaihtelivat 0,4-1 pg/nl. N/A ei käyttökelpoinen.
20 1 Yksikköä/ml (x 103); luvut suluissa edustavat spesifisiä aktiivisuuksia.
GIA-aktiivisuuden suhde RRA-aktiivisuuteen.
' 25 G196-mutantin vähentyneen GIA-aktiivisuuden vahvistamiseksi tämä proteiini puhdistettiin homogeeniseksi ja verrattiin onkostatiini M:n Mr32000-muotoon pSPOM-transfektoiduista soluista (kappale 7, infra). Onkostatiini M:n puhdistetulla muodolla Mr32000 oli suurempi GIA-aktiivisuus kuin G196:lla (puolimaksimaaliset aktiivisuudet 6 ja 130 pM:ssä, vastaavasti). Kolmessa erillisessä kokeessa ero kas- ' : 30 vuinhibitioaktiivisuuksissa näiden puhdistettujen proteiinien välillä oli 9-kertainen, 22-kertainen ja 5-kertainen (keskiarvo + keskihajonta (12+ 9-kertainen)). Sitä vastoin kahden puhdistetun proteiinin RRA-aktiivisuuksia oli mahdoton erottaa (keski- ! määrin 100 pM:n puolimaksimaaliset aktiivisuudet). RRA:ssa kolme erillistä koetta osoitti, että G196:lla oli keskimäärin 1,1-, 1,1-ja 2-kertaisesti suurempi (1,3 + 0,3-35 kertainen) RRA-aktiivisuus kuin onkostatiini M:n Mr32000-muodolla. Täten puhdis-. . tettu G196 (Mr36000-muoto) sitoutuu onkostatiini M -reseptoriin yhtä hyvin kuin
Mr32000-muoto, mutta sillä on vähemmän GIA-aktiivisuutta.
24 104424
Onkostatiini M:n deleetio-mutanttien kasvuinhibitioaktiivisuuksien vertailu nähdään kuviossa 2. Δ181:11a, A182:lla ja Δ183:11a on minimaalinen kasvuinhibitioaktiivisuus (<1 yksikkö/ng). Kohonnutta kasvuinhibitioaktiivisuutta suhteessa natiiviin onkostatiini M:ään havaittiin Δ195-227-, Δ190-227-, Δ188-227- ja A187-227-onkostatiini 5 M -mutanteilla. Mutantilla Δ187-227 oli korkein aktiivisuus (>14 yksikköä/ng) verrattuna natiiviin onkostatiini M:ään (n. 8 yksikköä/ng). Täten C-terminaalisen alueen olennaisien osien poisto lisää onkostatiini M:n inhibitioaktiivisuutta.
Taulukko II esittää useiden onkostatiini M:n deleetiomutanttien suhteelliset spesifi-10 set kasvuinhibitioaktiivisuudet ja reseptorin sitomisaktiivisuudet. Nämä tiedot vahvistavat, että C-terminaalisen alueen olennaisien osien poisto lisää onkostatiini M:n inhibitioaktiivisuutta.
Taulukko II
15
Suhteelliset kasvuinhibitio- ja reseptorin sitomisaktiivisuudet, jotka johtuvat mutaatioista C-terminuksessa
Suhteellinen spesifinen aktiivisuus (%) 20 Mutantti GIA RRA n Δ196-227 171 73 Δ191-227 90+30 26+13 3 Δ190-227 99 68 i: 25 Δ189-227 197+57 42+1 2 Δ188-227 135 54 Δ187-227 66+31 21+5 2 Δ186-227 60+30 20+4 2 Δ185-227 17 2 30 Δ184-227 2 <1 Δ183-227 <2 <1 2 ' w Δ182-227 <3 <1 2
Seerumittomasta alustasta COS-soluista, jotka oli transfektoitu osoitetuilla onkosta-35 tiini M -mutanteilla, testattiin kasvuinhibitio (GIA)- ja radioreseptori (RRA) -aktiivisuudet. Onkostatiini M -konsentraatiot määritettiin kvantitatiivisella immunoblot- > * : ting-menetelmällä ja ne vaihtelivat 0,2-1,0 pg/nl. Arvot osoittavat mutanttien spesi- 25 104424 fisen aktiivisuuden prosentin suhteessa villityypin rekombinanttiseen onkostatiini M:ään, joka testattiin samassa kokeessa ja laskettiin mutantin spesifinen aktiivisuus / villityypin onkostatiini M x 100:n spesifinen aktiivisuus. Kokeiden lukumäärä ilmaistaan "n":llä.
5 6.3.2. Substituutiomutantit
Mutanttiklooneista, jotka valmistettiin kuten kappaleessa 6.2.3., supra, kuvattiin, ; testattiin kasvuinhibitioaktiivisuus. Kuviossa 3 esitetyt tulokset osoittavat, että kys-10 teiinit asemissa 49 ja 167 ovat olennaisia biologiselle aktiivisuudelle, samoin kuin mutanteilla, joilta puuttuvat nämä jäännökset (S49, S167 ja S6/167), oli minimaalinen tai ei lainkaan biologista aktiivisuutta. Substituutiomutanteilla S6, S80 ja S127 oli biologiset aktiivisuudet, jotka olivat vastaavat kuin tai suuremmat kuin natiivin onkostatiini M:n aktiivisuus, tulokset, jotka osoittavat, että kysteiinit asemissa 6, 80 15 ja 127 eivät ole olennaisia onkostatiini M GIA:lle. Tosiasiassa kys-teiinin vaihto asemassa 80 seriiniin johti vähäiseen mutta merkittävään bioaktiivisuuden kasvuun.
6.3.3. Onkostatiini M -mutaatiot, joihin liittyy aminohappojen deleetioita ja insertioita 20
Skanningdeleetio- ja insertiomutantit valmistettiin kuten kappaleessa 6.2.1 ja 6.2.4, vastaavasti, kuvattiin ja niistä testattiin kasvuinhibitio- ja radioreseptoriaktiivisuudet (taulukko 3). Deleetiomutantit Δ22-36 ja Δ44-47 menettivät kaikki GIA- ja RRA-aktiivisuudet, kun taas mutantilla Δ87-90 oli korkeampi spesifinen aktiivisuus kuin 25 villityypin onkostatiini M:llä. Deleetiomutantilla Δ152-155 oli keskimääräinen suhteellinen spesifinen aktiivisuus. Gly-Ala-Gly-insertio aminohappoasemien 5 ja 5,
103 ja 104, ja 139 ja 140 väliin johti merkityksettömään biologisen aktiivisuuden menettämiseen. Suhteelliset spesifiset GIA- ja RRA-aktiivisuudet olivat merkittävästi vähentyneet, kun Gly-Ala-Gly-sekvenssin insertio oli aminohappoasemien 76 ja 30 77 välissä, oletetun N-sitoutuneen glykosylaation tunnistussekvenssin alkaessa ami- I
nohaposta asemassa 75.
Taulukko ΙΠ 35 Suhteelliset spesifiset kasvuinhibitio- ja reseptorin sitomisaktiivisuudet, jotka johtuvat skanningdeleetio- ja insertiomutaatioista 26 104424
Suhteellinen spesifinen aktiivisuus (%)
Mutantti GIA RRA
Δ22-36 <1 <5 5 Δ44-47 <1 <3 Δ87-90 320 260 Δ152-155 39 48 GAG6 58 37 GAG77 8 24 10 GAG104 125 196 GAG140 79 40
Seemmittomasta alustasta COS-soluista, jotka oli transfektoitu osoitetuilla onkosta-tiini M -mutanttirakenteilla (jäännösten deleetio, mukaan luettuina ne numeroidut, 15 jotka nähdään 'W:na, ja Gly-Ala-Gly-jäännösten insertio erikseen mainittuihin kohtiin on osoitettu "GAG":na) testattiin kasvuinhibitio (GIA)- ja radioreseptori (RRA) -aktiivisuudet. Onkostatiini M -konsentraatiot määritettiin kvantitatiivisella immunoblotting-menetelmällä ja ne vaihtelivat 0,14-1,8 pg/nl. Arvot osoittavat mu-tantin spesifisen aktiivisuuden prosentin suhteessa villityypin rekombinanttiseen 20 onkostatiini M:ään, joka testattiin samassa kokeessa, laskettuna mutantin spesifisenä aktiivisuutena / villityypin onkostatiini M x 100 spesifistä aktiivisuutta kohden.
7. Esimerkki
Onkostatiini M:n ekspressio COS-soluissa tuottaa kaksi molekulaarista muotoa 25 7.1. COS-transfektiot COS-solut transfektoitiin pSPOM:lla tai p30M:lla, kuten on kuvattu (Malik, et ai., 1989 Mol. Cell. Biol. 9: 2847-2853). 24 h transfektion jälkeen lisättiin alustaa, jossa ei ollut seerumia, ja soluja inkuboitiin 37 °C:ssa vielä 48 h. Kerättiin konditioitu 30 alusta ja analysoitiin välittömästi tai tehtiin happamaksi etikkahapolla 1 Niksi ja konsentroitiin puhdistusta varten. Alusta, joka oli pSPOM:lla transfektoiduista soluista, sisälsi kaksi proteiinia (Mr36000 ja Mr32000), jotka olivat immunologisesti läheisiä natiivin onkostatiini M:n kanssa, joka oli tehty U937-soluilla, mutta eivät identtisiä 35 kooltaan. Samat proteiinit havaittiin myös, kun COS-solut transfektoitiin rakenteella, joka koodaa onkostatiini M:ää, jonka signaalisekvenssi on korvattu signaalipepti-dillä simian TGF-β 1 :stä (ρβΟΜ). Sekä Mr36000- että Mr32000-proteiinien N-termi- 27 104424 naalinen aminohapposekvensointi paljasti saman N-teiminaalisen sekvenssin kuin luonnon onkostatiini M osoittaen, että ero näiden proteiinien välillä ei ole seurausta N-terminaalisesta sekvenssiheterogeenisuudesta.
5 7.2. Onkostatiini M:n Mr32000-muodon puhdistaminen
Onkostatiini M:n Mr32000-muoto puhdistettiin olennaisesti kuten on kuvattu (Linsley et ai., ja Malik et ai., supra) happamaksi tehdystä ja konsentroidusta alustasta, jossa ei ollut seerumia ja joka oli pSPOMilla transfektoiduista COS-soluista.
10 Kasvuinhibitioaktiivisuuspiikkifraktiot kokofraktioidusta kasvatusalustasta kerättiin ja niille tehtiin lopullinen puhdistus käänteisfaasikromatografialla. Saaduissa valmisteissa oli pääasiallisesti onkostatiini M:n Mr32000-muotoa. Joissakin kokeissa onkostatiini M, jota käytettiin radioleimaukseen 125I:llä tai standardikäyriin radio-immunomäärityksissä, valmistettiin samalla lailla CHO-solujen, jotka ylituottavat 15 rekombinantti-onkostatiini M:ää (Oncogen; Seattle, WA), alustasta, jossa ei ollut seerumia. Tästä puhdistetusta lähteestä oleva onkostatiini M ei osoita immunoreak-tiivisuutta anti-206-218-antiseerumin kanssa ja sillä on ominaisuudet, jotka ovat vastaavat kuin onkostatiini M:n Mr32000-muodolla COS-soluista.
20 7.3. Mr36000-muodot
Onkostatiini M:n Mr36000-muoto pSPOMilla transfektoiduista soluista puhdistettiin osittain kolmivaiheproseduurissa. Kasvualusta, jossa ei ollut seerumia, tehtiin happamaksi ja kokofraktioitiin TSK 3000SW -pylväässä, joka tehtiin 40-prosenttisessa 25 asetonitriilissä, 0,1-prosenttisessa trifluorietikkahapossa. Fraktiot, joissa oli pääasiassa onkostatiini M:n Mr36000-muotoa, tunnistettiin immunoblotting-analyysillä käyttämällä anti-6-9-seerumia, kerättiin, konsentroitiin ja ajettiin uudestaan saman pylvään läpi. Fraktiot, joissa oli immunokemiallisesti puhdasta Mr36000-muotoa (so. ei ollut havaittavasti Mr32000-muotoa), kerättiin ja käytettiin myöhempiin 30 kokeisiin. Puhdistettujen proteiinien konsentraatiot määritettiin aminohappoanalyy-sillä, jonka suoritti Dr. Gary Hathaway (Biotechnology Instrumentation Center,
University of California, Riverside).
7.4. Elektroforeesi 35
Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) tehtiin • " käyttämällä Laemmli-systeemiä (Laemmli, U.K., Nature (1979) 227: 680-685).
28 104424 Käytettiin lineaarisia akryyliamidigradienttigeelejä, joissa oli 5 % akryyliamidiker-rosgeelit. Näytteet ajettiin pelkistävissä olosuhteissa. Geelit värjättiin hopeareagens-silla (BioRad) tai Coomassie-sinellä, väri poistettiin ja kuivattiin ennen valokuvausta. Onkostatiini M.n erilaisten muotojen näennäiset molekyylipainot laskettiin ver-5 taamalla standardeihin, kuten on kuvattu (Malik et ai., supra).
7.5. Onkostatiini M Mr36000:n trypsiinikäsittely
Onkostatiini M:n Mr36000-muoto puhdistettiin osittain kokofraktioinnilla ja suori-10 tettiin lisää puhdistusta käänteisfaasikromatografialla. Saatu valmiste oli n. 80 % puhdas, kuten arvioitiin SDS-PAGE:lla. Näyte-eriä, joissa oli n. 150 ng onkostatiini M:ää (arvioitu RRA:lla), käsiteltiin 37 °C:ssa 6 ng:lla TPCK-käsiteltyä trypsiiniä (Worthington) 30 pl:ssa 50 mM Tris-asetaattia, pH 7,9. Näytteitä inkuboitiin 37 °C:ssa kasvavia aikapituuksia, reaktiot lopetettiin lisäämällä konsentroitua elekt-15 roforeesinäytepuskuria ja immunoblottaamalla anti-16-19-seeramilla tunnistettiin erilaisia onkostatiini M -muotoja.
7.6. Oligosakkaridien poistaminen 20 Ennustetussa onkostatiini M -prekursorisekvenssissä on kaksi mahdollista N-sitoutu-nutta glykosylaatiokohtaa. Jotta määritettiin, voisiko differentiaaliglykosylaatio näissä kohdin selittää eron onkostatiini M Mr36000- ja Mr32000-muotojen välillä, käsiteltiin pSPOM:lla transfektoitujen COS-solujen konditioutua alustaa, jossa ei ollut seerumia, N-glykanaasientsyymillä, joka poistaa N-sitoutuneet oligosakkaridit ! 25 ja immunoreaktiivisuus analysoitiin onkostatiini M:ää vastaan olevalla kohtaspesi- fisellä anti-seerumilla (anti-6-19). Onkostatiini M:n sekä Mr36000- että Mr32000-muotojen liikkuvuudet lisääntyivät tällä käsittelyllä johtaen uusiin lajeihin, Mr n. 34000 ja Mr30000. Molempien fragmenttien liikkuvuuden lisääntyminen on yhdenmukainen yhden N-sitoutuneen oligosakkaridiosan (Mr n. 2000) poiston kanssa jo-30 kaisesta onkostatiini M -muodosta. Koska molempien muotojen liikkuvuudet lisääntyivät rinnakkain, on epätodennäköistä, että differentiaali N-sitoutunut glykosylaatio voisi selittää kokoeron näiden fragmenttien välillä.
29 104424 7.7. Kohtaspesifiset antiseerumit paljastavat erilaiset C-terminukset onkostati-ini M:n M.36000- ja Mr32000-muodoille
Hydropatia-analyysi (Keski-Oji, J. et ai., J. Cell. Biochem. Suppl. (1987) 1 IA: 60) 5 paljasti, että onkostatiini M:n C-terminus (aminohapot n. 190-227) on vahvasti hydrofiilinen. Emäksisissä aminohapoissa (R, K tai H) on 24 38:sta (63 %) jäännöksestä tältä alueelta ja 5 on pariutunutta kaksiemäksistä jäännöstä, jotka voisivat edustaa mahdollisia proteolyyttisiä pilkkomiskohtia. Sen tutkimiseksi, selittääkö C- terminaalinen heterogeenisuus eron Mr36000- ja Mr32000-muotojen välillä, nostet-10 tiin antiseerumeja peptidejä vastaan, jotka vastaavat alueita valmiin onkostatiini M:n N-terminuksesta (Malik et ai., supra ja Zarling, J.M. et ai., 1986, Proc. Natl. Acad.
Sei. 83: 9739-9743) ja C-terminus ennustettiin cDNA-sekvenssistä. Sitten näitä anti-seerumeja käytettiin immunoblotting-kokeissa pSPOM:lla transfektoitujen solujen konditioidun alustan, jossa ei ollut seerumia, ja luonnon U937-solusta johdetun 15 onkostatiini M:n kanssa. Kun anti-6-19-seerumi reagoi pSPOMilla transfektoitujen solujen sekä Mr36000- että Mr32000-muotojen kanssa ja Mr28000 luonnon onkostatiini M:n kanssa U937-soluista, anti-206-218-seerumi reagoi vain onkostatiini M:n Mr36000-muodon kanssa. Molempien antiseerumien spesifisyys osoitettiin vierekkäisten peptidien kyvyllä inhiboida niiden reaktiivisuudet. Nämä tulokset osoitta-20 vat, että erot onkostatiini M Mr36000-ja Mr32000-muotojen välillä voidaan selittää ainakin osittain C-terminaaliheterogeenisuudella, joka oletettavasti johtuu proteo-lyyttisestä prosessoinnista hydrofiilisessä C-terminaalidomeenissa. : 7.8. Onkostatiini M:n M,36000-muodon muuttaminen Mr32000-muodoksi rajoi-25 tetulla proteolyysillä
Sen vahvistamiseksi, että onkostatiini M:n Mr36000-muodon proteolyyttinen pros- : essointi synnyttää Mr32000-muodon, osittain puhdistettu Mr36000-valmiste altistettiin rajoitetulle proteolyysille. Reaktiotuotteet havaittiin anti-6-19-seerumilla.
30 Kasvavalla trypsinaatioajalla nähtiin astettainen väheneminen onkostatiini M:n ' Mr36000-muodon määrässä, samanaikaisesti Mr32000-muodon määrän kasvaessa. :
Pisimpänä mittauspisteaikana väheni Mr32000-muodon määrä ja lisäksi pienimole- = kyylipainoisia immimoreaktiivisia tuotteita havaittiin. Koska Mr32000-tuote reagoi : N-terminaali-spesifisen antiseerumin kanssa, se edustaa onkostatiini M:ää, joka on 35 prosessoitu C-terminukseen. Tämä osoittaa, että proteolyysi lähellä onkostatiini M:n :
Mr36000-muodon C-terminusta voi synnyttää onkostatiini M -muodon, joka on 30 104424 samanlainen kooltaan Mr32000-muodon kanssa, joka on tuotettu pSPOM:lla trans-fektoiduilla soluilla.
7.9. Onkostatiini M:n kasvuinhibitioaktiivisuus (32K- ja 36K-muodot) 5
Konditioitu alusta, jossa ei ollut seerumia, pPOM:llä transfektoiduista soluista fraktioitiin kromatografialla BioGel P60:ssä. Sitten yksittäisistä fraktioista testattiin GLA-aktiivisuus A375-melanoomasoluihin ja immunoreaktiivisuus testattiin anti-6-19:llä. Piikkifraktiot, joissa oli GIA-aktiivisuutta, eluoituivat fraktioiden 35 ja 40 10 välillä, reilusti koko A2go:tä absorboivan materiaalin jälkeen. GIA-aktiivisuuden tarkkaa piikkifraktiota ei voitu määrittää tässä kokeessa, koska piikkifraktioissa oli enemmän aktiivisuutta kuin voitiin tarkasti mitata testatuissa laimennuksissa.
Immunoblotting-analyysi osoitti, että onkostatiini M:n Mr32000-muoto eluoitui 15 fraktioiden kanssa, jossa oli koko GLA-aktiivisuus. Päinvastoin, Mr36000 eluoitui useita fraktioita ennen (piikki fraktiossa 33) GIA-aktiivisuuden pääpiikkiä. Koska fraktiot, joissa oli Mr36000-muoto, värjäytyivät intensiivisemmin, mutta niissä oli vähemmän GIA-aktiivisuutta kuin Mr32000-muodossa, spesifinen Mr36000-muodon GIA-aktiivisuus näyttää olevan vähemmän kuin Mr32000-muodon.
20
Mr32000- ja Mr36000-muotojen biologisten aktiivisuuksien kvantitatiivisten vertailujen suorittamiseksi kerättiin kokofraktioituja fraktioita, joissa oli pääasiassa yksi muoto tai toinen ja verrattiin sekä GLA- että RRA-aktiivisuuksiin. Tähän analyysiin 1 käytettiin erilaista pylvästä (TSK 3000SW), joka antoi laadullisesti samanlaiset tu- 25 lokset kuin BioGel P60, mutta tarjosi paremman erottumisen Mr36000- ja Mr-muotojen välille. Kerätyt fraktiot analysoitiin immunoblottauksella vahvistamaan ristiin kontaminoituminen onkostatiini M:n vaihtoehtoisen muodon kanssa. SDS-PAGE:n jälkeen tehdyt värjättyjen geelien analyysi osoitti, että jokaisen onkostatiini M-muodon puhtaus oli likimäärin 20 % Mr36000-muodolle ja 80 % Mr32000-muo-30 dolle. Kuten taulukossa 4 nähdään, oli osittain puhdistetulla Mr36000:lla vähemmän GIA-aktiivisuutta, mutta enemmän RRA-aktiivisuutta kuin Mr32000-muodolla. Tämä ero on ilmeinen likimäärin 10-kertaisesti suuremmassa suhteessa näiden aktiivisuuksien välillä Mr32000:lle kuin Mr36000:lle.
31 104424
Taulukko IV
Näyte GIÄ-aktiivisuus1 RRA-aktiivisuus1 Suhde2 5 36K-muoto 104 43,5 2,4 32K-muoto 345 17,9 19,2
Fraktiot, joissa oli Mr36000- tai Mr32000-muodot, kerättiin ja näytteistä testattiin kasvuinhibitio (GIA)-ja radioreseptori (RRA) -aktiivisuudet.
10 1 Yksikköä/ml (xlO'3).
2 GIA-aktiivisuuden suhde RRA-aktiivisuuteen.
Claims (12)
1. Förfarande för framställning av en onkostatin M -mutant, kännetecknat av att en aminosyrasekvens sasom väsentligen illustreras i figur 1 modifieras genom att 15 deletera vilken eller vilka som heist aminosyrarester i position 186, inklusive denna, fr an och med position 227 tili karboxiterminalresten, inklusive denna.
1. Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että modifioidaan aminohapposekvenssiä, joka on olennaisesti kuten kuviossa 1 on esitetty, deletoimalla mikä tai mitkä tahansa aminohappotähteet asemasta 186, tämä mukaan 5 luettuna, lähtien aseman 227 karboksiterminaaliseen tähteeseen asti, tämä mukaan luettuna.
2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att aminosyrarestema 186-227 deleteras. 20
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aminohappotähteet 186-227 deletoidaan. 10
3. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att aminosyrarestema 196-227 deleteras.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aminohappo- ! tähteet 196-227 deletoidaan.
4. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att aminosyrarestema 189- 25 227 deleteras.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aminohappo-15 tähteet 189-227 deletoidaan.
5. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att aminosyrarestema 188- ' 227 deleteras. 30 6. Förfarande för framställning av en onkostatin M -mutant, kännetecknat av att 1 en aminosyrasekvens säsom väsentligen illustreras i figur 1 modifieras genom att substituera vilken som heist aminosyrarest i positionema 6, 80 och/eller 127 med en annan aminosyra än kystein. 35 7. Förfarande enligt patentkrav 6, kännetecknat av att en aminosyrarest i posi- | tionema 6, 80 och/eller 127 substitueras med serin. B i 34 104424
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aminohappotähteet 188-227 deletoidaan.
6. Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että modifioidaan aminohapposekvenssiä, joka on olennaisesti kuten kuviossa 1 on esitetty, korvaamalla mikä tahansa aminohappotähde asemissa 6, 80 ja/tai 127 aminohapolla, joka on muu kuin kysteiini.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aminohappo tähde asemassa 6, 80 ja/tai 127 korvataan seriinillä.
8. Förfarande för framställning av en onkostatin M -mutant, kännetecknat av att en aminosyrasekvens säsom väsentligen illustreras i figur 1 modifleras genom att deletera aminosyrarestema 87-90. 5
9. Förfarande för framställning av en onkostatin M -mutant, kännetecknat av att en aminosyrasekvens säsom väsentligen illustreras i figur 1 modifieras genom att deletera aminosyrarestema 152-155.
8. Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että modifioidaan aminohapposekvenssiä, joka on olennaisesti kuten kuviossa 1 on esitetty, il 30 deletoimalla aminohappotähteet 87-90. fl [ 9. Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mo difioidaan aminohapposekvenssiä, joka on olennaisesti kuten kuviossa 1 on esitetty, deletoimalla aminohappotähteet 152-155.
10. Förfarande för framställning av en onkostatin M -mutant, kännetecknat av att 1 10 en aminosyrasekvens säsom väsentligen illustreras i figur 1 modifieras genom att substituera vilken som heist aminosyra i positionema 195 och/eller 196 med en annan aminosyra än arginin.
10. Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että modifioidaan aminohapposekvenssiä, joka on olennaisesti kuten kuviossa 1 on esitetty, : 35 33 104424 korvaamalla mikä tahansa aminohappo asemissa 195 ja/tai 196 aminohapolla, joka on muu kuin arginiini.
11. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat av att aminosyrarestema 195 15 och/eller 196 substitueras med glycin.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aminohappo-5 tähteet 195 ja/tai 196 korvataan glysiinillä.
12. Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mo- j difioidaan aminohapposekvenssiä, joka on olennaisesti kuten kuviossa 1 on esitetty, insertoimalla aminohapposekvenssi GAG aminohappojen 103 ja 104 väliin. 10
12. Förfarande för framställning av en onkostatin M -mutant, kännetecknat av att en aminosyrasekvens säsom väsentligen illustreras i figur 1 modifieras genom att in-sertera aminosyrasekvensen GAG mellan aminosyroma 103 och 104. I 20 ;i
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US44775989A | 1989-12-08 | 1989-12-08 | |
US44775989 | 1989-12-08 | ||
US62386790A | 1990-12-03 | 1990-12-03 | |
US62386790 | 1990-12-03 | ||
US9007227 | 1990-12-07 | ||
PCT/US1990/007227 WO1991009057A1 (en) | 1989-12-08 | 1990-12-07 | Novel proteins with oncostatin m activity and process for their preparation |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI922612A FI922612A (fi) | 1992-06-05 |
FI922612A0 FI922612A0 (fi) | 1992-06-05 |
FI104424B true FI104424B (fi) | 2000-01-31 |
Family
ID=27035080
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI922612A FI104424B (fi) | 1989-12-08 | 1992-06-05 | Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0504291B1 (fi) |
JP (1) | JPH05504134A (fi) |
KR (1) | KR920703636A (fi) |
CN (1) | CN1055389A (fi) |
AT (1) | ATE168117T1 (fi) |
AU (1) | AU651330B2 (fi) |
CA (1) | CA2070171A1 (fi) |
DE (1) | DE69032471T2 (fi) |
DK (1) | DK0504291T3 (fi) |
ES (1) | ES2120958T3 (fi) |
FI (1) | FI104424B (fi) |
GR (1) | GR3027654T3 (fi) |
IL (1) | IL96593A0 (fi) |
NO (1) | NO301769B1 (fi) |
NZ (1) | NZ236382A (fi) |
PT (1) | PT96134B (fi) |
WO (1) | WO1991009057A1 (fi) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5783672A (en) * | 1994-05-26 | 1998-07-21 | Immunex Corporation | Receptor for oncostatin M |
CA2178256A1 (en) * | 1995-06-06 | 1996-12-07 | Christopher H. Clegg | Oncostatin m induced hematopoiesis |
GB9806530D0 (en) | 1998-03-26 | 1998-05-27 | Glaxo Group Ltd | Inflammatory mediator |
US20120308517A1 (en) | 2010-02-09 | 2012-12-06 | Digna Biotech, S.L. | Compositions for the treatment of infectious and tumoural diseases |
-
1990
- 1990-12-07 CA CA002070171A patent/CA2070171A1/en not_active Abandoned
- 1990-12-07 ES ES91901400T patent/ES2120958T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-07 DK DK91901400T patent/DK0504291T3/da active
- 1990-12-07 JP JP91501786A patent/JPH05504134A/ja active Pending
- 1990-12-07 IL IL96593A patent/IL96593A0/xx unknown
- 1990-12-07 AU AU70361/91A patent/AU651330B2/en not_active Ceased
- 1990-12-07 PT PT96134A patent/PT96134B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 EP EP91901400A patent/EP0504291B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-07 NZ NZ236382A patent/NZ236382A/xx unknown
- 1990-12-07 AT AT91901400T patent/ATE168117T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 KR KR1019920701316A patent/KR920703636A/ko not_active Application Discontinuation
- 1990-12-07 WO PCT/US1990/007227 patent/WO1991009057A1/en active IP Right Grant
- 1990-12-07 DE DE69032471T patent/DE69032471T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-08 CN CN90110122A patent/CN1055389A/zh active Pending
-
1992
- 1992-06-04 NO NO922202A patent/NO301769B1/no unknown
- 1992-06-05 FI FI922612A patent/FI104424B/fi active
-
1998
- 1998-08-14 GR GR980401829T patent/GR3027654T3/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH05504134A (ja) | 1993-07-01 |
NZ236382A (en) | 1992-08-26 |
DK0504291T3 (da) | 1998-11-30 |
EP0504291B1 (en) | 1998-07-08 |
EP0504291A1 (en) | 1992-09-23 |
AU651330B2 (en) | 1994-07-21 |
ES2120958T3 (es) | 1998-11-16 |
NO922202L (no) | 1992-06-04 |
IL96593A0 (en) | 1991-09-16 |
NO922202D0 (no) | 1992-06-04 |
AU7036191A (en) | 1991-07-18 |
DE69032471T2 (de) | 1999-03-04 |
DE69032471D1 (de) | 1998-08-13 |
KR920703636A (ko) | 1992-12-18 |
FI922612A (fi) | 1992-06-05 |
FI922612A0 (fi) | 1992-06-05 |
WO1991009057A1 (en) | 1991-06-27 |
PT96134B (pt) | 1998-04-30 |
ATE168117T1 (de) | 1998-07-15 |
CN1055389A (zh) | 1991-10-16 |
CA2070171A1 (en) | 1991-06-09 |
PT96134A (pt) | 1991-09-30 |
EP0504291A4 (en) | 1992-10-28 |
NO301769B1 (no) | 1997-12-08 |
GR3027654T3 (en) | 1998-11-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5258287A (en) | DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53 | |
JP3117992B2 (ja) | 血管内皮細胞成長因子の生産およびそれをコードするdna | |
US6124131A (en) | Mutant hypoxia inducible factor-1 HIF-1 | |
AU646014B2 (en) | Novel platelet-derived growth factor B chain analogs and method for homogeneous production thereof | |
GB2214185A (en) | Proteins and methods for their production | |
US5115096A (en) | Amphiregulin: a bifunctional growth modulating glycoprotein | |
CA2084514A1 (en) | O-glycosylated ifn-alpha | |
AU8899298A (en) | Lipocalin homologs | |
JPH02442A (ja) | エリトロポエチンを発現するヒトcDNAのクローニング方法 | |
HU211984A9 (en) | Neuroglial derived neurothrophic factors | |
CZ497290A3 (cs) | Isoformy erythropoietinu | |
EP1428883A1 (en) | Megakaryocyte stimulating factors | |
AU623589B2 (en) | Platelet related growth regulator | |
US5618715A (en) | Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity | |
US5874536A (en) | Proteins with Oncostatin M activity and process for their preparation | |
JPH03195496A (ja) | 成長因子 | |
FI104424B (fi) | Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi | |
JPH03164183A (ja) | 脳由来の膜蛋白質発現系 | |
US5451506A (en) | Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity | |
IE904732A1 (en) | Novel proteins with oncostatin m activity and process for¹their preparation | |
KR960016305B1 (ko) | 온코스타틴 m 및 항신생물 활성을 갖는 신규 조성물 | |
AU2005244575B2 (en) | Human Vascular Endothelial Growth Factor 2 |