ES2964985T3 - Compuestos sonda basados en actividad, composiciones y métodos de uso - Google Patents

Compuestos sonda basados en actividad, composiciones y métodos de uso Download PDF

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Abstract

Se proporcionan compuestos sonda basados en actividad para uso en el marcado de una cisteína proteasa. Los compuestos se dirigen a la proteasa a través de un elemento de dirección específico. Los compuestos incluyen además un elemento detectable, tal como un marcador fluorescente, un radiomarcador o un quelante. En algunos casos, los compuestos incluyen adicionalmente un elemento de extinción que se libera tras la reacción con la proteasa. También se proporcionan composiciones que comprenden los compuestos y métodos para usar los compuestos, por ejemplo para marcar una proteasa en un animal y visualizar un tumor en un animal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos sonda basados en actividad, composiciones y métodos de uso
Referencia cruzada a la solicitud relacionada
Declaración de financiación gubernamental
Esta invención se ha realizado con financiación gubernamental mediante el contrato EB005011 concedido por el National Institutes of Health. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.
Antecedentes de la invención
Actualmente se está desarrollando una diversidad de técnicas para su uso en las áreas de imágenes moleculares y monitorización de enfermedades. En particular, la obtención de imágenes por fluorescencia óptica es un enfoque que está empezando a resultar prometedor como herramienta clínica, dada su sensibilidad, especificidad y no invasividad. En algunos casos, la especificidad de las sondas ópticas fluorescentes puede venir proporcionada por sus dianas biológicas. Por ejemplo, las sondas ópticas que son reconocidas por dianas enzimáticas en una muestra biológica a menudo generan señales extremadamente específicas si la fluorescencia de la sonda solo se desencadena tras una reacción enzimática. De manera ideal, la porción fluorescente de la sonda permanece asociada a su diana enzimática, incluso después de que la señal fluorescente haya sido activada por la reacción enzimática. Estas sondas basadas en actividad fluorescente (ABP) se han descrito para dianas de proteasas. Blumet al.(2009) PLoS One 4:e6374; doi: 10.1371/journal.pone.0006374. Las ABP pueden distinguirse de los sustratos fluorogénicos sencillos por el enlace covalente permanente que resulta de la reacción de la ABP con el resto catalítico del sitio activo de la enzima. Aunque los sustratos fluorescentes pueden parecer ventajosos debido a la amplificación de la señal resultante del recambio catalítico por parte de su enzima diana, se ha descubierto que las APB muestran una cinética aumentada de absorción tisular y una retención prolongada de la sonda en el tejido diana debido a su modificación covalente de la enzima diana.
Entre las enzimas diana de interés para su uso con sondas ópticas basadas en fluorescencia se encuentran las proteasas y, en particular, las cisteína proteasas. Las cisteína catepsinas son una familia de proteasas que desempeñan funciones importantes en la salud y la enfermedad. Reiseret al.(2010)J. Clin. Invest.120:3421-31 Aunque se ha descrito principalmente que su función se limita a la ruta endosómica, se está acumulando evidencia de que son uno de los principales reguladores de la degradación de la matriz, sugiriendo que también funcionan en un contexto extracelular. Bromme & Wilson (2011)Role of Cysteine Cathepsins in Extracellular Proteolysis. Biology of Extracellular Matrix Volume223-51. Además, se ha demostrado que los miembros de la familia de las cisteína catepsinas desempeñan un papel importante en el desarrollo y el avance de varios tipos de cáncer. Mohamed & Sloane (2006)Nat. Rev. Cancer(2006) 6:764-75; Palermo & Joyce (2008)Trends Pharmacol. Sci.29:22-8. Adicionalmente, se han observado cambios en la expresión de los inhibidores endógenos de las catepsinas, las cistatinas, en el cáncer. Cox (2009)Cystatins and cancer. Front. Biosci.14:463-74. Estas observaciones, en combinación con cambios potenciales en el medio intra y extracelular, destacan la importancia de herramientas que permitan la evaluación directa de la actividad de estas proteasas en el contexto de un microambiente tumoral nativo. Se han sintetizado diversas ABP dirigidas a la familia de las cisteína catepsinas. Edgingtonet al.(2011)Curr. Opin. Chem. Biol.15:798-805. En particular, las ABP inactivadas con fluorescencia (qABP) han demostrado ser herramientas poderosas para la obtención de imágenes ópticas no invasivas del cáncer y la posterior caracterización de las catepsinas diana a un nivel histológico, celular y de proteínas. Blumet al.(2007)Nat. Chem. Biol.3:668-77; Verdoeset al.(2012)Chem. Biol.19:619-28.
Se han informado inhibidores basados en la actividad de la dipeptidil peptidasa I basados en un grupo reactivo de 2,3,5,6-tetrafluorofenoxiarilmetil cetona (Deuet al.(2010)Chem. Biol.17:808-819), pero estos inhibidores no eran peptídicos y no incluían un grupo detectable.
También se han informado inhibidores peptídicos basados en actividad inactivada para su uso en la obtención de imágenes fluorescentes de células que contienen proteasas activas tales como la catepsina. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2007/0036725. Estas sondas emplean un grupo reactivo aciloximetil cetona enlazado a éster para unirse al sitio activo de la proteasa. En algunos casos, las sondas fluorescentes basadas en actividad no son peptídicas. Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional PCT N.° WO 2012/118715. En algunos casos, las sondas basadas en actividad se usan para radiomarcar sus enzimas diana. Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional PCT N.° WO 2009/124265.
Otros inhibidores de caspasa y otras cisteína proteasas basados en actividad se informan en la Publicación Internacional PCT N° WO 2012/021800; la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2002/0052323; la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2002/0028774; la Publicación Internacional PCT N.° WO 96/41638; y la Publicación de Solicitud de Patente Europea N.° EP 0272671.
Sigue existiendo una necesidad en el campo, sin embargo, de novedosas sondas fluorescentes basadas en actividad de cisteína proteasas que tengan una captación celular más alta, que se dirijan a un espectro más amplio de actividades de cisteína proteasa y que ofrezcan una sensibilidad aumentada de detección y menores señales de fondo.
Sumario de la invención
La presente invención aborda estos y otros problemas proporcionando compuestos y composiciones para su uso para etiquetar una cisteína proteasa.
En particular, según un aspecto de la invención, se proporcionan compuestos como se representa mediante la fórmula estructural (III):
en donde R comprende un bloqueador QSY o un bloqueador QC-1; y m y n son independientemente números enteros del 1 al 8; en donde D comprende un tinte de benzoindol;
AA1 es una cadena lateral de aminoácidos;
U es O, NH o S;
R1 es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo o un grupo protector, y está opcionalmente sustituido con de 1 a 3 grupos A;
cada A es independientemente alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alcanoílo, alquilamino, arilo, ariloxi, arilamino, aralquilo, aralcoxi, aralcanoílo, aralcamino, heteroarilo, heteroariloxi, heteroarilamino, heteroaralquilo, heteroaralcoxi, heteroaralcanoílo, heteroaralcamino, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalcoxi, cicloalcanoílo, cicloalcamino, heterociclilo, heterocicliloxi, heterociclilamino, heterociclilalquilo, heterociclilalcoxi, heterociclilalcanoílo, heterociclilalcamino, hidroxilo, tio, amino, alcanoilamino, aroilamino, aralcanoilamino, alquilcarboxi, carbonato, carbamato, guanidinilo, urea, halo, trihalometilo, ciano, nitro, fosforilo, sulfonilo, sulfonamido o azido.
En algunas realizaciones, el tinte de benzoindol tiene la estructura:
en donde o es un número entero de 1 a 4;
R2 es un grupo alquilo C2-C8, opcionalmente sustituido con un sulfonato o carbonato; cada R3 es independientemente un grupo alquilo C1-C6; y
L4 es un enlazador alquilo opcionalmente sustituido, en donde cada átomo de carbono está opcionalmente reemplazado con un heteroátomo.
En realizaciones más específicas, el tinte de benzoindol tiene la estructura:
En algunas realizaciones AA1 es una cadena lateral de aminoácidos aralquilo, opcionalmente sustituido con de 1 a 3 grupos A, U es O. Más específicamente, el bloqueador QSY puede ser un bloqueador QSY hidrófilo o un bloqueador sulfo-QSY. En algunas realizaciones, el bloqueador QC-1 tiene la estructura:
Más específicamente, en estos compuestos R puede ser
y D puede ser
En realización aún más específicas, el compuesto puede tener la estructura:
De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona composiciones para su uso para etiquetar una proteasa en un animal, que comprenden un compuesto de la presente divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con otro aspecto más, la invención proporciona una composición para su uso para etiquetar una proteasa en un animal, que comprende la etapa de: administrar una composición de la presente divulgación al animal.
La invención también proporciona además una composición para su uso para visualizar un tumor en un animal, que comprende las etapas de:
administrar una composición de la presente divulgación al animal y medir una señal detectable generada en el animal a partir de una reacción de la composición con una cisteína proteasa catepsina, en donde la señal detectable está asociada con un tumor en el animal.
En una composición específica para su uso en realizaciones, la señal detectable es una señal fluorescente. En otra composición para el uson específica para su uso en realizaciones, la señal fluorescente se genera en el margen de un tumor.
Breve descripción de los dibujos
FIG. 1A: Estructuras de las qABP GB137 (1) y las sondas2 - 8.FIG. 1B: Perfil de marcaje de las sondas1 - 8en células vivas RAW a 1 pM. FIG. 1C: Marcaje dependiente de la concentración mediante las sondas1y8en células vivas RAW. FIG. 1D: Intensidad de marcaje de catepsina total de las sondas1 - 8en células vivas RAW en relación con GB1375 pM (1).
FIG. 2A: Marcaje dependiente de la concentración de lisado de células RAW mediante la sonda8a pH 5,5. FIG. 2B: Transcurso de tiempo de marcaje con sonda80,5 pM en células vivas RAW. FIG. 2C: Inhibición del marcaje de las sondas1y8en células vivas RAW mediante pretratamiento con JPM-OEt (50 pM) y estabilidad sérica. FIG. 2D: Microscopía de fluorescencia de células vivas de células RAW expuestas a sonda81 pM (fila superior de paneles) y colocalización con LysoTracker (segunda fila de paneles, barra de escala de 10 pm).
FIG. 3A: Transcurso temporal de formación de imágenes ópticas no invasivas de ratones con tumores a los que se les inyectó sonda8y1(paneles de la derecha). Los paneles inferiores representan el contraste de fluorescencia óptimo en cada momento. FIG. 3B: Fluorescencia específica del tumor dependiente del tiempo (tumor - fondo) para ratones tratados con sonda1u8(n = 3; los datos representan valores medios ± errores estándar). FIG. 3C: Fluorescencia tumoralex-vivo(panel superior) y proteínas marcadas con fluorescenciain vivodespués de SDS-PAGE visualizadas mediante barrido de fluorescencia en gel (panel inferior). FIG. 3D: Intensidad de fluorescencia en el criterio de valoración de la formación de imágenes ópticas no invasivas (mostrada en 3A), formación de imágenes tumoralesex vivoy marcaje de fluorescencia en gel (mostrado en 3C). Se representa la intensidad con respecto a la sonda1(n = 3; los datos representan valores medios ± errores estándar). FIG. 3E: Microscopía de fluorescencia de la sección de tejido tumoral tratado con sonda8(panel izquierdo) con inmunotinción CD68 (panel central) y tinción nuclear (DAPI - panel derecho, barra de escala 50 pm). FIG. 3F: Reconstrucción 3D de CLSM de la sección de tejido tumoral tratado con sonda8(rojo en el original) con inmunotinción CD68 (verde en el original) y tinción nuclear (DAPI - azul en el original).
FIG. 4A: Inmunoprecipitación de cisteína catepsinas marcadas con BMV109 (sonda8). FIG. 4B y 4C: Marcaje dependiente de la concentración mediante las sondas1 - 8en células vivas RAW. Los paneles en 4B y 4C se ejecutaron en los mismos geles respectivamente.
FIG. 5A: Formación de imágenes ópticas no invasivas de ratones con tumores 8 horas después de la inyección de la sonda1, 2, 6u8.Los paneles inferiores representan el contraste de fluorescencia óptimo en cada momento. FIG.
5B: Fluorescencia específica del tumor dependiente del tiempo (tumor - fondo) para ratones tratados con sonda1, 2, 6u8(n = 3; los datos representan valores medios ± errores estándar). FIG. 5C: Fluorescencia tumoralex-vivo(panel superior) y proteínas marcadas con fluorescenciain vivodespués de SDS-PAGE visualizadas mediante barrido de fluorescencia en gel (panel inferior). FIG. 5D: Intensidad de fluorescencia del criterio de valoración de la formación de imágenes ópticas no invasivas (mostrada en 5A), formación de imágenes tumoralesex vivoy marcaje de fluorescencia en gel (mostrado en 5C). Se representa la intensidad con respecto a la sonda1(n = 3; los datos representan valores medios ± errores estándar). FIG. 5E: Microscopía de fluorescencia de sección de tejido tumoral tratado con sonda8(primera, tercera y cuarta columnas) con inmunotinción CD68 (segunda, tercera y cuarta columnas) y tinción nuclear (DAPI - tercera y cuarta columnas, barra de escala 50 pm). No se representa control de sonda (paneles de la fila central) ni control de isotipo para la inmunotinción (paneles de la fila inferior). FIG. 5F: Diagrama de colocalización para la sonda8(Cy5) y CD68 (FITC).
FIG. 6A: Comparación de BMV109-Dylight780 y BMV109-ICG (10 nmol, 24 h, Perla, ex/em = 785/820 nm) datosin vivoyex vivo.FIG. 6B: Estudiosex vivode BMV109-Dylight780 y BMV109-ICG con concentraciones variadas (10 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 24 h, Perla, ex/em = 785/820 nm).
Descripción detallada de la invención
Las catepsinas de cisteína son una familia de proteasas que desempeñan funciones importantes tanto en la fisiología celular normal como en la patología de muchas enfermedades del ser humano. Por lo tanto, se han desarrollado varias clases de sondas basadas en sustrato y actividad para estudiar la actividad de estas enzimas. En el presente documento se proporciona una clase de sondas basadas en la actividad fluorescente bloqueada que contienen, en algunas realizaciones, un electrófilo de fenoximetilcetona (PMK). Estos reactivos muestran una amplia reactividad mejorada hacia las catepsinas de cisteína, que da como resultado unas propiedades de etiquetadoin vitroein vivomejoradas drásticamente con respecto a las ABP publicadas anteriormente. En el presente documento se demuestra además que las sondas resaltan tumores en ratones con una intensidad y contraste de la señal sin precedentes. Estos nuevos reactivos hacen posible el estudio de las catepsinas de cisteína a nivel de organismo, tejido, célula y proteína, en diferentes modelos de enfermedad humana. Los ejemplos de dichos reactivos se han descrito en la solicitud internacional PCT n.° WO 2014/145257.
Compuestos
Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente divulgación proporciona compuestos novedosos para su uso para etiquetar enzimas proteasas, en particular catepsinas. Los compuestos de la divulgación pueden ser compuestos de fórmula (I):
en donde
L es un elemento saliente unido a éter;
T es un elemento de dirección; y
D es un elemento detectable.
El elemento de dirección, T, de los presentes compuestos puede ser una estructura peptídica o no peptídica, y preferentemente dirige el compuesto a una cisteína proteasa.
Los ejemplos no limitantes de elementos estructurales no peptídicos incorporados de manera útil a los presentes compuestos para estos fines se describen en la publicación internacional de patente PCT n.° WO2012/118715,. En realizaciones preferidas, los elementos de dirección no peptídicos comprenden una estructura triazol.
Los ejemplos específicos de compuestos de la divulgación con elementos de dirección no peptídicos son:
Los ejemplos no limitantes de elementos estructurales peptídicos que se pueden incorporar de forma útil en los presentes compuestos para dirigir los compuestos a las cisteína proteasas y, en particular, catepsinas de cisteína, se describen en la publicación internacional PCT n.° WO2009/124265.
En algunas realizaciones de los presentes compuestos, D-T- es
en donde L1es un enlazador;
AA1es una cadena lateral de aminoácidos;
U es O, N o S;
R1es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo o un grupo protector, y está opcionalmente sustituido con de 1 a 3 grupos A; y cada A es independientemente alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alcanoílo, alquilamino, arilo, ariloxi, arilamino, aralquilo, aralcoxi, aralcanoílo, aralcamino, heteroarilo, heteroariloxi, heteroarilamino, heteroaralquilo, heteroaralcoxi, heteroaralcanoílo, heteroaralcamino, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalcoxi, cicloalcanoílo, cicloalcamino, heterociclilo, heterocicliloxi, heterociclilamino, heterociclilalquilo, heterociclilalcoxi, heterociclilalcanoílo, heterociclilalcamino, hidroxilo, tio, amino, alcanoilamino, aroilamino, aralcanoilamino, alquilcarboxi, carbonato, carbamato, guanidinilo, urea, halo, trihalometilo, ciano, nitro, fosforilo, sulfonilo, sulfonamido o azido.
Como se usa en el presente documento, el término "alquilo" se refiere al radical de grupos alifáticos saturados, que incluyen grupos alquilo de cadena lineal, grupos alquilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo (alicíclicos), grupos cicloalquilo sustituidos con alquilo y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo. En algunas realizaciones, un alquilo de cadena lineal o ramificada tiene 30 átomos de carbono o menos en su estructura principal (por ejemplo, C1-C30para cadenas lineales, C3-C30para cadenas ramificadas) y, más específicamente, 20 o menos. De manera análoga, algunos cicloalquilos tienen de 3-10 átomos de carbono en su estructura de anillo y, más específicamente, tienen 5, 6 o 7 carbonos en la estructura anular.
Además, la expresión "alquilo" (o "alquilo inferior") como se usa a lo largo de la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones pretenden incluir tanto "alquilos no sustituidos" como "alquilos sustituidos", refiriéndose estos últimos a restos alquilo que tienen sustituyentes reemplazando un hidrógeno en uno o más carbonos de la estructura principal del hidrocarburo. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, un resto halo, un hidroxilo, un carbonilo (tal como un ceto, un carboxi, un alcoxicarbonilo, un formilo o un acilo), un tiocarbonilo (tal como un tioéster, un tioacetato o un tioformiato), un alcoxilo, un fosforilo, un fosfato, un fosfonato, un fosfinato, un amino, un amido, una amidina, una imina, un ciano, un nitro, un azido, un tio, un alquiltio, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoílo, un sulfonamido, un sulfonilo, un heterociclilo, un aralquilo o uno aromático o heteroaromático. Los expertos en la materia entenderán que los restos sustituidos en la cadena de hidrocarburo pueden a su vez estar sustituidos, si es apropiado. Por ejemplo, los sustituyentes de un alquilo sustituido pueden incluir formas sustituidas y no sustituidas de grupos amino, azido, imino, amido, fosforilo (que incluye fosfonato y fosfinato), sulfonilo (que incluye sulfato, sulfonamido, sulfamoílo y sulfonato) y sililo, así como éteres, alquiltios, carbonilos (que incluyen cetonas, aldehídos, carboxilatos y ésteres), -CF3, -CN y similares. A continuación se describen los alquilos sustituidos a modo de ejemplo. Los cicloalquilos pueden estar además sustituidos con alquilos, alquenilos, alcoxis, alquiltios, aminoalquilo, alquilos sustituidos con carbonilo, -CF3, -CN y similares.
Como se usa en el presente documento, el término "alcoxi" se refiere a un grupo alquilo, en determinadas realizaciones específicas, un grupo alquilo inferior, que tiene un oxígeno unido al mismo. Los grupos alcoxi representativos incluyen metoxi, etoxi, propoxi, f-butoxi y similares.
El término "alquenilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alifático que contiene al menos un doble enlace y pretende incluir tanto "alquenilos no sustituidos" como "alquenilos sustituidos", refiriéndose estos últimos a restos alquenilo que tienen sustituyentes reemplazando un hidrógeno en uno o más carbonos del grupo alquenilo. Dichos sustituyentes pueden aparecer en uno o más dobles enlaces que están incluidos o no incluidos en uno o más dobles enlaces. Además, dichos sustituyentes incluyen todos los contemplados para los grupos alquilo, como se han analizado anteriormente, excepto donde no se puede alcanzar la estabilidad. Por ejemplo, se contempla la sustitución de los grupos alquenilo con uno o más grupos alquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo.
El término "Cx-y", cuando se usa junto con un resto químico, tal como acilo, aciloxi, alquilo, alquenilo, alquinilo o alcoxi, pretenden incluir grupos que contienen de x a y carbonos en la cadena. Por ejemplo, la expresión "alquilo Cxy" se refiere a grupos hidrocarburo saturados, sustituidos o no sustituidos, que incluyen grupos alquilo de cadena lineal y alquilo de cadena ramificada, que contienen de x a y carbonos en la cadena, que incluyen grupos haloalquilo tales como trifluorometilo y 2,2,2-trifluoroetilo, etc. "Alquilo C0" indica un hidrógeno donde el grupo está en una posición terminal, o es un enlace si es interno. Las expresiones "alquenilo C2-y" y "alquinilo C2-y" se refieren a grupos alifáticos no saturados, sustituidos o no sustituidos, análogos en longitud y posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un doble o triple enlace, respectivamente.
El término "alquilamino", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquilo.
El término "alquiltio", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo tiol sustituido con un grupo alquilo y puede estar representado por la fórmula general alquil-S-.
El término "alquinilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alifático que contiene al menos un triple enlace y pretende incluir tanto "alquinilos no sustituidos" como "alquinilos sustituidos", refiriéndose estos últimos a restos alquinilo que tienen sustituyentes reemplazando un hidrógeno en uno o más carbonos del grupo alquinilo. Dichos sustituyentes pueden aparecer en uno o más carbonos que está incluidos o no incluidos en uno o más triples enlaces. Además, dichos sustituyentes incluyen todos los contemplados para los grupos alquilo, como se han analizado anteriormente, excepto donde no se puede alcanzar la estabilidad. Por ejemplo, se contempla la sustitución de los grupos alquinilo con uno o más grupos alquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo.
El término "amida", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo
en donde cada uno de Rx y Ry independientemente representa un hidrógeno o un grupo hidrocarbilo, o Rx y Ry tomados junto con el átomo de N al que están unidos completan un heterociclo que tiene de 4 a 8 átomos en la estructura anular.
Los términos "amina" y "amino" están reconocidos en la materia y se refieren tanto a aminas sustituidas como no sustituidas y sus sales, por ejemplo, un resto que puede estar representado por
$F
W
en donde cada uno de Rx, Ry y Rz independientemente representa un hidrógeno o un grupo hidrocarbilo, o Rx y Ry tomados junto con el átomo de N al que están unidos completan un heterociclo que tiene de 4 a 8 átomos en la estructura anular.
El término "aminoalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo amino.
El término "aralquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo.
El término "arilo", como se usa en el presente documento, incluye grupos aromáticos de un solo anillo, sustituidos o sin sustituir, en los que cada átomo del anillo es carbono. En determinadas realizaciones, el anillo es un anillo de 5 a 7 miembros y, en realizaciones más específicas, es un anillo de 6 miembros. El término "arilo" también incluye sistemas anulares policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos, en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes en donde al menos uno de los anillos es aromático, por ejemplo, los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos, heteroarilos y/o heterociclilos. Los grupos arilo incluyen benceno, naftaleno, fenantreno, fenol, anilina y similares.
El término "carbamato" está reconocido en la materia y se refiere a un grupo
en donde Rx y Ry independientemente representan hidrógeno o un grupo hidrocarbilo, o Rx y Ry tomados junto con los átomos a los que están unidos completan un heterociclo que tiene de 4 a 8 átomos en la estructura anular.
El término "cicloalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un anillo saturado o no saturado, no aromático, en el que cada átomo del anillo es carbono. En determinadas realizaciones, un anillo cicloalquilo contiene de 3 a 10 átomos y, en realizaciones más específicas, de 5 a 7 átomos.
El término "carbonato" está reconocido en la materia y se refiere a un grupo -OCO2-Rx, en donde Rx representa un grupo hidrocarbilo.
El término "carboxi", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo representado por la fórmula -CO2H.
El término "éster", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -C(O)ORx en donde Rx representa un grupo hidrocarbilo.
El término "éter", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo hidrocarbilo unido a través de un oxígeno a otro grupo hidrocarbilo. Por consiguiente, un sustituyente éter de un grupo hidrocarbilo puede ser hidrocarbil-O-. Los éteres pueden ser tanto simétricos como asimétricos. Los ejemplos de éteres incluyen, pero no se limitan a, heterociclo-O-heterociclo y aril-O-heterociclo. Los éteres incluyen grupos "alcoxialquilo", que pueden estar representados por la fórmula general alquil-O-alquilo.
El término "guanidinilo" está reconocido en la materia y se puede representar por la fórmula general
en donde Rx y Ry representan independientemente hidrógeno o un hidrocarbilo.
Los términos "halo" y "halógeno", como se usan en el presente documento, se refieren a halógeno e incluyen, flúor, bromo y yodo.
Los términos "hetaralquilo" y "heteroaralquilo", como se usa en el presente documento, se refieren a un grupo alquilo sustituido con un grupo hetarilo.
Los términos "heteroarilo" y "hetarilo" incluyen estructuras anulares sencillas, aromáticas, sustituidas o no sustituidas,, en determinadas realizaciones anillos de 5 a 7 miembros, más específicamente anillos de 5 a 6 miembros, cuyas estructuras anulares incluyen al menos un heteroátomo, en algunas realizaciones de uno a cuatro heteroátomos, y en realizaciones específicas de uno o dos heteroátomos. Los términos "heteroarilo" y "hetarilo" también incluyen sistemas anulares policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes en donde al menos uno de los anillos es heteroaromático, por ejemplo, los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos, heteroarilos y/o heterociclilos. Los grupos heteroarilo incluyen, por ejemplo, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina, y similares.
El término "heteroátomo", como se usa en el presente documento, significa un átomo distinto de carbono o hidrógeno. Habitualmente los heteroátomos son nitrógeno, oxígeno y azufre.
Los términos "heterociclilo", "heterociclo" y "heterocíclico" se refieren a estructuras anulares no aromáticas, sustituidas o no sustituidas, en determinadas realizaciones anillos de 3 a 10 miembros, más específicamente anillos de 3 a 7 miembros, cuyas estructuras anulares incluyen al menos un heteroátomo, en algunas realizaciones de uno a cuatro heteroátomos, y en realizaciones específicas de uno o dos heteroátomos. Los términos "heterociclilo" y "heterocíclico" también incluyen sistemas de anillos policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes en donde al menos uno de los anillos es heterocíclico, por ejemplo, los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos, heteroarilos y/o heterociclilos. Los grupos heterociclilo incluyen, por ejemplo, piperidina, piperazina, pirrolidina, morfolina, lactonas, lactamas y similares.
El término "heterociclilalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo heterociclo.
El término "hidrocarbilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo que está unido a través de un átomo de carbono que no tiene un sustituyente =O o =S y habitualmente tiene al menos un enlace carbonohidrógeno y una cadena principal fundamentalmente de carbono, pero opcionalmente puede incluir heteroátomos. Por lo tanto, los grupos como metilo, etoxietilo, 2-piridilo t trifluorometilo se considera que son hidrocarbilo para los fines del presente documento, pero los sustituyentes tales como acetilo (que tiene un sustituyente =O en el carbono de unión) y etoxi (que está unido a través de oxígeno, no carbono) no lo son. Los grupos hidrocarbilo incluyen, pero no se limitan a arilo, heteroarilo, carbociclo, heterociclo, alquilo, alquenilo, alquinilo y combinaciones de los mismos. El término "hidroxialquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo hidroxi.
El término "inferior" cuando se usa junto con un resto químico, tal como acilo, aciloxi, alquilo, alquenilo, alquinilo o alcoxi, pretende incluir los grupos donde hay diez o menos átomos distintos de hidrógeno en el sustituyente y, en ciertas realizaciones, seis o menos. Un "alquilo inferior", por ejemplo, se refiere a un grupo alquilo que contiene diez o menos átomos de carbono y, en realizaciones específicas, seis o menos átomos de carbono. En determinadas realizaciones, los sustituyentes acilo, aciloxi, alquilo, alquenilo, alquinilo y alcoxi definidos en el presente documento y respectivamente acilo inferior, aciloxi inferior, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior y alcoxi inferior, tanto si aparecen solos o en combinación con otros sustituyentes, tales como en las enumeraciones de hidroxialquilo y aralquilo (en cuyo caso, por ejemplo, los átomos del grupo arilo no se cuentan cuando se cuentan los átomos de carbono del sustituyente alquilo).
Los términos "policiclilo", "policiclo" y "policícliclo" se refieren a dos o más anillos (por ejemplo, cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos, heteroarilos y/o heterociclilos) en los que dos o más átomos son comunes a dos anillos adyacentes, por ejemplo, los anillos son "anillos condensados". Cada uno de los anillos del policiclo puede estar sustituido o no sustituido. En determinadas realizaciones, cada anillo del policiclo contiene de 3 a 10 átomos en el anillo, más específicamente de 5 a 7.
El término "sustituido" se refiere a restos que tienen sustituyentes que reemplazan un hidrógeno en uno o más carbonos de la estructura principal. Se entenderá que "sustitución" o "sustituido con" incluye la condición implícita de que dicha sustitución es acorde con la valencia permitida del átomo sustituido y el sustituyente, y que la sustitución da como resultado un compuesto estable, por ejemplo, un compuesto que no experimenta de forma espontánea una transformación tal como reordenamiento, ciclación, eliminación, etc., en las condiciones en las que se va a usar el compuesto. Como se usa en el presente documento, se contempla que el término "sustituido" incluya todos los sustituyentes permitidos de compuestos orgánicos. En un aspecto amplio, los sustituyentes permitidos incluyen sustituyentes acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos, de los compuestos orgánicos. Los sustituyentes permitidos pueden ser uno o más e iguales o diferentes, para compuestos orgánicos apropiados. Para los fines de la presente invención, los heteroátomos tales como el nitrógeno pueden tener sustituyentes de hidrógeno y/o cualquier sustituyente permitido de los compuestos orgánicos descritos en el presente documento que satisfagan las valencias de los heteroátomos. Los sustituyentes pueden incluir cualquier sustituyente descrito en el presente documento, por ejemplo, un halógeno, un hidroxilo, un carbonilo (tal como un ceto, un carboxi, un alcoxicarbonilo, un formilo o un acilo), un tiocarbonilo (tal como un tioéster, un tioacetato o un tioformiato), un alcoxilo, un fosforilo, un fosfato, un fosfonato, un fosfinato, un amino, un amido, una amidina, una imina, un ciano, un nitro, un azido, un sulfhidrilo, un alquiltio, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoílo, un sulfonamido, un sulfonilo, un heterociclilo, un aralquilo o un resto aromático o heteroaromático. Los expertos en la materia entenderán que los restos sustitutos en la cadena hidrocarburo pueden a su vez estar sustituidos, si es apropiado.
A menos que se describan de manera específica como "sin sustituir", se entiende que las referencias a restos químicos en el presente documento incluyen variantes sustituidas. Por ejemplo, la referencia a un grupo o resto "arilo" incluye de forma implícita variantes tanto sustituidas como sin sustituir.
El término "sulfato" está reconocido en la materia y se refiere al grupo -OSO3H, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El término "sulfonamida" está reconocido en la materia y se refiere al grupo representado por las fórmulas generales
en donde Rxy Ryrepresenta independientemente hidrógeno o hidrocarbilo.
El término "sulfóxido" está reconocido en la materia y se refiere al grupo -S(O)-Rx, en donde Rxrepresenta un hidrocarbilo.
El término "sulfo" o "sulfonato" está reconocido en la materia y se refiere al grupo - SO3H o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El término "sulfona" está reconocido en la materia y se refiere al grupo -S(O)2-Rx, en donde Rxrepresenta un hidrocarbilo.
El término "tioalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo tiol.
El término "tioéster", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -C(O)SRx o - SC(O)Rx en donde Rx representa un hidrocarbilo.
El término "tioéter", como se usa en el presente documento, es equivalente a un éter, en donde el oxígeno está reemplazado por un azufre.
El término "urea" está reconocido en la materia y se puede representar por la fórmula general
en donde Rx y Ry representan independientemente hidrógeno o un hidrocarbilo.
Los compuestos de la presente invención normalmente se sintetizan usando técnicas de síntesis convencionales, por ejemplo usando los métodos descritos en la sección de ejemplos siguiente. Otras técnicas de síntesis útiles se describen, por ejemplo, enMarch’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7a ed.,(Wiley, 2013); Carey y Sundberg,Advanced Organic Chemistry 4a ed., vols. A y B(Plenum 2000, 2001);Fiesers' Reagents for Organic Synthesis, volúmenes 1-27(Wiley, 2013);Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds, volúmenes 1-5 y suplementos(Elsevier Science Publishers, 1989);Organic Reactions, volúmenes 1-81(Wiley, 2013); yLarock's Comprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc., 1989). Los compuestos normalmente se sintetizan usando materiales de partida en general disponibles en proveedores comerciales o se preparan con facilidad usando métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo,Fiesers’ Reagents for Organic Synthesis,volúmenes1-27(Wiley, 2013) oBeilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl.ed. Springer- Verlag, Berlín, incluyendo los suplementos.
Cuando se hace referencia a los componentes de los compuestos de la invención, se puede usar la expresión "resto procedente de" para describir un resto formado por la reacción de un primer grupo funcional reactivo en un primer componente y un segundo grupo funcional reactivo en un segundo componente para formar un enlace covalente. En realizaciones a modo de ejemplo, un grupo amina en un primer componente se puede hacer reaccionar con un grupo carboxilo activado en un segundo componente para formar un resto que incluye uno o más restos amida. La invención abarca otras permutaciones del primer y el segundo grupos funcionales reactivos. Por ejemplo, la reacción catalizada por cobre o libre de cobre de un primer componente sustituido con azida con un segundo componente sustituido con alquino da como resultado un resto que contiene triazol mediante la reacción "click", bien conocida, tal como lo entenderán los expertos habituales en la materia. Véase Kolbet al.(2001)Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
40:2004; Evans (2007)Aus. J. Chem.60:384. Los métodos a modo de ejemplo para generar sondas fluorescentes no peptídicas para la obtención de imágenes que usan reacciones "click" se proporcionan en la publicación internacional pCt n.° WO 2012/118715. Los conocimientos de la materia incluyen la adaptación de estos métodos para generar o modificar compuestos de las presentes reivindicaciones.
Un experto habitual en la materia entenderá que un grupo protector está unido de manera reversible a una posición deseada de la molécula para controlar la reacción de otros agentes en esa posición. En la materia se conocen bien los grupos protectores útiles en la práctica de la presente invención. Véase, por ejemplo,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4a edición,de P.G.M. Wuts y T.W. Greene (Wiley-Interscience, 2006); yProtecting Groups,de P. Kocienski (Thieme, 2005).
El grupo Li de los presentes compuestos es un grupo enlazador que conecta el elemento detectable,D,con el elemento de dirección. Este grupo puede ser cualquier enlazador adecuado, como entenderá el experto habitual en la materia. El grupo L1 es preferentemente un grupo enlazador alquilo, en donde el enlazador alquilo está opcionalmente sustituido y, además, en donde los carbonos en el enlazador están opcionalmente reemplazados con heteroátomos en la medida en que la estructura resultante sea químicamente estable. Se debe entender que dichas sustituciones y reemplazos incluyen grupos intervinientes dentro del enlazador, tales como éteres, tioéteres, disulfuros, ésteres, amidas, carbonatos, carbamatos, etc. Los enlazadores preferidos varían en longitud de 5 a 40 enlaces y pueden ser de cadena ramificada, lineal, o contener anillos. En algunos casos, los enlazadores pueden incluir dobles enlaces. Estos pueden ser hidrófobos e hidrófilos según se desee según las necesidades particulares. También debe entenderse que la conexión entre el grupo L1 y el elemento detectable, D, puede ser cualquier conexión química adecuada, como entenderá el experto en la materia. Por ejemplo, los presentes compuestos en algunos casos se pueden preparar de manera conveniente incluyendo en el precursor del elemento detectable un resto que es reactivo con un grupo químico particular, tal como, por ejemplo, un grupo amino, un grupo tiol o similar. En dicha situación el elemento detectable se puede unir fácilmente al elemento de dirección mediante la reacción de este grupo en el elemento de dirección. Se entiende por tanto que estos tipos de uniones están dentro del alcance de los compuestos divulgados, incluso si los detalles estructurales de la conexión no se muestran de forma explícita. El grupo AA1 de los presentes compuestos es cualquier cadena lateral de aminoácidos natural o no natural, como entenderán los expertos en la materia. En realizaciones preferidas, el grupo AA1 es una cadena lateral de aminoácidos aralquilo que está opcionalmente sustituida con de 1 a 3 grupos A. En realizaciones aún más preferidas, el grupo AA1 es una cadena lateral de fenilalanina.
En compuestos preferidos, el grupo U es O.
El elemento detectable de los presentes compuestos es en realizaciones específicas un marcador fluorescente, un radiomarcador, un quelante o similar. Los ejemplos de radiomarcadores o quelantes adecuados para su uso en estos compuestos se describen en la publicación internacional PCT n.° 2009/124265.
En realizaciones preferidas de los presentes compuestos, el elemento detectable es un marcador fluorescente. Como saben los expertos habituales en la materia, los marcadores fluorescentes emiten radiación electromagnética, preferentemente luz visible, cuando son estimulados por la absorción de la radiación electromagnética incidente. En el mercado existe una gran variedad de marcadores fluorescentes, que incluyen marcadores que tienen restos reactivos útiles para acoplar el marcador a los grupos reactivos tales como, por ejemplo, grupos amino, grupos tiol y similares. Véase, por ejemplo,The Molecular Probes® Handbook—A Guide to Fluorescent Probes y Labeling Technologies,
Un ejemplo de un marcador fluorescente es la fluoresceína, que se usa ampliamente en el etiquetado por inmunofluorescencia. La fluoresceína es un tinte de xanteno con un máximo de absorción a 495 nanómetros. Un fluoróforo relacionado es Oregon Green, un derivado fluorado de la fluoresceína.
El marcador fluorescente usado en el elemento detectable de los compuestos de la presente divulgación en algunas realizaciones puede ser un fluoróforo dependiente de pH. Dichos marcadores fluorescentes, por ejemplo como los usados en los compuestos etiquetados "LES12" y "LES13", mostrados a continuación, presentan un espectro fluorescente que depende del pH del entorno del marcador, como entenderá el experto en la materia, y pueden, por lo tanto, ser útiles para proporcionar información sobre el entorno del marcador después de la reacción, por ejemplo información sobre la ubicación o el tipo de proteasa etiquetada por el compuesto reactivo. Se conoce bien la fluorescencia dependiente de pH de diferentes marcadores incluidos útilmente en el elemento detectable de los presentes compuestos. Véase, por ejemplo,The Molecular Probes® Handbook—A Guide to Fluorescent Probes y Labeling Technologies.
Otros marcadores fluorescentes a modo de ejemplo adecuados para su uso en los presentes compuestos son boradiaza-indeceno, rodamina y tintes de cianina. En particular, los tintes de bora-diaza-indeceno están representados por el 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno, conocidos como tintes BODIPY®. Se conocen diferentes derivados de estos tintes y se consideran adecuados para su uso como elemento detectable en los compuestos de la presente divulgación. Véase, por ejemplo, Chenet al.(2000)J. Org. Chem.65:2900-2906.
Otra clase de marcador fluorescente útilmente empleado en los compuestos de la presente divulgación son los tintes infrarrojos IRDye disponibles en Li-Cor (www.licor.com). Los ejemplos no limitantes de estos tintes son IRDye 800CW, IRDye 680RD, IRDye 680LT, IRDye 750, IRDye 700DX, IRDye 800RS e IRDye 650.
Los tintes de rodamina son una clase de tintes basados en la estructura anular de la rodamina. Las rodaminas incluyen, entre otros, tetrametilrodamina (TMR), un fluoróforo muy común para preparar conjugados de proteína, especialmente conjugados de anticuerpo y avidina y carboxitetrametil-rhodamina (TAMRA), un tinte usado habitualmente para el etiquetado de oligonucleótidos y la secuenciación automática de ácidos nucleicos. Las rodaminas se han establecido como suplementos naturales de los fluoróforos basados en fluoresceína, que proporcionan máximos de emisión de longitud de onda más larga y, por lo tanto, abren la oportunidad al etiquetado o la tinción multicolor.
Dentro del grupo de los tintes de rodamina también se incluyen las series de fluoróforos de rodamina sulfonada conocidos como tintes Alexa Fluor. Los impresionantes avances en la moderna tecnología de los fluoróforos se ejemplifican con los tintes Alexa Fluor, que fueron introducidos por Molecular Probes. Estos derivados de rodamina sulfonados exhiben rendimientos cuánticos más altos para una emisión de fluorescencia más intensa que las sondas espectralmente similares, y tienen varias características mejoradas más, que incluyen fotoestabilidad mejorada, espectros de absorción adaptados a las líneas láser comunes, insensibilidad al pH y un alto grado de solubilidad en agua.
Los tintes de cianina corresponden a una familia de tintes relacionados, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7 y sus derivados, que se basan en el núcleo heterocíclico de nitrógeno indol parcialmente saturado con dos unidades aromáticas conectadas a través de un puente de polialqueno con un número variable de carbonos. Estas sondas exhiben excitación fluorescente y perfiles de emisión que son similares a muchos de los tintes tradicionales, tales como fluoresceína y tetrametilrodamina, pero con solubilidad en agua mejorada, fotoestabilidad y rendimientos cuánticos más altos. La mayoría de los tintes de cianina son más estables medioambientalmente que sus homólogos tradicionales, lo que hace que su intensidad de emisión de fluorescencia sea menos sensible al pH y a los medios de montaje orgánicos. De manera similar a la de los Alexa Fluor, las longitudes de onda de excitación de las series Cy de los tintes sintéticos están sintonizadas específicamente para su uso con fuentes comunes de láser y de descarga por arco, y la emisión de fluorescencia se puede detectar con combinaciones de filtros tradicionales. Los tintes de cianina están fácilmente disponibles en forma de tintes reactivos o fluoróforos. Los tintes de cianina generalmente tienen espectros de absorción más amplios que los miembros de la familia Alexa Fluor, haciéndolos algo más versátiles en la elección de fuentes de excitación láser para microscopía confocal.
En realizaciones preferidas, el elemento detectable de los presentes compuestos es el tinte de cianina, Cy5.
Según la presente invención, el elemento detectable comprende un tinte benzoindol, tal como verde de indocianina ("ICG") o un residuo de verde de indocianina:
El verde de indocianina se usa en diferentes aplicaciones de diagnóstico médico, por ejemplo, para la monitorización y obtención de imágenes de determinadas afecciones cardíacas, hepáticas, oftálmicas y circulatorias. Ventajosamente, el verde de indocianina y los compuestos relacionados presentan espectros de absorción y emisión en la región del infrarrojo cercano. Por ejemplo, el ICG absorbe principalmente entre 600 nm y 900 nm y emite principalmente entre 750 nm y 950 nm. Dichas longitudes de onda pueden penetrar los tejidos biológicos, haciendo posible de este modo la obtención de imágenes usando el ICG y compuestos relacionados. Además, el uso a largo plazo y generalizado del ICG en estudios de diagnóstico médico demuestra la biocompatibilidad de estos compuestos.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, el elemento detectable comprende un tinte de benzoindol que tiene la estructura:
en donde o es un número entero de 1 a 4;
R2 es un grupo alquilo C2-C8, opcionalmente sustituido con un sulfonato o carbonato; cada R3 es independientemente un grupo alquilo C1-C6; y
L4 es un enlazador alquilo opcionalmente sustituido, en donde cada átomo de carbono está opcionalmente reemplazado con un heteroátomo.
Más específicamente, el tinte de benzoindol puede tener la estructura:
Los tintes que contienen benzoindol se pueden sintetizar por ejemplo, como se describe en Zhanget al.(2005)Chem. Commun.2005:5887 (DOI: 10.1039/b512315a). Véase también la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2009/0214436 A1.
En algunas realizaciones, L4puede ser un enlazador alquilo opcionalmente sustituido, en donde cada átomo de carbono está opcionalmente reemplazado con un heteroátomo.
En algunas realizaciones, puede ser beneficioso incluir múltiples marcadores fluorescentes, radiomarcadores, quelantes o similares, dentro del elemento detectable de los compuestos de la invención. Por ejemplo, los compuestos a modo de ejemplo etiquetados "LES12" y "LES13" siguientes incluyen dos marcadores fluorescentes diferentes dentro de un único elemento detectable. Los expertos en la materia entenderán que dichos marcadores múltiples se pueden conseguir usando química de acoplamiento rutinaria. Por ejemplo, los marcadores fluorescentes en los compuestos "LES12" y "LES13" se acoplaron usando química "click". Un ejemplo de un compuesto intermedio útil en la síntesis de compuestos que contienen múltiples marcadores dentro del elemento detectable mediante química "click" se muestra a continuación ("WL938"). Este compuesto contiene un grupo azido y por lo tanto puede reaccionar fácilmente con un reactivo que contiene alquino en una reacción "click". Las posiciones de los grupos alquino y azido también se pueden invertir, si se desea, tal como lo entenderán los expertos habituales en la materia.
El elemento saliente unido a éter, L, de los presentes compuestos incluye en la reactividad de los compuestos con su sitio activo enzimático objetivo y también puede afectar a la especificidad de dirigirse a una enzima particular. El enlace éter del elemento saliente en estos compuestos está en contraste con el enlace éster de otras sondas basadas en la actividad, tal como las aciloximetil cetonas (AOMK). Un elemento saliente unido a éter, tal como, por ejemplo, un elemento saliente unido a un éter fenólico, puede proporcionar una estabilidadin vivomejorada por encima de la de sondas unidas a éster u otros tipos de sondas.
En algunas realizaciones, el elemento saliente unido a éter de los presentes compuestos comprende un bloqueador. El término "bloqueador" se refiere a una entidad química que modula la emisión de un fluoróforo. En algunos casos, un bloqueador puede ser él mismo una molécula fluorescente que emite fluorescencia en una longitud de onda característica diferente de la del marcador cuya fluorescencia se está bloqueando. Por lo tanto, un fluoróforo puede actuar como bloqueador cuando se acopla de manera apropiada con otro tinte y viceversa. En estas situaciones, el aumento de la fluorescencia de la molécula aceptora, que es de una longitud de onda diferente que la del marcador donante, puede reportar por separado interacciones del compuesto etiquetado con su entorno, tales como, por ejemplo, el sitio activo de una enzima objetivo. En algunos casos, el bloqueador no es él mismo fluorescente (es decir, el bloqueador es un "aceptor oscuro"). Dichos bloqueadores incluyen, por ejemplo, dabcilo, rojo de metilo, los tintes de diarilrodamina QSY y similares. En particular, el dabcilo (ácido 4-dimetilamino-fenilazo)benzoico) es un bloqueador oscuro habitual usado ampliamente en muchos ensayos, tal como "balizas moleculares" para la detección de ADN. Patente de Estados Unidos n.° 5.989.823. Los tintes diazo de la serie BHQ, que se denominan "bloqueadores Black Hole", proporcionan un amplio intervalo de absorción que se superpone bien con la emisión de muchos fluoróforos. Publicación internacional PCT n.° W001/86001. Los tintes de la serie QSY de Molecular Probes son otro ejemplo de bloqueadores oscuros que se han usado extensamente como reactivos de bloqueo en muchos bioensayos. Patente de Estados Unidos n.° 6.399.392.
QSY7 en particular es un derivado de diarilrodamina no fluorescente. Publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2005/0014160. QSY21 es un cromóforo de diarilrodamina no fluorescente con absorción fuerte en el espectro visible y es un bloqueador de fluorescencia eficaz. Los pares fluoróforo/bloqueador se ilustran con más detalle en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2004/0241679.
IRDye QC-1 (disponible en Li-Cor) es otro ejemplo de un tinte no fluorescente que es adecuado para su uso como bloqueador de los presentes compuestos. Este bloquea de manera eficaz la fluorescencia de una amplia gama de fluoróforos, que incluyen los que varían en longitud de onda desde la región visible hasta el infrarrojo cercano.
En algunas realizaciones de los presentes compuestos, el elemento grupo saliente, L, es L2-L3-Q, en donde L2es un grupo fenoxi, L3 es un enlazador y Q comprende un bloqueador. El elemento grupo saliente puede estar, por ejemplo,
en donde cada Y es independientemente un grupo aceptor de electrones o hidrógeno. En dichos compuestos, cada Y puede ser independientemente un halógeno o hidrógeno. En compuestos específicos, el grupo L es, por ejemplo,
el grupo enlazador L3 del elemento saliente descrito anteriormente puede ser cualquier enlazador adecuado, como entenderá el experto habitual en la materia. En particular, el grupo enlazador L3 puede ser, por ejemplo, un grupo L1, como se ha descrito anteriormente.
En otros compuestos específicos, el grupo L es, por ejemplo,
en donde R comprende un bloqueador QSY y n es un número entero de 1 a 8. En realizaciones específicas, el bloqueador QSY es un bloqueador hidrófilo, tal como, por ejemplo, un bloqueador sulfo-QSY.
En algunas realizaciones específicas, los compuestos de la presente divulgación tienen la estructura de la fórmula (II):
En algunas realizaciones
en donde R comprende un bloqueador QSY o un bloqueador QC-1; y
n es un número entero de 1 a 16. Más específicamente, el bloqueador QSY es un bloqueador QSY hidrófilo tal como, por ejemplo, un bloqueador sulfo-QSY.
En algunas realizaciones, el bloqueador QC-1 tiene la estructura:
Según la presente invención, los compuestos de la presente divulgación tienen la estructura de la fórmula (III):
En estas realizaciones, m y n son independientemente números enteros de 1 a 8.
En algunas realizaciones, R comprende QSY21 o sulfo-QSY21, y D es Cy5.
Como alternativa, R comprende un bloqueador QC-1, y D comprende un tinte de benzoindol.
En realizaciones específicas de fórmula (III), R es
Otras realizaciones de compuestos no limitantes específicas de la divulgación incluyen:
R = Sulfo-QSY21 y n = 6;
R = QSY21 y n = 2; y
R = Sulfo-QSY21 y n = 2.
Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones son útiles, por ejemplo, para la obtención de imágenes de tejidos en un animal y son además útiles para evaluar la actividad de enzimas en el animal, por ejemplo, enzimas proteasas. En particular, para los compuestos de la invención que etiquetan catepsinas, las composiciones farmacéuticas pueden servir de manera útil como herramientas para la obtención no invasiva de imágenes ópticas de células cancerosas.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas tales como agua o solución salina fisiológicamente tamponada, u otros disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol, aceites tales como aceite de oliva o ésteres orgánicos inyectables. En una realización específica, cuando dichas composiciones farmacéuticas son para su administración a seres humanos, la solución acuosa es apirógena o sustancialmente apirógena. Los expedientes se pueden seleccionar, por ejemplo, para efectuar una liberación retardada de un agente o para dirigirlo de manera selectiva a una o más células, tejidos u órganos. La composición farmacéutica puede estar en una forma farmacéutica unitaria, tal como un comprimido, cápsula, cápsula para espolvorear, gránulo, polvo, jarabe, supositorio, inyección o similares. La composición también puede estar presente en un sistema de suministro transdérmico, por ejemplo, un parche dérmico.
Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede contener agentes fisiológicamente aceptables que actúan, por ejemplo, para estabilizar o aumentar la absorción de un compuesto de la presente invención. Dichos agentes fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular u otros estabilizantes o excipientes. La elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable, que incluye un agente fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración de la composición. La composición farmacéutica también puede comprender un liposoma u otra matriz de polímero, que puede tener incorporado en la misma, por ejemplo, un compuesto de la invención. Los liposomas, por ejemplo, que consiste en fosfolípidos u otros lípidos, son vehículos no tóxicos, fisiológicamente aceptables y metabolizadores, que son relativamente fáciles de fabricar y administrar.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, implicado en portar o transportar los compuestos objeto de un órgano o una parte del cuerpo, a otro órgano o parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua exenta de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de tampón fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. VéaseRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed.(Alfonso R. Gennaro ed.), 2000.
Una composición farmacéutica que contiene un compuesto de la presente invención se puede administrar a un sujeto mediante diferentes vías de administración que incluyen, por ejemplo, por vía oral (por ejemplo, empapados como en soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas, comprimidos, emboladas, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua); sublingüal; anal, rectal o vaginal (por ejemplo, en forma de un óvulo, crema o espuma); por vía parenteral (que incluye intramuscular, intravenosa, subcutánea o intratecal en forma de, por ejemplo, solución o suspensión estéril); por vía nasal; intraperitoneal; subcutánea; transdérmica (por ejemplo, en forma de un parche aplicado a la piel); o tópica (por ejemplo, en forma de una crema, pomada o pulverizador aplicado a la piel). El compuesto también se puede formular para inhalación. En determinadas realizaciones, un compuesto de la presente invención se puede simplemente disolver o suspender en agua estéril. Los detalles de las vías de administración apropiadas y las composiciones adecuadas para la misma se pueden encontrar en, por ejemplo, patentes de Estados Unidos n.° 6.110.973; 5.763.493; 5.731.000; 5.541.231; 5.427.798; 5.358.970; y 4.172.896, así como en las patentes citadas en esos documentos.
Composiciones para su uso en el etiquetado y la visualización
En otro aspecto, la invención proporciona una composición para su uso para visualizar un tumor en un animal, que comprende la etapa de administrar una composición de la invención al animal.
En otro aspecto más, la invención proporciona una composición para su uso para visualizar un tumor en un animal, que comprende las etapas de administrar una composición de la invención al animal y medir una señal detectable generada en el animal a partir de la reacción de la composición con una cisteína proteasa catepsina, en donde la señal detectable está asociada con un tumor en el animal.
En algunas realizaciones de la composición para su uso, la señal detectable es una señal fluorescente. En algunas realizaciones, la señal fluorescente se genera en el margen de un tumor.
Los expertos habituales en la materia comprenden bien la administración de agentes peptídicos para la obtención de imágenes a un animal. En realizaciones preferidas, el agente se administra mediante inyección, aunque cualquier otro medio de administración adecuado se considera dentro del alcance de la invención.
Las composiciones para su uso de la invención están orientadas al etiquetado y la visualización de una proteasa, en particular una cisteína proteasa, en un animal. Los animales adecuados incluyen animales que expresan cisteína proteasas, particularmente en células tumorales. En realizaciones preferidas, el animal es un mamífero. En realizaciones muy preferidas, el animal es un ser humano. En otras realizaciones preferidas, es animal es ganado o una mascota.
En algunas realizaciones, la composición para su uso de la invención comprende la etapa de medir una señal detectable generada en el animal. Los métodos para medir la señal detectable incluyen, pero no se limitan a, métodos de obtención de imágenes, por ejemplo métodos de obtención de imágenes fluorescentes. En algunas realizaciones, el sistema de obtención de imágenes fluorescentes es, por ejemplo, un sistema Xenogen IVIS 100, pero se puede usar cualquier sistema de obtención de imágenes adecuado.
Será muy evidente para el experto habitual en las materias pertinente que se pueden hacer otras modificaciones y adaptaciones adecuadas a los métodos y aplicaciones descritos en el presente documento sin apartarse del alcance de la invención o cualquier realización de la misma. Describiendo ahora la presente invención con detalle, la misma se entenderá con más claridad refiriéndose a los ejemplos siguientes, que están incluidos en el presente documento solamente con fines de ilustración y no pretender limitar la invención.
Ejemplos
Síntesis y caracterización de sondas de formación de imágenes de cisteína catepsina fluorescentes inactivadas que contienen un novedoso electrófilo de fenoximetil cetona (PMK)
La meta de este trabajo fue desarrollar una qABP con propiedades generalesin vivomejoradas en comparación con las qABP existentes que podrían usarse para la formación de imágenes ópticas no invasivas del cáncer. Por lo tanto, se decidió optimizar tres elementos principales de la sonda, el inactivador, el enlazador y la "ojiva" electrófila. Uno de los mayores inconvenientes de las qABP de cisteína catepsina informadas hasta la fecha es la solubilidad acuosa relativamente mala. Por lo tanto, se introdujeron grupos sulfonato en el inactivador QSY21 (Xinget al.(2005)J. Am. Chem. Soc.127:4158-9) para mejorar la solubilidad en agua y, por tanto, la biodistribución de la sonda. La longitud del espaciador que une al electrófilo y al inactivador también se varió para disminuir la lipofilidad de la qABP. Finalmente, se exploró un nuevo electrófilo para aumentar el intervalo de posibles dianas de catepsina. Dado que varios miembros de la familia de las cisteína catepsinas están regulados positivamente en una diversidad de cánceres (Mohamed & Sloane (2006)Nat. Rev. Cáncer(2006) 6:764-75), se esperaría una señal de fluorescencia más brillante en los tumores si la sonda se dirige a un amplio espectro de actividades de cisteína catepsina. Para obtener una sonda más pan-reactiva, se disminuyó el tamaño del electrófilo y la reactividad aumentó. Anteriormente se ha demostrado que el electrófilo de fenoximetil cetona (PMK) 2,3,5,6-tetrafluoro sustituida tiene una mayor reactividad para las cisteína dipeptidil aminopeptidasas en comparación con la aciloximetil cetona derivada del ácido 2,6-dimetilbenzoico (AOMK). Deuet al.(2010)Chem. Biol.17:808-819. El tamaño más pequeño de la PMK también podría aumentar la panreactividad ya que los surcos de unión de algunas de las cisteína catepsinas, están estéricamente restringidos. Blumet al. (2005) Nat. Chem. Biol.1:203-9; Blumet al. (2002) Nat. Chem. Biol.3:668-77; Paulick & Bogyo (2011)ACS Chem. Biol.6:563-72. Adicionalmente, se espera que el éter de fenol sea más establein vivoen comparación con el electrófilo AOMK que contiene un enlace éster que puede degradarse por estereasas.
Como punto de partida para este estudio se sintetizaron 7 análogos(2 - 8)de qABP GB137 (1). Blumet al.(2007)Nat. Chem. Biol.3:668-77; la Publicación Internacional PCT N.° WO 2014/145257. (FIG. 1<a>) Estos compuestos representan todas las combinaciones de los dos electrófilos, dos inactivadores y dos longitudes de enlazador. Todas las sondas se sintetizaron usando un procedimiento optimizado basado en la química de la solución como se describe en la descripción asociada con el Esquema 1 a continuación. La especificidad y la potencia de la sonda se probaron inicialmente marcando células RAW 264.7 intactas (línea celular de monocitos macrófagos leucémicos de ratón) (FIG. 1B). Se observaron varias tendencias en las propiedades de las sondas. Todas las qABP Sulfo-QSY21 funcionalizadas(2, 4, 6y8)mostraron un marcado general de catepsina más fuerte en comparación con las sondas que contienen QSY21 más hidrófobas(1, 3, 5y7).De forma interesante, el cambio en la longitud del espaciador de un enlazador hexilo a uno etilo no tuvo una influencia drástica en el perfil de marcaje. Quizás la observación más sorprendente fue que las qABP con el electrófilo PMK mostraron un perfil de marcaje de cisteína catepsina más amplio en comparación con sus homólogos AOMK. Las sondas5 - 8mostraron un marcaje robusto con catepsina X y las sondas funcionalizadas con Sulfo-QSY216y8fueron capaces de marcar una proforma de catepsina L de mayor peso molecular. Las identidades de las catepsinas marcadas fluorescentemente se determinaron mediante inmunoprecipitación (FIG. 4A). Tras realizar experimentos de marcaje de titulación en células RAW vivas, se observaron varias otras tendencias interesantes (FIG. 1C, 1D; FIG. 4<b>, 4C). Las qABP más hidrófobas (1y5) alcanzan un máximo reducido de intensidad de marcaje a 0,5 pM, sugiriendo que su reducida solubilidad en agua da como resultado la precipitación de las sondas a las concentraciones más altas. La longitud más corta del espaciador parece ser beneficiosa, dando todas las sondas que llevan el espaciador de etilo un marcaje más brillante en comparación con sus homólogos que contienen hexilo. Al comparar AOMK con PMK, se observa una clara diferencia en la selectividad. Las AOMK qABP marcan de forma preferencial las catepsinas S y L y solo en concentraciones más altas marcan la catepsina B. Sorprendentemente, las AOMK qABP2 - 4marcan catepsina X, aunque estudios anteriores habían demostrado que varias otras AOMK relacionadas son incapaces de marcar esta diana (Paulick & Bogyo (2011)ACS Chem. Biol.6:563-72). Las PMK qABP también marcaron todas las cisteína catepsinas diana con igual intensidad, incluso en las concentraciones de sonda más bajas. En conjunto, estos experimentos demuestran que una mayor hidrofilidad mejora la intensidad del marcaje y que las nuevas PMK qABP tienen un perfil de marcaje más amplio, más pan-cisteína catepsina.
Debido a que la PMK qABP8fue la más óptima en términos de intensidad general de marcaje y amplia reactividad de catepsina, se decidió continuar con esta investigación para estudiosin vivoadicionales. Para definir adicionalmente la selectividad de la diana, los lisados de células RAW se marcaron con concentraciones crecientes de qABP8a pH 5,5. Estos resultados demostraron que la sonda es más potente hacia las catepsinas B y X, observándose marcaje en concentraciones tan bajas como 5 nM. Sin embargo, el marcaje de todas las catepsinas (B, S, L, X) se saturó con 500 nM de la sonda (FIG. 2A). Cuando la sonda se usó para un marcaje de transcurso temporal de células RAW vivas a la concentración establecida de 500 nM, se observó una saturación rápida de catepsina X y después un marcaje más lento de catepsina S, L y B con la señal de marcaje de catepsina B aumentando incluso a los 120 min (FIG. 2B). Estos datos indican que la sonda probablemente pueda acceder a los grupos de catepsina X más rápidamente, quizás debido a su localización dentro o en la superficie de las células. También indica que las catepsinas B y X pueden estar en ubicaciones alternativas en las células a las que la sonda puede acceder en diferentes grados. Para probar la estabilidad de la nueva sonda PMK, se examinaron los efectos de la exposición al suero sobre el marcaje en células RAW (FIG. 1C). Mientras que 4 horas de preexposición sérica a la sonda 1 AOMK original resultó en una pérdida de casi el 70%del mareaje diana, más del 80%del mareaje se mantuvo para PMK qABP 8. El tratamiento previo de las células con el inhibidor de cisteína catepsina JPM-OEt también bloqueó más del 90 % de este marcaje. Dada la estabilidad y las propiedades de marcaje mejoradas de la sonda PMK, después se realizaron estudios de microscopía de fluorescencia de células vivas. Estos resultados confirmaron que la sonda produjo señales de marcaje brillantes y específicas y que la mayoría de las catepsinas marcadas con la sonda residen en lisosomas (FIG. 2D).
Dadas las propiedades positivas de marcaje de células vivas del nuevo electrófilo PMK, las qABP PMK de mejor rendimiento 2, 6 y 8 se probaron en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama. Taoet al.(2008)BMC Cáncer8:228. Además, estas sondas PMK se compararon con la sonda AOMK 1 original (FIG. 3A-3F y FIG. 5A-5F). Se implantaron células 4T1 en las almohadillas de grasa mamaria número 2 y 7 de ratones Balb/c y se monitorizó el crecimiento del tumor. Cuando se establecieron los tumores, a los ratones se les inyectaron cantidades equimolares de qABP (20 nmol) a través de la vena de la cola y se obtuvieron imágenes de la fluorescencia de Cy5 de forma no invasiva a lo largo del tiempo (FIG. 3A, 3B). De nuevo, estos resultados confirmaron que la qABP 8 demostró ser superior. Pudo observarse una sólida activación de la fluorescencia específica del tumor para la sonda 8 específicamente en la región del tumor con alto contraste general. Esta señal continuó aumentando con el tiempo hasta el final del curso del tiempo. Por último, la sonda 8 logró una señal de fluorescencia específica del tumor mejorada más de veinte veces en comparación con la sonda 1. También se observó un buen contraste específico del tumor para la sonda 6 y en menor medida para la sonda 2, aunque ambos todavía superaron a la sonda 1 en más de diez veces (FIG. 5A, 5B). Después de completar el curso del tiempo, se extirparon los tumores y se midió la fluorescencia del tumorex vivo,seguido de homogeneización y análisis de las proteínas marcadas fluorescentemente mediante SDS-PAGE (FIG. 3C y FIG. 5C). La cuantificación de la fluorescenciaex vivoy el marcaje de cisteína catepsina total mostraron una tendencia similar a la observada en los estudios de imágenes ópticas no invasivas (FIG. 3D y FIG. 5D). Para determinar la fuente celular de la fluorescencia de la sonda, la tinción por inmunofluorescencia de secciones de tejido tumoral de ratones marcados con sonda se tiñeron usando el marcador de macrófagos CD68 (FIG. 3E y FIG. 5E). La fluorescencia de Cy5 localizada en células CD68 positivas, sin embargo, no todas las células positivas para CD68 también fueron sondadas 8 positivas, indicando diferentes estados de activación de los macrófagos asociados a tumores. Un análisis más detallado con microscopía de barrido láser confocal (CLSM) confirmó que todas las células positivas para la sonda 8 fueron CD68 positivas, pero esa sonda marcó catepsinas y las señales de CD68 no se localizan en las mismas vesículas (FIG. 3F y FIG. 5F). Tomados en conjunto, estos datos confirman que al aumentar la hidrofilidad del inactivador, el acortamiento del espaciador y la introducción de una trampa nucleofílica más reactiva y menos restringida estéricamente dieron como resultado una qABP con una amplia reactividad de cisteína catepsina y unas propiedades mejoradas generalesin vivo.
Aunque se han descrito funciones muy distintas para algunos de los miembros de la familia de las cisteína catepsinas, (Conus & Simon (2010)Swiss Med. Wkly.140:w13042) otras funciones son redundantes y las alteraciones en la actividad de una catepsina pueden influir en la actividad de otras. Por ejemplo, la pérdida de catepsina B se compensa con una actividad aumentada de catepsina X Sevenichet al.(2010)Proc. Natl Acad. Sci. USA107:2497-502) y la regulación positiva de la catepsina B da como resultado una regulación negativa de la catepsina L (Gopinathanet al.(2012)Gut61:877-84). Por lo tanto una sonda de amplio espectro es muy valiosa ya que facilita la lectura de múltiples cisteína catepsinas en un experimento y permite la comparación de las actividades de las catepsinas individuales entre sí. La utilidad de estas ABP pan-reactivas ha sido demostrada por las sondas de fluorofosfonato pan-serina hidrolasa (Liuet al.(1999)Proc. Natl Acad. Sci. USA96:14694-9) y la sonda de proteasoma panreactivo MV151 (Verdoeset al.(2006)Chem. Biol.13:1217-26). Adicionalmente, debido a que las qABP basadas en PMK son altamente reactivas hacia la catepsina X, estos andamios pueden usarse para generar qABP selectivas contra esta cisteína catepsina aún poco comprendida. (Paulick & Bogyo (2011)ACS Chem. Biol.
6:563-72).
En conclusión, se ha sintetizado una novedosa clase de sondas basadas en actividad fluorescente inactivada que llevan un electrófilo PMK con mayor reactividad y selectividad más amplia en comparación con las sondas basadas en AOMK informadas anteriormente. La hidrofilidad de la qABP se ha aumentado adicionalmente introduciendo un inactivador sulfonado y acortando el espaciador que une el electrófilo y el inactivador, dando como resultado una mayor solubilidad acuosa y propiedadesin vivomejoradas que dan como resultado un contraste mejorado en formación de imágenes ópticas no invasivas del cáncer.
MÉTODOS
General
Todas las resinas y reactivos se adquirieron a proveedores comerciales y se usaron sin más purificaciones. Todos los disolventes usados eran de calidad HPLC. Todas las reacciones sensibles al agua se realizaron en disolventes anhidros a presión positiva de argón. Las reacciones se analizaron por LC-MS usando un espectrómetro de masa API 150EX de un solo cuadrupolo (Applied Biosystems). La HPLC de fase inversa se realizó con un ÁKTA explorer 100 (Amersham Pharmacia Biotech) usando columnas C18. Los espectros de las RMN se registraron en un Varian 400 Mhz (400/100), Varian 500 MHz (500/125) o un Varian Inova 600 MHz (600/150 MHz) equipado con un accesorio de gradiente de campo pulsado. Los desplazamientos químicos se proporcionan en Chemical ppm (8) con respecto al tetrametilsilano como patrón interno. Las constantes de acoplamiento se proporcionan en Hz. Los geles fluorescentes se escanearon usando un escáner láser de superficie plana Typhoon 9400 (GE Healthcare). Las intensidades del etiquetado en gel se cuantificaron usando el programa informático Image J. El análisis estadístico se realizó usando Microsoft Excel, y el s.e.m. se calculó dividiendo el s.d. por la raíz cuadrada de n. Las imágenes de microscopio fluorescentes se obtuvieron con un microscopio confocal Zeiss LSM 710 y un microscopio inverso Zeiss Axiovert 200 M equipado con un objetivo de 10x, 40x y 63x (Carl Zeiss). Se usó el programa informático Slidebook para controlar el microscopio y la cámara y para el análisis de los datos (Intelligent Imaging Innovations).
Síntesis de qABP
El esquema de síntesis para la síntesis de los compuestos siguientes se representa a continuación en el esquema 1.
Ácido 2,6-dimetil-4-((6-(tritilamino)hexil)carbamoil)benzoico(11a).Se recogió la sal del ácido monotritil 1,6-diaminohexano acético(9a)(117,2 mg, 0,28 mmol) en DCM y se lavó con NaHCO3ac. sat., se secó sobre Na2SO4y se concentró al vacío. La amina se disolvió en DMF y HOBt monohidrato (43 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.), Se añadieron EDC (54 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y ácido 2,6-dimetiltereftálico(10)(54,4 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante una noche, antes de concentrarla al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (DCM ^ MeOH al 5 % en DCM) y posteriormente se recogió en DCM y se lavó con agua y se secó sobre MgSO4para producir 70 mg (0,13 mmol, 47 % de rendimiento aislado).
Ácido 2,6-dimetil-4-((2-(tritilamino)etil)carbamoil)benzoico(11b).La sal del ácido mono-tritil etilendiamino acético(9b)(97,9 mg, 0,27 mmol) se recogió en DCM y se lavó con NaHCO3ac. sat., se secó sobre Na2SO4y se concentró al vacío. La amina se disolvió en DMF y HOBt monohidrato (43 mg, 0,28 mmol, 1,04 equiv.), Se añadieron EDC (61 mg, 0,32 mmol, 1,2 equiv.) y ácido 2,6- dimetiltereftálico(10)(52 mg, 0,27 mmol, 1 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante una noche, antes de concentrarla al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (DCM ^ 5 % de MeOH en DCM) y posteriormente se recogió en DCM y se lavó con agua y se secó sobre MgSO4para producir 28 mg (0,06 mmol, 22 % de rendimiento aislado).
2.3.5.6- tetrafluoro-4-hidroxi-N-(6-(tritilamino)hexil)benzamida(13a).Se recogió la sal del ácido monotritil 1,6-diaminohexano acético(9a)(117,2 mg, 0,28 mmol) en DCM y se lavó con NaHCO3ac. sat., se secó sobre Na2SO4y se concentró al vacío. La amina se disolvió en DMF y HOBt monohidrato (43 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.), se añadieron EDC (54 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y ácido 2,3,5,6-tetrafluoro-4-hidroxibenzoico(12)(59 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante una noche, antes de concentrarla al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (15% -> 30% de acetato de etilo en hexano) para producir 90 mg (0,16 mmol, 58 % de rendimiento aislado).
2.3.5.6- tetrafluoro-4-hidroxi-N-(2-(tritilamino)etil)benzamida(13b).La sal del ácido mono-tritil etilendiamino acético(9b)(100 mg, 0,28 mmol) se recogió en DCM y se lavó con NaHCO3ac. sat., se secó sobre Na2SO4y se concentró al vacío. La amina se disolvió en DMF y HOBt monohidrato (43 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.), se añadieron EDC (54 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y ácido 2,3,5,6-tetrafluoro-4-hidroxibenzoico(12)(59 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante una noche, antes de concentrarla al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida (20 % -> 35 % de acetato de etilo en hexano) para producir 90 mg (0,18 mmol, 65 % de rendimiento aislado). RMN1H (400 MHz, DMSO) 8 = 8,77 (t, J = 6,0, 1H), 7,39 (d, J = 7,8, 6H), 7,27 (t, J = 7,7, 6H), 7,17 (t, J = 7,2, 3H), 3,40-3,35 (m, 2H), 2,86-2,77 (m, 1H), 2,14-2,04 (m, 2H).
Esquema 1.Reactivos y condiciones: i. EDC, HOBt, DMF. ii. a) KF, DMF. b) TFA al 1 %, DCM. Ni. a) QSY21-NHS o Sulfo-QSY21-NHS, DiPEA, DMSO. b) TFA/DCM = 1/1. c) Cy5-NHS, DiPEA, DMSO. iv. a) KF, DMF, 80 °C. b) TFA al 1 %, DCM.
Producto intermedio15.Se suspendió fluoruro de potasio (3 mg, 52 |jmol, 3 equiv.) en DMF con sonicación durante 5 min, tras lo cual se añadió el ácido carboxílico11a(10 mg, 19 |jmol, 1,1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante 10 min, antes de añadir la clorometil cetona14(9,7 mg, 17,3 jmol, 1 equiv.). Después de 2 h la mezcla de reacción se concentró al vacío y el producto en bruto se recogió en TFA al 1 % en DCM y se agitó durante 30 min, antes de inactivar mediante la adición de triisopropilsilano hasta que la solución se hizo incolora. Después de coevaporación con tolueno (3x) el compuesto del título se purificó por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 15:85 a 55:45 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización para proporcionar15en forma de un polvo de color blanco (3,12 mg, 3,46 jmol, 20 % en 2 etapas).
Producto intermedio16.Se suspendió fluoruro de potasio (3 mg, 52 jmol, 3 equiv.) en DMF con sonicación durante 5 min, tras lo cual se añadió el ácido carboxílico11b(9,5 mg, 20 jmol, 1,1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante 10 min, antes de añadir la clorometil cetona14(10 mg, 17,9 jmol, 1 equiv.). Después de 1,5 h la mezcla de reacción se concentró al vacío y el producto en bruto se recogió en TFA al 1 % en DCM y se agitó durante 30 min, antes de inactivar mediante la adición de triisopropilsilano hasta que la solución cambió a incolora. Después de coevaporación con tolueno (3x), el producto intermedio16se purificó por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 15:85 a 55:45 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización para proporcionar un polvo de color blanco (3,99 mg, 4,57 jmol, 26 % en 2 etapas). Rm N1H (500 MHz, CD3OD) 87,80 (s, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,35-7,18 (m, 10H), 5,06 (s, 2H), 4,85-4,78 (m, 2H), 4,42 (dd,J=13,1, 6,2 Hz, 1H), 4,37 (dd, J = 10,1, 4,0 Hz, 1H), 3,64 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,18 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,12 (dd, J = 13,7, 7,0 Hz, 1H), 3,01 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,94 (dd, J = 13,6, 8,9 Hz, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,92-1,82 (m, 1H), 1,67-1,57 (m, 1H), 1,49-1,26 (m, 4H), 1,42 (s, 9H).
Producto intermedio17.Se suspendió fluoruro de potasio (6,3 mg, 108 jmol, 3 equiv.) en DMF con sonicación durante 5 min, tras lo cual se añadió el fenol13a(21,5 mg, 39 jmol, 1,1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante 10 min, antes de añadir la clorometil cetona14(20 mg, 36 jmol, 1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 5 h, antes de concentrarla al vacío. El producto en bruto se recogió en TFA al 1 % en DCM y se agitó durante 30 min, antes de inactivar mediante la adición de triisopropilsilano hasta que la solución cambió a incolora.
Después de coevaporación con tolueno (3x), la purificación por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1%, 25:75 a 70:30 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización proporcionó el compuesto del título en forma de un polvo de color blanco (16,6 mg, 17,5 jmol, 49% en 2 etapas). RMN1H (500 MHz, CD3OD) 8 7,29 (m, 10H), 5,07 (s, 2H), 4,86 (m, 2H), 4,44 (m, 2H), 3,41 (t,J= 6,8, 2H), 3,10 (dd, J = 13,5, 7,0, 1H), 3,02 (t, J = 6,8, 2H), 2,97-2,91 (m, 3H), 1,93-1,81 (m, 1H), 1,73-1,62 (m, 4H), 1,62-1,53 (m, 1H), 1,51-1,46 (m, 4H), 1,43 (s, 9H), 1,45-1,25 (m, 4H).
Producto intermedio18.Se suspendió fluoruro de potasio (6,3 mg, 108 jmol, 3 equiv.) en DMF con sonicación durante 5 min, tras lo cual se añadió el fenol13b(19,4 mg, 39 jmol, 1,1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante 10 min, antes de añadir la clorometil cetona14(20 mg, 36 jmol, 1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 3 h, antes de concentrarla al vacío. El producto en bruto se recogió en TFA al 1 % en DCM y se agitó durante 30 min, antes de inactivar mediante la adición de triisopropilsilano hasta que la solución cambió a incolora.
Después de coevaporación con tolueno (3x), la purificación por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1%, 20:80 a 60:40 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización proporcionó el compuesto del título en forma de un polvo de color blanco (15,4 mg, 17,3 jmol, 48% en 2 etapas). RMN1H (400 MHz, CD3OD) 8 = 7,36-7,12 (m, 10H), 5,05 (s, 2H), 4,86-4,81 (m, 2H), 4,42-4,37 (m, 2H), 3,64 (t, J = 6,5, 2H), 3,14 (t, J = 6,5, 2H), 3,08 (dd, J = 13,9, 7,2, 1H), 2,99 (t, J = 6,5, 2H), 2,91 (dd, J = 13,9, 8,4, 1H), 1,90-1,78 (m, 1H), 1,62-1,48 (m, 1H), 1,41 (s, 9H), 1,46-1,20 (m, 4H). Las sondas 1 a 8 son ejemplos de referencia.
Sonda1(GB137). El producto intermedio15(1,5 mg, 1,7 jmol) se recogió en DMSO (50 jl) y se añadieron QSY21-NHS (1.39 mg, 1,7 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,5 jl, 8,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h la amina QSY21 se purificó por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TfA al 0,1 %, 40:60 a 80:20 durante 20 min;
5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc el polvo de color azul oscuro resultante se recogió en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de coevaporación con tolueno (3x) para dar 2,42 mg de la sal TFA correspondiente (1,6 jmol, 95 % en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSO (50 jl) y se añadieron Cy5-NHS (1,3 mg, 1,76 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (1,4 jl, 8 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, la purificación por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 40:60 a 75:25 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, proporcionó la sonda1en forma de un polvo de color azul oscuro (2,0 mg, 0,99 jmol, 62 %).
Sonda2(BMV122). El producto intermedio15(1,5 mg, 1,7 jmol) se recogió en DMSO (50 jl) y se añadieron Sulfo-QSY21-NHS (1,66 mg, 1,7 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,5 jl, 8,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h la amida Sulfo-QSY21 se purificó por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 30:70 a 70:30 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc el polvo de color azul oscuro resultante se recogió en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de coevaporación con tolueno (3x) para dar 2,29 mg de la sal TFA correspondiente (1,39 jmol, 81 % en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSO (50 jl) y se añadieron Cy5-NHS (1,1 mg, 1,5 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (1,2 jl, 7 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, la purificación por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 15:85 a 50:50 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, proporcionó la sonda2en forma de un polvo de color azul oscuro (1,83 mg, 0,84 jmol, 61 %).
Sonda3(BMV145). El producto intermedio16(1,5 mg, 1,7 |jmol) se recogió en DMSO (50 jl) y se añadieron QSY21-n Hs (1,39 mg, 1,7 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,5 jl, 8,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h la amina QSY21 se purificó por HPLC (columna preparativa de fase inversa C-is, CH3CN/H2O TfA al 0,1 %, 40:60 a 80:20 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc el polvo de color azul oscuro resultante se recogió en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de coevaporación con tolueno (3x) para dar 0,86 mg de la sal TFA correspondiente (0,6 jmol, 35 % de rendimiento aislado en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSO (50 jl) y se añadieron Cy5-NHS (0,5 mg, 0,66 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (0,57 jl, 3,3 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, la purificación por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 40:60 a 75:25 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, proporcionó la sonda3en forma de un polvo de color azul oscuro (0,67 mg, 0,34 jmol, 57 %).
Sonda4(BMV146). El producto intermedio16(1,0 mg, 1,2 jmol) se recogió en DMSO (50 jl) y se añadieron Sulfo-QSY21-NHS (1,25 mg, 1,2 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,05 jl, 6 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h la amida Sulfo-QSY21 se purificó por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 20:80 a 80:20 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc el polvo de color azul oscuro resultante se recogió en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de coevaporación con tolueno (3x) para dar 1,06 mg de la sal TFA correspondiente (0,66 jmol, 55 % en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSO (50 jl) y se añadieron Cy5-NHS (0,55 mg, 0,73 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (0,64 jl, 3,65 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h., la purificación por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 15:85 a 50:50 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, proporcionó la sonda4en forma de un polvo de color azul oscuro (0,63 mg, 0,3 jmol, 45 %).
Sonda5(BMV118). El producto intermedio17(1,2 mg, 1,3 jmol) se recogió en DMSO (50 jl) y se añadieron QSY21-n Hs (1.0 mg, 1,3 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,13 jl, 6,5 jmol, 5 equiv.). Después de 2 h la amina QSY21 se purificó por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TfA al 0,1 %, 40:60 a 80:20 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc el polvo de color azul oscuro resultante se recogió en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de coevaporación con tolueno (3x) para dar 2,0 mg de la sal TFA correspondiente (1,3 jmol, cuantitativo en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSO (50 jl) y se añadieron Cy5-NHS (1,0 mg, 1,3 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,1 jl, 6,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, la purificación por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 40:60 a 85:15 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, proporcionó la sonda5en forma de un polvo de color azul oscuro (1,91 mg, 0,94 jmol, 72 %).
Sonda6(BMV119). El producto intermedio17(1,2 mg, 1,3 jmol) se recogió en DMSO (50 jl) y se añadieron Sulfo-QSY21-NHS (1,35 mg, 1,3 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,13 jl, 6,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h la amida Sulfo-QSY21 se purificó por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TfA al 0,1 %, 30:70 a 90:10 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc el polvo de color azul oscuro resultante se recogió en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de coevaporación con tolueno (3x) para dar 1,98 mg de la sal TFA correspondiente (0,9 jmol, 70 % en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSO (50 jl) y se añadieron Cy5-NHS (0,7 mg, 0,9 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (0,8 jl, 4,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, la purificación por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 15:85 a 50:50 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, proporcionó la sonda6en forma de un polvo de color azul oscuro (1,63 mg, 0,74 jmol, 82 %).
Sonda7(BMV108). El producto intermedio18(1,2 mg, 1,3 jmol) se recogió en DMSO (50 jl) y se añadieron QSY21-<n>H<s>(1,2 mg, 1,4 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (1,13 jl, 6,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h la amina QSY21 se purificó por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 30:70 a 70:30 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización para proporcionar un polvo de color azul oscuro (1,43 mg, 0,99 jmol, 76%). El grupo protector Boc se eliminó posteriormente en TFA/DCM (1/1) durante 30 min, antes de la coevaporación con tolueno (3x). La sal TFA se disolvió en DMSO (50 jl) y se añadieron Cy5-NHS (0,83 mg, 1,1 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (0,88 jl, 5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, la purificación por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 30:70 a 70:30 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización proporcionó la sonda7en forma de un polvo de color azul oscuro (0,95 mg, 0,48 jmol, 49 % en 2 etapas).
Sonda8(BMV109). El producto intermedio18(5,8 mg, 6,5 jmol) se disolvió en DMSO (100 jl). Se añadieron Sulfo-QSY21-NHS (9,75 mg, 10,39 jmol, 1,6 equiv.) y DiPEA (8,4 jl, 50,5 jmol, 7,8 equiv.) y la mezcla se agitó durante una noche. La amida Sulfo-QSY21 se purificó por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 25:75 a 55:45 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización para proporcionar un polvo de color azul oscuro. El grupo protector Boc se eliminó posteriormente en TFA/dCm (1/1) durante 30 min, antes de la coevaporación con tolueno (3x). El residuo se disolvió en DMSO (250 jl) y se añadieron Cy5-NHS (10,5 mg, 13,9 jmol, 2,1 equiv.) y DiPEA (12 jl, 72 jmol, 11 equiv.). Después de 4 h, la purificación por HPLC (columna preparativa de fase inversa C18, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 25:75 a 45:55 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización proporcionó la sonda8en forma de un polvo de color azul oscuro (7,74 mg, 4,61 jmol, 71 % en 3 etapas). RMN (600 MHz, CD3CN) 8 8,12-8,08 (m, 1H), 8,01-7,93 (m, 2H), 7,89-7,85 (m, 2H), 7,75 (dd,J= 12,0, 1,5 Hz, 2H), 7,72 (dd,J = 8.4,1,7 Hz, 1H), 7,69 (dd,J =8.3, 1,2 Hz, 1H), 7,66 (s, 2H), 7,62-7,57 (m, 2H), 7,51 (dd,J =8.4, 5,1 Hz, 2H), 7,46 (d,J= 9,4 Hz, 2H), 7,41-7,35 (m, 3H), 7,24 (s, 1H), 7,22 (s, 1H), 7,21-7,14 (m, 6H), 7,13-7,09 (m, 6H), 7,05 (dd, J = 8,8, 4,6 Hz, 1H), 6,39 (t,J= 12,8 Hz, 1H), 6,11 (t, J = 12,6 Hz, 1H), 4,87 (c, J = 12,7 Hz, 2H), 4,83 (dd, J = 39,7, 14,1 Hz, 2H), 4,23-4,12 (m, 4H), 3,93 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 3,86 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 3,34 (dd, J = 6,7, 4,1 Hz, 2H), 3,28-3,15 (m, 9H), 3,04-2,92 (m, 3H), 2,80-2,74 (m, 1H), 2,45 (t, J = 11,9 Hz, 2H), 2,15-2,09 (m, 1H), 2,09-2,03 (m, 2H), 1,74-1,58 (m, 7H), 1,57 (s, 6H), 1,55 (s, 6H), 1,49 (dd, J = 15,1,7,4 Hz, 4H), 1,35-1,22 (m, 7H), 1,20 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,16-1,12 (m, 4H).
Cultivo celular y mareaje de células vivas y lisados celulares
Las células RAW se cultivaron en DMEM (GIBCO) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; GIBCO), penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 pg/ml de (GIBCO). Las células 4T1 (ATCC) se cultivaron en RPMI (GIBCO) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; GIBCO), penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 pg/ml de (GIBCO). Todas las células se cultivaron en una incubadora humidificada con CO2 al 5% a 37 °C. Para el marcaje de células intactas, las células se expusieron a una sonda (500x en DMSO) en medio de cultivo y se incubaron durante 2 horas a 37 °C, salvo que se indique lo contrario. Cuando se indicó, las células se preincubaron durante 1 h con el inhibidor JPM-OEt (500x en DMSO) o se expusieron a suero de ratón (1 pl de solución madre de sonda en DMSO añadido a 9 pl de suero) durante 4 h antes de la adición a las células. Después del marcaje, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampón de lisis hipotónico (PIPES 50 mM, pH 7,4, KCl 10 mM, MgCl25 mM, EDTA 2 mM, 4 mM DTT y NP-40 al 1 %) y se pusieron en hielo durante 15 min, se centrifugaron a 4 °C durante 30 min y se recogieron los sobrenadantes y se determinó la concentración de proteínas usando un kit BCA (pierce). Se desnaturalizaron 40 pg de proteína total mediante la adición de 4x tampón de muestra SDS y calentamiento durante 3 min a 100 °C, se resolvieron mediante SDS-PAGE (15%) y las proteasas marcadas se visualizaron barriendo el gel con un formador de imágenes Typhoon (GE Healthcare). Las intensidades de marcaje se cuantificaron usando el software Image J. Para el marcaje de catepsina en lisados celulares, las células se recogieron, se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampón citrato (tampón citrato 50 mM, pH 5,5, DDT 5 mM, CHAPS al 0,5%, Triton X al 0,1 %). Después de 15 minutos en hielo y centrifugación a 4 °C durante 30 min se recogieron los sobrenadantes y se determinó la concentración de proteínas usando un kit BCA (pierce). Se expusieron 40 pg de proteína total a la sonda indicada (200x en DMSO) durante 1 h a 37 °C. Se añadió 4x tampón de muestra SDS y la proteína se desnaturalizó durante 3 min a 100 °C y se analizó como se describe anteriormente. Para la microscopía de células vivas, se sembraron células RAW en medio completo sin rojo de fenol a una densidad de 1105 células en una placa con fondo de vidrio de 35 mm(in vitroscientific) y se cultivaron durante la noche. Las células se expusieron a DMSO o a una sonda 1 pM (500x en DMSO) durante 2 horas. Durante la última h, se añadió a las células LysoTracker-green (concentración final de 200 nM, 1000x en DMSO). Cuando se indicó, las células se preincubaron durante 1 h con el inhibidor JPM-OEt (500x en DMSO). Se tomaron imágenes de las células a 40x usando un microscopio confocal Zeiss Axiovert 200 M en los canales Cy5 y FITC.
Modelos animales
Todo el cuidado y la experimentación con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices actuales del National Institutes of Health and Stanford University Institutional Animal Care and Use Committee. Los ratones BALB/c hembra (6-8 semanas, The Jackson Laboratory) fueron inyectados en la almohadilla de grasa número 2 y 7 con 1-105 células 4T1 (ATCC) en PBS bajo anestesia con isoflurano y se monitorizó el crecimiento del tumor. 24 h antes de la obtención de imágenes se retiró el pelo de la región de interés usando la "loción Nair". En el día 10, la sonda indicada (20 nmol; 0,8 nmol g'1) se administró a través de la vena de la cola en un volumen de 100 pl (DMSO al 20 % en PBS). Después de la inyección, se tomaron imágenes de los ratones de forma no invasiva en los momentos indicados usando un sistema IVIS 100 (Xenogen). Las imágenes se analizaron con el software Living Image (PerkinElmer). Después del último momento, los ratones se anestesiaron con isofluorano y se sacrificaron mediante dislocación cervical. Para las mediciones de fluorescenciaex vivoy la evaluación del perfil de marcaje de la sondain vivose eliminaron los tumores, se tomaron imágenes usando un FMT 2500 (PerkinElmer) y el tejido se sometió a ultarsonidos (1 min en hielo) en tampón citrato (tampón citrato 50 mM, pH 5,5, DDT 5 mM, CHAPS al 0,5 %, Triton X al 0,1 %). Después de la centrifugación a 4 °C durante 30 min se recogieron los sobrenadantes y se determinó la concentración de proteínas usando un kit BCA (pierce). Se desnaturalizaron 40 pg de proteína total en tampón de muestra SDS durante 3 minutos a 100 °C y se analizaron como se ha descrito anteriormente. Para la inmunofluorescencia, los tumores resecados se incubaron en una solución de PFA al 4 % en PBS durante 6 h a 4 °C, seguido de una incubación durante la noche en una solución de sacarosa al 30 % y congelación del tejido en medio OCT. Se fijaron secciones de 6 pm en acetona, se bloquearon con tampón de bloqueo de PNB y se incubaron con rata anti-CD68 de ratón (1:1000; Serotec) durante la noche. Cabra-anti Rata conjugada con AlexaFluor-488 (1:500; Invitrogen) se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después las secciones se tiñeron con DAPI (2 pg/ml; Invitrogen) durante cinco minutos y después se montó en ProLong Gold Mounting Medium (Invitrogen). Después se visualizaron los tejidos usando un microscopio Zeiss Axiovert 200M.
Síntesis y caracterización de una sonda de formación de imágenes marcada con verde de indocianina
Se sintetizó una sonda de formación de imágenes que comprende un elemento detectable de verde de indocianina y un inactivador de QC-1 como se ilustra en el siguiente esquema:
donde el péptido protegido con Boc usado en la segunda etapa se preparó como se describe anteriormente. Los productos de las reacciones de acoplamiento con QC-1 e ICG se confirmaron mediante análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas ("CLEM").
La sonda que comprende un fluoróforo ICG y un inactivador QC-1 (BMV109-ICG) se comparó en estudiosin vivoyex vivoa una sonda que comprende un fluoróforo Dylight780 y un inactivador QC-1 (BMV109-Dylight780). Como se muestra en las FIG. 6A y 6B, la sonda marcada con ICG muestra una captación tumoral mejorada y señales de fondo más bajas en comparación con la sonda marcada con Dylight780. (Véase, en particular, FIG. 6B a dosis de 50 nmol).
Aunque se han proporcionado ejemplos específicos, la descripción anterior es ilustrativa y no restrictiva. Una cualquiera o más de las características de las realizaciones descritas anteriormente se puede combinar de cualquier manera con una o más características de cualquier otra de las realizaciones de la presente invención. Además, para los expertos en la materia serán evidentes muchas variaciones de la invención tras revisar la memoria descriptiva. El alcance de la invención debe, por lo tanto, determinarse por referencia a las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de los equivalentes.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto para su uso para etiquetar una proteasa, que tiene la fórmula (III):
  2. en donde R comprende un bloqueador QSY o un bloqueador QC-1; y m y n son independientemente números enteros de 1 a 8; en donde D comprende un tinte de benzoindol; AA1 es una cadena lateral de aminoácidos; U es O, NH o S; R1 es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo o un grupo protector, y está opcionalmente sustituido con de 1 a 3 grupos A; y cada A es independientemente alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alcanoílo, alquilamino, arilo, ariloxi, arilamino, aralquilo, aralcoxi, aralcanoílo, aralcamino, heteroarilo, heteroariloxi, heteroarilamino, heteroaralquilo, heteroaralcoxi, heteroaralcanoílo, heteroaralcamino, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalcoxi, cicloalcanoílo, cicloalcamino, heterociclilo, heterocicliloxi, heterociclilamino, heterociclilalquilo, heterociclilalcoxi, heterociclilalcanoílo, heterociclilalcamino, hidroxilo, tio, amino, alcanoilamino, aroilamino, aralcanoilamino, alquilcarboxi, carbonato, carbamato, guanidinilo, urea, halo, trihalometilo, ciano, nitro, fosforilo, sulfonilo, sulfonamido o azido. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el tinte de benzoindol tiene la estructura:
  3. en donde o es un número entero de 1 a 4; R2 es un grupo alquilo C2-C8, opcionalmente sustituido con un sulfonato o carbonato; cada R3 es independientemente un grupo alquilo C1-C6; y L4 es un enlazador alquilo opcionalmente sustituido, en donde cada átomo de carbono está opcionalmente reemplazado con un heteroátomo. 3. El compuesto de la reivindicación 2, en donde el tinte de benzoindol tiene la estructura:
  4. 4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde AA1 es una cadena lateral de aminoácido aralquilo, opcionalmente sustituido con de 1 a 3 grupos A; o en donde U es O.
  5. 5. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el bloqueador QSY es un bloqueador QSY hidrófilo; preferentemente, el bloqueador QSY hidrófilo es un bloqueador sulfo-QSY.
  6. 6. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el bloqueador QC-1 tiene la estructura:
  7. 7. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R es
    y D es
  8. 8. El compuesto de la reivindicación 7, que tiene la estructura:
  9. 9. Una composición para su uso para etiquetar una proteasa en un animal, que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  10. 10. La composición para su uso de la reivindicación 9, en donde el uso comprende la etapa de: administrar la composición según se define en la reivindicación 9 al animal.
  11. 11. Una composición para su uso para visualiza un tumor en un animal, en donde el uso comprende las etapas de: administrar la composición como se define en la reivindicación 9 al animal; y medir una señal detectable generada en el animal a partir de una reacción de la composición con una cisteína proteasa de catepsina; en donde la señal detectable está asociada con un tumor en el animal.
  12. 12. La composición para su uso de la reivindicación 11, en donde la señal detectable es una señal fluorescente.
  13. 13. La composición para su uso de la reivindicación 12, en donde la señal fluorescente se genera en el margen de un tumor.
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