CN110545883A - 针对cd19的人源化抗原结合结构域及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区，其中人源化VL和VL区衍生自小鼠抗CD19克隆FMC63抗体；人源化VL和/或人源化VH区在框架区中包含一个或多个氨基酸取代。人源化抗CD19抗体或抗原结合片段可以是单链可变片段(scFv)、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的一部分。本发明的其他方面涉及包含CAR或TCR的细胞及其在T细胞疗法中的用途。

Description

针对CD19的人源化抗原结合结构域及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年4月24日提交的美国临时申请62/489,258的优先权，其通过引用整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交并且在此通过引用整体并入本文。2017年4月24日创建的所述ASCII拷贝命名为K-1046_01SL_ST25.txt，并且大小为43,305字节。
发明背景
人类癌症就其本质而言包含已经经历了遗传或表观遗传转化而变成异常癌细胞的正常细胞。此时，癌细胞开始表达与正常细胞表达的蛋白质和其他抗原不同的蛋白质和其他抗原和/或蛋白质以显著大于正常细胞表达的量得以表达。
嵌合抗原受体(CAR)和工程化T细胞受体(TCR)，其包含能够与癌细胞表达蛋白质相互作用的结合结构域，允许T细胞靶向并杀伤表达特定蛋白质的癌细胞。类似地，与治疗剂缀合的抗体能够选择性地将治疗剂提供给表达特定蛋白质的癌细胞并杀伤这些癌细胞。
需要包含人源化抗原结合结构域的CAR、TCR和抗体用于靶向和杀伤癌细胞。
发明概述
本发明通过提供包括经工程化的免疫细胞的组合物和方法满足了该需求，所述经工程化的免疫细胞表达具有人源化抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)；这些CAR和TCR特异性靶向并杀伤癌细胞。本发明还通过提供包括特异性靶向并杀伤癌细胞的抗体的组合物和方法满足了该需求。
本发明的一方面是人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段。抗体包含轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区，其中VL区包含VL互补决定区(CDR)1(VL CDR1)、VL CDR2和VL CDR3并且VH区包含VH CDR1、VL CDR2和VL CDR3。VL区可以衍生自SEQ ID NO:36且VH区衍生自SEQID NO:37，并且VL和/或VH区在框架区包含一个或多个氨基酸取代。
在一些实施方案中，权利要求1的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中VL区与SEQ ID NO:36相比包含高达5、10、15、20、25或30个氨基酸取代。
在一些实施方案中，VL区中一个或多个氨基酸取代在对应于SEQ ID NO:36的7、8、10、15、22、41、42、43、44、49、71、72、77、79、80、83、87、100和/或107的位置处。
在一些实施方案中，VL区中一个或多个氨基酸取代选自SEQ ID NO:36的位置7处的Ser、位置8处的Pro、位置15处的Val、位置22处的Thr、位置41处的Gln、位置42处的Lys、位置43处的Ala、位置72处的Thr、位置77处的Ser、位置79处的Gln、位置80处的Pro和/或位置107处的Lys。
在一些实施方案中，VH区与SEQ ID NO:37相比包含高达5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸取代。
在一些实施方案中，VH区中一个或多个氨基酸取代在对应于SEQ ID NO:37的1、3、5、9、13、15、16、17、19、20、21、23、24、37、42、48、67、69、70、71、73、76、77、78、79、81、83、86、87、88、92和/或115的位置处。
在一些实施方案中，VH区中一个或多个氨基酸取代选自SEQ ID NO:37的位置1处的Gln、位置3处的Gln、位置5处的Val、位置9处的Gly、位置13处的Lys、位置13处的Gln、位置15处的Gly、位置16处的Arg、位置16处的Thr、位置17处的Thr、位置19处的Arg、位置20处的Leu、位置21处的Ser、位置24处的Ala、位置42处的Gly、位置48处的Ile、位置67处的Phe、位置70处的Ser、位置71处的Arg、位置73处的Thr、位置76处的Asn、位置77处的Thr、位置78处的Leu、位置79处的Tyr、位置81处的Gln、位置83处的Ser、位置86处的Thr、位置86处的Arg、位置87处的Ala、位置88处的Glu、位置88处的Ala、位置92处的Val和/或Leu。
本发明的另一方面是人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区。VL区包含VL互补决定区(CDR)1(VL CDR1)、VL CDR2和VL CDR3并且VH区包含VH CDR1、VL CDR2和VL CDR3。VL区具有与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:17至少85％相同的氨基酸序列；和/或VH区具有与SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:18至少85％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自下组：IgG、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv和单结构域抗体(dAB)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是scFv。
在一些实施方案中，VL CDR1与SEQ ID NO:27至少80％相同，VL CDR2与SEQ IDNO:28至少80％相同，并且VL CDR3与SEQ ID NO:29至少80％相同。
在一些实施方案中，VL CDR1包含SEQ ID NO:27，VL CDR2包含SEQ ID NO:28，并且VL CDR3包含SEQ ID NO:29。
在一些实施方案中，VH CDR1与SEQ ID NO:30或33至少80％相同，VH CDR2与SEQID NO:31或34至少80％相同，并且VH CDR3与SEQ ID NO:32至少80％相同。
在一些实施方案中，VH CDR1包含SEQ ID NO:30或33，VH CDR2包含SEQ ID NO:31或34，并且VH CDR3包含SEQ ID NO:32。
在一些实施方案中，VL CDR1与SEQ ID NO:27至少80％相同，VL CDR2与SEQ IDNO:28至少80％相同，VL CDR3与SEQ ID NO:29至少80％相同，VH CDR1与SEQ ID NO:30或33至少80％相同，VH CDR2与SEQ ID NO:31或34至少80％相同，并且VH CDR3与SEQ ID NO:32至少80％相同。
在一些实施方案中，VL CDR1包含SEQ ID NO:27，VL CDR2包含SEQ ID NO:28，VLCDR3包含SEQ ID NO:29，VH CDR1包含SEQ ID NO:30或33，VH CDR2包含SEQ ID NO:31或34，并且VH CDR3包含SEQ ID NO:32。
在一些实施方案中，VL CDR1包含SEQ ID NO:27，VL CDR2包含SEQ ID NO:28，VLCDR3包含SEQ ID NO:29，VH CDR1包含SEQ ID NO:30，VH CDR2包含SEQ ID NO:31，并且VHCDR3包含SEQ ID NO:32。
在一些实施方案中，VL CDR1包含SEQ ID NO:27，VL CDR2包含SEQ ID NO:28，VLCDR3包含SEQ ID NO:29，VH CDR1包含SEQ ID NO:33，VH CDR2包含SEQ ID NO:34，并且VHCDR3包含SEQ ID NO:32。
在一些实施方案中，VL CDR1包含SEQ ID NO:27，VL CDR2包含SEQ ID NO:28，VLCDR3包含SEQ ID NO:29，VH CDR1包含SEQ ID NO:30，VH CDR2包含SEQ ID NO:34，并且VHCDR3包含SEQ ID NO:32。
在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:14至少85％相同。
在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:15至少85％相同。
在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:14至少85％相同并且VH与SEQ ID NO:15至少85％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:14至少90％相同并且VH与SEQ ID NO:15至少90％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:14至少95％相同并且VH与SEQ ID NO:15至少95％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:14至少99％相同并且VH与SEQ ID NO:15至少99％相同。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:14并且VH包含SEQ ID NO:15。
在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:24。
在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:20至少85％相同。
在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:21至少85％相同。
在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:20至少85％相同并且VH与SEQ ID NO:21至少85％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:20至少90％相同并且VH与SEQ ID NO:21至少90％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:20至少95％相同并且VH与SEQ ID NO:21至少95％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:20至少99％相同并且VH与SEQ ID NO:21至少99％相同。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:20并且VH包含SEQ ID NO:21。
在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:26。
在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:11至少85％相同。
在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:12至少85％相同。
在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:11至少85％相同并且VH与SEQ ID NO:12至少85％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:11至少90％相同并且VH与SEQ ID NO:12至少90％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:11至少95％相同并且VH与SEQ ID NO:12至少95％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:11至少99％相同并且VH与SEQ ID NO:12至少99％相同。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:11并且VH包含SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:17至少85％相同。
在一些实施方案中，VH与SEQ ID NO:18至少85％相同。
在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:17至少85％相同并且VH与SEQ ID NO:18至少85％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:17至少90％相同并且VH与SEQ ID NO:18至少90％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:17至少95％相同并且VH与SEQ ID NO:18至少95％相同。在一些实施方案中，VL与SEQ ID NO:17至少99％相同并且VH与SEQ ID NO:18至少99％相同。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:17并且VH包含SEQ ID NO:18。
在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:25。
本发明的另一方面是多肽，其由上述方面或实施方案的人源化抗CD19抗体编码。
在一些实施方案中，多肽包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的His标签。
在一些实施方案中，多肽与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:19至少85％相同。在一些实施方案中，多肽与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19至少90％相同。在一些实施方案中，多肽与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19至少95％相同。在一些实施方案中，多肽与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19至少99％相同。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19。
在一些实施方案中，多肽与治疗剂连接。在一些实施方案中，治疗剂是化学治疗剂、细胞因子、放射性原子、siRNA或毒素。在一些实施方案中，治疗剂是化学治疗剂。
在一些实施方案中，治疗剂是放射性原子。
本发明的又一个方面是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。CAR或TCR包含：(i)抗原结合结构域，(ii)共刺激结构域，和(iii)活化结构域。共刺激结构域包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且抗原结合结构域包含至少权利要求52的多肽。
在一些实施方案中，共刺激结构域来自或衍生自CD2、CD3 delta、CD3epsilon、CD3gamma、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关的alpha链)、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关的beta链)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-zeta)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2R beta、IL-2Rgamma、IL-7R alpha、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fc gamma受体、MHC 1类分子、MHC 2类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、激活性NK细胞受体、Toll配体受体，及其片段或组合。
在一些实施方案中，跨膜结构域来自或衍生自4-1BB/CD137、T细胞受体的alpha链、T细胞受体的beta链、CD2、CD3 delta、CD3 epsilon、CD3 gamma、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关的alpha链)、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关的beta链)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-zeta)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2R beta、IL-2Rgamma、IL-7R alpha、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fc gamma受体、MHC 1类分子、MHC 2类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、激活性NK细胞受体、Toll配体受体，及其组合。
在一些实施方案中，细胞内结构域来自或衍生自4-1BB/CD137、激活性NK细胞受体、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3 delta、CD3 epsilon、CD3 gamma、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8alpha、CD8beta、CD96(Tactile)、CDl la、CDl lb、CDl lc、CDl ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fc gamma受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Ig alpha(CD79a)、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、免疫球蛋白样蛋白质、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、与CD83特异性结合的配体、LIGHT、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CDlla/CD18)、MHC I类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或其组合。
在一些实施方案中，细胞外结构域来自或衍生自CD2、CD3 delta、CD3 epsilon、CD3 gamma、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关的alpha链)、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关的beta链)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-zeta)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rbeta、IL-2R gamma、IL-7R alpha、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fc gamma受体、MHC 1类分子、MHC 2类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、激活性NK细胞受体、Toll配体受体，及其片段或组合。
在一些实施方案中，活化结构域来自或衍生自CD3-zeta或CD3-episilon。
本发明的一个方面是人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其编码上述方面或实施方案的CAR或TCR。
本发明的又一个方面是载体，其包含上述方面或实施方案的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，载体是腺病毒载体、腺病毒相关载体、DNA载体、慢病毒载体、质粒、逆转录病毒载体或RNA载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体是慢病毒载体。
本发明的另一方面是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其由上述方面或实施方案的载体编码。
本发明的又一个方面是细胞，其包含上述方面或实施方案的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段、上述方面或实施方案的载体或者上述方面或实施方案的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，细胞是T细胞。
在一些实施方案中，T细胞是同种异体T细胞、自体T细胞、工程化自体T细胞(eACT)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，T细胞是CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，T细胞是CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，细胞是体外细胞。
在一些实施方案中，T细胞是自体T细胞。
在一些实施方案中，细胞与人CD19结合后产生至少干扰素gamma(IFNγ)。
本发明的一个方面是组合物，其包含多个上述方面或实施方案的细胞。
在一些实施方案中，组合物包含CD4+或CD8+细胞。在一些实施方案中，组合物包含CD4+和CD8+细胞。在一些实施方案中，T细胞的约20％和80％之间是CD4+细胞并且T细胞的其余部分是CD8+细胞。在一些实施方案中，T细胞的约30％和70％之间是CD4+细胞并且T细胞的其余部分是CD8+细胞。在一些实施方案中，T细胞的约40％和60％之间是CD4+细胞并且T细胞的其余部分是CD8+细胞。在一些实施方案中，T细胞的约50％是CD4+细胞并且T细胞的约50％是CD8+细胞。
在一些实施方案中，多个细胞中的每个细胞是自体T细胞。
在一些实施方案中，组合物包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
本发明的另一方面是组合物，其包含上述方面或实施方案的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段、上述方面或实施方案的载体或者上述方面或实施方案的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
本发明的又一个方面是用于制造表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的方法。方法包括用上述方面或实施方案的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段或上述方面或实施方案的载体转导细胞的步骤。
在一些实施方案中，细胞是从需要治疗的患者中分离的淋巴细胞。
在一些实施方案中，淋巴细胞是自然杀伤细胞、T细胞或B细胞。
在一些实施方案中，方法进一步包括在促进细胞增殖和/或T细胞活化的条件下培养细胞的步骤。
在一些实施方案中，方法进一步包括分离所期望的T细胞的步骤。
在一些实施方案中，分离所期望的T细胞的步骤在培养的约六天后发生。
在一些实施方案中，所期望的T细胞表达CD4+和/或CD8+。
本发明的又一个方面是用于治疗B细胞淋巴瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用上述方面或实施方案的细胞或上述方面或实施方案的组合物。
在一些实施方案中，B细胞淋巴瘤选自下组：急性淋巴母细胞白血病(ALL)、AIDS相关淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、经典霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心Castleman病引起的大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、***边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)和瓦氏巨球蛋白血症。在一些实施方案中，B细胞淋巴瘤选自下组：急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)和非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
一般地，本发明涉及工程化自体细胞疗法(缩写为“eACTTM”，也称为过继细胞转移eACTTM)，其是收集患者自身的T细胞，随后将其经遗传工程化改造以识别并靶向一种或多种在一种或多种特定癌症的细胞表面上表达的抗原的过程。T细胞可以经工程化改造以表达例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。参见图1A、图1B和图2。CAR阳性(CAR+)T细胞经工程化改造以表达CAR。CAR可以包含例如对特定肿瘤抗原如人CD19具有特异性的人源化单链可变片段(scFv)。scFV可以直接或间接与包含至少一个共刺激结构域的细胞内信号传导部分连接，所述共刺激结构域继而直接或间接与至少一个活化结构域连接。CAR的组分可以以任何顺序排列。CAR T细胞疗法和构建体的实例描述于美国专利公开号2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309和2014/0050708；美国临时申请号62/470,703和62/317,258；国际专利公开号WO2012033885、WO2012079000、WO2014127261、WO2014186469、WO2015080981、WO2015142675、WO2016044745和WO2016090369；以及Rosenberg andRestifo,Cancer Immunology and Immunotherapy,348:62-68(2015)中，其每一篇通过引用整体并入。
另外，本发明一般涉及对人CD19具有特异性的人源化单链可变片段(scFv)。可以将人源化scFV抗人CD19scFV与治疗剂(例如化学治疗剂和放射性原子)缀合(例如连接)以与癌细胞结合，从而将治疗剂递送至癌细胞并杀伤表达人CD19的癌细胞。
本文所述的任何方面或实施方式可以与如本文公开的任何其他方面或实施方式组合。尽管本发明已联合其详细描述进行描述，但前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。
本文所指的专利和科学文献建立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和已公开或未公开的美国专利申请均通过引用并入。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均在此通过引用并入。本文引用的所有其他公开的参考文献、词典、文件、手稿和科学文献均在此通过引用并入。
本发明的其他特征和优点将从附图和以下包括实施例的发明详述以及权利要求书中显而易见。
附图简述
当联合附图时，根据以下详细描述，将更清楚地理解上述以及其他特征。然而，这些附图仅用于说明目的；不用于限制。
图1A和图1B是描绘嵌合抗原受体(CAR)制造和使用的特征的漫画。图1A显示编码CAR的示例性多核苷酸、包含编码CAR的多核苷酸的病毒载体、病毒载体转导到患者的T细胞中、整合到宿主基因组中以及在经转导的(“CAR工程化的”)T细胞的表面上表达CAR。图1B显示CAR工程化的T细胞，其已经识别了位于癌细胞的表面上的靶抗原。靶抗原的识别和结合激活了T细胞中的机制，包括溶细胞活性、细胞因子释放和T细胞增殖；这些机制促进了癌细胞的杀伤。
图2是显示在工程化自体细胞疗法(eACTTM)期间进行的主要步骤的漫画。
图3A和图3B是显示七种选择的人源化scFv与Raji(CD19+人伯基特淋巴瘤)细胞结合的流式细胞术数据的图。RS、CS、BS、SS、JS、AS、AS-R和NS代表发明人关于人源化抗体的内部命名惯例；WT代表野生型。
图4A至图4D是显示NS、SS、JS和AS人源化scFV的尺寸排阻色谱法(SEC)分析的图。该测定法反映了这些抗体的可溶性聚集倾向。
图5A和图5B是显示热斜升(thermal ramping)以确定包含NS、SS、JS和AS人源化scFV的CAR的多肽稳定性的图。在图5A中，在50mM NaCl的存在下确定热稳定性并且在图5B中，省略了NaCl。显示了衍生自scFVAS(“□”)、SS(“Δ”)、JS(“◇”)和NS(“X”)的CAR。
图6A和图6B包括一系列绘图，其显示了检测从两个供体受试者5244(图6A)和5273(图6B)获得的T细胞的表面上表达的本发明的包含SS、JS、AS和NS的CAR。还制备了表达模拟品CAR的供体细胞和表达包含亲本抗体(“FMC63”)scFV的CAR的供体细胞。
图7A至图7D包括一系列条形图，其用来自供体5244的CAR或模拟品转导的供体细胞显示了本发明的CAR的溶细胞活性。以1:1或4:1的效应物与靶标的比率添加了CAR或模拟品转导的供体细胞。使用了四种靶细胞类型：Raji(CD19+人伯基特淋巴瘤细胞；图7A)、Namalawa(CD19+人伯基特淋巴瘤细胞；图7B)、Eol-1(CD19-人急性髓样(嗜酸性)白血病细胞；图7C)和Mv411(CD19-人双表型B骨髓单核细胞白血病细胞；图7D)。星形孢菌素(“Stauro”)用作肿瘤细胞杀伤的阳性对照。
图8A至图8D包括一系列条形图，其用来自供体5273的CAR或模拟品转导的供体细胞显示了本发明的CAR的溶细胞活性。以1:1或4:1的效应物与靶标的比率添加了CAR或模拟品转导的供体细胞。使用了四种靶细胞类型：Raji细胞(图8A)、Namalawa细胞(图8B)、Eol-1细胞(图8C)和Mv411细胞(图8D)。Stauro用作肿瘤细胞杀伤的阳性对照。
图9A和9B显示了用OKT3最初刺激后十天内测量的来自另外供体的CAR或模拟品转导的T细胞的生长动力学。每种CAR的观察到的生长概况显示在图9A中。然后第二次刺激CAR或模拟品转导的T细胞，并观察生长动力学的差异，如图9B中所示。
图10A显示了在第10天使用抗CAR抗体和CD3的T细胞群的表征。图10B显示了在CART细胞产生期间的CD4/CD8染色。
图11A和11B显示了在CD19+NAMALWA(图11A)或CD19-EOL-1(图11B)细胞上进行的细胞毒性测定。
发明详述
本发明涉及包含识别和结合人CD19的人源化抗原结合结构域的新型多肽和编码其的多核苷酸。本发明的一些方面涉及编码包含人源化抗人CD19抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的多核苷酸。本发明还提供了包含此类多核苷酸的载体(例如病毒载体)和包含此类载体的组合物。本发明进一步提供了编码此类CAR或TCR的多核苷酸和包含此类多核苷酸的组合物。本发明此外提供了包含此类多核苷酸的工程化细胞(例如T细胞)和/或用此类病毒载体转导的工程化细胞(例如T细胞)和包含此类工程化细胞的组合物。本发明提供了包括多个工程化T细胞的组合物(例如药物组合物)。本发明提供了用于制造此类工程化T细胞和组合物的方法以及此类工程化T细胞和组合物的用途(例如在治疗B细胞淋巴瘤中)。并且，本发明提供了诱导针对肿瘤的免疫的方法，包括向受试者施用有效量的包含本发明的多核苷酸、载体或多肽的细胞。本发明的其他方面涉及包含CAR或TCR的细胞及其在T细胞疗法例如自体细胞疗法(eACTTM)中的用途，用于治疗患有癌症的患者。
定义
为了使本发明更容易理解，下面首先定义某些术语。对于以下术语和其他术语的附加定义在整个说明书中得以阐述。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
除非在上下文中明确说明或显而易见，否则如本文所用，术语“或”应当理解为包含性的并且涵盖“或”和“和”两者。
本文使用的术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组分中的每一个的具体公开。因此，如在本文中的短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如在短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
如本文所用，术语“例如”和“即”仅作为实例使用，而无意于限制，并且不应当诠释为仅涉及在说明书中明确列举的那些项目。
术语“或更多”、“至少”、“超过”等，例如“至少一种”应当理解为包括但不限于比所述值多至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括任何更大的数字或其间的分数。
相反地，术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括任何更小的数字或其间的分数。
术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等应当理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括任何更大的数字或其间的分数。
在整个说明书中，词语“包含(comprising)”或变形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将理解为暗指包括所述要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。应当理解的是，在本文中无论何处用语言“包含”描述方面，还提供了以“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他类似方面。除非明确说明或从上下文中显而易见，如本文所用，术语“约”是指如本领域普通技术人员测定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于如何测量或测定值或组成，即测量***的局限性。例如，“约”或“基本上由......组成”可以意指按本领域实践的1个内或超过1个标准偏差。“约”或“基本上由......组成”可以意指高达10％的范围(即±10％)。因此，“约”可以理解为在10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％内大于或小于所述值。例如，约5mg可以包括4.5mg和5.5mg之间的任何量。此外，特别是关于生物***或过程，该术语可以意指高达一个数量级或高达5倍的值。当在本公开中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上由......组成”的含义在该特定值或组成的可接受的误差范围内。
如文本所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括所叙述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。
使用其国际单位制(SI)接受的形式提供本文所使用的单位、前缀和符号。数字范围包括定义范围的数字。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所涉及领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。例如，Juo,“The Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology”,2nd ed.,(2001),CRC Press；“The Dictionary ofCell&Molecular Biology”,5th ed.,(2013),Academic Press；和“The Oxford DictionaryOf Biochemistry And Molecular Biology”,Cammack et al.eds.,2nd ed,(2006),OxfordUniversity Press为本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
“施用”是指使用本领域技术人员已知的任何各种方法和递送***将药剂物理导入受试者。本文公开的制剂的示例性施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用外的施用方式，通常通过注射以及包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、***内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。在一些实施方案中，经由非肠胃外途径例如口服施用制剂。其他非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、***、直肠、舌下或局部。也可以进行施用，例如，一次，多次，和/或在一个或多个延长时期。
术语“抗体”(Ab)包括但不限于，特异性结合抗原的糖蛋白免疫球蛋白。通常，抗体可以包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合分子。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域，CL。VH和VL区域可以进一步细分为高变的区域，称为互补决定区(CDR)，散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。Ab的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫***的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)。
抗体可以包括例如，单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、工程化抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、抗体融合物(本文有时称为“抗体缀合物”)、异缀合抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼源化抗体、亲和体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如，抗-抗Id抗体)、微抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)和以上任何的抗原结合片段。在某些实施方案中，本文所述的抗体是指多克隆抗体群。
免疫球蛋白可以衍生自任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG、IgE和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的Ab类或亚类(例如IgM或IgG1)。术语“抗体”包括例如天然存在的和非天然存在的Ab两者；单克隆和多克隆Ab；嵌合和人源化Ab；人或非人Ab；全合成Ab；和单链Ab。可以通过重组方法将非人Ab人源化，以降低其在人中的免疫原性。在没有明确说明的情况下，除非上下文另有说明，否则术语“抗体”还包括任何上述免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，并包括单价和二价片段或部分，以及单链Ab。
“衍生自抗体的氨基酸序列”可以是物理衍生的，例如，从编码抗体的多核苷酸的片段表达，或者可以是计算机衍生的，例如，确定为编码抗体(或其片段)的核苷酸序列用于合成人工多核苷酸序列(或片段)，并且人工多核苷酸序列表达为抗体或其片段。
“抗原结合分子”、“抗原结合部分”或“抗体片段”是指包含从该分子所衍生于的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)的任何分子。抗原结合分子可以包括抗原互补决定区(CDR)。抗体片段的实例包括但不限于，从抗原结合分子形成的Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、dAb、线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。肽体(即，包含肽结合结构域的Fc融合分子)是合适的抗原结合分子的另一个实例。在一些实施方案中，抗原结合分子结合肿瘤细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合参与过度增殖性疾病的细胞上的抗原或结合病毒或细菌抗原。在某些实施方案中，抗原结合分子结合CD19。在进一步的实施方案中，抗原结合分子是特异性结合抗原的抗体片段，包括其一个或多个的互补决定区(CDR)。
在进一步的实施方案中，抗原结合分子是单链可变片段(scFv)。scFv多肽分子是共价连接的VH::VL异源二聚体，其可以从包括通过肽编码接头连接的VH和VL编码基因的基因融合物表达。(参见Huston et al.(1988)Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883)。接头肽(例如，约10至约25个氨基酸)通常为了柔性富含甘氨酸，并且为了溶解度富含丝氨酸或苏氨酸。接头可以将VH的N末端与VL的C末端相连，或者将VH的C末端与VL的N末端相连。尽管去除了恒定区并导入了接头，该蛋白质仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。scFv还可以包括N末端肽序列，其有时称为“信号肽”或“前导序列”。已经描述了许多方法来辨别用于将天然聚集的但化学分离的轻和重多肽链从抗体V区转变为scFv分子的化学结构，该化学结构将折叠成三维结构，其基本类似于抗原结合位点的结构。参见例如，美国专利号5,091,513；5,132,405；和4,946,778。
已经并且可以创建非常大的初始scFv文库以提供针对大量靶分子的重排抗体基因的大量来源。为了分离疾病特异性抗体，可以从患有传染病的个体构建较小的文库(参见Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9339-43(1992)；Zebedee et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3175-79(1992))。
如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用，并且在本领域中常见。可变区通常是指抗体的一部分，通常是轻链或重链的一部分，通常是成熟重链中约氨基末端110至120个氨基酸和成熟轻链中约90至115个氨基酸，其在抗体之间的序列差别很大，并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的可变性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中更高度保守的区域称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施方案中，可变区为人可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和人框架区(FR)。在特定实施方案中，可变区为灵长类动物(例如非人灵长类动物)可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和灵长类动物(例如非人灵长类动物)框架区(FR)。
术语“VL”、“VL区”和“VL结构域”可互换使用以指抗原结合结构域如抗体或其抗原结合片段的轻链可变区，并且包含一个、两个或所有三个CDR。
术语“VH”、“VH区”和“VH结构域”可互换使用以指抗原结合结构域如抗体或其抗原结合片段的重链可变区，并且包含一个、两个或所有三个CDR。
通常使用CDR的许多定义：Kabat编号、Chothia编号、AbM编号或contact编号。AbM定义是Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的两者之间的折衷。contact定义基于对可用复杂晶体结构的分析。
表1.CDR编号
术语“Kabat编号”和类似术语在本领域中是公认的，并且是指在抗体的重链和轻链可变区或其抗原结合分子中氨基酸残基的编号***。在某些方面，抗体的CDR可以根据Kabat编号***确定(参见例如Kabat EA&Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190:382-391和Kabat EA et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。使用Kabat编号***，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置31至35(其在35之后任选地可以包括一个或两个额外的氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A和35B))(CDR1)、氨基酸位置50至65(CDR2)和氨基酸位置95至102(CDR3)。使用Kabat编号***，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置24至34(CDR1)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)。在具体的实施方案中，本文所述抗体的CDR已根据Kabat编号方案确定。
在某些方面，抗体的CDR可以根据Chothia编号方案确定，其是指免疫球蛋白结构环的位置(参见例如Chothia C&Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917；Al-LazikaniB et al.,(1997)J Mol Biol 273:927-948；Chothia C et al.,(1992)J Mol Biol 227:799-817；Tramontano A et al.,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；和美国专利号7,709,226)。通常，当使用Kabat编号惯例时，Chothia CDR-H1环存在于重链氨基酸26至32、33或34，Chothia CDR-H2环存在于重链氨基酸52至56，并且Chothia CDR-H3环存在于重链氨基酸95至102，而Chothia CDR-L1环存在于轻链氨基酸24至34，Chothia CDR-L2环存在于轻链氨基酸50至56，并且Chothia CDR-L3环存在于轻链氨基酸89至97。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-HI环的末端在H32和H34之间变化，取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将***放置在H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，则环结束于32；如果仅存在35A，则环结束于33；如果35A和35B两者都存在，则环结束于34)。在具体的实施方案中，本文所述抗体的CDR已根据Chothia编号方案确定。
表2.FMC63抗CD19抗体或其片段的轻链可变(VL)区的CDR
表3.FMC63抗CD19抗体或其片段的重链可变(VH)区的CDR
如本文所用，术语“恒定区”和“恒定结构域”是可互换的并且具有本领域常见的含义。恒定区是抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但可以表现出各种效应物功能，例如与Fc受体的相互作用。免疫球蛋白分子的恒定区通常相对于免疫球蛋白可变结构域具有更保守的氨基酸序列。
如本文所用，当用于提及抗体时，术语“重链”基于恒定结构域的氨基酸序列可以指任何不同类型，例如alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)，其分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类抗体，包括IgG的亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
如本文所用，当用于提及抗体时，术语“轻链”基于恒定结构域的氨基酸序列可以指任何不同类型，例如kappa(κ)或lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域中公知的。在具体的实施方案中，轻链为人轻链。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以以本领域已知的多种方式测量和/或表达，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD由koff/kon的商计算，而KA由kon/koff的商计算。kon是指例如抗体与抗原的结合速率常数，而koff是指例如抗体与抗原的解离。kon和koff可以通过本领域普通技术人员已知的技术例如或KinExA测定。
CD19(也称为分化簇19、B淋巴细胞抗原CD19、B淋巴细胞表面抗原B4、B4、CVID3、分化抗原CD19)是在人中由CD19基因编码的蛋白质。它发现于B细胞的表面上。由于CD19是B细胞的标志，因此它可能是用于识别由这种类型的B细胞引起的癌细胞(即B细胞淋巴瘤)有用的抗原。
如本文所用，“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，beta分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在某些实施方案中，可以用具有相似侧链的氨基酸残基取代抗体或其抗原结合分子的CDR内或框架区内的一个或多个氨基酸残基。
如本文所用，术语“异源”表示来自除天然存在的序列之外的任何来源。例如，作为具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的共刺激蛋白质(例如相应的人共刺激蛋白质)的一部分所包括的异源序列是不作为野生型人共刺激蛋白质天然存在(即不与之对齐)的氨基酸。例如，异源核苷酸序列是指野生型人共刺激蛋白质编码序列以外的核苷酸序列。
如本文所用，术语“表位”是本领域的术语并且是指抗体可以特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)或者表位可以例如来自多肽或多个多肽的两个或更多个非连续区域(构象、非线性、不连续的或非连续的表位)。在某些实施方案中，可以通过例如核磁共振波谱法(NMR波谱法)、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、氢/氘交换与质谱联用(例如液相色谱电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变作图(例如定点诱变作图)测定抗体结合的表位。对于X射线晶体学，可以使用本领域任何已知方法完成结晶(例如，GiegéR et al.,(1994)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；ChayenNE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303)。抗体:抗原晶体可以使用公知的X射线衍射技术进行研究，并且可以使用本领域已知的计算机软件例如Refmac和Phenix进行精制。可以使用本领域技术人员已知的任何方法完成诱变作图研究。关于诱变技术，包括丙氨酸扫描诱变技术的描述，参见例如Champe M et al.,(1995)J Biol Chem 270:1388-1394和Cunningham BC&Wells JA(1989)Science 244:1081-1085。
如本文所用，如果抗原与第一结合分子、抗体或其抗原结合分子之间的相互作用阻断、限制、抑制或以其他方式降低参照结合分子、参照抗体或其抗原结合分子与抗原相互作用的能力，则抗原结合分子、抗体或其抗原结合分子与参照抗体或其抗原结合分子“交叉竞争”。交叉竞争可以是完全的，例如结合分子与抗原的结合完全阻断了参照结合分子结合抗原的能力，或者其可以是部分的，例如结合分子与抗原的结合降低了参照结合分子结合抗原的能力。在某些实施方案中，与参照抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子结合与参照抗原结合分子相同或重叠的表位。许多类型的竞争性结合测定可以用于确定一种抗原结合分子是否与另一种竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定(EIA)；夹心法竞争测定法(Stahli et al.,1983,Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA((Kirkland et al.,1986,J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定法、固相直接标记夹心法测定法(Harlow and Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125标记的固相直接标记RIA(Morel et al.,1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung,et al.,1990,Virology 176:546-552)；以及直接标记RIA(Moldenhaueret al.,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。
如本文所用，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”在抗体的背景下是类似的术语并且是指结合抗原(例如表位或免疫复合物)的分子，因为本领域技术人员理解此类结合。例如，特异性结合抗原的分子可以与其他肽或多肽结合，通常具有较低的亲和力，如通过例如免疫测定、KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments，Boise，ID)或本领域已知的其他测定法测定的。在具体的实施方案中，特异性结合抗原的分子以比当该分子与另一个抗原结合时的KA大至少2个对数(log)、2.5个对数、3个对数、4个对数或更大的KA与抗原结合。
在具体的实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合分子，该抗体或其抗原结合分子以比另一种靶抗原(例如非人CD19)更高的亲和力与靶人抗原(例如人CD19)结合。在某些实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合分子，该抗体或其抗原结合分子以比另一种靶抗原高5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更高的亲和力与靶人抗原(例如人CD19)结合，如通过例如放射免疫测定、表面等离激元共振或动力学排除测定法测量的。在具体的实施方案中，本文所述的与靶人抗原结合的抗体或其抗原结合分子将以少于10％、15％或20％的抗体或其抗原结合分子与人抗原的结合，与另一种靶抗原结合，如通过例如放射免疫测定、表面等离激元共振或动力学排除测定法测量的。
“抗原”是指引发免疫应答或能够被抗体或抗原结合分子结合的任何分子。免疫应答可以牵涉抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或这两者。本领域技术人员将容易理解任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)均可以充当抗原。抗原可以内源性表达，即由基因组DNA表达或可以重组表达。抗原可以对某些组织，例如癌细胞具有特异性或者其可以广泛地表达。此外，较大分子的片段可以起抗原作用。在一些实施方案中，抗原为肿瘤抗原。在一个具体的实施方案中，抗原是人CD19的全部或片段。
术语“中和”是指结合配体并防止或降低该配体的生物效应的抗原结合分子、scFv、抗体或其片段。在一些实施方案中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段直接阻断配体上的结合位点或者通过间接方式(如配体的结构或能量改变)改变配体的结合能力。在一些实施方案中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段防止与其结合的蛋白质行使生物学功能。
如本文所用，术语“自体”意指衍生自其稍后重新导入到其中的同一个体的任何物质。例如，工程化自体细胞疗法(eACTTM，也称为过继细胞转移)是收集患者自身的T细胞，随后将其经遗传工程化改造以表达多核苷酸(例如编码识别并靶向一种或多种特定肿瘤细胞或恶性肿瘤的细胞表面上表达的一种或多种抗原的CAR的多核苷酸)，然后再施用回同一患者的过程。
术语“同种异体”是指衍生自一个个体然后被导入相同物种的另一个个体的任何物质，例如同种异体T细胞移植。
术语“转导”和“经转导的”是指一种过程，通过该过程将外源DNA经由病毒载体导入到细胞中(参见Jones et al.,“Genetics:principles and analysis,”Boston:Jones&Bartlett Publ.(1998))。在一些实施方案中，载体为逆转录病毒载体、DNA载体、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、EB病毒载体、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体、慢病毒载体或其任何组合。
如本文所用，术语“遗传工程”或“工程化”可互换使用，并且意指修饰细胞基因组的方法，包括但不限于删除编码或非编码区或其一部分或者***编码区或其一部分。在一些实施方案中，经修饰的细胞是淋巴细胞，例如T细胞，其可以获自患者或供体。细胞可以经修饰以表达外源构建体，例如掺入到细胞的基因组中的嵌合抗原受体(CAR)。
“癌症”是指一大组各种疾病，其特征为体内异常细胞不受控制的生长。不受调节的细胞***和生长导致形成入侵相邻组织且也可以通过淋巴***或血流转移到身体远程部分的恶性肿瘤。“癌症”或“癌症组织”可以包括肿瘤。可以通过本发明的方法治疗的癌症的实例包括但不限于免疫***的癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤及其他白细胞恶性肿瘤。
可以治疗的癌症包括B细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、AIDS相关淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、经典霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心Castleman病引起的大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、***边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)和瓦氏巨球蛋白血症或其组合。在一个实施方案中，B细胞淋巴瘤是急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)和非霍奇金淋巴瘤。在一个实施方案中，B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
特定癌症可以对化学疗法或放射疗法有响应或者癌症可以是难治性的。难治性癌症是指不易于通过外科手术干预的癌症，并且癌症或是最初对化学疗法或放射疗法无响应，或是癌症随时间变成无响应。
如本文所用，“抗肿瘤效应”是指可以呈现为肿瘤体积缩小、肿瘤细胞的数目减少、肿瘤细胞增殖减少、转移的数目减少、总体或无进展生存期增加、期望寿命增加或各种与肿瘤相关的生理症状改善的生物效应。抗肿瘤效应也可以指肿瘤发生的预防，例如疫苗。
如本文所用，“细胞因子”是指响应与特定抗原的接触由一个细胞释放的非抗体蛋白质，其中细胞因子与第二个细胞相互作用以介导在第二个细胞中的应答。细胞因子可以由细胞内源性表达或施用于受试者。细胞因子可以由免疫细胞(包括巨噬细胞、B细胞、T细胞和肥大细胞)释放以传播免疫应答。细胞因子可以诱导受体细胞中的各种应答。细胞因子可以包括稳态细胞因子、趋化因子、促炎细胞因子、效应物和急性期蛋白质。例如，稳态细胞因子(包括白细胞介素(IL)7和IL-15)促进免疫细胞存活和增殖，而促炎细胞因子可以促进炎症应答。稳态细胞因子的实例包括但不限于IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15及干扰素(IFN)gamma。促炎细胞因子的实例包括但不限于IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、肿瘤坏死因子(TNF)-alpha、TNF-beta、成纤维细胞生长因子(FGF)2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)、可溶性血管黏附分子1(sVCAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D以及胎盘生长因子(PLGF)。效应物的实例包括但不限于颗粒酶A、颗粒酶B、可溶性Fas配体(sFasL)以及穿孔素。急性期蛋白质的实例包括但不限于C反应蛋白(CRP)及血清淀粉样蛋白A(SAA)。
“趋化因子”是介导细胞趋化性或定向运动的一类细胞因子。趋化因子的实例包括但不限于IL-8、IL-16、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC或CCL22)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1或CCL2)、MCP-4、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α、MIP-1a)、MIP-1β(MIP-1b)、gamma-诱导蛋白10(IP-10)以及胸腺和活化调节的趋化因子(TARC或CCL17)。
治疗剂(例如经工程化的CAR T细胞)的“治疗有效量”、“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一治疗剂组合使用时保护受试者免于疾病发作或者促进疾病消退的任何量，所述疾病消退的证据为疾病症状的严重性降低、疾病无症状期的频率和持续期间增加或防止由于疾病折磨导致的损伤或残疾。可以使用熟练从业人员已知的各种方法评估治疗剂促进疾病消退的能力，例如在临床试验期间在人受试者中评估、在用于预测在人体中的效力的动物模型***中评估或通过在体外测定法中测定试剂的活性评估。
如本文所用，术语“淋巴细胞”包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。NK细胞是代表固有免疫***的主要组分的一类细胞毒性(cytotoxic)(细胞毒性(cell toxic))淋巴细胞。NK细胞排斥肿瘤以及病毒感染的细胞。其通过凋亡或程序性细胞死亡的过程发挥作用。由于其不需要活化来杀伤细胞，因而称为“自然杀伤”。T细胞在细胞介导的免疫(无抗体参与)中发挥主要作用。它的T细胞受体(TCR)将自身与其他淋巴细胞类型区分开来。胸腺(免疫***的专门器官)主要负责T细胞的成熟。有六种已知类型的T细胞，即：辅助性T细胞(例如CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+ T细胞或杀伤T细胞)、记忆T细胞((i)干细胞样记忆TSCM细胞(如初始细胞)为CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L选择素)、CD27+、CD28+以及IL-7Rα+，但它们也表达大量的CD95、IL-2Rβ、CXCR3以及LFA-1，并且显示许多记忆细胞独特的功能属性；(ii)中央记忆TCM细胞表达L-选择素和CCR7，它们分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4，以及(iii)效应记忆TEM细胞，然而，不表达L-选择素或CCR7，但产生效应细胞因子，如IFNγ和IL-4)、调节性T细胞(Treg、抑制性T细胞或CD4+CD25+调节性T细胞)、自然杀伤T细胞(NKT)以及Gamma DeltaT细胞。另一方面，B细胞在体液免疫(有抗体参与)中发挥主要作用。B细胞生成抗体、加工抗原以执行抗原呈递细胞(APC)的作用，并且在通过抗原相互作用的活化后发育为记忆B细胞。在哺乳动物中，未成熟的B细胞在骨髓中发育，该处为B细胞名字的来源。
术语“经遗传工程化改造的”或“经工程化改造的”是指修饰细胞的基因组的方法，包括但不限于删除编码或非编码区或其部分，或***编码区或其部分。在一些实施方案中，经修饰的细胞为淋巴细胞(例如T细胞)，其可以从患者或供体获得。细胞可以经修饰以表达外源构建体，例如掺入到细胞的基因组中的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
“免疫应答”是指免疫***的细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞以及中性粒细胞)和由这些细胞的任一种或肝脏产生的可溶性大分子(包括Ab、细胞因子和补体)的作用，该作用导致选择性靶向、结合、损害、破坏和/或排除脊椎动物体内的入侵病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情况下，正常的人细胞或组织。
术语“免疫疗法”是指患有疾病或处于感染疾病或疾病复发的风险的受试者的治疗，该治疗通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式修饰免疫应答的方法进行。免疫疗法的实例包括但不限于T细胞疗法。T细胞疗法可以包括过继性T细胞疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)免疫疗法、自体细胞疗法、工程化自体细胞疗法(eACTTM)以及同种异体T细胞移植。然而，本领域技术人员将认为本文公开的调理方法将增强任何移植的T细胞疗法的有效性。T细胞疗法的实例描述于美国专利公开号2014/0154228和2002/0006409、美国专利号5,728,388以及国际公开号WO 2008/081035中。
免疫疗法的T细胞可以来自本领域已知的任何来源。例如，T细胞可以在体外从造血干细胞群分化，或者T细胞可以从受试者获得。T细胞可以从例如外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织以及肿瘤获得。此外，T细胞可以衍生自本领域中可获得的一个或多个T细胞系。T细胞也可以使用本领域技术人员已知的任何数目的技术(如FICOLLTM分离和/或单采术(apheresis))从受试者收集的单位血液获得。分离用于T细胞疗法的T细胞的另外的方法公开于美国专利公开号2013/0287748，其通过引用整体并入本文。
术语“工程化自体细胞疗法”(其可以缩写为“eACTTM”，也称为过继细胞转移)是收集患者自身的T细胞，随后将其经遗传改变以识别并靶向一种或多种在一种或多种特定的肿瘤细胞或恶性肿瘤的细胞表面上表达的抗原的过程。T细胞可以经工程化改造以表达例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)或两者。CAR阳性(+)T细胞经工程化改造以表达对特定肿瘤抗原具有特异性的一个或多个细胞外单链可变片段(scFv)，其连接到包含至少一个共刺激结构域和至少一个活化结构域的细胞内信号传导部分。共刺激结构域可以衍生自天然存在的共刺激结构域或其变体，并且活化结构域可以衍生自例如CD3-zeta和CD3-episilon。在某些实施方案中，CAR设计成具有两个、三个、四个或更多个共刺激结构域。CARscFv可以设计成靶向例如人CD19，人CD19是由B细胞谱系(包括所有正常B细胞和B细胞恶性肿瘤，包括但不限于NHL、CLL以及非T细胞ALL)的细胞表达的跨膜蛋白。在一些实施方案中，CAR经工程化改造使得共刺激结构域表达为单独的多肽链。实例CAR T细胞疗法和构建体描述于美国专利公开号2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309和2014/0050708以及美国临时申请号62/470,703和62/317,258中；这些参考文献通过引用整体并入。
如本文所用，“患者”包括任何患有癌症(例如淋巴瘤或白血病)的人。本文中，术语“受试者”和“患者”可互换使用。
如本文所用，术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。特别地，体外细胞可以包括T细胞。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用并且是指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽含有至少两个氨基酸并且可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括任何包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸的肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链(其在本领域中也通常称为例如肽、寡肽和寡聚体)和较长的链(其在本领域中通常称为蛋白质，其具有许多类型)两者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然的肽、重组的肽、合成的肽或其组合。
如本文所用，“刺激”是指由刺激分子与其同源配体的结合所诱导的初级应答，其中结合介导信号转导事件。“刺激分子”是T细胞上的分子，例如与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的T细胞受体(TCR)/CD3复合物。“刺激配体”是当存在于抗原呈递细胞(例如APC、树突状细胞、B细胞等)上时可以与T细胞上的刺激分子特异性结合，从而介导T细胞的初级应答(包括但不限于活化、启动免疫应答、增殖等)的配体。刺激配体包括但不限于抗CD3抗体(如OKT3)、装载有肽的MHCI类分子、超激动性抗CD2抗体以及超激动性抗CD28抗体。
如本文所用，“共刺激信号”是指与初级信号(例如TCR/CD3连接)组合时导致T细胞应答(例如但不限于增殖和/或关键分子的上调或下调)的信号。
如本文所用，“共刺激配体”包括与T细胞上的同源共刺激分子特异性结合的抗原呈递细胞(APC)上的分子。替代地/另外地，当抗体(例如，抗CD28抗体)结合至板、珠、APC或在溶液中时，其可以是共刺激配体。共刺激配体的结合提供介导T细胞应答(包括但不限于增殖、活化、分化等)的信号。共刺激配体诱导除了由刺激分子提供的初级信号(例如由T细胞受体(TCR)/CD3复合物与装载有肽的主要组织相容性复合物(MHC)分子的结合提供)外的信号。共刺激配体可以包括但不限于，3/TR6、4-1BB配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD30配体、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒侵入介体(HVEM),人白细胞抗原G(HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白样转录物(ILT)3、诱导性共刺激配体(ICOS-L)、细胞内黏附分子(ICAM)、特异性结合B7-H3的配体、淋巴毒素beta受体、MHC I类链相关蛋白A(MICA)、MHC I类链相关蛋白B(MICB)、OX40配体、PD-L2或程序性死亡(PD)L1。共刺激配体包括但不限于，与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，该存在于T细胞上的共刺激分子例如但不限于4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、与CD83特异性结合的配体、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、自然杀伤细胞受体C(NKG2C)、OX40、PD-1或肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14或LIGHT)。
“共刺激分子”是在T细胞上特异性结合共刺激配体，从而介导T细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD 33、CD 45、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3(alpha；beta；delta；epsilon；gamma；zeta)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配体、CD84、CD86、CD8alpha、CD8beta、CD9、CD96(Tactile)、CDl-la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fc gamma受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Ig alpha(CD79a)、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CDl la/CD18)、MHC I类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子，SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或其片段、截短或组合。
术语“减少”和“降低”在本文可互换使用并且表示小于原来的任何变化。“减少”和“降低”是相对的术语，需要在测量前和测量后间进行比较。“减少”和“降低”包括完全消耗。
受试者的“治疗”或“处理”是指在受试者上进行任何类型的干预或过程，或对该受试者施用活性剂，以达到逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症或状况或与疾病相关的生化指标的发作、进展、发展、严重或复发的目的。在一些实施方案中，“治疗”或“处理”包括部分缓解。在另一个实施方案中，“治疗”或“处理”包括完全缓解。
为了计算同一性百分比，通常以给出序列之间最大匹配的方式比对所比较的序列。可以用来确定同一性百分比的计算机程序的一个实例是GCG程序包，其包括GAP(Devereux et al.,1984,Nucl.Acid Res.12:387；Genetics Computer Group,Universityof Wisconsin,Madison,Wis.)。计算机算法GAP用于比对两个待确定序列同一性百分比的多肽或多核苷酸。序列经比对以使其各自的氨基酸或核苷酸最佳匹配(“匹配跨度”，由算法确定)。在某些实施方案中，算法还使用标准比较矩阵(关于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoffet al.,1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352；关于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919)。
本发明的各种方面进一步详细描述于下列小节中。
I.嵌合抗原受体和T细胞受体
嵌合抗原受体(CAR或CAR-T)和T细胞受体(TCR)是经遗传工程化改造的受体。这些工程化受体可以根据本领域已知的技术容易地***到免疫细胞中并且被免疫细胞(包括T细胞)表达。使用CAR，单一受体可以经编程以识别特定抗原，并且当与该抗原结合时，活化免疫细胞以攻击并破坏携带该抗原的细胞。当这些抗原存在于肿瘤细胞上，表达CAR的免疫细胞可以靶向并杀伤肿瘤细胞。
制造表达CAR的细胞中进行的步骤显示于图1A中，并且经由识别肿瘤细胞上的靶标介导的CAR介导的杀伤机制显示于图1B中。
本发明涉及包含与人CD19特异性结合的抗原结合结构域如scFv的嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)，以及包含与人CD19特异性结合的抗原结合结构域的工程化T细胞。在一些实施方案中，本发明的抗原结合结构域是衍生自抗体例如FMC63抗体的scFv。可以使用其他针对人CD19的抗体。
本发明的抗人CD19 CAR或TCR包含与人CD19特异性结合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗人CD19 CAR或TCR进一步包含共刺激结构域和/或细胞外结构域(即“铰链”或“间隔区”区域)和/或跨膜结构域和/或细胞内(信号传导)结构域和/或CD3-zeta或CD3-episilon活化结构域。在一些实施方案中，抗人CD19 CAR或TCR包含特异性结合人CD19的scFv抗原结合结构域、共刺激结构域、细胞外结构域、跨膜结构域和CD3-zeta或CD3-episilon活化结构域。
在一些实施方案中，根据本发明的CAR的定向包含与共刺激结构域和活化结构域串联的抗原结合结构域(例如scFv)。共刺激结构域可以包含一个或多个细胞外部分、跨膜部分和细胞内部分。在其他实施方案中，多个共刺激结构域可以串联利用。
I.A.抗原结合结构域
可以通过掺入与特定靶定的抗原相互作用的抗原结合分子来工程化改造CAR以结合抗原(例如细胞表面抗原)。在一些实施方案中，抗原结合分子是其抗体片段，例如一个或多个单链抗体片段(“scFv”)。scFv是具有连接在一起的抗体的重链和轻链的可变区的单链抗体片段。参见美国专利号7,741,465和6,319,494，以及Eshhar et al.,Cancer ImmunolImmunotherapy(1997)45:131-136。scFv保留亲本抗体与靶抗原特异性相互作用的能力。scFv在嵌合抗原受体中有用，因为它们可以经工程化改造以与其他CAR组分一起作为单链的一部分表达。同上。还参见Krause et al.,J.Exp.Med.,Volume 188,No.4,1998(619–626)；Finney et al.,Journal of Immunology,1998,161:2791–2797。应当领会，抗原结合分子通常包含在CAR的细胞外部分内，使得它能够识别并结合感兴趣的抗原。具有对超过一个感兴趣的抗原的特异性的双特异性和多特异性CAR考虑在本发明的范围内。
本发明涉及具有人源化抗原结合结构域的抗人CD19抗体、其片段(例如scFv)、嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)。
以下核苷酸序列以“前导序列-VL-接头-VH-His标签-终止密码子”的格式显示，即，“前导序列”以粗体显示，“接头”以斜体显示，“His标签”以粗体斜体显示，而VL、VH和“终止密码子”则以标准字体显示。
WT-FMC63-scFv
SS-scFv
JS-scFv
AS-scFv
NS-scFv
在一些实施方案中，多核苷酸序列可以与上述多核苷酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同。
野生型scFv和七种选择的人源化scFv中四种的氨基酸序列
以下多肽序列以“前导序列-VL-接头-VH-His标签”的格式显示，即，“前导序列”以粗体显示，“接头”以斜体显示而“His标签”以粗体斜体显示。
以下scFv的每一个中使用的前导序列具有MEWTWVFLFLLSVTAGVHS(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。以下scFv的每一个中使用的接头具有GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。以下scFv的每一个中使用的His标签具有HHHHHH(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列。
WT-FMC63-scFv
WT-FMC63-scFV的VL序列具有
的氨基酸序列。
WT-FMC63-scFV的VH序列具有
的氨基酸序列。
SS-scFv
SS-scFV的VL序列具有的
氨基酸序列。
SS-scFV的VH序列具有
的氨基酸序列。
JS-scFv
JS-scFV的VL序列具有
的氨基酸序列。
JS-scFV的VH序列具有
的氨基酸序列。
AS-scFv
AS-scFV的VL序列具有
的氨基酸序列。
AS-scFV的VH序列具有
的氨基酸序列。
NS-scFv
NS-scFV的VL序列具有
的氨基酸序列。
NS-scFV的VH序列具有
的氨基酸序列。
上述WT-FMC63-、SS-、JS-、AS-和NS-scFv氨基酸序列可以缺少His标签(SEQ IDNO: 8的)。因此，scFv具有以下氨基酸序列：
WT-FMC63-scFv (没有His标签)
SS-scFv(没有His标签)
JS-scFv(没有His标签)
AS-scFv(没有His标签)
NS scFv(没有His标签)
在一些实施方案中，多肽序列可以与上述多肽序列中的任一个至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同。
人源化抗体(例如scFv)具有与SEQ ID NO:36不同的VL区，不同之处在于至少一个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个氨基酸。例如，人源化抗体(例如scFv)可以具有与SEQ ID NO:36不同的VL区，不同之处在于具有位置7处的Ser、位置8处的Pro、位置15处的Val、位置22处的Thr、位置41处的Gln、位置42处的Lys、位置42处的Gln、位置43处的Ala、位置44处的Pro、位置49处的Lys、位置72处的Thr、位置77处的Ser、位置79处的Gln、位置80处的Pro、位置83处的Phe、位置87处的Tyr、位置100处的Gln和/或位置107处的Lys。在一些实施方案中，人源化抗体(例如scFv)可以具有与SEQ ID NO:36不同的VL区，不同之处在于具有位置7处的Ser、位置8处的Pro、位置15处的Val、位置22处的Thr、位置42处的Gln、位置43处的Ala、位置44处的Pro、位置49处的Lys、位置72处的Thr、位置77处的Ser、位置79处的Gln、位置80处的Pro、位置83处的Phe、位置87处的Tyr、位置100处的Gln和/或位置处的Lys107。在其他实施方案中，人源化抗体(例如scFv)可以具有与SEQ ID NO:36不同的VL区，不同之处在于具有位置7处的Ser、位置8处的Pro、位置15处的Val、位置22处的Thr、位置41处的Gln、位置42处的Lys、位置43处的Ala、位置72处的Thr、位置77处的Ser、位置79处的Gln、位置80处的Pro和位置107处的Lys107。
人源化抗体(例如scFv)具有与SEQ ID NO:37不同的VH区，不同之处在于至少一个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个氨基酸。例如，人源化抗体(例如scFv)可以具有与SEQ ID NO:37不同的VH区，不同之处在于具有位置1处的Gln、位置3处的Gln、位置5处的Val、位置9处的Gly、位置13处的Lys、位置13处的Gln、位置15处的Gly、位置16处的Arg、位置16处的Thr、位置17处的Thr、位置19处的Arg、位置20处的Leu、位置21处的Ser、位置24处的Ala、位置42处的Gly、位置48处的Ile、位置67处的Phe、位置70处的Ser、位置71处的Arg、位置73处的Thr、位置76处的Asn、位置77处的Thr、位置78处的Leu、位置79处的Tyr、位置81处的Gln、位置83处的Ser、位置86处的Thr、位置86处的Arg、位置87处的Ala、位置88处的Glu、位置88处的Ala、位置92处的Val和/或位置115处的Leu115。在一些实施方案中，人源化抗体(例如scFv)可以具有与SEQ IDNO:37不同的VH区，不同之处在于具有位置3处的Gln、位置5处的Val、位置9处的Gly、位置13处的Gln、位置15处的Gly、位置16处的Arg、位置19处的Arg、位置20处的Leu、位置21处的Ser、位置24处的Ala、位置42处的Gly、位置48处的Ile、位置67处的Phe、位置70处的Ser、位置71处的Arg、位置76处的Asn、位置77处的Thr、位置78处的Leu、位置79处的Tyr、位置81处的Gln、位置86处的Arg、位置87处的Ala、位置88处的Glu、位置92处的Val和/或位置115处的Leu。在其他实施方案中，人源化抗体(例如scFv)可以具有与SEQ ID NO:37不同的VH区，不同之处在于具有位置1处的Gln、位置3处的Gln、位置13处的Lys、位置16处的Thr、位置17处的Thr、位置42处的Gly、位置70处的Ser、位置73处的Thr、位置76处的Asn、位置83处的Ser、位置86处的Thr、位置87处的Ala、位置88处的Ala和/或位置115处的Leu。
在一些实施方案中，抗原结合分子以小于1x 10-6M、小于1x 10-7M、小于1x 10-8M或小于1x 10-9M的KD结合靶抗原(例如人CD19)。在一些实施方案中，抗原结合分子以约1x 10- 8M、约2x 10-8M、约3x 10-8M、约4x 10-8M、约5x 10-8M、约6x 10-8M、约7x 10-8M、约8x 10-8M、约9x 10-8M、约1x 10-9M、约2x 10-9M、约3x 10-9M、约4x 10-9M、约5x 10-9M、约6x 10-9M、约7x10-9M、约8x 10-9M或约9x 10-9M的KD结合靶抗原(例如人CD19)。在某些实施方案中，KD计算为koff/kon的商，并且如通过例如表面等离激元共振技术所测量的，使用单价抗体例如Fab片段来测定kon和koff。在其他实施方案中，KD计算为koff/kon的商，并且如通过例如表面等离激元共振技术所测量的，使用二价抗体例如Fab片段来测定kon和koff。
在一些实施方案中，抗原结合分子以小于1x 10-4M-1s-1、小于2x 10-4M-1s-1、小于3x10-4M-1s-1、小于4x 10-4M-1s-1、小于5x 10-4M-1s-1、小于6x 10-4M-1s-1、小于7x 10-4M-1s-1、小于8x 10-4M-1s-1、小于9x 10-4M-1s-1、小于1x10-5M-1s-1、小于2x 10-5M-1s-1、小于3x 10-5M-1s-1、小于4x 10-5M-1s-1、小于5x 10-5M-1s-1、小于6x 10-5M-1s-1、小于7x 10-5M-1s-1、小于8x 10-5M-1s-1、小于9x 10-5M-1s-1、小于1x 10-6M-1s-1、小于2x 10-6M-1s-1、小于3x 10-6M-1s-1、小于4x 10- 6M-1s-1、小于5x 10-6M-1s-1、小于6x 10-6M-1s-1、小于7x 10-6M-1s-1、小于8x 10-6M-1s-1、小于9x10-6M-1s-1或小于1x 10-7M-1s-1的结合速率(kon)结合靶抗原(例如人CD19)。在某些实施方案中，如通过例如表面等离激元共振技术所测量的，使用单价抗体例如Fab片段来测定kon。在其他实施方案中，如通过例如表面等离激元共振技术所测量的，使用二价抗体来测定kon。
在一些实施方案中，抗原结合分子以小于1x 10-2s-1、小于2x 10-2s-1、小于3x 10- 2s-1、小于4x 10-2s-1、小于5x 10-2s-1、小于6x 10-2s-1、小于7x 10-2s-1、小于8x 10-2s-1、小于9x 10-2s-1、小于1x 10-3s-1、小于2x 10-3s-1、小于3x 10-3s-1、小于4x 10-3s-1、小于5x 10-3s-1、小于6x 10-3s-1、小于7x 10-3s-1、小于8x 10-3s-1、小于9x 10-3s-1、小于1x 10-4s-1、小于2x10-4s-1、小于3x 10-4s-1、小于4x 10-4s-1、小于5x 10-4s-1、小于6x 10-4s-1、小于7x 10-4s-1、小于8x 10-4s-1、小于9x 10-4s-1、小于1x 10-4s-1或小于5x 10-4s-1的解离速率(koff)结合靶抗原(例如人CD19)。在某些实施方案中，如通过例如表面等离激元共振技术所测量的，使用单价抗体例如Fab片段来测定koff。在其他实施方案中，如通过例如表面等离激元共振技术所测量的，使用二价抗体来测定koff。
在一些实施方案中，多核苷酸编码TCR，其中TCR进一步包含第四互补决定区(CDR4)。在某些实施方案中，多核苷酸编码TCR，其中TCR进一步包含恒定区。在一些实施方案中，恒定区选自以下各项的恒定区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM。
I.B.共刺激结构域
嵌合抗原受体整合共刺激(信号传导)结构域以提高其效力。参见美国专利号7,741,465和6,319,494，以及Krause et al.and Finney et al.(supra),Song et al.,Blood 119:696-706(2012)；Kalos et al.,Sci Transl.Med.3:95(2011)；Porter et al.,N.Engl.J.Med.365:725-33(2011)和Gross et al.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.56:59–83(2016)。示例性共刺激蛋白质具有天然存在于T细胞上的共刺激蛋白质的氨基酸序列。该共刺激蛋白质的完整天然氨基酸序列描述于NCBI参考序列：NP_006130.1中。
其他共刺激结构域的多核苷酸和多肽序列是本领域已知的。在一些实施方案中，编码共刺激结构域的多核苷酸包含与本领域已知的核苷酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，共刺激结构域的多肽序列包含与本领域已知的多肽序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的多肽序列。
I.B.1细胞外或“铰链”结构域
在一个实施方案中，本公开的CAR或TCR包含“细胞外”或“铰链”或“间隔区”结构域或区域，这些术语在本文中可互换使用。在另一个实施方案中，细胞外结构域来自或衍生自(例如包含以下的全部或片段)CD2、CD3delta、CD3 epsilon、CD3 gamma、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关的alpha链)、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关的beta链)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-zeta)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2R beta、IL-2Rgamma、IL-7R alpha、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fc gamma受体、MHC 1类分子、MHC 2类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、激活性NK细胞受体、Toll配体受体，及其片段或组合。“细胞外”或“铰链”或“间隔区”结构域或区域可以衍生自天然或合成来源。这些铰链结构域的多核苷酸和多肽序列是本领域已知的。
在一些实施方案中，编码铰链结构域的多核苷酸包含与本领域已知的核苷酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域的多肽序列包含与本领域已知的多肽序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的多肽序列。
在一些实施方案中，铰链结构域位于抗原结合结构域(例如scFv)和跨膜结构域之间。以这种定向，铰链结构域提供了抗原结合结构域和表达CAR的细胞膜的表面之间的距离。在一些实施方案中，铰链结构域来自或衍生自免疫球蛋白。在一些实施方案中，铰链结构域选IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM的铰链区或其片段。在其他实施方案中，铰链结构域包含、来自或衍生自CD8 alpha的铰链区。在一些实施方案中，铰链结构域包含、来自或衍生自CD28的铰链区。在一些实施方案中，铰链结构域包含CD8alpha的铰链区的片段或CD28的铰链区的片段，其中片段小于整个铰链区。在一些实施方案中，CD8 alpha铰链区的片段或CD28铰链区的片段包含排除CD8alpha铰链区或CD28铰链区的N末端或C末端或两者处的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个氨基酸的氨基酸序列。
I.B.2跨膜结构域
用于本发明的CAR或TCR的共刺激结构域可以进一步包含跨膜结构域和/或细胞内信号传导结构域。该跨膜结构域可以设计成与CAR的细胞外结构域融合。类似地，其可以与CAR的细胞内结构域融合。在一个实施方案中，使用天然与CAR中的结构域之一缔合的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可以经过选择或通过氨基酸取代进行修饰以避免此类结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合以使其与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。跨膜结构域可以衍生自天然来源或来自合成来源。当来源为天然来源时，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。本发明中特定用途的跨膜区可以衍生自(即包含)4-1BB/CD137、激活性NK细胞受体、免疫球蛋白蛋白质、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3 delta、CD3 epsilon、CD3 gamma、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8alpha、CD8beta、CD96(Tactile)、CDl la、CDl lb、CDllc、CDl ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fc gamma受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Ig alpha(CD79a)、IL-2R beta、IL-2Rgamma、IL-7R alpha、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、与CD83特异性结合的配体、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1；CDl-la/CD18)、MHC class 1molecule、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或其片段、截短或组合。这些跨膜结构域的多核苷酸和多肽序列是本领域已知的。
在一些实施方案中，编码跨膜结构域的多核苷酸包含与本领域已知的核苷酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域的多肽序列包含与本领域已知的多肽序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的多肽序列。
任选地，短接头可以形成任何或一些CAR的细胞外、跨膜和细胞内结构域之间的连接。
I.B.3细胞内(信号传导)结构域
本发明的工程化T细胞的细胞内(信号传导)结构域可以对活化结构域提供信号传导，该活化结构域然后活化免疫细胞的至少一个正常效应物功能。T细胞的效应物功能可以是例如细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。
在某些实施方案中，合适的细胞内信号传导结构域包括(即包含)但不限于，4-1BB/CD137、激活性NK细胞受体、免疫球蛋白蛋白质、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3 delta、CD3 epsilon、CD3 gamma、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8alpha、CD8beta、CD96(Tactile)、CDl la、CDl lb、CDl lc、CDl ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fc gamma受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Ig alpha(CD79a)、IL-2R beta、IL-2R gamma、IL-7Ralpha、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、与CD83特异性结合的配体、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229),Lyl08)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1；CDl-la/CD18)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或其片段、截短或组合。这些细胞内信号传导结构域的多核苷酸和多肽序列是本领域已知的。
在一些实施方案中，编码细胞内信号传导结构域的多核苷酸包含与本领域已知的核苷酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域的多肽序列包含与本领域已知的多肽序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的多肽序列。
I.C活化结构域
CD3是天然T细胞上的T细胞受体的元件，并且已经显示是CAR中重要的细胞内激活元件。在一些实施方案中，CD3是CD3-zeta或CD3-epsilon，其各自的多核苷酸和多肽序列是本领域已知的。
在一些实施方案中，编码活化结构域的多核苷酸包含与本领域已知的核苷酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，活化结构域的多肽序列包含与本领域已知的多肽序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的多肽序列。
I.D.开关结构域(Switch Domain)
应当领会，通过用***基因转导免疫细胞(含有一种或多种CAR或TCR)可以使不良事件最小化。也可以期望将诱导性“开(on)”或“加速器”开关掺入到免疫细胞中。合适的技术包括在用本发明的CAR构建体转导细胞之前、之后或同时使用诱导性胱天蛋白酶-9(美国申请2011/0286980)或胸苷激酶。导入***基因和/或“开”开关的另外的方法包括TALENS、锌指、RNAi、siRNA、shRNA、反义技术和本领域已知的其他技术。
根据本发明，另外的开-关或其他类型的控制开关技术可以并入本文。这些技术可以采用二聚化结构域和任选此类结构域二聚化的活化剂。这些技术包括例如，Wu et al.,Science 2014 350(6258)描述的在某些细胞中利用FKBP/Rapalog二聚化***的那些，其内容通过引用整体并入本文。另外的二聚化对可以包括环孢霉素-A/亲环素受体、***/***受体(任选地使用他莫昔芬)、糖皮质激素/糖皮质激素受体、四环素/四环素受体、维生素D/维生素D受体。二聚化技术的其他实例可以在例如WO 2014/127261、WO 2015/090229、US 2014/0286987、US 2015/0266973、US 2016/0046700、美国专利号8,486,693、US 2014/0171649和US 2012/0130076中找到，其内容进一步通过引用整体并入本文。
I.E.前导肽或前导序列
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸编码的CAR或TCR，其可以进一步包含前导肽(本文中也称为“信号肽”或“前导序列”)。在某些实施方案中，前导肽包含与氨基酸序列MEWTWVFLFLLSVTAGVHS(SEQ ID NO:6)或MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:35)至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，前导肽包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
其他前导肽的多核苷酸和多肽序列是本领域已知的。
在一些实施方案中，编码前导肽的多核苷酸包含与本领域已知的核苷酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，前导肽的多肽序列包含与本领域已知的多肽序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的多肽序列。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸编码CAR或TCR，其中CAR或TCR包含前导肽(P)、抗原结合分子(B)、共刺激蛋白质的细胞外结构域(E)、跨膜结构域(T)、共刺激区(C)和活化结构域(A)，其中CAR根据如下配置：P-B-E-T-C-A。在一些实施方案中，抗原结合分子包含VH和VL，其中CAR根据如下配置：P-VH-VL-E-T-C-A或P-VL-VH-E-T-C-A。在一些实施方案中，VH和VL通过接头(L)连接，其中CAR根据如下配置(从N末端至C末端)：P-VH-L-VL-E-T-C-A或P-VH-L-VL-E-T-C-A。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸编码CAR或TCR，其中CAR或TCR包含与本领域已知的CAR或TCR的氨基酸序列至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列。参见例如，US 62/470,703和US62/317,258。
II.载体、细胞和药物组合物
在某些方面，本文提供了包含本发明的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，本发明涉及载体或一组载体，其如本文所述，包含编码CAR或TCR的多核苷酸，该CAR或TCR包含抗原结合结构域。
本领域已知的任何载体可以适于本发明。在一些实施方案中，载体为病毒载体。在一些实施方案中，载体为逆转录病毒载体、DNA载体、鼠白血病病毒载体、SFG载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、EB病毒载体、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体(AAV)、慢病毒载体或其任何组合。
在其他方面，本文提供了包含本发明的多核苷酸或载体的细胞。在一些实施方案中，本发明涉及细胞，例如体外细胞，其包含编码如本文所述的CAR的多核苷酸或包含抗原结合结构域。在其他实施方案中，本发明涉及细胞，例如体外细胞，其包含由包含如本文所述的抗原结合结构域的CAR或TCR编码的多肽。
对于本发明的多核苷酸、载体或多肽，任何细胞可以用作宿主细胞。在一些实施方案中，细胞可以为原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞例如哺乳动物细胞。合适的原核细胞包括但不限于，真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，肠杆菌科细菌(Enterobactehaceae)例如埃希氏菌(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)；肠杆菌(Enterobacter)；欧文氏菌(Erwinia)；克雷伯氏菌(Klebsiella)；变形杆菌(Proteus)；沙门氏菌(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)；沙雷氏菌(Serratia)，例如褪色沙雷氏菌(Serratiamarcescans)和志贺氏菌(Shigella)；芽孢杆菌(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；和链霉菌(Streptomyces)。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选自下组：T细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、TCR表达细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞、粒细胞、先天淋巴样细胞、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板、胸腺细胞和髓样细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在另一个实施方案中，免疫细胞是NK细胞。在某些实施方案中，T细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自体T细胞、工程化自体T细胞(eACTTM)、同种异体T细胞、异源T细胞，或其任何组合。
可以通过本领域已知的任何来源获得本发明的细胞。例如，T细胞可以在体外从造血干细胞群分化，或者可以从受试者获得T细胞。T细胞可以从例如外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织以及肿瘤获得。此外，T细胞可以衍生自本领域中可获得的一个或多个T细胞系。T细胞也可以使用本领域技术人员已知的任何数目的技术(例如FICOLLTM分离和/或单采术(apheresis))从受试者收集的血液单位取得。在某些实施方案中，通过单采术收集的细胞经清洗以去除血浆部分，并且放置于适当的缓冲液或介质中以进行后续处理。在一些实施方案中，用PBS清洗细胞。如应当领会的，可以例如通过使用半自动无逆流离心机(例如CobeTM 2991细胞处理器，Baxter CytoMateTM等)来使用清洗步骤。在一些实施方案中，将经清洗的细胞重悬于一种或多种生物相容性缓冲液，或含有或不含有缓冲液的其他盐溶液中。在某些实施方案中，除去单采样品中不期望的成分。分离用于T细胞疗法的T细胞的另外的方法公开于美国专利公开号2013/0287748，其通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，通过溶解红细胞和消耗单核细胞(例如经由PERCOLLTM梯度，通过使用离心来分离)从PBMC分离T细胞。在一些实施方案中，可以通过本领域中已知的正或负选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，例如CD4+、CD8+、CD28+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，可以使用针对负选择的细胞所特有的表面标志物的抗体组合来完成通过负选择进行的T细胞群富集。在一些实施方案中，可以使用细胞分选和/或经由负磁性免疫黏附或流式细胞术(其使用针对存在于经负选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物)进行选择。例如，为了通过负选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD8、CD11b、CD14、CD16、CD20和HLA-DR的抗体。在某些实施方案中，使用流式细胞术和细胞分选来分离用于本发明中的感兴趣的细胞群。
在一些实施方案中，PBMC直接用于使用如本文所述的方法的免疫细胞的遗传修饰(例如CAR或TCR)。在某些实施方案中，分离PBMC后，可以进一步分离出T淋巴细胞，并在遗传修饰和/或扩增前或后将细胞毒性和辅助性T淋巴细胞两者分选成初始T细胞、记忆T细胞和效应T细胞亚群。
在一些实施方案中，通过鉴别与CD8+细胞的初始细胞、中央记忆细胞和效应细胞类型中每种相关联的细胞表面抗原来将CD8+细胞进一步分选成初始细胞、中央记忆细胞及效应细胞。在一些实施方案中，中央记忆T细胞的表型标志物的表达包括CCR7、CD3、CD28、CD45RO、CD62L和CD127并且为颗粒酶B阴性。在一些实施方案中，中央记忆T细胞为CD8+、CD45RO+和CD62L+ T细胞。在一些实施方案中，效应T细胞为CCR7、CD28、CD62L和CD127阴性并且为颗粒酶B和穿孔素阳性。在某些实施方案中，将CD4+ T细胞进一步分选成亚群。例如，可以通过鉴别具有细胞表面抗原的细胞群将CD4+T辅助性细胞分选为初始细胞、中央记忆细胞和效应细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞例如T细胞在分离后使用已知的方法进行遗传修饰，或者免疫细胞在经遗传修饰前在体外活化和扩增(或者，在祖细胞的情况下分化)。在另一个实施方案中，免疫细胞例如T细胞以本文所述的嵌合抗原受体进行遗传修饰(例如用包含一个或多个编码CAR的核苷酸序列的病毒载体转导)，并然后在体外活化和/或扩增。用于活化和扩增T细胞的方法为本领域所已知并描述于例如美国专利号6,905,874；6,867,041；和6,797,514；以及PCT公开号WO 2012/079000中，其内容在此通过引用整体并入。一般而言，此类方法包括将PBMC或分离的T细胞在具有适当的细胞因子(例如IL-2)的培养基中与刺激剂和共刺激剂(例如抗CD3和抗CD28抗体，通常黏附在珠或其他表面)接触。黏附在相同珠上的抗CD3和抗CD28抗体充当“替代”抗原呈递细胞(APC)。一个实例为***，用于生理活化人T细胞的CD3/CD28活化剂/刺激剂***。在其他实施方案中，使用例如美国专利号6,040,177和5,827,642以及PCT公开号WO 2012/129514(其内容在此通过引用整体并入)中描述的方法，以饲养细胞以及适当的抗体和细胞因子活化并刺激T细胞以进行增殖。
在某些实施方案中，从供体受试者获得T细胞。在一些实施方案中，供体受试者为患有癌症或肿瘤的人类患者。在其他实施方案中，供体受试者为未患有癌症或肿瘤的人类患者。
本发明的其他方面涉及包含本文所述的多核苷酸、本文所述的载体、本文所述的多肽或本文所述的体外细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在一些实施方案中，组合物包含赋形剂。在一个实施方案中，组合物包含编码包含如本文所述的抗原结合结构域的CAR或TCR的多核苷酸。在另一个实施方案中，组合物包含含有由本发明的多核苷酸编码的如本文所述的抗原结合结构域的CAR或TCR。在另一个实施方案中，组合物包含含有CAR或TCR(其包含如本文所述的抗原结合结构域)的T细胞。
III.本发明的方法
本发明的另一方面涉及制造表达CAR或TCR的细胞的方法，其包括在合适的条件下用本文所公开的多核苷酸转导的细胞。在一些实施方案中，如本文所公开的，方法包括用编码CAR或TCR的多核苷酸转导细胞。在一些实施方案中，方法包括用包含编码CAR或TCR的多核苷酸的载体转导细胞。
本发明的另一方面涉及诱导针对肿瘤的免疫的方法，其包括对受试者施用有效量的细胞，该细胞包含本文所述的多核苷酸、本文所述的载体或本文所述的CAR或TCR。在一个实施方案中，方法包括对受试者施用有效量的细胞，该细胞包含编码本文所公开的CAR或TCR的多核苷酸。在另一个实施方案中，方法包括对受试者施用有效量的包含载体的细胞，该载体包含编码本文所公开的CAR或TCR的多核苷酸。在另一个实施方案中，方法包括对受试者施用有效量的细胞，该细胞包含由本文所公开的多核苷酸编码的CAR或TCR。
本发明的另一方面涉及诱导受试者中免疫应答的方法，其包括施用有效量的本申请的经工程化改造的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫应答为T细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，T细胞介导的免疫应答针对一种或多种靶细胞。在一些实施方案中，经工程化改造的免疫细胞包含CAR或TCR，其中CAR或TCR包含如本文所述的抗原结合结构域。在一些实施方案中，靶细胞为肿瘤细胞。
本发明的另一方面涉及用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用有效量的至少一种免疫细胞，其中免疫细胞包含至少一种CAR或TCR，并且其中该CAR或TCR包含如本文所述的抗原结合结构域。
本发明的另一方面涉及治疗有此需要的受试者中癌症的方法，其包括对受试者施用本文所公开的多核苷酸、载体、CAR或TCR、细胞或组合物。在一个实施方案中，方法包括施用编码CAR或TCR的多核苷酸。在另一个实施方案中，方法包括施用包含编码CAR或TCR的多核苷酸的载体。在另一个实施方案中，方法包括施用由本文所公开的多核苷酸编码的CAR或TCR。在另一个实施方案中，方法包括施用包含编码CAR或TCR的多核苷酸或包含编码CAR或TCR的多核苷酸的载体的细胞。
在一些实施方案中，治疗有此需要的受试者中癌症的方法包括T细胞疗法。在一个实施方案中，本发明的T细胞疗法为工程化自体细胞疗法(eACTTM)。根据该实施方案，方法可以包括从患者收集血细胞。然后，分离的血细胞(例如T细胞)可以经工程化改造以表达本发明的CAR或TCR。在一个具体的实施方案中，将CAR T细胞或TCR T细胞施用于患者。在一些实施方案中，CAR T细胞或TCR T细胞治疗患者中的肿瘤或癌症。在一个实施方案中，CAR T细胞或TCR T细胞缩小肿瘤或癌症的尺寸。
在一些实施方案中，从患者获得用于T细胞疗法中的供体T细胞(例如用于自体T细胞疗法)。在其他实施方案中，从非患者的受试者获得用于T细胞疗法中的供体T细胞。
T细胞可以以治疗有效量施用。例如，T细胞的治疗有效量可以为至少约104个细胞、至少约105个细胞、至少约106个细胞、至少约107个细胞、至少约108个细胞、至少约109个细胞或至少约1010个细胞。在另一个实施方案中，T细胞的治疗有效量为约104个细胞、约105个细胞、约106个细胞、约107个细胞或约108个细胞。在一个具体的实施方案中，CAR T细胞或TCR T细胞的治疗有效量为约2X 106个细胞/kg、约3X 106个细胞/kg、约4X 106个细胞/kg、约5X 106个细胞/kg、约6X 106个细胞/kg、约7X 106个细胞/kg、约8X 106个细胞/kg、约9X106个细胞/kg、约1X 107个细胞/kg、约2X 107个细胞/kg、约3X 107个细胞/kg、约4X 107个细胞/kg、约5X 107个细胞/kg、约6X 107个细胞/kg、约7X 107个细胞/kg、约8X 107个细胞/kg或约9X 107个细胞/kg。
IV.癌症治疗
本发明的方法可以用于治疗受试者中的癌症、缩小肿瘤尺寸、杀死肿瘤细胞、防止肿瘤细胞增殖、防止肿瘤生长、从患者消除肿瘤、防止肿瘤复发、防止肿瘤转移、诱导患者缓解或其任何组合。在某些实施方案中，方法诱导完整响应。在其他实施方案中，方法诱导部分响应。
可以治疗的癌症包括B细胞淋巴瘤。在某些实施方案中，B细胞淋巴瘤是急性淋巴母细胞白血病(ALL)、AIDS相关淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、经典霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心Castleman病引起的大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、***边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)和瓦氏巨球蛋白血症或其组合。在一个实施方案中，B细胞淋巴瘤是急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)和非霍奇金淋巴瘤。在一个实施方案中，B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方案中，方法进一步包括施用化学治疗剂。
在其他实施方案中，抗原结合分子，转导的(或以其他方式工程化的)细胞(例如CAR或TCR)和化学治疗剂各自以有效治疗受试者的疾病或状况的量施用。
在某些实施方案中，包含本文所公开的表达CAR和/或TCR的免疫效应细胞的组合物可以在任何数目的化学治疗剂之前、与之联合和/或之后施用。化学治疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXANTM)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamineresume)；氮芥类(nitrogen mustards)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，如阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类，如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；曲布赛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2′,2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOLTM，Bristol-Myers Squibb)和多西他塞(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；xeloda；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸(retinoic acid)衍生物，如TargretinTM(贝沙罗汀(bexarotene))、PanretinTM、(阿利维A酸(alitretinoin))；ONTAKTM(地尼白介素(denileukindiftitox))；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，可以与抗激素剂联合施用包含CAR和/或TCR表达性免疫效应细胞的组合物，所述抗激素剂作用为调节或抑制激素对肿瘤的作用，如抗***，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、奇沃昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在适当的情况下也施用化学治疗剂的组合，包括但不限于CHOP，即环磷酰胺多柔比星(羟基多柔比星)、长春新碱和***。
在某些实施方案中，包含本文公开的表达CAR和/或TCR的免疫效应细胞的组合物可以在CHOP之前、与之联合和/或之后施用。CHOP由以下组成：(C)环磷酰胺，烷化剂，通过与DNA结合并引起形成交联而破坏DNA；(H)羟基柔红霉素(也称为多柔比星或阿霉素)，嵌入剂，通过将自身***DNA碱基之间而破坏DNA；(O)ncovin(长春新碱)，通过与蛋白质微管蛋白结合来防止细胞复制；和(P)***或***龙，其是皮质类固醇。
在一些实施方案中，在施用工程化细胞或核酸同时或之后一周内施用化学治疗剂。在其他实施方案中，在施用工程化细胞或核酸后1至4周或1周至1个月、1周至2个月、1周至3个月、1周至6个月、1周至9个月或1周至12个月施用化学治疗剂。在一些实施方案中，在施用细胞或核酸之前至少1个月施用化学治疗剂。在一些实施方案中，该方法还包含施用两种或更多种化学治疗剂。
适合于与本发明组合使用的另外的治疗剂包括但不限于伊布替尼(ibrutinib)奥法木单抗(ofatumumab)利妥昔单抗(rituximab)贝伐单抗(bevacizumab)曲妥珠单抗(trastuzumab)trastuzumabemtansine伊马替尼(imatinib)西妥昔单抗(cetuximab)帕尼单抗(panitumumab)卡妥索单抗(Catumaxomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法木单抗、托西莫单抗(tositumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、阿昔替尼(axitinib)、马赛替尼(masitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、toceranib、来他替尼(lestaurtinib)、阿昔替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞格非尼(regorafenib)、司马沙尼(semaxanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、替瓦沙尼(tivozanib)、托西雷尼(toceranib)、凡德他尼、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕纳替尼(ponatinib)、雷多替尼(radotinib)、博舒替尼(bosutinib)、来他替尼(lestaurtinib)、鲁索替尼(ruxolitinib)、帕利替尼(pacritinib)、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、必尼美替尼(binimetinib)、阿雷替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿迪波太(adipotide)、地尼白介素、mTOR抑制剂如依维莫司(Everolimus)和西罗莫司(Temsirolimus)、hedgehog抑制剂如索尼得吉(sonidegib)和维莫得告(vismodegib)、CDK抑制剂如CDK抑制剂(帕博西尼(palbociclib))。
适合用于本发明的另外的治疗剂包括放射性原子。此类放射性原子的实例包括131I、90Y、212Bi、186Re、221At、99m Tc及其混合物。然而，如本领域已知的，也可以使用其他放射性原子。
在另外的实施方案中，将包含表达CAR和/或TCR的T细胞、包含scFV的缀合物或scFV本身的组合物与抗炎剂一起施用。消炎剂或药物可以包括但不限于类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松(betamethasone)、布***(budesonide)、***(dexamethasone)、乙酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲基***龙(methylprednisolone)、***龙(prednisolone)、***(prednisone)、曲安西龙(triamcinolone))、非类固醇类消炎药(NSAIDS)，包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特(leflunomide)、抗TNF药物、环磷酰胺和麦考酚酯(mycophenolate)。示例性的NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂和唾液酸化物(sialylate)。示例性镇痛剂包括扑热息痛(acetaminophen)、羟考酮(oxycodone)、曲马多或盐酸丙氧芬(tramadol of proporxyphene hydrochloride)。示例性糖皮质激素包括可的松、***、氢化可的松、甲基***龙、***龙或***。示例性生物反应调节剂包括针对细胞表面标志物(例如CD4，CD5等)的分子、细胞因子抑制剂如TNF拮抗剂，(例如依那西普(etanercept)阿达木单抗(adalimumab)和英夫利昔单抗(infliximab)生物反应调节剂包括单克隆抗体以及重组形式的分子。示例性的DMARD包括硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、Gold(口服(金诺芬(auranofin))和肌内)和米诺环素(minocycline)。
在某些实施方案中，与细胞因子联合施用本文所述的组合物。如本文所用，“细胞因子”意指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质对另一种细胞起作用的蛋白质。细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，如人生长激素，N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和***(LH)；肝生长因子(HGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；催乳素；胎盘催乳激素；缪勒管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠***相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子(NGF)如NGF-beta；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-alpha和TGF-beta；***-I和-II；***(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-alpha、beta和-gamma；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15，肿瘤坏死因子如TNF-alpha或TNF-beta；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
V.缀合物
本发明的抗原结合结构域(例如，抗人CD19 scFV)可以与如本文所述的治疗剂(例如，化学治疗剂和放射性原子)缀合(例如，连接)。
将此类治疗剂与抗体例如scFv缀合的技术是公知的；参见例如Arnon et al.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),1985,pp.243-56,Alan R.Liss,Inc.)；Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery”,inControlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.(eds.),1987,pp.623-53,MarcelDekker,Inc.)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,in Monoclonal Antibodies′84:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),1985,pp.475-506)；“Analysis,Results,And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”,in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin etal.(eds.),1985,pp.303-16,Academic Press；和Thorpe et al.,Immunol.Rev.,62:119-58,1982。前述参考文献的每一篇通过引用整体并入。
VI.抗体人源化
抗体人源化是用人抗体框架替换非人抗体例如scFv框架的过程。成功的抗体人源化取决于替换残基后维持亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体是其中轻链和重链两者的至少一部分序列来自人基因的抗体分子。此类抗体在本文称为“人源化抗体”、“人抗体”或“完全人抗体”。人单克隆抗体可以通过使用三源杂交瘤(trioma)技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor,et al.,1983Immunol Today 4:72)；和产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole,et al.,1985In:Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96)制备。人单克隆抗体可以使用人杂交瘤(参见Cote,et al.,1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030)或通过用EB病毒体外转化人B细胞(参见Cole,et al.,1985In:Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)产生。
另外，人抗体(例如scFv)可以使用另外的技术产生，包括噬菌体展示文库(参见Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991))。类似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座导入到转基因动物例如其中内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠中制备。攻击后，观察到人抗体产生，其在各个方面都与在人中所见的非常相似，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分(repertoire)。该方法描述于美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016中以及Marks et al.,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberget al.,Nature 368856-859(1994)；Morrison,Nature 368,812-13(1994)；Fishwild etal,Nature Biotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14,826(1996)；和Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)中。
提供了人源化抗体的方法。该方法遵循组合CDR移植、基于结构的反向突变方法以及快速筛选表达水平、生物物理特性和亲和力技术(FASEBA)，该技术生成具有亲和力和优化特性的人源化抗体，例如scFv。FASEBA技术用于优化人源化抗体的特性，例如表达水平和热稳定性，这对于优化制造和体内行为至关重要。方法的另外的详细信息在万维网(www)genscript.com/Antibody-Humanization.html处找到。如在本申请的公开中可获得的，其内容通过引用整体并入。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。然而，本文引用的参考文献不应解释为承认此类参考文献是本发明的现有技术。在通过引用并入的参考文献中提供的任何定义或术语与本文提供的术语和讨论不同的程度上，以本发明的术语和定义为准。
通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。本申请中引用的所有参考文献的内容通过引用明确地并入本文。
实施例
实施例1：FMC63抗体的scFv的人源化
本实施例的目的是在不牺牲亲本(野生型)抗体的结合亲和力的情况下，使用CDR嫁接加回复突变来人源化抗CD19小鼠单克隆抗体(mAb)克隆FMC63。抗原细胞与参照抗体的结合验证
培养Raji(人伯基特淋巴瘤)细胞，并通过离心收获。每孔约3×105个细胞用PBS洗涤两次，并在200μl的参照抗体(FMC63：小鼠抗人B细胞(CD19)IgG抗体)的连续稀释液中于4℃温育30分钟。用PBS洗涤后，将二抗(5μg/ml山羊抗小鼠IgG[FITC])添加到细胞，并于4℃温育30分钟。用PBS洗涤后，通过使用FACSCaliburTM(BD Bioscience，San Jose，CA)和FlowJo软件(Ashland，OR)分析细胞的结合EC50。
参照抗体(FMC63)与Raji细胞结合，但不与Eol-1(人急性髓样(嗜酸性)白血病)细胞结合(数据未显示)。
人源化FMC63文库的生成
设计了用于FMC63的重链和轻链的组合人源化回复突变(BM)筛选文库。遵循GenScript的标准操作规程实施文库的构建。
从噬菌体展示文库分离人源化FMC63 scFv
对从上述人源化文库获得的人源化scFv噬菌体展示文库针对Raji(人伯基特淋巴瘤)细胞进行淘选。在有和没有Eol-1(人急性髓样(嗜酸性)白血病)细胞的情况下对输入噬菌体颗粒进行预温育，并且结合的噬菌体用TEA洗脱，其中先通过野生型抗体进行竞争性洗脱以得到多样化且高亲和力结合剂。
在96深孔板中扩增单个输出噬菌体克隆，并且通过基于细胞的ELISA和流式细胞术验证来分析扩增的噬菌体。用HRP/抗M13单克隆抗体探测结合的噬菌体。
当发现高百分比的噬菌体克隆与Raji细胞结合而不与Eol-1细胞结合时，淘选结束。遵循GenScript的标准操作规程实施淘选和噬菌体ELISA。
快速筛选表达、生物物理特性和亲和力(FASEBA)
所选择的输出噬菌体用于感染指数生长的TG1(噬菌体展示感受态)细胞。培养转染的细胞，从中提取dsDNA。从双链噬菌粒中消化人源化scFv片段，并将其***pFASEBA载体中，以筛选最佳的人源化抗体克隆。
在96深孔板中表达各个克隆，并通过针对BSA的ELISA和针对Raji细胞的FACS验证来分析大肠杆菌分泌至培养基的粗蛋白，以分别评价表达和结合活性。
人源化FMC63 scFv的构建和生产
合成编码FMC63(小鼠抗人B细胞(CD19)IgG抗体)的人源化重链和轻链的DNA序列，并将其***到pTT5表达载体中以构建表达scFv(单链片段可变)的质粒。人源化抗体的表达在100ml HEK293细胞培养物中进行，并用Ni-螯合亲和柱纯化上清液。使用PD-10脱盐柱将纯化的抗体缓冲液交换成PBS。分别通过OD280和SDS-PAGE测定经纯化的蛋白质的浓度和纯度。
人源化FMC63 scFv的流式细胞仪滴定
对于人源化FMC63抗体对Raji细胞的亲和力排名，对经纯化的抗体进行流式细胞仪滴定。简而言之，培养Raji细胞并通过离心收获。每孔约3×105个细胞用PBS洗涤两次，并在200μl的scFV的连续稀释液中于4℃温育30分钟。用PBS洗涤后，将二抗(5μg/ml His标签抗体[FITC])添加到细胞，并于4℃温育30分钟。用PBS洗涤后，通过使用FACSCaliburTM和FlowJo软件分析细胞的结合EC50。
从噬菌体展示文库分离人源化FMC63 scFv克隆
在有和没有Eol-1细胞的情况下对经预温育的人源化scFv噬菌体文库进行淘选(表4)。
表4：细胞淘选和噬菌体ELISA验证的详细信息
第二轮的阳性率(抗原特异性人源化克隆的数量相对于随机挑选的克隆的总数)为～40％。始终观察到针对Raji和Eol-1细胞的基于细胞的ELISA结果，然后通过流式细胞仪进行验证。
FASEBA筛选
扩增编码第二输出噬菌体的scFv片段的DNA，并将其***到pFASEBA载体中以筛选领先的抗体。接种单个FASEBA文库克隆，并诱导其在96深孔板中表达。进行FACS筛选以分离特异性识别Raji细胞的scFv。
根据结果，选择了七个克隆(命名为RS、CS、BS、SS、JS、AS和NS)用于表达、纯化和亲和力测量。
人源化FMC63 scFv的表达和纯化
将上述七种人源化scFv和野生型scFv在100ml HEK293细胞中表达，并通过NTA-Ni树脂纯化。如通过SDS-PAGE所评估的，每个scFv的纯度超过90％。
人源化FMC63 scFv的流式细胞仪滴定
首先通过FACS研究人源化scFv与Raji细胞的结合，所述FACS以使用3μM经纯化的抗体开始。在两轮流式细胞仪期间，一致观察到七种上述人源化scFv克隆的阳性结合信号。
最后，选择这七种人源化scFv用于流式细胞术分析。这七种选择的人源化抗体的几何平均值和EC50显示在图3A和图3B和表5中。值得注意的是，scFv克隆SS、JS、AS/AS-R和NS的EC50分别为72.76nM、65.98nM、53.06/61.97nM和34.02nM，与野生型抗体的27.11nM相当。
表5：通过FACS滴定的七种选择的人源化scFv的几何平均值
对数(nM) RS CS BS SS JS AS AS-R NS WT
3.477121 72.7 65.8 73.3 62 60.2 62.7 65.2 60.7 /
3 72.5 65.4 70.9 61.7 59.7 62.4 64.5 61.9 70.3
2.522879 58.3 57.4 64.1 60.4 58.9 63.9 64.2 61.6 69.4
2.045758 29.3 23.9 26.8 51.4 46.6 62.4 61.6 56.3 67.7
1.568636 18.1 14.7 16.9 19.3 25.7 19.4 18.9 41.2 50.8
1.091515 14.1 13.9 12.7 14.6 13.6 14.5 16.1 15.1 24.9
0.614394 13.2 13.6 14.7 13.9 13.3 14 13.4 15.5 15.7
0.137273 13.7 12.4 15.3 13.9 13.4 14.2 14.9 15.7 15.5
-0.33985 / / / / / / / / 15.4
EC50 191.5 183.7 177.6 72.76 65.98 53.06 61.97 34.02 27.11
七种选择的scFV中四种的表征。
在上文的发明详述中描述了编码野生型scFv和七种选择的人源化scFv中四种的核苷酸序列。同样，在上文的发明详述中描述了野生型scFv和七种选择的人源化scFv中四种的氨基酸序列。
选择具有与野生型scFv相当的结合EC50的四种人源化scFv(命名为SS、JS、AS和NS的克隆)用于进一步表征。
对四个克隆进行了尺寸排阻色谱法(SEC)分析，部分为了鉴定了scFv形成可溶性聚集体的倾向。如图4A和图4B中所示，NS和JS克隆在SEC上显示单峰；因此，NS和JS scFv在测定的条件下不形成聚集体。另一方面，如图4C和图4D中所示，SS和AS克隆在SEC上显示双峰；参见每个图中的插图。因此，SS和AS scFv在测试的条件下形成相当数量的可溶性聚集体。
结论
在本实施例中，抗CD19小鼠单克隆抗体(mAb)克隆FMC63成功地人源化。从FASEBA高通量筛选和噬菌体展示技术获得了七种人源化scFv。四种人源化scFv(命名为SS、JS、AS和NS的克隆)显示出与野生型FMC63 scFv相当的结合(EC50值)。
实施例2：包含每种选择的scFV的嵌合抗原受体(CAR)的表征
设计嵌合抗原受体(CAR)，其表达四种选择的scFV(SS、JS、AS和NS)之一作为其抗原结合分子。
进行热斜升测定法以确定包含CAR结合结构域的四种scFv的热稳定性
增强的稳定性是蛋白质的期望特性。通常通过确定各种条件下蛋白质的解链温度来评价。具有较高解链温度的蛋白质通常稳定更长的时间。当CAR更加热稳定时，它可以在更长的时间段在细胞表面上具有功能活性。
使用Bio-Rad C1000热循环仪、CFx96实时***测量包含本发明的CAR的结合结构域的scFv的热稳定性。使用荧光染料Orange(Invitrogen)监测蛋白质的去折叠，该染料与随着蛋白质的去折叠而暴露出来的疏水氨基酸结合。温度梯度设置为从25℃至95℃，其中逐步增量为1℃/分钟。每个样品均含有10μM的CAR scFv和5XOrange蛋白质凝胶染料(Molecular ProbesTM；DMSO中5,000X浓缩液)。在图5A中显示的样品中包括50mM NaCl。
在该测定法中，CAR的可接受的解链温度理想地大于60℃。
如图5A中所示，包含人源化scFv的CAR在存在50mM NaCl的情况下显示出变化的热稳定性，其中当省略NaCl时差异很小(如图5B种所示)。此外，本发明的CAR的scFv相对于其他CAR中使用的其他研究的scFv非常稳定。AS(“□”)scFv具有约58℃的最低解链温度；对于SS克隆(“Δ”；65℃)、JS克隆(“◇”；67℃)和NS克隆(“X”；73℃)的scFV，观察到升高的解链温度。
在两种细胞系中的CAR表达
在两种T细胞供体的细胞中表达包含SS-、JS-、AS-和NS-scFv的CAR：5244(图6A)和5273(图6B)。还制备了表达模拟品CAR的供体细胞样品和表达包含FMC63(亲本)scFV的CAR的供体细胞。
通过将细胞与PE缀合的抗CAR抗体一起温育，在供体细胞的表面上检测CAR。通过流式细胞术测量CAR阳性的百分比和荧光强度。
图6A和图6B显示在模拟品转导的T细胞中没有CAR表达。在任何一个供体的细胞中，与其他三个选择的人源化scFv克隆相比，更多SS CAR得以表达；AS CAR具有最少的表达量。
实施例3：包含选择的scFV的每一种的CAR选择性杀伤肿瘤细胞
将来自供体5244(图7A至7D)或5273(图8A至8D)的CAR或模拟品转导的T细胞以1:1或4:1的效应物与靶标的比率添加至靶细胞系。使用了四种靶细胞类型：Raji(CD19+人伯基特淋巴瘤细胞；图7A和图8A)、Namalawa(CD19+人伯基特淋巴瘤细胞；图7B和图8B)、Eol-1(CD19-人急性髓样(嗜酸性)白血病细胞；图7C和图8C)和Mv411(CD19-人双表型B骨髓单核细胞白血病细胞；图7D和图8D)。星形孢菌素(“Stauro”)用作肿瘤细胞杀伤的阳性对照。
于37℃共培养18小时后，将R10培养基中的50μL的稳定Glo萤光素试剂添加到每个孔中，并将板于37℃温育10分钟。萤光素酶活性用作细胞活力的量度。在Varioskan Flash读板器中读取发光。
图7A-7D和8A-8D显示了对于CAR转导的供体细胞并与靶细胞一起温育测量的发光。本发明的CAR的每一种都能够杀伤CD19+靶细胞。
用OKT3最初刺激后十天内测量了来自另外供体的CAR或模拟品转导的T细胞的生长动力学。每种CAR的观察到的生长概况显示在图9A中。然后第二次刺激CAR或模拟品转导的T细胞，并观察生长动力学的差异，如图9B中所示。在第10天，用抗CAR抗体和CD3进行T细胞群的表征(图10A)。还进行了CD4/CD8染色以检测CAR T细胞产生期间CD8细胞的富集，显示于图10B中。以1:1的效应物与靶标比率在CD19+NAMALWA(图11A)或CD19-EOL-1(图11B)上进行了细胞毒性测定。
序列表
<110> 凯德药业股份有限公司
<120> 针对CD19的人源化抗原结合结构域及其使用方法
<130> K-1046.01
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
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ggtaccgtta aactgctgat ctatcatacg tctcgtctgc acagtggcgt cccgtcccgc 240
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
1 5
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Trp Gly Ser Glu Thr
1 5
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (106)

1.人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区，其中所述VL区包含VL互补决定区(CDR)1(VL CDR1)、VL CDR2和VL CDR3并且所述VH区包含VH CDR1、VL CDR2和VL CDR3，
其中所述VL区衍生自SEQ ID NO:36且VH区衍生自SEQ ID NO:37，并且其中所述VL和/或VH区在框架区中包含一个或多个氨基酸取代。
2.权利要求1的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL区与SEQ ID NO:36相比包含高达5、10、15、20、25或30个氨基酸取代。
3.权利要求1或2的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL区中所述一个或多个氨基酸取代在对应于SEQ ID NO:36的7、8、10、15、22、41、42、43、44、49、71、72、77、79、80、83、87、100和/或107的位置处。
4.权利要求1至3中任一项的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL区中所述一个或多个氨基酸取代选自SEQ ID NO:36的位置7处的Ser、位置8处的Pro、位置15处的Val、位置22处的Thr、位置41处的Gln、位置42处的Lys、位置43处的Ala、位置72处的Thr、位置77处的Ser、位置79处的Gln、位置80处的Pro和/或位置107处的Lys。
5.权利要求1至4中任一项的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VH区与SEQ ID NO:37相比包含高达5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸取代。
6.前述权利要求中任一项的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VH区中所述一个或多个氨基酸取代在对应于SEQ ID NO:37的1、3、5、9、13、15、16、17、19、20、21、23、24、37、42、48、67、69、70、71、73、76、77、78、79、81、83、86、87、88、92和/或115的位置处。
7.前述权利要求中任一项的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VH区中所述一个或多个氨基酸取代选自SEQ ID NO:37的位置1处的Gln、位置3处的Gln、位置5处的Val、位置9处的Gly、位置13处的Lys、位置13处的Gln、位置15处的Gly、位置16处的Arg、位置16处的Thr、位置17处的Thr、位置19处的Arg、位置20处的Leu、位置21处的Ser、位置24处的Ala、位置42处的Gly、位置48处的Ile、位置67处的Phe、位置70处的Ser、位置71处的Arg、位置73处的Thr、位置76处的Asn、位置77处的Thr、位置78处的Leu、位置79处的Tyr、位置81处的Gln、位置83处的Ser、位置86处的Thr、位置86处的Arg、位置87处的Ala、位置88处的Glu、位置88处的Ala、位置92处的Val和/或Leu。
8.人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区，其中所述VL区包含VL互补决定区(CDR)1(VL CDR1)、VL CDR2和VL CDR3并且所述VH区包含VH CDR1、VL CDR2和VL CDR3，
其中所述VL区具有与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:17至少85％相同的氨基酸序列；和/或
其中所述VH区具有与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:18至少85％相同的氨基酸序列。
9.前述权利要求中任一项的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自下组：IgG、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv和单结构域抗体(dAB)。
10.权利要求9的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv。
11.权利要求10的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL CDR1与SEQ IDNO:27至少80％相同，所述VL CDR2与SEQ ID NO:28至少80％相同，并且所述VL CDR3与SEQID NO:29至少80％相同。
12.权利要求10或权利要求11的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VLCDR1包含SEQ ID NO:27，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:28，并且所述VL CDR3包含SEQ IDNO:29。
13.权利要求10至12中任一项的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VHCDR1与SEQ ID NO:30或33至少80％相同，所述VH CDR2与SEQ ID NO:31或34至少80％相同，并且所述VH CDR3与SEQ ID NO:32至少80％相同。
14.权利要求13的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VH CDR1包含SEQ IDNO:30或33，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:31或34，并且所述VH CDR3包含SEQ ID NO:32。
15.权利要求10的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL CDR1与SEQ IDNO:27至少80％相同，所述VL CDR2与SEQ ID NO:28至少80％相同，所述VL CDR3与SEQ IDNO:29至少80％相同，所述VH CDR1与SEQ ID NO:30或33至少80％相同，所述VH CDR2与SEQID NO:31或34至少80％相同，并且所述VH CDR3与SEQ ID NO:32至少80％相同。
16.权利要求15的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL CDR1包含SEQ IDNO:27，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:28，所述VL CDR3包含SEQ ID NO:29，所述VH CDR1包含SEQ ID NO:30或33，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:31或34，并且所述VH CDR3包含SEQ IDNO:32。
17.权利要求16的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL CDR1包含SEQ IDNO:27，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:28，所述VL CDR3包含SEQ ID NO:29，所述VH CDR1包含SEQ ID NO:30，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:31，并且所述VH CDR3包含SEQ ID NO:32。
18.权利要求16的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL CDR1包含SEQ IDNO:27，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:28，所述VL CDR3包含SEQ ID NO:29，所述VH CDR1包含SEQ ID NO:33，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:34，并且所述VH CDR3包含SEQ ID NO:32。
19.权利要求16的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL CDR1包含SEQ IDNO:27，所述VL CDR2包含SEQ ID NO:28，所述VL CDR3包含SEQ ID NO:29，所述VH CDR1包含SEQ ID NO:30，所述VH CDR2包含SEQ ID NO:34，并且所述VH CDR3包含SEQ ID NO:32。
20.权利要求1至19中任一项的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:14至少85％相同。
21.权利要求20的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VH与SEQ ID NO:15至少85％相同。
22.权利要求21的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:14至少85％相同并且所述VH与SEQ ID NO:15至少85％相同。
23.权利要求22的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:14至少90％相同并且所述VH与SEQ ID NO:15至少90％相同。
24.权利要求23的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:14至少95％相同并且所述VH与SEQ ID NO:15至少95％相同。
25.权利要求24的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:14至少99％相同并且所述VH与SEQ ID NO:15至少99％相同。
26.权利要求25的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL包含SEQ ID NO:14并且所述VH包含SEQ ID NO:15。
27.权利要求26的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中多肽包含SEQ ID NO:24。
28.权利要求1至19中任一项的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:20至少85％相同。
29.权利要求28的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VH与SEQ ID NO:21至少85％相同。
30.权利要求29的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:20至少85％相同并且所述VH与SEQ ID NO:21至少85％相同。
31.权利要求30的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:20至少90％相同并且所述VH与SEQ ID NO:21至少90％相同。
32.权利要求31的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:20至少95％相同并且所述VH与SEQ ID NO:21至少95％相同。
33.权利要求32的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:20至少99％相同并且所述VH与SEQ ID NO:21至少99％相同。
34.权利要求33的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL包含SEQ ID NO:20并且所述VH包含SEQ ID NO:21。
35.权利要求34的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中多肽包含SEQ ID NO:26。
36.权利要求1至19中任一项的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:11至少85％相同。
37.权利要求36的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VH与SEQ ID NO:12至少85％相同。
38.权利要求37的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:11至少85％相同并且所述VH与SEQ ID NO:12至少85％相同。
39.权利要求38的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:11至少90％相同并且所述VH与SEQ ID NO:12至少90％相同。
40.权利要求39的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:11至少95％相同并且所述VH与SEQ ID NO:12至少95％相同。
41.权利要求40的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:11至少99％相同并且所述VH与SEQ ID NO:12至少99％相同。
42.权利要求41的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL包含SEQ ID NO:11并且所述VH包含SEQ ID NO:12。
43.权利要求42的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中多肽包含SEQ ID NO:23。
44.权利要求1至19中任一项的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:17至少85％相同。
45.权利要求44的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VH与SEQ ID NO:18至少85％相同。
46.权利要求45的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:17至少85％相同并且所述VH与SEQ ID NO:18至少85％相同。
47.权利要求46的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:17至少90％相同并且所述VH与SEQ ID NO:18至少90％相同。
48.权利要求47的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:17至少95％相同并且所述VH与SEQ ID NO:18至少95％相同。
49.权利要求48的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL与SEQ ID NO:17至少99％相同并且所述VH与SEQ ID NO:18至少99％相同。
50.权利要求49的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中所述VL包含SEQ ID NO:17并且所述VH包含SEQ ID NO:18。
51.权利要求50的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其中多肽包含SEQ ID NO:25。
52.多肽，其由权利要求1至51中任一项的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段编码。
53.权利要求52的多肽，其进一步包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的His标签。
54.权利要求53的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19至少85％相同。
55.权利要求54的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19至少90％相同。
56.权利要求55的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19至少95％相同。
57.权利要求56的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19至少99％相同。
58.权利要求57的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19。
59.权利要求52至58中任一项的多肽，其中所述多肽与治疗剂连接。
60.权利要求59的多肽，其中所述治疗剂是化学治疗剂、细胞因子、放射性原子、siRNA或毒素。
61.权利要求60的多肽，其中所述治疗剂是化学治疗剂。
62.权利要求60的多肽，其中所述治疗剂是放射性原子。
63.嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其包含：(i)抗原结合结构域，(ii)共刺激结构域，和(iii)活化结构域，
其中所述共刺激结构域包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且
其中所述抗原结合结构域至少包含权利要求52的多肽。
64.权利要求63的CAR或TCR，其中所述共刺激结构域来自或衍生自CD2、CD3 delta、CD3epsilon、CD3 gamma、CD4、CD7、CD8、CD8、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关的alpha链)、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关的beta链)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-zeta)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2R beta、IL-2R gamma、IL-7R alpha、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fc gamma受体、MHC 1类分子、MHC 2类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、激活性NK细胞受体、Toll配体受体，及其片段或组合。
65.权利要求63或权利要求64的CAR或TCR，其中所述跨膜结构域来自或衍生自4-1BB/CD137、T细胞受体的alpha链、T细胞受体的beta链、CD2、CD3 delta、CD3 epsilon、CD3gamma、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关的alpha链)、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关的beta链)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-zeta)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2R beta、IL-2Rgamma、IL-7R alpha、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fc gamma受体、MHC 1类分子、MHC 2类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、激活性NK细胞受体、Toll配体受体，及其组合。
66.权利要求63至65中任一项的CAR或TCR，其中所述细胞内结构域来自或衍生自4-1BB/CD137、激活性NK细胞受体、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3delta、CD3 epsilon、CD3 gamma、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8alpha、CD8beta、CD96(Tactile)、CDl la、CDl lb、CDl lc、CDl ld、CDS、CEACAM1、CRTAM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fc gamma受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Ig alpha(CD79a)、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、免疫球蛋白样蛋白质、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、与CD83特异性结合的配体、LIGHT、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CDl la/CD18)、MHC I类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或其组合。
67.权利要求63至66中任一项的CAR或TCR，其中所述细胞外结构域来自或衍生自CD2、CD3 delta、CD3 epsilon、CD3 gamma、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关的alpha链)、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关的beta链)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-zeta)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、诱导性T细胞共刺激物(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2R beta、IL-2R gamma、IL-7R alpha、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fc gamma受体、MHC 1类分子、MHC 2类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、激活性NK细胞受体、Toll配体受体，及其片段或组合。
68.权利要求63至67中任一项的CAR或TCR，其中所述活化结构域来自或衍生自CD3-zeta或CD3-episilon。
69.人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段，其编码权利要求63至68中任一项的CAR或TCR。
70.载体，其包含权利要求69的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段。
71.权利要求70的载体，其中所述载体是腺病毒载体、腺病毒相关载体、DNA载体、慢病毒载体、质粒、逆转录病毒载体或RNA载体。
72.权利要求71的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体。
73.权利要求72的载体，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
74.嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其由权利要求70至73中任一项的载体编码。
75.细胞，其包含权利要求69的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段、权利要求70至73中任一项的载体或者权利要求63至67或权利要求74中任一项的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
76.权利要求75的细胞，其中所述细胞是T细胞。
77.权利要求76的细胞，其中所述T细胞是同种异体T细胞、自体T细胞、工程化自体T细胞(eACT)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
78.权利要求77的细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞。
79.权利要求77的细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
80.权利要求75至79中任一项的细胞，其中所述细胞是体外细胞。
81.权利要求76至80中任一项的细胞，其中所述T细胞是自体T细胞。
82.权利要求75至81中任一项的细胞，其中所述细胞与人CD19结合后至少产生干扰素gamma(IFNγ)。
83.组合物，其包含多个权利要求75至82中任一项的细胞。
84.权利要求83的组合物，其中所述组合物包含CD4+或CD8+细胞。
85.权利要求84的组合物，其中所述组合物包含CD4+和CD8+细胞。
86.权利要求85的组合物，其中所述T细胞的约20％和80％之间是CD4+细胞并且所述T细胞的其余部分是CD8+细胞。
87.权利要求86的组合物，其中所述T细胞的约30％和70％之间是CD4+细胞并且所述T细胞的其余部分是CD8+细胞。
88.权利要求87的组合物，其中所述T细胞的约40％和60％之间是CD4+细胞并且所述T细胞的其余部分是CD8+细胞。
89.权利要求88的组合物，其中所述T细胞的约50％是CD4+细胞并且所述T细胞的约50％是CD8+细胞。
90.权利要求85的组合物，其中所述T细胞的约20％和80％之间是CD8+细胞并且所述T细胞的其余部分是CD4+细胞。
91.权利要求90的组合物，其中所述T细胞的约30％和70％之间是CD8+细胞并且所述T细胞的其余部分是CD4+细胞。
92.权利要求91的组合物，其中所述T细胞的约40％和60％之间是CD8+细胞并且所述T细胞的其余部分是CD4+细胞。
93.权利要求77至79中任一项的组合物，其中所述多个细胞中的每个细胞是自体T细胞。
94.权利要求83至92中任一项的组合物，其中所述组合物包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
95.组合物，其包含权利要求69的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段、权利要求70至73中任一项的载体或者权利要求63至67或权利要求74中任一项的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
96.用于制造表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的方法，其包括用权利要求69的人源化抗CD19抗体或其抗原结合片段或权利要求70至67中任一项的载体转导细胞的步骤。
97.权利要求96的方法，其中所述细胞是从需要治疗的患者中分离的淋巴细胞。
98.权利要求97的方法，其中所述淋巴细胞是自然杀伤细胞、T细胞或B细胞。
99.权利要求96至98中任一项的方法，其进一步包括在促进细胞增殖和/或T细胞活化的条件下培养所述细胞的步骤。
100.权利要求96至99中任一项的方法，其进一步包括分离所期望的T细胞的步骤。
101.权利要求100的方法，其中所述分离所期望的T细胞的步骤在培养的约六天后发生。
102.权利要求101的方法，其中所述所期望的T细胞表达CD4+和/或CD8+。
103.用于治疗B细胞淋巴瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用权利要求75至82中任一项的细胞或权利要求83至95中任一项的组合物。
104.权利要求103的方法，其中所述B细胞淋巴瘤选自下组：急性淋巴母细胞白血病(ALL)、AIDS相关淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、经典霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、HHV8相关多中心Castleman病引起的大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、***边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)和瓦氏巨球蛋白血症。
105.权利要求104的方法，其中所述B细胞淋巴瘤选自下组：急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)和非霍奇金淋巴瘤。
106.权利要求105的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
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