FI101937B - Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka reagoi ihmi sen cachectiinin kanssa - Google Patents

Description

101937

Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka reagoi ihmisen cachectiinin kanssa Tämä keksintö koskee immunologisten tekniikkojen sovellutusta, jotta saataisiin 5 uusia materiaaleja, jotka ovat hyödyllisiä käsiteltäessä, inter alia, bakteeri-infektiota, ja erityisesti parantuneiden monoklonaalisten vasta-aineiden, jotka kykenevät reagoimaan ihmisen TNF:n kanssa, tuottamista ja sovellutusta.

Leviävien ärsykkeiden vieminen, kuten parasiitti-, bakteeri- tai virusinfektiot tai neoplastiset solut, alttiiseen isäntään indusoi merkittäviä metabolisia muutoksia. Jos 10 ne ovat vakavia, muutokset voivat todennäköisesti hajottaa normaalit tasapainoon liittyvät mekanismit, sekä paikallisesti että systeemisesti, mikä johtaa isännän ener-giavarastojen loppumiseen johtaen surkastumiseen (Cachexia, sairaalloinen laihuus), kudostuhoon, moninkertaiseen elinsysteemin vajaatoimintaan, shokkiin ja kuolemaan.

15 Viime aikoihin asti kliinikot uskoivat systemaattisten mallien johtuvan pääasiassa itse tunkeutuvien aineiden toiminnoista. Kuitenkin nyt tiedetään, että tunkeutuvat ärsykkeet saivat isännän synnyttämään erilaisia sytokiinejä, joiden yhdistyneet toiminnat aiheuttavat useimmat ei-toivotut biologiset vasteet. Nämä isännästä johdetut tulehdukseen liittyvät välittäjät edustavat uusia mahdollisuuksia kehitettäessä hoitoni, 20 ohjeita erilaisia tulehdustautitiloja vastaan.

• · · · • · · : Yksi tehokkain sytokiini on cachectiini, jota pääasiassa makrofagit vapauttavat sopi- van ärsykkeen jälkeen. Cachectiini, joka tunnetaan myös kasvainnekroositekijänä, :***: TNF, on proteiini, jossa on 157 aminohappoa, normaalisti havaittuina in vivo di- ;···; meerinä tai multimeerinä. Ihmisen TNF-monomeerin laskettu molekyylipaino on 25 noin 17 000 daltonia.

• · ··* ....

*·*·* TNF tornin estäen useiden adiposyytti-spesifisten proteiinien biosynteesin, kuten li- v : poproteiinilipaasin. Se toimii myös indusoimalla lukuisten muiden proteiinien bio- synteesiä tai vapautumista, mukaan lukien luokan I pääasiallinen histokompatibi- « C ( c . liteettitekijä, jyvässolu-makrofagi-pesäkettä stimuloiva tekijä ja interleukiini 1.

j ‘ 30 (Katso yleisesti Beutler ja Cerami, New England J. of Med., 316:379-385 (1987), ' ·. ’ joka on liitetty tähän viitteeksi.) « · « « I ·

Kun on havaittu TNF:n laaja vaikutus erilaisiin sairaustiloihin, on se johtanut yrityksiin kontrolloida sen toimintoja. Esimerkiksi kokeet ovat osoittaneet, että vasta- 2 101937 aineet, jotka ovat erityisen reaktiivisia TNF:n kanssa, saattavat olla terapeuttisesti hyödyllisiä kontroilloimaan immunomodulaattorivasteita, joiden nyt tiedetään liittyvän TNF:ään (katso US-patentit 4 603 106 ja 4 684 623, jotka molemmat on liitetty tähän viitteeksi). Erityisesti sellaisilla neutraloivilla vasta-aineilla, jotka kykenevät 5 sitomaan erilaisia epitooppeja ihmisen TNF:ään suurella tehokkuudella, on merkittävää potentiaalia välittämään ylimääräisten TNF-tasojen toksisten vaikutusten tehoja.

Täten on olemassa tarve parannetuille vasta-aineille, jotka kykenevät neutraloimaan TNF:n toksisia vaikutuksia in vivo. Tämä keksintö täyttää nämä tarpeet. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

10 Saadaan uudet solulinjat, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutumaan ihmisen TNF:n epitooppeihin lisääntyneellä in vivo neutralisoin-tikyvyllä. Lisäksi saadaan menetelmät ihmisen hoitamiseksi, joka on altis bakteeri-verisyydelle tai verenmyrkytykselle tai jonka ovat jo endotoksiinia sisältävät bakteerit infektoineet, antamalla ennalta ehkäisevä tai terapeuttinen määrä yhdistettä, jossa 15 on ainakin yksi monoklonaalinen vasta-aine tai sen sitova fragmentti, joka kykenee reagoimaan ihmisen TNF:n kanssa ja osoittamaan neutraloivaa aktiivisuutta L929-solun sytolyyttisessä määrityksessä vähemmässä kuin noin 400 ng:ssa, tyypillisesti noin 50-200 ng tai enemmän, koostumuksen edullisesti sisältäessä vielä fysiologisesti hyväksyttävän kantajan. Koostumuksessa voi olla myös mikä tahansa tai use-20 ampia seuraavasta: muita monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kykenevät reagoimaan bakteerien endotoksiinien tai eksotoksiinien kanssa; monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kykenevät reagoimaan tiettyjen bakteerikantojen, joilla on endotoksiineja, se- • \·* rotyyppideterminanttien kanssa; gammaglobuliinifraktio ihmisen veren plasmasta; *:··: gammaglobuliinifraktio ihmisen veren plasmasta, jolloin plasma voi olla saatu ihmi- :**: 25 sestä, jolla on kohonneet immunoglobuliinien, jotka ovat reaktiivisiä bakteerien en- • · t dotoksiinien kanssa, tasot; ja yksi tai useampia antimikrobisia aineita. Lisäksi on kehitetty kliinisiä monoklonaalisten vasta-aineiden käyttöjä.

• · Tämän keksinnön mukaisesti saadaan uusia soluja, jotka kykenevät tuottamaan sei- • · · •V ·’ laisia neutraloivia monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on toivotut affiniteetit, ja 30 koostumuksia, joissa on sellaisia vasta-aineita, sellaisten koostumusten kyetessä se-<, lektiivisesti tunnistamaan ihmisen TNF:ssä olevat epitoopit. Kohteen soluilla on tunnistettavat kromosomit, joissa niiden tai prekursorisolun alkio-linjan DNA on :: järjestäytynyt uudelleen, jotta se koodaisi vasta-ainetta, jolla on sitomiskohta toivo- :, tulle epitoopille ihmisen TNFillä. Näitä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyt- 35 tää monella eri tavalla, terapia mukaan lukien.

3 101937

Siten saadut monoklonaaliset vasta-aineet ovat erityisen hyödyllisiä verrattuna tekniikan tason mukaisiin vasta-aineisiin vakavien sairauksien käsittelyssä tai ennalta ehkäisyssä, kuten bakteeriverisyys, verenmyrkytys, kuihtuminen tai muut taudintilat, jotka liittyvät kohonneisiin TNF-tasoihin. Täten vasta-aineilla on tyypillisesti neut-5 raloiva aktiivisuus vähemmässä kuin 400 ng, edullisesti vähemmässä kuin noin 300 ng, edullisemmin noin 50-200 ng, L929-solun sytolyyttisessä määrityksessä. Tämä korkea aktiivisuuden taso sallii merkittävästi alhaisempien annostasojen käytön käsittelyissä.

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus voidaan panna täytäntöön tekemällä 10 kuolemattomaksi solulinja, joka kykenee ilmentämään nukleiinihapposekvenssiä, joka koodaa vasta-ainetta, joka on spesifinen sopivalle epitoopille ihmisen TNF:ssä. Kuolemattomaksi tehty solulinja voi olla nisäkässolulinja, joka on transformoitu on-kogeneesillä, transfektiolla, mutaatiolla tai sen kaltaisella. Sellaisiin soluihin kuuluvat myeloomalinjat, lymfoomalinjat tai muu solulinja, joka kykenee ylläpitämään 15 immunoglobuliinin tai sen sitovan fragmentin ilmenemistä ja eritystä in vitro. Immu-noglobuliini tai -fragmentti voi olla luonnostaan esiintyvä nisäkkään, joka on muu kuin edullisista hiiri- tai ihmislähteistä, immunoglobuliini, joka on tuotettu transformoimalla lymfosyytti, erityisesti pernasolu, viruksen avulla tai lymfosyytin ja neoplastisen solun fuusiolla, esim. myelooma, hybridisolulinjan tuottamiseksi. Tyy-20 pillisesti pernasolu saadaan eläimestä, joka on immunisoitu TNF:n kaltaisia antigee-,;, nejä tai sen fragmentteja vastaan, joissa on epitooppiset kohdat. Immunisaatioproto- kollat ovat hyvin tunnettuja ja voivat vaihdella melkoisesti ollen silti tehokkaita. (Katso Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. painos, Acade- « t « : · ] mic Press, N.Y. [1986], joka on liitetty tähän viitteeksi.) • · :***: 25 Hybridisolulinjat voidaan kloonata ja seuloa tavanomaisten tekniikkojen mukaisesti • · · ja detektoida solusupematanteissa olevat vasta-aineet, jotka kykenevät sitoutumaan toivottuihin ihmisen TNF:n determinantteihin sopivin affiniteetein. Sopivia hybridi- #v# solulinjoja kasvatetaan sitten suuren mittakaavan viljelmässä tai ruiskutettuna sopi- • · · van isännän vatsaonteloon vasta-aineiden tuottamiseksi vesivatsanesteeseen.

• · · • · · • 30 Joissakin tapauksissa myöhempien kokeiden supematantit voidaan seuloa sen nojal-la, että niissä on tämän keksinnön vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä ihmisen TNF- « '! ‘ proteiinille, kilpailevalla määrityksellä näillä monoklonaalisilla vasta-aineilla keino- na tunnistaa lisäesimerkkejä toivotusta anti-ihmis-TNF-monoklonaalisista vasta-aineista (niin kutsutut "blocking-vasta-aineet"). Täten hybridisolulinjoja voidaan 35 tuottaa helposti erilaisista lähteistä perustuen näiden vasta-aineiden, jotka ovat spesifisiä erityisille TNF-determinanteille sopivilla affiniteettitasoilla, saatavuuteen.

4 101937

Vaihtoehtoisesti kun on saatavilla hybridisolulinjoja, jotka tuottavat vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä kohteen epitooppikohdille, nämä hybridisolulinjat voidaan fuusioida muiden neoplastisten B-solujen kanssa, jolloin sellaiset muut B-solut voivat toimia resipientteinä genomiselle DNA:lle, joka koodaa vasta-aineita. Nämä vasta-5 aineet voivat olla toiminnallisia solun pinnalla mutta eivät esimerkiksi reseptoreina. Vaikka jyrsijän, erityisesti hiiren, neoplastiset B-solut ovat yleisemmin käytettyjä, voidaan muitakin nisäkäslajeja käyttää, kuten jäniseläimet, nauta, lammas, hevonen, porsas, lintu tai sen kaltaiset.

Monoklonaaliset vasta-aineet voivat olla mitä tahansa immunoglobuliinien luokkaa 10 tai alaluokkaa, kuten IgM, IgD, IgA, IgE tai IgG:n alaluokkia, jotka tunnetaan jokaiselle eläinlajille. Yleisesti, monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää koskemattomina tai sitovina fragmentteina, kuten Fv, Fab, F(ab')2, mutta yleensä koskemattomana.

Tämän keksinnön solulinjoja voidaan käyttää muuhun kuin monoklonaalisten vasta-15 aineiden suoraan tuottoon. Solulinjat voidaan fuusioida muiden solujen (kuten sopivasti lääkkeeksi merkityn ihmisen myelooman, hiiren myeloomien tai ihmisen lym-fablastisolujen) kanssa, jotta tuotettaisiin hybridoomia tai trioomia ja täten saaden geenien siirtoa varten, jotka koodaavat monoklonaalisia vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti solulinjoja voidaan käyttää kromosomien, jotka koodaavat immunoglobuliinejä, 20 lähteenä, jotka voidaan eristää ja siirtää soluihin muilla tekniikoilla kuin fuusiolla. Lisäksi monoklonaalisia vasta-aineita koodaavia geenejä voidaan eristää ja käyttää rekombinantti-DNA-tekniikkojen mukaisesti spesifisen immunoglobuliinin tuotta-miseksi erilaisissa isännissä. Erityisesti valmistamalla cDNA-kirjastoja lähetti-·:··· RNA.sta voidaan yksittäinen cDNA-klooni, joka koodaa immunoglobuliinejä ja va- 25 paita introneja, eristää ja panna sopivaan prokaryoottiseen tai eukaryoottiseen eks- • · · pressiovektoriin ja sen jälkeen transformoida isäntään, lopullista suurtuotantoa varten. (Katso yleisesti US-4 172 124, 4 350 683, 4 363 799, 4 381 292 ja 4 423 147. Katso myös Kennet, et ai., Monoclonal Antibodies, Plenum New York [1980] ja siinä viitatut viitteet, joista kaikki on liitetty tähän viitteeksi.) • · « • · · 30 Tarkemmin hybridi-DNA-tekniikan mukaisesti tämän keksinnön immunoglobuliine- "" ja tai -fragmentteja voidaan tuottaa bakteereissa tai hiivassa. (Katso Boss, et ai.

*!' Nucl. Acid. Res., 12:3791 ja Wood et ai., Nature 314:446, joista molemmat on lii- • · · tetty tähän viitteeksi.) Esimerkiksi lähetti-RNA, joka on transkrinoitu geeneistä, jot-ka koodaavat monoklonaalisten vasta-aineiden kevyttä ja raskasta ketjua, joita tämän 35 keksinnön solulinja tuottaa, voidaan eristää myös differentiaali-cDNA-hybridisaa-tiolla käyttämällä cDNA:ta BALB/c-lymfosyyteistä, jotka ovat muita kuin kohteena 5 101937 oleva klooni. mRNA:ssa, joka ei hybridisoidu, on runsaasti lähettiä, joka koodaa toivottuja immunoglobuliiniketjuja. Jos tarpeellista, tämä prosessi voidaan toistaa, jotta lisättäisiin vielä toivottuja mRNA-tasoja. Vähennetty mRNA-koostumus voidaan sitten käänteis-transkriboida, jotta saataisiin cDNA-seos, joka on rikastettu 5 haluttujen sekvenssien suhteen. RNA voidaan hydrolysoida sopivalla RNAasilla ja ssDNA tehdä kaksoisjuosteiseksi DNA-polymeraasi I:llä ja satunnaisilla alukkeilla, esim. satunnaisesti fragmentoitu vasikan kateenkorvan DNA. Saatu dsDNA voidaan sitten kloonata insertoimalla sopivaan vektoriin, esim. virusvektorit, kuten lambda-vektorit tai plasmidivektorit (kuten pBR322, pACY184, jne.). Kehittämällä koetti-10 mia, jotka perustuvat tunnettuihin kevyen ja raskaan ketjun vakioalueiden sekvens-seihin ne cDNA-kloonit, joilla on geeni, joka koodaa haluttua kevyttä ja raskasta ketjua, voidaan tunnistaa hybridisaatiolla. Sen jälkeen geenit voidaan leikata plasmi-dista, manipuloida poistamalla tarpeeton DNA ylävirtaan aloituskodonista tai va-kioalue DNA:sta ja se viedään sitten sopivaan vektoriin isäntään transformointia 15 varten ja geenin lopullista ilmentämistä varten.

Sopivasti nisäkäsisäntiä (esim. hiirisoluja) voidaan käyttää prosessoimaan ketjua (esim. liittämään raskas ja kevyt ketju), jotta tuotettaisiin koskematon immunoglo-buliini ja lisäksi eritettäisiin immunoglobuliini, jossa ei ole johtosekvenssiä, jos toivottua. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää yksisoluisia mikro-organismeja kahden 20 ketjun tuottamiseen, jolloin saatetaan tarvita lisämanipulaatioita poistamaan DNA- ,;, sekvenssit, jotka koodaavat eritys- ja prosessointisignaaleja, samalla kun saadaan « aloituskodoni sekvenssin, joka koodaa raskasta ketjua, 5'-päähän. Tällä tavoin voi-;; *; daan valmistaa immunoglobuliinit ja prosessoida niin, että ne kootaan ja glykosyloi- ♦ 4 « : · ] daan muissa soluissa kuin nisäkässoluissa. Jos toivottua, jokainen ketjuista voidaan * ‘ 25 typistää niin, että ainakin vaihteleva alue jää, alue jota voidaan sitten manipuloida toisille immunoglobuliineille tai -fragmenteille, jotka ovat spesifisiä TNF-epitoo- • · · · peille (katso esim. eurooppalaiset patenttihakemusjulkaisut 0 239 400 ja 0 125 023, jotka on liitetty tähän viitteeksi).

• · • · · • · · Tämän keksinnön monoklonaaliset vasta-aineet ovat erityisen hyödyllisiä niiden *\ * 30 suuren ihmisen TNF-epitooppien affiniteetin takia. Myös jotkin monoklonaalisista vasta-aineista ovat suojaavia in vivo sallien liittymisen farmaseuttisiin tuotteisiin, kuten vasta-ainekombinaatiot bakteeri-infektioihin.

:: Tämän keksinnön monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää myös laajalti in viri • · ro. Esimerkin vuoksi monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää puhdistamaan 35 luonnollista tai ihmisen rekombinantti-TNF:ää, selektiivisesti poistamaan ihmisen TNF:ää proteiinien heterogeenisestä seoksesta tai sen kaltaiseen.

6 101937 Tämän keksinnön monoklonaalisia vasta-aineita voidaan myös liittää farmaseuttisten koostumusten komponenteiksi, joissa koostumuksissa on terapeuttinen tai ennalta ehkäisevä määrä ainakin yhtä tämän keksinnön monoklonaalisia vasta-ainetta, mutta tavallisesti seosta, joka koostuu kahdesta tai useammasta keksinnön mukaises-5 ta monoklonaalisesta vasta-aineesta, jossa on farmaseuttisesti tehokasta kantajaa. Farmaseuttinen kantaja pitäisi olla mikä tahansa sekoittuva, ei-toksinen aine, joka on sopiva jakamaan monoklonaalisia vasta-aineita potilaalle. Steriiliä vettä, alkoholia, rasvoja, vahoja ja inerttejä kiinteitä aineita voidaan käyttää kantajana. Farmaseuttisiin koostumuksiin voidaan lisätä myös farmaseuttisesti hyväksyttyjä adjuvantteja 10 (puskuroivia aineita, dispergoivia aineita). Sellaisissa koostumuksissa voi olla monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä vain ihmisen TNFille. Vaihtoehtoisesti farmaseuttisessa koostumuksessa voi olla monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat suoraan bakteerien kanssa ja joita käytetään muodostamaan "cocktail". Esimerkiksi cocktail, jossa on monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat ihmisen 15 TNF-epitooppeja ja ryhmää erilaisia bakteerikantoja vastaan (esim. erilaista sero-tyyppiä), jotka aiheuttavat verenmyrkytystä, olisi yleismaailmallinen tuote, joka olisi aktiivinen suurta pääosaa kliinisiä eristyksiä vastaan, jotka ovat vastuussa taudeista.

Erilaisten monoklonaalisten vasta-ainekomponenttien moolisuhde ei eroa tavalli-20 sesti enempää kuin tekijällä 10, useimmiten ei enempää kuin tekijällä 5 ja on tavalli-sesti moolisuhteessa noin 1:1-2 jokaiseen muuhun vasta-ainekomponenttiin. Kun ” ‘ i tämän keksinnön monoklonaalisia vasta-aineita käytetään yhdistelmänä, niitä käyte- ;;1; tään tavallisesti samanlaisina molaarisina suhteina.

Tämän keksinnön monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää myös yhdessä ole- :***: 25 massa olevien veren plasmatuotteiden kanssa, kuten kaupallisesti saatavilla olevan • · · gammaglobuliini- ja immuuniglobuliinituotteiden kanssa, joita käytetään ihmisen verenmyrkytyksen ennaltaehkäisevään tai terapeuttiseen käsittelyyn. Edullisesti im->v< munoglobuliineja varten plasma saadaan ihmisluovuttajilta, joilla on kohonneet im- «Il M munoglobuliinitasot, jotka reagoivat endotoksiinia sisältävien bakteerien kanssa.

• · « 30 (Katso, yleisesti käsikirja "Intravenous Immune Globulin and the Compromised t .·:* Host," Amer. J. Med. 76(3a), maaliskuun 30. 1984, ss. 1-231, joka on liitetty tähän viitteeksi).

Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää myös erikseen annettuina koostumuksina annettuna yhdessä antibioottien tai antimikrobisten aineiden kanssa. Tyy-35 pillisesti antimikrobisiin aineisiin voi kuulua penisilliini yhdessä aminoglykosidien 7 101937 kanssa (esim. gentamysiini, tobramysiini, jne.), mutta myös muita lukuisia ammat-timiehille hyvin tunnettuja aineita voidaan käyttää.

Siitä syystä tämän keksinnön monoklonaaliset vasta-aineet ja farmaseuttiset koostumukset ovat erityisen hyödyllisiä suun kautta tai ruoansulatuskanavan ulkopuoli-5 sesti tapahtuvaan lääkkeenantomuotoon. Farmaseuttiset koostumukset voidaan antaa edullisesti ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta so. ihonalaisesti, lihaksensisäisesti, valtimonsisäisesti tai laskimonsisäisesti. Täten tämä keksintö antaa koostumukset ruoansulatuskanavan ulkopuoliselle lääkkeenantomuodolle, mihin kuuluu monoklo-naalisen vasta-aineen liuos tai siitä tehty cocktail, joka on liuotettu hyväksyttävään 10 kantajaan, edullisesti vesipitoiseen kantajaan. Erilaisia vesipitoisia kantajia voidaan käyttää, esim. vettä, puskuroitua vettä, 0,4 % suolaliuosta, 0,3 % glysiiniä ja niiden kaltaisia. Nämä liuokset ovat steriilejä ja yleensä niissä ei ole osasista koostuvaa ainetta. Nämä liuokset voidaan steriloida tavanomaisilla, hyvin tunnetuilla sterili-sointitekniikoilla. Koostumuksissa voi olla farmaseuttisesti hyväksyttäviä apuainei-15 ta, joita tarvitaan arvioimaan fysiologisia tiloja, kuten pH:n säätö ja puskuroivat aineet, toksisuutta säätelevät aineet ja sen kaltaiset, esimerkiksi natriumasetaatti, nat-riumkloridi, kaliumkloridi, kalsiumkloridi, natriumlaktaatti, jne. Vasta-aineen kon-sentraatio voi vaihdella laajasti näissä formuloinneissa, s.o. vähemmästä kuin 0,5 %, tavallisesti 1 % tai vähintään 1 % niin paljon kuin 15 tai 20 paino-% ja valitaan pää-20 asiassa perustuen nestetilavuuksiin, viskositeetteihin, jne., edullisesti valittu tietylle . ·. lääkkeenantomuodolle.

* . Γ Täten tyypillinen farmaseuttinen koostumus lihaksensisäistä ruiskutusta varten voi- • * · • V täisiin tehdä sisältämään 1 ml steriiliä puskuroitua vettä ja 500 mg monoklonaalista *:··: vasta-ainetta. Tyypillinen koostumus laskimonsisäistä infuusiota varten voitaisiin :***: 25 tehdä sisältämään 250 ml steriiliä Ringerin liuosta ja 150 mg monoklonaalista vasta- ··· ainetta. Varsinaiset menetelmät valmistettaessa koostumuksia ruoansulatuskanavan • · · ulkopuolista lääkkeenantomuotoa varten ovat tunnettuja tai ilmeisiä ammattimiehille ja niitä kuvataan yksityiskohtaisemmin, esimerkiksi teoksessa Remington's Pharma- • · · J.I ceutical Science, 15. painos, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania *\ * 30 (1980), mikä on liitetty tähän viitteeksi.

··· Tämän keksinnön monoklonaalisia vasta-aineita voidaan lyofilisoida varastointia varten ja palauttaa alkuperäiseen kokoonpanoonsa sopivassa kantajassa ennen käyttöä. Tämän tekniikan on osoitettu olevan tehokas tavanomaisten immuuniglobulii-nien kanssa ja alalla tunnettuja lyofilisointitekniikkoja alkuperäiseen kokoonpa-35 noonsa palauttamistekniikkoja voidaan käyttää. Ammattimiehet ymmärtävät, että lyofilisaatio ja alkuperäiseen kokoonpanoonsa palauttaminen voi johtaa erilaista as- 8 101937 tetta olevaan vasta-aineen aktiivisuuden katoamiseen (esim. tavanomaisilla immuu-niglobuliineilla, IgM-vasta-aineilla on taipumusta suurempaan aktiivisuuden katoamiseen kuin IgG-vasta-aineilla) ja käyttötasot täytyy säätää kompensoimaan.

Koostumuksia, joissa on näitä monoklonaalisia vasta-aineita tai sen cocktailia voi-5 daan antaa ennalta ehkäisevään ja/tai terapeuttiseen minkälaisten tahansa bakteeri-infektoiden käsittelyyn. Terapeuttisessa sovellutuksessa koostumuksia annetaan potilaalle, joka on jo infektoitunut yhdellä tai useammalla bakteerikannalla, määränä joka on riittävä parantamaan tai ainakin osittain pysäyttämään infektion ja sen komplikaatiot. Sopivaa määrää, joka täyttää tämän, kuvataan "terapeuttisesti tehok-10 kaaksi annokseksi". Määrät, jotka ovat tähän tehokkaita, riippuvat infektion vakavuudesta ja potilaan oman immuunisysteemin yleisestä tilasta, mutta rajoittuu yleensä noin 1-200 mg vasta-ainetta kilogrammaa kehonpainoa kohti, annosten 5-25 mg kilogrammaa kohti ollessa tavallisemmin käytettyjä. On pidettävä mielessä, että tämän keksinnön materiaaleja voidaan yleensä käyttää vakavissa sairauden tiloissa, se 15 on, elämää uhkaavissa tai mahdollisesti elämää uhkaavissa tilanteissa, etenkin bak-teeriverisyydessä ja endotoksemiassa.

Ennaltaehkäisevissä sovellutuksissa annetaan koostumuksia, joissa on tätä vasta-ainetta tai sen cocktailia, potilaalle, joka ei vielä ole infektoitunut, kohottamaan potilaan resistenssiä mahdollisia infektioita vastaan. Sellaista määrää kuvataan "ennalta-·;· 20 ehkäiseväksi tehokkaaksi annokseksi". Tässä käytössä tarkat määrät riippuvat taas

• » > I

potilaan terveydentilasta ja yleisestä immuunisuustasosta, mutta rajoittuu yleensä • .·. 0,1-25 mg kilogrammaa kohti, erityisesti 0,5-2,5 mg kilogrammaa kohti.

• · • ·

Koostumusten yksittäiset tai moninkertaiset annostelut voidaan suorittaa annosta-

• M

soina ja käsittelevä lääkäri valitsee mallin. Joka tapauksessa farmaseuttisten formu-:T: 25 lointien pitäisi antaa sellaiset määrät tämän keksinnön vasta-ainetta (aineita), jotka ovat riittävän tehokkaita käsittelemään tai ennalta ehkäisemään potilasta.

• · • · · ’·'[·' TNF:n tuotto ja puhdistaminen • · • · ·

Synteettinen geeni, joka koodaa metioniinin aloitusta ja valmiin TNF:n sekvenssiä, '!!! ilmentää ihmisen rekombinantti-TNF:ää (Pennica et ai., Nature, 312:724-729 (1984) 30 ja Shirai et ai., Nature, 313:803-806 (1985), joista molemmat on liitetty tähän viitteeksi) hiivassa solunsisäisenä proteiinina kodoneina, jotka valittiin heijastamaan runsaasti ilmentyneitä hiivageenejä standardi tekniikkojen mukaisesti. Synteettiset sekvenssit asetettiin alavirtaan hybridialkoholidehydrogenaasi/glyseraldehydi-3-fos-faattidehydrogenaasi (ADH2/GAPDH)-promoottorista. TNF-synteesi indusoitiin 9 101937 transformoiduissa Saccharomyces cerevisiae -viljelmissä glukoosivajauksella. Noin 5-10 % kokonaishiivaproteiinista oli TNF:ää.

TNF puhdistettiin karkeista hiivauutteista (a) ammoniumsulfaattijakotislauksella, (b) Q-Sepharose nopeavirtauspylväskromatografialla, (c) S-Sepharose nopeavirtauspyl-5 väskromatografialla ja (d) Sephacryl S-200 (HR) pylväskromatografialla.

Tällä menetelmällä saatiin noin 80 % takaisinsaanti TNF-aktiivisuudessa määritettynä aktinomysiini D-käsitellyillä L929-soluilla (RufF ja Gifford, (1981) Tumor Necrosis Factor, Lymphokines, 2:235-272). Puhdistetun TNF:n spesifinen aktiivisuus oli 2-4 x 10** yksikköä/mg ja puhtaus suurempi kuin 98 % pääteltynä SDS-10 polyakryyliamidigeelielektroforeesilla.

TNF:ää vastaan olevien monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen BALB/c-hiiret immunisoitiin vatsaontelon sisäisesti 5-25 pg:lla Freundin täydellistä adjuvanttia ja annettiin lisäannos kaksi kertaa samalla annoksella Freundin epätäydellisessä adjuvantissa 3 viikon välein. Lopullinen vatsaontelon sisäinen lisäannos 15 samaa annosta vesipitoisessa liuoksessa annettiin ja fuusio suoritettiin 3-4 päivää myöhemmin.

Immunisoitujen hiirien pernasolut (noin 10** solua) fuusioitiin noin 2 x 107 mye-··· loomasolun kanssa (P3-X63-Ag.653) (Keamey et ai., J. Immunol. (1979) 123:1548- 1550) käyttämällä polyetyleeniglykolia Kohler ja Milstein (Nature 256:495 (1979)) 20 mukaisesti. Solut maljattiin mikrotiitterimaljoille ja hybridit selektoitiin hypoksan-' ,': tiiniaminopteriinitymidiini (HAT)-alustalla.

• · ·

Suoritettiin 5 fuusiota 5 TNF:llä immunisoidun hiiren pernasoluilla. Käyttämällä :j: : kiinteä faasi entsyymikytketty immunosorbentti -määrityksiä saatiin 60 positiivista kloonia, jotka tuottivat vasta-aineita TNF:lle.

• · • · « Y.f 25 Positiivisten kaivojen hybridit kloonattiin 3 kertaa rajalaimennuksilla, jotta varmis-• · · . *·[ * tettaisiin, että jokainen oli todellinen klooni. Kloonattiin 14 TNF-positiivista hybri- ·:· doomaa ja luonnehdittiin ne.

* * 9 t * TNF/TNF-biomääritys: L-292-solu solumyrkyllisyys . ·. : TNF-aktiivisuus mitattiin käyttämällä sytolyyttistä määritystä aktinomysiini D-käsi- 30 tellyillä L292-soluilla, kuten Ruff ja Gifford kuvaavat teoksessa Lymphokines 2:235, (1981), joka on liitetty tähän viitteeksi.

ίο 101937 L292-soluja (CCL1, American Type Culture Collection, Rockville, (MD) pidetään RPMI 1640:ssa, johon on lisätty 10 mM Hepestä ja 10 % naudan sikiön seerumia (tai DME + 10 % FBS). Konfluentit viljelmät (3-4 x 10^ solua/75 cm pullo) vapautetaan lyhyellä trypsiinikäsittelyllä (huuhdellaan 0,05 %:lla trypsiinillä) fysiologi-5 sessa suolaliuoksessa, jossa on 5 mM EDTA ja 10 mM Hepes, pH 7,4 ja suspendoi-daan uudelleen tuoreeseen alustaan, jossa on aktinonysiini D:tä (lpg/ml). Sitten solut maljataan 96 kaivon mikrotiitteriastoihin (5-7x10^ solua/kaivo).

Sen jälkeen, kun solut ovat olleet 2 h viljelmässä, lisätään kaivoihin laimennussarja-näytteitä (vähemmän kuin 10-20 % seerumia) ja maljoja inkuboitiin yön yli (5 % 10 CC>2, 37 °C). Näytteet määritettiin neljänä kappaleena. Seuraavana päivänä mikro skooppisen arvoinnin jälkeen alusta dekantoitiin ja kaivot täytettiin 0,2 % kiistalli-violettiliuoksella, 10 % formaliinilla ja 0,01 fosfaatilla pH 7-7,5, 5 min., pestiin läpikotaisin vedellä ja kuivattiin. Lyysauksen aste määritettiin spektrofotometrisesti (550-570 nM) mikrotiitterilukijalla. Määrityksen tulokset ilmaistaan U/ml, jolloin 1 15 yksikkö (U) kuvataan TNF-määräksi, joka johtaa 50 % solujen lyysaukseen.

In vitro neutralisointimääritys

Ihmisen rekombinantti-TNF:ää (20 ng/ml 0,02 M Tris NClissä, pH 8,0, 0,15 M NaCl, 1 mg/ml BSA) sekoitetaan vastaavien laimennettujen vasta-ainemäärien kans-. saja inkuboidaan 37 °C:ssa 60 min. Seosta laimennetaan 1:10 tuoreella alustalla, ···; 20 jossa on aktinomysiini D:tä (pg/ml); ja lisätään 0,1 ml laimennussarjaa (kaksin- · · · kertainen) neljänä kappaleena mikrotiitterikaivoihin. Jäljelle jäänyt sytolyyttinen : aktiivisuus määritetään käyttämällä L292-solu solutoksisuusmääritystä.

.···. Monoklonaalisten vasta-aineiden luonnehdinta • · · • · · : Tunnistettiin 14 hybridoomaa, jotka olivat TNF-positiivisia ja subkloonattiin ne.

25 Näiden hybridoomien tuottamista vasta-aineista luonnehdittiin niiden kyky kilpailla vJ monoklonaalisen vasta-aineen 18-1-1 kanssa. (Tracey, et ai., Nature 330:662-664 (1987), joka on liitetty tähän viitteeksi) sitoa TNF:ää ELISAssa. Kuten taulukossa 1 \# nähdään, jakautuvat monoklonaaliset vasta-aineet 3 luokkaan; sellaiset, jotka eivät kilpaile 18-1-1 :n kanssa, sellaiset, jotka kilpailevat ja sellaiset, jotka osoittavat kes-30 kimääräistä kilpailua. Jotta varmistettaisiin, että sellaiset monoklonaaliset vasta-aineet, jotka eivät kilpailleet 18-1-1 :n kanssa, olivat TNF-spesifisiä, suoritettiin TNF-vangitsemismääritys. Kiinteään faasiin sidottiin monoklonaaliset vasta-aineet vangitsemaan TNF ja monoklonaalista vasta-ainetta 18-1-1 käytettiin leimattuna vasta- aineena. Kaikki monoklonaaliset vasta-aineet olivat spesifisiä TNF:lle tässä määri tyksessä.

11 101937

Suoritettiin myös kokeita hybridoomasolujen ilmastoidulla alustalla, jotta määritettäisiin MAb'ien TNF:n solua tappavan aktiivisuuden neutralisoinnin laajuus. Kaikki 5 14 monoklonaalista vasta-ainetta tuotettiin hiiren vatsaonteloon kertyneessä nestees sä lisäluonnehtimista varten. Määritettiin puhdistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden tehokkuus suojata L292-soluja TNF:n tappamista vastaan. MAb l-2-4Bl:n neutralisoiva aktiivisuus vahvistettiin puhdistetulla materiaalilla. Kun inkuboitiin MAb 2-2-3E3:a (50 ng/ml) vastaavan määrän kanssa ihmisen rekombinantti-TNF:ää 10 (20 ng/ml) 37 °C:ssa 60 min, osoitettiin, että 50 % TNF:n sytolyyttisestä aktiivisuu desta neutraloitiin, kuten määritettiin L292-solun tappamismäärityksellä. Kuten taulukossa 1 osoitetaan, MAb 2-2-3E3, joka tunnistaa saman epitoopin kuin MAb 18-1-1, sitä tarvitaan 1/8 määränä 18-1-1 :stä solun suojelua varten. Taulukossa 1 osoitetaan myös, että suurin osa vasta-aineista, joilla on sama spesifisyys kuin 18-1-15 l:llä, neutralisoi TNF:ää (100 %) L292-solun tappamismäärityksessä. Muilla vasta-aineilla, kuten 1-2-4B1, joilla on erilaiset epitooppispesifisyydet kuin 18-1-1 :llä, oli myös merkittävää neutralisointiaktiivisuutta.

Taulukko 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden, jotka reagoivat ihmisen TNF:n kanssa, kat-···; 20 saus

Hybridooma MAb, tyyppia Kilpailumääritys Neutralisointimääritys ·;··: 18-1-lb:n kanssa Alusta Puhdistettu Ig ng .···. 18-1-1 IgG + + 400 1-2-4D4 igG + +

*** * 25 1-2-4B2 IgM

1-2-4B1C IgG - + 400 v:: 1-1-1F3 IgG - + V : 2-2-2FS IgG + + >800 ··· 1-1-4C8 IgG - + 30 2-2-3E3C IgG + +50 1-2-2F8 IgG + + 1-1-2E3 IgG + + 200 1- 2-2 AI IgG + + 2- 3-1A8 IgG + + 35 1-2-4C6 IgG + 12 101937 a) Määritetty SDS-PAGE:lla MAb:stä, joka on osittain puhdistettu vatsaonteloon kertyvästä nesteestä saostamalla ammoniumsulfaatilla.

b) Määritetty kiinteä-faasi-kilpailu-ELISAssa seuraavasti. Ilmastettua alustaa 24 h hybridoomaviljelmistä (50 μΐ) ja HPR-leimattua 18-1-1 :tä (25 μΐ, 0,2 μg/ml 5 PBS:ssä + 10 % vuohen seerumi) lisättiin joka kaivoon.

c) Solulinjat 1-2-4B1 ja 2-2-3E3 tallennettiin ATCC:ssä ja merkittiin talletus-numeroilla HB9737 ja HB9736, vastaavasti.

Anti-TNF-monoklonaalisella vasta-ainefragmentilla tehdyn jälkikäsittelyn tehokkuus estettäessä paviaaneissa verenmyrkytyksen vahingollisia vaikutuksia 10 Paviaaneille annettiin laskimon sisäisesti 2 h LDioo-infuusio Escherichia colia (E. coli). Eläimiä valvottiin 10 h ja tarkkailtiin, kunnes ne kuolivat tai korkeintaan 7 d. Aminoglykosidiantibioottia, gentamysiiniä annettiin määrättyinä aikoina 2 h E. coli -infuusion jälkeen. Neljälle paviaanille annettiin annosruiske anti-TNF-monoklonaalista vasta-aine 2-2-3E3 F-(ab')2 -fragmenttia (10 mg/kg) T+30 minuut-15 tina (yksi neljännes menetelmästä bakteeri-infuusiolla, so. "jälkikäsittely"). Lisäksi yhdelle muulle paviaanille annettiin sama annos E. colia plus gentamysiiniä ja käsiteltiin samantyyppisellä soveltumattomalla F(ab')2 -fragmenttikontrollilla.

(1) Hengissäpysymistiedot • · · · ..!: ’ Päivämäärä Koe Paviaani Paviaanin paino Annos Elossapysy- IV 20 # (kg+sukup.) E. coli misaika ·:··: (#org/kg) :***: 25.2.88 +Va 1 6,8 M 3,7xl010 17 h 1.3.88 +Va 2 14,3 M 4,6xl010 24 h 17.3.88 +Va 3 7,3 M 6,2xl010 7+d .. 25 5.4.88 +Va 4 6,6 N 4,4xl0l<> 7+d 6.4.88 Kontr. 5 6,4 N 6,5xl010 21 h • · · ’** " (kantaja) • ♦ · (2) Ruumiinavaukset

Summittaiset ruumiinavaukset tehtiin paviaaneille #1,2,5, (ruumiinavauksia ei tehty 30 henkiinjääneille paviaaneille #3,4, koska aikaisempi työ henkiinjääneillä eläimillä ei osoittanut haitallisia histologisia vaikutuksia). Karkeat ruumiinavauslöydöt eläimillä #1,2,5 olivat hyvin samankaltaiset toistensa kanssa ja ovat seuraavanlaiset: 13 101937

Keuhkot: verta vuotava (3++)

Munuaiset: verentungos, kuolioinen (3+++)

Lisämunuaiset: verta vuotavat, kuolioiset (4++)

Maksa: verentungos (2+) 5 Perna: veren vaikutuksesta venyttynyt ja verentungos

Suolet: normaalit näöltään, mutta tuppeumia ohutsuolessa havaittiin eläimissä #1,2. Sydän, haima, mahalaukku, paksusuoli: normaalit näöltään.

(3) Fysiologisia ja muita parametrejä, joita tarkkailtiin 10 h (a) Parametrit, jotka liittyivät hengissäpysymisen etuihin paviaaneilla #3,4 ja jotka 10 olivat erilaiset kuin ei-hengissäpysyneillä paviaaneilla (#1,2,5), olivat: TKeskimääräinen systeeminen valtimoperäinen paine (MSAP), TpH, ilaktaatti, 4-BUN, ^kreatiniini, ^SGPT, ikortisoli, tglukoosi, iFDP ja Tfibrinogeeni.

(b) Parametrit, jotka eivät olleet erilaisia hengissäpysyneillä (#3,4) ja ei-hengissäpysyneillä (#1,2,5) paviaaneilla, olivat: sydän ja hengitysnopeudet, WBS, verihiuta- 15 leet, pCC>2, p02, CPK, hematokriitti, kasvupesäkkeen (E coli) veren konsentraatiot, kehon lämpötila.

Kun tutkimukset toistettiin kokonaisvasta-aineilla, ei havaittu merkittäviä eroja. Täten voidaan käyttää sekä sitovia fragmentteja että koskemattomia vasta-aineita tä-; i · män keksinnön mukaisesti.

20 Edellä olevasta on ymmärrettävä, että tämän keksinnön solulinjat antavat keinot : *' tuottaa monoklonaalisia vasta-aineita ja sen ihmisen TNF:n kanssa alhaisissa neutra- * ‘ loivissa määrissä reaktiivisia ffgamentteja. Tämä sallii ennalta ehkäisevien ja tera- peuttisten koostumusten taloudellisemman kehittämisen ja niiden turvallisemman • · · v : antomuodon, jotta ne olisivat tehokkaita infektioita vastaan, jotka ovat useimpien 25 endotoksiinia sisältävien bakteerikantojen aiheuttamia. Lisäksi vasta-aineita voidaan : ‘‘: käyttää erilaisissa diagnostisissa ja muissa terapeuttisissa menetelmissä.

• · · • φ · \ Vaikka tätä keksintöä on kuvattu pelkästään esimerkinomaisesti, on selvää, että ..*·* tiettyjä muutoksia ja modifikaatioita voidaan toteuttaa patenttivaatimusten puit- :' teissä.

Claims (6)

101937

1. Solulinja, joka tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta, joka vasta-aine tai sen F(ab')2-fragmentti kykenee spesifisesti reagoimaan ihmisen cachectiinin kanssa, tunnettu siitä, että solulinja on 2-2-3E3, joka on talletettu talletuslaitokseen ATCC- 5 numerolla HB9736, tai solulinja 1-2-4B1, joka on talletettu talletuslaitokseen ATCC-numerolla HB9737.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen solulinja, tunnettu siitä, että monoklonaali-nen vasta-aine on suojaava in vivo endotoksiinia sisältäviä bakteereja vastaan.

3. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka vasta-aine kyke-10 nee neutr aloimaan cachectiiniä, tunnettu siitä, että mainittu menetelmä käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen solulinjan kasvattamisen ja solulinjan tuottamien vasta-aineiden talteenottamisen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaa-linen vasta-aine tai sen F(ab')2-fragmentti on konjugoitu merkkiaineeseen, joka antaa 15 detektoitavan signaalin.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että merkkiaine on fluoresoiva aine tai entsyymi.

• · ·; 6. Menetelmä cachectiiniaktiivisuuden inhiboimiseksi, tunnettu siitä, että • · ·: (a) saadaan aikaan monoklonaalinen vasta-aine, joka on tuotettu solulinjalla, joka • · · : 20 solulinja on 2-2-3E3, joka on talletettu talletuslaitokseen ATCC-numerolla HB9736, ""·1 tai solulinja 1-2-4B1, joka on talletettu talletuslaitokseen ATCC-numerolla HB9737; ja (b) saatetaan cachectiini kosketukseen sellaisen määrän kanssa mainittua mo-noklonaalista vasta-ainetta, joka kykenee inhiboimaan cachectiiniaktiivisuuden. • t • · · • « ♦ • ♦ • · · • · · • · · i i · · • · · · 101937