ES2966891T3 - Sustratos de prueba precargados para probar sustancias reactivas a LAL, procedimientos de uso y procedimientos de fabricación - Google Patents

Sustratos de prueba precargados para probar sustancias reactivas a LAL, procedimientos de uso y procedimientos de fabricación Download PDF

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Abstract

Un sustrato de prueba para detectar una sustancia reactiva a LAL, en el que al menos una porción de dicho sustrato de prueba se ha precargado con al menos un reactivo LAL y/o al menos un estándar reactivo a LAL. Se describen métodos de uso del sustrato de prueba. También se describen métodos para depositar reactivos de prueba sobre un sustrato de prueba. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sustratos de prueba precargados para probar sustancias reactivas a LAL, procedimientos de uso y procedimientos de fabricación
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la determinación de la concentración de sustancias reactivas a LAL en una muestra. Más concretamente, la invención se refiere a sustratos de prueba precargados y a nuevos procedimientos de medición compatibles con las pruebas de endotoxinas bacterianas ("BET") de la farmacopea estadounidense, europea y japonesa y a los estándares BET de la farmacopea equivalente mundial.
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud tiene derecho al beneficio de la Solicitud de Patente Provisional No. de Serie 61/710,908 presentada el 8 de octubre de 2012 y titulada Microfluidic Bacteria Endotoxin Testing Method and Apparatus; Solicitud de Patente Provisional No. de Serie 61/710,990 presentada el 8 de octubre de 2012 y titulada Centrypetal Microfluidic Platform for Bacterial Endotoxin Testing; Solicitud de Patente Provisional No. de Serie 61/710,898 presentada el 8 de octubre de 2012 y titulada Sensitive and Rapid Method for Detection of Low Endotoxin Levels Using LAL Reagents; y Solicitud de Patente Provisional No. de Serie 61/710,903 presentada el 8 de octubre de 2012 y titulada Microplates Pre-loaded with Endotoxin Detection Reagents with Calibration Means. Todas las solicitudes enumeradas anteriormente se incorporan a la presente memoria por referencia.
Antecedentes de la invención
La contaminación microbiana, como bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, levaduras y hongos, puede causar enfermedades graves e incluso la muerte en los seres humanos. Cuando las personas se infectan con bacterias gramnegativas, éstas pueden producir endotoxinas bacterianas que provocan fiebre. Las endotoxinas pueden ser peligrosas e incluso mortales para los seres humanos. Las moléculas de endotoxina, que son lipopolisacáridos componentes de las paredes celulares de las bacterias gramnegativas, pueden estar presentes en las fórmulas de los medicamentos y en las superficies de los dispositivos médicos, independientemente de la contaminación microbiana. La contaminación por endotoxinas puede producirse incluso si un sistema supera una prueba de esterilidad, por lo que se requiere una prueba de endotoxinas independiente.
Actualmente, se han desarrollado diversas pruebas para detectar la presencia de endotoxina en o sobre la muestra analizada utilizando lisados de hemocitos de cangrejos herradura. La coagulación se producirá cuando el lisado de hemocitos se exponga a la endotoxina. El lisado de hemocitos es un lisado de amebocitos producido a partir de la hemolinfa de varias especies de cangrejos herradura, incluidas las especies Limulus, Tachypleus y Carcinoscorpius. Un lisado amebocitario comúnmente utilizado se produce a partir de la hemolinfa de especies de Limulus o Tachypleus, y se denomina lisado amebocitario de Limulus ("LAL"). Las pruebas rutinarias que utilizan LAL como reactivo incluyen pruebas de coágulo de gel, pruebas turbidimétricos de punto final, pruebas turbidimétricos cinéticos, pruebas cromogénicos de punto final y pruebas cromogénicos cinéticos. Las pruebas que utilizan el reactivo LAL también pueden utilizarse para detectar glucanos, un marcador de contaminación fúngica.
Se puede encontrar más información sobre las pruebas de LAL y los estándares utilizados en el capítulo 85 de la Farmacopea de los Estados Unidos ("USP") "Bacterial Endotoxin Test" ("BET"), en la Farmacopea Japonesa 4.01 "Prueba de Endotoxinas Bacterianas", en la Farmacopea Europea 2.6.14 "Bacterial Endotoxin", y en otras farmacopeas nacionales equivalentes. Muchas de las farmacopeas enumeradas anteriormente han sido armonizadas. Se puede encontrar información adicional de la farmacopea armonizada internacionalmente en ICH Q4B Anexo 14 "Bacterial Endotoxin Test General Chapter". Para las pruebas de endotoxinas en productos sanitarios, se puede encontrar información en el capítulo 161 de USP "Transfusion and Infusion Assemblies and Similar Medical Devices" y ANSI/AAMI ST72 "Bacterial endotoxins - Test methods, routine monitoring, and alternatives to batch testing". Estos estándares y procedimientos suelen denominarse compendios. Lonza, Endotoxin Detection, 2010. pg 1-36. divulga 4 viales separados de diluciones de lisado (reactivo de detección) y estándar de endotoxina (estándar reactivo a LAL) suficientes para 200 pruebas ("PyrogentTM ultra Gel Clot LAL Assays"). Estos líquidos a granel están destinados a ser pipeteados, por ejemplo, en placas de 96 pocillos por el cliente en el laboratorio.
Los fabricantes de las industrias farmacéutica, de dispositivos médicos e industrias alimentarias deben cumplir ciertos estándares para garantizar que sus productos no contengan contaminación microbiana o endotoxina. Estas industrias requieren pruebas frecuentes, precisas y sensibles para detectar la existencia de endotoxinas a fin de cumplir diversos estándares de seguridad, como las establecidas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos o la Agencia de Protección del Medio Ambiente. Estas agencias aceptan muchas de los estándares de procedimientos de los compendios. Así pues, si los fabricantes desean obtener la aprobación gubernamental para lanzar un nuevo producto al mercado, muchos de los requisitos de la FDA pueden cumplirse si los productos se ajustan a los procedimientos y estándares de los compendios mencionados. Esto puede reducir sustancialmente el coste que supone para los fabricantes obtener la aprobación de la FDA para nuevos productos.
Estas pruebas en los diversos compendios requieren soluciones acuosas que comprenden concentraciones conocidas de una endotoxina para su uso como "estándares". Estas soluciones acuosas suelen ser inestables, por lo que normalmente se preparan a partir de toxinas en polvo en el lugar de la prueba justo antes de realizarla. El reactivo a LAL también suele presentarse en forma de polvo y debe reconstituirse en una solución acuosa antes de su uso.
Típicamente, sólo se requieren unos pocos miligramos de los polvos de endotoxina y LAL, por lo que la medición precisa de estos polvos puede ser tediosa. Debido a su fino tamaño de partícula, estos polvos suelen pegarse a las superficies de los recipientes y las espátulas, y son difíciles de confinar en los recipientes durante los procedimientos de prueba, lo que plantea problemas adicionales de manipulación. Con los procedimientos de prueba convencionales, un operario cualificado debe reconstituir manualmente los polvos de endotoxinas y LAL en agua libre de endotoxinas sin contaminar las soluciones reactivas con el material de laboratorio o por contacto con el medio ambiente.
La preparación de los polvos de endotoxina y LAL es difícil debido a la lenta disolución de las moléculas biológicas críticas y a su propensión a adherirse a las superficies durante la mezcla y a condensarse en ellas posteriormente. El reactivo de lAl también comienza a reaccionar lentamente tras la reconstitución y tiene una vida útil muy corta. Aunque la mejor práctica sería mezclarlos inmediatamente antes de su uso, el flujo de trabajo suele dictar que se mezclen al principio del proceso. Además, el proceso de preparación es propenso a la contaminación por endotoxinas, omnipresentes en el medio ambiente.
Las agencias también exigen una serie de pruebas de calibración para garantizar que el equipo y los reactivos utilizados funcionan correctamente. Las pruebas de calibración y las mediciones de muestras también deben realizarse más de una vez. El procedimiento actual de laboratorio para cumplir con el BET y otros compendios es muy detallado y requiere una medición repetitiva y muy precisa de los volúmenes de fluido para su distribución en múltiples entradas de una microplaca o similar sin contaminación.
El procedimiento más común de realizar una prueba de LAL es con una placa de micropocillos y un lector. Una placa de pocillos de reacción, abiertos en la parte superior y con una ventana transparente en la parte inferior, se coloca en un lector espectrofotométrico calefactado utilizado para pruebas múltiples y simultáneos. Hay muchos inconvenientes, como el tiempo que se tarda en preparar la placa, su elevado coste, la posibilidad de que se produzcan errores y contaminación, y la necesidad de que el trabajo lo realice un técnico específicamente formado y dedicado a esta tarea.
Los operarios altamente cualificados son supervisados continuamente para garantizar una técnica adecuada y la precisión de las mediciones y pruebas, y los operarios son reciclados según sea necesario para garantizar la precisión de las acciones repetitivas. Los procedimientos típicos pueden tener hasta 248 pasos de pipeteado, lentos y tediosos, lo que los convierte en procedimientos propensos a errores por su complejidad y a la contaminación por su longitud y número de manipulaciones.
Se han desarrollado procedimientos y dispositivos para reducir la cantidad de pasos o automatizar algunos o todos los pasos en las pruebas de endotoxinas. Algunos procedimientos incluyen la automatización de uno o más pasos de pipeteo o alicuotado, la mezcla automatizada de muestras o la precarga de reactivos en sustratos de prueba que sólo permiten un número muy limitado de pruebas.
Otros procedimientos automatizados se basan en la robótica para medir y distribuir muestras y reactivos en una microplaca. Una vez preparada, la placa se carga en un lector, ya sea manualmente o utilizando otro robot. El robot suele ser un sistema de dispensación basado en pipetas que transfiere con precisión muestras y reactivos de una gradilla de viales a la placa, sustituyendo las puntas de las pipetas para evitar la contaminación cruzada. Se trata de un sistema caro que necesita una validación frecuente de sus operaciones robóticas y puede utilizar múltiples desechables, pipetas, puntas, placas de multipocillos, tubos de dilución, bandejas de llenado de pipetas, viales de muestreo, etc. para cada ejecución. También prepara los pocillos en secuencia y, al igual que la preparación manual, no puede iniciar todas las reacciones simultáneamente. La contaminación sigue siendo un problema y, dado que el proceso no suele estar controlado, no hay forma legítima de rechazar muestras contaminadas por una causa.
Todos los procedimientos o dispositivos desarrollados, sin embargo, carecen de uno o más de los siguientes aspectos, automatización de bajo coste diseñada en el sustrato, sustrato limpio desechable para asegurar la limpieza, cumplimiento de pruebas de compendio en cada sustrato, validación de medición de prueba individual incorporada y simplicidad de operación de medición. Por consiguiente, existe la necesidad de un método o procedimiento de prueba más semiautomatizado para probar y analizar la concentración de endotoxina en una muestra de fluido que reduzca o elimine la cantidad de error potencial del operador que cumpla con los compendios.
Breve descripción de la invención
En consecuencia, se dan a conocer sustratos y procedimientos de prueba en los que el número de pasos se reduce significativamente, minimizando así la contaminación, los retrasos de tiempo y los desajustes, y por lo tanto, mejorando la precisión. Los procedimientos son adecuados para su uso con LAL autorizados por la FDA. Los sustratos de prueba y los procedimientos de medición divulgados son adecuados para su uso en la fabricación farmacéutica y biofarmacéutica y son compatibles con las pruebas de endotoxinas bacterianas de la farmacopea estadounidense, europea y japonesa y con los estándares BET de la farmacopea mundial equivalente. Para la fabricación de dispositivos médicos, las realizaciones divulgadas son compatibles con las regulaciones y estándares sobre endotoxinas que se encuentran en la Farmacopea internacional y las organizaciones de consenso de normas y estándares equivalentes globales.
La presente invención mejora el estándar de pruebas de endotoxinas bacterianas ("BET") mediante la creación de sustratos de prueba especializados con reactivos de detección (pueden ser reactivos de detección de endotoxinas y/o estándares reactivos a LAL precargados en el sustrato de prueba. El reactivo de prueba es: al menos un estándar reactivo a LAL, o al menos un reactivo de detección y al menos un estándar reactivo a LAL está al menos parcialmente seco, físicamente inmovilizado en el sustrato de prueba. En una realización, se divulga un sustrato de prueba precargado en el que el sustrato de prueba precargado se ha precargado con al menos un reactivo de detección y/o al menos un estándar reactivo a<l>A<l>. Estos sustratos de prueba precargados pueden utilizarse en pruebas para determinar la concentración de sustancias reactivas a LAL en una muestra acuosa. En el presente documento, por sustancia reactiva a LAL se entiende una sustancia que reacciona con los reactivos de detección. Algunos ejemplos de sustancias reactivas a LAL son la endotoxina o los 1,3-P-D-glucanos como la laminarina y el curdlan. Los estándares reactivos a LAL contienen sustancias reactivas a LAL. La presente invención también puede utilizarse con cualquier fuente comercial de reactivos de detección. Entre los reactivos de detección adecuados para detectar sustancias reactivas a LAL figuran el lisado de amebocitos (Limulus Polyphemus o LAL y Tachypleus Tridentatus o TAL), el factor C recombinante del cangrejo herradura o rFc, los reactivos de pirógenos de tipo activación de monocitos, una mezcla de factor C recombinante y LAL, y preparados que incluyan péptidos sushi, fragmentos de péptidos sushi, dímeros de péptidos sushi y otras proteínas de unión específica, como anticuerpos y proteínas de unión a receptores derivadas de bacteriófagos, y cualquier otro reactivo capaz de reaccionar con el Lípido A para producir una respuesta mensurable.
La presente invención puede reducir el número de pasos que el usuario tiene que realizar para preparar y medir tanto los estándares de calibración como las muestras. Esto puede reducir la necesidad de un alto nivel de destreza, experiencia y formación, y reducir los costes, los tiempos y la posibilidad de error humano. Además, la invención puede configurarse o utilizarse de forma que cumpla los requisitos de los compendios y las normativas de la FDA.
La invención también es adecuada para su uso con todos los procedimientos fotométricos de compendio cuantitativo de relacionar el progreso de la reacción con los niveles de endotoxina, incluyendo 1) cromogénico cinético, donde el tiempo hasta que la absorción óptica cambia en una cantidad especificada está relacionado con la concentración, 2) cromogénico de punto final, 3) turbidimétrico cinético, en el que la unidad de tiempo en que la turbidez (medida normalmente por absorción óptica) cambia en una cantidad especificada está relacionada con la concentración, y 4) turbidimétrico de punto final, en el que el cambio de turbidez en un tiempo fijo está relacionado con la concentración.
En otra realización, al menos una parte del sustrato de prueba precargado puede tener una superficie modificada. La superficie puede modificarse mediante grabado por plasma. Alternativamente, la superficie puede modificarse utilizando al menos un revestimiento. El revestimiento puede ser estático, dinámico o una combinación de ambos. Los revestimientos estáticos adecuados incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), colágeno y combinaciones de los mismos. Los revestimientos dinámicos adecuados incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), desoxicolato sódico y combinaciones de los mismos.
En otra realización, el sustrato de prueba precargado puede tener al menos una barrera mecánica entre al menos una de las porciones. La barrera mecánica puede ser soluble. El sustrato de prueba precargado puede comprender además un mecanismo de identificación de porciones, como un trazador. En otra realización, el sustrato de prueba precargado puede ser una microplaca. En otra realización, el sustrato de prueba precargado puede tener un material de barrera para proteger el sustrato de prueba precargado de la exposición ambiental y la contaminación de la superficie.
En otra realización, se describe un procedimiento para medir una sustancia reactiva a LAL en una muestra. El procedimiento comprende poner en contacto la muestra con un sustrato de prueba precargado, en el que al menos una parte del sustrato de prueba precargado se ha precargado con al menos un reactivo de detección y/o al menos un estándar reactivo a LAL, obteniéndose así una muestra preparada. El reactivo de prueba es: al menos un estándar reactivo a LAL, o al menos un reactivo de detección y al menos un estándar reactivo a LAL, está al menos parcialmente seco, físicamente inmovilizado en dicho sustrato de prueba. A continuación, puede medirse la absorbancia de la muestra.
En otra realización del procedimiento, al menos una parte del sustrato de prueba precargado puede tener una superficie modificada. La superficie puede modificarse mediante grabado por plasma. Alternativamente, la superficie puede modificarse utilizando al menos un revestimiento. El revestimiento puede ser estático, dinámico o una combinación de ambos. Los revestimientos estáticos adecuados incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), colágeno y combinaciones de los mismos. Los revestimientos dinámicos adecuados incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), desoxicolato sódico y combinaciones de los mismos.
En otra realización, el sustrato de prueba precargado puede ser una microplaca. En otra realización, el sustrato de prueba precargado puede tener un material de barrera para proteger el sustrato de prueba precargado de la exposición ambiental y la contaminación de la superficie.
En otra realización, se divulga un procedimiento para depositar al menos un reactivo de prueba en una microplaca. Los reactivos de prueba pueden ser cualquier reactivo que ayude a analizar las muestras. Los reactivos de prueba adecuados incluyen, entre otros, reactivos de detección y estándares reactivos a LAL. Los reactivos de detección adecuados se han descrito anteriormente y pueden comprender lisado de amebocitos. Los estándares reactivos a LAL también se describen más arriba e incluyen un Estándar de Referencia de Endotoxina USP (RSE) que se ha calibrado según el Estándar Internacional de Endotoxina de la Organización Mundial de la Salud vigente. El procedimiento puede comprender proporcionar un sustrato de prueba que tiene una placa de pocillos que comprende una pluralidad de pocillos, donde cada pocillo tiene al menos una superficie de ventana óptica y una pluralidad de superficies de ventana no ópticas. Una primera solución líquida que contenga al menos un reactivo de detección puede colocarse en una primera superficie de ventana no óptica de al menos un pocillo. La primera solución líquida puede secarse sobre la superficie de la primera ventana no óptica, depositando así el reactivo de detección sobre la primera superficie no óptica para formar un sustrato de prueba precargado.
El procedimiento para depositar al menos un reactivo de prueba sobre un sustrato de prueba comprende además colocar una segunda solución que tenga al menos un estándar reactivo a LAL en el mismo sobre una segunda superficie de ventana no óptica de diferentes pocillos, y en el que dicho estándar reactivo a LAL está presente en una pluralidad de concentraciones y cada concentración está presente en un pocillo diferente. La segunda solución líquida se seca sobre la superficie de la segunda ventana no óptica, depositando así el estándar reactivo a LAL sobre la superficie de la segunda ventana no óptica.
En otra realización, el sustrato de prueba puede ser una microplaca. En otra realización, el procedimiento puede comprender además cubrir el sustrato de prueba precargado con un material de barrera después del paso de secado para proteger el sustrato de prueba precargado de la exposición ambiental y la contaminación de la superficie.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra una realización de la invención en la que un reactivo de prueba puede depositarse en las paredes laterales de una microplaca.
Descripción detallada de realizaciones ejemplares
En una realización, se divulga un sustrato de prueba precargado en el que el sustrato de prueba precargado se ha precargado con al menos un reactivo de detección y/o al menos un estándar reactivo a lAl . El sustrato de prueba precargado está diseñado para medir el BET en muestras. También puede utilizarse para proporcionar datos de calibración a partir de picos conocidos utilizando un estándar reactivo a LAL. Los sustratos de prueba precargados pueden diseñarse para cumplir todos los requisitos de la normativa farmacéutica BET vigente y pueden utilizarse con procedimientos BET turbidimétricos, cromogénicos y de coágulo de gel. El estándar reactivo a LAL puede ser una endotoxina que se ha calibrado con la endotoxina maestra reguladora pertinente (CSE) y el estándar de endotoxina maestro regulador (RSE). Cuando otros procedimientos son aceptables o han sido validados como equivalentes y aceptables para las agencias reguladoras, se puede utilizar una calibración almacenada basada en datos históricos en lugar de los resultados de los estándares individuales.
En consecuencia, se divulgan sustratos de prueba precargados y procedimientos en los que el número de pasos de prueba se reduce significativamente, minimizando así la contaminación, los retrasos de tiempo y los desajustes, y por lo tanto, mejorando la precisión. Los procedimientos son adecuados para su uso con reactivos de detección autorizados por la FDA. Los procedimientos pueden utilizarse con un lector estándar de absorbancia o de microplacas con control térmico incorporado, un mezclador y un lector óptico para determinar los resultados BET
En otra realización, el estándar reactivo a LAL puede precargarse en al menos tres porciones diferentes del sustrato de prueba precargado. Estas tres porciones diferentes pueden formar una porción de calibración. La concentración del estándar reactivo a LAL en cada porción puede ser la misma o diferente. Si se utiliza endotoxina, la primera porción puede tener una cantidad tal que cuando una muestra acuosa (o agua pura) está presente en esa porción, la concentración de endotoxina en la muestra oscila entre 0,005 y 0,5 EU/mL. Del mismo modo, la segunda porción puede tener una cantidad correspondiente a una concentración comprendida entre 0,05 y 5,0 EU/mL y la tercera porción puede tener una cantidad correspondiente a una concentración comprendida entre 0,5 y 50 EU/mL.
En otra realización, al menos dos porciones del sustrato de prueba precargado pueden formar una porción de medición de muestra. Las dos porciones pueden cargarse con un estándar reactivo a lA l para formar picos.
El reactivo de detección y/o el estándar reactivo a LAL pueden depositarse sobre diversos sustratos de prueba, como sobre las paredes laterales de un pocillo de la microplaca para permitir una medición del blanco de muestra, sobre la ventana óptica de un pocillo de la microplaca, sobre un revestimiento soluble o sobre una película insoluble ópticamente translúcida o reflectante. Alternativamente, los reactivos de prueba pueden añadirse como perlas secas o partículas gruesas, o depositarse en un medio portador que se añade al sustrato de prueba.
En otra realización, al menos una parte del sustrato de prueba precargado puede tener una superficie modificada. La superficie puede modificarse mediante grabado por plasma. Alternativamente, la superficie puede modificarse utilizando al menos un revestimiento. El revestimiento puede ser estático, dinámico o una combinación de ambos. Los revestimientos estáticos adecuados incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), colágeno y combinaciones de los mismos. Los revestimientos dinámicos adecuados incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), desoxicolato sódico y combinaciones de los mismos.
En otra realización, el sustrato de prueba precargado puede tener al menos una barrera mecánica entre al menos una de las porciones. La barrera mecánica puede ser soluble.
El sustrato de prueba con reactivos precargados puede envasarse de tal manera que quede sellado del medio ambiente mediante el uso de un material de barrera que impida que la humedad, las bacterias y los agentes de endotoxina contaminen los reactivos precargados. En consecuencia, en otra realización, el sustrato de prueba precargado puede tener un material de barrera para proteger el sustrato de prueba precargado de la exposición ambiental y la contaminación de la superficie. En otra realización, el sustrato de prueba precargado puede ser una microplaca.
Los errores de introducción de muestras pueden reducirse aún más mediante una pluralidad de mecanismos de identificación opcionales en el sustrato de prueba precargado o en un lector configurado para leer o medir muestras en el sustrato de prueba. Los mecanismos de identificación pueden identificar la muestra al usuario o notificarle si necesita reactivos adicionales. Los medios de identificación adecuados pueden incluir marcadores ópticos como marcadores de color, marcadores alfanuméricos o diodos emisores de luz. En una realización, el mecanismo de identificación puede ser un trazador. Un trazador es un compuesto inerte que se añade a un fluido para ayudar a determinar el volumen, la ubicación del fluido y su movimiento (movimientos del fluido). El trazador también puede utilizarse para ayudar a validar los datos de medición. Los trazadores adecuados incluyen, entre otros, los colorantes.
En otra realización, se describe un procedimiento para medir una endotoxina en una muestra. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "muestra" puede incluir no sólo la muestra a analizar, sino también el agua que no muestre reacción con el reactivo de detección o el lisado empleado en el límite de detección. Las muestras de agua no reactiva también pueden denominarse "agua reactiva a LAL", "agua para BET" o "agua para inyección".
El procedimiento puede comprender el contacto de la muestra con un sustrato de prueba precargado en el que al menos una parte del sustrato de prueba precargado se ha precargado con al menos un reactivo de detección y/o al menos un estándar reactivo a LAL, obteniéndose así una muestra preparada. A continuación, puede medirse la absorbancia de la muestra.
La muestra puede entrar en contacto con más de una porción del sustrato de prueba. La muestra preparada que entra en contacto con el sustrato de prueba precargado puede o no entrar en contacto con un reactivo de prueba. Por ejemplo, la muestra preparada puede ser un "blanco" o control negativo que no entra en contacto con ningún reactivo de prueba, o sólo entra en contacto con un reactivo de detección. En otro procedimiento, una porción del sustrato puede precargarse además con al menos un estándar reactivo a LAL. Si el estándar reactivo a LAL es un estándar de endotoxina, puede estar presente en una pluralidad de concentraciones, en las que cada concentración está presente en una porción diferente del sustrato, como se ha descrito anteriormente. Las endotoxinas pueden precargarse en el sustrato de forma que pueda generarse una "curva estándar", tal como se exige en el USP 85. En otra realización, la pluralidad de concentraciones estándar de endotoxina puede utilizarse para generar una curva estándar.
En otra realización del procedimiento, al menos una porción del sustrato de prueba precargado puede tener una superficie modificada. La superficie puede modificarse mediante grabado por plasma. Alternativamente, la superficie puede modificarse utilizando al menos un revestimiento. El revestimiento puede ser estático, dinámico o una combinación de ambos. Los revestimientos estáticos adecuados incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), colágeno y combinaciones de los mismos. Los revestimientos dinámicos adecuados incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), desoxicolato sódico y combinaciones de los mismos.
En otra realización, el sustrato de prueba precargado puede ser una microplaca. En otra realización, el sustrato de prueba precargado puede tener un material de barrera para proteger el sustrato de prueba precargado de la exposición ambiental y la contaminación de la superficie.
En otra realización, se divulga un procedimiento para depositar al menos un reactivo de prueba en una microplaca. Los reactivos de prueba pueden ser cualquier reactivo que ayude a analizar las muestras. Los reactivos de prueba adecuados incluyen, entre otros, reactivos de detección y estándares reactivos a LAL. Los reactivos de detección adecuados se han descrito anteriormente y pueden comprender lisado de amebocitos. Los estándares reactivos a LAL también se describen más arriba e incluyen un Estándar de Referencia de Endotoxina USP (RSE) que se ha calibrado según el Estándar Internacional de Endotoxina de la Organización Mundial de la Salud vigente. El procedimiento puede comprender proporcionar un sustrato de prueba que tenga una placa de pocillos que comprenda una pluralidad de pocillos, en la que cada pocillo tenga al menos una superficie de ventana óptica y una pluralidad de superficies de ventana no ópticas. Una primera solución líquida que contenga al menos un reactivo de detección puede colocarse en una primera superficie de ventana no óptica de al menos un pocillo. La primera solución líquida puede secarse sobre la superficie de la primera ventana no óptica, depositando así el reactivo de detección sobre la primera superficie no óptica para formar un sustrato de prueba precargado. El estándar reactivo a LAL puede estar presente en una pluralidad de concentraciones, en las que cada concentración esté presente en un pocillo separado del sustrato de prueba.
En otra realización, el procedimiento para depositar al menos un reactivo de prueba sobre un sustrato de prueba puede comprender además la colocación de una segunda solución que contenga al menos un estándar reactivo a LAL sobre una segunda superficie de ventana no óptica. La segunda solución líquida puede secarse sobre la superficie de la segunda ventana no óptica, depositando así el estándar reactivo a LAL sobre la superficie de la segunda ventana no óptica.
En otra realización, el sustrato de prueba puede ser una microplaca. En otra realización, el procedimiento puede comprender además cubrir el sustrato de prueba precargado con un material de barrera después del paso de secado para proteger el sustrato de prueba precargado de la exposición ambiental y la contaminación de la superficie. Los sustratos de prueba adecuados incluyen cualquier sustrato de prueba que ayude a evaluar o probar una muestra, como las microplacas disponibles en Sigma-Aldrich, o las placas de microtitulación. Como se muestra en la FIG. 1, la microplaca (100) puede tener múltiples pocillos de muestra (102) dispuestos en una matriz rectangular de 2 por 3. Las microplacas suelen tener 6, 24, 96, 384 o 1536 pocillos. En una realización, la microplaca (100) puede tener 96 pocillos (102). Aunque la capacidad de retención de los pocillos individuales de una microplaca suele ser la misma, la capacidad de retención de los pocillos puede variar de una microplaca a otra. Las paredes laterales (104) y los fondos (106) de los pocillos (102) pueden ser curvos o rectos, de manera que los pocillos tengan forma semiesférica, cilíndrica o rectangular. La placa también puede comprender una superficie inferior sustancialmente plana (108) de manera que la microplaca se apoye plana sobre las superficies de trabajo. Las superficies de trabajo pueden incluir, entre otras, el suelo, las mesas de laboratorio, los lectores de microplacas y las placas calefactoras, así como superficies de fabricación como mesas, cintas transportadoras y rodillos. También es posible que la microplaca no descanse en absoluto sobre una superficie de trabajo, sino que esté suspendida por encima de la superficie de trabajo a través de un medio de suspensión como ganchos, clips, etc. La microplaca puede estar realizada de diversos materiales, como poliestireno, polipropileno o policarbonato. Una microplaca de detección óptica puede fabricarse con poliestireno u otro polímero adecuado que no interfiera con el rendimiento químico de los reactivos de prueba con la muestra. En algunas realizaciones, puede añadirse dióxido de titanio para que el poliestireno sea blanco y ayude en los procedimientos de absorbancia óptica.
Una o más porciones del sustrato de prueba pueden tener superficies modificadas. Las porciones con superficies modificadas pueden incluir, entre otras, las paredes laterales y los pocillos. Las superficies pueden modificarse por cualquier medio conocido por los expertos en la materia, incluidos, entre otros, la aplicación de un revestimiento, la radiación, el grabado por plasma, la luz ultravioleta y el ozono, o los reactivos disueltos que pueden cubrir dinámicamente la superficie, de modo que la interacción de las superficies y los reactivos o las muestras imite la del análisis estándar de microplacas, de modo que se cumplan las especificaciones del fabricante o las estándares de los compendios para el análisis.
En una realización, las superficies del sustrato de prueba pueden modificarse para controlar la interacción bioquímica LAL y sustancia reactiva a LAL o para controlar la energía superficial. Controlar el nivel de interacción química de la superficie con los productos químicos de reacción puede mejorar la repetibilidad y la precisión del rendimiento bioquímico. Por ejemplo, los materiales adecuados para la fabricación de los sustratos de prueba también pueden inhibir o potenciar bioquímicamente la química de reacción a LAL o de la sustancia reactiva a LAL. Esta interacción bioquímica entre la superficie del material y los productos químicos de reacción puede controlarse o reducirse con la aplicación de un revestimiento o mediante una modificación química de la superficie. Además, la superficie no modificada de los sustratos de prueba puede tener una energía superficial indeseable para los microfluidos presentes en el sustrato de prueba. La energía superficial también puede modificarse a un valor deseado mediante modificación química o la adición de un revestimiento para hacer que la energía superficial sea más hidrófila o más hidrófoba, o para conseguir cualquier otra energía superficial entre estos estados. Al optimizar la energía superficial, también puede optimizarse la microfluídica presente en el sustrato de prueba.
Otro medio para modificar las superficies de los sustratos de prueba incluye el grabado por plasma, en el que la superficie se modifica exponiéndola a plasma para afectar a una estructura química superficial final determinada. Se pueden añadir diferentes elementos al plasma para modificar la química de la superficie, por ejemplo, oxígeno o amoníaco. Otros medios son el uso de revestimientos superficiales estáticos o dinámicos permanentes. Pueden añadirse revestimientos superficiales estáticos para formar una capa sobre la superficie del sustrato de prueba y cambiar el carácter de la superficie. Los revestimientos superficiales estáticos pueden aplicarse como solución con un disolvente y secarse o aplicarse mediante injerto superficial en el que el revestimiento se adhiere químicamente a la superficie. Algunos ejemplos de revestimientos estáticos que pueden injertarse o aplicarse como revestimiento son, entre otros, el polietilenglicol (PEG) y el colágeno. Los revestimientos superficiales dinámicos pueden añadirse a los reactivos, muestras o estándares y recubrir la superficie in situ a medida que los fluidos se mueven en el sustrato de prueba o en los pocillos de muestras. Algunos ejemplos de revestimientos dinámicos son, entre otros, PEG y tensioactivos como el desoxicolato sódico.
En una realización, el procedimiento puede comprender proporcionar una microplaca que tenga una placa de pocillos que comprenda una pluralidad de pocillos, en la que cada pocillo tenga al menos una superficie de ventana óptica y una pluralidad de superficies de ventana no ópticas; proporcionar una solución líquida que tenga al menos un reactivo de prueba en su interior; colocar la solución líquida en una primera de dichas superficies de ventana no ópticas de al menos un pocillo; y secar la solución líquida en la primera superficie de ventana no óptica, depositando así el reactivo de prueba en la primera superficie de ventana no óptica. En otra realización, los pasos de deposición pueden repetirse en superficies de ventana no ópticas subsiguientes de manera que se depositen reactivos de prueba adicionales en porciones de pared lateral subsiguientes.
Los reactivos de prueba pueden añadirse a las superficies de la ventana no óptica del pocillo, para permitir una medición óptica inicial de la muestra antes de que los reactivos de prueba hayan tenido la oportunidad de mezclarse. Esto es útil para determinar el cero óptico. Además, cada reactivo de prueba tiene una firma óptica que puede utilizarse para comprobar que se añaden los niveles correctos de reactivos de prueba, antes de que comience la reacción. En otra realización, cada reactivo de prueba puede marcarse con un material óptico inerte a la reacción de prueba de endotoxinas. Si el usuario encuentra niveles incorrectos de los niveles esperados de reactivos de prueba antes de que se produzca la reacción (período de fase de retardo de la reacción), entonces el usuario puede rechazar la prueba de medición para esa muestra. Esto es de gran valor para el usuario farmacéutico, ya que cualquier prueba fuera de especificación (OOS) debe ser evaluada y explicada.
En otra realización del procedimiento, el procedimiento puede comprender proporcionar una solución líquida que contenga al menos un reactivo de prueba; proporcionar una microplaca que tenga una superficie inferior sustancialmente plana, una pluralidad de bordes (110), y una placa de pocillos, en la que la superficie inferior sea sustancialmente paralela con respecto a una superficie de trabajo horizontal (112), y en la que la placa de pocillos comprenda una pluralidad de pocillos que tengan una pluralidad de paredes laterales. Un primero de la pluralidad de bordes (110) puede estar inclinado de tal manera que el primer borde esté inclinado (114) en una orientación generalmente perpendicular con respecto a la superficie de trabajo horizontal, de tal manera que la superficie inferior ya no sea sustancialmente paralela con respecto a la superficie de trabajo y de tal manera que una porción de pared lateral más cercana a la superficie de trabajo esté en una orientación generalmente paralela con respecto a la superficie de trabajo. La solución líquida puede colocarse (116) en la porción de pared lateral y luego secarse, depositando así el reactivo de prueba en la porción de pared lateral. Cualquier medio adecuado para transferir un líquido puede ser adecuado, incluyendo, pero no limitado a, una pipeta, o una boquilla de pulverización.
Cualquier proceso de secado es adecuado para la presente invención, siempre que el proceso de secado no altere la reactividad de los reactivos de prueba. Estos procesos de secado incluyen, entre otros, un proceso de secado al vacío a temperatura ambiente o un proceso de liofilización (liofilización). En otra realización, la solución líquida puede secarse a temperatura ambiente o liofilizarse. Debe entenderse que no es necesario secar completamente la solución líquida; puede secarse parcialmente, especialmente si se utilizan disolventes no acuosos. Basta con que el reactivo de prueba se inmovilice físicamente tras su depósito de forma que permanezca en su lugar. Puede quedar algo de líquido después de inmovilizar el reactivo de prueba si se utiliza una pasta de glicerina, como en ciertos productos farmacéuticos y otros materiales preparados para un almacenamiento estable. El mismo proceso puede utilizarse tanto con pocillos de paredes redondas como de paredes planas. La posición inclinada de la microplaca puede mantenerse durante los pasos de deposición mediante el uso de un medio de soporte, como un soporte o abrazadera.
En otra realización, la microplaca puede ser rotada y los pasos de deposición pueden ser repetidos con bordes subsecuentes de la microplaca, de tal manera que reactivos de prueba adicionales son depositados en porciones de pared lateral subsecuentes. En otra realización del procedimiento, al menos un reactivo de prueba que comprenda un reactivo de detección de endotoxinas puede estar presente en cada pocillo. En otra realización del procedimiento, al menos un reactivo de prueba compromete un estándar de endotoxina. En otra realización del procedimiento, el estándar de endotoxina puede estar presente en una pluralidad de concentraciones, donde cada concentración está presente en un pocillo diferente. En otra realización del procedimiento, la microplaca puede comprender además un mecanismo de identificación de pocillos.
Se pueden utilizar muchos enfoques para la deposición del reactivo de prueba para reducir el tiempo de mezclado, la formación de burbujas, el tiempo de resolubilización, la facilidad de fabricación y la sensibilidad de detección. Los enfoques pueden abarcar medios químicos y físicos para producir los resultados deseados. Los medios químicos pueden incluir el uso de aditivos químicos. Algunos ejemplos de aditivos químicos son los agentes que aumentan la solubilidad, como los sacáridos sacarosa, glucosa y manitol, así como los agentes antiaglomerantes, como las soluciones acuosas de polímeros que comprenden poli(óxido de etileno), hidroxipropilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa, o agentes diseñados para evitar la degradación, como el dextrano y diversos sacáridos como la lactosa y la trehalosa. Los medios físicos pueden incluir diversas técnicas de revestimiento, pulverización o secado durante el proceso de deposición.
En algunas realizaciones, puede depositarse un reactivo de detección en cada pocillo. Alternativamente, no hay reactivo de detección en ninguno de los pocillos, lo que permite al usuario añadir reactivo de detección de un proveedor preferido. En una realización, el reactivo de detección puede ser lisado de amebocitos. El uso de la absorción natural del LAL, o la adición de trazadores reactivos no LAL turbidimétricos o cromogénicos a LAL y la endotoxina también pueden utilizarse para reducir los errores de las pruebas.
El estándar reactivo a LAL puede depositarse sólo en una parte de los pocillos. Además, varios pocillos pueden precargarse o predepositarse con estándar reactivo a LAL con diferentes concentraciones de la sustancia reactiva a LAL en su interior, de forma que el usuario sólo tenga que añadir a los pocillos la muestra que se va a analizar. En una realización, el reactivo de detección y la sustancia reactiva a LAL pueden depositarse en los pocillos de forma que todas las pruebas y réplicas requeridas por el USP 85 puedan realizarse simplemente añadiendo las muestras. En una realización de este tipo, cada pocillo comprende una prueba dada por separado o una réplica de una prueba dada. En una realización, la concentración más baja puede confirmarse en cuatro réplicas, en las que 4 de los 96 pocillos comprendan cada uno una réplica. Alternativamente, los pocillos pueden precargarse con estándares reactivos a LAL de forma que puedan realizarse las pruebas de inhibición/mejora (o "picos"), incluidas las réplicas. Alternativamente, los pocillos pueden precargarse de forma que puedan realizarse las pruebas cuantitativas, en las que se cuantifica la concentración de endotoxinas bacterianas en una muestra determinada. En otra realización, los pocillos pueden precargarse de forma que todas las pruebas y réplicas requeridas por el USP 85, incluyendo la sensibilidad del lisado, la inhibición/mejora y las pruebas cuantitativas, puedan realizarse en la misma microplaca. Conceptos similares pueden emplearse con cualquier sustrato de prueba o cualquier porción de un sustrato de prueba y no se limitan a microplacas con pocillos.
En una realización, los pocillos pueden cubrirse con un medio de sellado, como una etiqueta adhesiva con adhesivo sólo en las porciones de la etiqueta fuera de la abertura del pocillo. Los medios de sellado pueden estar realizados de un material de barrera que impida el paso del agua y el oxígeno, por lo que los pocillos pueden mantenerse secos hasta un nivel de humedad inferior al 5%, aproximadamente.
Los procedimientos divulgados pueden utilizarse para depositar previamente reactivos a LAL, reactivos cromogénicos y endotoxina en microplacas de 96 o 384 pocillos previamente limpiadas (sin endotoxina). Los reactivos de prueba, en una solución líquida, pueden colocarse en las paredes de los pocillos, o en la superficie de la ventana óptica del pocillo óptico. Los procedimientos descritos permiten que los reactivos se depositen en las paredes de las microplacas estándar de 96 o 384 pocillos sin interferir con la ventana óptica o el camino óptico, permitiendo así una medición inicial de la absorción de la muestra.
En otra realización, se divulga un sustrato de prueba en el que al menos una parte del sustrato de prueba se ha precargado con al menos un reactivo de prueba. El sustrato de prueba es adecuado para el control óptico de líquidos y su uso en la realización de pruebas de LAL para endotoxinas o glucanos.
Los reactivos para las pruebas de LAL pueden aislarse en segmentos del sustrato de prueba. El sustrato de prueba puede ser desechable. El sustrato de prueba puede tener una variedad de formas, geometrías y formas, incluyendo una forma típica de microplaca. Otras formas adecuadas son, entre otras, tarjetas, cartuchos o discos. El sustrato de prueba también puede configurarse de forma que puedan añadirse al mismo muestras y fluidos. El sustrato de prueba también permite mezclar las muestras cuando se agita, remueve, hace girar o rota. El sustrato de prueba también permite el control óptico de líquidos.
El sustrato de prueba puede utilizarse para realizar funciones analíticas que incluyen, entre otras, la medición de muestras con un control de producto positivo añadido que es un pico de endotoxina o glucano, la medición de blancos de agua (libres de endotoxina o reactivo a LAL), la medición de una serie de al menos tres soluciones de calibración. Además, el sustrato de prueba puede utilizarse para realizar todas las funciones analíticas enumeradas en dos o más duplicados.
El sustrato de prueba puede utilizarse con un aparato óptico o lector que mida los tiempos entre estados de absorción óptica o el cambio de absorción óptica entre tiempos. El sustrato de prueba precargado también puede utilizarse para confirmar que los reactivos y el analizador cumplen las especificaciones, calibrar para la conversión a concentraciones de endotoxina o glucano en la muestra, validar el rendimiento o cumplir los compendios o las especificaciones de los fabricantes de aparatos ópticos, y medir las muestras analizadas.
El sustrato de prueba puede estar realizado de cualquier material adecuado. En otra realización, partes del sustrato de prueba pueden recubrirse con materiales poliméricos, tratamientos superficiales o revestimientos para cumplir las especificaciones de los compendios o de los fabricantes del reactivo de prueba. En otra realización, una parte del sustrato de prueba puede recubrirse con un revestimiento estático para reducir la pérdida de reactivo a LAL o de estándar. Otra porción del sustrato de prueba puede recubrirse con un revestimiento dinámico de los pocillos de la microplaca para reducir la pérdida de reactivos o estándares a LAL. El revestimiento dinámico también puede mezclarse con estándares o reactivos.
Una porción del sustrato de prueba también puede recubrirse con aditivos para ayudar, o regular, el análisis adecuado y las interacciones de los reactivos de prueba o materiales de muestra. Los aditivos ejemplares incluyen, entre otros, adyuvantes de solubilidad, adyuvantes de transporte y estabilizadores.
En otra realización adicional, el sustrato de prueba puede comprender barreras mecánicas que separen los reactivos para evitar la interacción mientras se aíslan en el sustrato de prueba o se almacenan a largo plazo. Las barreras pueden ser insolubles y estar dispuestas de forma que no interfieran con las mediciones ópticas. Otras barreras pueden ser solubles hasta cierto punto para que se disuelvan durante la medición y no interfieran en ella.
En otra realización, el sustrato de prueba puede precargarse con estándares y picos realizados de endotoxina estándar de control (CSE) o endotoxina estándar de referencia. Los picos pueden almacenarse como material seco para que tengan la concentración correcta y no diluyan ni interfieran con la muestra a la que se añaden los picos.
Ejemplo
El siguiente ejemplo muestra una realización en la que los estándares de endotoxina se precargan en el sustrato de prueba. La gama estándar de endotoxinas se muestra en la Tabla 1. Sin embargo, el intervalo estándar de endotoxinas puede ser diferente en otras realizaciones.
La Tabla 2 es una descripción del sustrato de prueba precargado, en el que el sustrato de prueba tiene 96 porciones. La columna 1 indica la parte del sustrato de prueba. La columna 2 indica la muestra que el operador debe añadir al sustrato de prueba. Cada porción del sustrato de prueba puede precargarse con una concentración estándar de endotoxina diferente, como se muestra en la columna 3. La columna 4 es una descripción de la prueba BET que puede completarse en cada parte. El reactivo de detección de endotoxinas no se muestra en la Tabla 2, ya que las 96 porciones pueden precargarse con la misma cantidad de reactivo de detección de endotoxinas. Alternativamente, el sustrato de prueba puede no tener ningún reactivo de detección de endotoxinas, permitiendo al operador añadir un reactivo de detección de endotoxinas de un proveedor preferido.
La presente descripción utiliza ejemplos para divulgar la invención, incluyendo el mejor modo, y también para permitir a cualquier experto en la materia poner en práctica la invención, incluyendo fabricar y utilizar cualquier dispositivo o sistema y realizar cualquier procedimiento incorporado. El alcance patentable de la invención viene definido por las reivindicaciones, y puede incluir otros ejemplos que se les ocurran a los expertos en la materia. Por ejemplo, existen muchos enfoques distintos para depositar los reactivos sin entremezclar el LAL y la endotoxina y provocar una reacción prematura.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un sustrato de prueba precargado para detectar una sustancia reactiva a LAL, en el que al menos una porción de dicho sustrato de prueba precargado se ha precargado con un reactivo de prueba, que es:
al menos un estándar reactivo a LAL, o
al menos un reactivo de detección y al menos un estándar reactivo a LAL;
dicho sustrato de prueba está precargado de tal manera que dicho reactivo de prueba está al menos parcialmente seco, inmovilizado físicamente en dicho sustrato de prueba;
en el que dicho estándar reactivo a LAL está presente en una pluralidad de concentraciones y cada concentración está presente en una porción separada de dicho sustrato de prueba precargado.
2. El sustrato de prueba precargado de la reivindicación 1, en el que al menos una parte de dicho sustrato de prueba precargado está grabado con plasma.
3. El sustrato de prueba precargado de la reivindicación 1, en el que dicho reactivo de prueba es secado al menos parcialmente, utilizándose disolventes no acuosos.
4. El sustrato de prueba precargado de la reivindicación 1, que comprende además al menos una barrera mecánica entre al menos una de dichas porciones separadas.
5. El sustrato de prueba precargado de la reivindicación 4, en el que al menos una barrera mecánica es soluble.
6. El sustrato de prueba precargado de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato de prueba precargado comprende además un mecanismo de identificación de porciones.
7. El sustrato de prueba precargado de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato de prueba precargado es una microplaca.
8. El sustrato de prueba precargado de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato de prueba precargado comprende además un material de barrera para proteger dicho sustrato de prueba precargado de la exposición ambiental y la contaminación de la superficie.
9. Un procedimiento para medir una sustancia reactiva a LAL en una muestra, dicho procedimiento comprende:
(a) poner en contacto dicha muestra con un sustrato de prueba precargado en el que al menos una porción de dicho sustrato de prueba precargado ha sido precargado con un reactivo de prueba, siendo:
al menos un estándar reactivo a LAL, o
al menos un reactivo de detección y al menos un estándar reactivo a LAL;
dicho sustrato de prueba está precargado de tal manera que dicho reactivo de prueba está al menos parcialmente seco, inmovilizado físicamente en dicho sustrato de prueba;
en el que dicho estándar reactivo a LAL está presente en una pluralidad de concentraciones y cada concentración está presente en una porción separada de dicho sustrato de prueba, formando así una muestra preparada; y
(b) medir una absorbancia de dicha muestra preparada.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que al menos una porción de dicho sustrato de prueba precargado es grabado con plasma.
11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha pluralidad de concentraciones estándar reactiva a LAL se utiliza para generar una curva estándar.
12. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho sustrato de prueba precargado es una microplaca.
13. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho sustrato de prueba precargado comprende además un material de barrera para proteger dicho sustrato de prueba precargado de la exposición ambiental y la contaminación de la superficie.
14. Un procedimiento para depositar al menos un reactivo de prueba sobre un sustrato de prueba, dicho procedimiento comprende:
(a) tomar un sustrato de prueba que tenga una placa de pocillos que comprenda una pluralidad de pocillos, en la que cada pocillo tenga al menos una superficie de ventana óptica y una pluralidad de superficies de ventana no ópticas;
(b) colocar una primera solución líquida que contenga al menos un reactivo de detección en una primera superficie de ventana no óptica de al menos un pocillo;
(c) secar dicha primera solución líquida sobre dicha primera superficie de ventana no óptica, depositando así dicho reactivo de detección sobre dicha primera superficie de ventana no óptica y formando un sustrato de prueba precargado;
(d) colocar una segunda solución líquida que contenga al menos un estándar reactivo a LAL en una segunda superficie de ventana no óptica de diferentes pocillos, y en la que dicho estándar reactivo a LAL esté presente en una pluralidad de concentraciones y cada concentración esté presente en un pocillo diferente; y (e) secar dicha segunda solución líquida sobre dicha segunda superficie de ventana no óptica, depositando así dicho estándar reactivo a LAL sobre dicha segunda superficie de ventana no óptica.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicho sustrato de prueba precargado es una microplaca.
16. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicho procedimiento comprende además cubrir dicho sustrato de prueba precargado con un material de barrera después de dicho paso de secado para proteger dicho sustrato de prueba precargado de la exposición ambiental y la contaminación de la superficie.
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