ES2961384T3 - Derivados de GIP y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos péptidos que son derivados de análogos del polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP) que tienen una estabilidad física mejorada en solución y un perfil de acción prolongado. Más en particular, la invención se refiere a péptidos que son agonistas del receptor GIP y a su uso en el control del peso o para el tratamiento de enfermedades tales como obesidad, diabetes o esteatohepatitis no alcohólica (NASH). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de GIP y usos de los mismos
Campo técnico
La presente solicitud se refiere a derivados novedosos de análogos del polipéptido insulinotrópico dependiente de la glucosa (GIP) con mejor estabilidad física en solución y un perfil de acción prolongado, y al uso farmacéutico de los derivados de GIP.
Antecedentes de la invención
El polipéptido insulinotrópico dependiente de la glucosa (GIP, también conocido como péptido inhibidor gástrico) es una de dos incretinas endógenas y es una hormona peptídica de 42 aminoácidos liberada por las células K intestinales después de la ingestión de alimentos. GIP y la otra incretina, el Péptido similar al glucagón tipo-1 (GLP-1), son hormonas derivadas de células enteroendocrinas intestinales responsables del efecto incretina, que se estima que representa más del 70 % de la respuesta total de la insulina a un reto de glucosa oral.
Debido al efecto incretina, el receptor de GIP se convierte en un objetivo farmacológico atractivo en el tratamiento de enfermedades metabólicas tales como la obesidad y la diabetes, con agonistas del receptor de GIP, ya sea de forma independiente, en combinación con agonistas del receptor de GLP-1 o en combinación con coagonistas del receptor de GLP-1/glucagón. El propio GIP tiene una semivida plasmática corta debido a la inactivación mediada por la dipeptidil peptidasa-4 (DPP-IV) y una estabilidad física deficiente debido a una elevada tendencia a formar fibrillas en solución.
Irwin y otros. J. Med. Chem, vol. 49, núm. 3, 2006, 1047-1054 sugirió que los derivados de GIP que tienen palmitato directamente unido a la posición 16 o 37 tienen una semivida mayor en comparación con el GIP(1-42). Se describen solicitudes de patente que divulgan diferentes agonistas del receptor de GIP o y sus usos médicos potenciales, tales como, por ejemplo, los descritos en WO 2016/066744, WO 2016/034186, WO 2012/055770 y WO 2012/167744. También se estudiaron coagonistas del receptor de GIP/GLP-1 y su uso médico en, por ejemplo, WO 2013/164483 y WO 2014/192284.
Los derivados de la presente invención proporcionan novedosos análogos de GIP modificados con un perfil de acción prolongado, además de proporcionar una estabilidad mejorada.
Compendio
La invención se refiere a derivados de análogos de GIP capaces de activar el receptor de GIP humano en donde el análogo de GIP comprende la Fórmula II (SEQ ID NO: 48), en donde X<1>es Tyr o D-Tyr; X<2>es Aib, Ala o D-Ala; X<14>es Leu, Nle, Asp o Met; X<16>es Lys o Ala; X<18>es Arg o His; X<20>es Gln, Glu o Aib; X<31>es Gly o Pro; y en donde un grupo modificador se une al grupo amino épsilon de la lisina en la posición 24 de la Fórmula II. Dicho grupo modificador está definido por A-B-C-en donde A- es
A- es Quím.1
Quím. 1:
p es un número entero en el intervalo de 14-20;
en donde * denota la posición de un enlace amida que conecta A- y B-; y
B-C- es un enlazador, en donde
B- es Quím. 2
Quím. 2:
q es un número entero en el intervalo de 0-1;
r es un número entero en el intervalo de 1-3;
en donde * denota la posición del enlace amida que conecta A- y B-, y ** denota la posición de un enlace amida que conecta B- y C-; y en donde
C- se selecciona de Quím. 3 y Quím. 4
Quím. 3:
Quím. 4:
s es un número entero en el intervalo de 1-3;
t es un número entero en el intervalo de 1-4;
u es un número entero en el intervalo de 1-3;
en donde ** denota la posición del enlace amida que conecta B- y C-, y *** denota la posición de un enlace amida que conecta C- y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición 24, o una sal o amida farmacéuticamente aceptable de la misma.
La invención se refiere, además, a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos derivados de análogos de GIP y excipientes farmacéuticamente aceptables, así como también al uso médico de dichos derivados.
En un primer aspecto, la invención se refiere a derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 que son capaces de activar el receptor de GIP. En un aspecto adicional, los derivados de análogos de GIP son selectivos en la activación del receptor de GIP humano por sobre el receptor de GLP-1 humano y el receptor de glucagón humano.
Además o alternativamente, en un segundo aspecto, la invención se refiere a derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 que son activosin vivosolos o en combinación con un agonista del receptor de GLP-1.
Además o alternativamente, en un tercer aspecto, la invención se refiere a derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 con propiedades farmacocinéticas mejoradas.
Además o alternativamente, en un cuarto aspecto, la invención se refiere a derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 con estabilidad física mejorada.
Además o alternativamente, en un quinto aspecto, la invención se refiere a derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 con estabilidad química mejorada.
Descripción
La invención se refiere a derivados de análogos de GIP capaces de activar el receptor de GIP humano en donde el análogo de GIP comprende la Fórmula II (SEQ ID NO: 48), en donde X<1>es Tyr o D-Tyr; X<2>es Aib, Ala o D-Ala; X<14>es Leu, Nle, Asp o Met; X<16>es Lys o Ala; X<18>es Arg o His; X<20>es Gln, Glu o Aib; X<31>es Gly o Pro; y en donde un grupo modificador se une al grupo amino épsilon de la lisina en la posición 24 de la Fórmula II. Dicho grupo modificador está definido por A-B-C-en donde A- es
A- es Quím.1
Quím. 1:
p es un número entero en el intervalo de 14-20;
en donde * denota la posición de un enlace amida que conecta A- y B-; y
B-C- es un enlazador, en donde
B- es Quím. 2
Quím. 2:
q es un número entero en el intervalo de 0-1;
r es un número entero en el intervalo de 1-3;
en donde * denota la posición del enlace amida que conecta A- y B-, y ** denota la posición de un enlace amida que conecta B- y C-; y en donde
C- se selecciona de Quím. 3 y Quím. 4
Quím. 3:
Quím. 4:
s es un número entero en el intervalo de 1-3;
t es un número entero en el intervalo de 1-4;
u es un número entero en el intervalo de 1-3;
en donde ** denota la posición del enlace amida que conecta B- y C-, y *** denota la posición de un enlace amida que conecta C- y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición 24, o una sal o amida farmacéuticamente aceptable de la misma.
Además, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 y excipientes farmacéuticamente aceptables, así como también al uso médico de dichos derivados.
En un aspecto, la invención se refiere a derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 que son capaces de activar el receptor de GIP. En un aspecto adicional, los derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 son selectivos en la activación del receptor de GIP humano por sobre el receptor de GLP-1 humano y el receptor de glucagón humano. El término "selectivo" para el receptor de GIP por sobre el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón se refiere a derivados que presentan al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces, al menos 500 veces o al menos 1000 veces mayor potencia por el receptor de GIP que por el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón según se midein vitroen un ensayo de potencia para la función del receptor, tal como un ensayo de potencia funcional con luciferasa CRE y se compara por los valores de EC50.
Además o alternativamente, la invención se refiere a derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 que son activosin vivosolos o en combinación con un agonista del receptor de GLP-1.
Además o alternativamente, en un aspecto, la invención se refiere a derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 con propiedades farmacocinéticas mejoradas.
Además o alternativamente, en un aspecto, la invención se refiere a derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 con estabilidad física mejorada.
Además o alternativamente, en un aspecto, la invención se refiere a derivados de análogos de GIP como se define en la reivindicación 1 con estabilidad química mejorada.
En lo adelante, las letras del alfabeto griego pueden representarse por su símbolo o por el correspondiente nombre escrito, por ejemplo: a = alfa; p = beta; s = épsilon; y = gamma; o = omega; etc. Además, la letra griega de |i puede representarse por "u", por ejemplo, en |il=ul o en |iM=uM.
A menos que se indique de otra forma en la especificación, los términos que se presentan en forma singular generalmente incluyen la situación plural.
También se describen en la presente descripción derivados de análogos de GIP, composiciones farmacéuticas y usos de las mismas en los que términos abiertos como “comprende” y ”que comprende” se reemplazan por términos cerrados tales como “consiste en”, “que consiste de” y similares.
Compuesto/producto
Agonista del receptor de GIP
Un agonista de receptor puede definirse como un compuesto que se une a un receptor e induce una respuesta típica del ligando natural (ver, por ejemplo, “Principles of Biochemistry “, AL Lehninger, DL Nelson, MM Cox, segunda edición, editorial Worth, 1993, página 763).
Como se describió en la presente descripción, un “agonista del receptor de GIP” puede definirse como un compuesto que es capaz de activar el receptor de GIP.
Análogos de GIP
El término “hGIP(1-42)” como se usa en la presente se refiere al polipéptido insulinotrópico dependiente de la glucosa humano, cuya secuencia se incluye en el listado de secuencias como la SEQ ID NO: 1. El péptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 también puede designarse hGIP nativo o hGIP.
El término “hGIP(1-31)” como se usa en la presente se refiere a una versión truncada de hGIP(1-42), que comprende los aminoácidos 1-31 de hGIP(1-42), la secuencia de hGIP(1-31) se incluye en los listados de secuencias como la SEQ ID NO: 2.
El término “análogo de GIP” como se usa en la presente se refiere a un péptido o un compuesto, que es una variante de hGIP(1-31). El término “variante” se usa para péptidos que comprenden al menos una sustitución de aminoácido en comparación con hGIP(1-31) y es capaz de activar el receptor de GIP.
El término “sustitución” como se usa en la presente descripción se refiere al reemplazo de un aminoácido por otro en la cadena principal del péptido. En un aspecto, los aminoácidos pueden sustituirse mediante sustitución conservadora. El término "sustitución conservadora" como se usa en la presente descripción indica que uno o más aminoácidos se reemplazan por otro residuo biológicamente similar. Los ejemplos incluyen la sustitución de residuos de aminoácidos con características similares, por ejemplo, aminoácidos pequeños, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos básicos, aminoácidos hidrófobos y aminoácidos aromáticos. En un aspecto, los análogos de GIP de los derivados de la invención pueden comprender sustituciones de uno o más aminoácidos no naturales y/o no aminoácidos, por ejemplo, miméticos de aminoácidos, en la secuencia del análogo de GIP.
Los análogos de GIP de los derivados como se describen en la reivindicación 1 pueden describirse como referencia a i) el número del residuo de aminoácido en hGIP(1-31) o hGIP(1-42) que corresponde al residuo de aminoácido que se cambia (es decir, la posición correspondiente en hGIP(1-31) o hGIP(1-42)) y ii) al cambio real. Por ejemplo, [Lys24]-hGIP(1-31) se refiere a un análogo de GIP en el que la posición 24 de hGIP(1-31) se reemplaza por una lisina.
En un aspecto, los análogos de GIP de los derivados de la invención comprenden un residuo de lisina en la posición correspondiente a la posición 24 de hGIP(1-31) como se describió mediante la fórmula II: X-<i>-X<2>-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-X<14>-Asp-X<16>-Ile-X<18>-Gln-X<20>-Asp-Phe-Val-Lys-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-X<31>, en donde X<1>es Tyr o D-Tyr; X<2>es Aib, Ala o D-Ala; X<14>es Leu, Nle, Asp o Met; X<16>es Lys o Ala; X<18>es Arg o His; X<20>es Gln, Glu o Aib; X<31>es Gly o Pro. La fórmula II se incluye en los listados de secuencias como la SEQ ID NO: 48. En un aspecto, los análogos de GIP de los derivados de la invención pueden estar en forma de ácidos carboxílicos C-terminales o amidas.
Además o alternativamente, en un aspecto, los análogos de GIP de los derivados como se define en la reivindicación 1 comprenden una extensión C-terminal de la Fórmula II. En otro aspecto, los análogos de GIP de los derivados de la invención comprenden una extensión C-terminal descrita mediante la Fórmula III: Lys-X<33>-X<34>-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln en donde X<33>es Lys o Glu; X<34>es Asn, Glu o Asp. La extensión C-terminal se une a la Fórmula II por medio de un enlace amida desde el ácido carboxílico C-terminal de la Fórmula II al grupo amino N-terminal de la Fórmula III. La Fórmula III se incluye en los listados de secuencias como SEQ ID NO: 51.
Los análogos “que comprende” determinados cambios especificados pueden comprender otros cambios, cuando se comparan con la fórmula respectiva. En una modalidad particular, el análogo "tiene" los cambios especificados.
Como es evidente a partir de los ejemplos mencionados más arriba, los residuos de aminoácidos pueden identificarse por su nombre completo, su código de una letra y/o su código de tres letras. Estas tres maneras son totalmente equivalentes.
Las expresiones “una posición equivalente a” o "una posición correspondiente a" pueden usarse para caracterizar el sitio del cambio en una secuencia variante de GIP mediante la referencia a una secuencia dada, por ejemplo hGIP(1-31) o hGIP(1-42).
El término “péptido”, como se usa, por ejemplo, en el contexto de los análogos de GIP de los derivados de la invención, se refiere a un compuesto que comprende una serie de aminoácidos interconectados mediante enlaces amida (o peptídicos).
Los aminoácidos son moléculas que contienen un grupo amino y un grupo ácido carboxílico, y, opcionalmente, uno o más grupos adicionales, frecuentemente referidos como una cadena lateral.
El término "aminoácido" incluye aminoácidos proteinogénicos (o codificados o naturales) (entre ellos los 20 aminoácidos estándar), así como también aminoácidos no proteinogénicos (o no codificados o no naturales). Los aminoácidos proteinogénicos son aquellos que se incorporan naturalmente en las proteínas. Los aminoácidos estándar son los codificados por el código genético. Los aminoácidos no proteinogénicos o no se encuentran en las proteínas o no se producen por la maquinaria celular estándar (por ejemplo, pueden haberse sometido a modificación postraduccional). Ejemplos no limitantes de aminoácidos no proteinogénicos son Aib (ácido alfa-aminoisobutírico), Nle (norleucina), así como también los isómeros D de los aminoácidos proteinogénicos. Ejemplos no limitantes de isómeros D de un aminoácido proteinogénico son los isómeros D de tirosina o alanina, que pueden escribirse como D-Tyr o D-Ala, respectivamente.
En lo que sigue, todos los aminoácidos de los análogos de GIP de los derivados de la invención para los que no se indique el isómero óptico se entenderán referidos al isómero L (a menos que se especifique de cualquier otra manera).
Derivados de GIP
El término “derivado” como se usa en la presente descripción en el contexto de un análogo de GIP significa un análogo de GIP modificado químicamente, en el cual uno o más sustituyentes se unen covalentemente a la cadena principal del péptido.
El término “sustituyente N-terminal” o “grupo modificador” como se usa en la presente, significa una porción o grupo químico que reemplaza un átomo de hidrógeno.
En un aspecto, el derivado de un análogo de GIP como se define en la reivindicación 1 comprende un sustituyente unido covalentemente al grupo alfa-amino del residuo de aminoácido en el extremo N-terminal del análogo, por ejemplo, el sustituyente N-terminal es un grupo alcanoilo o acilo tal como un grupo acetilo. Como un ejemplo de un aminoácido N-terminal sustituido es Ac-Tyr en la posición 1.
El análogo de GIP comprende un grupo modificador unido covalentemente al residuo de aminoácido correspondiente a la posición 24 de hGIP(1-31) o hGIP(1-42), siendo el grupo modificador capaz de formar conjugados no covalentes con proteínas, por ejemplo, albúmina, lo que promueve de esta manera la circulación del derivado con el torrente sanguíneo y tiene también el efecto de prolongar el tiempo de acción del derivado debido a que el conjugado del derivado de GIP y la albúmina sólo se desintegra lentamente para liberar el ingrediente farmacéutico activo.
El grupo modificador se une covalentemente a un residuo de lisina del análogo de GIP mediante acilación, es decir por medio de un enlace amida que se forma entre un grupo ácido carboxílico del grupo modificador y el grupo amino épsilon de dicho grupo de lisina. El grupo amino de la lisina también podría acoplarse a un aldehído del grupo modificador mediante aminación reductora.
El grupo modificador se une covalentemente a la cadena lateral del grupo épsilon amino del residuo de lisina en una posición correspondiente a la posición 24 de hGIP(1-31) o hGIP(1-42) mediante acilación, es decir por medio de un enlace amida que se forma entre un grupo ácido carboxílico del grupo modificador y el grupo amino épsilon del residuo de lisina.
De acuerdo con la invención, el grupo modificador A-B-C- se une covalentemente a la cadena lateral del grupo amino épsilon de la lisina en posición 24 de la Fórmula II se define mediante A-B-C- en donde A- Quím.1
Quím. 1:
p es un número entero en el intervalo de 14-20;
en donde * denota la posición de un enlace amida que conecta A- y B-; y
B-C- es un enlazador, en donde
B- es Quím. 2
Quím. 2:
q es un número entero en el intervalo de 0-1;
r es un número entero en el intervalo de 1-3;
en donde * denota la posición del enlace amida que conecta A- y B-, y ** denota la posición de un enlace amida que conecta B- y C-; y en donde
C- se selecciona de Quím. 3 y Quím. 4
Quím. 3:
Quím. 4:
s es un número entero en el intervalo de 1-3;
t es un número entero en el intervalo de 1-4;
u es un número entero en el intervalo de 1-3;
en donde ** denota la posición del enlace amida que conecta B- y C-, y *** denota la posición de un enlace amida que conecta C- y el grupo amino épsilon de la lisina en la posición 24
En una modalidad preferida, el grupo modificador A-B-C- se selecciona del grupo que consiste en:
Quím. 5:
Quím. 6:
Quím. 8:
Quím. 10:
Quím. 11:
Quím. 12:
Quím. 13:
Quím. 14:
Quím. 15:
Quím. 16:
Quím. 17:
Quím. 18:
Los derivados como se define en la reivindicación 1, pueden existir en diferentes formas estereoisómeras que tienen la misma fórmula molecular y secuencia de átomos enlazados, pero que difieren solo en la orientación tridimensional de sus átomos en el espacio. El estereoisomerismo de los derivados ejemplificados se indica en la sección experimental, en los nombres así como también en las estructuras, mediante el uso de la nomenclatura estándar. A menos que se establezca de cualquier otra manera, la invención se refiere a todas las formas estereoisoméricas del derivado reivindicado.
Los derivados como se definen en la reivindicación 1 tienen actividad GIP. Este término se refiere a la capacidad de unirse al receptor de GIP e iniciar una trayectoria de transducción de señales que da como resultado una acción insulinotrópica u otros efectos fisiológicos como se conoce en la técnica. Por ejemplo, los derivados de la invención pueden probarse para la actividad o estabilidad de GIP mediante el uso del ensayo que se describe en los Ejemplos 1-6 en la presente descripción.
Sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable
Los derivados de la invención pueden estar en la forma de una sal o amida farmacéuticamente aceptable. Las sales se forman, por ejemplo, mediante una reacción química entre una base y un ácido, por ejemplo: 2NH<3>+ H<2>SO<4>^ (NH<4>)<2>SO<4>.
La sal puede ser una sal básica, una sal ácida, o puede no ser ninguna de estas (es decir, una sal neutra). Las sales básicas producen iones de hidróxido y las sales ácidas iones de hidronio en agua.
Las sales de los derivados de la invención pueden formarse con cationes o aniones adicionados entre grupos aniónicos o catiónicos, respectivamente. Estos grupos pueden situarse en la porción peptídica y/o en el grupo modificador de los derivados de la invención.
Los ejemplos no limitantes de grupos aniónicos de los derivados de la invención incluyen grupos carboxílicos libres en la cadena lateral, si los hay, así como también en la porción peptídica. La porción peptídica incluye frecuentemente un grupo de ácido carboxílico libre en el C-terminal, y también puede incluir grupos carboxílicos libres en los residuos de aminoácidos ácidos internos tales como Asp y Glu.
Los ejemplos no limitantes de grupos catiónicos en la porción peptídica incluyen el grupo amino libre en el N-terminal, si se presenta, así como también cualquier grupo amino libre de residuos de aminoácidos básicos internos tales como His, Arg y Lys.
La amida de los derivados de la invención puede formarse, por ejemplo, mediante la reacción de un grupo de ácido carboxílico libre con una amina o una amina sustituida, o mediante la reacción de un grupo amino libre o sustituido con un ácido carboxílico.
La formación de amida puede implicar el grupo carboxílico libre en el C-terminal del péptido, cualquier grupo carboxílico libre en la cadena lateral, el grupo amino libre en el N-terminal del péptido, y/o cualquier grupo amino libre o sustituido del péptido en el péptido y/o la cadena lateral.
En un aspecto, el derivado de la invención tiene forma de una sal farmacéuticamente aceptable, preferentemente en la forma de una sal de sodio. Además o alternativamente, en un aspecto, el derivado de la invención tiene forma de una amida farmacéuticamente aceptable, preferentemente con un grupo amida en el extremo C-terminal del péptido.
Propiedades funcionales
En un primer aspecto funcional, los derivados de la invención tienen una buena potencia en el receptor de GIP. Preferentemente, son potentes agonistas del receptor de GIP, como lo refleja su capacidad para activar el receptor de GIP. Además o alternativamente, un segundo aspecto funcional, tiene un efectoin vivosobre el peso corporal, la ingestión de alimentos y la tolerancia a la glucosa tanto solos como en combinación con un agonista del receptor de GLP-1. Además, o alternativamente, en un tercer aspecto funcional, tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas. Además, o alternativamente, en un cuarto aspecto funcional, los derivados de la invención son físicamente estables. Además, o alternativamente, en un quinto aspecto funcional, los derivados de la invención son químicamente estables.
Actividad biológica - potencia in vitro
De acuerdo con el primer aspecto funcional, los derivados de la invención son biológicamente activos, o potentes en el receptor de GIP humano.
En una modalidad, la potencia y/o actividad se refiere a potenciain vitro,es decir, rendimiento en un ensayo de receptor de GIP funcional, más en particular a la capacidad de activar el receptor de GIP humano.
La potenciain vitropuede determinarse, por ejemplo, en un medio que contiene membranas que expresan el receptor de GIP humano, y/o en un ensayo con células completas que expresan el receptor de GIP humano. Por ejemplo, la respuesta del receptor de GIP humano puede medirse en un ensayo de gen reportero, por ejemplo en una línea celular BHK transfectada de forma estable que expresa el receptor de GIP humano y contiene el ADN para el elemento de respuesta a AMPc (CRE) acoplado a un promotor y al gen para la luciferasa de luciérnaga (luciferasa CRE). Cuando el AMPc se produce como resultado de la activación del receptor de GIP esto a su vez da como resultado que la luciferasa se exprese. La luciferasa puede determinarse mediante la adición de luciferina, que mediante la enzima se convierte en oxiluciferina y produce bioluminiscencia, que se mide y es una medida de la potenciain vitro.Un ejemplo no limitante de un ensayo de este tipo se describe en el Ejemplo 2 como se describió en la presente descripción.
El término concentración efectiva semimáxima (EC<50>) se refiere generalmente a la concentración que induce la mitad de una respuesta entre el valor basal y el máximo, en referencia a la curva de respuesta a la dosis. La EC<50>se usa como una medida de la potencia de un compuesto y representa la concentración en donde se observa el 50 % de su efecto máximo.
La potenciain vitrode los derivados de la invención puede determinarse como se describió anteriormente, y determinarse la EC<50>del derivado en cuestión. A menor valor de EC<50>, mejor será la potencia.
En otra modalidad particular, el derivado de la invención tiene una potenciain vitroque se determina mediante el uso del método del Ejemplo 2 correspondiente a una EC<50>de o más abajo de 5000 pM, con mayor preferencia más abajo de 900 pM, aún con mayor preferencia más abajo de 500 pM, o con la máxima preferencia más abajo de 200 pM.
En otra modalidad particular, los derivados de la invención son capaces de activar el receptor de GIP selectivamente sobre el receptor de GLP-1 humano y el receptor de glucagón humano. El término "selectivamente" cuando se usa en relación con la activación del receptor de GIP por sobre el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón se refiere a los derivados que muestran al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces, al menos 500 veces o al menos 1000 veces mejor potencia por el receptor de GIP que por el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón según se midein vitroen un ensayo de potencia para la función del receptor, tal como un ensayo de potencia funcional con luciferasa CRE y se compara por los valores de EC<50>. El término “mejor potencia” de los derivados de la invención en el receptor de GIP por sobre el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón se determina por la relación de los valores de EC<50>en el receptor de GLP-1 frente al receptor de GIP o el receptor de glucagón frente al receptor de GIP, respectivamente.
Actividad biológica - farmacología in vivo
De acuerdo con un segundo aspecto funcional, los derivados de GIP de la invención, así como también los análogos de GIP constituyentes tales como [Lys24]-hGIP(1-31) o análogos de los mismos, son potentesin vivo,lo que puede determinarse como se conoce en la técnica en cualquier modelo animal adecuado, así como también en ensayos clínicos.
El ratón obeso inducido por dieta (DIO) es un ejemplo de un modelo animal adecuado, y el efecto sobre el peso corporal, la ingestión de alimentos y la tolerancia a la glucosa pueden evaluarse durante la dosificación subcrónica en este modelo. El efecto de los derivados de GIP de la invención sobre el peso corporal, la ingestión de alimentos y la tolerancia a la glucosa puede determinarse en dichos ratonesin vivo,por ejemplo, como se describió en el Ejemplo 6 en la presente descripción. La ingestión de alimentos puede evaluarse mediante el alojamiento individual de animales y el pesaje de los alimentos consumidos por día. Este modelo también puede ser usado para evaluar los efectos sobre la tolerancia a la glucosa mediante la realización de una prueba de tolerancia a la glucosa oral o i.p. (OGTT o IPGTT). Estas pruebas se realizan mediante la administración de una carga de glucosa por vía oral o i.p. a animales semidesnutridos y subsecuentemente se mide la glucosa en sangre durante hasta tres horas.
Perfil farmacocinético
De acuerdo con el tercer aspecto funcional, los derivados de la invención tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas tales como una vida media terminal aumentada.
El aumento de la vida media terminal significa que el compuesto en cuestión se elimina más lentamente del cuerpo. Para los derivados de la invención esto implica una duración extendida del efecto farmacológico. Las propiedades farmacocinéticas de los derivados de la invención pueden determinarse adecuadamentein vivoen estudios farmacocinéticos (PK). Tales estudios se realizan para evaluar cómo los compuestos farmacéuticos se absorben, distribuyen y eliminan en el cuerpo, y cómo estos procesos afectan la concentración del compuesto en el cuerpo, en el transcurso del tiempo.
En el descubrimiento y la fase preclínica del desarrollo farmacéutico de fármacos, los modelos animales tales como el ratón, rata, mono, perro, o cerdo, pueden usarse para realizar esta caracterización. Cualquiera de estos modelos puede usarse para probar las propiedades farmacocinéticas de los derivados de la invención. En tales estudios, a los animales se les administra típicamente una única dosis del fármaco, ya sea por vía intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.) u oral (p.o.) en una formulación relevante. Se extraen las muestras de sangre en puntos temporales predefinidos después de la administración de la dosis, y las muestras se analizan para determinar la concentración del fármaco con un ensayo cuantitativo relevante. En base a estas mediciones, los perfiles de concentración plasmática en el tiempo para el compuesto de estudio se grafican y se realiza el denominado análisis farmacocinético no compartimental de los datos.
Para la mayoría de los compuestos, la parte terminal de los perfiles de concentración plasmática será lineal cuando se trazan en un gráfico semilogarítmico, lo que refleja que después de la absorción inicial y la distribución, el fármaco se elimina del cuerpo a una velocidad fraccionaria constante. La velocidad (lambda Z o Xz) es igual a menos la pendiente de la parte terminal de la gráfica. A partir de esta velocidad, también puede calcularse una vida media terminal, como t^ = ln(2) / Xz (ver, por ejemplo, Johan Gabrielsson y Daniel Weiner: Pharmacokinetics and Pharmacodynamic Data Analysis. Concepts & Applications, 3ra Ed., Swedish Pharmaceutical Press, Estocolmo (2000)).
El aclaramiento puede determinarse después de la administración i.v. y se define como la dosis (D) dividida por el área bajo la curva (AUC) en el perfil de concentración plasmática frente al tiempo (Rowland, M y Tozer TN: Clinical Pharmacokinetics: Concepts and Applications, 3ra edición, 1995 Williams Wilkins).
El cálculo de la vida media terminal y/o el aclaramiento es relevante para la evaluación de regímenes de dosificación y es un parámetro importante en el desarrollo farmacéutico, en la evaluación de nuevos compuestos farmacológicos.
Perfil farmacocinético - vida mediain vivoen minicerdos
De acuerdo con el tercer aspecto funcional, los derivados de la invención tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas.
En una modalidad particular, las propiedades farmacocinéticas pueden determinarse como la vida media terminal (ty2)in vivoen minicerdos después de la administración i.v., por ejemplo, como se describió en el Ejemplo 3 en la presente descripción.
En modalidades particulares, el tiempo de vida media terminal en minicerdos es al menos 24 horas, preferentemente al menos 40 horas, aún con mayor preferencia al menos 60 horas.
Propiedades físicas
De acuerdo con el cuarto aspecto funcional, el derivado de la invención tiene una estabilidad física mejorada en solución. El término “estabilidad física” se refiere a la tendencia del polipéptido a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles, por ejemplo, fibrillas o geles amiloides.
En una modalidad particular, la estabilidad física mejorada puede determinarse mediante la medición del tiempo de retardo y/o la recuperación en un ensayo de fibrilación con Tioflavina T (ThT), por ejemplo, como se describió en el Ejemplo 4 en la presente descripción.
En otra modalidad particular adicional, el derivado de la invención tiene más de 70 por ciento de recuperación en un ensayo de fibrilación con ThT, preferentemente más de 90 por ciento de recuperación, aún con mayor preferencia más de 95 por ciento de recuperación, o con la máxima preferencia más de 98 por ciento de recuperación, tal como se muestra en el Ejemplo 4 descrito en la presente descripción.
En una modalidad particular adicional, el derivado de la invención tiene un tiempo de retardo en el ensayo de fibrilación con ThT de más de 10 horas, preferentemente, más de 20 horas, aún con mayor preferencia, más de 45 horas, tal como se muestra en el Ejemplo 4 descrito en la presente descripción.
En una modalidad particular, la estabilidad física mejorada puede determinarse mediante el ensayo del índice de estabilidad de Dispersión Dinámica de la Luz (DLS-SI), por ejemplo, como se describió en el Ejemplo 4 en la presente descripción.
En una modalidad particular adicional, el derivado de la invención tiene un valor de DLS-SI bajo en un ensayo DLS-SI, preferentemente, menos de 7, con mayor preferencia, menos de 2, tal como se muestra en el Ejemplo 4 en la presente descripción.
En una modalidad particular adicional, el derivado de la invención muestra poca o ninguna precipitación en un ensayo DLS-SI, preferentemente, ninguna precipitación, tal como se muestra en el Ejemplo 4 en la presente descripción.
Propiedades químicas
De acuerdo con el quinto aspecto funcional, los derivados de la invención tienen una estabilidad química mejorada. El término “estabilidad química” se refiere a cambios químicos (en particular covalentes) en la estructura polipeptídica que conducen a la formación de productos de degradación química, tales como proteínas de alto peso molecular (HMWP), desamidación, isomerización y productos de hidrólisis que tienen potencialmente una potencia biológica reducida, y/o efecto inmunogénico aumentado en comparación con el polipéptido intacto.
En una modalidad particular, la estabilidad química mejorada puede determinarse mediante la medición del contenido de HMWP y/o la pérdida de pureza, al medir la cantidad de productos de degradación química en diversos puntos temporales después de la exposición a diferentes condiciones ambientales, por ejemplo, mediante SEC-HPLC y/o LCMS, por ejemplo, como se describió en el Ejemplo 5 en la presente descripción. En otra modalidad particular adicional, el derivado de la invención tiene una pérdida de pureza por mes de menos del 35 por ciento, preferentemente menos del 15 por ciento, con mayor preferencia menos del 7 por ciento, tal como se muestra en el Ejemplo 5 descrito en la presente descripción.
En otra modalidad particular adicional, el derivado de la invención tiene una formación de HMWP por mes de menos del 4 por ciento, preferentemente menos del 2 por ciento, con mayor preferencia menos del 1 por ciento, tal como se muestra en el Ejemplo 5 descrito en la presente descripción.
Procesos de producción
La producción de péptidos como los análogos de hGIP(1-31) y de hGIP se conoce bien en la técnica.
Los análogos de GIP de los derivados de la invención (o fragmentos de los mismos), tal como [Lys24]-hGIP(1-31) o un análogo o fragmento del mismo, pueden producirse, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos clásica, por ejemplo, síntesis de péptidos en fase sólida mediante el uso de química t-Boc o Fmoc u otras técnicas bien establecidas, véase, por ejemplo, Greene y Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, “Organic Synthesis on solid Phase”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, y “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, Editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000.
También, o alternativamente, pueden producirse mediante métodos recombinantes, respectivamente, mediante el cultivo de una célula hospedera que contiene una secuencia de ADN que codifica el análogo y es capaz de expresar el péptido en un medio de nutrientes adecuado bajo condiciones que permiten la expresión del péptido. Los ejemplos de células hospederas adecuadas para la expresión de estos péptidos no limitantes son: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, así como también líneas celulares de mamíferos BHK o CHO. Los derivados de la invención que incluyen aminoácidos no naturales y/o un mono- o dipéptido mimético N-terminal unido covalentemente pueden producirse, por ejemplo, como se describió en la parte experimental. O véase, por ejemplo, Hodgson y otros: "The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, núm. 7 (2004), p. 422-430.
Los ejemplos específicos de métodos para preparar un número de derivados de la invención se incluyen en la parte experimental.
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones inyectables que comprenden derivados de la presente invención pueden prepararse mediante el uso de las técnicas convencionales de la industria farmacéutica que implican disolver y mezclar los ingredientes según sea adecuado para obtener el producto final deseado. Por lo tanto, de acuerdo con un procedimiento, un derivado de esta invención se disuelve en un tampón adecuado a un pH adecuado para minimizar o evitar la precipitación. La composición inyectable se esteriliza, por ejemplo, mediante esterilización por filtración.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden un derivado de la invención o una sal o amida farmacéuticamente aceptables de la misma y un excipiente farmacéuticamente aceptable pueden prepararse como se conoce en la técnica.
El término "excipiente" se refiere en un sentido amplio a cualquier componente además del (de los) ingrediente(s) terapéutico(s) activo(s). El excipiente puede ser una sustancia inerte, una sustancia inactiva, y/o una sustancia no activa medicinalmente.
En la técnica se conoce la formulación de ingredientes activos farmacéuticamente con diversos excipientes, véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo, 19na edición (1995) y cualquiera de las ediciones posteriores).
Una composición puede ser una formulación estabilizada. El término “formulación estabilizada” se refiere a una formulación con estabilidad física y/o química aumentada, preferentemente ambas. En general, una formulación debe ser estable durante el uso y el almacenamiento (de conformidad con el uso recomendado y las condiciones de almacenamiento) hasta que se alcance la fecha de vencimiento.
El tratamiento con un derivado de acuerdo con la presente invención también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas adicionales, por ejemplo seleccionadas entre agonistas del receptor de GLP-1 o coagonistas del receptor de GLP-1/glucagón.
En un aspecto de la invención, el derivado de la invención se combina con un agonista del receptor de GLP-1. Los compuestos pueden suministrarse en una forma de dosificación única, en donde la forma de dosificación única contiene ambos compuestos, o en forma de un kit de partes que comprende una preparación del derivado de la invención como una primera forma de dosificación unitaria y una preparación del agonista del receptor de GLP-1 como una segunda forma de dosificación unitaria.
Ejemplos de agonistas del receptor de GLP-1 no limitantes a combinarse con el derivado de la presente invención son liraglutida, semaglutida, exenatida, dulaglutida, lixisenatida, taspoglutida y albiglutida. La semaglutida es un agonista del receptor de GLP-1 que puede prepararse como se describió en WO2006/097537, Ejemplo 4 y se conoce también como N626-{18-[N-(17-carboxiheptadecanoil)-L-Y-glutamil]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaoctadecanoil}-[8-(ácido 2-amino-2-propanoico), 34-L-arginina]péptido humano similar al glucagón 1(7-37), véase WHO Drug Information Vol. 24, Núm. 1, 2010 (SEQ ID NO: 57). Ejemplos de coagonistas del receptor de GLP-1/glucagón no limitantes se describen en WO 2014/170496, por ejemplo, véase la presente SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55 o 56.
Indicaciones farmacéuticas
La presente invención se refiere, además, a un derivado de un análogo de GIP, para usar como un medicamento. Las referencias a métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía o métodos de diagnóstico in vivo en los ejemplos de esta descripción deben interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas de la invención para su uso en dichos métodos.
En modalidades particulares, el derivado de la invención puede usarse para los siguientes tratamientos médicos:
(i) prevención y/o tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de aparición en la madurez de los jóvenes), diabetes gestacional y/o para la reducción de HbA1C;
(ii) el retardo o la prevención de la progresión de la enfermedad diabética, tal como la progresión en la diabetes tipo 2, el retardo de la progresión de la intolerancia a la glucosa (IGT) a diabetes tipo 2 que requiere insulina, el retardo o prevención de la resistencia a la insulina y/o el retardo de la progresión de la diabetes tipo 2 que no requiere insulina a diabetes tipo 2 que requiere insulina;
(iii) prevención y/o tratamiento de trastornos alimentarios, tales como obesidad, por ejemplo, mediante la disminución de la ingestión de alimentos, la disminución del peso corporal, la supresión del apetito, la inducción de la saciedad; el tratamiento o prevención del trastorno por atracón, la bulimia nerviosa y/o la obesidad inducida por la administración de un antipsicótico o un esteroide; la disminución de la motilidad gástrica; el retraso del vaciamiento gástrico; el aumento de la movilidad física y/o la prevención y/o tratamiento de comorbilidades de la obesidad, tales como osteoartritis y/o incontinencia de la orina;
(iv) mantener el peso después de una pérdida de peso exitosa (ya sea inducida por fármacos o por dieta y ejercicio) - es decir, prevenir el aumento de peso después de una pérdida de peso exitosa.
(v) prevención y/o tratamiento de trastornos hepáticos, tales como esteatosis hepática, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), inflamación del hígado o hígado graso.
En una modalidad particular, la indicación es diabetes tipo 2 y/u obesidad.
En algunas modalidades la invención se refiere a un método para controlar el peso. En algunas modalidades la invención se refiere a un método para reducir el apetito. En algunas modalidades la invención se refiere a un método para reducir la ingestión de alimentos.
Generalmente, todos los sujetos que padecen de obesidad se considera, además, que sufren de sobrepeso. En algunas modalidades, la invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención de la obesidad. En algunas modalidades la invención se refiere al uso del derivado de la presente invención para el tratamiento o prevención de la obesidad. En algunas modalidades el sujeto que padece de obesidad es humano, tal como un humano adulto o un humano pediátrico (que incluye lactantes, niños, y adolescentes). El índice de Masa Corporal (IMC) es una medida de la grasa del cuerpo basada en la altura y el peso. La fórmula para su cálculo es IMC = peso en kilogramos/altura en metros2. Un sujeto humano que padece de obesidad puede tener un IMC de >30; este sujeto puede referirse, además, como obeso. En algunas modalidades el sujeto humano que padece de obesidad puede tener un IMC de >35 o un IMC en el intervalo de >30 a <40. En algunas modalidades la obesidad es obesidad severa u obesidad mórbida, en donde el sujeto humano puede tener un IMC de >40. En algunas modalidades, la invención se refiere a un método para el tratamiento o la prevención del sobrepeso, opcionalmente en presencia de al menos una comorbilidad relacionada con el peso. En algunas modalidades la invención se refiere al uso del derivado de un análogo de GIP para el tratamiento o la prevención del sobrepeso, opcionalmente en presencia de al menos una comorbilidad relacionada con el peso. En algunas modalidades, el sujeto que padece de sobrepeso es un ser humano, tal como un ser humano adulto o un ser humano pediátrico (lo que incluye lactantes, niños, y adolescentes). En algunas modalidades un sujeto humano que padece de sobrepeso puede tener un IMC de >25, tal como un IMC de >27. En algunas modalidades un sujeto humano que padece de sobrepeso tiene un IMC en el intervalo de 25 a <30 o en el intervalo de 27 a <30. En algunas modalidades la comorbilidad relacionada con el peso se selecciona del grupo que consiste en hipertensión, diabetes (tal como diabetes tipo 2), dislipidemia, colesterol alto y apnea obstructiva del sueño. En algunas modalidades, la invención se refiere a un método para la reducción del peso corporal. En algunas modalidades la invención se refiere al uso del derivado de un análogo de GIP para la reducción del peso corporal. Un humano sujeto a disminución del peso corporal de acuerdo con la presente invención puede tener un IMC de >25, tal como un IMC de >27 o un IMC de >30. En algunas modalidades el ser humano que va a someterse a una reducción del peso corporal de acuerdo con la presente invención puede tener un IMC de >35 o un IMC de >40. El término “reducción del peso corporal” puede incluir el tratamiento o la prevención de la obesidad y/o el sobrepeso.
Ejemplos
Esta parte experimental comienza con una lista de abreviaturas y le continúa una sección que incluye los métodos generales para sintetizar y caracterizar los análogos y derivados de la invención. A continuación, una serie de ejemplos que se relacionan con la preparación de derivados específicos de la invención, y al final se incluyen una serie de ejemplos relacionados con la actividad y las propiedades de estos análogos y derivados (sección titulada métodos farmacológicos).
Los ejemplos sirven para ilustrar la invención.
Materiales y métodos
Lista de abreviaturas
Las siguientes abreviaturas se usan en lo adelante, en orden alfabético:
Ac: acetil
Ado: ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico
Aib: ácido alfa-aminoisobutírico
AUC: Área bajo la curva
BHK: Riñón de Hámster Recién Nacido
Boc: f-butiloxicarbonilo
BW: peso corporal
DCC: N,N'-diciclohexilcarbodiimida
DCM: diclorometano
DIC: diisopropilcarbodiimida
DIO: obesidad inducida por la dieta
DIPEA: W,W-diisopropiletilamina o base de Hünig
DLS-SI: Índice de Estabilidad de Dispersión Dinámica de la Luz DMEM: Medio de Eagle modificado de Dulbecco
DMF: dimetil formamida
DODT: 3,6-dioxa-1,8-octanoditiol
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
ELISA: Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas
FBS: Suero Fetal Bovino
Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo
GIP: polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa
GLP-1: péptido similar al glucagón 1
HFIP: 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol o hexafluoroisopropanol HMWP: Proteína de Alto Peso Molecular
HOBt: 1-hidroxibenzotriazol
HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento
HSA: Albúmina Sérica Humana
ip.:intraperitoneal
IPGTT: prueba intraperitoneal de tolerancia a la glucosa
i.v. por vía intravenosa
kcal: kilocaloría
kg: kilogramo
LCMS: Cromatografía líquida acoplada a espectroscopia de masas MeCN: acetonitrilo
mM: milimolar
Mtt: 4-metiltritilo
Nle: norleucina
NMP: N-metil pirrolidona
Oxyma Pure®: Éster etílico de ácido ciano-hidroxiimino-acético
PBS: Solución salina tamponada con fosfato
PK: farmacocinética
pM: picomolar
QTof: Tiempo de Vuelo Cuantitativo
Rh: Radio de Stokes
s.c.: por vía subcutánea
SD: Desviación estándar
SEC-HPLC: Cromatografía líquida de alto resolución con exclusión por tamaño
SEC-MS: Espectrometría de masas por cromatografía de exclusión por tamaño
SEM: Error estándar de la media
tBu:f-butilo
TFA: ácido trifluoroacético
ThT: Tioflavina T
TIS: triisopropilsilano
Trt: trifenilmetilo (tritilo)
Trx: ácido tranexámico
UPLC: Cromatografía líquida de ultra alto rendimiento
Métodos generales de preparación
Esta sección se refiere a métodos para la síntesis de péptidos en fase sólida (métodos de SPPS, que incluyen métodos para la desprotección de aminoácidos, métodos para escindir el péptido de la resina, y para su purificación), así como también métodos para detectar y caracterizar el péptido resultante (métodos de LCMS). Las resinas empleadas para la preparación de amidas peptídicas C-terminales fueron la resina PAL Amida AM (que carga por ejemplo 0,6 mmol/g) o la resina H-Rink Amida-ChemMatrix (que carga por ejemplo 0,5 mmol/g) o la resina de poliestireno Rink Amida AM (que carga por ejemplo 0,3-0,7 mmol/g). La resina empleada para la preparación de glicil-ácidos peptídicas C-terminales fue la resina de poliestireno de Fmoc-Gly-Wang (que carga por ejemplo 0,3-0,7 mmol/g).
Los derivados de aminoácidos protegidos con Fmoc que se usaron, a menos que se indique específicamente de cualquier otra manera, fueron los estándares recomendados: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH (en caso del método SPPS_A y SPPS_D) o Fmoc-Trp-OH (en caso de los métodos SPPS_B y SPPS_C), Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-D-Tyr-(tBu)-OH, etcétera, suministrados por ejemplo por AAPPTEC, Anaspec, Bachem, ChemImpex, Iris Biotech, Midwest Biotech, Gyros Protein Technologies o Novabiochem. Donde no se especifica nada más se usa la forma L natural de los aminoácidos. Cuando el aminoácido N-terminal no estaba acetilado, el aminoácido N-terminal se protegía con Boc en el grupo alfa amino, ya sea mediante el uso de un reactivo con el grupo Boc preinstalado (por ejemplo Boc-Tyr(tBu)-OH para los péptidos con Tyr en el N-terminal) o bien intercambiando el grupo protector Fmoc N-terminal por el grupo protector Boc tras la instalación del aminoácido en el N-terminal del péptido.
En caso de la unión modular de una porción de unión a albúmina mediante el uso de SPPS, se usaron los siguientes bloques estructurales adecuadamente protegidos tales como, pero sin limitarse a, Fmoc-ácido-8-amino-3,6-dioxaoctanoico (Fmoc-Ado-OH), Fmoc-ácido tranexámico (Fmoc-Trx-OH), Fmoc-Glu-OtBu, éster mono-ferc-butílico del ácido octadecanodioico, éster mono-ferc-butílico del ácido nonadecanodioico, éster mono-ferc-butílico del ácido eicosanodioico, éster mono-ferc-butílico del ácido tetradecanodioico o ésterferc-butílico del ácido 4-(9-carboxinoniloxi) benzoico. Todas las operaciones indicadas más abajo se realizaron dentro de un intervalo de escala de síntesis de 100-450 pmol.
Síntesis de la cadena principal protegida unida a la resina
Método: SPPS_A
SPPS se realizó mediante el uso de química basada en Fmoc en un sintetizador de péptidos en fase sólida SymphonyX de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 Estados Unidos). La desprotección Fmoc se logró con piperidina al 20%en DMF, que contenía Oxyma Pure® 0,1 M. Los acoplamientos de los péptidos se realizaron mediante el uso de DIC/Oxyma Pure®. Se añadieron a la resina soluciones de aminoácido/Oxyma Pure® (0,3 M/0,3 M en DMF en un exceso molar de 4-8 veces) seguidas del mismo equivalente molar de DIC (1,5 M en DMF) y colidina (1,5 M en DMF). El ensamble por etapas se realizó mediante el uso de las siguientes etapas: 1) pre-inflado de la resina con DCM y DMF; 2) desprotección Fmoc mediante el uso de piperidina al 20 % en DMF que contiene Oxyma Pure® 0,1 M durante dos tratamientos de 10 minutos cada uno; 3) lavados con DMF para eliminar la piperidina; 4) acoplamiento de Fmoc-aminoácido con 4-8 equivalentes de Fmocaminoácido como solución 0,3 M en Oxyma Pure® 0,3 M en DMF mezclado con un volumen equimolar de DIC y colidina durante 1-2 horas; 5) lavados con DMF para eliminar el exceso de reactivos; 6) lavado final con DCM para la terminación del ensamblaje. Para los péptidos que portan acetilación N-terminal, la resina peptidil desprotegida con Fmoc se trató con anhídrido acético 1 M en DMF durante 30-60 minutos, y después se lavó con DMF y DCM.
Método: SPPS_B
La resina peptidil protegida se sintetizó de acuerdo con la estrategia Fmoc en un sintetizador de péptidos en fase sólida 431A de Applied Biosystems mediante el uso de los protocolos generales para Fmoc suministrados por el fabricante. La mezcla se llevó a cabo mediante agitación con vórtex y burbujeo ocasional con nitrógeno. El ensamble por etapas se realizó mediante el uso de las siguientes etapas: 1) desprotección del Fmoc mediante el uso de piperidina al 20 % en NMP durante un tratamiento de 3 minutos seguido por un tratamiento de 15 minutos; 2) lavados con NMP para eliminar la piperidina; 3) acoplamiento de Fmoc-aminoácido con 5-10 equivalentes de Fmoc-aminoácido, DIC y HOBt en NMP durante 45-90 minutos; 4) lavados con NMP para eliminar el exceso de reactivos; 5) lavados finales con DCM para la terminación del ensamble. Los derivados de aminoácidos protegidos estándar que se mencionaron anteriormente se suministraron en cartuchos pesados previamente (por ejemplo de Midwest Biotech), y los derivados no estándar se pesaron manualmente. Algunos aminoácidos tales como, pero sin limitarse a, los que siguen a un aminoácido con impedimento estérico (por ejemplo Aib) se “acoplaron doblemente” para garantizar la terminación de la reacción, lo que significa que después del primer acoplamiento (por ejemplo 45 minutos) la resina se drena, se añaden más reactivos (Fmocaminoácido, DIC, HOBt) y la mezcla se deja reaccionar de nuevo (por ejemplo 45 minutos). Para los péptidos que portan acetilación N-terminal, la resina peptidil desprotegida con Fmoc se retiró del sintetizador y se trató manualmente con anhídrido acético 10 % (v/v)/piridina 10 % (v/v) en DMF durante 30-60 minutos, después se lavó con DMF y DCM.
Método: SPPS_C
La resina peptidil protegida se sintetizó de acuerdo con la estrategia Fmoc en un sintetizador de péptidos en fase sólida Protein Technologies SymphonyX mediante el uso de protocolos suministrados por el fabricante con modificaciones menores. El ensamble por etapas se realizó sobre una base de 0,2 mmol mediante el uso de las siguientes etapas: 1) pre-inflado de la resina en DMF (3x8 ml durante 15 minutos cada uno); 2) desprotección Fmoc mediante el uso de piperidina al 20 % (v/v) en DMF (2x8 ml durante 10 minutos cada uno); 3) lavados con DMF para eliminar la piperidina (5x6 ml); 4) acoplamiento de Fmoc-aminoácido mediante adición de una mezcla de Fmoc-aminoácido (12 equivalentes, 2,4 mmol) y Oxyma Pure ® (12 equivalentes, 2,4 mmol) como una solución de 0,6 M en DMF (4 ml), seguido por la adición de DIC (12 equivalentes, 2,4 mmol) como una solución de 1,2 M en DMF (2 ml), y adición de DMF adicional (2 ml), después se mezcla durante 0,5-4 horas; 4) lavados con DMF para eliminar los reactivos en exceso (3x6 ml); 5) lavado final con DCM en la terminación del ensamblaje. Algunos aminoácidos tal como, pero sin limitarse a, los que le siguen a un aminoácido con impedimento estérico (por ejemplo Aib) se acoplaron con un tiempo de reacción prolongado (por ejemplo, 4 horas) para garantizar la terminación de la reacción. Para los péptidos que portan acetilación N-terminal, o para los péptidos que necesitaron instalación de un grupo protector N-terminal antes del ensamble de la cadena lateral (por ejemplo intercambio de Fmoc por el grupo protector Boc), el grupo Fmoc N-terminal se eliminó mediante tratamiento con piperidina al 20 % (v/v) en DMF como se describió anteriormente en la etapa 2. Después la resina peptidil se retiró del sintetizador y se trató manualmente con anhídrido acético al 10 % (v/v)/DIPEA al 10 % (v/v) en DMF durante 30-60 minutos, luego se lavó con DMF y DCM.
Método: SPPS_D
La resina peptidil protegida se sintetizó de acuerdo con la estrategia Fmoc en un sintetizador de péptidos en fase sólida Prelude (Protein Technologies, Tucson, Estados Unidos) mediante el uso de los protocolos de la máquina suministrados por el fabricante. El acoplamiento se realizó mediante el uso de acoplamientos mediados por DCC y Oxyma Pure ® (Merck, Novabiochem, Suiza) en NMP. El acoplamiento del Fmocaminoácido se realizó como se describió anteriormente mediante el uso de exceso de 4-8 veces de aminoácido con relación a la sustitución de la resina (4-8 equivalentes). El tiempo de acoplamiento varió de 1-6 horas. El Fmoc-Arg(pbf)-OH se acopló mediante el uso de un procedimiento de doble acoplamiento (1 hora 1 hora). El ensamble en fase sólida por etapas en el Prelude se realizó mediante el uso de las siguientes etapas: 1) desprotección (eliminación de Fmoc) mediante el uso de piperidina al 25 % en NMP durante 2x4 minutos, etapa 2) lavado (eliminación de piperidina) con NMP y DCM, etapa 3) acoplamiento de Fmoc-aminoácido (Fmocaminoácido 0,3 M en Oxyma Pure® 0,3 M en NMP) 4-8 equivalentes en exceso durante 1-4 horas acoplamiento que se inicial al añadir 1/10 de volumen de DCC 3 M en NMP y 1/10 de volumen de colidina en NMP. La mezcla se realizó mediante burbujeo ocasional con nitrógeno, etapa 4) Lavado (eliminación del exceso de aminoácido y reactivos mediante el uso de NMP y DCM). La última etapa incluyó el lavado con DCM que volvió a la resina lista para la unión de un grupo modificador en la cadena lateral de la lisina.
Unión de las cadenas laterales a la cadena principal peptídica protegida unida a la resina
Método: SC_A
El grupo de protección Mtt para N-épsilon-lisina se eliminó mediante el lavado de la resina con HFIP/TIS/DCM (75:2,5:22,5, v/v/v) (1 x 5 minutos y 2 x 20 minutos) antes de lavar con piperidina, DMF y DCM.
La acilación se realizó en un sintetizador de péptidos en fase sólida SymphonyX de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 EE. UU.) como se describió en el método SPPS_A mediante el uso de la adición por etapas de bloques estructurales tales como, pero no limitados a, Fmoc-ácido-8-amino-3,6-dioxaoctanoico (Fmoc-Ado-OH), Fmoc-Glu-OtBu, Fmoc-ácido tranexámico (Fmoc-Trx-OH). La introducción de la porción de ácido graso se logró mediante el uso del método SPPS_A y un bloque estructural adecuado, tal como, pero no limitado a, éster mono-ferc-butílico del ácido octadecanodioico o éster mono-ferc-butílico del ácido eicosanodioico. Método: SC_B
El grupo de protección Mtt para N-épsilon-lisina se eliminó mediante lavado de la resina con HFIP al 30 % en DCM con dos tratamientos de 45 minutos cada uno, seguido de un lavado con DCM y DMF.
La acilación se realizó en un sintetizador de péptidos en fase sólida Applied Biosystems 431A mediante el uso de los protocolos descritos en el método SPPS_B mediante el uso de la adición por etapas de bloques estructurales, tales como, pero no limitado a, Fmoc-ácido-8-amino-3,6-dioxaoctanoico, Fmoc-ácido tranexámico, Fmoc-Glu-OtBu, éster mono-ferc-butílico del ácido octadecanodioico, éster mono-ferc-butílico del ácido eicosanodioico.
Método: SC_C
El grupo protector Mtt para N-épsilon-lisina se eliminó mediante el lavado de la resina con HFIP al 30 % (v/v) en DCM con dos tratamientos de 1 hora cada uno, seguido de un lavado con DCM y DMF.
La acilación se realizó en un sintetizador de péptidos en fase sólida SymphonyX de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 EE. UU.) como se describió en el método SPPS_C con tiempos de acoplamiento de 4 horas mediante el uso de la adición por etapas de bloques estructurales tales como, pero no limitados a, Fmoc-ácido-8-amino-3,6-dioxaoctanoico (Fmoc-Ado-OH), Fmoc-Glu-OtBu, Fmoc-ácido tranexámico (Fmoc-Trx-OH). La introducción de la porción de ácido graso se logró mediante el uso del método SPPS_C con tiempos de acoplamiento de 4 horas y un bloque estructural adecuado, tal como, pero no limitado a, éster mono-tercbutílico del ácido octadecanodioico o éster mono-terc-butílico del ácido eicosanodioico. En determinados casos en los que los bloques estructurales no eran solubles a una concentración madre de 0,6 M en DMF (por ejemplo, Fmoc-Trx-OH y éster mono-terc-butílico del ácido eicosanodioico), se prepararon concentraciones madre de 0,3 M y se duplicó el volumen de adición.
Método: SC_D
El grupo de protección Mtt para N-épsilon-lisina se eliminó mediante el lavado de la resina con HFIP al 70 % TIS al 3 % en DCM con dos tratamientos de 15 minutos cada uno, seguido de lavado con DCM y NMP. La acilación se realizó en un sintetizador en fase sólida Prelude mediante el uso de los protocolos descritos en el método SPPS_D mediante el uso de la adición por etapas de bloques estructurales, tales como, pero no limitado a, Fmoc-ácido-8-amino-3,6-dioxaoctanoico, Fmoc-ácido tranexámico, Fmoc-Glu-OtBu, éster monoterc-butílico del ácido octadecanodioico, éster mono-terc-butílico del ácido eicosanodioico.
Método: SC_E
El grupo de protección Mtt para N-épsilon-lisina se eliminó mediante el lavado de la resina con HFIP/TIS/DCM (75:5:20, v/v/v) (2 x 5 minutos y 2 x 30 minutos) antes de lavar con DMF y DCM.
La acilación se realizó en un sintetizador de péptidos en fase sólida SymphonyX de Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 EE. UU.) como se describió en el método SPPS_A mediante el uso de la adición por etapas de bloques estructurales tales como, pero no limitados a, Fmoc-ácido-8-amino-3,6-dioxaoctanoico (Fmoc-Ado-OH), Fmoc-Glu-OtBu, Fmoc-ácido tranexámico (Fmoc-Trx-OH). La introducción de la porción de ácido graso se logró mediante el uso del método SPPS_A y un bloque estructural adecuado, tal como, pero no limitado a, éster mono-ferc-butílico del ácido octadecanodioico o éster mono-ferc-butílico del ácido eicosanodioico. Escisión del péptido unido a la resina y purificación
Método: CP_A
Después de la síntesis la resina se lavó con DCM, y la resina peptidil se sometió a un tratamiento de 1,5-3 horas con TFA/TIS/agua (95:2,5:2,5, v/v/v) seguido de precipitación con éter dietílico. El precipitado se lavó con éter dietílico y se disolvió en una mezcla adecuada de agua, ácido acético y/o MeCN. La solución del péptido crudo se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa (Waters Deltaprep 4000) en una columna que contiene gel de sílice C18. La elución se realizó con un aumento de gradiente de MeCN en agua que contiene TFA al 0,1 %. Las fracciones relevantes se verificaron mediante UPLC analítica. Las fracciones que contenían el péptido diana puro se combinaron y se liofilizaron.
Cuando fue necesaria una purificación adicional, la sal TFA del péptido liofilizado aislada anteriormente se disolvió en un tampón acuoso neutro basado en sales comunes tales como, pero no limitadas a, hidrogenofosfato de sodio y se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (Waters Deltaprep 4000) en una columna que contenía gel de sílice C18. La elución se realizó con un gradiente creciente de MeCN en fosfato de sodio acuoso (90 mM, pH 7,4). Las fracciones relevantes se verificaron mediante UPLC analítica. Las fracciones que contenían el péptido diana puro se combinaron y, después de diluirlas con agua, se aplicaron a una segunda HPLC preparativa de fase inversa (Waters Deltaprep 4000) en una columna que contenía gel de sílice C18. La elución se realizó con un gradiente creciente de MeCN en agua que contenía TFA al 0,1 %. Las fracciones relevantes se combinaron y se liofilizaron para proporcionar la sal de TFA del péptido diana.
Método: CP_B
Después de la terminación de la síntesis de la cadena lateral, la resina peptidil se lavó con DCM y se secó, después se trató con TFA/agua/TIS (92,5:5:2,5 v/v/v, 10 ml) durante 2 horas, seguido por precipitación con éter dietílico. El precipitado se lavó con éter dietílico y se disolvió en un solvente adecuado (por ejemplo agua/MeCN 2:1 o NH4HCO3/MeCN acuoso 4:1 25 mM), con modulación del pH de la solución si fuera necesario para la disolución completa del péptido. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa de fase inversa (módulo de gradiente binario Waters 2545, detector de UV/Visible Waters 2489, colector III de fracciones Waters) en una columna C8(2) Phenomenex Luna (tamaño de partícula 10 pM, tamaño de los poros 100 A, dimensiones 250 x 21,2 mm). La separación de impurezas y la elución del producto se llevaron a cabo mediante el uso de un gradiente creciente de MeCN en agua que contenía TFA al 0,1 %. Las fracciones relevantes se verificaron mediante LCMS analítica. Las fracciones que contenían el péptido diana puro se combinaron y liofilizaron para proporcionar la sal TFA del péptido diana.
Método: CP_C
Después de la síntesis la resina se lavó con DCM, y la resina peptidil se sometió a un tratamiento de 1,5-3 horas con TFA/TIS/agua/anisol/DODT (90:2,5:2,5:2,5:2,5, v/v/v/v) seguido por precipitación con éter dietílico. El precipitado se lavó con éter dietílico y se disolvió en bicarbonato de amonio acuoso (concentración por ejemplo de 50 mM) y se agitó en vórtex. A esto se añadió MeCN para proporcionar una solución amarilla transparente. A continuación, esta solución se filtró por medio de Stericup de 0,22 um antes de purificarse mediante HPLC preparativa de fase inversa (Waters: bomba 2545, 2489 UV-vis, Fr.Collector III) en una columna que contenía gel de sílice C18. La elución se realizó con un aumento de gradiente de MeCN en agua que contiene TFA al 0,1 %. Las fracciones relevantes se verificaron mediante UPLC analítica. Las fracciones que contenían el péptido diana puro se combinaron y se liofilizaron.
Intercambio de sales - formación de sales de sodio.
Método: SX_A:
El péptido liofilizado aislado a partir del método CP_A, CP_B o CP_C se disolvió en tampones acuosos que contenían sodio de neutros a ligeramente básicos (pH 7-8,5), por ejemplo, tampones 0,1-0,2 M de acetato sódico o bicarbonato sódico. Las soluciones tamponadas que contenían el péptido se intercambiaron en sal mediante el uso de un cartucho Sep-Pak C18 (1-5 g): El cartucho se equilibró primero con 4 volúmenes de columna de isopropanol, después 4 volúmenes de MeCN, después 8 volúmenes de columna de agua. La solución peptídica se aplicó al cartucho, y el flujo se volvió a aplicar para garantizar la retención completa de péptido. El cartucho se lavó con 2-4 volúmenes de columna de agua, después 4-15 volúmenes de columna de las soluciones tampón (por ejemplo pH 7,5) que contenía sales de sodio, tales como, pero sin limitarse a, NaHCO3, NaOAc, Na2HPO4. El péptido se eluyó con 5-10 volúmenes de columna de entre 50-80 % de MeCN en agua y se liofilizó para proporcionar la sal de sodio del péptido como un sólido blanco, que se usó como tal. Método: SX_B:
La solución del péptido en H2O/MeCN/TFA se ajustó con NaOH a pH 7-8 con un contenido máximo de MeCN del 20 %. A continuación, se aplicó la mezcla en una HPLC preparativa de fase inversa (Waters Deltaprep 4000) en una columna que contenía gel de sílice C18. Primero se equilibró con ~4 volúmenes de columna de NaOAc 0,1 M seguido de enjuague con 2 volúmenes de columna de agua. La elución se realizó con un gradiente creciente de MeCN en agua. Las fracciones relevantes se verificaron mediante UPLC analítica. Las fracciones que contenían la sal de sodio del péptido diana puro se combinaron y se liofilizaron.
Métodos Generales de Detección y Caracterización
Métodos de LCMS:
Método: LCMS 34:
La LCMS_34 se realizó en una configuración que consistió en un sistema Waters Acquity UPLC H Class y Waters Xevo G2-XS QTof. Eluyentes: A: ácido fórmico al 0,1 % en agua MQ; B: ácido fórmico al 0,1 % en MeCN.
El análisis se realizó a RT (temp de la columna 40 °C) mediante la inyección de un volumen adecuado de la muestra en la columna que se eluyó con un gradiente de A y B. Las condiciones de UPLC, configuraciones del detector, y configuraciones del espectrómetro de masas fueron: Columna: Waters Acquity BEH, C-18, 1,7 pm, 2,1 mm x 50 mm. Gradiente: Lineal 5 % - 95 % B durante 4,0 minutos a 0,4 ml/minutos Detección: Modo de resolución de MS, método de ionización: ES. Escaneo: 50-4000 amu.
Método: LCMS_27:
La LCMS_27 se realizó en una configuración que consistió en un sistema UPLC 1290 infinity series de Agilent y LC/MSD TOF 6230 (G6230A) de Agilent Technologies. Eluyentes: A: TFA al 0,02 % en agua: B: TFA al 0,02 % en MeCN.
El análisis se realizó a RT (temperatura de la columna 40 °C) mediante la inyección de un volumen adecuado de la muestra en la columna que se eluyó con un gradiente de A y B. Columna: Eclipse C18+,1,8 pm, 2,1 mm x 50 mm. Tiempo de corrida del gradiente: B lineal al 5-95 % durante 4,5 minutos, después B al 95 % durante 0,5 minutos, B al 95-5 % durante 0,5 minutos, B al 5 % durante 0,5 min a un régimen de flujo de 0,40 ml/minutos. Detección: modo reflector lineal (positivo); método de ionización: Fuente Jet Stream de Agilent. Barrido: 100 3200 (m/z)
Método: LCMS_01
La LCMS_01 se realizó en una configuración que consistió en un sistema Waters Acquity UPLC y un espectrómetro de masas LCT Premier XE de Micromass. Eluyentes: A: Ácido fórmico al 0,1 % en agua MQ; B: Ácido fórmico al 0,1 % en MeCN. El análisis se realizó a RT (temp de la columna 40 °C) mediante la inyección de un volumen adecuado de la muestra en la columna que se eluyó con un gradiente de A y B. Las condiciones de UPLC, configuraciones del detector y configuraciones del espectrómetro de masas fueron: Columna: Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1,7 pm, 2,1 mm x 50 mm. Gradiente: Lineal 5 % - 95 % de B durante 4,0 minutos a 0,4 ml/minutos. Detección: 214 nm (salida analógica de TUV (detector de UV ajustable)) Modo de ionización del MS: API-ES. Escaneo: 500-2000 amu.
Ejemplo 1:
Síntesis de derivados de GIP
Los derivados de la invención se sintetizaron de acuerdo con los métodos generales de preparación como se describió anteriormente.
hGIP(1-42); (SEQ ID NO: 1) (para referencia):
H— Y A E G T F I S D Y S I A M D K I H Q Q D F V N W L L A Q K G K K N D W K H N I T Q -O H Métodos generales usados: SPPS_D, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4983,53 g/mol
LCMS01: encontrado (M 4H)4+ 1246,17
hGIP(1-31); (SEQ ID NO: 2) (para referencia):
H - Y A E G T F I S D Y S I A M D K I H Q Q D F V N W L L A Q K<& O H>
Métodos generales usados: SPPS_A, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 3589,98 g/mol
LCMS01: encontrado (M 3H)3+ 1197,61
Compuesto 1 (SEQ ID NO: 6):
N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4302,87 g/mol
LCMS_34: encontrado (M 4H)4+ 1076,82
Compuesto 2 (SEQ ID NO: 7):
N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4283,82 g/mol
LCMS_34: encontrado (M 4H)4+ 1071,82
Compuesto 3 (SEQ ID NO: 8):
N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi] acetil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4502,20 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1501,50
Compuesto 4 (SEQ ID NO: 9):
N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilammo)metil]ciclohexanocarboml]amino]butanoil]aiTiino]butanoil]aiTimo]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4470,12 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 4H)4+ 1118,11
Compuesto 5 (SEQ ID NO: 10):
N{1}-acetil, N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31)
L A Q K GOH
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4344,91 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1449,10
Compuesto 6 (SEQ ID NO: 11):
N{1}-acetil,N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-
Métodos generales usados: SPPS_B, SC_B, CP_B, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4512,16 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1504,79
Compuesto 7 (SEQ ID NO: 12):
N{1}-acetil,N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_B, SC_B, CP_B, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4330,88 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1444,41
Compuesto 8 (SEQ ID NO: 13):
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]-butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_B, SC_B, CP_B, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4498,13 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1500,12
Compuesto 9 (SEQ ID NO: 14):
N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_B, SC_B, CP_B
Peso molecular (promedio) calculado: 4303,86 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1435,08
Compuesto 10 (SEQ ID NO: 15):
N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]-butanoil]amino]butanoil]-
Métodos generales usados: SPPS_B, SC_B, CP_B, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4471,10 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1490,79
Compuesto 11 (SEQ ID NO: 16):
N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Aib20,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_C, SC_C, CP_C, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4259,85 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1420,74
Compuesto 12 (SEQ ID NO: 17):
N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarboml]amino]butanoil]aiTiino]-butanoil]aiTiino]butanoil]-
Métodos generales usados: SPPS_C, SC_C, CP_C, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4427,09 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1476,45
Compuesto 13 (SEQ ID NO: 18):
N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Ala16,Arg18,Lys24]-hGIP(1-
L A Q K G oh
Métodos generales usados: SPPS_C, SC_C, CP_C
Peso molecular (promedio) calculado: 4245,78 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1416,06
Compuesto 14 (SEQ ID NO: 19):
N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]-butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Ala16,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_C, SC_C, CP_C
Peso molecular (promedio) calculado: 4413,02 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1471,77
Compuesto 15 (SEQ ID NO: 20):
N{1}-acetil,N{épsilon-24H2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetilHD-
L A Q K G- oh
Métodos generales usados: SPPS_B, SC_B, CP_B, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4362,97 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1455,09
Compuesto 16 (SEQ ID NO: 21):
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[D-
L A Q K GOH
Métodos generales usados: SPPS_C, SC_C, CP_C
Peso molecular (promedio) calculado: 4363,95 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1455,42
Compuesto 17 (SEQ ID NO: 22):
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]
L A Q K GOH
Métodos generales usados: SPPS_B, SC_B, CP_B, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4621,19 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1541,12
Compuesto 18 (SEQ ID NO: 23):
N{1}-acetil,N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_C, SC_C, CP_C
Peso molecular (promedio) calculado: 4330,88 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1444,40
Compuesto 19 (SEQ ID NO: 24):
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[D-Tyr1,Asp14,Arg18,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_C, SC_C, CP_C
Peso molecular (promedio) calculado: 4365,88 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1456,07
Compuesto 20 (SEQ ID NO: 25):
N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]airiino]butanoil]aiTimo]butanoil]-aiTimo]butanoil]-
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4413,92 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1472,07
Compuesto 21 (SEQ ID NO: 26):
N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]-amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4581,17 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1527,78
Compuesto 22 (SEQ ID NO: 27):
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4480,07 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1494,13
Compuesto 23 (SEQ ID NO: 28):
N{1}-acetil,N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4499,11 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1500,47
Compuesto 24 (SEQ ID NO: 29):
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4436,06 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1479,46
Compuesto 25 (SEQ ID NO: 30):
N{1}-acetil,N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4455,10 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1485,81
Compuesto 26 (SEQ ID NO: 31):
N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]-butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4509,20 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1503,84
Compuesto 27 (SEQ ID NO: 32):
N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]-butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4490,15 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1497,49
Compuesto 28 (SEQ ID NO: 33):
N{1}-acetil,N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4537,21 g/mol
LCMS_34: encontrado (M 4H)4+ 1135,13
Compuesto 29 (SEQ ID NO: 34):
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D Tyr1,Nle14,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4518,16 g/mol
LCMS_34: encontrado (M 4H)4+ 1130,37
Compuesto 30 (SEQ ID NO: 35):
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]-amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31)
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4627,24 g/mol
LCMS_34: encontrado (M 4H)4+ 1130,37
Compuesto 31 (SEQ ID NO: 36):
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]-amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Arg18,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4551,23 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1517,81
Compuesto 32 (SEQ ID NO:37):
N{1}-acetil,N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida
Métodos generales usados: SPPS_C, SC_C, CP_C, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4532,19 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 3H)3+ 1511,44
Compuesto 33 (SEQ ID NO: 38):
N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Lys24,Glu33]-hGIP
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 5678,32 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 4H)4+ 1420,54
Compuesto 34 (SEQ ID NO: 39):
N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Lys24,Glu33]-hGIP
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 5697,36 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 4H)4+ 1425,29
Compuesto 35 (SEQ ID NO: 40):
N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 5725,41 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 4H)4+ 1432,25
Compuesto 36 (SEQ ID NO: 41):
N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 5711,39 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 4H)4+ 1428,75
Compuesto 37 (SEQ ID NO: 42):
N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 5744,46 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 4H)4+ 1437,03
Compuesto 38 (SEQ ID NO: 43):
N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Lys24,Glu33,Glu34]-hGIP
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 5693,33 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 4H)4+ 1424,24
Compuesto 39 (SEQ ID NO: 44):
N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Lys24,Glu33,Asp34]-hGIP
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 5679,30 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 4H)4+ 1420,79
Compuesto 40 (SEQ ID NO: 45):
N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Lys24,Glu33,Glu34]-
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 5712,37 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 4H)4+ 1429,00
Compuesto 41 (SEQ ID NO: 46):
N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Lys24,Glu33,Glu34]-hGIP
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 5911,71 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 4H)4+ 1478,81
Compuesto 42 (SEQ ID NO: 47):
N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilammo)metil]ciclohexanocarboml]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 5879,62 g/mol
LCMS_27: encontrado (M 4H)4+ 1470,81
Compuesto 43 (SEQ ID NO: 59) (para referencia):
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[D-
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_E, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4358,08 g/mol
LCMS_34: encontrado (M 3H)3+ 1452,82
Compuesto 44 (SEQ ID NO: 60) (para referencia):
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Arg18,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_E, CP_A, SX_A
Peso molecular (promedio) calculado: 4454,21 g/mol
LCMS_34: encontrado (M 3H)3+ 1484,83
Compuesto 45 (SEQ ID NO: 61)
N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[Aib2,Leu14,Lys24]-hGIP
Métodos generales usados: SPPS_D, SC_D, CP_A
Peso molecular (promedio) calculado: 5709,46 g/mol
LCMS_34: encontrado (M 4H)4+ 1428,36
Compuesto 46 (SEQ ID NO: 62)
N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Arg18,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida
Métodos generales usados: SPPS_A, SC_A, CP_A, SX_B
Peso molecular (promedio) calculado: 4383,99 g/mol
LCMS_34: encontrado (M 3H)3+ 1461,99
Métodos farmacológicos
La utilidad de los derivados de la presente invención como agentes activos farmacológicamente en la reducción de la ganancia de peso y el tratamiento de la obesidad en mamíferos, tales como los seres humanos, y para el tratamiento de diabetes y NASH puede demostrarse mediante la actividad de los agonistas en ensayos convencionales y en los ensayosin vitroein vivodescritos más abajo.
Dichos ensayos proporcionan, además, un medio de manera que las actividades de los derivados de la invención pueden compararse con las actividades de compuestos conocidos.
Ejemplo 2:
Potenciain vitro(luciferasa CRE; células completas)
El propósito de este ejemplo es probar la actividad, o la potencia, de los derivadosin vitroen el receptor de GIP humano así como también en el receptor de GLP-1 humano y el receptor de glucagón humano. La potenciain vitroes la medida de la activación de los receptores humanos de GIP, GLP-1 o glucagón, respectivamente, en un ensayo con células enteras.
Las potencias de los derivados del Ejemplo 1 se determinaron como se describió más abajo. Se incluyeron para la comparación hGIP y hGIP truncado C-terminal (1-31) así como también hGLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 4) y glucagón humano (hGcg) (SEQ ID NO: 5).
Principio:
La potenciain vitrose determinó mediante la medición de la respuesta de los receptores humanos de GIP, GLP-1 o glucagón en un ensayo de gen reportero en líneas celulares individuales. El ensayo se realizó en líneas celulares BHK transfectadas establemente que expresan tanto el receptor de GIP humano, el receptor de GLP-1 humano o el receptor de glucagón humano y donde cada una contiene el ADN para el elemento de respuesta a AMPc (CRE) acoplado a un promotor y el gen para la luciferasa de luciérnaga (CRE luciferasa). Cuando el receptor respectivo se activa da como resultado la producción de AMPc, que a su vez da lugar a la expresión de la proteína luciferasa. Cuando se completa la incubación del ensayo, se añade el sustrato de luciferasa (luciferina) y la enzima convierte la luciferina en oxiluciferina para producir bioluminiscencia. La luminiscencia se mide como la lectura de salida del ensayo.
Cultivo celular y preparación
Las células usadas en este ensayo (BHK CRE luc2P hGIPR clon #5, BHK CRE luc2P hGLP-1R clon #6, BHK CRE luc2P hGCGR clon #18) eran células BHK con BHKTS13 como línea celular parental. Las células se derivaron de un clon que contenía el elemento luciferasa CRE y se establecieron mediante transfección posterior con el receptor respectivo para obtener el clon corriente.
Las células se cultivaron en CO2 al 5 % en Medio de Cultivo Celular. Se alicuotaron y se almacenaron en nitrógeno líquido. Las células se mantuvieron en pases y se sembraron el día antes de cada ensayo.
Materiales
Se usaron los siguientes compuestos químicos en el ensayo: Pluronic F-68 (10 %) (Gibco 2404), albúmina sérica humana (HSA) (Sigma A9511), SFB al 10 % (suero fetal bovino; Invitrogen 16140-071), ovoalbúmina fetal (Sigma A5503), DMEM sin fenol rojo (Gibco 11880-028), Hepes 1 M (Gibco 15630), Glutamax 100x (Gibco 35050), G418 (Invitrogen 10131-027), higromicina (Invitrogen 10687-010), pen/strep al 1 % (penicilina/estreptomicina; Invitrogen 15140-122) y steadylite plus (PerkinElmer 6016757).
Tampones
El medio de cultivo celular consistió en medio DMEM con SFB al 10 %, G418 a 1 mg/ml, higromicina a 1 mg/ml y pen/strep al 1 % (penicilina/estreptomicina; Invitrogen 15140-122).
El medio de ensayo consistió en DMEM sin rojo de fenol, Hepes 10 mM y Glutamax 1x. El tampón del ensayo consistió en ovoalbúmina al 1 % y Pluronic F-68 al 0,1 % en medio del ensayo con la adición de albúmina sérica humana al doble de las concentraciones indicadas. El medio del ensayo se mezcló 1:1 con un volumen igual del compuesto de prueba en tampón de ensayo para producir la concentración final en el ensayo de albúmina sérica.
Procedimiento
1) Las células se sembraron a 5000 células/pocillo y se incubaron durante la noche.
2) Las células se lavaron tres veces en PBS.
3) Se añadió medio de ensayo (alícuota de 50 j l ) con o sin seroalbúmina a cada pocillo de la placa de ensayo.
4) Las reservas de los compuestos de prueba y los compuestos de referencia se diluyeron a una concentración de 0,2 jM en el tampón del ensayo. Los compuestos se diluyeron 10 veces para dar las siguientes concentraciones: 2x10-7 M, 2x10-8 M; 2x10-9 M, 2x10-10 M, 2x10-11 M, 2x10-12 M, 2x10-13 M y 2x10-14 M.
5) Una alícuota de 50 j l del compuesto o del blanco se transfirió de la placa de dilución a la placa del ensayo. Los compuestos se evaluaron en las siguientes concentraciones finales: 1x10-7 M, 1x10-8 M; 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, 1x10-13 M y 1x10-14 M.
6) La placa de ensayo se incubó durante 3 h en una incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C.
7) La placa de ensayo se retiró de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
8) Las células se lavaron tres veces con PBS más algo de líquido en cada pocillo.
9) Una alícuota de 100 j l del reactivo steadylite plus se añadió a cada pocillo de la placa del ensayo (el reactivo era sensible a la luz).
10) Cada placa del ensayo se cubrió con papel de aluminio para protegerla de la luz y se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente.
11) Cada placa de ensayo se leyó en un lector de placas de microtitulación.
Cálculos y Resultados
Los datos del lector de placas de microtitulación se transfirieron al programa informático GraphPad Prism. El programa informático realiza una regresión no lineal (log(agonista) frente a la respuesta). Los valores de EC50 que se calcularon mediante el programa informático y se informaron en pM se muestran en la Tabla 1 más abajo.
Se midió un mínimo de dos réplicas para cada muestra. Los valores informados son los promedios de las réplicas.
Tabla 1: Potencias, EC50
* Ensayo realizado en presencia de HSA al 1 %; nd=no determinado.
Todos los derivados de la presente invención muestran una buena potencia de GIP y sustancialmente ninguna actividad o ninguna actividad medible en el receptor de GLP-1 humano y el receptor de glucagón humano en las condiciones dadas.
Ejemplo 3:
Estudio farmacocinético en minicerdos
El propósito de este estudio es determinar el tiempo de vida mediain vivode los derivados de la presente invención después de una administración i.v. en minicerdos, es decir la prolongación del tiempo en el cuerpo y de esta manera su tiempo de acción. Esto se realiza en un estudio farmacocinético (PK), donde se determina la vida media terminal del derivado en cuestión. Por vida media terminal se entiende generalmente el período de tiempo que se tarda en reducir a la mitad una determinada concentración plasmática, medida después de la fase de distribución inicial.
Estudio:
En los estudios se usaron minicerdos hembras de Gottingen obtenidos de Ellegaard Gottingen Minipigs (Dalmose, Dinamarca) de aproximadamente 7-14 meses de edad y con peso de aproximadamente 16-35 kg.
Los minicerdos se alojaron individualmente y se alimentaron de forma restringida una vez al día con dieta SDS para minicerdos (Special Diets Services, Essex, Reino Unido).
Después de 3 semanas de adaptación se implantaron dos catéteres venosos centrales permanentes en la vena cava caudal en cada animal. A los animales se les permitió recuperarse durante 1 semana después de la cirugía, y después se usaron para estudios farmacocinéticos repetidos con un periodo de reposo farmacológico adecuado entre la dosificación sucesiva del derivado.
Los animales se mantuvieron en ayunas durante aproximadamente 18 horas antes de la dosificación y de 0 a 4 horas después de la dosificación, pero tuvieron acceso ad libitum al agua durante todo el periodo.
Los derivados de GIP del Ejemplo 1 se disolvieron en un tampón de fosfato de sodio 8 mM, pH 7,8, que contenía propilenglicol 236 mM hasta una concentración de 50 nmol/ml. Se administraron inyecciones intravenosas (el volumen correspondiente usualmente a 5 nmol/kg, por ejemplo, 0,1 ml/kg) de los compuestos a través de un catéter y se tomaron muestras de sangre en puntos temporales predefinidos hasta 13 días después de la dosificación (preferentemente, a través del otro catéter). Las muestras de sangre (por ejemplo 0,8 ml) se recolectaron en tampón de EDTA (8 mM) y después se centrifugaron a 4 °C y 1942 G durante 10 minutos.
Muestreo y análisis:
El plasma se pipeteó en tubos Micronic sobre hielo seco, y se mantuvo a -20 °C hasta que se analizó la concentración plasmática del derivado peptídico GIP respectivo mediante el uso de ELISA o un ensayo similar basado en anticuerpos o LCMS. Los perfiles individuales de concentración plasmática-tiempo se analizaron mediante un modelo no compartimental en Phoenix WinNonLin versión 6.4. (Pharsight Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos) y se determinaron los tiempos de vida media terminales resultantes (media armónica).
Resultados:
Tabla 2: Tiempo de vida media (ty2)
Los derivados de GIP analizados tienen tiempos de vida media muy largos en comparación con el tiempo de vida media de hGIP(1-42) que medido en el hombre es de aproximadamente 5 min [Meier y otros, Diabetes, Vol. 59, 2004, 654-662] o 7 min [Deacon y otros, J. Clin. Endocrinol. & Metab., Vol. 85, No. 10, 2000, 3575 3581].
Ejemplo 4:
Estabilidad física de las composiciones de péptidos (ensayo de fibrilación ThT y DLS_SI)
El propósito de este estudio es evaluar la estabilidad física de los derivados de la invención en soluciones acuosas en un ensayo ThT y en un ensayo DLS-SI como se explica más abajo.
Ensayo ThT:
El ensayo con tioflavina T se realizó como se explica en Schlein (2017), AAPS J, 19(2), 397-408.
La baja estabilidad física de un péptido puede conducir a la formación de fibrillas amiloides, que se observan como estructuras macromoleculares bien ordenadas, similares a hilos, en la muestra, que finalmente pueden conducir a la formación de gel. Esto se mide tradicionalmente mediante inspección visual de la muestra. Sin embargo, ese tipo de medición es muy engorroso y depende del observador. Por lo tanto, la aplicación de una sonda indicadora de molécula pequeña es mucho más ventajoso. La tioflavina T (ThT) es una sonda de este tipo y tiene una firma de fluorescencia distintiva cuando se une a las fibrillas [Naiki y otros (1989) Anal. Biochem.
177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284].
El curso del tiempo para la formación de las fibrillas puede describirse mediante una curva sigmoidea con la siguiente expresión [Nielsen y otros (2001) Biochemistry 40, 6036-6046]:
F =f+ m t ■ f f<+ m f t>
<- [ ( í>- t0<) / r ]>
1e............ Ec.(1)
Aquí, F es la fluorescencia de ThT en el tiempo t. La constante t0 es el tiempo necesario para alcanzar el 50 % de fluorescencia máxima. Los dos parámetros importantes que describen la formación de la fibrilla son el tiempo<de retardo que se calcula por t0 ->2<t y la constante de velocidad aparente kapp>1</ t .>
La formación de un intermediario parcialmente plegado del péptido se sugiere como un mecanismo de iniciación general para la formación de fibrillas. Algunos de esos intermediarios se nuclean para formar una plantilla sobre la cual los intermediarios posteriores pueden ensamblarse y se procede a la formación de fibrillas. El tiempo de retraso corresponde al intervalo en el cual se acumula la masa crítica de núcleos y la constante de velocidad aparente es la velocidad con la que se forma la propia fibrilla.
Las muestras se preparan frescas antes de cada ensayo. La sustancia farmacológica se disolvió con 250 pM del derivado de GIP en fosfato 8 mM, propilenglicol 14 mg/ml, fenol 58 mM, pH 7,4. El pH de la muestra se ajustó al valor deseado mediante el uso de cantidades apropiadas de NaOH y HCl concentrados. La tioflavina T se añadió a las muestras a partir de una solución madre en H2O hasta una concentración final de 1 |iM. Se colocaron alícuotas de muestra de 200 |il en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Packard OptiPlate™-96, poliestireno blanco). Se colocaron cuatro réplicas de cada muestra (correspondientes a una condición de prueba) en una columna de pocillos. La placa se selló con Scotch Pad (Qiagen).
La incubación, agitación y medición de la emisión de fluorescencia de ThT se realizaron en un lector de placas de fluorescencia Fluoroskan Ascent FL (Thermo Labsystems). La placa se incubó a 37 °C con agitación orbital ajustada a 960 rpm con una amplitud de 1 mm. La medición de la fluorescencia se realizó mediante el uso de excitación mediante un filtro de 444 nm y la medición de la emisión mediante un filtro de 485 nm. El ensayo terminó después de 45 horas de incubación.
Cada corrida se inició mediante la incubación de la placa a la temperatura del ensayo durante 10 minutos. La placa se midió cada 20 minutos por el período de tiempo deseado. Entre cada medición, la placa se agitó y se calentó como se describió.
Una vez terminado el ensayo de ThT, la réplica de cada muestra se agrupó y centrifugó a 20000 rpm durante 30 minutos a 18 °C. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 pm y se transfirió una alícuota a un frasco de HPLC. La concentración de la muestra filtrada con relación a la muestra inicial (en porcentaje) se informó como la recuperación.
Los puntos de medición se guardaron en formato de Microsoft Excel para el procesamiento posterior y el dibujo y el ajuste de las curvas se realizó mediante el uso de GraphPad Prism. La emisión de fondo a partir de la ThT en ausencia de fibrillas fue insignificante. Los puntos de datos son la media de las cuatro réplicas y se muestran con barras de error de desviación estándar. Solo los datos obtenidos en el mismo experimento (es decir muestras en la misma placa) se presentaron en el mismo gráfico, lo que garantiza una medida relativa de la fibrilación entre experimentos.
El conjunto de datos puede ajustarse a la Ec. (1). Sin embargo, el tiempo de retraso antes de la fibrilación que se informa en la presente descripción, se determinó mediante inspección visual de la curva identificando el punto temporal en el que la fluorescencia de ThT aumenta significativamente por encima del nivel de fondo. La ausencia de aumento de la fluorescencia de ThT durante la duración del ensayo se informó como un tiempo de retraso de 45 horas.
Índice de estabilidad de Dispersión Dinámica de la Luz (DLS-SI) para la evaluación de la estabilidad física de los péptidos en solución:
El radio hidrodinámico (Rh, sinónimo: radio de Stokes) de un péptido en solución es un indicador del tamaño y estado oligomérico de la biomolécula en solución y puede medirse mediante dispersión dinámica de la luz (DLS). Los cambios en el radio hidrodinámico (Rh) en el tiempo pueden ser un indicador de cambios de tamaño y estado oligomérico y, por lo tanto, un indicador de la inestabilidad física del péptido en solución.
Las muestras se prepararon frescas antes de cada ensayo. La sustancia farmacológica se resolvió con 250 pM del derivado de GIP en fosfato 8 mM, propilenglicol 14 mg/ml, fenol 58 mM, pH 7,4. El pH de la muestra se ajustó al valor deseado mediante el uso de cantidades apropiadas de NaOH y HCl concentrados.
Se filtraron 400 pl de cada muestra recién preparada a través de un filtro de jeringa Whatman® Anotop® 10 no estéril con un tamaño de los poros de 0,02 pm, de manera que se descartaron las dos primeras gotas. Se colocaron 25 pl de muestra filtrada por pocillo en una placa de microtitulación de 384 pocillos (Corning® 3540 de poliestireno, negra con fondo plano y transparente), cada muestra se analizó como tres réplicas. La muestra en cada pocillo se cubrió con 15 pl de aceite de silicona (Sigma-Aldrich, viscosidad 20 cSt a 25 °C). La placa se centrifugó durante 5 minutos a 1200 rpm (centrífuga Eppendorf® 5430, rotor A 2 MTP) y se colocó en un lector de placas Wyatt DynaPro II durante 30 minutos antes de comenzar la medición para equilibrar la temperatura de la muestra a 25 °C. El lector de placas Wyatt DynaPro II estaba equipado con un láser de 830 nm y el programa informático Dynamics v7.5. Cada muestra en cada pocillo se analizó con un intervalo de adquisición de datos de 5 segundos y 40 adquisiciones por muestra. Después de la medición, la placa se cubrió con película adhesiva para microplacas (película de polipropileno resistente al calor VWR) y se incubó durante 4 semanas a 25 °C. Las muestras se volvieron a medir por DLS después de 1, 2 y 4 semanas con el mismo parámetro.
Después de la medición, los datos de cada muestra se filtraron primero mediante el programa informático Dynamics v7.5 con amplitud mínima: 0,03, amplitud máxima: 1, límite de línea base (1+/-): 0,005 y SOS máximo: 100. Posteriormente, la función autocorrelación-tiempo de cada muestra medida se revisó cuidadosamente antes de calcular la DLS-SI de acuerdo con la Ec. (2).
En el ensayo DLS-SI, los cambios de Rh acumulativo se definen como índice de estabilidad en dependencia del tiempo por:
j R j , l , t j - R n ( t p ) >
DLSSÍ (t) =
2aEc. (2)
con DLS-SI como índice de estabilidad en dependencia del tiempo (t), la diferencia entre el radio hidrodinámico acumulado, Rh al principio (tü) y al final (t) de la investigación de estabilidad normalizada por la variabilidad estadísticamente significativa 2o. La variabilidad analítica de las mediciones de Rh bajo dichas condiciones se investigó exhaustivamente y dio como resultado o = 0,3 nm. Un valor de DLS-SI mayor que 1 representa un cambio estadístico significativo en Rh. Cuanto mayor sea el valor de DLS-SI, más cambios en Rh en el tiempo.
Resultados:
Tabla 3: Tiempo de retardo y recuperación del ensayo ThT a pH 7,4 y DLS-SI.
nd=no determinado; # la concentración de hGIP(1-42) en DLS-SI fue de solo 156 ^M en lugar de 250 ^M como se describió en la preparación de la muestra. ## la concentración de hGIP(1-31) en DLS-SI fue de solo 5 ^M en lugar de 250 ^M como se describió en la preparación de la muestra. * la concentración fue de solo 162 ^M en lugar de 250 ^M como se describió en la preparación de la muestra. ** Compuesto no soluble a un pH dado.
Los derivados de GIP que se probaron en el ensayo de ThT no muestran formación de fibrillas después de 45 horas (tiempo de retardo) y una recuperación muy alta, es decir, la concentración del derivado de GIP recuperado después del ensayo con relación a la concentración inicial en comparación con hGIP(1-42) y hGIP(1-31). Además, se muestra la tendencia de hGIP(1-42) y hGIP(1-31) a formar fibrillas en solución. Los datos de DLS-SI muestran un aumento nulo o pequeño en el radio hidrodinámico para el hGIP(1-42) y los derivados de GIP de la invención, la precipitación no fue visible. El cambio de Rh en el tiempo fue significativo para hGIP(1-31) y la formación de grandes agregados se hizo visible como precipitación en el instrumento DLS. En consecuencia, los derivados de GIP de la invención tienen una alta estabilidad física en comparación con hGIP(1-42) y hGIP(1-31).
Ejemplo 5:
Estabilidad química de las composiciones de derivados de GIP
El objetivo de este estudio es determinar la estabilidad química de composiciones de derivados de GIP. Como una medida de la estabilidad de la composición del derivado de GIP, se analizó la formación de péptidos de alto peso molecular (% HMWP) en función del tiempo mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-MS). Además, la pérdida de pureza de las composiciones de derivados de GIP se midió mediante LCMS.
Formulaciones:
Las muestras para los ensayos de estabilidad química se prepararon frescas antes de cada ensayo. La sustancia farmacológica se disolvió con 250 pM del derivado de GIP en fosfato 8 mM, propilenglicol 14 mg/ml, fenol 58 mM, pH 7,4. El pH de la muestra se ajustó al valor deseado mediante el uso de cantidades apropiadas de NaOH y HCl concentrados.
Incubación:
Las formulaciones de los derivados de GIP respectivos se almacenaron en una incubadora a 37 oC durante 4 semanas antes de analizar la formación de HMWP y la pérdida de pureza, como se describió más abajo.
Análisis de la formación de HMWP:
La formación de oligómeros covalentes (HMWP) se analizó e identificó mediante un método de SEC-MS. Se utilizó un Acquity i-class UPLC de Waters equipado con columna Acquity SEC BEH200, 4,6 mm x 150 mm, tamaño de partícula de 1,7 pm y tamaño de los poros de 200 A. Se realizó una elución isocrática con TFA al 0,05 % en MeCN al 55 % a una temperatura de la columna de 45 oC y un régimen de flujo de 0,2 ml/min. El sistema de LC se acopló tanto a un detector TUV operado a 215 nm, 10 Hz y un espectrómetro de masas QToF de alta resolución de Waters (Synapt G2S) operado en modo de ion positivo e intervalom/zde 100 a 4000 con una configuración de resolución normal. La corrección de masa de bloqueo contra Leu-encefalina se realizó cada 31 segundos. Los espectros se procesaron en MassLynx versión 4.1 y se deconvolucionaron con MaxEnt. Los resultados se muestran en la tabla 5.
Análisis de pureza mediante LCMS:
Para las pruebas de estabilidad química aceleradas se analizaron muestras relevantes en un sistema Acquity I-class UPLC de Waters acoplado con un sistema de espectrometría de masas Synapt G2S high resolution QToF de Waters para la identificación y caracterización de purezas e impurezas. El sistema UPLC se ajustó con una columna Acquity CSH C18 de Waters con un tamaño de partícula de 1,7 pm y diámetro interno de 1 mm y longitud de 150 mm. El horno de la columna se mantuvo a 55 oC. El solvente usado fue ácido fórmico al 0,1%en agua (Eluyente A), premezclado de Thermo (Optima LS118-1) y para el eluyente B ácido fórmico al 0,1 % en MeCN también premezclado de Thermo (Optima LS120-1). Los solventes se bombearon desde un sistema binario de manejo de solventes y se mezclaron en el lado de alta presión en un mezclador con un volumen de 50 pl. El gradiente y el flujo pueden observarse en la tabla 4:
Tabla 4: Tabla de gradiente LC
Fue usado un muestreador automático de flujo a través de aguja a 8 oC para inyectar 1 pl de cada muestra. El efluente pasó a través de un detector UV ajustable (TUV) ajustado a 215 nm. La salida del detector UV pasó a la fuente de electropulverización del espectrómetro de masas. El capilar se mantuvo a 3 kV y se purgó gas nitrógeno seco a un flujo de 750 l/h y una temperatura de 250 oC. El bloque fuente se mantuvo a 120 oC y el cono de gran calibre se purgó con nitrógeno a 50 l/h con potenciales de electrodo estándar en el resto del instrumento. El MS se operó en modo de alta resolución con una resolución nominal de 35000. El analizador ToF operó en modo ADC con una ventana dem/zde 100-2000. Una segunda función con mayor energía de colisión en la región de la onda T de la trampa se usó para un experimento de tipo MSE con la rampa de alta energía que tiene una tensión entre 32 y 52 V.
Resultados:
Tabla 5: Formación de HMWP y pérdida de la pureza a 37 oC
Como se observa en la Tabla 5, los derivados de GIP de la presente invención muestran una baja formación de HMWP y tienen una baja pérdida de pureza por mes. En consecuencia, se considera que son químicamente estables en solución.
Ejemplo 6:
Estudios subcrónicosin vivoen ratones obesos
El propósito de este ejemplo es evaluar el efectoin vivode los derivados de GIP de la presente invención solos y en combinación con un agonista del receptor de GLP-1 sobre la ingestión de alimentos, el peso corporal y la tolerancia a la glucosa en ratones obesos inducidos por dieta (DIO). El agonista del receptor GLP-1 usado para este ejemplo fue una molécula similar a la semaglutida que tiene las mismas propiedades farmacológicas que la semaglutida, pero una estructura ligeramente diferente. El compuesto puede sintetizarse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describió mediante métodos del presente Ejemplo 1 o como se describe en WO 2006/097537, ejemplo 4.
Molécula similar a la semaglutida (compuesto núm. 47; SEQ ID NO: 58):
N626-{18-[N-(17-carboxiheptadecanoil)-D-Y-glutamil]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaoctadecanoil}-[8-(ácido 2-amino-2-propanoico), 34-L-arginina]péptido similar al glucagón humano 1(7-37)
Los animales se trataron una vez al día con el agonista del receptor GLP-1 (compuesto núm. 47) y/o un derivado de GIP de la presente invención ejemplificado por los compuestos núms. 5, 25 y 31, para evaluar la pérdida de peso, la eficacia y la tolerancia a la glucosa.
Animales y dieta
Todos los protocolos animales se aprobaron por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales y el Comité de Revisión Ética de Novo Nordisk. Los animales se alojaron de acuerdo con las estándares de alojamiento de roedores de Novo Nordisk y se les dio accesoad libituma alimentos y agua bajo condiciones de iluminación controlada (ciclo luz/oscuridad 12h:12h; apagado de las luces 18:00-06:00), temperatura (23 ± 2 °C) y humedad relativa (50 ± 20 %). Se obtuvieron de Charles River (Francia) ratones C57BL/6J machos DIO mantenidos con una dieta alta en grasas (45 % kcal de grasa, RD12451, Research Diets, New Brunswick, NJ, EE. UU.) durante 22 semanas. A su llegada, los ratones se alojaron individualmente (un ratón por jaula) y se les permitió aclimatarse a su nuevo entorno durante dos semanas antes del inicio del tratamiento.
Asignación de grupos y dosificación
Antes del inicio del estudio, los animales se alojaron individualmente y se aclimataron a la manipulación durante 7 días. Los ratones DIO se distribuyeron en grupos (n=8/grupo) de manera que las variaciones estadísticas en la media y las desviaciones estándar de la masa grasa y el peso corporal se minimizaron entre los grupos. A los animales se les administró una dosis una vez al día, por vía subcutánea, con vehículo o con el compuesto de prueba.
Tampones de formulación
Todos los compuestos en el estudio se formularon en el siguiente tampón: fosfato 50 mM; cloruro de sodio 70 mM; polisorbato 80 al 0,05 %, pH 7,4. Las soluciones de dosificación se formularon en viales de vidrio y se almacenaron a 2-8 °C. Las soluciones de dosificación se llevaron a temperatura ambiente antes de la dosificación y se retornaron a 2-8 °C después de la dosificación.
Peso corporal e ingestión de alimentos
El peso corporal (BW) y la ingestión de alimentos se midieron inmediatamente antes de la dosificación cada día. El peso corporal inicial promedio de los ratones antes del inicio del tratamiento fue de 45,2 ± 0,2 gramos. Los resultados se muestran en las Tablas 6-8.
IPGTT (prueba intraperitoneal de tolerancia a la glucosa)
El día de la prueba de tolerancia a la glucosa (día 15), los animales se sometieron a ayuno durante 4 horas. Se retiró el alimento y los animales se transfirieron a jaulas nuevas. Los animales tenían acceso al agua pero no al alimento. A los ratones se les midieron los niveles de glucosa en sangre de la cola y se les inyectó (t = 0) una carga de glucosa intraperitoneal (i.p.) de 2 g/kg (200 mg/ml de solución de glucosa, volumen de la dosis 10 ml/kg). Los niveles de glucosa en sangre de la cola se midieron a los tiempos 0, 15, 30, 60, 90, 120 minutos después de la carga de glucosa i.p. La estratificación de los animales durante la IPGTT fue de manera que, por ejemplo, se dosificaron dos ratones del grupo 1 seguido de dos ratones del grupo 2, 3, 4, antes de manipular los dos ratones siguientes del grupo 1, 2, 3, etc. Esto se hizo para permitir una distribución equitativa del “momento del día” en todos los grupos.
Resultados:
Tabla 6: Estudio 1, Efectos sobre la ingestión de alimentos, el peso corporal y la tolerancia a la glucosa en ratones DIO tratados con el agonista del receptor de GLP-1 (compuesto núm. 47, 2 nmol/kg) y/o el compuesto GIP núm. 5 (30 nmol/kg).
a_d p<0,05, ANOVA unidireccional y prueba de comparación múltiple de Tukey para cada día; los grupos no conectados por la misma letra (en cada columna) son significativamente diferentes entre sí. Los resultados se expresaron como media ± SEM, n=6-8. iAUC = área bajo la curva sustraída de la línea base
Tabla 7: Estudio 2, Efectos sobre la ingestión de alimentos, el peso corporal y la tolerancia a la glucosa en ratones DIO tratados con el agonista del receptor de GLP-1 (compuesto núm. 47, 2 nmol/kg) y/o el compuesto GIP núm. 25 (30 nmol/kg).
a-d p<0,05, ANOVA unidireccional y prueba de comparación múltiple de Tukey para cada día; los grupos no conectados por la misma letra (en cada columna) son significativamente diferentes entre sí. Resultados se expresaron como media ± SEM, n=8. iAUC = área bajo la curva sustraída de la línea base
Tabla 8: Estudio 3, Efectos sobre la ingestión de alimentos, el peso corporal y la tolerancia a la glucosa en ratones DIO tratados con el agonista del receptor de GLP-1 (compuesto núm. 47, 2 nmol/kg) y el compuesto GIP núm. 31 (30 nmol/kg).
a-d p<0,05, ANOVA unidireccional y prueba de comparación múltiple de Tukey para cada día; los grupos no conectados por la misma letra (en cada columna) son significativamente diferentes entre sí. Resultados se expresaron como media ± SEM, n=8. iAUC = área bajo la curva sustraída de la línea base
En las Tablas 6-8, se observa que la monoterapia con el compuesto agonista del receptor de GLP-1 núm. 47 (2 nmol/kg) indujo una reducción en la ingestión de alimentos que resultó en una pérdida de peso corporal y una mejora en la tolerancia a la glucosa. La monoterapia con los derivados de GIP de la invención (compuestos 5, 25, 31, 30 nmol/kg) tuvo un efecto menor sobre la ingestión de alimentos lo que resultó en una pérdida de peso corporal menor que para el compuesto 47. La monoterapia con los derivados de GIP 5, 25, 31 mejoraron todos la tolerancia a la glucosa. La terapia combinada del compuesto 47 (2 nmol/kg) con cada uno de los derivados de GIP 5, 25, 31 (30 nmol/kg) potenció la reducción en la ingestión de alimentos y la pérdida de peso corporal con un efecto mayor que el aditivo en comparación con las monoterapias. La tolerancia a la glucosa de la terapia combinada no mejoró con respecto a la conseguida con la monoterapia con derivados de GIP (Tablas 6-8).

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Un derivado de un análogo de GIP capaz de activar el receptor de GIP humano, en donde el análogo de GIP comprende la Fórmula II (SEQ ID NO: 48): Xi-X2-Glu-Gly-Thr-Phe-Ne-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ne-Ala-Xi4-Asp-Xi6-Ne-Xi8-Gln-X20-Asp-Phe-Val-Lys-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-X31 (II), en donde los aminoácidos en las posiciones X1, X2, X14, X16, X18, X20, y X31 se seleccionan de: X1 es Tyr o D-Tyr; X2 es Aib, Ala o D-Ala; X14 es Leu, Nle o Met; X16 es Lys o Ala; X18 es Arg o His; X20 es Gln, Glu o Aib; X31 es Gly o Pro; en donde un grupo modificador se une covalentemente a la cadena lateral del grupo épsilon amino de la lisina en la posición 24, el grupo modificador se define por A-B-C-, en donde A- es A- es Quím.1 Quím. 1:
    p es un número entero en el intervalo de 14-20; en donde * denota la posición de un enlace amida que conecta A- y B-; y B-C- es un enlazador, en donde B- es Quím. 2
    Quím. 2: q es un número entero en el intervalo de 0-1; r es un número entero en el intervalo de 1-3; en donde * denota la posición del enlace amida que conecta A- y B-, y ** denota la posición de un enlace amida que conecta B- y C-; y en donde C- se selecciona de Quím. 3 y Quím. 4
    Quím. 3: Quím. 4:
    s es un número entero en el intervalo de 1-3; t es un número entero en el intervalo de 1-4; u es un número entero en el intervalo de 1-3; en donde ** denota la posición del enlace amida que conecta B- y C-, y *** denota la posición de un enlace amida que conecta C- y el grupo épsilon amino de la lisina en la posición 24; o una sal o amida farmacéuticamente aceptable del mismo. El derivado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los aminoácidos en las posiciones X1, X2, X14, X16, X18, X20, y X31 se seleccionan de: X1 es Tyr o D-Tyr; X2 es Aib o Ala; X14 es Leu, Nle o Asp; X16 es Lys o Ala; X18 es Arg o His; X20 es Gln, Glu o Aib; X31 es Gly o Pro o una sal o amida farmacéuticamente aceptable del mismo. El derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los aminoácidos en las posiciones X1, X2, X14, X16, X18, X20, y X31 se seleccionan de: X1 es Tyr o D-Tyr; X2 es Aib o Ala; X14 es Leu o Nle; X16 es Lys o Ala; X18 es Arg o His; X20 es Gln, Glu o Aib; X31 es Gly o Pro o una sal o amida farmacéuticamente aceptable del mismo. El derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los aminoácidos en las posiciones X1, X2, X14, X16, X18, X20, y X31 se seleccionan de: X1 es Tyr, Ac-Tyr, D-Tyr o Ac-D-Tyr; X2 es Aib o Ala; X14 es Nle; X16 es Lys o Ala; Xi8 es Arg o His; X20 es Gln, Glu o Aib; X31 es Gly o Pro o una sal o amida farmacéuticamente aceptable del mismo. 5. El derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el grupo modificador A-B-C- se selecciona de: Quím. 5:
    Quím. 7
    Quím. 9:
    Quím. 11:
    Quím. 13:
    Quím. 15:
    6. El derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aminoácido N-terminal del derivado se acila, por ejemplo, mediante acetilación. 7. El derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se selecciona de los siguientes: N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 1; SEQ ID NO: 6)
    N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 2; SEQ ID NO: 7)
    N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino) metN]cidohexanocarboml]ammo]butanoN]amino]etoxi]etoxi]acetN]ammo]etoxi]etoxi]acetN]-[Aib2,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 3; SEQ ID NO: 8)
    N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 4; SEQ ID NO: 9)
    N{1}-acetil, N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 5; SEQ ID NO: 10) L A Q K G oh N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 6; SEQ ID NO: 11)
    N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 7; SEQ ID NO: 12)
    N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]-butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 8; SEQ ID NO: 13)
    N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 9; SEQ ID NO: 14) L A Q K G oh N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]-butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 10; SEQ ID NO: 15)
    N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Aib20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 11; SEQ ID NO: 16)
    N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]-butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Aib20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 12; SEQ ID NO: 17)
    N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Ala16,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 13; SEQ ID NO: 18)
    N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]-butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Ala16,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 14; SEQ ID NO: 19)
    N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 15; SEQ ID NO: 20) L A Q K G - oh N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 16; SEQ ID NO: 21) L A Q K G - oh N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]-butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 17; SEQ ID NO: 22) L A Q K G - oh N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 18; SEQ ID NO: 23) L A Q K G-oh N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]etoxi]etoxi]acetil]amino]etoxi]etoxi]acetil]-[D-Tyr1,Asp14,Arg18,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 19; SEQ ID NO: 24) G -oh N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 20; SEQ ID NO: 25)
    N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]-amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 21; SEQ ID NO: 26)
    N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 22; SEQ ID NO: 27)
    N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Glu20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 23; SEQ ID NO: 28)
    N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Aib20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 24; SEQ ID NO: 29)
    N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Aib20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 25; SEQ ID NO: 30)
    N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]-butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Arg18,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida (Compuesto 26; SEQ ID NO: 31)
    N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]amino]-butanoil]amino]butanoil]-[Aib2,Nle14,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida (Compuesto 27; SEQ ID NO: 32)
    N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida (Compuesto 28; SEQ ID NO: 33)
    N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida (Compuesto 29; SEQ ID NO: 34)
    N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]-amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 30; SEQ ID NO: 35)
    N{1}-acetN,N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]-amino]butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Arg18,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida (Compuesto 31; SEQ ID NO: 36)
    N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida (Compuesto 32; SEQ ID NO: 37)
    N{1}-acetN,N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Arg18,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida (Compuesto 46; SEQ ID NO: 62)
    8. El derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el derivado es: N{1}-acetil, N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-(17-carboxiheptadecanoilamino)butanoil]amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Arg18,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 5; SEQ ID NO: 10) L A Q K GOH 9. El derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el derivado es: N{1}-acetil,N{épsilon-24H(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]cidohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Nle14,Arg18,Aib20,Lys24]-hGIP(1-31) (Compuesto 25; SEQ ID NO: 30)
    10. El derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el derivado es: N{1}-acetil,N{épsilon-24}-[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[(4S)-4-carboxi-4-[[4-[(19-carboxinonadecanoilamino)metil]ciclohexanocarbonil]amino]butanoil]-amino]butanoil]amino]butanoil]-[D-Tyr1,Aib2,Nle14,Arg18,Lys24,Pro31]-hGIP(1-31) amida (Compuesto 31; SEQ ID NO: 36)
    11. Una composición farmacéutica que comprende el derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. 12. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además un agonista del receptor de GLP-1 o un coagonista del receptor de GLP-1/glucagón. 13. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el agonista del receptor de GLP-1 es semaglutida (SEQ ID NO: 57). 14. Un derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso como un medicamento. 15. Un derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso en el tratamiento y/o prevención de la obesidad. 16. Un derivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso en el tratamiento y/o prevención de todas las formas de diabetes, por ejemplo, diabetes tipo 2.
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