ES2958619T3 - Compuestos anti-invasivos - Google Patents

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Marc Bracke
Christian Stevens
Ryck Tine De
Bart Roman
Barbara Vanhoecke
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Universiteit Gent
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Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de los compuestos antiinvasivos y métodos para predecir la actividad antiinvasiva de dichos compuestos, así como su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas con invasión celular no deseada; en particular, esta invención se refiere al campo de los compuestos antiinvasivos similares a la chalcona. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos anti-invasivos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al campo de los compuestos de tipo chalcona para uso en la inhibición de la invasión de células tumorales en el tejido adyacente en un sujeto. También se describen métodos para predecir la actividad anti-invasiva de dichos compuestos, así como su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con la invasión celular no deseada.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
A pesar de los grandes avances en la medicina en general y en el campo de la oncología en particular, el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte en todo el mundo. En 2007, representó 7,9 millones de muertes o el 13 % de la mortalidad mundial. Entre las mujeres, el cáncer de mama tiene la mayor incidencia, provocando 548.000 muertes al año. Por lo tanto, la 'guerra contra el cáncer', declarada por el presidente estadounidense Nixon hace unas cuatro décadas, está lejos de terminar.
Un tumor es una masa celular en crecimiento anormal, que resulta de un aumento de la entrada de células o de una disminución de la salida. No obstante, el crecimiento del tumor primario ya no es el principal problema terapéutico. Particularmente para los tumores 'benignos' o 'no agresivos', la extirpación quirúrgica, la radioterapia, la quimioterapia y la inmunoterapia han demostrado ser tratamientos exitosos para un gran número de pacientes. Fundamentalmente diferentes, sin embargo, son los cánceres 'malignos' o 'rápidamente progresivos', que son capaces de invadir los tejidos vecinos y posteriormente diseminarse a órganos locorregionales o distantes, provocando tumores secundarios en tejidos permisivos. Estos procesos, invasión y metástasis, son las principales causas de muerte por cáncer y, por consiguiente, constituyen un desafío principal en la investigación del cáncer. Los mecanismos moleculares de la invasión del tumor se han descifrado en parte y se originan a partir de un desequilibrio entre la expresión de los genes promotores de la invasión y supresores de la invasión (Mareel et al., 1994). Curiosamente, aunque la invasión es crucial en todas las diferentes etapas del proceso metastásico, no todos los tumores invasivos tienen tendencia a metastatizar.
Estudios o terapias existentes se centran en la inhibición de la mitosis (a través del ensamblaje de microtúbulos) y en la proliferación (Edwards et al., 1990; Romagnoli et al. 2008; Bath et al., 2005; documento WO02/02593), o en la inhibición de la angiogénesis, el reclutamiento de nuevos vasos sanguíneos (Robinson et al., 2005; documentos WO02/02593; WO03/037315). En marcado contraste con la nueva y eficiente generación de fármacos inhibidores del crecimiento que fijan como objetivo vías específicas de señalización del crecimiento en las células tumorales (p. ej., trastuzumab, imatinib e inhibidores de la farnesil transferasa), todavía no existen fármacos similares disponibles para tratar o prevenir la invasión y la metástasis. Muchos compuestos antineoplásicos están diseñados para interrumpir la replicación en células que se dividen rápidamente o para inhibir un enlace metabólico clave en células que proliferan activamente. Aunque enfoques de este tipo han tenido niveles de éxito en determinados tipos de cáncer, o cánceres en determinadas fases, la quimioterapia generalmente se asocia con efectos secundarios de desagradables a debilitantes debido a sus efectos en las células normales, tales como malestar general, náuseas, pérdida de apetito, alopecia y anemia y, en casos extremos, pérdida de la función inmunitaria y/o pérdida de la actividad digestiva. Además, los compuestos que actúan al nivel de la replicación celular, ya sea introduciendo análogos de nucleótidos en células en división o interrumpiendo la replicación normal, tienen el potencial de introducir mutaciones genéticas generalizadas en células normales del sujeto. Además, las células cancerosas pueden desarrollar resistencia a muchos tipos de agentes anticancerígenos, ya sea limitando la absorción del agente en las células o alterando el metabolismo del agente dentro de las células.
Aunque los inhibidores de la angiogénesis están diseñados para prevenir la formación de nuevos vasos sanguíneos, deteniendo o ralentizando con ello el crecimiento o la propagación de tumores, el uso de dichos compuestos no siempre dará como resultado la inhibición de la invasión, ya que la invasión puede producirse sin angiogénesis. Más aún, Pennaccietti et al. afirman que aunque los inhibidores de la angiogénesis se han mostrado prometedores al obstaculizar el suministro de sangre y controlar los tumores, parece que inhibidores de este tipo, al privar a los tumores de oxígeno, podrían tener un efecto no deseado, es decir, fomentar la metástasis. Por lo tanto, la resistencia de las células tumorales a la terapia antiangiogénica a través de la viabilidad sostenida o el aumento de la invasión puede representar un desafío previamente no reconocido.
En la actualidad, los bisfosfonatos son los fármacos más frecuentemente aplicados para el tratamiento de las metástasis óseas. Además, los inhibidores de microtúbulos (Atassi et al., 1982) y de la angiogénesis (Jain et al., 2006) se han incluido en ensayos clínicos para evaluar su actividad anti-invasiva y anti-metastásica.
No obstante, existe una necesidad continua de compuestos que se fijen específicamente como objetivo las primeras etapas del desarrollo de tumores malignos, en particular, que inhiban la invasión. Al fijar específicamente como objetivo la capacidad de las células tumorales de invadir el tejido vecino, un tumor maligno puede detenerse en su sitio inicial y evitar que se extienda por todo el cuerpo.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención era proporcionar compuestos que tuvieran una actividad anti-invasiva específica. Además, como para la mayoría de los compuestos farmacéuticos es deseable proporcionar compuestos que tengan la concentración activa más baja que sea lo más baja posible para evitar efectos secundarios no deseados y aún así obtener la actividad deseada. En general, con el fin de determinar la concentración activa más baja de un compuesto, cada uno de los compuestos individuales debe sintetizarse y testarse in vitro a diferentes concentraciones. Sin embargo, como es evidente, dicho método está lejos de ser eficiente para testar un gran conjunto de compuestos para seleccionar aquellos que tengan las mejores posibilidades de éxito. Por lo tanto, un objetivo adicional de esta solicitud era proporcionar un método adecuado para determinar in silico la concentración activa más baja de un compuesto, reduciendo con ello significativamente el número de compuestos potencialmente interesantes para sintetizar y testar in vitro.
En la búsqueda de nuevos agentes anti-invasivos, los autores de la invención han adoptado recientemente una estrategia dual de síntesis y modelado. En primer lugar, en busca de nuevas pistas, analizaron los resultados del programa de selección del grupo Bracke (Hospital Universitario de Gante, Bélgica), que contiene datos de actividad anti-invasivain vitrode cientos de compuestos. Aunque pocas de las sustancias seleccionadas inhiben la invasión de tejidos sanos por células de carcinoma MCF-7/6, los agentes potencialmente interesantes pertenecen a categorías muy diversas: polifenoles, péptidos, esteroides, fosfolípidos y retinoides. El potencial prometedor de los polifenoles se reflejó en el establecimiento del programa de selección indo-belga, un esfuerzo de colaboración de las universidades de Delhi y Gante, que ha evaluado sistemáticamente la actividad anti-invasivain vitrode polifenoles y alcaloides desde 1989 (Vanhoecke et al. al., 2005). Mirando más de cerca los resultados de esta colaboración, la atención de los autores de la invención se centró principalmente en las chalconas (1,3-diarilpropenonas) y compuestos estructuralmente relacionados, ya que se demostró que la mayoría de estos tienen una actividad anti-invasiva a 1 o 10 μM.
Aunque ciertamente prometedor como un conjunto de compuestos principales, no se disponía de un patrón de sustitución sistemática en esta colección inicial, ya que las chalconas testadas eran todas productos naturales. Por lo tanto, el primer objetivo de los autores de la invención fue ampliar la serie de chalconas seleccionadas mediante la síntesis de análogos (no naturales). Sin embargo, dado que el o los sitios de unión de las chalconas permanece(n) sin revelar, el diseño de nuevos compuestos basados en la topología del receptor fue imposible. Dado que la preparación y evaluación biológica de una colección completa de chalconas, que comprende una amplia gama de sustituyentes y farmacóforos, sería una tarea enorme, los autores de la invención previeron sintetizar un número limitado de compuestos que posean un patrón de sustitución elegido estratégicamente. La colección ampliada podría utilizarse para desarrollar un modelo de relación estructura-actividad cuantitativa (QSAR, por sus siglas en inglés), que predice la actividad anti-invasiva de compuestos hipotéticos. A su vez, esta selecciónin silicoles permitiría centrar futuros esfuerzos de síntesis en sustancias prometedoras. Un uso de este tipo de enfoques QSAR es atractivo tanto desde el punto de vista económico como ecológico.
Como se detalla en los ejemplos que siguen más adelante en esta memoria, este enfoque QSAR permitió a los autores de la invención proporcionar un modelo para la predicción in silico de la actividad anti-invasiva de los compuestos similares a las chalconas. Además, les permitió identificar compuestos anti-invasivos similares a las chalconas potencialmente interesantes que tienen una actividad anti-invasiva prevista a una concentración activa más baja de ≤ 0,1 μM y, por lo tanto, son al menos 10-100 veces más efectivos en comparación con los compuestos similares a las chalconas que están actualmente bajo investigación para su uso como compuestos anti-invasivos.
Katritzky et al., 2006 y Katritzky et al., 2006b también describen un modelo QSAR para determinar la actividad anti invasiva de múltiples compuestos orgánicos, incluyendo compuestos similares a las chalconas. Sin embargo, dicho modelo no es adecuado para predecir compuestos anti-invasivos que tengan una concentración activa mínima inferior a 1 μM, ya que la concentración activa mínima que se puede predecir haciendo uso de este modelo se establece en 1 μM, como se desprende de la tabla 1 de esta publicación y de Bracke et al., 2008.
Yadav et al., 2011 (tabla 4) proporciona una descripción general de múltiples compuestos similares a las chalconas y su concentración activa más baja que genera actividad "anticancerígena", variando dichas concentraciones de 1,9 a 50 μM. Estos compuestos son por tanto al menos 20 veces menos efectivos en comparación con los compuestos de acuerdo con esta invención.
Además, también Abel Bar et al., 2010 (concentración activa más baja 1 μM), Mukherjee et al., 2010 (concentración activa más baja 10 μM), Parmar et al., 1997 (concentración activa más baja 1 μM), Parmar et al. , 1998 (concentración activa más baja 1 μM) y Parmar et al., 2003 (concentración activa más baja 1 μM) proporcionan compuestos similares a las chalconas que se testaron para determinar su actividad anti-invasiva, sin embargo, como es evidente a partir de estos documentos, ninguno de dichos compuestos ha demostrado tener una actividad anti-invasiva de menos de 1 μM.
En resumen, en general se sabe que cuanto mayor sea la concentración de un compuesto necesaria para obtener un determinado efecto, mayor será el riesgo de efectos secundarios no deseados. Por lo tanto, existía la necesidad de compuestos que tuvieran una actividad anti-invasiva a la concentración más baja posible, así como de un modelo para predecir dicha actividad anti-invasiva con el fin de reducir la carga de experimentación. El método y los compuestos de acuerdo con esta invención proporcionan una solución a dichos problemas. Más en particular, la presente invención proporciona compuestos similares a las chalconas que tienen una actividad anti-invasiva a una concentración de 0,1 gM, o incluso menos. Además, estos compuestos no son tóxicos y no tienen efecto negativo alguno sobre la supervivencia de las células. Es una ventaja adicional que estos compuestos tengan un amplio campo de aplicación, es decir, puedan utilizarse para el tratamiento de varios tipos de cánceres, más específicamente cánceres caracterizados por la presencia de un tumor sólido maligno.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención proporciona un compuesto de fórmula I, la, Ib, Ic, Id o le, seleccionándose dicho compuesto de la lista que consiste en:
(2E)-3-(4-fluorofenil)-1-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-2-en-1-ona;
(2E)-1-(4-metoxifenil)-3-(2,4,6-trimetoxifenil)prop-2-en-1-ona;
(2E)-3-(3-fluorofenil)-1 -(4-fluorofenil)prop-2-en-1 -ona;
(2E)-3-(-2-furan-2-il)-1-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-2-en-1-ona;
(2E)-1 -(2,6-dimetoxifenil)-3-(furan-2-il)prop-2-en-1 -ona;
(2E)-1 -(4-fluorofenil)-3-(furan-3-il)prop-2-en-1 -ona; y
para uso como un compuesto anti-invasivo.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para uso como una composición anti-invasiva; comprendiendo dicha composición un compuesto de acuerdo con esta invención.
En un aspecto adicional, esta solicitud proporciona un método para inhibir la invasividad de células tumorales; comprendiendo dicho método poner en contacto dichas células con una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto o una composición de acuerdo con esta invención.
En un aspecto adicional, esta solicitud proporciona un método para inhibir la invasión de células tumorales en el tejido adyacente en un sujeto que tiene una afección asociada con la migración celular no deseada; comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una composición de acuerdo con esta invención. Estando dicha condición en particular asociada con tumores malignos sólidos; más en particular, seleccionados de la lista que comprende tumores mamarios, tumores de próstata, tumores colorrectales, tumores de pulmón, tumores cerebrales, tumores de cabeza y cuello, melanoma, sarcoma o tumores de ovario. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones. Las referencias a métodos de tratamiento en el sumario y la descripción detallada de la invención en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo del ser humano (o animal) por terapia.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS DIBUJOS
Figura 1.Determinación del 'punto de ruptura' utilizando Ar2 < 0,05 como criterio de corte.
Figura 2.Matriz de confusión del conjunto de entrenamiento.
Figura 3.Matriz de confusión del conjunto de ensayo.
Figura 4.Curva de supervivencia de Kaplan-Meier obtenida durante la evaluación inicial de la potenciain vivo.
Figura 5.Evaluación de los efectos antiproliferativos de compuestos similares a las chalconas en células MCF-7/6 en el ensayo MTT. Determinación de la actividad mitocondrial a las 24 y 48 h en presencia de 0,05, 0,5 o 5 jUmol.L-1 de un compuesto, respecto al disolvente control (promedio ± DE).
Figura 6.Evaluación de los efectos antiproliferativos de compuesto 49 en células MCF-7/6 y MCF-7/LucF5 en los ensayos SRB y MTT. Determinación del contenido total de proteínas y de la actividad mitocondrial después de 72 y 144 h en presencia de 0,1, 1, 10 o 100 μmol.L-1 de compuesto 49, respecto al control disolvente (promedio ± DE,*p < 0,05).
Figura 7.Efectos antiproliferativos de compuesto 49 sobre células de melanoma BLM. Determinación del contenido total de proteínas y de la actividad mitocondrial después de 24 h en presencia de disolvente y 0,1, 1, 10 o 100 μmol.L-1 de chalcona 49, respecto a la prueba en blanco (promedio ± DE,*p < 0,05).
Figura 8.Especificidad celular de los efectos antiproliferativos de compuesto 49, con relación al control de disolvente (promedio ± DE, *p < 0,05).Arriba:ensayo SRB después de 24 h de incubación para seis líneas celulares.Abajo: ensayo MTT después de 24 h de incubación para seis líneas celulares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se describirá ahora con más detalle. En los siguientes pasajes se definen con más detalle diferentes aspectos de la invención. Cada uno de los aspectos así definidos puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos, a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.
Cuando se describen los compuestos de la invención, los términos utilizados deben interpretarse de acuerdo con las siguientes definiciones, a menos que el contexto dicte lo contrario.
El término "alquilo" por sí mismo o como parte de otro sustituyente se refiere a un hidrocarburo completamente saturado de Fórmula CxH<2>x<+1>, en donde x es un número mayor que o igual a 1. Generalmente, los grupos alquilo de esta invención comprenden de 1 a 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden ser lineales o ramificados y pueden estar sustituidos como se indica en esta memoria. Cuando en esta memoria se utiliza un subíndice después de un átomo de carbono, el subíndice se refiere al número de átomos de carbono que puede contener el grupo mencionado. Así, por ejemplo, alquilo C<1-4>significa un alquilo de uno a cuatro átomos de carbono. Ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, butilo y sus isómeros (p. ej., n-butilo, i-butilo y t-butilo); pentilo y sus isómeros, hexilo y sus isómeros, heptilo y sus isómeros, octilo y sus isómeros, nonilo y sus isómeros; decilo y sus isómeros. Alquilo C<1>-C<6>incluye todos los grupos alquilo lineales, ramificados o cíclicos con entre 1 y 6 átomos de carbono y, por lo tanto, incluye metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, butilo y sus isómeros (p. ej., n-butilo, i -butilo y t-butilo); pentilo y sus isómeros, hexilo y sus isómeros, ciclopentilo, 2-, 3- o 4-metilciclopentilo, ciclopentilmetileno y ciclohexilo.
En una realización particular, y de acuerdo con los métodos y compuestos descritos en esta memoria, -alquilo C<1-6>significa -CH<3>y -O-alquilo C<1-6>significa -O-CH<3>.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "-halo" se refiere a halógeno; siendo dicho halógeno en una realización particular -F (-flúor).
Resultará claro para la persona experta que los compuestos de la invención pueden existir en forma de diferentes isómeros y/o tautómeros, incluyendo, pero no limitados a isómeros geométricos, isómeros conformacionales, isómeros E/Z e isómeros estereoquímicos (es decir, enantiómeros y diastereoisómeros). Todos estos posibles isómeros, tautómeros y mezclas de los mismos están incluidos dentro del alcance de la invención.
Siempre que se utilice en la presente invención, la expresión "compuestos de la invención" o una expresión similar pretende incluir los compuestos de las reivindicaciones.
Tal como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el", "la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A modo de ejemplo, "un compuesto" significa un compuesto o más de un compuesto.
Las expresiones arriba descritas y otras utilizadas en la memoria descriptiva son bien entendidos por aquellos en la técnica.
"Log cmin" se refiere al logaritmo decádico de la concentración activa más baja (cmin) de un compuesto expresado en unidades de μmol/l, y es una medida para determinar su clase de actividad anti-invasiva, como se representa en la tabla 1.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "cmin" significa la concentración activa más baja de un compuesto, es decir, la concentración más baja a la que una sustancia muestra un comportamiento anti-invasivo. "Anti-invasiva" o "actividad anti-invasiva" es la capacidad de inhibir la invasividad de las células tumorales. La invasión por células tumorales se define como la ocupación y destrucción progresiva de su entorno, y es el resultado de la degradación de la matriz y la motilidad celular direccional. La actividad anti-invasiva de un compuesto es la capacidad de inhibir o bloquear la invasión y puede evaluarse contando el número de células invasoras, por la profundidad de su invasión y/o por la cantidad de destrucción del entorno. Se pueden aplicar muchos ensayos in vitro para testar la actividad anti invasiva (para obtener una lista completa, véase Brackeet al.2008). Los tres más populares son:
- Ensayo de invasión del corazón de pollo (Bracke e t al., 2001, véanse detalles más adelante).
El valor de corte está entre el grado II (no invasivo) y el grado III (invasivo). Se considera que la actividad anti-invasiva cambia la lectura del grado III o IV (tratado con disolvente) al grado 0, grado I o grado II (tratado con compuesto).
- Ensayo de invasión de colágeno tipo I. Los geles de colágeno, preparados en el fondo de pocillos de plástico, se cubren con una suspensión de células de ensayo y se incuban con medio de cultivo líquido durante 24 h. La invasión se evalúa con un microscopio invertido de contraste de fase y se basa en el porcentaje de células que muestran extensiones en el gel. Se considera actividad anti-invasiva si este porcentaje atribuido a las células tratadas con disolvente es significativamente menor para las células tratadas con compuesto.
- Ensayo de invasión de M atrige l. Matrigel es una mezcla de componentes de la membrana basal, y se aplica como una capa semisólida encima de un filtro con poros que permiten la transgresión de las células. La suspensión de células de ensayo se siembra encima del gel y se incuba durante 1 día en un sistema de cámara de dos compartimientos. A continuación, se evalúa la invasión a través del porcentaje de células que están unidas al lado inferior del filtro. Se considera actividad anti-invasiva si este porcentaje atribuido a las células tratadas con disolvente es significativamente menor para las células tratadas con compuesto.
En el ensayo de invasión de corazón de pollo, las células cancerosas se confrontan con un fragmento de tejido normal, para no descuidar la contribución del tejido huésped en el micro-ecosistema que gobierna el comportamiento del tumor. Como tales, los fragmentos de tejido cardíaco precultivados (PHFs, por sus siglas en inglés), disecados de embriones de pollo de 9 días de edad, pueden confrontarse con agregados de células de carcinoma mamario MCF-7/6 invasivas humanas en presencia de una determinada concentración de un compuesto de ensayo. Después de ocho días, la interacción entre las células cancerosas y el PHF se evalúa histológicamente y se clasifica en una escala subjetiva de 5 grados (Bracke et al., 2001). Los grados III y IV son típicos de invasión, mientras que los grados 0, I y II corresponden a ausencia de invasión. Compuestos que inhiben la invasión de células cancerosas enfrentadas,es decir,de III/IV a 0/I/II, se determinan como anti-invasivos. Posibles ensayos alternativos generalmente conocidos en la técnica son el ensayo de invasión de colágeno de tipo I, el ensayo de cicatrización de heridas y el ensayo de invasión de Matrigel. Así, se definieron seis niveles de actividad, que van desde la clase -2 para los compuestos más activos (invasión grado I o II al nivel de 0,01 μmol/l) hasta la clase 3 (compuestos sin efecto aparente a una concentración de 100 μmol/(véase la tabla 1).
Tabla 1.Definición de las seis clases de actividad anti-invasiva de acuerdo con’cmin: la concentración más baja a la que se exhibe una actividad anti-invasivain vitro(invasión de grado I o II)
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "a una concentración de aproximadamente 0,1 μM o menos" incluye 0,1 μM, 0,05 μM, 0,01 μM, 0,005 μM, 0,001 μM y menos; y todos los valores intermedios.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "a una concentración de aproximadamente 0,01 μM o menos" incluye 0,005 μM, 0,001 μM, 0,0005 μM y menos; y todos los valores intermedios.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "descriptor molecular" pretende dar a entender el resultado final de un procedimiento lógico y matemático que transforma la información química codificada dentro de la estructura de una molécula en un número útil, es decir, el descriptor molecular teórico. Una persona experta en la técnica conoce bien estos términos y expresiones y su significado y, haciendo uso del paquete de software requerido, es capaz de determinar un descriptor teórico dado para un compuesto dado. Por ejemplo, se puede cargar un dibujo 2D de un compuesto en un paquete de software de química computacional tal como, por ejemplo, HyperChem, obteniendo con ello su geometría molecular de equilibrio refinada mediante:
(i) conversión de 2D a 3D utilizando parámetros incluidos en dicho paquete de software,
(ii) optimización previa utilizando el método de campo de fuerza de mecánica molecular (MM+) y
(iii) optimización final en el nivel semi-empírico de teoría AM1 utilizando un gradiente conjugado Polak-Ribiere y un gradiente RMS de 0,01 kcal/(Á.mol) como condición de terminación para estructuras optimizadas.
Estas geometrías son luego cargadas en un paquete de software que combina diversas técnicas estadísticas de correlación estructura-propiedad-actividad, y que permite la determinación de los descriptores teóricos definidos; tales como, por ejemplo, CODESSA Pro. Todos los descriptores definidos se derivan únicamente de la estructura molecular y, por lo tanto, su cálculo no requiere datos experimentales.
El modelo descrito en esta memoria proporciona el uso de 6 descriptores como se define en la tabla 2.
Tabla 2.DescriptoresDidel modelo óptimo y sus parámetros estadísticos
Tal como se utiliza en el modelo de acuerdo con esta solicitud, el primer descriptor, 'Contribución máxima de anti unión de un MO' (D i ),es un descriptor químico cuántico que está relacionado con la estabilidad de una molécula, dado que resultará una mayor contribución de anti-unión en un orbital molecular de mayor energía. El coeficiente deDitiene un signo positivo, lo que sugiere que las moléculas de menor energía exhibirán una potencia anti-invasiva más fuerte. Además, una puntuación más alta para este tipo de descriptor se ha asociado con una solubilidad acuosa incrementada. En el presente estudio, esto significaría que más compuestos lipófilos poseerán propiedades anti invasivas más fuertes.
DescriptorD2 ,'Área de Superficie Parcial para el átomo C', junto con su coeficiente negativo, destaca la importancia de los restos de hidrocarburos en la molécula y puede apuntar hacia una importante contribución de Van der Waals a la interacción huésped-huésped, es decir, la presencia de un importante sitio de unión lipófilo en el bolsillo de unión.
El descriptor más significativo del modelo, de acuerdo con el f-estadístico esD3 :'Calor final de formación / n° átomos’. El coeficiente de este descriptor químico cuántico lleva un signo positivo. En consecuencia, para compuestos termodinámicamente más estables, que poseen una energía de formación negativa, la contribución de este descriptor dará como resultado una puntuación global más baja y, por tanto, una actividad anti-invasiva más alta. Esta observación está en consonancia con la información extraída del descriptorDi.
'XY Sombra/XY Rectángulo',D4 ,es un índice de sombra molecular, definido como la proyección de la envolvente de Van der Waals de las moléculas en el plano XY, en que X e Y son los ejes de inercia más cortos y los segundos ejes de inercia más cortos de la molécula, respectivamente. El área de sombra se determina habitualmente mediante la aplicación de una cuadrícula cuadrada bidimensional en la proyección molecular y la suma posterior de las áreas de los cuadrados superpuestos con la proyección. Este descriptor está directamente relacionado con el tamaño molecular y, en consecuencia, también destaca la contribución de van der Waals a la unión en el objetivo molecular. Además, puede proporcionar información sobre la correcta orientación de la chalcona hacia su objetivo. Dado que el coeficiente de este descriptor porta un signo positivo, las moléculas con dimensiones proyectadas más pequeñas en el plano XY tendrán una actividad deseada más alta. Es muy probable que esto se deba a un mejor ajuste de las moléculas con una envoltura XY proyectada más pequeña en el bolsillo de unión.
El descriptorD5es el 'índice de reacción mínimo de 1 electrón para un átomo de oxígeno', calculado como
en el que las sumas se realizan sobre todos los orbitales atómicosi, jdel átomo dado,cíhomoychumoson los coeficientes orbitales atómicosPyj°en HOMO y LUMO, respectivamente, y£<lumo>y£<homo>representan las energías de los últimos orbitales. Este descriptor probablemente destaca una interacción importante entre el oxígeno del carbonilo y el sitio de unión del receptor.
El sexto descriptorD6en la ecuación QSAR es el 'Parámetro de polaridad', que se define como
^ 6 Q m u j Qmin’
es decir, la diferencia entre las cargas parciales más positivas y más negativas de la molécula. En este cálculo, la distribución de carga en la molécula se determina con base en el enfoque de Zefirov, que utiliza la escala de electronegatividad de Sanderson y representa la electronegatividad molecular como la media geométrica de las electronegatividades atómicas. El coeficiente positivo para este descriptor indica que menos polares, más lipofílicos tienden a exhibir una mejor potencia anti-invasiva. Esto nuevamente concuerda con el análisis realizado para los descriptoresDiyÜ2.
Como ya se ha definido en esta memoria, el modelo óptimo para determinar la actividad anti-invasiva de los compuestos de acuerdo con esta solicitud es:
log Cmin = - 58.90 (28.63xDij - ("16.29x0^ (1.093xD^ (9.904x04,1 - (116.3xD5J
(17.01xDe;
en dondeD1-D6representan los descriptores teóricos como se definen arriba en esta memoria.
Con el fin de proporcionar una indicación de la precisión, los errores estándares de los factores de ponderación son los siguientes:
log Cmin = - (58.90+11.91) (28.63±5.352)xOr -(16.29+2.905)xO¿ (1.093±0.145)<x>D3
(9.904±1.924)xOf-(116.3±44.61)xDs+ (17.01±5.296)xDe
Como es evidente para una persona experta en la técnica, el método como se define arriba en esta memoria, no solo es adecuado para predecir la actividad anti-invasiva de un compuesto de acuerdo con la fórmula I, sino también para predecir la actividad anti-invasiva de un compuesto de acuerdo con cualquier subgrupo de los mismos como se define en esta memoria más adelante, en particular compuestos de acuerdo con las fórmulas Ia, Ib, Ic, Id y le.
La actividad anti-invasiva puede determinarse in vitro, por ejemplo utilizando el ensayo de invasión de corazón de pollo descrito por Bracke et al., 2001. Más específicamente, la solicitud incluye dicho compuesto para uso como un compuesto anti-invasivo. Es particularmente ventajoso que estos compuestos, a dicha concentración específica, no sean tóxicos y no tengan un efecto negativo sobre la supervivencia y proliferación de las células, incluyendo las células sanas, lo que dará como resultado efectos secundarios reducidos normalmente asociados con los compuestos citotóxicos cuando se utilizan en terapia.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un compuesto que se selecciona de la lista que consiste en:
(2E)-3-(4-fluorofenil)-1-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-2-en-1-ona;
(2E)-1-(4-metoxifenil)-3-(2,4,6-trimetoxifenil)prop-2-en-1-ona;
(2E)-3-(3-fluorofenil)-1 -(4-fluorofenil)prop-2-en-1 -ona;
(2E)-3-(-2-furan-2-il)-1-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-2-en-1-ona;
(2E)-1 -(2,6-dimetoxifenil)-3-(furan-2-il)prop-2-en-1 -ona;
(2E)-1 -(4-fluorofenil)-3-(furan-3-il)prop-2-en-1 -ona; y
o un estereoisómero, tautómero, compuesto racémico, sal, hidrato o solvato del mismo, para uso en un método para inhibir la invasión de células tumorales en el tejido adyacente en un sujeto.
Más específicamente, dicho compuesto tiene una actividad anti-invasiva (p. ej., según se determina por el ensayo de invasión de corazón de pollo descrito por Bracke et al., 2001) a una concentración de 0,1 μM o menos. Incluso más específico, dicho compuesto tiene una actividad anti-invasiva a una concentración de 0,01 μM o menos. Además, la presente invención proporciona dicho compuesto para uso como un compuesto anti-invasivo. Los compuestos de la presente invención se pueden preparar de acuerdo con los esquemas de reacción proporcionados en los ejemplos en esta memoria, pero los expertos en la técnica apreciarán que estos son solo ilustrativos de la invención y que los compuestos de esta invención se pueden preparar mediante cualquiera de varios procedimientos de síntesis estándares comúnmente utilizados por los expertos en la técnica de la química orgánica.
Uso médico
La diseminación del cáncer desde su tejido de origen y su posterior crecimiento en otros órganos es el aspecto de la enfermedad que más amenaza la vida. Este proceso se denomina metástasis y requiere que las células cancerosas sobrevivan y proliferen fuera de su tejido de origen. El primer paso crucial en este proceso es la invasión de células cancerosas en el tejido que rodea el tumor y la vasculatura.
Los compuestos de la presente invención son capaces de inhibir dicha primera etapa y, con ello, prevenir y/o reducir la diseminación de células cancerosas y la formación de metástasis. Como tal, la invención se refiere a los compuestos descritos en esta memoria para uso en el tratamiento del cáncer mediante la inhibición de la invasión de células tumorales en el tejido circundante o adyacente, células y/o su entrada en el sistema circulatorio. Por lo tanto, los compuestos de la invención son especialmente útiles para inhibir o detener la propagación del tumor.
En un aspecto específico, el compuesto de la invención se utiliza como un compuesto anti-invasivo. Anti-invasivo se refiere a la capacidad de inhibir la invasión del tumor o célula cancerosa en el tejido circundante (dentro o fuera del órgano de origen). Para determinar si un compuesto exhibe un comportamiento anti-invasivo, se puede aplicar el ensayo de invasión de corazón de pollo como se describe en Bracke et al., 2001. Este método de selección confronta células cancerosas con un fragmento de tejido normal, para no descuidar la contribución del tejido huésped en el micro-ecosistema que gobierna el comportamiento del tumor. La interacción entre las células cancerosas y el tejido normal se evalúa histológicamente y se clasifica en una escala subjetiva de 5 grados. Los grados III y IV son típicos de invasión, mientras que los grados 0, I y II corresponden a ausencia de invasión. Compuestos que inhiben la invasión de células cancerosas confrontadas,es decir,de III/IV a 0/I/II, se determinan como anti-invasivos. Posibles ensayos alternativos generalmente conocidos en la técnica son el ensayo de invasión de colágeno de tipo I y el ensayo de invasión de Matrigel.
Esta invención proporciona, además, una composición farmacéutica para uso como una composición anti-invasiva; comprendiendo dicha composición un compuesto de acuerdo con esta invención y un soporte, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En aún un aspecto adicional, esta solicitud proporciona un método para prevenir o inhibir la invasividad de células tumorales; comprendiendo dicho método poner en contacto dichas células con una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto o una composición de acuerdo con esta solicitud.
En un aspecto adicional, esta solicitud proporciona un método para inhibir la invasión de células tumorales en el tejido circundante en un sujeto que tiene una afección asociada con la migración celular no deseada; comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una composición de acuerdo con esta solicitud. Estando dicha afección en particular caracterizada por la presencia de un tumor maligno sólido; más en particular, estando dicha afección seleccionada de la lista que comprende tumores mamarios, tumores de próstata, tumores colorrectales, tumores de pulmón, tumores cerebrales, tumores de cabeza y cuello, melanoma, sarcoma o tumores de ovario.
La presente solicitud proporciona, además, un método para el tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno asociado con la migración celular no deseada; en particular estando asociado con tumores malignos sólidos; más en particular seleccionado de la lista que comprende tumores mamarios, tumores de próstata, tumores colorrectales, tumores de pulmón, tumores cerebrales, tumores de cabeza y cuello, melanoma, sarcoma y tumores de ovario.
Para uso farmacéutico, los compuestos de la invención se pueden utilizar como un ácido libre o una base, y/o en forma de una sal por adición de ácidos y/o por adición de bases farmacéuticamente aceptable (p. ej., obtenida con ácido o base orgánico o inorgánico no tóxico), en forma de un hidrato, solvato y/o complejo. Tal como se utiliza en esta memoria y a menos que se indique lo contrario, el término "solvato" incluye cualquier combinación que pueda formarse por un compuesto de esta invención con un disolvente inorgánico adecuado (p. ej., hidratos) o un disolvente orgánico, tal como, pero no limitado a alcoholes, cetonas, ésteres y similares. Sales, hidratos, solvatos, etc. de este tipo y la preparación de los mismos serán evidentes para la persona experta; se hace referencia, por ejemplo, a las sales, hidratos, solvatos, etc. descritos en los documentos US-A-6.372.778, US-A-6.369.086, U<s>-A-6.369.087 y US-A-6.372.733.
Sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de acuerdo con la invención, es decir, en forma de productos hidrosolubles, solubles en aceite o dispersables, incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario que se forman, p. ej., a partir de ácidos o bases inorgánicos u orgánicos. Ejemplos de sales por adición de ácidos de este tipo incluyen acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftaleno-sulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Sales de bases incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos tales como sales de sodio y potasio, sales de metales alcalinotérreos tales como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas tales como sales de diciclohexilamina, N-metil-D-glucamina y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina, etcétera. Además, los grupos de carácter básico que contienen nitrógeno pueden cuaternizarse con agentes tales como haluros de alquilo inferior, tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo tales como dimetilo, dietilo, dibutilo; y sulfatos de diamilo, haluros de cadena larga, tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, haluros de aralquilo tales como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen el etanolato de sal sulfato y las sales sulfato.
Generalmente, para uso farmacéutico, los compuestos de la invención pueden formularse como una preparación farmacéutica o composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de la invención y al menos un soporte, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más otros compuestos farmacéuticamente activos.
Por medio de ejemplos no limitantes, una formulación de este tipo puede estar en una forma adecuada para administración oral, para administración parenteral (tal como por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa), para administración tópica (incluyendo ocular), para administración por inhalación, parche cutáneo, implante, supositorio, etc. Formas de administración adecuadas de este tipo - que pueden ser sólidas, semisólidas o líquidas, dependiendo de la manera de administración - así como métodos y soportes, diluyentes y excipientes para uso en la preparación de los mismos, serán claros para la persona experta; se vuelve a hacer referencia, por ejemplo, a los documentos US-A-6.372.778, US-A-6.369.086, u S-A-6.369.087 y US-A-6.372.733, así como a los manuales estándares tales como la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences.
Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos, de preparaciones de este tipo incluyen comprimidos, píldoras, polvos, pastillas, bolsitas, sellos, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles, ungüentos, cremas, lociones, cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, gotas para los ojos, soluciones inyectables estériles y polvos envasados estériles (que habitualmente se reconstituyen antes de su uso) para administración en forma de un bolo y/o para administración continua, que pueden formularse con soportes, excipientes y diluyentes que son adecuados per se para formulaciones de este tipo, tales como lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, celulosa, agua (estéril), metilcelulosa, hidroxibenzoatos de metilo y propilo, talco, estearato de magnesio, aceites comestibles, aceites vegetales y aceites minerales o mezclas adecuadas de los mismos. Las formulaciones pueden contener opcionalmente otras sustancias farmacéuticamente activas (que pueden o no dar lugar a un efecto sinérgico con los compuestos de la invención) y otras sustancias que se utilizan comúnmente en las formulaciones farmacéuticas, tales como agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes dispersantes, desintegrantes, agentes conferidores de consistencia, cargas, agentes conservantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, reguladores de flujo, agentes de liberación, etc. Las composiciones también pueden formularse para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada del o de los compuestos activos contenidos en las mismas, por ejemplo utilizando liposomas o matrices poliméricas hidrófilas a base de geles naturales o polímeros sintéticos. Con el fin de potenciar la solubilidad y/o la estabilidad de los compuestos de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, puede ser ventajoso emplear a-, p- o<y>-ciclodextrinas o sus derivados. En el documento EP-A-721.331 se ha descrito una forma interesante de formular los compuestos en combinación con una ciclodextrina o un derivado de la misma. En particular, la presente invención abarca una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de acuerdo con la invención con una ciclodextrina farmacéuticamente aceptable.
Además, co-disolventes tales como los alcoholes pueden mejorar la solubilidad y/o la estabilidad de los compuestos. En la preparación de composiciones acuosas, la adición de sales de los compuestos de la invención puede ser más adecuada debido a su mayor solubilidad en agua.
Más en particular, las composiciones se pueden formular en una formulación farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de partículas que consisten en una dispersión sólida de los compuestos de la invención y uno o más polímeros hidrosolubles farmacéuticamente aceptables.
La expresión "una dispersión sólida" define un sistema en estado sólido (en contraposición a un estado líquido o gaseoso) que comprende al menos dos componentes, en donde un componente se dispersa más o menos uniformemente en el otro componente o componentes. Cuando dicha dispersión de los componentes es tal que el sistema es química y físicamente uniforme u homogéneo en su totalidad o consiste en una fase como se define en termodinámica, una dispersión sólida de este tipo se denomina "una solución sólida". Soluciones sólidas son los sistemas físicos preferidos porque los componentes de las mismas habitualmente están fácilmente biodisponibles para los organismos a los que se administran.
Además, puede ser conveniente formular los compuestos en forma de nanopartículas que tengan un modificador de superficie adsorbido en la superficie de las mismas en una cantidad suficiente para mantener un tamaño de partícula promedio efectivo de menos de 1000 nm. Modificadores de la superficie adecuados se pueden seleccionar preferiblemente de excipientes farmacéuticos orgánicos e inorgánicos conocidos. Excipientes de este tipo incluyen diversos polímeros, oligómeros de bajo peso molecular, productos naturales y tensioactivos. Modificadores de la superficie preferidos incluyen tensioactivos no iónicos y aniónicos.
Aún otra forma interesante de formular los compuestos de acuerdo con la invención implica una composición farmacéutica en la que los compuestos se incorporan en polímeros hidrófilos y esta mezcla se aplica como una película de recubrimiento sobre muchas perlas pequeñas, produciendo con ello una composición con buena biodisponibilidad que puede ser convenientemente fabricada y que es adecuada para preparar formas de dosificación farmacéuticas para la administración oral. Materiales adecuados para uso como núcleos en las perlas son múltiples, siempre que dichos materiales sean farmacéuticamente aceptables y tengan las dimensiones y la firmeza apropiadas. Ejemplos de materiales de este tipo son polímeros, sustancias inorgánicas, sustancias orgánicas y sacáridos y derivados de los mismos.
Las preparaciones se pueden preparar de una manera conocida per se, que habitualmente implica mezclar al menos un compuesto de acuerdo con la invención con el uno o más soportes farmacéuticamente aceptables y, si se desea, en combinación con otros compuestos farmacéuticos activos, cuando sea necesario bajo condiciones asépticas. Se hace referencia nuevamente a los documentos US-A-6.372.778, US-A-6.369.086, US-A-6.369.087 y US-A-6.372.733 y la técnica anterior adicional mencionada anteriormente, así como a los manuales estándares tales como la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences.
Las preparaciones farmacéuticas de la invención están preferiblemente en una forma de dosificación unitaria, y pueden envasarse adecuadamente, por ejemplo, en una caja, blíster, vial, frasco, bolsita, ampolla o en cualquier otro soporte o recipiente monodosis o multidosis adecuado (que puede estar debidamente rotulado); opcionalmente con uno o más prospectos que contengan información del producto y/o instrucciones de uso. Generalmente, dosis unitarias de este tipo contendrán entre 1 y 1000 mg, y habitualmente entre 5 y 500 mg, del al menos un compuesto de la invención, p. ej., aproximadamente 10, 25, 50, 100, 200, 300 o 400 mg por dosis unitaria.
Los compuestos se pueden administrar por una diversidad de vías, incluyendo las vías oral, rectal, ocular, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular o intranasal, dependiendo principalmente de la preparación específica utilizada y de la afección a tratar o prevenir, y generalmente se prefiere la administración oral e intravenosa. El al menos un compuesto de la invención se administrará generalmente en una "cantidad eficaz", lo que significa cualquier cantidad de un compuesto de Fórmula I, II o III o cualquier subgrupo del mismo que, tras una administración adecuada, sea suficiente para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado en el individuo al que se administra. Por lo general, dependiendo de la afección a prevenir o tratar y de la vía de administración, una cantidad eficaz de este tipo estará habitualmente entre 0,01 y 1000 mg por kilogramo de peso corporal del paciente al día, más a menudo entre 0,1 y 500 mg, tal como entre 1 y 250 mg, por ejemplo aproximadamente 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200 o 250 mg, por kilogramo de peso corporal del paciente al día, que puede administrarse como una dosis única diaria, dividida en una o más dosis diarias, o esencialmente de forma continua, p. ej., utilizando una infusión por goteo. La(s) cantidad(es) a administrar, la vía de administración y el régimen de tratamiento adicional pueden ser determinados por el médico tratante, dependiendo de factores tales como la edad, el sexo y el estado general del paciente y la naturaleza y gravedad de la enfermedad/síntomas a tratar. Se hace referencia nuevamente a los documentos US-A-6.372.778, US-A-6.369.086, US-A-6.369.087 y US-A-6.372.733 y la técnica anterior adicional mencionada anteriormente, así como a los manuales estándares tales como la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences.
De acuerdo con el método de la presente invención, dicha composición farmacéutica se puede administrar por separado en diferentes momentos durante el curso de la terapia o simultáneamente en formas de combinación única o dividida. Por lo tanto, debe entenderse que la presente invención abarca todos estos regímenes de tratamiento simultáneo o alternativo y el término "administrar" debe interpretarse en consecuencia.
Para una forma de administración oral, las composiciones de la presente invención pueden mezclarse con aditivos adecuados, tales como excipientes, estabilizantes o diluyentes inertes, y llevarse por medio de métodos habituales a las formas de administración adecuadas, tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas duras, soluciones acuosas, alcohólicas u oleosas. Ejemplos de soportes inertes adecuados son goma arábiga, magnesia, carbonato de magnesio, fosfato de potasio, lactosa, glucosa o almidón, en particular, almidón de maíz. En este caso, la preparación se puede llevar a cabo tanto en forma de gránulos secos como húmedos. Excipientes o disolventes oleosos adecuados son aceites vegetales o animales, tales como aceite de girasol o aceite de hígado de bacalao. Disolventes adecuados para soluciones acuosas o alcohólicas son agua, etanol, soluciones de azúcar o mezclas de las mismas. Los polietilenglicoles y polipropilenglicoles también son útiles como auxiliares adicionales para otras formas de administración. Como comprimidos de liberación inmediata, estas composiciones pueden contener celulosa microcristalina, fosfato dicálcico, almidón, estearato de magnesio y lactosa y/u otros excipientes, aglutinantes, extensores, desintegrantes, diluyentes y lubricantes conocidos en la técnica. Cuando se administran por aerosol nasal o inhalación, estas composiciones se pueden preparar de acuerdo con técnicas bien conocidas en el campo de la formulación farmacéutica y se pueden preparar en forma de soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarbonos, y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes conocidos en la técnica. Formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración en forma de aerosoles o esprays son, por ejemplo, soluciones, suspensiones o emulsiones de los compuestos de la invención o sus sales fisiológicamente tolerables en un disolvente farmacéuticamente aceptable, tal como etanol o agua, o una mezcla de disolventes de este tipo. Si es necesario, la formulación también puede contener otros auxiliares farmacéuticos, tales como tensioactivos, emulsionantes y estabilizantes, así como un propulsor. Para la administración subcutánea, el compuesto de acuerdo con la invención, si se desea, con las sustancias usuales, tales como solubilizantes, emulsionantes u otros coadyuvantes, se disuelven, suspenden o emulsionan. Los compuestos de la invención también pueden liofilizarse y los liofilizados obtenidos pueden utilizarse, por ejemplo, para la producción de preparaciones para inyección o infusión. Disolventes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina fisiológica o alcoholes, p. ej., etanol, propanol, glicerol, además también soluciones de azúcar tales como soluciones de glucosa o manitol o, alternativamente, mezclas de los diferentes disolventes mencionados. Las soluciones o suspensiones inyectables se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida, utilizando diluyentes o disolventes adecuados, no tóxicos y parenteralmente aceptables, tales como manitol, 1,3-butanodiol, agua, solución de Ringer o solución isotónica de cloruro de sodio, o dispersantes o agentes humectantes y de suspensión adecuados, tales como aceites fijos, blandos y estériles, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos, y ácidos grasos, incluido el ácido oleico.
Cuando se administran por vía rectal en forma de supositorios, estas formulaciones pueden prepararse mezclando los compuestos de acuerdo con la invención con un excipiente no irritante adecuado, tal como manteca de cacao, ésteres de glicéridos sintéticos o polietilenglicoles, que son sólidos a temperaturas ordinarias, pero se licuan y/o disuelven en la cavidad rectal para liberar el fármaco.
En realizaciones preferidas, los compuestos y las composiciones de la invención se utilizan localmente, por ejemplo, de forma tópica o en aplicaciones tanto absorbidas como no adsorbidas.
Las composiciones son valiosas en el campo veterinario, que para los fines de esta memoria no solo incluye la prevención y/o el tratamiento de enfermedades en animales, sino también - para animales económicamente importantes tales como ganado vacuno, porcino, ovino, pollos, pescado, etc. - el potenciamiento del crecimiento y/o el peso del animal y/o la cantidad y/o la calidad de la carne u otros productos obtenidos del animal. Así, en un aspecto adicional, la solicitud se refiere a una composición para uso veterinario que contiene al menos un compuesto de la invención y al menos un soporte adecuado (es decir, un soporte adecuado para uso veterinario). La invención también se refiere al uso de un compuesto de la invención en la preparación de una composición de este tipo.
La invención se ilustrará ahora por medio de los siguientes ejemplos de síntesis y biológicos.
EJEMPLOS (solo los ejemplos 43,45,53,75,76,77 son parte de la invención, los demás compuestos son compuestos de referencia)
A. Propiedades físico-químicas de los compuestos
Información detallada para los compuestos del conjunto de entrenamiento 1-34 se puede encontrar en sus referencias correspondientes como se indica en la Tabla 10 que figura más adelante.
Compuesto 42: (2E)-3-(2,4,5-trimetoxifenil)-1-(2,4,6-trimetoxifenil)propenona
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm): 5 = 3.77 (s, 6H, 2x OMe), 3.81 (s, 3H, OMe), 3.85 (s, 3H, OMe) 3.86 (s, 3H, OMe), 3.92 (s, 3H, OMe), 6.16 (s, 1H, H3', H5'), 6.47 (s, 1H, H3), 6.90 (d, 1H, Jtrans = 16.1 Hz, Ha), 7.04 (s, 1H, H6), 7.66 (d, 1H, Jtrans = 16.1 Hz, H3); 13C NMR (CDCla, 75 MHz, ppm): 5 = 55.42 (OMe), 55.90 (2x OMe), 56.03 (OMe), 56.40 (2x OMe), 90.75 (C3', C5'), 96.92 (C3), 110.82 (C6), 112.17 (C1'), 115.44 (C1), 127.14 (Ca), 139.72 (CqO), 143.25 (C3), 152.27 (cqO), 154.13 (CqO), 158.67 (2x CqO), 162.13 (CqO), 194.87 (C=O); IR (KΒr, cm-1): v = 1634 (C=O), 1600 (C=C), 1586, 1208, 1152, 1124, 1026, 812; MS (ES+): m/z (%): 389.1 ([M+H]+, 100), 390.1 ([M+1+H]+, 23) 799.3 (6); MP (°C): 127.5 128.5 °C.
Rendimiento: 78 %, cristales amarillos.
Compuesto 43: (2 E)-3-(4-metoxifenil)-1-(2,4,6-trimetoxifenil)propenona
1H NMR (CDCla, 300 MHz, ppm): 5 = 3.77 (s, 6H, 2 x OMe), 3.83 (s, 3H, OMe), 3.86 (s, 3H, OMe), 6.16 (s, 2H, H3', H5'), 6.87 (d, 1H, Jtrans = 16.0 Hz, Ha), 6.89 (d, 2H, Jh,víc = 8.5 Hz, H3, H5), 7.31 (d, 1H, Jtrans = 16.0 Hz, H3), 7.48 (d, 2H, Jh,víc = 8.5 Hz, H2, H6); 13C NMR (CDCh, 75 MHz, ppm): 5 = 55.36 (OMe), 55.44 (OMe), 55.90 (2 x OMe), 90.69 (C3', C5'), 111.88 (C1'), 114.27 (C3, C5), 126.97 (Ca), 127.63 (C1), 130.08 (C2, C6), 144.27 (C3), 158.71 (C2, C6), 161.40 (CqO), 162.27 (CqO), 194.42 (C=O); IR (KΒr, cm-1): v = 1672, 1634 (C=O), 1594 (C=C), 1572, 1512, 1253, 1222, 1200, 1174, 1152, 1127, 1020, 820, 804; MS (ES+): m/z (%): 329.1 ([M+H]+, 100), 330.1 ([M+1+H]+, 21), 679.2 (13), 680.2 (5); MP (°C): 118.5-119.5 °C.
Rendimiento: 69 %, cristales amarillo pálido.
Compuesto 44: (2E)-3-(2,4,5-trimetoxifenil)-1-(4-metoxifenil)propenona
1H NMR (CDCh, 300 MHz, ppm): 5 = 3.88 (s, 3H, OMe), 3.90 (s, 3H, OMe), 3,90 (s, 3H, OMe), 3.94 (s, 3H, OMe), 6.52 (s, 1H, H3), 6.97 (d, 2H, J<h>,<víc>= 8.8 Hz, H3', H5'), 7.13 (s, 1H, H6), 7.48 (d, 1H, Jtrans = 15.7 Hz, Ha), 8.03 (d, 2H, J<h>,<víc>= 8.8 Hz, H2', H6), 8.09 (d, 1H, Jtrans = 15.7 Hz, H3); 13C NMR (CDCh, 75 MHz, ppm): 5 = 55.41 (OMe), 56.00 (OMe), 56.29 (OMe), 56.51 (OMe), 96.77 (C3), 111.30 (C6), 113.69 (C3, C5'), 115.53 (C1), 119.85 (Ca), 130.65 (C2, C6), 131.56 (C1'), 139.26 (CP), 143.15 (cqO), 152.30 (CqO), 154.51 (CqO), 163.08 (CqO), 189.22 (C=O); IR (KΒr, cm-1): v = 1466, 1504, 1563, 1584, 1603 (C=C), 1646 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 329.2 ([M+H]+, 100); MP (°C): 124°C.
Rendimiento: 92 %, cristales amarillos.
Compuesto 45: (2E)-1-(4-metoxifenil)-3-(2,4,6-trimetoxifenil)prop-2-en-1-ona
Esta molécula ha sido reseñada por Okunrobo et al., 2006
Compuesto 46: (2E)-3-(2,4,5-trimetoxifenil)-1-(2,6-dimetoxifenil)propenona
1H NMR (CDCla, 300 MHz, ppm):5= 3.78 (s, 6H, 2x OMe), 3.80 (s, 3H, OMe), 3.85 (s, 3H, OMe), 3.92 (s, 3H, OMe), 6.47 (s, 1H, H3), 6.62 (d, 2H,Jh,víc = 8.5 Hz, H3', H5'), 6.91 (d, 1H, Jtrans = 16.1 Hz, Ha), 7.04 (s, 1H, H6), 7.32 (t, 1H,Jh,víc = 8.5 Hz, H4'), 7.63 (d, 1H, Jtrans = 16.1 Hz, HP); 13C NMR (CDCla, 75 MHz, ppm):5= 55.99 (2x OMe), 56.06 (OMe), 56.45 (OMe), 56.49 (OMe), 97.01 (C3), 104.19 (C3', C5'), 110.97 (C6), 115.49 (C1), 119.09 (C1'), 126.79 (Ca), 130.42 (C4'), 140.39 (Cp), 143.35 (c^O), 152,39 (C^O), 154.21 (Cq-2O), 157.54 (C2, C6'), 195.49 (C=O); IR (KΒr, cm-1): v = 1473, 1510, 1599 (C=C), 1638 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 359.2 ([M+H]+, 100); MP (°C): 157.7°C.
Rendimiento: 62 %, cristales amarillo pálido.
Compuesto 47: (2E)-3-(2,4,6-trimetoxifenil)-1-(2,6-dimetoxifenil)propenona
1H NMR (CDCh, 300 MHz, ppm):5= 3.76 (s, 6H, 2x OMe), 3.79 (s, 6H, 2x OMe), 3.82 (s, 3H, OMe), 6.07 (s, 2H, H3, H5), 6.59 (d, 2H,J<h>,<víc>= 8.3 Hz, H3', H5'), 7.28 (t, 1H,J<h>,<víc>= 8.3 Hz, H4'), 7.31 (d, 1H, Jtrans = 16.4 Hz, Ha), 7.77 (d, 1H, Jtrans = 16.4 Hz, HP); 13C NMR (CDCh, 75 MHz, ppm):5= 55.35 (OMe), 55.71 (2x OMe), 55.96 (2x OMe), 90.46 (C3, C5), 104.13 (C3', C5'), 106.28 (C1), 119.40 (C1'), 128.66 (Ca), 130.07 (C4'), 137.37 (CP), 157.49 (2x C^O), 161.48 (2x CqO), 163,12 (C4), 197.25 (C=O); IR (KΒr, cm'1): v = 1454, 1471, 1563, 1584, 1611 (C=C), 1664 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 359.2 ([M+H]+, 100); MP (°C): 158°C.
Rendimiento: 64 %, cristales amarillo pálido.
Compuesto 49: (2E)-3-(4-fluorofenil)-1-(3,4,5-trimetoxifenil)propenona
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm):5= 3.94 (s, 3H, OMe), 3.95 (s, 6H, 2 x OMe), 7.11 (dd, 1H,Jh,víc = 8.5 Hz,Jhf = 8.5 Hz, H3, H5), 7.28 (s, 2H, H2', H6'), 7.42 (d, 1H, Jtrans = 15.4 Hz, Ha), 7.64 (dd, 2H,J<h>,<víc>=8.5 Hz,J<hf>= 5.2 Hz, H2, H6), 7.78 (d, 1H, Jtrans = 15.4 Hz, HP); 13C NMR (CDCh, 75 MHz, ppm):5= 56.32 (2x OMe), 60.95 (OMe), 106.02 (C2', C6'), 116.09 (C3, C5,J<cf>= 21.9 Hz), 121.34 (Ca), 130.40 (C2, C6,J<cf>= 8.1 Hz), 131.15 (C1,J<cf>= 3.5 Hz), 133.38 (CP), 142.51 (C1'), 143.35 (C4'O), 153.15 (C3', C5'), 164.01 (C4,J<cf>= 251.5Hz), 188.85 (C=O); 19F NMR (CDCh, 282 MHz, ppm):5= (-)109.57 -(-)109.35 (m); IR (ATR, cm'1): v = 1124, 1157, 1227, 1338, 1504, 1580, 1599, 1611, 1660 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 317.1 ([M+H]+, 100), 318.1 (18), 339.1 (8), 655.2 (8); MP (°C): 124-125 °C.
Rendimiento: 69 %, agujas blanquecinas.
Compuesto 52: (2E)-3-(4-clorofenil)-1-(4-metoxifenil)prop-2-en-1-ona
Esta molécula ha sido reseñada por Kumar et al. 2010
Compuesto 53: (2E)-3-(3-fluorofenil)-1-(4-fluorofenil)propenona
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm):5= 7.05-7.16 (m, 1H, H4), 7.17 (dd, 1H,Jh,víc = 8.8 Hz,Jhf = 8.8 Hz, H3', H5'), 7.29 7.43 (m, 3H, H1, H5, H6), 7.49 (d, 1H, Jtrans = 15.7 Hz, Ha), 7.75 (d, 1H, Jtrans = 15.7 Hz, HP), 8.06 (dd, 2H,J<hvíc>= 8.8 Hz,Jhf = 5.5 Hz, H2', H6); 13C NMR (CDCh, 75 MHz, ppm):5= 77.16 (CDCh), 114.47 (C4,Jcf = 21.9 Hz), 115.81 (C3', C5',Jcf = 21.9 Hz), 117.44 (C2,Jcf = 21.9 Hz), 122.64 (Ca), 124.64 (C6,Jcf = 2.3 Hz), 130.54 (C5,Jcf = 8.1 Hz), 131.16 (C2', C6',J<cf>= 9.2 Hz), 134.26 (C1,J<cf>= 2.3 Hz), 137.04 (C1,J<cf>= 6.9 Hz), 143.38 (CP), 163.03 (CF,J<cf>= 246.9 Hz), 165.71 (CF,J<cf>= 255.0 Hz), 188.30 (C=O); 19F NMR (CDCh, 282 MHz, ppm):5= (-)112.95 - (-)112.75 (m, CF), (-)105.65 -(-)105.49 (m, CF); IR (ATR, cm-1): v = 1669 (C=O), 1609, 1598 (C=C), 1583, 1444, 1227, 1207, 1159, 1141, 834, 779; MS (ES+): m/z (%): 245.0 ([M+H]+, 100), 246.1 ([M+1+H]+, 15); MP (°C): 94-95 °C.
Rendimiento: 70 %, agujas amarillo pálido.
Compuesto 54: (2E)-3-(3-fluorofenil)-1-(4-metoxifenil)propenona
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm):5= 3.89 (s, 3H, OMe), 6.99 (dd, 1H,J<h>,<víc>= 9.1 Hz, H3', H5'), 7.04-7.16 (m, 1H, H4), 7.29-7.44 (m, 3H, H2, H5, H6), 7.53 (d, 1H, Jtrans = 15.7 Hz, Ha), 7.75 (d, 1H, Jtrans = 15.7 Hz, HP), 8.04 (d, 2H,J<h>,<víc>= 9.1 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCh, 75 MHz, ppm):5= 55.48 (OMe), 113.92 (C3', C5'), 114.37 (C4,Jcf = 21.9 Hz), 117.12 (C2, J<cf>= 20.8 Hz), 123.00 (Ca), 124.48 (C6, J<cf>= 2.3 Hz), 130.46 (C5, J<cf>= 8.1 Hz), 130.88 (C1, C2', C6), 137.37 (C1, J<cf>= 6.9 Hz), 142.39 (CP, J<cf>= 2.3 Hz), 163.03 (C3, J<cf>= 246.9 Hz), 163.60 (C4'O), 188.24 (C=O); 19F NMR (CDCls, 282 MHz, ppm):5= (-)113.15 -(-)112.99 (m); IR (ATR, cm-1): v = 1662 (C=O), 1612, 1596, 1584 (C=C), 1446, 1337, 1261, 1239, 1199, 1172, 1144, 1017, 1000, 967, 828, 774; MS (ES+): m/z (%): 257.1 ([M+H]+, 100), 258.1 ([M+1+H]+, 17), 279.1 ([M+Na]+, 6); MP (°C): 104.5-105.5 °C.
Rendimiento: 76 %, cristales blancos.
Compuesto 60: (2E)-3-fenil-1-[4-(3-metilbut-2-eniloxi)fenil]propenona
1H NMR (CDCla, 300 MHz, ppm):5= 1.77 (br. s, 3H, Me), 1.82 (br. s, 3H, Me), 4.60 (d, 2H, Jvic = 6.6 Hz, OCH<2>), 5,51 (tt. 1H, Jvic = 6.6 Hz, Jallyl = 1.4 Hz, =CH), 6.99 (d, 2H, Jvic = 9.1 Hz, H3', H5'), 7.37-7.47 (m, 3H, H3, H4, H5), 7.56 (d, 1H, Jtrans = 15.7 Hz, Ha), 7.61-7.69 (m, 2H, H2, H6), 7.81 (d, 1H, Jtrans = 15.7 Hz, Hp), 8.04 (d, 2H, Jvic = 9.1 Hz, H2', H6); 13C NMR (CDCls, 75 MHz, ppm):5= 18.28 (Me), 25.85 (Me), 65.04 (OCH<2>), 114.51 (C3', C5'), 118.98 (=CH), 121.90 (Ca), 128.36 (C2, C6), 128.92 (C3, C5), 130.31 (C4), 130.80 (C2, C6), 130.95 (C1'), 135.12 (C1), 138.97 (Cq), 143.90 (Cp), 162.80 (C4'O), 188.71 (C=O); IR (KΒr, cm-1): v = 1574, 1597, 1610 (C=C), 1657 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 293.2 ([M+H]+, 100); MP (°C): 63-64°C.
Rendimiento: 86 %, cristales amarillo-anaranjados.
Compuesto 61: (2E)-3-(4-clorofenil)-1-[4-(3-metilbut-2-eniloxi)fenil]propenona
1H NMR (CDCls, 300 MHz, ppm):5= 1.77 (br. s, 3H, Me), 1.82 (br. s, 3H, Me), 4.60 (d, 2H, Jvic = 6.6 Hz, OCH<2>), 5.50 (tt, 1H, Jvic = 6.6 Hz, Jallyl = 1.4 Hz, =CH), 6.99 (d, 2H, Jvic = 8.8 Hz, H3', H5'), 7.39 (d, 2H, JH,víc= 8.3 Hz, H3, H5), 7.53 (d, 1H, Jtrans = 15.7 Hz, Ha), 7.58 (d, 2H, Jvic = 8.3 Hz, H2, H6), 7.75 (d, 1H, Jtrans = 15.7 Hz, Hp), 8.03 (d, 2H, Jvic = 8.8 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCls, 75 MHz, ppm):5= 18.26 (Me), 25.85 (Me), 65.04 (OCH<2>), 114.53 (C3, C5), 118.91 (=CH), 122.27 (Ca), 129.18 (C3, C5), 129.50 (C2, C6), 130.74 (Cq), 130.82 (C2, C6), 133.58 (Cq), 136.15 (C^), 139.03 (C^), 142.38 (Cp), 162,90 (Cq4'O), 188.35 (C=O); IR (KΒr, cm-1): v = 1566, 1574, 1603 (C=C), 1657 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 327.2 ([M+H]+, 100), 329.2 ([M+2+H]+, 32); MP (°C): 140.5-142°C.
Rendimiento: 86 %, cristales amarillos.
Compuesto 62: (2E)-3-(4-fluorofenil)-1-[4-(3-metilbut-2-eniloxi)fenil]propenona
1H NMR (CDCls, 300 MHz, ppm): 5= 1.77 (br. s, 3H, Me), 1.82 (br. s, 3H, Me), 4.60 (d, 2H,Jvic= 6.6 Hz, OCH<2>), 5.50 (t x t, 1H,Jvic= 6.6 Hz,Jallyl= 1.4 Hz, =CH), 6.99 (d, 2H,Jvic= 9.1 Hz, H3', H5'), 7.11 (dd, 2H,Jh.víc= 8.8 Hz,Jhf= 8.8 Hz, H3, H5), 7.48 (d, 1H,Jtrans= 15.7 Hz, Ha), 7.63 (dd, 2H,Jhvíc= 8.8 Hz,Jhf= 5.5 Hz, H2, H6), 7.77 (d, 1H,Jtrans= 15.7 Hz, HP), 8.03 (d, 2H,Jvic= 9.1 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCls, 75 MHz, ppm): 5= 18.56 (Me), 26.15 (Me), 65.33 (OCH<2>), 114.80 (C3, C5), 116.36 (d, J<cf>= 21.9 Hz, C3, C5), 119.23 (=CH), 121.85 (Ca), 130.53 (d, J<cf>= 8.1 Hz, C2, C6), 131.09 (C2, C6), 131.61 (Cq), 131.66 (Cq), 139.32 (C1'), 142.86 (Cp), 163.14 (C4'), 164.21 (d, J<cf>= 251.5 Hz, C4), 188.73 (C=O); 19F NMR (CDCls, 282 MHz, ppm): 5= (-)109.5 -(-)109.3 (m); IR (KBr, cm'1): v= 1508, 1590, 1597,1611 (C=C), 1658 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 311.2 ([M+H]+, 100); MP (°C): 107-108°C.
Rendimiento: 99 %, cristales amarillos.
Compuesto 65: (2E)-3-[4-(3-metilbut-2-eniloxi)fenil]-1-fenilpropenona
1H NMR (CDCls, 300 MHz, ppm): 5= 1.76 (br. s, 3H, Me), 1.81 (br. s, 3H, Me), 4.56 (d, 2H,Jvic= 6.9 Hz, OCH<2>), 5.50 (t x t, 1H,Jvic= 6.9 Hz,Jallyl= 1.4 Hz, =CH), 6.95 (d, 2H,Jvc= 8.8 Hz, H3, H5), 7.46-7.57 (m, 3H, H3', H4', H5'), 7.42 (d, 1H,Jtrans= 15.7 Hz, Ha), 7.60 (d, 2H,Jvic= 8.8 Hz, H2, H6), 7.79 (d, 1H,Jtrans= 15.7 Hz, HP), 8.01 (d, 2H,Jvic= 8.8 Hz,Jallyl= 1.4 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCls, 75 MHz, ppm): 5= 18.25 (Me), 25.85 (Me), 64.92 (OCH<2>), 115.08 (C3, C5), 119.14 (=CH), 119.63 (Ca), 127.46 (C1), 128.42 (C2, C6), 128.56 (C3', C5), 130.24 (C2, C6), 132.54 (C4'), 138.51 (C^), 138.79 (Cq), 144.80 (Cp), 161.03 (C4), 190.59 (C=O); IR (KΒr,cm'1): v= 1510, 1571, 1590, 1599 (C=C), 1655 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 293.2 ([M+H]+, 100); MP (°C): 71-72°C.
Rendimiento: 95 %, cristales amarillo-anaranjados.
Compuesto 68:1-(2-furil)-s-(4-fluorofenil)propenona1H NMR(CDCls, 300 MHz, ppm):5= 6.60 (dd, 1H,Jvic.i= 3.6 Hz,Jvic2= 1.7 Hz, H4'), 7.11 (dd,Jvc= 8.5 Hz,Jhf= 8.5 Hz, 2H, H3, H5), 7.33 (d, 1H,Jvc= 3.6 Hz, H5'), 7.38 (d, 1H,Jtrans= 15.7 Hz, Ha), 7.61-7.64 (m, 3H, H3', H2, H6), 7.84 (d, 1H,Jtrans= 15.7 Hz, Hp); 13C NMR(CDCla, 75 MHz, ppm):5= 112.62 (C4'), 116.12 (d,Jcf= 21.9 Hz, C3, C5), 117.58 (C5'), 120.86 (Ca), 130.46 (d,Jcf= 9.2 Hz, C2, C6), 130.98 (d,Jcf= 3.5 Hz, C1), 142.63 (C6), 146.59 (C3), 153.63 (C1'), 164.09 (d,Jcf= 252.7 Hz, C4), 177.83 (C=O);IR(ATR, cm-1):v= 1220, 1463, 1589, 1602 (C=C), 1655 (C=O);MS(ES+): m/z (%): 217.3 ([M+H]+, 100);MP(°C): 115-116°C.Yield: 15%, white crystals, Mw = 216.06.
Compuesto 69: (2E)-3-(4-fluorofenil)-1-(2-furanil)propenona
1H NMR (CDCI<3>, 300 MHz, ppm):5= 6.60 (dd, 1H,Jvic.i= 3.6 Hz,Jvic,2= 1.7 Hz, H4'), 7.11 (dd,Jvic= 8.5 Hz,Jhf= 8.5 Hz, 2H, H3, H5), 7.33 (d, 1H,Jvic= 3.6 Hz, H5'), 7.38 (d, 1H,Jtrans= 15.7 Hz, Ha), 7.61-7.64 (m, 3H, H3, H2, H6), 7.84 (d, 1H,Jtrans= 15.7 Hz, HP); 13C NMR (CDCI<3>, 75 MHz, ppm): 5 = 112.62 (C4'), 116.12 (d,Jcf= 21.9 Hz, C3, C5), 117.58 (C5'), 120.86 (Ca), 130.46 (d,Jcf= 9.2 Hz, C2, C6), 130.98 (d,Jcf= 3.5 Hz, C1), 142.63 (CP), 146.59 (C3), 153.63 (C1'), 164.09 (d,Jcf= 252.7 Hz, C4), 177.83 (C=O); IR (ATR, cm-1):v= 1220, 1463, 1589, 1602 (C=C), 1655 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 217.3 ([M+H]+, 100); MP (°C): 115-116°C.
Rendimiento: 15 %, cristales blancos.
Compuesto 70: 1,3-difuran-2-il-propenona. Las propiedades espectrales de esta sustancia han sido reseñadas por Rasheed et al. 2007 (1H RMN, 13C RMN, IR, Ms , punto de fusión).
Compuesto 73: (2E)-3-(2-furanil)-1-(4-fluorofenil)propenona 73
1H NMR (CDCI<3>, 300 MHz, ppm): 5 = 6.53 (dd, 1H,J v ti= 3.5 Hz,Jvic2= 1.4 Hz, H4), 6.74 (d, 1H,Jvic= 3.5 Hz, H5), 7.17 (dd, 2H,Jhf= 8.8 Hz,Jvic= 8.8 Hz, H3', H5'), 7.43 (d, 1H,Jtrans= 15.4 Hz, Ha), 7.54 (d, 1H,Jvic= 1.4 Hz, H3), 7. 61 (d, 1H,Jtrans= 15.4 Hz, HP), 8.07 (dd, 2H,Jvic= 8.8 Hz, Jhf = 5.5 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCI<3>, 75 MHz, ppm): 5 = 112.74 (C4), 115.72 (d,Jcf= 21.9 Hz, C3', C5), 116.48, (C5), 118.80 (Ca), 130,85 (CP), 131.02 (d,Jcf= 9.2 Hz, C2', C6), 134.50 (d,Jcf= 2.3 Hz, C1'), 145.03 (C5), 151.60 (C2), 165.61 (d,Jcf= 253.8 Hz, C4), 188.15 (C=O); IR (KΒr, cm-1):v= 1221, 1260, 1323, 1505, 1555, 1589, 1599 (C=C), 1661 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 217.3 ([M+H]+, 100); MP (°C): 65-66°C.
Rendimiento: 82 %; cristales pardos.
Compuesto 74: 3-furan-2-il-1-(4-metoxifenil)propenona. Las propiedades espectrales de esta sustancia han sido reseñadas por Kumar et al. 2007 (1H r Mn , 13C RMN, MS, IR), Teh et al.2006 (estructura cristalina) y Dureja 1987 (punto de fusión).
Compuesto 75: (2E)-3-(2-furanil)-1-(3,4,5-trimetoxifenil)propenona
1H NMR (CDCI<3>, 300 MHz, ppm):5= 3.94 (s, 3H, OMe), 3.96 (s, 6H, 2 x OMe) , 6.53 (d x d, 1H,Jvic,i= 3.3 Hz,Jvic,2= 1.7 Hz, H4), 6.73 (br. d, 1H,Jvic= 3.3 Hz, H5), 7,30 (s, 2H, H2', H6), 7.41 (d, 1H,Jtrans= 15.4 Hz, Ha), 7.55 (br. s, 1H, H3), 7.61 (d, 1H,Jtrans= 15.4 Hz, HP); 13C NMR (CDCI<3>, 75 MHz, ppm): 5 = 56.43 (C3'OMe, C5'OMe), 61.00 (C4'OMe), 106.08 (C2', C6'), 112.74 (C4), 116.27 (C5), 118.97 (Ca), 130.62 (CP), 133.56 (C1'), 142.49 (C4'), 144.89 (C3), 151.73 (C1), 153.20 (C3', C5'), 188.48 (C=O) ; IR (KΒr, cm-1):v= 725, 738, 814, 1000, 1013, 1122, 1302, 1332, 1504, 1550, 1574 (C=C), 1652 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 289.2 ([M+H]+, 100); MP (°C): 61-62°C.
Rendimiento: 89 %, cristaIes pardo-amarilIentos.
Compuesto 76: (2E)-3-(2-furanil)-1-(2,6-dimetoxifenil)propenona
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm): 5 = 3.78 (s, 6H, 2x OMe), 6.46 (dd, 1H,Jvic,i= 3.3 Hz,Jvic,2= 1.7, H4 ), 6.60 (d, 2H,Jvic= 8.3 Hz, H3', H5'), 6.60 (d, 1H,Jvic= 3.3 Hz , H5), 6.83 (d, 1H,Jtrans= 16.0 Hz, Ha), 7.08 (d, 1H,Jtrans= 16.0 Hz, HP), 7.31 (t, 1H,Jvic= 8.3 Hz, H4'), 7.49 (d, 1H,Jvic= 1.7 Hz, H3); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, ppm): 5 = 55.92 (2x OMe), 104.02 (C3', C5), 112.53 (C4), 115.56 (C5), 118.31 (C1'), 126.28 (Ca), 130.76 (C4'), 131.21 (CP), 145.02 (C3), 151.26 (C1), 157.54 (C2', C6'), 194.73 (C=O); IR (KΒr, cm-1): v = 1294, 1469, 1593, 1614 (C=C), 1634 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 259.3 ([M+H]+, 100); MP (°C): 89-90°C.
Rendimiento: 65 %, cristaIes pardos.
Compuesto 77: (2E)-3-(3-furanil)-1-(4-fluorofenil)propenona
1H NMR (CDCI<3>, 300 MHz, ppm): 5 = 6.71 (d, 1H,Jvic= 2.2 Hz, H5), 7.17 (dd, 2H,Jhf= 8.8 Hz,Jvic= 8.8 Hz, H3', H5'), 7.21 (d, 1H,Jtrans= 15.4 Hz, Ha), 7.48 (br s, 1H, H2), 7.69-7.77 (m, 2H, HP, H4), 8.03 (dd, 2H,Jvic= 8.8 Hz,Jhf= 5.5 Hz, H2', H6); 13C NMR (CDCI<3>, 75 MHz, ppm): 5 = 107.38 (C5), 115.72 (d,Jcf= 21.9 Hz, C3', C5), 121.47 (Ca), 123.15 (C1), 131.00 (d,Jcf= 9.2 Hz, C2', C6), 131.14 (C1'), 134.48 (d,Jcf= 2.3 Hz, C1), 135.05 (CP), 144.59 (C2), 145.69 (C4), 165.57 (d,Jcf= 253.8 Hz, C4), 188.70 (C=O); IR (ATR, cm-1):v= 1158, 1208, 1224, 1316, 1586, 1603 (C=C), 1660 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 217.3 ([M+H]+, 100); MP (°C): 118-119°C.
Rendimiento: 66 %, cristaIes pardo páIidos.
Compuesto 78: (2E)-3-(2-benzofuranil)-1-(4-fluorofenil)propenona
1H NMR (CDCI<3>, 300 MHz, ppm): 5 = 7.05 (s, 1H, H7), 7.19 (dd, 2H, J<hf>= 8.5 Hz,Jvic= 8.5 Hz, H3', H5'), 7.26 (td, 1H,Jvic= 7.7 Hz,Jaiiyi= 1.1 Hz, H5), 7.39 (td, 1H,Jvic= 7.7 Hz,Jaiiy/= 1.1 Hz, H4), 7.52 (br. d, 1H,Jvic= 7.7 Hz, H3), 7.61 (d, 1H,Jvic= 7.7 Hz, H6), 7.67 (d, H,Jtrans= 15.1 Hz, Ha), 7.73 (d, H,Jtrans= 15.1 Hz, HP), 8.13 (dd, 2H,Jhf= 5.5 Hz,Jvic=
8.5 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCI<3>, 75 MHz, ppm): 5 = 111.41 (C3), 112.72 (C7), 115.83 (d,Jcf= 21.9 Hz, C3', C5), 121.44 (Ca), 121.95 (C6), 123.49 (C5), 126.86 (C4), 128.54 (C6a), 131.06 (CP), 131.18 (d,Jcf= 9.2 Hz, C2', C6), 134.34
(d,Jcf= 2.3 Hz, C1'), 152.97, 155.06 (C1, C2a), 165.79 (d,Jcf= 255.0 Hz, C4), 187.87 (C=O); IR (KΒr, cm-1): v = 1205, 1224, 1267, 1586, 1602 (C=C), 1660 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 267.3 ([M+H]+, 100); MP (°C): 103-104°C.
Rendimiento: 10 %, cristales pardos.
Compuesto 79: (2E)-3-(2-benzofuranil)-1-(4-metoxifenil)propenona
1H NMR (CDCla, 300 MHz, ppm): 5 = 3.89 (s, 3H, OMe), 6.94-7.03 (m, 3H, H7, H3', H5'), 7.25 (t, 1H,Jvic= 8.3 Hz, H5),
7.37 (t, 1H,Jvic= 8.3 Hz, H4), 7.51 (d, 1H,Jvic= 8.3 Hz, H3), 7.60 (d, 1H,Jvic= 8.3 Hz, H6), 7.67 (d, 1H,Jtrans= 15.4 Hz,
Ha), 7.73 (d, 1H,Jtrans= 15.4 Hz, HP), 8.09 (dt, 2H,Jvic= 8.8 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCla, 75 MHz, ppm): 5 = 55.57 (OMe), 111.42 (C3), 112.17 (C7), 113.97 (C3, C5), 121.91 (C6, Ca), 123.45 (C5), 126.66 (C4), 128.66, (Cq), 130.19 (CP), 130.98 (C2, C6', Cq), 153.30, 155.59 (C1, C2a), 163.67 (C4'), 187.78 (C=O); IR (ATR, cm-1):v= 1257, 1305, 1348, 1448, 1472, 1508, 1545, 1588 (C=C), 1655 (C=O); MS (ES+): m/z (%): 279.3 ([<m>+H]+, 100); MP (°C): 124-125 °C.
Rendimiento: 82 %, cristales amarillo pálido.
Compuesto 81b: 1-[1-(2-propen-1-il)-1H-indol-3-il]etanona
1H NMR (CDCI3, 300 MHz, ppm): 5= 2.51 (s, 3H, CH3), 4.73 (dt,Jvic=5.5 Hz,Jaiiyi=1.4 Hz, CH<2>), 5.15 (br. d, 1H,Jtrans
= 17.2 Hz, =CHcisHtrans), 5.28 (dd, 1H,Jais= 10.5 Hz,Jallyl=1.4 Hz, =CHc¡sHtrans). 6.00 (ddt, 1 H,Jtrans= 17.2 Hz,Jcis=
10.5 Hz,Jvic=5.5 Hz, NCH<2>CH=), 7.23-7.35 (m, 3H, H5, H6, H7), 7.72 (s, 1H, H2), 8.33-8.43 (m, 1H, H4); 13C NMR (CDCI3, 75 MHz, ppm): 5=27.54 (CH3), 49.27 (CH<2>), 110.04 (C7), 117.14 (C3), 118.57 (=CH<2>), 122.53 (br. s, 2xCH), 123.27 (CH), 126.31 (C3a), 132.04 (C2), 134.83 (CH=CH<2>), 136.82 (C7a), 193.00 (C=O); IR (ATR, cm-1): v= 1633 (C=O), 1523 (C=C), 1465, 1382, 1193, 926; MS (ES+): m/z (%)= 200.1 ([M+H]+, 100), 201.1 ([M+1+H]+, 15), 222.0 ([M+Na]+,
7), 421.1 (8); MP (°C): 54-55 °C; Yield: 91%.
Compuesto 81c: 1-[1-(3-metil-2-buten-1-il)-1H-indol-3-il]etanona
1H NMR (CDCI3, 300 MHz, ppm): 5=1.81 (d, 3H,Jaiiyi=1.4 Hz, CH3), 1.84 (br. s, 3H, CH3), 2.52 (s, 3H, C(O)CH3), 4.70
(br. d, 2H,Jvic=7.0 Hz, CH<2>), 5.39 (txsept, 1H,Jvc=7.0 Hz,Jaiy=1.4 Hz, =CH(CH<2>)), 7.24-7.37 (m, 3H, H5, 7.73 (s, 1H, H2), 8.33-8.41 (m, 1H, H4); 13C NMR (CDCI3, 75 MHz, ppm): 5= 18.14 (CH3), 25.71 (CH3), 27.60 (CH3), 44.66 (CH<2>), 109.95 (C7), 116.85 (C3), 118.33 (=CH(CH<2>)), 122.45, 122.51, 123.08 (C4, C5, C6), 126.48 (C3a), 134.34
(C2), 136.80 (=C(Me)<2>), 138.19 (C7a), 192.94 (C=O); IR (ATR, cm-1): v= 1638 (C=O), 1525, 1465, 1382, 1176, 1008,
929, 751; MS (ES+): m/z (%)= 228.1 ([M+H]+, 100), 229.1 ([M+2+H]+, 15), 477.2 (8); MP (°C): 63.5-64.5 °C
Rendimiento: 84 %.
Compuesto 82: (2E)-3-(2-bromofenil)-1-(1-metil-1H-indol-3-il)propenona
1H NMR (CDCI3, 300 MHz, ppm): 5=3.87 (s, 3H, N C ^), 7.18-7.38 (m, 6H, H4', H5', H6', H4, H5, Ha), 7.63 (dd, 1H,Jvt=
7.7 Hz,Jaiiyi=1.7 Hz, C3), 7.71 (dd, 1H,Jvc=8.0 Hz,Jaiiyi=1.7 Hz, C6), 7.83 (s, 1H, H2'), 8.11 (d, 1H,Jvc=15.4 Hz, H3),
8.48-8.56 (m, 1H, H7'); 13C NMR (CDC3, 75 MHz, ppm): 5=33.57 (NCH3), 109.70 (C4), 117.26 (C1'), 122.74, 122.89, 123.67 (C5', C6', C7'), 125.53 (C1'), 126.73 (C7'a), 126.85 (Ca), 127.57, 127.66 (C5, C6), 130.65 (C4), (Cq), 135.76 (C2'), 137.57 (Cq), 139.29 (C3), 183.97 (C=O); IR (ATR, cm-1): v= 1643 (C=O), 1588, 1525, 1466, 1370, 1088, 962; MS (ES+): m/z (%)= 340.0 ([M-2+H]+, 94), 341.3 ([M-1+H]+, 15), 342.0 ([M+H]+, 100), 343.0 ([M+1+H]+, 23);
MP (°C): 154-155 °C.
Rendimiento: 67 %.
Compuesto 83: (2E)-3-(4-bromofenil)-1-(1-metil-1H-indol-3-il)propenona
1H NMR (CDCh, 300 MHz, ppm): 5=3.83 (s, 3H, NCH3), 7.25-7.37 (m, 4H, H4', H5', H6', Ha), 7.46 (d, 2H,Jvi=8.5 Hz,
C2, C6), 7.51 (d, 2H,Jvi=8.5 Hz, C3, C5), 7.70 (d, 1H,Jvc=16.0 Hz, H3), 7.81 (s, 1H, H2'), 8.44-8.55 (m, 1H, H7'); 13C
NMR (CDC3, 75 MHz, ppm): 5=33.48 (NCH3), 109.70 (C4), 117.37 (C1'), 122.69, 122.86 (C7', Ca), 123.64 (CH), 123.84
(C4), 124.24 (CH), 126.68 (C7'a), 129.44 (C2, C6), 131.95 (C3, C5), 134.18 (C1'), 135.58 (C2'), 137.52 (C3'a), 139.35 (C3), 183.74 (C=O); IR (ATR, cm-1): v= 1648 (C=O), 1589, 1574, 1527, 1485, 1466, 1375; MS (ES+): m/z (%)= 340.0 ([M+H]+, 100), 341.0 ([M+1+H]+, 19), 342.0 ([M+2+H]+, 95), 343.0 ([M+3+H]+, 18); MP (°C): 180-181 °C.
Compuesto 84: (2E)-3-(4-clorofenil)-1-(1-alil-1H-indol-3-il)propenona
1H NMR (CÜCÍ3, 300 MHz, ppm): 5=4.77 (dt, 2H,Jvic=5.5 Hz,Jaiiyi=1.4 Hz), 5.18 (dd, 1H,Jtrans=17.6 Hz,Jaiiyi=1.4
Hz, =CHcisHtrans), 5.31 (dd, 1H,Jcis=10.5 Hz,Jallyl=1.4 Hz, =CHcisHtrans). 6.02 (ddt, 1 H,Jtrans=17.6 Hz,Jcis=10.5 Hz,
Jvc= 5.5 Hz, NCH<2>CH=), 7.25-7.38 (m, 6H, H2, H6, H4', H5', H6', Ha), 7.54 (d, 2H,Jvi=8.3 Hz, H3, H5) 7.74 (d, 1H,Jvic=
16.0 Hz, H3), 7.87 (s, 1H, H2'), 8.49-8.56 (m, 1H, H7'); 13C NMR (CÜCI3, 75 MHz, ppm): 5=49.45 (NCH<2>), 110.10 (C4'), 117.89 (C1'), 118.83 (=CH2), 122.83 (CH), 123.06 (C7'), 123.75 (CH), 124.22 (Ca), 126.89 (C7'a), 129.06 (C2, C6), 129.29
(C3, C5), 131.93 (NCH2CH=), 133.84 (Cq), 134.45 (C2'), 135.58 (Cq), 137.02 (C3'a), 139.60 (C3), 183.98 (C=O); IR (ATR, cm-1): v= 1637 (C=O), 1572, 1560, 1515, 1491, 1463, 1381, 1185; MS (ES+): m/z (%)= 322.3 ([M+H]+, 100), 324.2 ([M+2+H]+, 28); MP (°C): 149 °C.
Rendimiento: 62 %.
Compuesto 85: (2E)-3-(4-clorofenil)-1-[1-(3-metilbut-2-enil)-1H-indol-3-il]propenona
1H NMR (CÜCI3, 300 MHz, ppm): 5=1.83 (br. s, 3H, CH<3>), 1.87 (br. s, 3H, CH<3>), 4.76 (br. d, 2H,Jvc=7.2 Hz, CH<2>),
5.42 (t x sept, 1H,Jgem=7.2 Hz,Jaiiy=1.1 Hz, CH=), 7.30-7.41 (m, 6H, H2, H6, H4', H5', H6', Ha), 7.57 (d, 2H,Jvc=8.8
Hz, H3, H5) 7.76 (d, 1H,Jvc=16.0 Hz, H3), 7.89 (s, 1H, H2'), 8.47-8.56 (m, 1H, H7'); 13C NMR (CÜCI3, 75 MHz, ppm): 5=
18.23 (CH<3>), 25.76 (CH<3>), 44.90 (NCH<2>), 110.05 (C4'), 117.58 (C1'), 118.30 (NCH<2>CH=), 122.77, 123.05, 123.56, 124.37
(C5', C6', C7', Ca), 127.06 (C7'a), 129.05 (C2, C6), 129.31 (C3, C5), 133.95 (Cq), 134.07 (NCH=), 135.52 (Cq), 137.02 (=C(CH3)2), 138.31 (C3'a), 139.46 (C3), 183.90 (C=O); IR (ATR, cm-1): v= 1642 (C=O), 1580, 1572, 1565, 1519, 1488, 1463, 1384; MS (ES+): m/z (%)= 350.3 ([M+H]+, 100), 351.2 ([M+1+H]+, 21), 352.3 ([M+2+H]+, 26); MP (°C):203-204 °C.
Rendimiento: 54 %.
Compuesto 86: (2£)-3-(4-fluorofenil)-1-[1-(3-metilbut-2-enil)-1H-indol-3-il]propenona
1H NMR (CÜCI3, 300 MHz, ppm): 5=1.82 (br. s, 3H, CH<3>), 1.86 (br. s, 3H, CH<3>), 4.74 (br. d, 2H,Jvc=6.8 Hz, CH<2>),
5.42 (br. t, 1H,Jgem=6.8 Hz, CH=), 7.08 (t, 2H,Jvc=8.5 Hz,Jhf=8.5 Hz, H3, H5), 7.23-7.40 (m, 4H, H4', H5', H6', Ha),
7.61 (dd, 2H,Jvic=8.5 Hz,Jhf=5.5 Hz, H2, H6), 7.77 (d, 1H,Jvc=15.4 Hz, H3), 7.87 (s, 1H, H2'), 8.49-8.57 (m, 1H, H7');
13C NMR (CÜCI3, 75 MHz, ppm): 5=18.21 (CH<3>), 25.76 (CH<3>), 44.90 (NCH<2>), 110.04 (C4), 115.94 (d,Jcf=21.9 Hz, C3,
C5), 117.67 (C1'), 118.39 (NCH2CH=), 122.76, 123.12, 123.55, 123.73 (C5', C6', C7', Ca), 127.15 (C7'a), 129.95 (d,Jcf=
8.1 Hz, C2, C6), 131.73 (C1), 133.95 (C2'), 137.06, 138.28 (C3'a, =C(CH3)2), 139.69 (C3), 163.65 (d,Jcf=250.4 Hz, C4), 184.07 (C=O); IR (ATR, cm-1): v= 1643 (C=O), 1588, 1572, 1525, 1466, 1463, 1370, 1089, 962; MS (ES+): m/z (%)=
334.3 ([M+H]+, 100), 335.3 ([M+1+H]+, 22); MP (°C): 146.5-147.5 °C.
Rendimiento: 49 %.
Compuesto 87: (2E)-3-(2-fluorofenil)-1-[1-(3-metilbut-2-enil)-1H-indol-3-il]propenona
1H NMR (CÜCI3, 300 MHz, ppm): 5=1.83 (br. s, 3H, CH<3>), 1.87 (br. s, 3H, CH<3>), 4.77 (br. d, 2H,Jvc=6.8 Hz, CH<2>),
5.43 (br. t, 1H,Jgem=6.8 Hz, CH=), 7.08-7.23 (m, 2H, 2x CH), 7.29-7.41 (m, 4H, 4x CH), 7.51 (d, 1H,Jvc=15.7 Hz, Ha),7.65 (td, 1H,Jvc=7.6 Hz,Ja«yi=1.3 Hz, CH), 7.89 (d, 1H,Jvc=15.7 Hz, H3), 7.89 (s, 1H, H2'), 8.48-8.58 (m, 1H, H7');
13C NMR (CÜCI3,75MHz, ppm): 5=18.20 (CH<3>), 25.73 (CH<3>), 44.89 (NCH<2>), 110.02 (C4), 116.17 (d, C3), 117.61 (C1'), 118.34 (NCH<2>CH=), 122.74, 123.08, 123.52, (C5', C6', C7'), 123.63 (Ca), 124.38 (d,Jcf=3.5 Hz, C5), 126.82 (d,Jcf=6.9 Hz, C1), 127.12 (C7'a), 129.85 (d,Jcf=3.5 Hz, C6), 130.97 (d,Jcf=9.2 Hz, C4), (C3), 137.05, 138.31 (C3'a, =C(CH3)2), 161.61 (d,Jcf=253.8 Hz, C2), 184.29 (C=O); 19F NMR (CÜCI3, 282 MHz, ppm):
5=(-)113.9 -(-)113.3 (m); IR (ATR, cm-1): v= 1641 (C=O), 1571 (C=C), 1519, 1486, 1463, 1381, 1060, 957, 751,748,
736; MS (ES+): m/z (%)= 334.3 ([M+H]+, 100), 335.3 ([M+1+H]+, 34); MP (°C): 136-137 °C.
Rendimiento: 14 %.
Compuesto 90: (E)-4.4'-difluoroestilbeno
1H NMR (CÜCI3, 300 MHz, ppm): 5= 6.98 (s, 2H, Ha, Hp), 7.05 (dd, 4H,Jhf =8.8 Hz,Jvic =8.8 Hz, H3, H5, H3', H5'),
7.46 (dd, 4H,Jhf=5.5 Hz,Jvc= 8.8 Hz, H2, H6, H2', H6'); 13C NMR (CÜCI3, 75 MHz, ppm): 5= 116.32 (d,Jcf= 21.9 Hz,
C3, C5, C3', C5'), 128.18 (Ca, C3), 129.15 (d,Jcf= 8.1 Hz, C2, C6, C2', C6'), 134.81 (d,Jcf= 3.5 Hz, C1, C1'), 163.17 (d,
Jcf= 244.6 Hz, C4); IR (ATR, cm'1): v= 1205, 1230, 1255, 1506, 1599; MS (ES+): m/z (%): 216 ([M+H]+, 100); MP (°C):
116-117°C.
Rendimiento = 48 % (pureza 92 %, GC); cristales pardo-amarillentos.
Compuesto 91: 1-fluoro-4-[(E)-2-(4-metoxifenil)etenil]benceno
Esta molécula ha sido reseñada por Loska et al, 2008
Compuesto 92: 1-fluoro-4-[(Z)-2-feniletenil]benceno
Esta molécula ha sido reseñada por Sun et al, 2007
Compuesto 93:(Z)-3,4,5-trimetoxiestíibeno1H NMR (CDCI3, 300 MHz, ppm): 5= 3.64 (s, 6H, C3OMe, C5OMe), 3.83
(s, 3H, C4OMe ), 6.46 (s, 2H, H2, H6), 6.49 (d, 1H,Jds= 12.1 Hz, CH), 6.59 (d, 1H,Jds= 12.1 Hz, CH), 7.14-7-38 (m,
5H, H2', H3', H4', H5', H6'); 13C NMR (CDCh, 75 MHz, ppm): 5= 55.77 (C3OMe, C5OMe), 60.87 (C4OMe), 106.04 (C2,
C6), 127.12 (C4'), 128.24 (C2', C6), 128.89 (C3', C5), 129.96 (CH), 130.10 (CH), 132.44 (C1'), 137.14 (C4), 137.44 (C1'), 152.82 (C3, C5); IR (ATR,cm-1):v= 1123, 1236, 1327, 1403, 1420, 1451,1462, 1505, 1579; MS (ES+): m/z (%): 271.3 ([M+H]+, 100).
Rendimiento = 13 %; aceite amarillo; Cromatografía: Rf = 0,72 (éter de petróleo/EtOAc 1:1).
Compuesto 94: (Z)-4'-fluoro-3,4,5-trimetoxiestilbeno
La mezcla de (E)- y (Z)-37 se separó mediante CCF preparativa utilizando una mezcla de eluyentes de éter de petróleo y Et<2>O (1:1).
1H NMR (CDCI3, 300 MHz, ppm): 5= 3.67 (6H, s, 2x OCH<3>), 3.83 (3H, s, OCH<3>), 6.45 (2H, s, H2, H6), 6.48 (1H, d,Jds
=12.4 Hz, CH), 6.54 (1H, d,Jds= 12.4 Hz, CH), 6.94 (2H, dd,Jhf= 8.8 Hz,Jvc= 8.8 Hz, H3', H5'), 7.26 (2H, dd,Jvc=
8.8 Hz,Jhf= 5.5 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCh, 75 MHz:, ppm): 5= 55.85 (2x OCH<3>), 60.92 (OCH<3>), 105.94 (C2, C6), 115.13 (d,Jcf=21.9 Hz, C3', C5), 128.74 (CH), 130.15 (CH), 130.66 (d,Jcf=8.1 Hz, C2', C6'), 132.28 (C1'), 133.31 (d,
Jcf= 3.5 Hz, C1'), 137.23 (C4), 152.96 (C3, C5), 161.81 (d,Jcf= 246.9 Hz, C4'); IR (ATR,cm-1):v= 1 1411, 1421, 1452, 1462, 1506, 1578; MS (ES+): m/z (%): 289.2 ([M+H]+, 100).
Rendimiento = 43 %; aceite amarillo; Cromatografía: Rf = 0,83 (éter de petróleo/Et<2>O 1:1); PM = 288,31.
Compuesto 95: 1,1'-(E)-eteno-1,2-diildibenceno
Esta molécula ha sido reseñada por Bandari et al., 2010
Compuesto 96: 1,2,3-trimetoxi-5-[(E)-2-feniletenil]benceno
Esta molécula ha sido reseñada por Alonso et al., 2011. Esta sustancia se separó de su isómero (Z)víaCCF preparativa.
Compuesto 97: (E)-3-fluoroestilbeno
1H NMR{CDCh, 300 MHz, ppm): 5= 6.95 (ddd, 1H,Jvc =8.3 Hz,Jhf =8.3 Hz,Jaiy =1.7 Hz, H4), 7.05 (d, 1H,Jtrans =
16.0 Hz, CH), 7.12 (d, 1H,Jtrans= 16.0 Hz, CH), 7.22 (dt, 1H,Jhf= 10.0 Hz,Jaiy= 1.6 Hz, H2), 7.26-7.33 (m, 3H, H5,
H6, H4'), 7.37 (dt, 2H,Jvc= 7.4 Hz,Jayi= 1.7 Hz, H3', H5'), 7.51 (dd, 2H,Jvc= 7.4 Hz,Jaiiyi =1.7 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCI3, 75 MHz, ppm): 5= 112.76 (d,Jcf =21.9 Hz, C2), 114.38 (d,Jcf= 21.9 Hz, C4), 122.45 (d,Jcf= 2.3 Hz, C6), 126.65 (C2', C6), 127.47 (d,Jcf= 2.3 Hz, C°), 128.01 (CP), 128.74 (C3', C5'), 130.01, 130.15 (C4 C5), 136.82 (C1'), 139.70 (d,Jcf= 6.9 Hz, C1), 163.19 (d,Jcf= 245.8 Hz, C3); IR (ATR,cm-1):v= 1266, 1447, 1466, 1484, 1495, 1580,
1606; MS (ES+): m/z (%): 198 ([M+H]+, 100); MP (°C): 75-76°C.
Rendimiento = 79 %, cristales blancos.
Compuesto 98: (E)-3.4'-difluoroestilbeno
1H NMR (Acetone-de, 300 MHz, ppm): 5= 6.98-7.09 (m, 1H, H3), 7.17 (dd, 4H,Jhf= 8.8 Hz,Jhvc =8.8 Hz, H3', H5'),
7.22 (d, 1H,Jtrans= 16.2 Hz, CH), 7.34 (d, 1H,Jtrans =16.2 Hz, CH), 7.37-7.42 (m, 3H, H2, H5, H6), 7.68 (dd, 2H,Jhf=
5.5 Hz,Jhvíc= 8.8 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCh, 75 MHz, ppm): 5= 112.72 (d,Jcf= 21.9 Hz, C2), 114.44 (d,Jcf=
21.9 Hz, C4), 115.72 (d,Jcf= 21.9 Hz, C3', C5'), 122.40 (d,Jcf= 2.3 Hz, C6), 127.27 (=CH), 128.18 C2', C6), 128.80 (=CH), 130.14 (d,Jcf= 8.1 Hz, C5), 133.02 (d,Jcf= 3.5 Hz, C1'), 139.54 (d,Jcf= 8.1 Hz, C1), 162.55
(d,Jcf =244.6 Hz, C4'), 163.20 (d,Jcf= 248.1 Hz, C3); IR (ATR,cm-1):v= 1217, 1228, 1266, 1444, 1482, 1507, 1578,
1597; MS (ES+): m/z (%): 216 ([m H]+, 100); MP (°C): 92-93°C.
Rendimiento = 99 %; cristales blancos.
Compuesto 99: (E)-4'-cloro-3-metoxiestilbeno
1H NMR (CDCI3, 300 MHz, ppm): 5= 3.83 (s, 3H, OMe), 6.82 (dd, 1H,Jvc= 7.7 Hz,Jaiy =2.6 Hz, H4), 6.97-7.09 (m,
3H, H2, Ha, HP), 7.09 (d, 1H,Jvc= 7.7 Hz, H6), 7.27 (t, 1H,Jvic= 7.7 Hz, H5), 7.31 (d, 2H,Jvc= 8.5 Hz, H3', H5'), 7.42 (d,
2H,Jvc= 8.5 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCI3, 75 MHz, ppm): 5= 55.36 (OMe), 111.91 (C2), 113.62 (C4), 119.38 (C6), 127.78 (br.s, C2', C6', CH), 128.96 (br. s, C3', C5'), 129.30 (CH), 129.82 (br. s, C5), 133.33, 135.84, 138.52 (C1, C1', C4'), 160.02 (C3); IR (ATR,cm-1):v= 1251, 1269, 1431,1444, 1575, 1604; MS (ES+): m/z (%): 245.2 ([M+H]+, 100) en 247.2 ([M+2+H]+, 35); MP (°C): 71-72°C.
Rendimiento = 95 %; cristales blancos.
Compuesto 100:(E)-4'-fluoro-3,4,5-trimetoxiestilbeno
Esta sustancia se separó de su isómero (Z)víaCCF preparativa.
1H NMR (CDOls, 300 MHz, ppm): 5= 3.87 (s, 3H, C4OMe), 3.92 (s, 6H, C3OMe, C5OMe), 6.72 (s, 2H, H2, H6), 6.93 (d, 1H,Jtrans= 16.5 Hz, =CH), 6.99 (d, 1H,Jtrans= 16.5 Hz, =CH), 7.05 (dd, 2H,Jhf= 8.8 Hz,Jhvc= 8.8 Hz, H3', H5'), 7.47 (dd, 2H,Jhvíc= 8.9 Hz,Jhf= 5.0 Hz, H2', H6'); 13C NMR (CDCI3, 75 MHz, ppm): 5= 56.11 (C3OMe, C5OMe), 60.98 (C4OMe), 103.49 (C2, C6), 115.65 (d,Jcf= 21.9 Hz, C3', C5'), 126.98 (=CH), 127.89 (d,Jcf= 8.1 Hz, C2', C6), 128.44 (=CH), 132.94 (C1'), 133.39 (d,Jcf= 3.5 Hz, C1'), 137.93 (C4), 153.41 (C3, C5), 162.30 (d,Jcf= 246.9 Hz, C4'); IR (ATR, cm-1): v= 1128, 1152, 1225, 1239, 1334, 1521, 1449, 1508, 1582; MS (ES+): m/z (%): 289.2 ([M+H]+, 100).
Rendimiento = 3 %; aceite amarillo; Cromatografía: Rf = 0,69 (éter de petróleo/EtOAc 1:1).
B. Síntesis de compuestos
B.1. Procedimientos de reacción para la síntesis de chalconas
Preparación de chalconasvíacondensación de Claisen-Schmidt.Una solución de acetofenona (10 mmol) y UOH.H<2>O (10 % en moles) en 10 mL de etanol absoluto se agita a la temperatura adecuada durante 10 min (para reacciones a 40 °C, el bulbo está equipado con un condensador de reflujo). Luego, se añade el benzaldehído (10 mmol, 1 equiv.) y se protege el sistema de la atmósfera con un tapón de corcho. El progreso de la reacción se controla mediante CCF o análisis LCMS; durante el curso de la reacción, la chalcona puede precipitar. Al alcanzar el grado máximo de conversión, la mezcla de reacción se extingue con 15 mL de ácido clorhídrico al 1 %.
Si la chalcona ha precipitado, se aísla mediante filtración. Con el fin de eliminar las cantidades residuales de benzaldehído, el residuo se lava a fondo con agua hasta que el filtrado se vuelve transparente. El sólido obtenido es la chalcona, que se puede secar en un desecador. Posteriormente, la chalcona se puede recristalizar en etanol absoluto para obtener cristales de alta pureza.
Si la chalcona ha formado un líquido oleoso separado en el fondo del bulbo, se puede extraer de la mezcla con dietil éter. La fase orgánica se lava posteriormente con salmuera (2x) y se seca sobre MgSO4, después de lo cual la solución se concentrain vacuo.De nuevo, la purificación del residuo así obtenido se puede realizar mediante recristalización en etanol absoluto.
BBr3-Desmetilación mediada por metoxichalconas.
Advertencia-el tribromuro de boro es tóxico, corrosivo y extremadamente reactivo cuando entra en contacto con el aire o el agua.Se carga un vial de microondas de 10 mL secado a la llama con la metoxichalcona (0,4 mmol) y 7 mL de diclorometano seco. El espacio de cabeza se lava posteriormente con gas nitrógeno, mientras que el tribromuro de boro (3 equiv., 1,2 mmol o 4 equiv. para dimetoxichalconas) se añade rápidamente bajo la superficie del líquido con una jeringa. El vial se sella posteriormente con una tapa de Teflon® y se introduce en el aparato de microondas. La temperatura objetivo se establece en 55 °C (rampa de 5 min) y el tiempo de reacción en 30 min; la agitación magnética está activada, 'powermax' está desactivado.
Una vez completada la reacción, la mezcla se vierte en un matraz Erlenmeyer de 50 mL, al que se le añade aguagota a gotahasta destruir todo el exceso de BBr3. El contenido del matraz se transfiere a un embudo de decantación, al que se le añaden 20 mL de una solución acuosa de hidróxido de sodio 1 N y 20 mL de dietil éter. Tras una agitación vigorosa, la capa de agua intensamente amarilla (o roja en el caso de una dihidroxichalcona) se aísla y acidifica con ácido clorhídrico 3 N. La hidroxichalcona se extrae de la suspensión turbia resultante con un volumen igual de dietil éter (2x). Posteriormente, la fase orgánica se aísla y se seca sobre MgSO4, después de lo cual se evapora el disolvente, proporcionando la hidroxichalcona en forma de un polvo sólido de color pardo rojizo.
O-prenilación de hidroxichalconas.
A una solución de hidroxichalcona (2 mmol) en acetona (4 mL) se añade bromuro de prenilo (6 mmol, 3 equiv.), yoduro de sodio (6 mmol, 3 equiv.) y carbonato de potasio (14 mmol, 7 equiv.). La suspensión resultante se calienta a temperatura de reflujo bajo agitación magnética durante 4 horas (el progreso de la reacción se verifica mediante análisis CCF). Luego, la mezcla se vierte en un volumen mayor de dietil éter y las sales insolubles se eliminan mediante filtración. La concentración del filtradoin vacuoproporciona la chalcona O-prenilada, pero con un rendimiento casi cuantitativo.
La síntesis de loscompuestos 37-51se realizóvíauna condensación de Claisen-Schmidt de acetofenonas y benzaldehídos adecuadamente funcionalizados. Si bien se han propuesto otras síntesis para preparar chalconas (p.
ej.,vía 1,3-diaril-1 -siloxialenos o mediante reacciones de acoplamiento de Suzuki o Heck), esta condensación aldólica cruzada sigue siendo el método de elección, dada su simplicidad y la fácil disponibilidad de las acetofenonas35y los benzaldehídos36requeridos.
en donde R y R' son como se representan en la Tabla 3
Esquema:Síntesis de Chalcona. a) 1 equiv. de benzaldehído36,5 % en moles de LDH.H<2>O, EtOH abs., condiciones, véase la Tabla 3.
A lo largo de los años, se han propuesto numerosos catalizadores de carácter básico (p. ej., NaOH, Ba(OH)<2>y AbO3) y de carácter ácido (p. ej., HCl seco y BF<3>) para esta transformación. Los autores de la invención consideraron que el protocolo catalizado con LiOH.H<2>O propuesto por Bhagat y colaboradores es el más elegante, debido a su alta rotación y rendimiento del catalizador, tiempos de reacción cortos y fácil elaboración. No obstante, como solo pudieron obtener los altos rendimientos reseñados por estos investigadores después de tiempos de reacción prolongados, evaluaron la influencia de la temperatura de reacción en su resultado. Como tal, elevando la temperatura a 40 o 70 °C y optimizando el procedimiento de elaboración, los autores de la invención pudieron obtener las chalconas puras37-51con un rendimiento razonable a excelente después de la cristalización en etanol (véase la Tabla 3).
Tabla 3.Condiciones de síntesis y rendimiento de las chalconas sintéticas37-51en el conjunto de entrenamiento.
La síntesis de loscompuestos 52-55se realizó de forma similar a la descrita anteriormente para los compuestos 37 51, y las condiciones de síntesis se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4:Condiciones de síntesis y rendimiento de las chalconas sintéticas 52-55.
La síntesis de loscompuestos 56-65se realizó como se representa esquemáticamente en el siguiente esquema, y para los compuestos56-59representados en la Tabla 5.
Esquema:Síntesis de hidroxi- y preniloxi-chalconas. a) BBr3, CH<2>Cl<2>seco, microondas, 55 °C, 30 min) 3 equiv. RBr, 3 equiv. Nal, 7 equiv. K<2>CO<3>, acetona, □, 4 h. Condiciones de reacción, véase la Tabla 5.
Tabla 5.Síntesis de hidroxichalconas56-59víala desmetilación mediada por BBrs de metoxichalconas38, 52, 48 y 40 respectivamente.
La síntesis de loscompuestos 68-70 y 72-79se realizó como se representa esquemáticamente a continuación y se detalla con más detalle en la Tabla 6.
en donde R es como se representa en la Tabla 6.
Esquema: Síntesis de furil chalconas. 1 equiv. aldehido, 10 % en moles de LÍOH.H2O, abs. EtOH, 40 °C, condiciones de reacción, véase la Tabla 6
Tabla 6.Síntesis de furil chalconas68-70y72-79.
La síntesis de loscompuestos 82-87se realizó como se representa esquemáticamente a continuación y se detalla en la Tabla 7.
en donde R y R' son como se representan en la Tabla 7
Esquema: Síntesis de indolilchalconas. a) 1 equiv. De R1X, 1.5 % en moles (nBu)4N+Br-, 25% NaOH(ac.)/mTHF (3:2), A, 3.5 h; b) 1 equiv. de benzaldehído, 5 % en moles LiOH.H2O, EtOH abs. Condiciones de reacción, véase la Tabla 7
N-alquilación de 3-acetilindol: síntesis de compuestos 81a-c.
Una mezcla de 3-acetilindol (6,32 mmol, 1 g), bromuro de tetra-n-butilamonio (1,5 % en moles) y el haluro de alquilo (1 equiv., 6,32 mmol) en 6 mL de 2-metiltetrahidrofurano y 8 mL de una solución acuosa de hidróxido de sodio al 25 % se calienta a la temperatura de reflujo durante 3,5 horas (el progreso de la reacción también se controla mediante análisis CCF). Posteriormente, se deja enfriar el contenido del matraz a temperatura ambiente, mientras se separa en dos capas. Se añade dietil éter (10 mL) y la mezcla se transfiere a un embudo de decantación. La fase orgánica se aísla y se seca sobre MgSO4, después de lo cual el disolvente se evaporain vacuo,proporcionando el indol N-alquilado en forma de un sólido blanco.
Tabla 7.Síntesis de indolilchalconas80-86: resultado de la condensación de Claisen-Schmidt.
B.2. Procedimientos de reacción para la síntesis de estilbenos
Preparación de los estilbenos 90 y 91 vía reacción de Horner-Wadsworth-Emmons.Una mezcla de bromuro de bencilo adecuada (1 mmol) y fosfito de trietilo en exceso se agita a 130 °C durante 20 h. La eliminación del fosfito restante por destilación en vacío proporciona el fosfonato deseado como residuo. Este compuesto intermedio se disuelve en 2 mL de dimetilformamida seca, contenida en un matraz de fondo redondo secado a la llama bajo una atmósfera de nitrógeno. A continuación, se añade gota a gota una solución de metóxido de sodio (0,73 equiv.) en metanol. El contenido del matraz se enfría a 0 °C, tras lo cual se añade el aldehído (0,67 equiv.). A continuación, la mezcla resultante se agita sucesivamente a temperatura ambiente durante 1 h, se callenta a temperatura de reflujo durante otra hora y se deja reposar durante la noche. Posteriormente, se añade una mezcla de agua y metanol (1:1), que proporciona el estilbeno deseado en forma de un precipitado. Se puede recolectar una segunda cosecha de cristales de las aguas madres.
Síntesis de 1,2-diarilacetilenos vía acoplamiento de Sonogashira.Un matraz de fondo redondo se carga con PdCl2(PPh3)2(0,02 mmol, 2 % en moles) y se enjuaga a fondo con argón. Se añaden respectivamente sec.-butilamina (0,5 mL), agua (0,5 mL), yoduro de arilo (1 mmol) y el acetileno (1,3 mmol, 1,3 equiv), después de lo cual el espacio de cabeza se lava con argón una vez más. La mezcla resultante se agita a 25 °C, bajo atmósfera inerte, durante un tiempo adecuado. El acetileno deseado se obtiene en forma de un precipitado, que puede aislarsevíafiltración y secarse al aire.
Síntesis de los estilbenos 92 y 93 vía una secuencia de hidrosililación-protodesililación y aislamiento de estilbeno 96.Un matraz de fondo redondo secado a la llama se carga, a su vez, con el diarilacetileno (1 equiv.), EtOMe<2>SiH (1,5 equiv.) y PtÜ<2>(7 % en moles). La mezcla resultante se mantiene durante la noche a 60 °C bajo una atmósfera de nitrógeno. A continuación, el exceso de EtOMe<2>SiH se evapora bajo una atmósfera de alto vacío, tras lo cual el residuo se disuelve en THF seco. El contenido del matraz se enfría a 0 °C y se añade gota a gota una solución de fluoruro de tetra-n-butilamonio (TBAF) en THF (3 equiv.). La mezcla se agita durante la noche bajo una atmósfera de nitrógeno, mientras se deja que la temperatura ascienda a 20 °C. El contenido del matraz se filtra sobre Celite; el filtrado se concentrain vacuo,se recoge en dietil éter y se lava con salmuera (2x). La fase orgánica se seca posteriormente sobre MgSÜ4 y se concentra por evaporación rotatoria, proporcionando el estilbeno deseado en forma de una mezcla de estereoisómeros. Los isómeros (E) y (Z) se pueden aislar por medio de TLC preparativa, empleando una mezcla de eluyente de éter de petróleo y dietil éter (4:1).
Síntesis de estilbeno 94 vía hidrogenación parcial en presencia de catalizador de Lindlar.Catalizador de Lindlar se carga en un matraz de fondo redondo secado a la llama que contiene benceno. La suspensión resultante se lava a fondo con hidrógeno gaseoso. Posteriormente, se añade una mezcla de diarilacetileno y quinolina en benceno. El contenido del matraz se agita a temperatura ambiente, bajo una atmósfera de hidrógeno, durante un tiempo adecuado. A continuación, la suspensión se filtra sobre Celite y el filtrado se concentrain vacuo.La mezcla residual de isómeros (E) y (Z) del estilbeno deseado se puede separar media CCF preparativa, empleando una mezcla de eluyente de éter de petróleo y dietil éter.
Preparación de (E)-estilbeno 95 vía una reacción de Wittig.Se añaden bromuro de bencilo (1 mmol) y trifenilfosfina (0,26 g, 1 equiv.) a un matraz de fondo redondo secado a la llama lleno de 5 mL de dietil éter seco. La suspensión resultante se calienta a reflujo bajo una atmósfera de nitrógeno durante 12 h, después de lo cual la sal de fosfonio precipitada puede aislarse por filtración.
La suspensión resultante también se puede utilizar como tal en la reacción de Wittig. En este caso, se añade 1 equiv. de KOtBu, después de lo cual la mezcla se calienta a reflujo, todavía bajo una atmósfera de nitrógeno, durante una hora más. A continuación, el contenido del matraz se enfría a 0 °C y se añade gota a gota el aldehido (0,5 equiv.). Posteriormente, la mezcla se calienta a la temperatura de reflujo durante varias horas, mientras que el progreso de la reacción se controla por medio de CCF.
Una vez completada la reacción, la suspensión se extingue mediante la adición de un volumen igual de agua y la emulsión se extrae con dietil éter (2x). Las capas orgánicas combinadas se secan sobre MgSÜ4 y el disolvente se evaporain vacuo.El producto bruto resultante se recoge con hexano; las impurezas se eliminan por filtración y la fase de hexano se concentrain vacuo,proporcionando el estilbeno deseado. Si se forma una mezcla de isómeros (E) y (Z), la separación se puede realizar por medio de CCF preparativa, empleando una mezcla de eluyente de éter de petróleo y dietil éter (4:1).
B.3. Compuestos
En la Tabla 8 que se recoge a continuación, compuestos ejemplares de acuerdo con la fórmula I se exponen en forma tabulada.
Tabla 8: Compuestos de acuerdo con la fórmula I
En la Tabla 9 que se recoge a continuación, compuestos ejemplares de acuerdo con la fórmula II se exponen en forma tabulada.
Tabla 9: Compuestos de acuerdo con la fórmula II
C. Recopilación de un valioso conjunto de chalconas anti-invasivas
Datos inicialmente disponibles.Los procedimientos bien documentados del programa de detección indo-belga proporcionan datos de actividad anti-invasivain vitropara un total de 106 flavonoides y sirvieron como punto de partida para la compilación de un conjunto de datos adecuado para el análisis QSAR. Debido a la intención de los autores de la invención de centrar el poder predictivo del modelo en las chalconas, limitando al mismo tiempo la cantidad de vías biológicas a través de las cuales podrían actuar los compuestos investigados, solo se seleccionaron las chalconas completamente evaluadas de la lista (compuestos1-34,Tabla 10) para hacer parte del conjunto de entrenamiento.
Tabla 10.Resumen de la estructura, clase de actividad y predicción del modelo para los compuestos en el conjunto de entrenamiento.
La potencia de estas moléculas se evaluó por medio del ensayo de invasión de corazón de pollo, como se describe anteriormente en esta memoria. La traducción del grado de invasión del ensayo a diferentes concentraciones en clases estadísticamente viables se realizó calculando el logaritmo de la 'concentración activa más bajacminpara cada uno de los compuestos, siendo la concentración más baja a la que una sustancia exhibe un comportamiento anti invasivo (grados de invasión I o II, Eq. 1). Por lo tanto, se definieron seis niveles de actividad, que van desde la clase -2 para los compuestos más activos (grado de invasión I o II al nivel de 0,01 μmol/l) hasta la clase 3 (compuestos sin efecto aparente a una concentración de 100 pmol, véase la Tabla 1 anterior).
clase actividad anti - invasiva= logcmin(Eq. 1)
Ampliación del conjunto de datos.Las chalconas en la colección de selección indo-belga carecen de un patrón de sustitución sistemático. Aunque los anillos A y B de estos productos naturales están decorados con una diversidad de interesantes sustituyentes que se encuentran comúnmente en los metabolitos secundarios bioactivos de las plantas (p. ej., grupos prenilo, restos de cromano, grupos metilendioxi y metoxi), los autores de la invención consideraron necesario ampliar el conjunto de entrenamiento con un cierto número de análogos elegidos estratégicamente (Tabla 11 ,37-51). En primer lugar, quisieron investigar la influencia del resto metoxi en el nivel de actividad, variando tanto el número como la posición de este grupo simple donante de electrones. Además, se prepararon cuatro chalconas fluoradas (48-51). Los autores de la invención previeron que estos sencillos patrones de decoración les proporcionarían, en cierta medida, información sobre la influencia de la densidad de electrones de los dos anillos aromáticos sobre la actividad.
Estas quince chalconas se testaron posteriormente en cuanto a su actividad anti-invasivain vitro.Sorprendentemente, seis compuestos exhibieron una potente actividad en o por debajo del nivel de 1 μmol/l (clase de actividad 0, -1 o -2). Son particularmente llamativos los resultados de los compuestos45y49:ninguno de los productos naturales analizados anteriormente en el programa de selección indo-belga mostró ser activo en concentraciones tan bajas como 0,01 gmol/l. A pesar de su baja potencia, los análogos menos activos también añaden información útil a los conjuntos de entrenamiento.
Tabla 11:Resumen de la estructura y clase de actividad real de los compuestos 37-51.
Compilación final del conjunto de datos.La combinación de los datos recién obtenidos con las chalconas1-34seleccionadas anteriormente del programa de selección indo-belga permitió a los autores de la invención compilar un conjunto de datos de 49 chalconas, que cubren una amplia gama de potencia anti-invasiva: las actividades varían desde compuestos de clase 3 que no poseen actividad a 100 gmol/l - a clase -2 - compuestos activos a 10 nmol/l. Este grupo de 49 chalconas se utilizó posteriormente como conjunto de entrenamiento en el desarrollo de su modelo QSAR.
Correlación de datos de actividad anti-invasiva in vitro para chalconas con su estructura química
Modelado QSAR.Los dibujos bidimensionales de los compuestos se realizaron utilizando ChemDraw Ultra 7.0.1. Posteriormente, estas estructuras se cargaron en HyperChem 8.0.3 y su geometría molecular de equilibrio refinada se obtuvo mediante (i) conversión de 2D a 3D utilizando parámetros incluidos en HyperChem, (ii) pre-optimización utilizando el método de campo de fuerza de mecánica molecular (MM+) y (iii) optimización final en el nivel semiempírico de teoría AM1 utilizando un gradiente conjugado Polak-Ribiere y un gradiente RMS de 0,01 kcal/(Á.mol) como condición de terminación para estructuras optimizadas.
Estas geometrías se cargaron en CODESSA Pro, un paquete de software que combina diversas técnicas estadísticas de correlación estructura-propiedad-actividad. Recientemente, este programa correlacionó y predijo con éxito una serie de actividades biológicas (p. ej., actividad inhibidora de la proteasa del VIH-1 de tetrahidropirimidinonas sustituidas) y propiedades físico-químicas (p. ej., energías libres de complejación de ^-ciclodextrina).
Utilizando MOPAC 7.05, implementado en el paquete CODESSA Pro, se calcularon 863 descriptores teóricos. Estos se pueden clasificar en varios grupos: (i) constitucionales, (ii) topológicos, (iii) geométricos, (iv) termodinámicos, (v) químicos cuánticos y (vi) relacionados con la carga. Todos los descriptores se derivan únicamente de la estructura molecular y, por lo tanto, su cálculo no requiere datos experimentales.
A continuación, se buscó la mejor ecuación multilineal (Eq. 1) que correlaciona la clase de actividad anti-invasiva (log cmin)con ndescriptores moleculares (Di),ponderados por sus coeficientes de regresiónbutilizando la 'Mejor Regresión Multilineal' (BMLR) integrado en CODESSA Pro. Como tal, se generaron modelos QSAR que emplean hasta diez descriptores. De hecho, diez descriptores es el número máximo permitido para un conjunto de datos de cincuenta compuestos de acuerdo con la regla general de '5 a 1'.
Una etapa crucial en el desarrollo de un modelo QSAR significativo es la detección del 'punto de ruptura',es decir,el número de descriptores más allá del cual la mejora estadística del modelo se atenúa tras la adición de un descriptor adicional. El criterio más sencillo y frecuentemente empleado en este contexto es un valor de Ar2 de 0,05. Limitar el número de descriptores a un mínimo absoluto - pero no menor - también está de acuerdo con el principio de parsimonia (la navaja de Occam y la reformulación de Einstein de este último: 'hacer todo lo más simple posible, pero no más simple').
Como se ilustra claramente en la Figura 1, el 'punto de ruptura' se sitúa alrededor den= 6 para el conjunto de datos de los autores de la invención. De aquí en adelante, es más probable que los descriptores adicionales conduzcan a un mejor ajuste debido a la correlación aleatoria que debido a una razón bioquímica subyacente. Por lo tanto, el modelo de seis descriptores es el 'modelo óptimo' de los autores de la invención (Eq. 3, Tabla 12, 13).
Modelo óptimo (los errores estándar se incluyen solo para indicar la precisión)
Discusión del Modelo QSAR: evaluación estadística, validación interna e interpretación de descriptores.
Evaluación estadística.El modelo óptimo de seis descriptores de los autores de la invención posee un valor de r2 de 0,7411. La matriz de confusión, representada en la Figura 2, sirve como una buena herramienta para una evaluación adicional del ajuste de datos del conjunto de entrenamiento. De la clase 3 menos activa, 9 de los 16 compuestos (56 %) pertenecen a la clase correcta. Para la clase 2, la precisión es inferior al 40 %. La actividad de los compuestos de las clases 1 y 0 se asigna con un 67 y un 50 % de precisión respectivamente, mientras que la mayoría de los compuestos activos se clasifican en una clase demasiado alta.
Mientras que el ajuste puede parecer mediocre a primera vista para algunas clases, solo se observa un valor atípico. De hecho, para todos los compuestos menos uno, el error es a lo sumo una unidad de clase. Además, un error de una unidad de clase debe considerarse satisfactorio en el presente ejercicio, teniendo en cuenta la naturaleza discreta de las clases de actividad anti-invasiva y el consiguiente error de redondeo en los datos de entrenamiento.
Además, la asignación de compuestos débiles y moderadamente activos (clases 3, 2 y 1) tiene una precisión del 92 % (36 de 39 productos). Inversamente, el 90 % de las chalconas que se prevé que sean débil o moderadamente activas pertenecen a las clases 1, 2 o 3. Aún así, el 60 % (6 de 10) de los compuestos más activos (clases 0, -1 y -2) son asignados correctamente, y el 67 % de las sustancias que se prevé que sean potentes lo son (6 de 9). Por lo tanto, el ajuste de datos del conjunto de entrenamiento es razonablemente alto.
Otra forma de evaluar la calidad del ajuste de una regresión es realizar un test F, que da como resultado la aceptación o el rechazo de la 'hipótesis nula' H<0>: no existe una correlación significativa entre la variable dependiente y las variables independientes (¿><1>= ¿><2>= ...=b= 0). Un valor p para la estadísticaFde un modelo más pequeño que el valor crítico a/2 = 0,025 apunta hacia una buena significancia general de la correlación. Para el modelo óptimo representado por la Eq. 2, el valor p es 0.000000. Por lo tanto, la correlación en el modelo de los autores de la invención es significativa, al menos un descriptor está asociado linealmente con logcmin.En otras palabras, H<1>, se puede aceptar la hipótesis alternativa (al menos un ¿i t 0). De hecho, la estadística F alta sugiere más solo un predictor significativo.
Tests t individuales en cada uno de losbide la ecuación de regresión muestran que cada uno de los descriptores aporta información significativa a la predicción resultante, ya que el valor p para cada uno de los descriptores es menor quea/2= 0,025. Según los valores de los tests (|f|), la significancia de los descriptores en el modelo disminuye en el ordenD3>D2>Di > D4>Ü6>D5.
El error estándar de predicción s para el modelo óptimo de los autores de la invención es 0,6945. Como regla general, un modelo se considera útil cuando el valor de s es inferior al diez por ciento del intervalo de observación. En este caso, el error estándar de predicción es ligeramente mayor, pero parece razonable si se considera la naturaleza discreta de los datos de origen.
Validación interna del modelo.Una de las etapas más importantes en el desarrollo de un modelo QSAR valioso es su validación. La mayoría de los problemas de fiabilidad del modelo son consecuencia de (i) sobreajuste o (ii) correlación aleatoria.
(i) Elsobreajustees un problema común en quimiometría y puede evaluarse utilizando criterios objetivos tales como métodos de validación cruzada. El más simple de estos es el método comúnmente utilizado de 'dejar uno fuera' (CVOO). En este enfoque, se deja un punto de datos fuera del conjunto de entrenamiento, sobre el cual se predice su actividad mediante un modelo construido con los mismos descriptores que el modelo principal, aunque con coeficientes de regresión calculados para los compuestos n-1 restantes. Este cálculo se realiza para cada uno de los puntos, después de lo cual losnvalores pronosticados se retroceden con los datos experimentales, calculando asíq2cvOO.
Durante los cálculos de BMLR, CODESSA PRO proporciona automáticamente los resultados del test de validación cruzada 'dejar uno fuera'. Para el modelo óptimo de los autores de la invención se obtuvo unq2cvOOde 0,6407 y unRMs PEoode 0,77, mientras que elr2y s fueron 0,7411 y 0,6945, respectivamente. Por lo tanto, se podría concluir que el error de generalización es satisfactoriamente bajo. Sin embargo, la técnica de validación cruzada 'dejar uno fuera' tiene algunas deficiencias graves que limitan su valor. La validación cruzada 'dejar muchos fuera' (CVMO) se considera una técnica superior. Por lo tanto, los buenos resultados de CVMO para el modelo óptimo de los autores de la invención (q2cvMO= 0,6385, RMSPEnno = 0,7776) proporcionan más confianza en cuanto a su robustez.
Durante el desarrollo del modelo predictivo de los autores de la invención, inicialmente incluyeron chalcona 52 en su conjunto de entrenamiento. Sorprendentemente, todos los modelos obtenidos estaban claramente sobreajustados hacia el compuesto 52, ya que la validación cruzada de estas correlaciones fallaba cada vez que se omitía esta estructura. Cuando se eliminó del conjunto de entrenamiento, se obtuvo el "modelo óptimo" actual que se sometió con éxito a controles de validación cruzada. Claramente, la relación entre la estructura del compuesto 52 y su actividadin vitrodifiere mucho de la de las otras sustancias en el conjunto de entrenamiento de los autores de la invención, lo que apunta hacia un modo de acción diferente para esta chalcona. Los autores de la invención incluyeron compuesto 52 en su conjunto de validación (véase más adelante)para testar esta hipótesis.
(ii) El grado decorrelación aleatoriade su ecuación óptima se evaluó mediante un test de aleatorización. El r2 promedio de 0,251 para veinte permutaciones del vector Y indica una relación más fuerte entre sus descriptores y la actividad anti-invasiva que la esperada debido al azar. Además, los valores p del test F para el modelo y los tests t en los descriptores individuales sugieren la importancia de la correlación del modelo.
Interpretación del modelo.La información esencial que proporciona un modelo QSAR está contenida en el significado físico-químico de sus descriptores y su influencia en la variable dependiente. Por lo tanto, una interpretación de los descriptores contenidos en el modelo óptimo de los autores de la invención es imperativa si este último debe ser de alguna utilidad. Aunque una comprensión directa de estos descriptores es generalmente difícil, dada la complejidad de las interacciones en los fenómenos bioquímicos estudiados, los descriptores se pueden asociar a menudo con procesos implicados en el problema estudiado de una manera más indirecta, pero igualmente valiosa.
(i) El primer descriptor, 'Contribución máxima de anti-unión de un MO’ (Di, Tabla 2), es un descriptor químico cuántico que está relacionado con la estabilidad de una molécula, dado que resultará una mayor contribución de anti-unión en un orbital molecular de mayor energía. El coeficiente deDitiene un signo positivo, lo que sugiere que las moléculas de menor energía exhibirán una potencia anti-invasiva más fuerte. Además, una puntuación más alta para este tipo de descriptor se ha asociado con una solubilidad acuosa incrementada. En el presente estudio, esto significaría que más compuestos lipófilos poseerán propiedades anti-invasivas más fuertes.
(ii) DescriptorD2 ,'Área de Superficie Parcial para el átomo C', junto con su coeficiente negativo, destaca la importancia de los restos de hidrocarburos en la molécula y puede apuntar hacia una importante contribución de Van der Waals a la interacción huésped-huésped, es decir, la presencia de un importante sitio de unión lipófilo en el bolsillo de unión.
(iii) El descriptor más significativo del modelo, de acuerdo con el t-estadístico esD3 :'Calor final de formación / n° átomos’. El coeficiente de este descriptor químico cuántico lleva un signo positivo. En consecuencia, para compuestos termodinámicamente más estables, que poseen una energía de formación negativa, la contribución de este descriptor dará como resultado una puntuación global más baja y, por tanto, una actividad anti-invasiva más alta. Esta observación está en consonancia con la información extraída del descriptorD i.
(iv) 'XY Sombra/XY Rectángulo',D4,es un índice de sombra molecular, definido como la proyección de la envolvente de Van der Waals de las moléculas en el plano XY, en que X e Y son los ejes de inercia más cortos y los segundos ejes de inercia más cortos de la molécula, respectivamente. El área de sombra se determina habitualmente mediante la aplicación de una cuadrícula cuadrada bidimensional en la proyección molecular y la suma posterior de las áreas de los cuadrados superpuestos con la proyección. Este descriptor está directamente relacionado con el tamaño molecular y, en consecuencia, también destaca la contribución de van der Waals a la unión en el objetivo molecular. Además, puede proporcionar información sobre la correcta orientación de la chalcona hacia su objetivo. Dado que el coeficiente de este descriptor porta un signo positivo, las moléculas con dimensiones proyectadas más pequeñas en el plano XY tendrán una actividad deseada más alta. Es muy probable que esto se deba a un mejor ajuste de las moléculas con una envoltura XY proyectada más pequeña en el bolsillo de unión.
(v) El descriptorD5es el 'índice de reacción mínimo de 1 electrón para un átomo de oxígeno', calculado como
en el que las sumas se realizan sobre todos los orbitales atómicosi, jdel átomo dado,cíhomoychumoson los coeficientes orbitales atómicosPyj°en HOMO y LUMO, respectivamente, y£<lumo>y£<homo>representan las energías de los últimos orbitales. Este descriptor probablemente destaca una interacción importante entre el sitio de unión del receptor y el oxígeno del carbonilo o uno o más de otros átomos de oxígeno presentes en la molécula.
(vi) El sexto descriptor en la ecuación QSAR de los autores de la invención es el 'Parámetro de polaridad', que se define como
es decir, la diferencia entre las cargas parciales más positivas y más negativas de la molécula. En este cálculo, la distribución de carga en la molécula se determina con base en el enfoque de Zefirov, que utiliza la escala de electronegatividad de Sanderson y representa la electronegatividad molecular como la media geométrica de las electronegatividades atómicas. El coeficiente positivo para este descriptor indica que menos polares, más lipofílicos tienden a exhibir una mejor potencia anti-invasiva. Esto nuevamente concuerda con el análisis realizado para los descriptoresDiyD2.
En resumen, la interpretación del descriptor anterior proporciona un cierto número de pautas interesantes para el diseño de chalconas anti-invasivas novedosas y más potentes:
I. Es de esperar una actividad más fuerte para compuestos más apolares (Di, D2, De).Las contribuciones de Van der Waals pueden desempeñar un papel importante en las interacciones huésped-huésped, lo que sugiere la presencia de un sitio lipofílico en el bolsillo de unión.
II. Los compuestos termodinámicamente más estables serán más potentes (Di, D3).
III. Las moléculas con dimensiones proyectadas más pequeñas en el plano XY pueden encajar mejor en el bolsillo de unión (D4).
IV. Lo más probable es que el grupo carbonilo esté implicado en una interacción importante con una región más polar del bolsillo de unión (D<5>).
Validación externa: Diseño, síntesis y evaluación dirigida por QSAR de nuevos compuestos anti-invasivos.
Validación externa del modelo.Muy a menudo, elq2con validación cruzada se utiliza como el único indicador de la calidad de un modelo QSAR. Un alto valor de q2 con validación cruzada es un requisito necesario pero no suficiente para la predictividad. La evaluación del modelo frente a un conjunto de datos externo sigue siendo el único juicio fiable de su verdadero poder predictivo. Por lo tanto, tras la interpretación del modelo, la intención de los autores de la invención fue diseñar, sintetizar y testar un conjunto externo de compuestos basado en las predicciones de su modelo y las pautas extraídas de sus descriptores.
Selección de Compuestos para Síntesis.Para confirmar el poder predictivo externo del modelo de los autores de la invención, estos calcularon la actividad anti-invasiva de 250 chalconas hipotéticas. Se sintetizaron veinticinco de estos compuestos, de los cuales 19 se testaronin vitro.Los datos así obtenidos les proporcionaron un conjunto de validación externa. Dada la potencia extraordinariamente alta de la chalcona fluorada49recientemente evaluada, presente en el conjunto de entrenamiento de los autores de la invención, estos incorporaron cinco chalconas adicionales que contienen flúor(53-55,58,62)en el conjunto de validación. El modelo QSAR de los autores de la invención anticipa una fuerte tendencia anti-invasiva para tres de estos compuestos (53,55y59). Dado que dos chalconas preniladas con C en el conjunto de entrenamiento eran bastante potentes (clase 0), los autores de la invención estaban intrigados por investigar el potencial de sus análogos prenilados con O más fáciles de obtener. Por lo tanto, una de las fluorochalconas (62) fue diseñada para portar un resto preniloxi.
Además, la única furil chalcona (28) en el conjunto de entrenamiento llamó la atención de los autores de la invención, ya que los miembros de esta clase de compuestos se han propuesto como posibles conductores para nuevos inhibidores de la angiogénesis e inhibidores duales de COX y 5-LOX. En consecuencia, estaban intrigados por explorar más a fondo el potencial anti-invasivo de esta clase de compuestos e incorporaron diez chalconas de furilo funcionalizadas diferencialmente en el conjunto de validación. El modelo QSAR de los autores de la invención prevé que varias de estas moléculas (70,75,76y77) sean muy interesantes.
Con el fin de evaluar adicionalmente el dominio de aplicabilidad del modelo de los autores de la invención a otros núcleos de chalconas heterocíclicas, se añadieron dos indolil chalconas (84y85) al conjunto de validación. Esta clase de compuestos relativamente inexplorada exhibe propiedades anti-inflamatorias y citotoxicidad frente a las células cancerosasin vitro.Además, se demostró que análogos cercanos de estas sustancias eran agentes de despolimerización de microtúbulos, activos contra el glioblastomain vivo,lo que subrayó su capacidad de cruzar la BBB y validó su potencial como agentes quimioterapéuticos sistémicos, incluyendo el suministro al parénquima cerebral y al sistema nervioso central. Sin embargo, según las predicciones del modelo de los autores de la invención, estos compuestos deberían carecer de comportamiento anti-invasivo (clase 4/5).
Como se ha explicado anteriormente, el compuesto52se incluyó en el conjunto de validación para ayudar a confirmar su modo de acción aberrante. Además, con el fin de corroborar el escaso potencialin vitrodel armazón de nitrochalcona y de evaluar la aplicabilidad del modelo desarrollado a esta familia molecular, se incorporaron al conjunto de validación dos chalconas nitroportadoras más (88y89), ambas que tienen una baja actividadin silico.Las dos últimas sustancias se habían sintetizado y evaluadoin vitrocon anterioridad.
De esta manera, los autores de la invención compilaron un conjunto de validación que comprende 20 moléculas de diversidad molecular bastante grande, cuya actividad anti-invasiva se determinóin vitro(Tabla 14) utilizando el ensayo invasivo de αdo de pollo como se describe anteriormente, y que poseíain silicovalores de actividad anti-invasiva repartidos en un amplio intervalo de concentraciones. Posteriormente, dichos datosin vitrofueron comparados con los datos obtenidosin silicocomo se representa en la Tabla 14, con el fin de validar el modelo predictivo de los autores de la invención.
Tabla 14. Comparación entre las clases de actividad anti-invasiva in vitro predichas y reales para el conjunto de val idación.
Una comparación entre los valores de actividad anti-invasiva in vitro pronosticados y observados se representa en la Tabla 14 y en la matriz de confusión en la Figura 3. Como se puede deducir de la predictividad externa del modelo, es razonablemente buena, dada la naturaleza discreta de los datos fuente.
Como es evidente en la Tabla 15 que figura a continuación, ya se conoce en el estado de la técnica una amplia gama de compuestos similares a las chalconas, no obstante, se prevé que dichos compuestos tengan una concentración activa más baja de > 1 μM (clase predicha > 0) cuando se hace uso del método de acuerdo con esta solicitud. Como tal, se predice que se necesitan concentraciones más altas de dichos compuestos con el fin de obtener un efecto anti invasivo similar en comparación con los compuestos de acuerdo con esta invención, haciéndolos así menos adecuados para el desarrollo de fármacos anti-invasivos.
Tabla 15:Predicción de actividad anti-invasiva de compuestos similares a chalcona conocidos
Ejemplo: Ensayo de invasión de Matrigel de compuesto 49
Un método interesante para determinar la capacidad invasiva de las células y el potencial anti-invasivo de diferentes sustancias es el ensayo de invasión de matrigel. Matrigel puede considerarse una membrana basal y se obtiene de sarcomas EHS de ratón (tumores que tienen una expresión abundante de proteínas de la matriz extracelular). El componente principal de un matrigel es laminina, que también incluye colágeno IV, heparán, proteoglicanos de sulfato y factores de crecimiento. También es importante que estén presentes inhibidores y enzimas que degradan la matriz.
A temperatura ambiente, matrigel se polimeriza en una matriz que imita una membrana basal de células mamarias. El comportamiento de las células hacia un matrigel se parece mucho a la situaciónin vivoy, por lo tanto, se reconoce que este test es un enfoque apropiado para estudiar la migración y la invasión, y el papel de los receptores de ECM y las enzimas que degradan la matriz en estos procesos.
En particular, para este ejemplo, las células del test se colocaron en una capa de matrigel en medio sin suero. Posteriormente, se permitió que dichas células invadieran la capa de matrigel sobre la que se mueven a través de un filtro y se fijan al fondo de dicho filtro. La migración de las células es estimulada por la presencia de medio acondicionado, al otro lado del filtro, que actúa como quimio-atrayente para las células.
Protocolo:
Se aplicaron 50 μl de matrigel (+/- 3 mg/ml de DMEM sin suero) en el compartimiento apical (cámara superior) de inserciones de placas de 24 pocillos que tenían un tamaño de poro de 8 μm. Después de 1 h de polimerización (37 °C) se sembraron 50.000 células BLM (en 150 μl de DMEM sin suero) y se incubaron con concentraciones variables de compuesto 49 (0-100 μM). En el compartimiento basolateral (cámara inferior), se aplicaron 700 μl de medio acondicionado, que contenía la misma concentración de compuesto 49 que la utilizada en el compartimiento apical, como quimio-atrayente para las células. Las placas se incubaron durante 24 h a 37 °C y el matrigel y las células del lado apical se retiraron utilizando hisopos de algodón humedecidos (PBSD-). Los filtros se lavaron dos veces por ambas caras con PBSD- y posteriormente se incubaron durante 10 min en metanol helado para fijar las células. Para cuantificar el número de células migradas, los filtros se incubaron durante 15 min con DAPI y posteriormente se lavaron 4 veces durante 5 min con PBSD-. A continuación, los filtros se montaron en cubreobjetos y se determinó el número de células migradas para cada una de las concentraciones de compuesto 49 utilizando un microscopio de fluorescencia.
Resultados
Células BLM no tratadas (melanoma) son muy invasivas en un matrigel; sin embargo, tras el tratamiento con concentraciones variables de compuesto 49, la cantidad de células BLM invasivas se reduce significativamente (ANOVA, p = 0,001) como se desprende de la Tabla 16.
Tabla 16: Número de células BLM invasivas encontradas en el lado basolateral del filtro
El tratamiento con el compuesto 49100 μM da como resultado una reducción del 98 % del número de células invasoras (Tukey HSD, p < 0,05). Sin embargo, también concentraciones más bajas de compuesto 49 dan como resultado una reducción significativa (p < 0,05) del número de células invasoras, es decir, 93 % (10 μM), 67 % (1 μM) y 80 % (0,1 μM)
Experimento in vivo: Estudio de supervivencia
Materiales y Métodos
Con el fin de evaluar la potenciain vivode 4-fluoro-3',4',5'-trimetoxichalcona 49 contra la línea celular de carcinoma mamario MCF-7/6, se realizó un experimento de metástasis ampliamente utilizado que implicaba la inyección intracardíaca de las células cancerosas. Una semana después de la implantación subcutánea de un sedimento de estrógeno (1 mg) en la región dorsal del cuello, a 22 ratones Swissnu/nuse les inyectaron en el ventrículo cardíaco izquierdo con 1.105 células MCF-7/6 bajo anestesia con xilazina y ketamina (Smith W., 1993).
Las células MCF-7 se obtuvieron originalmente de un derrame pleural de una mujer nulípara posmenopáusica (Soule et al., 1973). Esta línea celular posee una serie de receptores de hormonas esteroides y peptídicas, y ha conservado la capacidad de respuesta hormonal. Por lo tanto, el crecimiento de tumores MCF-7 en ratones sin pelaje se ve potenciado por la administración de estrógenos, lo que se aseguró en el experimento de los autores de la invención a través del implante antes mencionado (Shafie S.M., 1980; Welsch et al., 1981).
En virtud de la inyección en el ventrículo cardíaco izquierdo, las células cancerosas entran directamente en la circulación arterial sistémica, lo que potencia la posibilidad de colonización (Arguello et al., 1988). Por lo tanto, este tipo de inoculación se utiliza ampliamente para inducir metástasis en el hueso y la médula ósea (Wetterwald et al., 2002). Sin embargo, dado que estas metástasis son difíciles de detectar y cuantificar, se eligió el tiempo de supervivencia como el único criterio de valoración de este estudio.
Tras la inoculación, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos iguales. A una cohorte se le inyectaron por vía intraperitoneal 10 nmol de 49 tres veces por semana (160 jg.kg-1 para un animal de 20 g), mientras que el otro grupo solo recibió el vehículo (100 jL de DMEM sin suero que contenía 1:1000 DMSO).
Se adquirieron ratones Swissnu/nuhembras de cuatro semanas de edad de Charles River (Francia). Estos ratones tienen una mutación en el gensin pelajedel ectodermo, lo que da lugar a un defecto en la formación del pelo, dando como resultado su fenotipo sin pelo. Esta mutación provoca, además, la falta de un timo funcional. Como resultado, los ratones Swissnu/nuno tienen linfocitos T y tienen una función inmunológica alterada, lo que los convierte en huéspedes adecuados para el desarrollo de tumores tras la inyección de células neoplásicas humanas (Reth M., 1995).
Los animales fueron alimentados con una dieta estéril 'RO4Aliment Composé Complet' (UAR, Epinay-sur-Orge, Francia). El agua de bebida se esterilizó y luego se acidificó con HCl al 35 % (1:10.000). Tanto el alimento como el agua se proporcionaronad libitum.Los ratones se mantuvieron en jaulas estériles con filtro superior, que contenían virutas de madera, un refugio y material para anidar. Las jaulas se cambiaban una o dos veces por semana; diariamente se evaluaron la humedad, la temperatura (entre 25 y 30 °C) y el estado general de los animales.
Ratones Swissnu/nuhembras de 6 semanas de edad recibieron un implante de estrógeno subcutáneo (1 mg) en la región dorsal del cuello. Una semana más tarde, se realizó una inyección intracardíaca de 100.000 células MCF-7/6 en 100 j M de PBSD+. Los animales fueron anestesiados previamente mediante inyección i.p. de xilazina (5 jL, Rompun®) y ketamina (36 jL, Ketalar®). La inyección intracardíaca se realizó con una aguja de 30 G (1/2" (12,7 mm)), que se introdujo en la cavidad torácica debajo del esternón. Al salir la pared del ventrículo izquierdo, la sangre se bombea a la jeringa. En este momento, se puede realizar una inyección cuidadosa de las células cancerosas. A continuación, los ratones se dividieron aleatoriamente en un control con vehículo y una cohorte tratada con 49.
A partir de la fecha de inoculación, los ratones fueron tratados i.p. tres veces por semana con 100 jL de una solución de 49100 jmol.L-1 en DMEM libre de suero que contenía DMSO 1:1000, o con vehículo solo (véase el "procedimiento de preparación"). Los números de supervivencia para ambas jaulas se registraron diariamente.
"Procedimiento de preparación": para el grupo tratado con 49, se prepararon soluciones frescas de 100 mmol.L-1 de 49 en DMSO en cada día de inyección, y se diluyeron 1:1000 con DMEM sin suero para obtener soluciones inyectables de 100 μmol.L-1 de 49. Los ratones de control recibieron inyecciones i.p. con 100 jL del vehículo (1:1000 DMSO en DMEM sin suero).
Resultados
En la Tabla 17 se representa una visión general de las observaciones realizadas en el curso del experimento. Dado que dos animales murieron durante la inyección intracardíaca, ambas cohortes comprendían inicialmente 10 ratones. En la semana 5-6, se hizo evidente la diferenciación en la supervivencia entre los dos grupos, ya que 7 ratones de control murieron en un período corto (días 34-51). Aunque no se pudo determinar una causa definitiva de muerte, un patrón de este tipo se observa a menudo en la mortalidad relacionada con el cáncer (Hung et al., 2011; Arap et al., 1998). En el grupo de tratamiento, solo se perdió un ratón en el mismo período. A los tres meses, se terminó el experimento y los ratones supervivientes se sacrificaron y examinaron mediante necropsia. No se detectaron metástasis macroscópicas.
Tabla 17. Contabilidad completa de los datos del experimento de supervivencia.
En la Figura 4 se representa una curva de supervivencia de Kaplan-Meier para la cohorte tratada con 49 y tratada con vehículo. Esta curva proporciona la probabilidad acumulada estimada de supervivencia en el tiempo. Una comparación de las curvas de supervivencia para ambas cohortes a través de un rango Log de Mantel-Cox da como resultado un valor depde 0,018. Por lo tanto, se obtuvo una diferencia significativa en la supervivencia entre los animales tratados y no tratados.
Efecto de los compuestos sobre el crecimiento y viabilidad de las células.
Test de sulforrodamina B
El ensayo SRB se utiliza para evaluar los efectos del crecimiento en las células y mide el contenido total de proteínas. En este test se siembran 5.000 células en una copa de una placa de 96 pocillos. Después de un período de unión de 24 h, las células se tratan con una determinada cantidad de la molécula de ensayo (disuelta en DMSO). Después de un tiempo de incubación pre-seleccionado, las células se fijan con 50 μL de ácido tricloroacético al 50 % (2 °C, 1 h). Posteriormente, la placa se enjuaga cinco veces con agua del grifo y se seca al aire durante la noche.
A continuación, las proteínas se tiñen con 75 μL de una solución al 0,4 % de SRB en AcOH (30 min). La SRB no unida se elimina posteriormente lavando con una solución al 1 % de AcOH glacial, tras lo cual la placa se seca al aire. Luego, la SRB unida se vuelve a disolver en 100 μL de un tampón de tris(hidroximetil)aminometano (T ris) de 10 mmol.L-1 (pH = 10,5), después de lo cual se determina la densidad óptica a 490 nm con un espectrofotómetro.
Ensayo MTT
Un ensayo MTT proporciona una indicación de la viabilidad, proliferación y actividad celular a través de la determinación de la conversión mitocondrial de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), una sal amarilla, en formazán, una sal que precipita en forma de cristales azules.
En concreto,se siembran 5.000 células en una copa de una placa de 96 pocillos, se tratan con la cantidad deseada de la sustancia de ensayo y se incuban durante un período de tiempo elegido. A continuación, se añaden a la copa 40 μL de una solución filtrada (0,2 μm) de 5 mg.mL-1 de MTT en PBS. Después de 2 h de incubación a 37 °C en la oscuridad, se elimina todo el líquido. Las sales de formazán obtenidas se disuelven en 200 μL de DMSO, después de lo cual se mide la densidad óptica a 490 nm.
Resultados
Se obtuvo una visión general de los efectos antiproliferativos generales de los compuestos sobre líneas celulares neoplásicas y sanas.
Se investigaron los efectos de algunos compuestos similares a chalcona sobre la proliferación de células MCF-7/6. Un método comúnmente utilizado para cuantificar la actividad metabólica de las células y - por lo tanto, hasta cierto punto la viabilidad celular - es el ensayo MTT. Este ensayo proporciona una medida de la actividad mitocondrial, ya que evalúa la reducción del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), un tetrazol amarillo, al formazán púrpura; esta transformación se produce en las mitocondrias de las células vivas (Mosmann T., 1983).
Por lo tanto, se determinó la influencia de 13 compuestos sobre la actividad mitocondrial de células MCF-7/6 a 3 concentraciones diferentes, tanto a las 24 como a las 48 h de incubación. La evaluación de la actividad mitocondrial después de 192 h de incubación, que correspondería a la duración del ensayo CHI, no fue posible ya que el grado de confluencia de las células era demasiado alto en ese momento.
De la figura 5 parece que ninguno de los compuestos genera una citotoxicidad significativa. La mayoría de las sustancias median una inhibición del 20 % de la actividad mitocondrial al nivel de 5 jumol.L-1, pero no causan efectos a concentraciones más bajas. Aún así, cabe señalar que para ambos tiempos de incubación, el compuesto 49 mostró el mayor efecto antiproliferativo a 5 jumol.L-1, provocando una disminución de la actividad mitocondrial de ~35 y 25 % después de 24 y 48 h, respectivamente. Sin embargo, sus niveles de actividad a concentraciones más bajas estaban en línea con los ejercidos por los otros compuestos.
Los efectos antiproliferativos de 4-fluoro-3',4',5'-trimetoxichalcona en células MCF-7/6 se evaluaron adicionalmente en el ensayo MTT tras una incubación prolongada, ya que esto proporcionaría un mayor grado de relevancia para el ensayo CHI que tiene un período de incubación de 8 días. Como se mencionó arriba, la confluencia celular fue demasiado alta después de 192 h; por lo tanto, un tiempo de incubación de 144 h se consideró un buen compromiso.
Además, también se realizó un ensayo SRB. Este ensayo se basa en la capacidad del colorante sulforrodamina B (SRB) de unirse electrostáticamente a los residuos de aminoácidos de carácter básico de la proteína en células fijadas con ácido tricloroacético. Los resultados obtenidos en el ensayo SRB son linealmente proporcionales a la cantidad de proteína celular y, por lo tanto, al número de células. Por lo tanto, el ensayo SRB proporcionaría información adicional sobre los efectos antiproliferativos de compuesto 49.
Con el fin de validar adicionalmente el uso de las células MCF-7/LucF5 en los experimentosin vivode los autores de la invención, se determinaron asimismo los efectos de la 4-fluoro-3',4',5'-trimetoxichalcona en esta línea celular en los ensayos MTT y SRB (Van Hoorde L. et al., 1999).
Como se puede apreciar de la Figura 6, compuesto 49 a razón de 100 y 10 μmol.L-1 (p < 0,01) medió en una reducción significativa tanto en la actividad mitocondrial como en el contenido de proteína total en las células MCF-7/6.
Se observó una reducción más pequeña pero aún significativa en el número de células con 1 jumol.L-1, mientras que la actividad mitocondrial había aumentado significativamente tras el tratamiento con 0,1 jumol.L-1 de compuesto 49.
El tratamiento de células MCF-7/LucF5 con 100 o 10 jumol.L-1 de compuesto 49 dio lugar a una reducción significativa del contenido total de proteínas después de 72 h (p = 0). Las concentraciones de 1 y 0,1 jumol.L-1 solo provocaron una reducción marginalmente significativa del recuento de células en el mismo intervalo de tiempo (p = 0,0703 y 0,0538, respectivamente). Después de reducciones significativas con respecto al control disolvente fueron 100 o 10 jUmol.L-1 de compuesto.
Los resultados obtenidos en el ensayo MTT fueron ampliamente equiparables a los del ensayo SRB: después de 72 y 144 h, se observó una reducción significativa en la actividad mitocondrial de las células MCF-7/LucF5 tras el tratamiento con 100 jumol.L-1 y 10 jumol.L-1 de compuesto 49. Sorprendentemente, también se obtuvo una reducción significativa en la actividad mitocondrial después de 72 h de incubación al nivel de 0,1 jumol.L-1 (p = 0,0196), aunque el número de células no se había alterado (de acuerdo con el ensayo SRB). Después de 144 h, se había producido la restauración de la viabilidad al nivel de control en las células tratadas con 0,1 jumol.L-1 del compuesto.
Dado que 4-fluoro-3',4',5'-trimetoxichalcona había ejercido una actividad anti-invasiva en las células de melanoma BLM en el ensayo de invasión de Matrigel, los autores de la invención estaban intrigados por verificar cómo se compararía su efecto sobre la viabilidad de las células BLM con el observado para las líneas celulares MCF-7. Por lo tanto, se realizaron ensayos de MTT y SRB en esta línea celular de melanoma para diferentes concentraciones de compuesto 49 (Figura 7) (De Rijck, 2010).
Se observó una reducción en el contenido total de proteínas del 20 % al tratar con 1 y 10 jumol.L-1 del compuesto (p < 0,01). Una tendencia similar fue apreciable a 100 jumol.L-1, pero no se obtuvo significancia alguna en este caso debido a la gran desviación estándar (p = 0,23). A 0,1 jumol.L-1, no se observó efecto alguno. Se obtuvo un claro patrón dosis-respuesta entre la actividad mitocondrial y la 4-fluoro-3',4',5'-trimetoxichalcona. Todos los tratamientos resultaron en una reducción altamente significativa de la viabilidad de las células BLM (p < 0,01), con una reducción máxima del 76 % a una concentración de 100 jumol.L-1. Los efectos obtenidos a 0,1 y 1 jumol.L-1 fueron mucho menores (22 y 27 %, respectivamente). El tratamiento con disolvente provocó una reducción del 13 % en la actividad mitocondrial (p < 0,05).
On el fin de verificar si los efectos antiproliferativos de compuesto 49, observados en células BLM y MCF-7/6 a altas concentraciones, eran específicos para células, se realizaron ensayos SRB y MTT adicionales en otras cinco líneas celulares (HCT8-E11, TR146, FaDu, 3T3-L1 y CT5.3) (Figura 8). Los resultados de las células MCF-7/6 se añadieron para facilitar la comparación.
La línea celular CT5.3 consiste en miofibroblastos humanos que se aislaron de un tumor de colon (Van Hoorde et al., 1999). Las células 3T3-L1 son fibroblastos murinos, que se originan a partir de embriones de ratones Swiss (Todaro y Green, 1963). HCT8-E11, FaDu y TR146 son líneas celulares de cáncer epitelial humano. La línea celular TR146 consiste en células bucales aisladas de una metástasis de ganglio linfático en el cuello (Clare Hall Laboratories) (Rupniak HT. et al., 1985). Se aislaron células FaDu (Unibioscreen S.A.) de un carcinoma hipofaríngeo (Rangan SR., 1972). HCT-8/E11 es una línea celular de carcinoma de colon, que se subclonó a partir de la línea celular HCT-8 (ATCC) (Vermeulen et al., 1995).
Tras un período de incubación de 24 h, no se observaron diferencias significativas en el contenido total de proteínas para un tratamiento de 1 o 10 jumol.L-1 con compuesto49(Figura 8). En esta última concentración, sin embargo, se observó una tendencia decreciente para las células HCT8-E11 (-27 %), 3T3 (-20 %), CT5.3 (-15 %) y MCF-7/6 (-10 %). En condiciones idénticas, se observó una reducción significativa de las células BLM (-20 %, Figura 7).
Sin embargo, al evaluar la actividad mitocondrial, se observaron diferencias significativas entre el tratamiento con disolvente y compuesto (Figura 8). A 1 jumol.L-1, se observó un aumento del 7 % para las células TR146. Las células FaDu y MCF-7/6 exhibieron la misma tendencia, pero sin significancia; sin embargo, estos resultados concuerdan con las observaciones realizadas para células MCF-7/6 después de 144 h de incubación (Figura 6).
A una concentración elevada (10 jumol.L-1), 4-fluoro-3',4',5'-trimetoxichalcona49engendró una reducción significativa en la actividad mitocondrial en todas las líneas celulares en el intervalo de tiempo de 24 h. Esta disminución de la viabilidad fue más fuerte para las células MCF-7/6, HCT8-E11 y BLM (40 %, Figura 7 y Figura 8). En las líneas celulares 3T3, TR146 y FaDu se obtuvo una reducción del 30 %. Sorprendentemente, las células CT5.3 fueron menos sensibles al compuesto49,ya que la disminución de la actividad mitocondrial solo ascendió al 22 % para esta línea celular de miofibroblastos.
En total, la actividad antiproliferativa de 4-fluoro-3',4',5'-trimetoxichalcona49es moderadamente específica para las células y puede apreciarse predominantemente al evaluar la actividad mitocondrial. Las células de carcinoma de colon HCT8-E11 mostraron la mayor sensibilidad para compuesto49,mientras que las células CT5.3 fueron menos susceptibles a los efectos mediados por esta propenona.
Se pueden sacar algunas conclusiones generales con respecto a los efectos antiproliferativos de los compuestos similares a las chalconas a partir de los datos arriba presentados:
- Al centrarse en el compuesto 49, se observaron reducciones apreciables (-50 %) tanto en el contenido total de proteínas como en la actividad mitocondrial a concentraciones elevadas (10-100 qmol.L-1) en células MCF-7/6, MCF-7/LucF5 y HCT8-E11. En varias otras líneas celulares, se apreciaron alteraciones equiparables en la actividad mitocondrial, pero el contenido total de proteínas casi no se vio afectado. Por lo tanto, compuesto49media en una reducción de la viabilidad celular a concentraciones micromolares, con el mayor efecto sobre las líneas celulares MCF-7 y HCT8.
- Sin embargo, a niveles submicromolares, no se observaron reducciones importantes en la viabilidad celular en las líneas celulares MCF-7/6, MCF-7/LucF5 y BLM. Por lo tanto, la potencia anti-invasiva de compuesto49a concentraciones nanomolares no puede atribuirse a efectos relacionados con el crecimiento.
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Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto para uso en un método para inhibir la invasión de células tumorales en el tejido adyacente en un sujeto; en donde dicho compuesto se selecciona de la lista que comprende:
(2E)-3-(4-fluorofenil)-1-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-2-en-1-ona;
(2E)-1-(4-metoxifenil)-3-(2,4,6-trimetoxifenil)prop-2-en-1-ona;
(2E)-3-(3-fluorofenil)-1 -(4-fluorofenil)prop-2-en-1 -ona;
(2E)-3-(-2-furan-2-il)-1-(3,4,5-trimetoxifenil)prop-2-en-1-ona;
(2E)-1 -(2,6-dimetoxifenil)-3-(furan-2-il)prop-2-en-1 -ona;
(2E)-1 -(4-fluorofenil)-3-(furan-3-il)prop-2-en-1 -ona; o
un estereoisómero, tautómero, racemato, sal, hidrato o solvato del mismo.
2. Una composición farmacéutica para uso en un método para inhibir la invasión de células tumorales en el tejido adyacente en un sujeto; comprendiendo dicha composición un compuesto como se define en la reivindicación 1
3. Una composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha composición comprende, además, un soporte, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más compuestos farmacéuticamente activos.
4. Un compuesto o una composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el sujeto tiene un tumor maligno sólido.
5. Un compuesto o una composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho tumor se selecciona de la lista que comprende tumores mamarios, tumores de próstata, tumores colorrectales, tumores de pulmón, tumores cerebrales, tumores de cabeza y cuello, melanoma, sarcoma o tumores de ovario.
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