FI102906B - Menetelmä ja väline aineen siirtämiseksi - Google Patents

Menetelmä ja väline aineen siirtämiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI102906B
FI102906B FI980399A FI980399A FI102906B FI 102906 B FI102906 B FI 102906B FI 980399 A FI980399 A FI 980399A FI 980399 A FI980399 A FI 980399A FI 102906 B FI102906 B FI 102906B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
microparticles
magnet
enzyme
immobilized
dna
Prior art date
Application number
FI980399A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI980399A (fi
FI102906B1 (fi
FI980399A0 (fi
Inventor
Matti Korpela
Original Assignee
Bio Nobile Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Nobile Oy filed Critical Bio Nobile Oy
Publication of FI980399A0 publication Critical patent/FI980399A0/fi
Priority to FI980399A priority Critical patent/FI102906B1/fi
Priority to US09/600,816 priority patent/US6468810B1/en
Priority to AU25242/99A priority patent/AU2524299A/en
Priority to ES99904897T priority patent/ES2245088T3/es
Priority to AT05101337T priority patent/ATE443258T1/de
Priority to EP05101337A priority patent/EP1548441B1/en
Priority to EP99904897A priority patent/EP1058851B1/en
Priority to PCT/FI1999/000135 priority patent/WO1999042832A1/en
Priority to DK99904897T priority patent/DK1058851T3/da
Priority to DE69941437T priority patent/DE69941437D1/de
Priority to DE69926218T priority patent/DE69926218T2/de
Priority to AT99904897T priority patent/ATE300046T1/de
Priority to JP2000532723A priority patent/JP2002504685A/ja
Application granted granted Critical
Publication of FI102906B publication Critical patent/FI102906B/fi
Publication of FI980399A publication Critical patent/FI980399A/fi
Publication of FI102906B1 publication Critical patent/FI102906B1/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/28—Magnetic plugs and dipsticks
    • B03C1/284—Magnetic plugs and dipsticks with associated cleaning means, e.g. retractable non-magnetic sleeve
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/28—Magnetic plugs and dipsticks
    • B03C1/286—Magnetic plugs and dipsticks disposed at the inner circumference of a recipient, e.g. magnetic drain bolt
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/18—Magnetic separation whereby the particles are suspended in a liquid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical applications
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Paints Or Removers (AREA)
  • Feeding, Discharge, Calcimining, Fusing, And Gas-Generation Devices (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Devices And Processes Conducted In The Presence Of Fluids And Solid Particles (AREA)

Description

MENETELMÄ JA VÄLINE AINEEN SIIRTÄMISEKSI 102906
Keksinnön kohteena on menetelmä immobilisoidun, erityisesti molekyylibiologiassa käytettävän entsyymin tai nukleoti-disekvenssin siirtämiseksi, menetelmään pohjautuva entsyymin tai nukleotidisekvenssin annostelujärjestelmä sekä " menetelmässä käytettävä siirtolaite. Keksintö koskee myös menetelmän soveltamista molekyylibiologian alalla.
TEKNIIKAN TASO
Molekyylibiologiassa suoritettavissa menetelmissä, joissa manipuloidaan DNA:ta tai RNA:ta käytetään hyväksi restrik-tioentsyymejä ja DNA/RNA modifioivia entsyyymejä. Näiden entsyymien käytöllä on keskeinen merkitys lähes kaikessa molekyylibiologian alueella tapahtuvassa työskentelyssä. Molekyylibiologian laboratorioissa yleisimmin käytettyjä entsyymejä ovat restriktioentsyymit. Nämä entsyymit ovat mahdollistaneet alueella tapahtuneen valtaisan kehityksen. Restriktioentsyymit tunnistavat erittäin tarkasti DNA:n nukleiinihapposekvenssin, jonka ne pilkkovat. Tunnistusalue on erityinen emäsjärjestys DNA:ssa, jonka restriktioentsyy-mi tunnistaa. Nämä emäsjärjestykset ovat yleensä 4-8 emästä pitkiä. Ratkaisupaikka on tarkka kohta DNA:ssa ja yleensä tunnistuskohdan sisällä. Esimerkiksi restriktioentsyymi EcoRI tunnistaa spesifisesti DNA:ssa olevan emäsjärjestyk- "· sen: * * « * i i f « · · « · « ’ . . .5’ -G A A T T C-3’ . . .
. . .3’ -C T T A A G-5’ . . .
t * • · · * · · • · • · · V * Restriktioentsyymi EcoRI katkaisee lisäksi tarkasta kohdas- ;'.fj ta tunnistusalueen sisältä DNA ketjussa olevan guaniinin(G) • · .···. ja adeniinin (A) välillä olevan sidoksen: i . . .5' -G-3’ 5’ -A A T T C-3’ . . .
i . . .3’ -C T T A A-5’ 3’ -G-5’ . . .
Tarkat restriktioentsyymien DNA-ketjun tunnistusominaisuu- 2 102906 det ja katkaisukohdat ovat ne tärkeät ominaisuudet, jotka ovat tehneet restriktioentsyymeistä niin hyödyllisen ja tarpeellisen työkalun molekyylibiologeille. Restriktioent-syymejä tunnetaan jo noin 1000 erilaista ja kaupallisestikin on saatavilla yli 200 erilaista.
Restriktioentsyymien käyttäminen molekyylibiologian sovelluksissa on lähinnä rutiinityöskentelyä ja useissa tapauksissa näiden entsyymien käyttämiseen liittyy työläitä välivaiheita. Hyvä esimerkki on tarvittavat toimenpiteet restriktioentsyymien aktiivisuuden poistamiseksi niiden käytön jälkeen. Monille restriktioentsyymeistä tarvitaan fenoliuutos niiden inaktivoimiseksi käytön jälkeen. Fenoli-uutokset ovat erittäin työläitä ja tekijän kannalta hyvin epämiellyttäviä toimenpiteitä. Lisäksi näissä uutoksissa syntyy runsaasti ongelmajätettä. Useille restriktioentsyy-meille kaupalliset valmistajat ehdottavat kuumakäsittelyä entsyymien inaktivoimiseksi, mutta käytännössä käyttäjät usein suorittavat fenoliuutoksen varmistaakseen entsyymien inaktivoitumisen. Kuumennuskäsittelyn jälkeen entsyymin aktiivisuudesta saattaa olla vielä jäljellä useita prosentteja. Koska restriktioentsyymejä ei ole voitu poistaa '.· : nykyään tunnetuilla tekniikoilla, on ongelma ratkaistu • entsyymin inaktivoimisella, esimerkiksi kuumakäsittelyllä : : tai fenoliuutoksella. Toinen epäkohta on se, että käytet- tyä, kallista entsyymiä ei voida käyttää uudelleen. Vähem-män aikaa vieviä, mutta muuten ongelmallisia ovat erilaiset * spin-kolonnit DNA:n puhdistamiseksi reaktioliuoksesta. Näiden kolonnien käyttö on erittäin kallista eivätkä ne « · i I.I toimi läheskään kaikkien entsyymien poistamiseksi DNA:n * · · *. joukosta. Tässäkään tapauksesssa poistettua entsyymiä ei * · voida käyttää uudelleen.
m m m • · • · ;·[·. Fenoliuutoksen käyttäminen monien muidenkin molekyylibiolo- gian alueella yleisesti käytettävien nk. DNA/RNA modifioivien entsyymien inaktivoimiseksi on tarpeellista. Esimerkkeinä voidaan mainita CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) ja Proteinaasi K.
3 102906
Restriktioentsyymien kanssa työskenneltäessä täytyy huolehtia myös monista muista käyttöä rajoittavista tekijöistä. Eräs keskeinen restriktioentsyymien ominaisuus on nk. star-aktiivisuus, jolla tarkoitetaan restriktioentsyymin ominaisuutta pilkkoa DNA:ta epätarkasti eli ei-halutuista kohdista. Yksi tähän restriktioentsyymien ominaisuuteen vaikuttava tekijä on glyserolin määrä reaktioseoksessa. Kaupalliset restriktioentsyymit toimitetaan yleensä liuoksena, joka sisältää 50 % glyserolia. Glyserolin käyttötarkoitus on estää entsyymiliuosta jäätymästä -20 °C pakkassäilytyk-sessä. Normaalikäytössä restriktioentsyymejä lisätään reaktioon hyvin pieniä määriä, jopa alle 1 ul:n määriä. Jos glyserolipitoisuus reaktioseoksessa nousee liian korkeaksi, aiheuttaa se monissa tapauksissa suuren ongelman juuri edellä mainitun star-aktiivisuuden esiintymisenä. Tämä rajoittaa useita molekyylibiologisia aplikaatioita restriktioentsyymien käytön suhteen. Toinen merkityksellinen seikka on se, että reaktioseoksen kokonaistilavuus tulee pyrkiä pitämään mahdollisimman pienenä, jotta entsyymiaktiivisuus olisi kyllin nopea. Nämä kaksi edellä mainittua asiaa vaikuttavat suoraan siihen, että tämänhetkisillä kaupallisilla restriktioentsyymivalmisteilla ei voida suorittaa kovinkaan joustavasti suurta restriktioentsyymi-; pitoisuutta vaativia reaktioita. Kaupallisesti saatavat restriktioentsyymit toimitetaan yleensä yhdessä tai enin-tään kahdessa vakiopitoisuudessa (U/ml). Haluttaessa lisätä
• V
paljon restriktioentsyymiä reaktioon kasvaa glyserolin/li-uoksen osuus reaktiossa liiaksi. Tuloksena saadaan helposti star-aktiivisuutta ja reaktiokinetiikka on merkittävästi « * · hidastunut. Glyserolin poistamiseksi ennen annostelua ei • « ole esitetty keinoja.
• * • · · • * · » · : : Perinteisesti restriktioentsyymeillä on laaja käyttöalue D,NA:n pilkkomisessa halutuista kohdista esimerkiksi geenien kloonaamisessa plasmidivektoreihin. Restriktioentsyymien ' ' käytölle löytyy jatkuvasti uusia sovelluksia. Esimerkkeinä voidaan mainita genomien kartoitusprojektit (esim. Human Genome Project), AFLP, RFLP, mutaatioiden määritykset ja 4 102906 erilaiset DNA/RNA:n monistusmenetelmät (esim. Inverse PCR). Restriktioentsyymejä tarvitaan menetelmissä pilkkomaan tutkittava DNA-materiaali aluksi pienemmiksi paloiksi, joista myöhemmin voidaan määrittää esimerkiksi yksityiskohtainen emäsjärjestys (sekvenointi). RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) -tekniikassa käytetään myös hyväksi restriktioentsyymejä niiden spesifisyyden takia. RFLP -tekniikassa saadaan restriktioentsyymikäsittelyn jälkeen tutkittavasta DNA:sta ns. sormenjälki. Tätä tekniikkaa käytetään laajasti muun muassa isyystutkimuksissa, rikostutkimuksissa, epidemiologisissa tutkimuksissa ja mutaatioiden määrityksessä. Nämä esimerkit kuvaavat rest-riktioentsyymien käyttöä sovelluksissa, joiden automatisoinnin tarve on suuri. Tässä keksinnössä kuvatun menetelmän etuja on magnetoitavaan materiaaliin immobilisoitu-jen restriktioentsyymien huomattavasti helpompi soveltuvuus automatisoituihin määrityksiin verrattuna ei-immobilisoi-tuihin restriktioentsyymeihin.
Patenttikirjallisuuden mukaan on myös ehdotettu valmisteita, joissa restriktio- ja vastaavia molekyylibiologiassa käytettäviä entsyymejä on immobilisoitu kiinteään kanta-; jaan. Kansainvälisessä patenttijulkaisussa W0 92/15674 on ] ehdotettu sekä restriktioentsyymien että DNA/RNA modifioi- :’ : vien entsyymien immobilisointia kalvoon, joka koostuu polymeeristä tai lasikuidusta. US 4,34 2,833 kuvaa myös immobilisoitu ja restriktioentsyyme jä, joissa kiinteänä kantajana käytetään CNBr aktivoitua agaroosia. Yleisesti magneettipartikkelien käyttöä entsyymien immobilisoinnissa • · · on kuvattu patenttijulkaisussa US 4,698,302, joskin tässä · · patenttijulkaisussa ei ollut mainintaa molekyylibiologian alueella käytettävistä entsyymeistä. Magneettipartikkelien erottaminen mainitussa patenttijulkaisussa tehtiin perin-;]·. teisesti ulkopuolisen magneetin avulla.
‘ ’ Perinteinen magnetoitavan materiaalin sitominen reaktioas- tian sisäseinämään reaktioastian ulkopuolisen magneetin luoman magneettikentän vaikutuksesta ei sovellu hyvin 5 102906 pienten (10-200 μΐ) liuostilavuuksien käsittelyyn. Patent-tikirjallisuudessa on esitetty useita erilaisia magnetoita-van materiaalin erotusvälineitä. Kansainvälisessä patenttijulkaisussa WO 87/05536 on esitetty erotusväline, jossa muovisen hoikin sisällä liikkuvalla kestomagneetilla voidaan magnetoitavaa materiaalia siirtää astiasta toiseen. Suomalaisissa patenttijulkaisuissa (FI 8605002, FI 9503669, FI 9701665, FI 9701666, FI 9701667 ja FI 9701668) on kuvattu samaten erilaisia kestomagneetin käyttöön perustuvia menetelmiä siirtää magnetoitavaa materiaalia astiasta toiseen. Patenttijulkaisuissa US 4272510, US 4649116 ja US 4751053 on kuvattu sähkömagneetin käyttöön perustuvia magneettisen materiaalin siirtoja lähinnä RIA ja EIA-määrityksissä. Missään edellä mainituista julkaisuista ei kuvata menetelmää molekyylibiologisissa menetelmissä ongelmallisten asioiden ratkaisemiseksi. Mainituissa patenttijulkaisuissa ei myöskään mainita immobilisoitujen restrik-tioentsyymien tai DNA/RNA:ta modifioivien entsyymien käytöstä .
Magnetoitavat partikkelit kehitettiin 1970-luvun alussa erityisesti entsyymien immobilisointiin. Tämä teknologia tuli hyvin suosituksi muun muassa immunomäärityksissä.
Magnetoitavien partikkelien käyttämisellä immunomäärityk- : sissä sitoutuneen antigeeni-vasta-aine kompleksin erottami- seksi vapaasta fraktiosta tarjosi merkittävän edun sekä • · reaktionopeudessa että erotuksen käytännöllisyydessä. Pääasiallinen kehitys magnetoitavien partikkelien hyväksi-käytössä on viimeisten vuosien aikana tapahtunut solubiolo- • » i gian ja immunokemian alueilla.
« · i « · » 6 102906
Yllä kuvattua teknologiaa ei ole kuitenkaan pystytty soveltamaan molekyylibiologian alalla. Partikkeleiden vangitseminen on hyvin ongelmallista pienten nestetilavuuksien takia. Solubiologian ja immunokemian alalta tunnettu tekniikka ei sovellu molekyylibiologian alalle, koska tällä alalla käytettävät nestemäärät ovat erittäin pieniä, eli suuruusluokkaa 10 - 100 μΐ, kun vastaavat määrät immunokemian alalla ovat usein millilitran suuruusluokkaa ja solubiologian alalla tyypillisesti 10 - 100 ml.
KEKSINNÖN TARKOITUS
Tämä keksintö tähtää muun muassa molekyylibiologian menetelmissä ja sovelluksissa käytettävien entsyymien helppokäyttöisyyden lisäämiseen ja kalliiden entsyymien uudelleenkäyttöön .
Tämän keksinnön tarkoituksena on poistaa edellä tunnetun tekniikan ongelmat ja aikaansaada uusi menetelmä ja siihen käytettävät siirtovälineet ja järjestelmät mikropartikke-leihin immobilisoitujen, molekyylibiologiassa käytettävien entsyymien tai nukleotidisekvenssien siirtämiseksi reaktio-astiaan ja sieltä pois.
Tarkoituksena on erityisesti aikaansaada menetelmä, jolla mikropartikkeleihin immobilisoitu restriktio- tai muu • · molekyylibiologian alueella käytettävä entsyymi voidaan siirtää entsyymin annosteluastiasta reaktioastiaan, ja poistaa reaktiossa käytetty entsyymi ja ottaa se talteen I I < reaktioastiasta.
• · c • · · • !/.{ Tarkoituksena on myös aikaansaada menetelmä, jolla immobi- lisoitu entsyymi voidaan pesulla vapauttaa glyserolista tai . \ vastaavasta reaktiota haittavasta aineesta ennen kuin se viedään reaktioastiaan.
Tarkoituksena on myös aikaansaada mikropartikkeleihin immobilisoidun entsyymin annostelu-, pesu- ja talteenotto 7 102906 järjestelmä, jonka avulla ennalta määritetyn entsyymimäärän annostelu reaktioastiaan ja talteenottaminen sieltä on helposti automatisoitavissa.
Tarkoituksena on myös aikaansaada siirtoväline, jonka avulla mikropartikkelit, joihin entsyymi tai nukleotidisek-venssi on sidottu, on helposti vangittavissa ja vapautettavissa uudelleen.
Tarkoituksena on lisäksi aikaansaada tehokkaimpia DNA:n pilkkomisreaktioita ja muita molekyylibiologisia reaktioita yllä mainitun menetelmän avulla.
KEKSINNÖN KUVAUS JA SUOSITELTAVAT SUORITUSMUODOT
Keksinnön tunnusmerkit ilmenevät patenttivaatimuksista.
Keksinnön kohteena on siten menetelmä mikropartikkeleihin immobilisoidun, erityisesti molekyylibiologiassa käytettävän entsyymin tai nukleotidisekvenssin siirtämiseksi ensimmäisestä astiasta toiseen astiaan. Keksinnölle on tunnusomaista, että mikropartikkelit ovat magneettista tai magnetisoitavissa olevaa materiaalia, tai mikropartikkelit on liitetty magneettiseen tai magnetisoitavissa olevaan : kappaleeseen ja että mikropartikkelit, joihin entsyymi tai nukleotidisekvenssi on immobilisoitu, vangitaan ensimmäi- • · ;1·1; seen astiaan upotetun magneetin avulla, siirretään magneet- ti vangittunne mikropartikkeleineen toiseen astiaan, ja vapautetaan mikropartikkelit magneetin vaikutuksesta.
• · 1 • · · t • · · • · ·
Keksinnön mukainen menetelmä ei rajoitu molekyylibiologian • alaan, vaan se on yleisesti sovellettavissa aloilla, joilla #11 käsitellään pieniä tilavuuksia.
Entsyymi on sopivasti restriktioentsyymi, modifioiva entsyymi tai jokin muu molekyylibiologiassa käytettävä entsyymi. Esimerkkeinä DNA/RNA modifioivista entsyymeistä voidaan mainita: Proteinaasi K, CIAP (Calf Intestinal Alkaline 102906 δ
Phosphatase), E. Coli alkaline phosphatase, eksonukleaasit (esimerkiksi P1 nukleaasi, SI nukleaasi), ribonukleaasit, RNaasit (esim. Pacreatic RNaasi, RNaasi H, RNaasi Tl, RNaasi M, RNaasi T2), DNA ligaasit, RNA ligaasit, DNA polymeraasit, Klenow entsyymi, RNA polymeraasit, DNA kinaa-sit, RNA kinaasit, terminal transferaasit, AMV reverse transcriptase ja fosfodiesteraasit. Näiden ja muiden DNA/RNA modifioivien entsyymien käyttö on erittäin monimuotoista sekä molekyylibiologian tutkimuksessa että sovelluksissa.
Nukleotidisekvenssi voi olla mikä tahansa yksi- tai kak-sisäikeinen nukleotidisekvenssi, ja on erityisesti DNA, RNA, mRNA tai cDNA.
Entsyymin tai nukleotidin immobilisointi mikropartikkelei-hin tarkoittaa sitä, että entsyymi tai nukeotidisekvenssi on kiinnitetty partikkeleiden pintaan tai että se on vangittu "häkkimäisen" partikkelin sisään, kuitenkin niin, että ympäröivä liuos pääsee kosketukseen sen kanssa.
Käsite "mikropartikkeli" tarkoittaa tässä yhteydessä hyvinkin pieniä partikkeleita, joiden koko suositeltavasti on alueella 0.1-10 μπι. Mikropartikkeli, johon entsyymi tai nukleotidisekvenssi on immobilisoitu, voi olla magneettista tai magnetoitavissa olevaa materiaalia. Toisen vaihtoehdon mukaan itse mikropartikkeli, johon aine on immobilisoitu, • I i voi olla ei-magneettinen. Tässä tapauksessa mikropartikkeli . . on kiinteästi liitetty toiseen kappaleeseen, joka on mag- « · r neettista tai magnetoitavissa olevaa materiaalia.
• · · · · :\j Entsyymin tai nukleotidin kiinnittäminen mikropartikkelei- hin voidaan tehdä kovalenttisen sidoksen avulla, esimerkik-si kantajassa olevien amino- tai hydroksiryhmien avulla.
t « ·. Vaihtoehtoisesti sitominen voidaan aikaansaada bioaf- *·'· finiteettiparin, esimerkiksi biotiini/streptavidiini -parin avulla. Erään tavan mukaan immobilisoitava entsyymi tuotetaan rekombinantti-DNA-teknologialla esimerkiksi Esche- 9 102906 richia coli bakteerissa ja entsyymiin on tehty erityinen affiniteettihäntä. Tämä affiniteettihäntä sitoutuu mikro-partikkeleihin, joihin on sopivasti kiinnitetty kyseiseen affiniteettihäntään voimakkaasti sitoutuva komponentti.
Affiniteettihäntä voi olla pienimolekyylinen yhdiste tai proteiini. Tällaisella järjestelyllä halutun entsyymin puhdistamisessa voitaisiin tehokkaasti käyttää hyväksi mikropartikkeleita ja samalla mikropartikkeliin sitoutunut entsyymi olisi valmiiksi immobilisoitu mikropartikkelin pinnalle käytettäväksi keksinnössä kuvatussa menetelmässä.
Entsyymin tai nukleotidisekvenssin kiinnittäminen mikropar-tikkeleihin voi myös olla epäspesifinen, ei-kovalenttinen, kuten adsorptio. Esimerkkinä voidaan mainita DNA:n suora kiinnittyminen lasipintaan.
Käsite "magneettinen tai magnetisoitavissa oleva materiaali" kattaa paramagneettiset ja superparamagneettiset materiaalit. Erityisen sopiva partikkelimateriaali on jokin superparamagneettinen materiaali. Superparamagneettiset partikkelit muodostavat ulkopuolisen magneettikentän vaikutuksesta itsellensä magneettikentän, joka katoaa kun ulkopuolinen magneettikenttä katoaa. Täten partikkelit pysyvät erillisinä eivätkä saostu, mikä on edullista niiden käytön kannalta. Magnetettipartikkeleita (para- ja superparamag-neettisia) valmistavat monet kaupalliset yritykset (Bangs m m m
Laboratories Inc., Dynal A.S, Advance Magnetics Inc., • « ·
Scipac Limited, Pael-Lorei, CPG Inc.). Valittavissa on eri . , kokoisia sekä eri tavoin valmiiksi aktivoituja magneetipar- • · ( *;'·* tikkeleita. Myös monin eri tavoin modifioituja magneetipar- • · i tikkeleita on saatavilla. Esimerkkeinä voi mainita karbok- syyli- ja amino-modifioidut magneettipartikkelit. Yleensä * · magnetiitti on sidottu polymeeriseen kantajaan kuten esi-.merkiksi lateksi ja sellulloosa. CPG Inc. valmistaa mag-:m ’ neettipartikkeleita, joiden materiaali on huokoinen lasi.
Kaikissa edellä mainituissa magneettipartikkeleissa on pieniä (1-20 nm) magnetiittikiteitä dispersoitu polymee-rin/lasin joukkoon, joka sitten on polymeroitu ja lopputu- 10 102906 loksena on magnetoitava partikkeli. Bangs Laboratries Inc. valmistaa magneettipartikkeleita, joissa magnetiittia on kontrolloidusti ainoastaan partikkelien ytimessä. Tämä on tärkeää siksi, että rautaa ei saa vapautua reaktioliuokseen monissa molekyylibiologian sovelluksissa kuten esimerkiksi PCR reaktiossa. Liuokseen vapautunut rauta inhiboi reaktion kulkua PCR reaktiossa.
Magneetti, jonka avulla partikkelit vangitaan, voi olla joko kestomagneetti tai sähkömagneetti.
Erään suositeltavan suoritusmuodon mukaan keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä magneetti on kestomagneetti tai sähkömagneetti, jonka pinta on erotettu mikropartikke-leista erillisen kalvon avulla. Kun kestomagneetti upotetaan astiaan mikropartikkeleiden vangitsemiseksi (eli kun magneetti lähennetään kalvoa kohti) kerääntyvät mikropar-tikkelit kalvon pintaan. Magneetti ja kalvoon kertyneet mikropartikkelit viedään sen jälkeen toiseen astiaan ja siinä viedään kestomagneetti kalvosta poispäin, jolloin mikropartikkelit vapautuvat heikentyneen magneettikentän johdosta. Sähkömagneetin tapauksessa magneettipartikkelien keräystapahtumassa luodaan magneettikenttä ja magneettipartikkelien irrottamiseksi magneettikenttä pysäytetään.
·„.· Keksinnön kohteena on myös mikropartikkeleiden vangitsemi- l seksi ja vapauttamiseksi soveltuva siirtoväline. Siirtovä- lineelle on tunnusomaista, että se käsittää varsiosan, ja sen päässä olevan magneetin, sekä kalvon, joka erottaa magneetin mikropartikkeleista, mutta joka ei olennaisesti • · « m m heikennä mikropartikkeleihin kohdistuvaa magneettikenttää.
· · • · *.1: Oleellista on se, että vietäessä siirtoväline nesteeseen ·,,,· tarkoituksena kerätä liuoksessa olevat magneettipartikke- ;·.·. lit, saatetaan siihen magneetikenttä niin, että magneetti- • t ... ; partikkelit keräytyvät luodun magneettikentän vaikutuksesta siirtovälineen läheisyyteen.
11 102906
Magneettipartikkelit eivät keräydy suoraan metallisen magneetin pintaan vaan magneetin ympärillä olevan suojakalvon ympärille. Suojakalvo on edullisimmin äärimmäisen ohut suojakerros magneetin päällä/ympärillä saattaen näin mahdollisimman suuren magneettikentän voimakkuuden liuokseen. Suojakalvo voi olla erityinen (kiinteästi, pysyvästi) magneetin ympärillä oleva inertti kerros kalvon muodostavaa ainetta esimerkiksi teflonia, silaania tms. Erityisesti tämä tapaus tulee kyseeseen käytettäessä sähkömagneettia. Suojakalvo voi olla taipuisa ja mahdollisesti myös venyvä, mutta se voi vaihtoehtoisesti olla holkkityyppinen, joustamattomasta materiaalista, esimerkiksi joustamattomasta polymeeristä valmistettu kerros, joka ei ole pinnoitteen tapaan kiinteässä yhteydessä magneettiin. Suojakalvo voi olla vielä venytetty, jolloin kalvon paksuus pienenee ja magneettikenttä voimistuu mikropartikkelien keräystapahtu-massa. Keksinnön mukaisella siirtovälineellä voidaan erittäin pienen kesto- tai sähkömagneetin avulla suorittaa mikropartikkelien siirtoja pienissä astioissa olevista pienistä nestetilavuuksista.
Keksinnön mukainen siirtoväline ja annostus järjestelmä on esitetty tarkemmin seuraavissa piirustuksissa, joissa
Kuvio 1 esittää keksinnön mukaista, kestomagneetin käyttöön pohjautuvaa siirtovälinettä aksiaalisuuntaisena leikkausku-vantona, jossa magneetti on partikkeleita vapauttavassa • · asennossa,
Kuvio 2A esittää kuvion 1 siirtovälinettä magneetin ollessa • · « partikkeleiden keräysasennossa, • · · 1 9
Kuviot 2B ja 2C esittävät kuvioiden 1 ja 2A yksityiskohtia : suurennettuina, *./. Kuvio 3 esittää kuvion 1 siirtovälinettä sivulta,
Kuviot 4A-4C esittävät kestomagneetin käyttöön pohjautuvaa 12 102906 siirtovälinettä toisen suoritusmuodon mukaan,
Kuviot 5A-5F esittävät sähkömagneetin käyttöön pohjautuvaa siirtovälinettä kolmannen suoritusmuodon mukaan, ja
Kuvio 6 esittää keksinnön mukaista annostelu- ja pesujär-jestelmää.
Kuvioissa 1 - 3 on esitetty siirtoväline 10, joka soveltuu entsyymiä tai nukleotidisekvenssiä sitovien mikropartikke-leiden vangitsemiseen ja uudelleen vapauttamiseen. Putkimaisessa runko-osassa 11 on aksiaalisuunnassa edestakaisin liikuteltavissa oleva tanko 17, joka toimii magneetin 18 kiinnitysvartena. Magneetti 18 on tässä ratkaisussa kesto-magneetti ja tanko 17 voi olla magneettisesti johtavaa materiaalia. Runko-osan 11 päässä on kärkikupu 20, jonka pohja 21 on kalvomaista materiaalia. Magneetin 18 pinta 22 on painettavissa kalvoa 21 vasten, jolloin mikropartikkelit 25 kiinnittyvät kalvoon 21 (kuviot 2A ja 2B). Mikropartikkelit irtoavat, kun magneettia 18 liikutetaan poispäin kalvosta 21 (kuvio 1 ja 2C).
Kuvion 1 viitenumero 12 on runko-osan 11 sisällä liikkuva, sormella käytettävä painin. Painimen 12 lukitussalpa on esitetty viitenumerolla 13. Painimeen vaikuttaa ylöspäin vaikuttava palautusjousi 14. Painin liikuttaa välitystankoa '·*.* 15, johon on kiinnitetty välitys jousi 16. Välitys jousen • · · ’ toiseen päähän on kiinnitetty magneetin kiinnitystanko 17.
Runko-osan yhteyteen on myös sovitettu vipu 19, jonka :V: avulla siirtovälineen alapäähän painettu kärkiosa 20 on :*·*: poistettavissa siirtovälineen rungosta. Kun mikropartikke- . lit on siirretty haluttuun astiaan, voidaan irroittaa kär- • · · ** • W f kiosa 20. Välitys jousen 16 tehtävänä on joustaa, kun mag-neetti 18 osuu kärkiosan 20 pohjaan 21. Tällä tavalla : varmistetaan välyksetön kosketus magneetin pinnan 22 ja kalvon 21 välille, jolloin saadaan mikropartikkelit mahdollisimman voimakkaan magneettivuon vaikutukseen. Lisäksi jousi 16 voi kompensoida rakenneosien väliset valmistukses- 13 102906 ta ja asennoinnista johtuvat pienet mittavaihtelut.
Yllä kuvattu siirtoväline voidaan tehdä em. periaate-konstruktion mukaisesti vaihdellen osien sijaintia, geometriaa ja materiaaleja sen mukaan kuin ergonomia eri työsken-telyasennoissa ja -olosuhteissa vaatii.
Kuvioissa 4A-4C nähdään kestomagneetin käyttöön pohjautuvaa siirtovälinettä toisen suoritusmuodon mukaan. Tangon 17 päähän on kiinnitetty kestomagneetti 18. Tanko 17 ja siihen kiinnitetty magneetti on nuolien mukaisesti liikkuvasti järjestetty tankoa ympäröivässä putkimaisessa kiinteässä katteessa 23. Katteen päässä on aukko 24, jonka läpi magneetti 18 on työnnettävissä. Siirtovälineen kärkiosan ympärille on sovitettu kalvo 21, joka on kiinnitetty katteeseen 23 pidikkeen 26 avulla. Kuviossa 4A magneetti 18 on mikropartikkeleita vapauttavassa asennossa ja kuvioissa 4B ja 4C magneetti 18 on mikropartikkeleita vangitsevassa asennossa. Kuviossa 4B magneetti 18 sijaitsee aivan kiinteän katteen 23 päässä. Magneetti 18 on tiukassa kontaktissa suojakalvon 21 kanssa. Kuvion 4C ratkaisussa magneetti 18 on työnnetty selvästi ulos katteen 23 aukosta 24. Tässä tapauksessa suojakalvo 21, joka on venyvää materiaalia, on selvästi venynyt ja magneetti on tiukassa kontaktissa kalvon 21 kanssa. Tanko 17 ja kate 23 on valmistettu sopi- '··’ vasta materiaalista, esimerkiksi muovista. Katteen 23 * * € *·*.· avulla saadaan haluttaessa magneettikenttä kohdistetuksi • · · * aivan siirtovälineen kärjen päähän. Aukon 24 ansiosta magneetti saadaan siirrettyä partikkeleiden keräyksen kan- :Y: naita edulliseen asentoon. Kuviossa 4C on esitetty mahdol- • · lisuus kerätä mikropartikkelit pienen kestomagneetin (esim.
* / . tilavuus < 50 μΐ) ja ohuen, venyvän kalvon 21 avulla.
• · ·
Katteen, tangon ja magneetin muodon ja kalvon avulla on myös mahdollista vaikuttaa kalvon ulkomuotoon erityisesti : mikropartikkeleiden keräys- ja siirtotapahtumaa ajatellen, i Haluttaessa esimerkiksi terävähkö ulkomuoto, voidaan muut taa magneetin ja tangon koon suhde. Katteen 23 muodolla ja sijainnilla magneetin suhteen on myös saavutettavissa 14 102906 monipuolisia vaihtoehtoja.
Kuviot 5A-5F esittävät sähkömagneetin käyttöön pohjautuvaa siirtovälinettä. Sähkömagneetin 18 kärki on merkitty numerolla 18' ja sen runko numerolla 18''. Kuviossa 5A nähdään ratkaisu, jossa sähkömagneetin kärki ja runko ovat vapaina ilman erityistä kiinteää katetta, ja kuviossa 5B nähdään ratkaisu, jossa kärki 18' ja runko 18'' on suojattu kiinteän katteen 23 avulla. Kuvio 5C esittää kuvion 5A välineen kärkiosaa ja kuvio 5D esittää tätä samaa kärkiosaa suoja-kalvon 21 ympäröimänä. Kuvion 5A siirtovälineen runko 18'' ja kärkiosa 18' voidaan pinnoittaa sopivalla pinnoitteella ja valita pinnoitteen hydrofobisuus tai hydrofiilisuus sopivasti sovelluksen mukaan. Kuvion 5A kärkiosa voidaan myös jälkipinnoittaa yhden tai useamman kerran. Kuvion 5C ratkaisussa, jossa kärkiosalla ei ole erillistä suojakalvoa, on kärki pestävä ennen välineen uudelleen käyttöä.
Tämä on helposti hoidettavissa esimerkiksi automaattisessa laitteessa, jossa on pesuasema. Kuvion 5C kärkiosa voidaan jälkipinnoittaa monia kertoja tarpeen mukaan. Kuvion 5D ratkaisussa suojakalvo pidetään kiinnitettynä pidikkeen 26 avulla. Suojakalvon ohuudesta johtuen sähkömagneetin kentän voimakkuus on hyvä. Sopivasti muotoillen kärkiosaa 18' voidaan välinettä käyttää pienissä tilavuuksissa.
Kuvion 5B kiinteä kate 23 voidaan valmistaa eri materiaa-:V: leista, esimerkiksi ei-ferromagneettisesta materiaalista kuten muovista, ja katteen muotoa voidaan vaihdella. Kate 23 ei peitä sähkömagneetin kärkeä 18'. Tämän ratkaisun kär-kiosa voi olla ilman erillistä kalvoa (kuvio 5E) tai varus- i i r
tettu erillisellä suojakalvolla 21 (kuvio 5F). Kuvion 5E
* a ratkaisussa kärkiosa voidaan pinnoittaa sopivasti valitulla • pinnoitteella (vrt. kuvion 5C kärkiosa). Kuvion 5E magneet-
« · I
tikärki 18' ja kate 23 voidaan pinnoittaa toisistaan poik-keavasti. Sähkömagneetin kärki 18' voidaan myös pinnoittaa • ·
useamman kerran. Kärkiosa on pestävä ennen välineen uudelleen käyttöä ja tämä on helposti hoidettavissa esimerkiksi automaattisessa laitteessa (vrt. kuvio 5C). Kuvion 5F
15 102906 ratkaisussa kärkiosa on suojakalvon 21 ympäröimänä (pidike merkitty numerolla 26). Suojakalvon ohuudesta johtuen sähkömagneetin kentän voimakkuus on hyvä. Sopivasti muotoillen kuvioiden 5E ja 5F kärkiosia voidaan välinettä käyttää pienissä tilavuuksissa. Muuttamalla katteen 23, magneettikärjen 18' ja suojakalvon 21 suhteita toisiinsa voidaan tuntuvasti vaikutta partikkeleiden keräysominai-suuksiin.
Kuviossa 6 on esitetty mikropartikkeleihin immobilisoidun entsyymin annostelu- ja pesujärjestelmä. Järjestelmä käsittää levyn 30, jossa on reagenssikuoppia 31, jotka sisältävät annosteltavan määrän mikropartikkeleita, joihin entsyymi on sidottu, ja mahdollisesti tarvittavat säilytysaineet. Levyssä on lisäksi pesunestekuoppia 32, jotka sisältävät sopivan pesunesteen, johon reagenssikuopasta nostettu mikropartikkelimäärä on upotettavissa pesua varten. Rea-genssikuopat 31 ja pesunestekuopat 32 on sopivasti järjestetty vierekkäisiin riveihin. Annostelu on helposti automatisoitavissa tällä järjestelmällä. Partikkeleiden siirtoväline viedään ensin reagenssikuoppaan 31, josta kerätään koko siihen annosteltu mikropartikkelimäärä. Haluttaessa voidaan ottaa suurempi määrä immobilisoitua entsyymiä raktioon keräämällä haluttu määrä entsyymiä useammasta kuopasta 31. Sen jälkeen siirtoväline siihen kiinnitettyine mikropartikkeleineen viedään tarvittaessa pesunestekuoppaan 32 tai suoraan reaktioastiaan. Pesun tarkoituksena on pois-taa entsyymien säilytysliuoksesta mahdollisesti mukaan tullut glyseroli tai muu reaktiossa epäsuotuisasti vaikut-tava aines entsyymivalmisteesta. Pesun jälkeen mikropartik-kelit viedään reaktioastiaan. Levyssä 30 voi myös olla • · « erillisiä pesunestekuoppia 33, jotka sisältävät sopivan pesunesteen, jolla voidaan pestä reaktioastiasta siirretyt mikropartikkelit. Levyssä 30 voi lisäksi olla isompia kuoppia eli jatkosäilytysastioita 34, joihin viedään mikro- .·. : partikkelit kuopissa 33 tapahtuneen pesun jälkeen.
Edellä kuvattu siirtoväline ja levy 30 voivat yhdessä 16 102906 muodostaa automaattisen laitteen pääkomponentteja. Siirto-välineitä voi laitteessa olla useitakin ja ne voivat olla kytkettyjä robottiin, joka ohjaa niiden toiminnan prosessin vaatimien olosuhteiden mukaisesti.
KEKSINNÖN SOVELLUKSET
Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu DNA:n pilkkomiseen restriktioentsyymin avulla, sekä muidenkin molekyylibiologisissa menetelmissä/sovelluksissa käytettävien entsyymien käyttöön. Mikropartikkeleihin immobilisoitu entsyymi siirretään reaktioastiaan, jossa entsymaattisen reaktion annetaan tapahtua halutun ajan. Reaktion jälkeen siirretään mikropartikkelit ja niihin sidottu entsyymi pois reaktioas-tiasta. Näin immobilisoidun entsyymin inaktivointia ei tarvitse suorittaa. Käytetyt immobilisoidut entsyymit siirretään pesukuoppaan, jossa mahdolliset epäpuhtaudet reaktioseoksesta pestään pois. Pestyt immobilisoidut entsyymit siirretään keräysastiaan tai muuhun erityisesti niille varattuun astiaan niiden uudelleenkäyttöä odottamaan .
Restriktioentsyymikäsittelyn jälkeen voidaan reaktioastiaan siirtää esimerkiksi mikropartikkeleihin immobilisoitu CIAP- entsyymi (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) tai jokin ; ; muu valitussa sovelluksessa tarvittava immobilisoitu ent- ««· syymi. Niiden käyttämisessä sovelletaan edellä kuvattua menetelmää saavuttaen samoja etuja kuin immobilisoitujen • « restriktioentsyymien tapauksessa.
• · r • · i
Koska käytetyt entsyymit voidaan siirtää pois, saadaan • · · ’ entsyymien inaktivoimisvaihe poistettua kokonaan. Samalla menetelmä on huomattavasti yksinkertaisempi ja nopeampi kuin perinteinen entsyymien inaktivoiminen. Kaaviossa 1 esitetystä vertailusta yksinkertaisen restriktioentsyymi-CIAP-käsittelyn tapauksessa nähdään, että uudessa menetel-'· ' mässä lukuisat vaiheet ovat jääneet pois tarpeettomina.
17 102906
Kaaviossa 2 on esitetty keksinnön sovellutus DNA:ta pilkkovien ja/tai modifioivien entsyymien kierrätyksessä ja käsittelyssä.
Keksinnön avulla on aikaansaatu menetelmä, jossa mikropar-tikkeleihin immobilisoitua proteaasia (esimerkiksi Pro-teinaasi K) voidaan käyttää inaktivoixnaan mikä tahansa haluttu entsyymi reaktioastiasta. Proteinaasi K on erittäin yleinen ja paljon käytetty entsyymi. Valitettavasti tämä entsyymi on erittäin stabiili ja vaatii tehokkaan inakti-voinnin (fenoliuutos). Kuvatun keksinnön mukaisesti Proteinaasi K:ta voidaan käyttää ja poistaa erittäin tehokkaasti reaktioastiasta. Toinen käyttötapa immobilisoidulle Proteinaasi K:lie on sen käyttäminen minkä tahansa liuoksessa olevan entsyymiaktiivisuuden poistamiseksi. Tällaisessa käyttömuodossa immobilisoitu Proteinaasi K täydentää keksinnön etuja yleisenä entsyymien inaktivointitoimenpi-teenä. Tällainen käyttötapa on erittäin hyödyllinen esimerkiksi tapauksissa, joissa inaktivoitavaa entsyymiä ei kyetä saattamaan immobilisoitavaan muotoon, inaktivoitava entsyymi on epäpuhtautena reaktiossa tai haluttaessa varmistaa ehdoton entsyymien inaktivoituminen reaktioseoksessa. Immobilisoitu Proteinaasi K täydentää keksinnön laajamittaisen käytön molekyylibiologian sovelluksissa.
·...· Keksinnön mukaisen menetelmän avulla voidaan ottaa entsyymi « « :.V talteen reaktioseoksesta uudelleenkäyttöä varten. Menetel- • I · ’ män avulla voidaan myös siirtää entsyymi annosteluastiasta reaktioseokseen. Haluttaessa voidaan viedä magneetin avulla vangitut mikropartikkelit pesunesteeseen glyserolin tai • · muun stabilointiaineen poispesemiseksi ennen kuin mikropar-m· m tikkelit viedään reaktioseokseen. Pesuastiassa mikropartik- • · t '· " kelit voidaan tarvittaessa vapauttaa magneettikentästä, jolloin partikkelit pääsevät vapaaksi ja pesu tehostuu.
.·. : Keksinnön kohteena olevan, ohuella kalvolla suojatun mag neettisen siirtovälineen avulla saavutetaan etuja myös muissakin sovelluksissa kuin immobilisoitujen entsyymien 18 102906 käytössä. Sovelluksia, joissa magnetoitavaa materiaalia käytetään, ovat esimerkiksi DNA:n puhdistus, RNA:n puhdistus, mRNA:n puhdistus, sekvenointi, affiniteettipuhdistus, cDNA kirjastojen valmistaminen, DNA/RNA koettimien valmistus, DNA/RNA koettimien leimaus, DNA/RNA hybridisaatiot, PCR menetelmät, ligaasi -amplifikaatiomenetelmät ja monistetun (esimerkiksi PCR) DNAsn määritys.
Keksintö soveltuu pienten tilavuuksien käsittelyyn magne-toitavan materiaalin kanssa. Saatettaessa magneetti (suoja-kuorella varustettu) liuokseen saavutetaan suuria etuja magnetoitavan materiaalin keräystapahtumaan perinteiseen verrattuna. Erityisesti on huomioitava se, että tässä tapauksessa magneettipartikkelit voidaan yksinkertaisesti siirtää liuoksesta pois. Perinteisessä tavassa magneetti-partikkelit jäivät reaktioastiaan ja liuos dekantoitiin pois. Saatettaessa magneetti liuokseen on magneetin ja magneettipartikkelien etäisyys lyhyempi verrattuna ulkopuolisen magneetin käyttöön. Samaten liuospintaan jäävien magneettipartikkelien, pintajännityksestä johtuen, keräys on tehokkaampaa saatettaessa magneetti liuokseen. Ongelmaksi tässäkin tapauksessa muodostuu pienten liuostilavuuksien käsittely ja myös riittävän tehokkaan magneettikentän synnyttäminen. Ulkopuolinen magneetti voi olla kuinka suuri tahansa ja samalla hyvin voimakas kerätäkseen suhteellisen pienetkin magnetoitavat partikkelit reaktioastian si- v · säseinämään. Magneetin koolle on suuret rajoitukset toimit-taessa pienissä astioissa ja pienissä liuostilavuuksissa. Magneetikentän voimakkuus on verrannollinen magneetin kokoon ja kerättävän magnetoitavan materiaalin etäisyyteen.
• ·
Suuria magneettipartikkeleita (10-100 μπι) voidaan kerätä « · · suhteellisen heikoillakin magneeteilla kun taas erittäin • · *. " pieniä (< 0.05 μπι) magneettipartikkeleita voidaan kerätä ·. .· vain erityisten high-gradient magneettien avulla. Käytännön . ·. sovelluksissa esimerkiksi molekyylibiologian alueella ; toimitaan 0.1-10 μπι läpimittaisten magneettipartikkelien kanssa. Yleensä on edullista käyttää mahdollisimman pieniä magneettipartikkeleita, koska muun muassa niiden sitomiska- 19 102906 pasiteetti ja reaktiokineettiset ominaisuudet ovat suuret verrattuna suurempiin magneettipartikkeleihin. Pienikokoisen magneetin avulla kyetäänkin yleensä keräämään suhteellisen suuria magneettipartikkeleita, koska magneettikentän ja etäisyyden välillä on voimakas riippuvuus eli magneettikenttä heikkenee nopeasti etäisyyden kasvaessa.
Konkreettisina esimerkkeinä keksinnön sovelluksista molekyylibiologian alalla voidaan mainita: 1. DNA inserttien kloonaus:
Restriction enzymes ( esim. EcoR I, Hind III, Bam HI, Pst I, Sal I, Bgl II, Κρη I, Xba I, Sac I, Xho I, Hae III, Pvu II, Not I, Sst I, Bgl I)
Creating blunt ends (esim. lämpöstabiilit polymeraasit, Klenow Fragment DNA Polymerase I, Mung Bean nukleaasi)
Ligation (esim. T4 DNA Ligase, E. coli DNA Ligase, T4 RNA Ligase)
Phosphorylation (esim. T4 Polynucleotide Kinase)
Dephosphorylation (esim. CIAP, E. coli Alkaline Phosphata- . . se, T4 Polynucleotide Kinase) · · * · • · a • · « λ! Nested deletions (esim. T4 DNA Polymerase, lämpöstabiilit ' polymeraasit, Exo III Nuclease, Mung Bean Nuclease) « « · *·*·* 2. cDNA:n syntetisointi 1a kloonaus: (esim. Reverse Trans- « · V : criptase, RNase H, DNA polymerase I, T4 DNA polymerase I, ;\J E. coli DNA Ligase) 3. Nukleiinihappojen leimaus: ·. 5' leimaus (esim. T4 Polynucleotide Kinase) 3' addition (esim. T4 RNA Ligase) 20 102906 3' fill-in (esim. Klenow Fragment DNA Polymerase I, T4 DNA Polymerase) 3' exchange (esim. T4 DNA Polymerase, lämpöstabiilit poly-meraasit)
Nick-translation ( esim. E. coli DNA Polymerase I, lämpöstabiilit polymeraasit)
Replacement synthesis (esim. T4 DNA Polymerase, lämpöstabiilit polymeraasit, Exo III Nuclease)
Random priming (esim. Klenow Fragment DNA Polymerase I, lämpöstabiilit polymeraasit) RNA probes (esim. T7 RNA Polymerase, SP6 RNA Polymerase) 4. Nukleiinihappojen sekventointi: DNA:n sekventointi (esim. E. coli DNA Polymerase I, Klenow Fragment DNA Polymerase I, lämpöstabiilit polymeraasit) RNA:n sekventointi (esim. Reverse Transcriptase, lämpöstabiilit käänteistanskriptaasit) 5. Nukleiinihappojen mutaqenointi:
Oligonucleotide directed (esim. T4 DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, lämpöstabiilit polymeraasit)
Misincorporation (esim. Exo III Nuclease, Klenow Fragment DNA Polymerase I, lämpöstabiilit polymeraasit « · t < ·
• I
« · > 6. Mapping: * * * · • · t i.I Restriction (esim. Exo III Nuclease)
Footprinting (esim. Exo III Nuclease) V *
Transcript (esim. Reverse Transcriptase, Mung Bean Nuclea-:: se)
I I I P
'. '. 7. Nukleiinihappojen (esim. DNA, RNA, mRNA, DNA/RNA koetti- ' ' met) puhdistaminen ia eristäminen 21 102906 8. Analyyttiset menetelmät lesimerkkejä): DNA Diagnostic Techniques: - DNA Mapping - DNA sequencing - Molecular analysis of point mutations - Chromosome analysis - DNA libraries - DNA amplification methods (PCR, Inverse PCR, Ligase chain reaction (LCR),
Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), Q beta replicase)
- Quantification of DNA/RNA
- Ribonuclease Protection Assay DNA diagnostics in Genetic disorders - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) - AFLP (Amplified Fragment Polymorphism) DNA diagnostics in Infections: - bacterial infections - drug resistance of microorganisms - epidemiology of infectious diseases Other applications of DNA diagnostics: - forensic applications (DNA fingerprints) .···, - artificical chromosomes • · - drug safety studies in molecular level « I f • · ««» • « « *·' Human Genome Project: - mapping of choromosomes • · « *·*·* - DNA sequencing • · · V : - mapping and sequencing of model organisms
Yllä mainitut keksinnön suoritusmuodot ovat vain esimerkkejä keksinnön mukaisen idean toteuttamisesta. Alan ammatti-·’ ' miehelle on selvää, että keksinnön erilaiset suoritusmuodot voivat vaihdella jäljempänä esitettävien patenttivaatimusten puitteissa.
22 1°29θ6 PERINTEINEN MENETELMÄ! ' : UUSI MENETELMÄ __ DNA(esimerkiksi plasmidi) DNA(esimerkiksi plasmidi) + Restriktioentsyymi + Restriktioentsyymi (Magnetoitavaan _·*· Puskun._ materiaaliin immobilisoitu) | _+ Puskuri.___ _Seisotus(l-3 tuntia)._ 1 I | Seisotus(l-3 tuntia). j
Jos DNA on pilkottu yhdellä 1 ' restriktioentsyytnillä lisätään Siirretään magnetoitavaan materiaaliin reaktioseokseen CLAP (Calf immobilisoitu restriktioentsyymi pois liuoksesta.
Intestinal Alkaline Phosphatase). ^ __ Jos DNA on pilkottu yhdellä
Seisotus(60 minuuttia). | restriktioentsyymillä lisätään 4 reaktioseokseen magnetoitavaan materiaaliin 1 ,^ra^n TT-kyiiä»ti.ttyä immobilisoitu CLAP (Calf fenoli-klorofonni -liuosta. _Intestinal Alkaline Phosphatase)._ i .+., —η
Sekoitetaan 1 minuutti. Seisotus(60 minuuttia).
i +. ~
Sentrifugoidaan 2 minuuttia. Siirretään magnetoitavaan materiaaliin -J immobilisoitu CIAP pois liuoksesta.
Siirretään ylempi liuosfaasi uuteen putkeen ja lisätään kloroformi-isoamyylialkoholi -liuosta.
‘ i
Sekoitetaan 1 minuutti.
Sentrifugoidaan 2 minuuttia.
Siirretään ylempi liuosfaasi uuteen putkeen ja lisätään kloroformi-isoamyylialkoholi -liuosta..
_Sekoitetaan 1 minuutti._
Sentrifugoidaan 2 minuuttia.
Siirretään ylempi liuosfaasi uuteen putkeen ja lisätään ammonium ase taa tti -liuosta ja etanolia.
;···. i • · · * Seisotetaan 30 minuuttia -70 °C:ssa.
• « *— " —'' i — • f < * · ▼ ___ .. _Sentrifugoidaan 5 minuuttia._
v I
Siirretään ylempi liuosfaasi pois ja pestään saatu DNA saostuma etanolilla.
« t I 11.··.. I. \ • « · • · · w • i ’ 1 ·.. Kuivataan pelletti vakuumieksikkaattorissa.
V . I
. . Lisätään steriiliä vettä.
« · 1 f « , Ψ + ·’·'>, _Jatkokäsittelyt._ _Jatkokäsittelyt._ ♦ · · 23 102906 (--“Λ ρ Μ \ 'Piv- ι ζ - ? 5 - <r r - r -
t JP
^ / > s ΝΡν ί/ - ρ,.
•/ -' N&J
/ ^ / Ζ Ε > S®3f£· I Ε 0.^7^ .. Ζ $ y&/ ι \ ν,^ %\ / “Ρ /ρ * * % \ Ξ ν'<?τ' ”· \ 7 / <?· .·.*. ^ \ ζ - / .-? f \ / < “ / ,*Ν ; ; ^ \ ς?:_ / / • * > \ ; < Σ Σ / < \ > ” ^* ^ Μ 5 ί Ζ ϊ _ t 5 - ? Λ J . V-· · Λ < ; < “ : i : >$ · * < <
M‘ ^ .¾.. I
. :’· O « 'v_-J
~-l

Claims (22)

1. Menetelmä mikropartikkeleihin immobilisoidun, erityisesti molekyylibiologiassa käytettävän entsyymin tai nukleoti-disekvenssin siirtämiseksi ensimmäisestä astiasta toiseen astiaan, jolloin 5. mikropartikkelit ovat magneettista tai magnetisoitavissa olevaa materiaalia, tai mikropartikkelit on liitetty magneettiseen tai magnetisoitavissa olevaan kappaleeseen, ja - mikropartikkelit, joihin entsyymi tai nukleotidisekvenssi on immobilisoitu, vangitaan ensimmäiseen astiaan upotetun 10 magneetin avulla, siirretään magneetti vangittunne mikro-partikkeleineen toiseen astiaan, ja vapautetaan mikropartikkelit magneetin vaikutuksesta, tunnettu siitä, että magneetin pinta erotetaan mikropartikkeleista ohuen venyvän kalvon avulla.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että magneetti on kestomagneetti, joka lähennetään kalvoa kohti mikropartikkeleiden vangitsemiseksi kalvoon, ja että kestomagneetti viedään kalvosta poispäin mikropartikkeleiden vapauttamiseksi.
2« 102906
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että magneetti on sähkömagneetti, joka magnetisoi-daan mikropartikkeleiden vangitsemiseksi kalvoon, ja että sähkömagneetin magneettikenttä poistetaan mikropartikkelei-den vapauttamiseksi. • · ·. 25
4 . Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, *! tunnettu siitä, että mikropartikkelit ovat superparamag- neettisia partikkeleita. • · • ·
5. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikropartikkelit ovat paramagneettisia : 30 partikkeleita.
: 6. Jonkin patenttivastimuksista 1-5 mukainen menetelmä, • · 25 1 0 2 9 0 6 tunnettu siitä, että entsyymi on restriktioentsyymi.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on DNA/RNA:ta modifioiva entsyymi.
8. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että menetelmän avulla otetaan entsyymi talteen reaktioseoksesta.
9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmän avulla siirretään entsyymi 10 annosteluastiasta reaktioseokseen.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että magneetin avulla vangitut mikropartikkelit viedään pesunesteeseen ennen kuin ne viedään reaktioseokseen .
11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että magneettisiin tai magnetoitavissa oleviin mikropartikkeleihin immobilisoitu entsyymi tai nukleotidisekvenssi siirretään automaattiseen laitteeseen liitetyn siirtovälineen avulla.
12. Mikropartikkeleihin immobilisoidun molekyylibiologiassa • · • ’ käytettävän entsyymin annostelu- ja pesujärjestelmä, tun- nettu siitä, että järjestelmä käsittää ·’: - levyn (30), jossa on reagenssikuoppia (31), jotka sisäl- tävät valmiiksi annosteltavan määrän mikropartikkeleita, > · 25 joihin entsyymi on sidottu, ja mahdollisesti tarvittavat säilytysaineet, ja pesunestekuoppia (32), jotka sisältävät *99 sopivan pesunesteen, johon reagenssikuopasta nostettu mikropartikkelimäärä on upotettavissa pesua varten ennen reaktioastiaan vientiä, sekä 30. siirtovälineen (10), joka käsittää tangon (17), ja sen ; päässä olevan magneetin (18), sekä ohuen venyvän kalvon ] (21)/ joka erottaa magneetin (18) mikropartikkeleista, 102906 mutta joka ei olennaisesti heikennä mikropartikkeleihin kohdistuvaa magneettikenttää.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen annostelu- ja pesujärjestelmä, tunnettu siitä, että se käsittää pesunestekuoppia 5 (33), jotka sisältävät sopivan pesunesteen reaktioastiasta reaktion jälkeen siirrettävien mikropartikkelien pesua varten ennen mikropartikkelien vientiä jatkosäilytysastiaan (34).
14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen annostelu- ja 10 pesujärjestelmä, tunnettu siitä, että reagenssikuopat (31) ja pesunestekuopat (32, 33) on järjestetty vierekkäisiin riveihin ja että mahdollinen jatkosäilytysastia (34) on yksittäisenä kuoppana levyllä.
15. Immobilisoitua molekyylibiologiassa käytettävää entsyy-15 miä tai nukleotidisekvenssiä sitovien mikropartikkeleiden vangitsemiseen ja uudelleen vapauttamiseen soveltuva siirtoväline (10), tunnettu siitä, että se käsittää tangon (17), ja sen päässä olevan magneetin (18), sekä ohuen venyvän kalvon (21), joka erottaa magneetin (18) mikropar-20 tikkeleista, mutta joka ei olennaisesti heikennä mikropartikkeleihin kohdistuvaa magneettikenttää.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen siirtoväline, tunnettu siitä, että se käsittää putkimaisessa runko-osassa (11) aksiaalisuunnassa edestakaisin liikuteltavissa olevan .·. 25 tangon (17), jonka kärjessä oleva magneetti (18) on kesto- ··. magneetti, ja runko-osan (11) päässä olevan kärkikuvun (20), jonka kalvomaista pohjaa (21) vasten kestomagneetin • · pinta (22) on painettavissa, mikropartikkeleiden vangitse-·* * miseksi kalvomaiseen pohjaan (21), josta mikropartikkelit 30 on irrotettavissa kun kestomagneettia (18) liikutetaan poispäin kalvomaisesta pohjasta (21). > I · .· ·.
17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen siirtoväline, tunnettu siitä, että magneetti (18) on sähkömagneetti, jonka tangon 102906 (17) kärjessä on ohut venyvä kalvo (21), ja että sähkömagneetti on magnetisoitavissa mikropartikkeleiden vangitsemiseksi kärkiosan kalvoon (21), josta mikropartikkelit on irrotettavissa, kun sähkömagneetin magneettikenttä poiste-5 taan.
18. Menetelmä DNA:n pilkkomiseksi restriktioentsyymin avulla, tunnettu siitä, että mikropartikkeleihin immobi-lisoitu restriktioentsyymi siirretään reaktioastiaan, jossa DNA:n pilkkominen suoritetaan, ja että immobilisoitu rest- 10 riktioentsyymi siirretään pois reaktioastiasta halutun reaktion jälkeen patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä .
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikropartikkeleihin immobilisoitu modifioiva 15 entsyymi, erityisesti proteinaasi K, CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase), E. coli alkaline phosphatase, DNA ligaasi, RNA ligaasi, DNA polymeraasi, RNA polymeraasi tai nukleaasi siirretään reaktioastiaan, ja että immobilisoitu entsyymi siirretään pois reaktioastiasta halutun reaktion 20 jälkeen patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä.
20. Menetelmä nukleotidisekvenssin, kuten DNA:n, RNA:n, mRNA:n tai cDNA:n, siirtämiseksi astiasta toiseen, tunnettu siitä, että mikropartikkelit, joihin nukleotidisekvenssi tulee sitoutumaan, siirretään reaktioastiaan, jossa nukle- 25 otidisekvenssi (DNA, RNA, mRNA tai cDNA) saatetaan sitoutu- • · maan mikropartikkeleihin, ja mikropartikkelit siirretään pois reaktioastiasta halutun käsittelyä jän jälkeen patent- " tivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä. • · · * m
[ · · '.· · 21. Menetelmä entsyymien inaktivoimiseksi Proteinaasi K:n 30 avulla, tunnettu siitä, että mikropartikkeleihin immobi-: lisoitu Proteinaasi K siirretään reaktioastiaan, jossa :entsyymien inaktivoiminen suoritetaan, ja että immobilisoi-tu Proteinaasi K siirretään pois reaktioastiasta halutun reaktion jälkeen patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetel- 28 102906 mällä.
22. Menetelmä molkyylibiologiassa käytettävien, mikropar-tikkeleihin inunobilisoitujen restriktioentsyymien tai DNA/RNA:ta modifioivien entsyymien käyttämiseksi analyytti-5 siin menetelmiin, tunnettu siitä, että immobilisoidut entsyymit siirretään reaktioastiaan, jossa halutun reaktion annetaan tapahtua, ja immobilisoidut entsyymit siirretään pois reaktioastiasta reaktion jälkeen patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä. • # • · • · • · • a • > • · • · • · • • a • a • • · • · • · 29 102906
FI980399A 1998-02-23 1998-02-23 Menetelmä ja väline aineen siirtämiseksi FI102906B1 (fi)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI980399A FI102906B1 (fi) 1998-02-23 1998-02-23 Menetelmä ja väline aineen siirtämiseksi
EP99904897A EP1058851B1 (en) 1998-02-23 1999-02-19 Devide and method for transferring magnetic particles
DK99904897T DK1058851T3 (da) 1998-02-23 1999-02-19 Indretning og fremgangsmåde til overföring af magnetiske partikler
ES99904897T ES2245088T3 (es) 1998-02-23 1999-02-19 Dispositivo y procedimiento para la transferencia de particulas magneticas.
AT05101337T ATE443258T1 (de) 1998-02-23 1999-02-19 Verfahren zum übertragen einer substanz
EP05101337A EP1548441B1 (en) 1998-02-23 1999-02-19 Method for transfer of a substance
US09/600,816 US6468810B1 (en) 1998-02-23 1999-02-19 Magnetic particle transfer device and method
PCT/FI1999/000135 WO1999042832A1 (en) 1998-02-23 1999-02-19 Magnetic particle transfer device and method
AU25242/99A AU2524299A (en) 1998-02-23 1999-02-19 Magnetic particle transfer device and method
DE69941437T DE69941437D1 (de) 1998-02-23 1999-02-19 Verfahren zum Übertragen einer Substanz
DE69926218T DE69926218T2 (de) 1998-02-23 1999-02-19 Vorrichtung und verfahren zur übertragung magnetischer partikel
AT99904897T ATE300046T1 (de) 1998-02-23 1999-02-19 Vorrichtung und verfahren zur überführung magnetischer partikeln
JP2000532723A JP2002504685A (ja) 1998-02-23 1999-02-19 磁性粒子移送装置及び方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI980399A FI102906B1 (fi) 1998-02-23 1998-02-23 Menetelmä ja väline aineen siirtämiseksi
FI980399 1998-02-23

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI980399A0 FI980399A0 (fi) 1998-02-23
FI102906B true FI102906B (fi) 1999-03-15
FI980399A FI980399A (fi) 1999-03-15
FI102906B1 FI102906B1 (fi) 1999-03-15

Family

ID=8550960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI980399A FI102906B1 (fi) 1998-02-23 1998-02-23 Menetelmä ja väline aineen siirtämiseksi

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6468810B1 (fi)
EP (2) EP1058851B1 (fi)
JP (1) JP2002504685A (fi)
AT (2) ATE443258T1 (fi)
AU (1) AU2524299A (fi)
DE (2) DE69926218T2 (fi)
DK (1) DK1058851T3 (fi)
ES (1) ES2245088T3 (fi)
FI (1) FI102906B1 (fi)
WO (1) WO1999042832A1 (fi)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7622046B2 (en) 2002-10-18 2009-11-24 Biocontrol Systems, Inc. Magnetic transfer method, a device for transferring microparticles and a reactor unit

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19823719B4 (de) * 1998-05-27 2011-12-15 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum Aufkonzentrieren von Substanzen
GB9923324D0 (en) * 1999-10-01 1999-12-08 Pyrosequencing Ab Separation apparatus and method
DE19958042A1 (de) * 1999-12-03 2001-06-21 Invitek Gmbh Oberflächenmodifizierte Trägermaterialien zur Bindung biologischer Materialien, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
FI108232B (fi) 2000-02-16 2001-12-14 Bio Nobile Oy Menetelmä aukon sulkemiseksi ja avaamiseksi
AU2001282785A1 (en) * 2000-08-23 2002-03-04 Imego Ab A sample collecting arrangement and a method
US20020048821A1 (en) * 2000-08-24 2002-04-25 David Storek Sample preparing arrangement and a method relating to such an arrangement
US7998746B2 (en) * 2000-08-24 2011-08-16 Robert Otillar Systems and methods for localizing and analyzing samples on a bio-sensor chip
ATE349011T1 (de) * 2000-10-03 2007-01-15 Minerva Biotechnologies Corp Magnetisches in situ dilutionsverfahren
US6649419B1 (en) * 2000-11-28 2003-11-18 Large Scale Proteomics Corp. Method and apparatus for protein manipulation
US7169578B2 (en) 2001-07-27 2007-01-30 Surface Logix, Inc. Cell isolation and screening device and method of using same
US7169577B2 (en) 2001-07-27 2007-01-30 Surface Logix, Inc. Cell isolation and screening device and method of using same
US7285412B2 (en) 2001-07-27 2007-10-23 Surface Logix Inc. Device for magnetic immobilization of cells
EP1553176A4 (en) * 2002-10-16 2008-10-01 Universal Bio Research Co Ltd DEVICE FOR INTRODUCING BIOLOGICAL MATERIAL, METHOD FOR INTRODUCING BIOLOGICAL MATERIAL AND MAGNETIC SUPPORT FOR INTRODUCING BIOLOGICAL MATERIAL
KR100483684B1 (ko) * 2003-01-29 2005-04-18 (주)바이오넥스 핵산 또는 다양한 생물학적 물질을 분리 및 정제하기 위한키트와, 이러한 키트를 이용하여 생물학적 물질의 분리또는 정제 작업을 자동화하기 위한 시스템
GB0319671D0 (en) * 2003-08-21 2003-09-24 Secr Defence Apparatus for processing a fluid sample
MXPA06002784A (es) * 2003-09-12 2006-06-14 Biocontrol Systems Inc Metodos, composiciones y equipos para la concentracion y deteccion de microorganismos.
FI20040159A0 (fi) * 2003-10-20 2004-02-02 Bio Mobile Oy Magneettinen siirtomenetelmä, mikropartikkelien siirtolaite, ja reaktioyksikkö
FI20031635A0 (fi) * 2003-11-11 2003-11-11 Thermo Electron Oy Partikkelien erotusväline
US8211386B2 (en) 2004-06-08 2012-07-03 Biokit, S.A. Tapered cuvette and method of collecting magnetic particles
FI20045231A0 (fi) * 2004-06-18 2004-06-18 Bio Nobile Oy Menetelmä ja laite näytteen ottamiseksi ja annostelemiseksi
US7219567B2 (en) * 2005-01-05 2007-05-22 Bio-Magnetics Ltd. Combinatorial pipettor device
DE102005004664B4 (de) * 2005-02-02 2007-06-21 Chemagen Biopolymer-Technologie Aktiengesellschaft Vorrichtung und Verfahren und Verwendung zum Abtrennen von magnetischen oder magnetisierbaren Partikeln aus einer Flüssigkeit sowie deren Verwendungen
US7534081B2 (en) 2005-05-24 2009-05-19 Festo Corporation Apparatus and method for transferring samples from a source to a target
US7597520B2 (en) 2005-05-24 2009-10-06 Festo Corporation Apparatus and method for transferring samples from a source to a target
KR100682945B1 (ko) * 2005-05-24 2007-02-15 삼성전자주식회사 상 분리를 이용한 세포 분리 방법 및 키트
US7727473B2 (en) 2005-10-19 2010-06-01 Progentech Limited Cassette for sample preparation
US7754148B2 (en) 2006-12-27 2010-07-13 Progentech Limited Instrument for cassette for sample preparation
FI20051248L (fi) 2005-12-02 2007-06-03 Bio Nobile Oy Biologisten komponenttien rikastusyksikkö ja rikastusmenetelmä
US20070166835A1 (en) * 2005-12-23 2007-07-19 Perkinelmer Las, Inc. Multiplex assays using magnetic and non-magnetic particles
WO2007075910A2 (en) * 2005-12-23 2007-07-05 Perkinelmer Las, Inc. Methods and compositions for detecting enzymatic activity
US20070172941A1 (en) * 2006-01-25 2007-07-26 Amir Porat Disposable vessels or tips having ultra-thin areas therein, and methods for manufacture of same
TWI296713B (en) * 2006-08-02 2008-05-11 Ind Tech Res Inst Magnetic beads-based sample separating device
JP5280626B2 (ja) * 2006-12-08 2013-09-04 電気化学工業株式会社 非磁性金属酸化物粉末における着磁性粒子の個数測定方法
JP2008167722A (ja) * 2007-01-15 2008-07-24 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法
US7799281B2 (en) 2007-01-16 2010-09-21 Festo Corporation Flux concentrator for biomagnetic particle transfer device
FR2914317B1 (fr) * 2007-03-30 2012-12-28 Biomerieux Sa Methode de decontamination d'une solution des acides nucleiques indesirables
WO2008131554A1 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Health Apparatus and process for immunomagnetic isolation of microorganisms
TWI325337B (en) * 2007-07-26 2010-06-01 Ind Tech Res Inst Magnetic separation device
TWI316874B (en) * 2007-07-26 2009-11-11 Ind Tech Res Inst Magnetic separation device
ATE471761T1 (de) 2007-08-14 2010-07-15 Qiagen Gmbh Verfahren zum suspendieren oder resuspendieren von partikeln in einer lösung sowie daran angepasste vorrichtung
US7841475B2 (en) * 2007-08-15 2010-11-30 Kalustyan Corporation Continuously operating machine having magnets
CN101377456B (zh) * 2007-08-27 2010-12-08 财团法人工业技术研究院 磁性转换分离装置
DE102007045474A1 (de) * 2007-09-21 2009-04-02 Qiagen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Behandeln von Flüssigkeiten mit magnetischen Partikeln
US8222048B2 (en) 2007-11-05 2012-07-17 Abbott Laboratories Automated analyzer for clinical laboratory
EP2229441B1 (en) 2007-12-12 2014-10-01 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Method and apparatus for magnetic separation of cells
KR101384142B1 (ko) * 2007-12-28 2014-04-14 삼성디스플레이 주식회사 표시기판, 이의 제조방법 및 이를 갖는 표시장치
DE102008047843A1 (de) * 2008-09-18 2010-04-22 Siemens Aktiengesellschaft Trenneinrichtung zur Trennung von in einer durch einen Trennkanal strömenden Suspension transportierten magnetisierbaren und nichtmagnetisierbaren Teilchen
DE102009021201A1 (de) 2009-05-13 2010-11-25 Stratec Biomedical Systems Ag Stabanordnung und Verfahren zur Extraktion magnetisierbarer Partikel aus Lösungen
US20100297778A1 (en) * 2009-05-20 2010-11-25 Abbott Laboratories Conjugate Having Cleavable Linking Agent
JP5292267B2 (ja) * 2009-12-16 2013-09-18 株式会社日立ハイテクノロジーズ 試料処理装置、試料処理方法及びこれらに使用する反応容器
EP3150690B1 (en) 2010-02-23 2022-04-06 Luminex Corporation Instrument for the manipulation of cartridges to perform nucleic acid isolation and amplification processes
US9316615B2 (en) * 2010-06-22 2016-04-19 Universal Bio Research Co., Ltd. Device for trapping biologically-relevant substances and system for collecting biologically-relevant substances
US20120019018A1 (en) * 2010-07-26 2012-01-26 Cammie Malaga Utensil retrieving apparatus
CN103501913B (zh) 2011-03-11 2017-02-15 杨贵生 磁性颗粒清除装置及方法
WO2012151473A2 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Luminex Corporation Apparatus and methods for integrated sample preparation, reaction and detection
JP5650056B2 (ja) * 2011-05-30 2015-01-07 株式会社日立ハイテクノロジーズ 試料処理装置、および試料処理方法
ES2797448T3 (es) 2011-08-01 2020-12-02 Bio Rad Laboratories Sistema de captura de células
JP5599488B2 (ja) * 2013-04-26 2014-10-01 株式会社日立ハイテクノロジーズ 試料処理方法
US10391490B2 (en) 2013-05-31 2019-08-27 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells
EP2835178B1 (en) * 2013-08-06 2017-04-12 Yantai AusBio Laboratories Co., Ltd. Centrifuge and method for centrifuging a reaction vessel unit
DE102014004578B3 (de) * 2014-03-28 2015-05-28 Gerstel Systemtechnik Gmbh & Co. Kg Vorrichtung zur automatischen Probenaufnahme
EP2982439B1 (en) * 2014-08-06 2017-10-11 Yantai AusBio Laboratories Co., Ltd. Reagent carrier unit with coupling section to permit pipettor arm attachment and handling
JP5771731B2 (ja) * 2014-09-19 2015-09-02 株式会社日立ハイテクノロジーズ 試料処理装置および試料処理方法に使用する反応容器
CN104646176B (zh) * 2015-02-11 2017-03-01 英芮诚生化科技（上海）有限公司 手动磁性固相萃取器
DE102015016068B4 (de) * 2015-12-11 2021-08-19 Hydac Cooling Gmbh Vorrichtung zum Abscheiden von ferromagnetischen Partikeln aus strömungsfähigen Fluiden
CN105628687B (zh) * 2016-02-24 2018-08-07 南京诺尔曼生物技术有限公司 一种全自动化学发光测定仪
AU2017326760A1 (en) 2016-09-16 2019-05-02 The University Of Western Australia Magnetic tool and method of collecting magnetic particles using same
DE102016219053A1 (de) 2016-09-30 2018-04-05 Hamilton Bonaduz Ag Magnetische Trennvorrichtung mit unkörperlicher Kopplung zwischen Magnetanordnung und deren Bewegungsantrieb
KR20180090543A (ko) * 2017-02-03 2018-08-13 주식회사 미코바이오메드 생물학적 시료로부터 목적하는 물질을 분리 또는 정제하기 위한 장치 및 방법
US10391493B2 (en) 2017-08-29 2019-08-27 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells
DE102017219800B4 (de) * 2017-11-08 2021-09-23 Helmholtz-Zentrum Dresden - Rossendorf E. V. Peptid-Trägermaterialien als biofunktionalisierte Sammler
US11278915B1 (en) * 2018-07-20 2022-03-22 NeoGeneStar LLC Device for capturing and releasing magnetic particles
KR102256776B1 (ko) * 2018-07-26 2021-05-27 (주)바이오니아 자석봉 블록의 교체가 가능한 표적물질 추출장치
US10633693B1 (en) 2019-04-16 2020-04-28 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for leakage control in a particle capture system
US11273439B2 (en) * 2019-05-07 2022-03-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for target material retrieval from microwells
US10900032B2 (en) 2019-05-07 2021-01-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for automated single cell processing
KR20220024734A (ko) * 2019-06-26 2022-03-03 바이오 래드 래버러토리스 인코오포레이티드 마이크로웰에서 표적 물질을 회수하기 위한 시스템 및 방법
EP3945318B1 (en) * 2020-07-31 2023-12-20 Synlab Holding Deutschland GmbH Method of pooling samples for analyte detection
WO2023131910A2 (en) * 2022-01-07 2023-07-13 Agency For Science, Technology And Research (A*Star) Rapid pathogen identification and detection molecular diagnostics technology

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4067810A (en) * 1976-02-09 1978-01-10 Ofco, Inc. Fluid filter magnet assembly
JPS55148090A (en) * 1980-01-28 1980-11-18 Inoue Japax Res Inc Preparation of compound with enzyme in magnetic field
DE3200988A1 (de) * 1982-01-14 1983-07-28 Thomas A. Dr. 6900 Heidelberg Reed Verfahren und vorrichtung zur abtrennung von organischen stoffen aus einer suspension oder loesung
FR2554016B1 (fr) * 1983-10-27 1986-08-08 Pasteur Institut Perfectionnements apportes aux moyens magnetiques destines a retirer des billes de gel magnetique d'un fluide de dosage
FR2572178B1 (fr) * 1984-10-23 1988-10-28 Pasteur Institut Nouveau dispositif magnetique destine a retirer des billes de gel magnetique d'un milieu a analyser et a les transferer sur un milieu de dosage immunoenzymatique
SE8601143L (sv) 1986-03-12 1987-09-13 Carbematrix Ab Sett och anordning for samling och spridning av ferromagnetiska partiklar i ett fluidformigt medium
FI932866A0 (fi) 1993-06-21 1993-06-21 Labsystems Oy Separeringsfoerfarande
JP3115501B2 (ja) * 1994-06-15 2000-12-11 プレシジョン・システム・サイエンス株式会社 分注機を利用した磁性体の脱着制御方法及びこの方法によって処理される各種装置
DE4421058A1 (de) 1994-06-16 1995-12-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur magnetischen Abtrennung von Flüssigkeitskomponenten
US5837144A (en) 1994-06-16 1998-11-17 Boehringer Mannheim Gmbh Method of magnetically separating liquid components
FI944940A0 (fi) * 1994-10-20 1994-10-20 Labsystems Oy Tvaofasigt separeringsfoerfarande
FI944938A0 (fi) * 1994-10-20 1994-10-20 Labsystems Oy Foerflyttningsanordning
US5736033A (en) * 1995-12-13 1998-04-07 Coleman; Charles M. Separator float for blood collection tubes with water swellable material
US5695165A (en) * 1995-12-29 1997-12-09 Rainin Instrument Co., Inc. Multi-mode attachable hanger for pipettes
DE19615254C2 (de) * 1996-04-18 1999-03-11 Diagnostikforschung Inst Gerät zur höchstempfindlichen magnetischen Detektion von Analyten
US6143578A (en) * 1996-05-10 2000-11-07 Bayer Corporation Method and apparatus for wash, resuspension, recollection and localization of magnetizable particles in assays using magnetic separation technology

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7622046B2 (en) 2002-10-18 2009-11-24 Biocontrol Systems, Inc. Magnetic transfer method, a device for transferring microparticles and a reactor unit

Also Published As

Publication number Publication date
EP1058851B1 (en) 2005-07-20
DE69941437D1 (de) 2009-10-29
ES2245088T3 (es) 2005-12-16
ATE443258T1 (de) 2009-10-15
FI980399A (fi) 1999-03-15
DE69926218T2 (de) 2006-05-24
EP1058851A1 (en) 2000-12-13
WO1999042832A1 (en) 1999-08-26
EP1548441A1 (en) 2005-06-29
EP1548441B1 (en) 2009-09-16
FI102906B1 (fi) 1999-03-15
ATE300046T1 (de) 2005-08-15
US6468810B1 (en) 2002-10-22
DE69926218D1 (de) 2005-08-25
FI980399A0 (fi) 1998-02-23
DK1058851T3 (da) 2005-08-08
AU2524299A (en) 1999-09-06
JP2002504685A (ja) 2002-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI102906B (fi) Menetelmä ja väline aineen siirtämiseksi
JP2965131B2 (ja) 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法
US7329491B2 (en) Methods for isolating nucleic acids
JP4594467B2 (ja) 常磁性粒子を用いた核酸の精製とその操作方法
JP4783016B2 (ja) 磁気移動法、微子移動装置と反応装置ユニット
JP2702450B2 (ja) 液体中の被検成分を磁気的に分離する方法
US20030199078A1 (en) Method, kit and apparatus for the isolation of nucleic acids
JP3996416B2 (ja) 核酸ハイブリダイゼーションにおけるｂ／ｆ分離方法
JP2008167722A (ja) 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法
JP6684868B2 (ja) 核酸の精製のための１工程法
EP1260595A2 (en) Nucleic acid-bondable magnetic carrier and method for isolating nucleic acid using the same
US6582922B1 (en) Method of extracting nucleic acids using particulate carrier
EP1145010A1 (en) Purification process using magnetic particles
US20110028703A1 (en) Method and apparatus for suspending magnetic microparticles
JP4214255B2 (ja) 粒子担体を使用する改良された核酸の抽出方法
EP1524317B1 (en) Methods for isolating nucleic acids
JP2017510278A (ja) 改善された濃縮方法
JP2001078761A (ja) 核酸結合性磁性シリカ粒子担体
JP2023144299A (ja) 磁気分離方法
AU2016203610B2 (en) Polynucleotide capture materials, and methods of using same
CN201823341U (zh) 磁性吸附分离装置
CN116323964A (zh) 用于分析物检测的汇集样品的方法
JPH11178571A (ja) 核酸抽出方法およびそのための試薬
MXPA98007681A (en) Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: BIO-NOBILE OY

MA Patent expired