ES2954184T3

ES2954184T3 - Compuestos, composiciones y métodos para controlar biopelículas

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Publication number: ES2954184T3
Application number: ES16801689T
Authority: ES
Inventors: Geert Hooyberghs; Stijn Robijns; Hans Steenackers; Der Eycken Erik Van
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2016-10-27
Publication date: 2023-11-20
Anticipated expiration: 2036-10-27
Also published as: PL3368517T3; GB201518988D0; EP3368517C0; WO2017070755A1; US10807960B2; EP3368517B1; US20180305321A1; EP3368517A1

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos de 5-aril-2-aminoimidiazol sustituidos que son activos contra la formación de biopelículas microbianas. La invención también se refiere a composiciones que comprenden una cantidad inhibidora de biopelículas microbianas de dichos compuestos de 5-aril-2-aminoimidiazol sustituidos en combinación con excipientes. También se describen métodos para inhibir o controlar la formación de biopelículas microbianas en una planta, una parte del cuerpo de un humano o un animal, o una superficie con la que un humano o un animal puede entrar en contacto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos, composiciones y métodos para controlar biopelículas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos, composiciones y métodos para controlar las biopelículas y el crecimiento microbiano, en particular, bacteriano, y para reducir la colonización bacteriana. La presente invención también se refiere a una superficie, tal como la superficie de un producto sanitario, recubierta con los compuestos de la presente invención. La presente invención también se refiere al tratamiento y a la prevención de enfermedades infecciosas causadas por la formación de biopelículas microbianas, en particular, a composiciones profilácticas y terapéuticas antimicrobianas que contienen una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de la formación de biopelículas para reducir o eliminar la colonización con microorganismos potencialmente patógenos, más particularmente, bacterias (incluyendo cepas bacterianas resistentes a muchos o a la mayoría de los agentes antimicrobianos comunes), reduciendo así el riesgo de aparición posterior de enfermedades. Por otra parte, la presente invención se refiere a compuestos, y a composiciones y métodos que implican estos compuestos, para inhibir, reducir o prevenir la formación de una biopelícula en una superficie de un producto sanitario, tal como un catéter, o en un tejido, tal como dientes, uretra o pulmones de un ser humano (por ejemplo, un paciente con fibrosis quística). Estos compuestos, composiciones y métodos de la presente invención son, en particular, útiles para prevenir la formación de biopelículas en un tejido para prevenir o controlar una infección bacteriana crónica o sepsis, y también son útiles para la higienización cuando se aplican a un sustrato con el que un ser humano o un animal puede entrar en contacto.

Antecedentes de la invención

Las biopelículas son comunidades complejas de microorganismos (por ejemplo, células bacterianas) asociadas a la superficie, que dependen de las condiciones y están incrustadas en una matriz autoproducida de sustancia polimérica extracelular. Las biopelículas representan un modo prevalente de vida microbiana en entornos naturales, industriales y hospitalarios. Las células microbianas que crecen en una biopelícula son fisiológicamente distintas de las células planctónicas del mismo organismo. Las células de biopelícula presentan cambios profundos en la expresión génica y en la fisiología celular en comparación con las células planctónicas, y múltiples vías genéticas median la regulación de la formación de biopelículas. Los microorganismos en las biopelículas forman colonias o condominios microbianos que facilitan la realización de reacciones químicas que son imposibles para las células microbianas individuales. Las biopelículas pueden contener muchos tipos diferentes de microorganismos, por ejemplo, bacterias, arqueas, protozoos, hongos y algas.

El uso de composiciones antimicrobianas eficaces para evitar la formación de biopelículas se recomienda para cualquier superficie en contacto con el agua, tal como revestimientos para piscinas, superficies de enfriamiento por agua, mangueras, dispensadores de agua, sistemas de almacenamiento y distribución de agua para agua potable o acuicultura, y para superficies de productos sanitarios, tales como catéteres, implantes médicos, apósitos para heridas y similares, especialmente cuando están destinados a pacientes con trastornos metabólicos.

Dentro de las biopelículas, las bacterias son hasta 1000 veces más tolerantes a los antibióticos, desinfectantes y otros factores de estrés, lo que dificulta enormemente el tratamiento antimicrobiano. De ahí que a menudo se produzcan infecciones y contaminaciones persistentes por biopelículas que causan una enorme cantidad de problemas en diversos sectores, entre los que se incluyen la medicina, la industria alimentaria, del hogar y la agricultura. En el sector médico, las biopelículas a menudo se asocian con dispositivos implantables. Los estafilococos son los principales microorganismos que colonizan estos dispositivos. Comprenden hasta dos tercios de todos los patógenos en las infecciones por implantes ortopédicos, donde pueden causar artritis séptica y osteomielitis, con la consiguiente destrucción inflamatoria de huesos y articulaciones. Estas infecciones pueden producirse como resultado de la contaminación directa durante la operación, o como resultado de la propagación microbiológica de infecciones crónicas en otras partes del cuerpo. Por desgracia, la falta de un tratamiento adecuado deja a menudo la extracción del dispositivo contaminado como la única opción viable para eliminar la biopelícula. Posteriormente se requiere un tratamiento antimicrobiano prolongado para garantizar la erradicación de la infección.

Dada la magnitud de los problemas causados por estas biopelículas, se ha realizado un gran esfuerzo para desarrollar nuevas estrategias antibiopelículas [1-3]. Uno de los enfoques más prometedores son los compuestos capaces de prevenir o erradicar las biopelículas, sin afectar al crecimiento planctónico de los microorganismos [4, 5]. Se cree que estos compuestos antibiopelícula específicos son menos propensos al desarrollo de resistencias. Anteriormente, se ha informado del desarrollo de varias series de compuestos antibiopelícula específicos, en función del andamio 2-aminoimidazol (2AI). Estas series incluyen los 5-aril-2Als monosustituidos (5-Ar-2Al) (6), los 5-Ar-2Als N1-sustituidos (6), los 5-Ar-2Als 2N-sustituidos [7], los 2Al 4,5-di-sustituidos (6), los 2Als 1,4,5-trisustituidos (8), y los conjugados de 2Al-triazol (9). Se demostró que estos compuestos mostraban una actividad preventiva frente a las biopelículas de Salmonella Typhimurium, una de las causas más importantes de infecciones causadas por alimentos en todo el mundo y un formador de biopelículas destacado tanto dentro como fuera del huésped, y de P. aeruginosa, un patógeno oportunista Gram-negativo que puede infectar a personas inmunodeprimidas tales como pacientes con fibrosis quística y causar infecciones pulmonares crónicas potencialmente mortales (10). Por otra parte, las biopelículas de P. aeruginosa pueden aparecer en diversos productos sanitarios, tales como catéteres intravasculares y urinarios.

Durante la última década, se han publicado varias metodologías sintéticas que conducen a 2-Als diversamente sustituidos [8, 9,11-13]. Nuestro grupo de investigación ha desarrollado un enfoque diversamente orientado hacia 2-Als a partir de 2-aminopirimidinas y a-bromocetonas [12,15]. Cambiando las condiciones de reacción se puede conseguir una síntesis selectiva de o bien 2-Als N1-sustituidos o bien 2-Al 2N-sustituidos.

En la búsqueda de nuevos compuestos antibiopelícula, la mayor parte de la atención se ha centrado en las biopelículas monoespecíficas, que consisten en una sola especie. Sin embargo, ha quedado claro que, en la naturaleza, las biopelículas suelen consistir en más de una especie microbiana. Por poner un ejemplo, se calcula que el 27 % de las infecciones nosocomiales por C. albicans en el torrente sanguíneo son polimicrobianas, siendo S. aureus el tercer organismo más común aislado junto con C. albicans. Las biopelículas de especies mixtas son a menudo más resistentes que las biopelículas de una sola especie, lo cual tiene repercusiones adicionales para su control y manipulación en una variedad de aplicaciones. Por lo tanto, hoy en día se incluyen biopelículas multiespecie en muchas más actividades de investigación preclínica.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 Estructuras de compuestos basados en 5-Ar-2AIs.

Fig. 2 Síntesis y estructuras de ocho nuevos 5-Ar-2Als N1-,2N-disustituidos.

Fig. 3 Efecto de los compuestos seleccionados (12,5 j M) sobre la proliferación y viabilidad de los osteoblastos (OB, Fig. 3B) y células madre mesenquimales (MSC, por sus siglas en inglés, Fig. 3A) después de 2 h, 48 h y 6 días de exposición, según lo determinado por tinción con azul de tripano. Las barras y las barras de error representan respectivamente las medias y los errores estándar de 8 repeticiones. El control negativo fue el medio de cultivo celular con un fondo de disolvente de etanol al 0,5 %, el control positivo fue fenol al 0,05 % para mostrar un efecto citotóxico. % de proliferación se define como: (células viables totales en la muestra tratada/células viables totales en el control de disolvente) * 100. % de viabilidad se define como: (células viables totales (sin teñir)/células totales (teñidas sin teñir)) * 100. Se indican diferencias significativas (p < 0,05 = *; p < 0,01 = ** y p < 0,001 = ***) con el control negativo.

Fig.4 Efecto de los compuestos seleccionados (12,5 j M) sobre la actividad metabólica de los osteoblastos (OB) y células madre mesenquimales (MSC) después de 6 días de exposición, según lo determinado por tinción MTT. Las barras y las barras de error representan respectivamente las medias y los errores estándar de 4 repeticiones. El control negativo fue el medio de cultivo celular con un fondo de disolvente de etanol al 0,5 %, el control positivo fue fenol al 0,05 % para mostrar un efecto citotóxico. Se indican diferencias significativas (p < 0,05 = *; p < 0,01 = ** y p < 0,001 = ***) con el control negativo.

Fig.5 Efecto de los compuestos seleccionados (12,5 ^jM) sobre el potencial de diferenciación osteogénica de osteoblastos (OB) y células madre mesenquimales (MSC) después de respectivamente 3 y 5 semanas de exposición, según lo determinado al medir la cantidad de contenido de calcio que se normalizó por los valores de ADN. Las barras y las barras de error representan respectivamente las medias y los errores estándar de al menos cuatro repeticiones. El control negativo no contiene suplementos osteogénicos. El control de disolvente (positivo) contiene suplementos osteogénicos y un fondo de etanol al 0,5 %. Se indican diferencias significativas (p < 0,05 = *; p < 0,01 = ** y p < 0,001 = ***) con el control del disolvente.

Fig. 6 Representación esquemática de la unión covalente de 2-aminoimidazoles funcionalizados en sustratos de titanio. A. Síntesis de un análogo LC0024 (8g) que contiene una amina primaria (LC0024-NH₂o 9.7). B. Acoplamiento de LC0024-NH₂a una superficie de titanio funcionalizada.

Fig. 7 Caracterización in vitro de la formación de biopelículas de S. aureus en los discos LC0024-Ti (LC0024 es el compuesto 8g de la Fig. 2). El porcentaje de células de biopelícula de S. aureus SH1000 presentes en la superficie de los discos de titanio recubiertos (discos LC0024-Ti) en comparación con los discos de control (discos control-Ti) a los que no se acopló ningún compuesto. Los datos representan la media ± errores estándar de las medias (SEM, por sus siglas en inglés) de tres experimentos independientes (P < 0,05 = *).

Fig. 8 Análisis de CLSM de biopelículas de S. aureus en discos LC0024-Ti. La fracción de área total de S. aureus SH1000 que cubre los discos de Ti, dividida en fracción de células muertas y viables, respectivamente. Se muestran las medias y los errores estándar de al menos 3 repeticiones; la fracción de área calculada para cada repetición es el valor medio de 25 imágenes analizadas por Mathlab (** P < 0,01).

Fig. 9 El espesor de las biopelículas de S. aureus SH1000 (jm ) en discos LC0024-Ti frente a discos de control-Ti (se muestran las medias y las desviaciones típicas de 2 repeticiones).

Fig. 10 Recuperación de S. aureus SH1000 de los discos de control-Ti y LC0024-Ti. Las UFC se representan como valores log10 por disco individual (se muestran las medias y la SEM de 2 experimentos independientes; * P < 0,05).

Fig. 11 Morfología de células estromales derivadas de médula ósea humana después de la prueba de citotoxicidad por contacto directo.

Fig. 12 Tinción de faloidina/DAPI de (A) células estromales derivadas de médula ósea humana y (B) células endoteliales microvasculares humanas sembradas en discos de control-Ti y LC0024-TÍ y cultivadas durante 5 y 12 días.

Definiciones

La referencia a lo largo de la presente memoria descriptiva a “ una realización” o “ una realización” significa que un rasgo, estructura o característica particular descrito en relación con la realización se incluye en al menos una realización de la presente invención. Por tanto, las apariciones, de las expresiones “ en una realización” o “ en una realización” en varios lugares a lo largo de la presente memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización, pero pueden. Por otra parte, los rasgos, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada, como resultaría evidente para un experto en la materia a partir de la presente invención, en una o más realizaciones. Cuando se usa un artículo indefinido o definido para referirse a un sustantivo singular, por ejemplo, “ un” o “ uno/una” , “ el/la” , se incluye el plural de ese sustantivo, a menos que se indique específicamente otra cosa.

De manera similar, debe apreciarse que en la descripción de las realizaciones ilustrativas de la invención, varios rasgos de la invención se agrupan a veces en una única realización, figura o descripción de la misma con el fin de simplificar la presente invención y ayudar en la comprensión de uno o más de los diversos aspectos inventivos.

Como se usa en el presente documento, los términos “ reducir” , “ suprimir” , “ inhibir” , “ disminuir” , “ eliminar” o similares en referencia a los microorganismos o a una biopelícula o a la formación de biopelículas significan la inhibición completa o parcial (más del 50 %, preferentemente más del 90 %, aún más preferentemente más del 95 % o incluso más del 99 %) de los microorganismos o de la formación de biopelículas (en términos del número de células restantes o biomasa total restante) y/o del desarrollo y también incluye dentro de su alcance la inversión de los microorganismos o del desarrollo de biopelículas o de los procesos asociados con los microorganismos o con la formación y/o desarrollo de biopelículas. Además, la inhibición puede ser permanente o temporal. En términos de inhibición temporal, los microorganismos o la formación y/o desarrollo de biopelículas pueden inhibirse durante un tiempo suficiente para producir el efecto deseado (por poner un ejemplo, al menos 5 días, preferentemente al menos 10 días). Preferentemente, la inhibición de los microorganismos o de una biopelícula es completa y/o permanente (sin persistidores) (“ erradicación” ).

Como se usa en el presente documento, “ prevenir” o similares en referencia a microorganismos o a una biopelícula o formación de biopelículas significa la prevención completa o parcial (más del 50 %, preferentemente más del 90 %, aún más preferentemente más del 95 % o incluso más del 99 %) de los microorganismos o de la formación de biopelículas (en términos del número de células restantes o biomasa total restante) y también incluye dentro de su alcance procesos asociados con microorganismos o formación de biopelículas. Además, la prevención puede ser permanente o temporal. En términos de prevención temporal, los microorganismos o la formación de biopelículas pueden inhibirse durante un tiempo suficiente para producir el efecto deseado (por poner un ejemplo, al menos 5 días, preferentemente al menos 10 días). Preferentemente, la prevención de los microorganismos o de una biopelícula es completa y/o permanente.

Como se usa en el presente documento, el término “ exponer” significa administrar a, o de cualquier otro modo poner en contacto con. Un microorganismo o biopelícula puede exponerse a un agente activo directa o indirectamente. Típicamente la exposición directa se refiere a la administración del agente al microorganismo o biopelícula a tratar o a poner de otro modo el microorganismo o biopelícula en contacto con el propio agente. Típicamente la exposición indirecta se refiere a la administración de un precursor del agente activo o de un compuesto o molécula capaz de generar, ya sea por sí solo o en reacción con otros compuestos o moléculas, el agente activo al microorganismo o biopelícula o de poner en contacto de otro modo al microorganismo o biopelícula con el mismo. De manera similar, los términos “tratar” y “tratamiento” y variaciones de los mismos como se usan en el presente documento significan administrar a, o de otro modo poner en contacto con.

La expresión “ opcionalmente sustituido” indica que el grupo especificado está no sustituido o está sustituido por uno o más sustituyentes adecuados. Un “ sustituyente” , como se define en el presente documento, es un átomo o grupo de átomos monovalente que sustituye un átomo de hidrógeno en una cadena o ciclo (anillo) de hidrocarburo de una molécula orgánica, por ejemplo halógeno, hidroxi, acilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalifático, heterociclo, arilo (en particular fenilo), heteroarilo, alcoxi (tal como metoxi), amino, amido, sulfhidrilo, alquiltio, alquilsulfonilo (tal como metilsulfonilo), nitro, carbonilo, carboxi, aminoácido (tanto natural como sintético) y peptido, o un átomo divalente que sustituye dos átomos de hidrógeno en el mismo átomo de carbono de una cadena hidrocarbonada, por poner un ejemplo, oxo o tioxo. El número de sustituyentes admisibles depende del número de átomos de hidrógeno que pueden sustituirse, por tanto, de la longitud de la cadena, del tipo de sustituyente y de los parámetros, tales como impedimento estérico, que son bien conocidos por el experto en la materia.

El término “ alifático” , como se usa en el presente documento, se refiere a “Alquilo” , “Alquenilo” o “Alquinilo” . El término “ alquilo” o “ alifático saturado” , como se usa en la presente documento, y a menos que se especifique lo contrario, se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene de 1 a 20 (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, etc.) átomos de carbono, de ahí, la anotación alquilo C1-20, preferentemente que contiene de 4 a 12 (p. ej., 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12) átomos de carbono, de ahí, la anotación alquilo C4-12, o que contiene de 2 a 3 átomos de carbono, de ahí, la anotación alquilo C2-3 o de 4 a 10 (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) átomos de carbono, de ahí, la anotación alquilo C4-10. Ejemplos representativos de alquilo C1-20, alquilo C4-12, alquilo C2-3, o alquilo C4-10, incluyen, aunque sin limitación, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, terc-butilo, n pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, 3-metilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, n-heptilo, n-octilo, nnonilo, n-decilo y similares. Dichos grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más (p. ej., 2, 3 o 4) sustituyentes como se definió anteriormente en el presente documento.

“Alquenilo” , como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene de 2 a 20 átomos de carbono, de ahí, la anotación alquenilo C2-20, y que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Ejemplos representativos de “ alquenilo” incluyen, aunque sin limitación, etenilo, 2-propenilo, 2-metil-2-propenilo, 3-butenilo, 4-pentenilo, 5-hexenilo, 2-heptenilo, 2-metil-l-heptenilo, 3-decenilo, butadienilo, hexadienilo y similares. Dichos grupos alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más (p. ej., 2, 3 o 4) sustituyentes como se definió anteriormente en el presente documento.

“Alquinilo” , como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena hidocarbonada lineal o ramificada que contiene de 2 a 20 átomos de carbono, de ahí, la anotación alquinilo C2-20, y que contiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Ejemplos representativos de alquinilo C2-20 incluyen, aunque sin limitación, acetilenilo, 1 -propinilo, 2-propinilo, 3-butinilo, 2-pentinilo, 1 -butinilo y similares. Dichos grupos alquinilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más (p. ej., 2, 3 o 4) sustituyentes como se definió anteriormente en el presente documento.

El término “ cicloalifático” , como se usa en el presente documento y a menos que se especifique lo contrario, se refiere a un grupo hidrocarburo monocíclico o policíclico saturado o etilénicamente insaturado que contiene de 3 a 10 (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) o de 3 a 12 (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12) átomos de carbono, que no es aromático, de ahí, las notaciones cicloalquilo C3-10 o cicloalquilo C3-12 (saturado) y cicloalquenilo C3-12 (insaturado). Ejemplos representativos de cicloalquilo incluyen, aunque sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, triciclodecilo, ciclododecilo, adamantilo, nornornilo, 5,6-trimetilenorborn-2-ilo y ciclooctilo. Dichos grupos cicloalifáticos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más (p. ej., 2, 3 o 4) sustituyentes como se definió anteriormente en el presente documento. Ejemplos representativos de cicloalquenilo incluyen, aunque sin limitación, ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclooctenilo, ciclononenilo, ciclodecenilo, 1,3-ciclohexadienilo, 1,4-ciclohexadienilo, 1,3-cicloheptadienilo, 1,5-ciclooctadienilo.

El término “ heterocíclico” , como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de anillo monocíclico o policíclico (p. ej., bicíclico) saturado o etilénicamente insaturado, pero no aromático, que comprende al menos un heteroátomo seleccionado preferentemente del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre en al menos un anillo.

Los sistemas de anillo heterocíclico monocíclico se ejemplifican por cualquier anillo de 3 a 8 miembros (p. ej., 4, 5 o 6 o 7) que contiene 1, 2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados independientemente del grupo que consiste en O, N y S. Un anillo de 5 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces, y un anillo de 6 miembros tiene de 0-3 dobles enlaces. Dependiendo del número de dobles enlaces, el sistema de anillo heterocíclico puede ser heteroaromático (véase la definición específica a continuación) o no. Ejemplos representativos de sistemas de anillo heterocíclico monocíclico no aromático incluyen, aunque sin limitación, azetidina, azepina, aziridina, diazepina, 1,3-dioxolano, 1,2-dioxano, 1,3-dioxano, 1,4-dioxano, 1,2-ditiano, 1,3-ditiano, 1,4-ditiano, imidazolina, imidazolidina, isotiazolina, isotiazolidina, isoxazolina, isoxazolidina, morfolina, oxadiazolina, oxadiazolidina, oxazolina, oxazolidina, piperazina, piperidina, pirazina, pirazolina, pirazolidina, pirrolina, pirrolidina, tetrahidrofurano, tetrahidrotiofeno, tiadiazolina, tiadiazolidina, tiazolina, tiazolidina, tiomorfolina, tiomorfolina sulfona, tiomorfolina sulfóxido y similares. Los sistemas de anillo bicíclico se ejemplifican por cualquiera de los sistemas de anillo monocíclico anteriores condensados con un grupo arilo o cicloalquilo o heterocíclico como se define en el presente documento. Ejemplos representativos de sistemas de anillo bicíclico incluyen, aunque sin limitación, por ejemplo, bencimidazol, benzotiazol, benzotiadiazol, benzotiofeno, benzoxadiazol, benzoxazol, benzofurano, benzopirano, benzotiopirano, benzodioxina, 1,3-benzodioxol, cinolina, indazol, indol, indolina, indolizina, naftiridina, isobenzofurano, isobenzotiofeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, ftalazina, piranopiridina, quinoleína, quinolizina, quinoxalina, quinazolina, tetrahidroisoquinolina, tetrahidroquinolina, tiopiranopiridina y similares.

“Aromático” , como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de anillo que tiene uno o más anillos aromáticos, que pueden ser homoaromáticos o heteroaromáticos.

“ Homoaromático” o “ arilo” , como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de anillo aromático en el que no se han sustituido átomos de carbono con heteroátomos. El grupo homoaromático puede estar no sustituido o sustituido con de 1 a 5 sustituyentes adecuados como se definió anteriormente en el presente documento, y en donde dos sustituyentes adyacentes pueden estar unidos para formar un ciclo tal como metilendioxi. Ejemplos representativos de arilo incluyen, aunque sin limitación, azulenilo, indanilo, indenilo, naftilo, fenilo, tetrahidronaftilo y versiones mono- y polisustituidas de los mismos.

“ Heterociaromático” o “ heteroarilo” , como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de anillo aromático en el que uno o más átomos de carbono se han sustituido con heteroátomos seleccionados independientemente del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre en al menos un anillo. Ejemplos de heteroarilo incluyen, aunque sin limitación, piridilo, pirimidinilo, imidazolilo, tienilo, furilo, pirazinilo, pirrolilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, indolilo, isoindolilo, indolizinilo, triazolilo, piridazinilo, indazolilo, purinilo, quinolizinilo, isoquinolilo, quinolilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, oxazolilo, dioxazolilo, pirazolilo, tetrazinilo, tetrazolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, triazinilo y benzo[b]tienilo. El grupo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más, p. ej., 1 a 4, sustituyentes adecuados como se definió anteriormente en el presente documento.

El término “ alcoxi” , como se usa en el presente documento, se refiere a sustituyentes en donde un átomo de carbono de un grupo alquilo (tal como se define en el presente documento), se une a un átomo de oxígeno a través de un enlace sencillo tal como, aunque sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, iso-butoxi, secbutoxi, terc-butoxi, pentoxi, 3-pentoxi, o n-hexiloxi.

El término “ alquiltio” , como se usa en el presente documento, se refiere a sustituyentes en donde un átomo de carbono de un grupo alquilo (tal como se define en el presente documento), se une a un átomo de azufre a través de un enlace sencillo tal como, aunque sin limitación, metiltio, etiltio, etc.

Como se usa en el presente documento y a menos que se indique lo contrario, el término halógeno significa cualquier átomo seleccionado del grupo que consiste en flúor, cloro, bromo y yodo.

El término “ microorganismo” , como se usa en el presente documento, se refiere a organismos microscópicos unicelulares o de conglomerados celulares que incluyen los eucariotas, tales como, hongos y protistas, y los procariotas, especialmente microorganismos que son susceptibles de provocar una enfermedad en seres humanos, pero excluyendo un virus o un prión. Estos microorganismos pueden organizarse en forma de una biopelícula, por ende, la expresión “ biopelícula microbiana” .

Como se usa en el presente documento, el término “ biopelícula” se refiere a un modo de crecimiento microbiano que comprende células sésiles, generalmente dentro de una matriz compleja y altamente heterogénea de polímeros extracelulares, y que se caracteriza por una sensibilidad reducida a los agentes antimicrobianos. En el contexto de la presente invención, las “ biopelículas” pueden contener especies individuales tales como bacterias que incluyen, aunque sin limitación, S. tyimurium, S. epidermis, P. aeruginosa, E. coli, S. aureus, S. liquefaciens, B. cepacia, P. gingivalis, o un hongo/levadura que incluye, aunque sin limitación, C. albicans. En el contexto de la presente invención, las “ biopelículas” también pueden contener microorganismos de múltiples especies tales como levaduras que incluyen, aunque sin limitación, C. albicans, y/u otros microorganismos tales como bacterias que incluyen, aunque sin limitación, E. coli, S. epidermis, S. aureus, P. aeruginosa.

El término “ antimicrobiano” , como se usa en el presente documento, significa que la composición de la presente invención reduce, erradica, inhibe o previene el crecimiento o la proliferación de un microbio o microorganismo. Por consiguiente, el término “ antimicrobiano” puede referirse a la actividad antibacteriana, antibiopelícula, antivírica, antiprotozoaria y/o antifúngica.

El término “ septicemia” , como se usa en el presente documento, se refiere a un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica asociado a una infección. El choque séptico se caracteriza, a saber, por (a) hipotensión que persiste a pesar de una reanimación adecuada con líquidos, y (b) anomalías relacionadas con la hipoperfusión o la disfunción orgánica.

Descripción detallada de la invención

En comparación con nuestros estudios previos sobre 2-aminoimidazoles sustituidos (WO2011080132), la presente invención proporciona una selección de nuevos compuestos en donde dichos compuestos muestran una actividad sorprendentemente mejor contra bacterias Gram-positivas.

En un primer objeto, la presente invención presenta un compuesto de 5-aril-2-aminoimidazol sustituido representado por la fórmula estructural (I) en donde R1 se selecciona del grupo que comprende alquilo C4-12 y cicloalquilo C3-12 sustituidos o no sustituidos; R2 se selecciona del grupo que comprende alquilo C2-3, alquilo C4-12 y cicloalquilo C3-12 sustituidos o no sustituidos; y R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que comprende hidrógeno, halógeno, nitro, alcoxi C1-12, alquilo 1-12, hidroxilo y metilsulfonilo.

En una realización preferida de la presente invención, dicho compuesto de 5-aril-2-aminoimidazol sustituido está representado por la fórmula estructural (I) en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C4-12 y cicloalquilo C3-12 sustituidos o no sustituidos; R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2-3, alquilo C4-10 y cicloalquilo C3-10 sustituidos o no sustituidos; y R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en halógeno, nitro, metoxi, metilo, hidroxilo y metilsulfonilo.

Típicamente, los compuestos de la presente invención también incluyen sales, hidratos, solvatos, estereoisómeros o formas polimórficas farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En una realización preferida de la presente invención, dicho compuesto se selecciona del grupo que comprende N-isobutil-1-octil-5-fenil-1H-imidazol-2-amina, 5-(4-clorofenil)-N-isobutil-1-octil-1H-imidazol-2-amina, 5-(4-bromofenil)-N-isobutil-1-octil-1H-imidazol-2-amina, 5-(3,4-diclorofenil)-N-isobutil-1-octil-1H-imidazol-2-amina, N-ciclopentil-1 -octil-5fenil-1H-imidazol-2-amina, 5-(4-dorofenil)-N-cidopentil-1-octil-1H-imidazol-2-amina, 5-(4-bromofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1H-imidazol-2-amina, y 5-(3,4-didorofenil)-N-cidopentil-1-octil-1H-imidazol-2-amina.

Típicamente, los compuestos de la presente invención como se describe en el presente documento se usan en el tratamiento o la prevención de una afección o infección asociada a biopelículas microbianas en un sujeto humano o animal. Preferentemente, dicha afección o infección asociada a biopelículas microbianas es una afección o infección asociada a biopelículas bacterianas, fúngicas o de levadura. Dicha biopelícula microbiana también puede comprender una combinación de microorganismos bacterianos y/o fúngicos y/o de levadura.

En un segundo objeto, la presente invención presenta una superficie recubierta con cualquiera de los compuestos según el primer objeto de la presente invención.

También se divulga en el presente documento que dicho compuesto puede recubrirse sobre una superficie a través de un enlace amida entre una amina libre en R1 o R2 y un grupo carboxilo de una molécula enlazadora unida covalentemente a dicha superficie.

Preferentemente, dicha superficie es la superficie de un implante veterinario o médico. Más preferentemente, dicho implante es un implante de titanio.

Curiosamente, se demostró que los implantes recubiertos con los compuestos según la presente invención tenían características favorables de osteointegración. Por lo tanto, los compuestos según la presente invención son particularmente adecuados para el recubrimiento de superficies de implantes destinados a integrarse en el tejido óseo.

Preferentemente, dichas superficies están recubiertas con dichos compuestos a una concentración de 0,01 nmol/cm²a 10 nmol/cm², más preferentemente a una concentración de 0,1 nmol/cm²a 1 nmol/cm², incluso más preferentemente a una concentración de 0,1 nmol/cm²a 0,5 nmol/cm².

En un tercer objeto, la presente invención presenta una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección patológica asociada con una infección microbiana o para disminuir o erradicar el crecimiento bacteriano en un animal o ser humano, en donde dicha composición comprende uno o más excipientes y una cantidad inhibidora de la biopelícula microbiana de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 5-aril-2-aminoimidazoles sustituidos representados por la fórmula estructural (I), en donde R1 se selecciona del grupo que comprende alquilo C4-12 y cicloalquilo C3-12 sustituidos o no sustituidos; R2 se selecciona del grupo que comprende alquilo C2-3, alquilo C4-12 y cicloalquilo C3-12 sustituidos o no sustituidos; y R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que comprende halógeno, nitro, alcoxi C1-12, alquilo C1-12, hidroxilo y metilsulfonilo.

También se divulga en el presente documento que dicha composición comprende uno o más excipientes y una cantidad inhibidora de biopelículas de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 5-aril-2-aminoimidazoles sustituidos representados por la fórmula estructural (I), en donde, R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C4-12 y cicloalquilo C3-12 sustituidos o no sustituidos; R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2-3, alquilo C4-10 y cicloalquilo C3-10 sustituidos o no sustituidos; y R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en halógeno, nitro, metoxi, metilo, hidroxilo y metilsulfonilo.

Típicamente, las composiciones de la presente invención también incluyen sus sales, hidratos, solvatos, estereoisómeros o formas polimórficas farmacéuticamente aceptables.

En una realización preferida, dicha composición comprende un compuesto seleccionado del grupo que comprende N-isobutil-1-octil-5-fenil-1H-imidazol-2-amina, 5-(4-clorofenil)-N-isobutil-1-octil-1H-imidazol-2-amina, 5-(4-bromofenil)-N-isobutil-1-octil-1H-imidazol-2-amina, 5-(3,4-diclorofenil)-N-isobutil-1-octil-1H-imidazol-2-amina, N-ciclopentil-1 -octil-5-fenil-1H-imidazol-2-amina, 5-(4-clorofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1H-imidazol-2-amina, 5-(4-bromofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1H-imidazol-2-amina, y 5-(3,4-diclorofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1H-imidazol-2-amina.

Típicamente, dichas composiciones de la presente invención como se describe en el presente documento se usan en el tratamiento o la prevención de una afección o infección asociada a biopelículas microbianas en un sujeto humano o animal. Preferentemente, dicha afección o infección asociada a biopelículas microbianas es una afección o infección asociada a biopelículas bacterianas, fúngicas o de levadura. Dicha biopelícula microbiana también puede comprender una combinación de microorganismos bacterianos y/o fúngicos y/o de levadura.

Típicamente, dichas composiciones de la presente invención como se describe en el presente documento pueden, ya sea para una eficacia mejorada o para controlar varios tipos de microbios en el mismo locus o en un locus vecinal de un ser humano, un animal o una planta, además comprender una cantidad eficaz de otra entidad o agente antimicrobiano (p. ej., antibacteriano, antiprotozoario o antifúngico). Dicha combinación de agentes activos puede estar en la forma de un kit en donde cada agente se mantiene separado hasta su uso eficaz. La otra entidad antimicrobiana puede ser un biocida, un agente antibiótico u otra entidad terapéutica específica. Agentes antibióticos adecuados incluyen, sin limitación, penicilina, quinolina, vancomicina, sulfonamidas, ampicilina, ciprofloxacina y sulfisoxazol. La entidad terapéutica específica puede incluir un resto de direccionamiento acoplado a un resto de péptido antimicrobiano.

Típicamente, dichas composiciones de la presente invención como se describe en el presente documento pueden, dependiendo del modo de administración o aplicación deseado, formularse en formas muy diferentes tales como, aunque sin limitación, líquidos, geles, espumas, semisólidos y sólidos. En la práctica, estas composiciones pueden estar en forma de un comprimido oral, una cápsula, un aerosol nasal, un líquido, tal como enjuagues faríngeos, enjuagues bucales o gárgaras, pastas dentífricas o pomadas tópicas. Pueden estar en forma de tampones, enjuagues, cremas o aerosoles, jabones, champús capilares, antitranspirantes, tejidos faciales, limpiadores de piel, componente de un apósito para heridas o cualquier dispositivo adecuado para higienización o tratamiento higiénico.

Cuando las composiciones antimicrobianas de esta invención se formulan como líquidos, al menos un excipiente puede ser un disolvente para el 5-aril-2-aminoimidazol sustituido biológicamente eficaz. Dicho disolvente puede ser dimetilformamida, tetrahidrofurano, acetonitrilo, diclorometano, N-metilpirrolidona, acetona, cloroformo, dimetilsulfóxido y mezclas de los mismos, pero no se limita a estos. Las proporciones respectivas del compuesto activo y el disolvente en la formulación líquida están determinadas principalmente por el límite de solubilidad del compuesto activo en el disolvente relevante, que puede determinar fácilmente el experto en la materia. Una composición antimicrobiana líquida de esta invención también puede estar en forma de un kit donde el compuesto activo y el disolvente se mantienen por separado hasta su uso eficaz.

Para un tratamiento eficaz, dado que el 5-aril-2-aminoimidazol sustituido puede volverse tóxico por encima de una cierta concentración, es necesario, por motivos de seguridad, prever administración o aplicación en forma de una composición que comprenda uno o más excipientes. Se prefieren particularmente las composiciones que comprenden un excipiente que es agrícolamente aceptable para su aplicación a una planta, o un excipiente que es farmacéutica o veterinariamente aceptable para su administración a un ser humano o un animal, o para su contacto con el mismo.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir uno o más excipientes o principios no activos, p. ej., ingredientes que no interfieren con la función inhibidora de biopelículas del compuesto activo. El principio no activo puede ser un polvo, un sólido encapsulado o un vehículo acuoso. En una realización, las composiciones de la presente invención en forma oral pueden incluir, sin limitación, materiales espesantes, humectantes, agua, agentes tamponantes, tensioactivos, dióxido de titanio, sistemas aromatizantes, agentes edulcorantes, agentes colorantes y mezclas de los mismos. Los excipientes, ingredientes y vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos, y un experto en la técnica farmacéutica puede seleccionarlos fácilmente para cualquier vía de administración particular (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985).

Preferentemente, las composiciones antimicrobianas de esta invención se formulan para un almacenamiento a largo plazo, tal como soluciones concentradas o preparaciones en polvo liofilizadas. También pueden incluirse en vesículas, p. ej., liposomas, o formularse como sistemas de liberación controlada, usando tecnologías de liberación controlada conocidas en la técnica.

Cuando las composiciones antimicrobianas de esta invención se formulan como geles o espumas, éstas pueden estar contenidas dentro de un dispositivo dispensador para gel o espuma.

En un cuarto objeto, la presente invención presenta un método para tratar una infección microbiana en una planta o para inhibir la formación de biopelículas microbianas en una planta, o en una superficie con la que un ser humano o un animal puede entrar en contacto, aplicando a dicha planta o superficie, un compuesto o composición antimicrobiano según uno cualquiera de los objetos anteriores de la presente invención.

Cuando se destina a un ser humano o a un animal tal como, aunque sin limitación, un mamífero, un animal doméstico o ganado, el método de tratamiento de esta invención puede realizarse mediante la administración de la composición antimicrobiana por vía intravesicular, tópica, oral, rectal, ocular, ótica, nasal, parenteral, vaginal, intravenosa, tópica a una parte del cuerpo infectada de dicho ser humano o animal. Dicha parte del cuerpo puede ser una superficie epitelial o una superficie mucosa. Dicha superficie mucosa puede ser una cavidad bucal, vagina, tracto gastrointestinal o tracto esofágico. Cuando se destina a la desinfección de una superficie que puede entrar en contacto con un ser humano o un animal tal como, aunque sin limitación, un producto sanitario o un dispositivo implantable (p. ej., una prótesis, una válvula cardíaca, un marcapasos, un dispositivo dental, un stent o un catéter o un material protésico de la vejiga), el método de tratamiento de esta invención puede consistir en sumergir dicho producto sanitario en la composición antimicrobiana. La superficie para desinfectar puede ser, p. ej., una superficie biológica o una superficie industrial o doméstica sólida inerte tal como un intercambiador de calor, un dispositivo de filtrado de aire, un componente de un sistema de acuicultura, utensilios de cocina o una tubería, o una superficie en un hospital, tal como en una unidad de cirugía donde la higienización es esencial. El material del que está hecha dicha superficie no es un parámetro crítico del método de la invención, en cuanto es susceptible de formación de biopelículas. La superficie puede incluir un plástico, tal como una silicona u otro tipo de material polimérico.

En un quinto objeto, la presente invención presenta el uso de una composición para desinfectar o esterilizar una superficie ex vivo para disminuir o erradicar una biopelícula o prevenir el crecimiento de una biopelícula, en donde dicha composición comprende una cantidad inhibidora de biopelículas de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 5-aril-2-aminoimidazoles sustituidos representados por la fórmula estructural (I) en donde, R1 se selecciona del grupo que comprende alquilo C4-12 y cicloalquilo C3-12 sustituidos o no sustituidos; R2 se selecciona del grupo que comprende alquilo C2-3, alquilo C4-12 y cicloalquilo C3-12 sustituidos o no sustituidos; y R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que comprende halógeno, nitro, alcoxi C1-12, alquilo C1-12, hidroxilo y metilsulfonilo.

También se divulga en el presente documento que dicha composición puede comprender una cantidad inhibidora de biopelículas del compuesto seleccionado del grupo que consiste en 5-aril-2-aminoimidazoles sustituidos representados por la fórmula estructural (I), en donde, R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C4-12 y cicloalquilo C3-12 sustituidos o no sustituidos; R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2-3, alquilo C4-10 y cicloalquilo C3-10 sustituidos o no sustituidos; y R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en halógeno, nitro, metoxi, metilo, hidroxilo y metilsulfonilo.

En otra realización preferida, dicha composición comprende uno o más excipientes. En otra realización preferida, dicho excipiente es un disolvente para dicho compuesto. En una realización aún más preferida, dicho disolvente se selecciona del grupo que comprende dimetilformamida, tetrahidrofurano, acetonitrilo, diclorometano, N-metilpirrolidona, acetona, cloroformo y dimetilsulfóxido.

Típicamente, las composiciones de la presente invención como se describe en el presente documento pueden coadministrarse o coaplicarse con uno o más de otros agentes antibacterianos.

Las composiciones y métodos de esta invención son especialmente útiles para tratar o prevenir una afección patológica asociada con una infección microbiana o para disminuir el crecimiento bacteriano en un animal o un ser humano que necesite dicho tratamiento.

Las composiciones y métodos de esta invención son especialmente útiles para tratar a un ser humano con una herida seleccionada del grupo que consiste en una úlcera, una laceración, una herida penetrante profunda y una herida quirúrgica.

Las composiciones y métodos de esta invención también son útiles para reducir el riesgo de infección bacteriana o septicemia en una persona colonizada con bacterias patógenas. Esto resulta especialmente relevante para pacientes inmunodeprimidos afectados con leucemia, linfoma, carcinoma, sarcoma, trasplante alogénico, inmunodeficiencia congénita o adquirida, fibrosis quística y SIDA.

Las composiciones y métodos de esta invención son especialmente útiles para reducir o erradicar el riesgo de infección bacteriana en un ser humano, en donde las bacterias patógenas son bacterias gram positivas seleccionadas del grupo que consiste en especies neumocócicas, Staphylococcus aureus resistente a meticilina, S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus, S. capitis, S. women, Streptococcus spp. resistente a múltiples fármacos, Enterococcus spp., Propionibacterium acnes.

Las composiciones y métodos de esta invención también son útiles para reducir o erradicar el riesgo de infección bacteriana en una persona, en donde las bacterias patógenas son bacterias gram negativas seleccionadas del grupo que consiste en Salmonella, p. ej., S. Typhimurium, S. enteritidis, S. arizonae, S. bongori, S. choleraesuis, S. choleraesuis, S. enterica, S. paratyphi, S. pullorum, S. subterranea, y S. typhi o Pseudomonas, p. ej.; una bacteria del grupo de Pseudomonas aeruginosa, tal como P. aeruginosa, P. alcaligenes, P. anguilliseptica, P. argentinensis, P. borbori, P. citronellolis, P. fíavescens, P. mendocina, P. nitroreducens, P. oleovorans, P. pseudoalcaligenes, P. resinovorans o P. straminea, o Neisseria sp., Hemophilus sp., Proteus sp., Klebsiella sp., Escherichia coli u otras bacterias tales como Serratia liquefaciens, Burkholdeia cepacia, Porphyromonoas gingivalis o levaduras tales como C. albicans.

Las composiciones y métodos de esta invención también son útiles para reducir o erradicar una biopelícula que consiste en una combinación de una cualquiera de las especies bacterianas y/o de levadura como se ha descrito anteriormente.

Sin embargo también se divulga en el presente documento un proceso para impartir propiedades de control microbiano a una composición fluida, comprendiendo dicho proceso añadir una composición antimicrobiana como se define anteriormente en el presente documento en dicha composición fluida.

Ejemplos

Materiales y métodos

Procedimiento general para la síntesis de 2-aminoimidazoles N-sustituidos (compuestos 8). Como se representa en la Fig. 2, los 2-Als desarrollados previamente 7 (6) se funcionalizaron adicionalmente mediante aminación reductora de la posición 2N de los 2-Als con isobutiraldehído y ciclopentanona. Los 5-Ar-2Als N1-,2N-disustituidos deseados 8 se obtuvieron en rendimientos moderados. Estos compuestos combinan el sustituyente N1-octilo del compuesto 2 con el sustituyente 2N-isobutilo o 2N-ciclopentilo de los compuestos 3 y 5 respectivamente.

A una solución del compuesto de 2-aminoimidazol 7 (Fig. 2) (6) en tolueno se añadió isobutiraldehído o cilopentanona (1,2 equiv.). La mezcla se agitó a 120 °C durante 3 h. Después de enfriar hasta ta, el disolvente se redujo in vacuo. El intermedio crudo se disolvió en MeOH y se enfrió a 0 °C. Se añadió NaBH4 (4 equiv.) por partes. La reacción se agitó durante 16 h a ta. El disolvente se redujo in vacuo, el producto crudo se recogió en agua y se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas resultantes se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron in vacuo. Los productos se purificaron por cromatografía sobre gel de sílice con acetato de etilo/heptano (7/3) como eluyente.

N-isobutil-1-octil-5-fenil-1H-imidazol-2-amina (8a). Obtenida del procedimiento general como un aceite de color naranja, rendimiento del 57 %. 1 H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 8 7,52-7,20 (m, 5H), 6,71 (s, 1H), 3,71 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 3,23 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 1,96 (dp, J = 13,4, 6,7 Hz, 1H), 1,80-1,45 (m, 2H), 1,18 (s, 10H), 1,00 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 0,86 (t, J = 6,8 Hz, 3H). 13C RMN (75 MHz, CDCb) 8 150,75, 131,13, 129,25, 128,67, 128,60, 128,23, 128,16, 127,05, 123,00, 51,56, 42,64, 31,67, 29,42, 29,02, 28,98, 28,94, 28,42, 26,51,22,58, 20,32, 14,06.

5-(4-clorofenil)-N-isobutil-1-octil-1H-imidazol-2-amina (8b). Obtenida del procedimiento general como un aceite de color naranja, rendimiento del 46 %. 1 H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 87,37 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,17 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,69 (s, 1H), 3,79 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 3,16 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 1,98-1,81 (m, 1H), 1,48 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,32-1,03 (m, 10H), 0,95 (d, J = 6,6 Hz, 6H), 0,85 (t, J = 6,9 Hz, 3H). 13 C RMN (75 MHz, CDCla) 8148,89, 134,47, 129,77, 129,11, 127.79, 127,32, 115,99, 51,07, 43,09, 31,61,28,93, 28,84, 28,80, 28,50, 28,27, 26,15, 22,54, 22,52, 19,99, 14,02.

5-(4-bromofenil)-N-isobutil-1-octil-1H-imidazol-2-amina (8c). Obtenida del procedimiento general como un aceite de color amarillo, rendimiento del 52 %. 1 H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 87,62-7,45 (m, 2H), 7,25-7,10 (m, 2H), 6,72 (s, 1H), 3,79-3,57 (m, 3H), 3,23 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 1,95 (dt, J = 13,4, 6,7 Hz, 1H), 1,57 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,32 1,11 (m, 10H), 1,00 (d, J = 6,6 Hz, 6H), 0,87 (t, J = 6,8 Hz, 3H). 13C RMN (75 MHz, CDCb) 8151,09, 131,78, 130,10, 129.54, 128,01, 123,68, 120,94, 51,50, 42,68, 31,68, 29,44, 29,03, 28,95, 28,41, 26,50, 22,60, 20,30, 14,07.

5-(3,4-diclorofenil)-N-isobutil-1-octil-1H-imidazol-2-amina (8d). Obtenida del procedimiento general como un aceite de color naranja, rendimiento del 41 %. 1 H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 87,43-7,28 (m, 2H), 7,06 (dt, J = 8,3, 1,9 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 29,1 Hz, 1H), 4,12-3,53 (m, 3H), 3,54-2,88 (m, 1H), 1,78-1,47 (m, 2H), 1,29-0,96 (m, 12H), 0,96-0,86 (m, 4H), 0,86-0,64 (m, 4H). 13C RMN (75 MHz, CDCb) 8 151,41, 131,54, 130,64, 129,64, 129,11, 125,61, 124,79, 122.55, 41,74, 39,10, 30,63, 28,52, 28,12, 26,49, 25,61, 25,50, 22,86, 22,66, 21,56, 19,94, 16,61, 13,02.

N-ciclopentil-1-octil-5-fenil-1H-imidazol-2-amina (8e). Obtenida del procedimiento general como un aceite de color naranja, rendimiento del 67 %. 1 H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 87,32 (tt, J = 12,4, 7,3 Hz, 5H), 6,73 (s, 1H), 4,20 (q, J = 6,3 Hz, 1H), 3,69 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 3,53 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 2,10 (tt, J = 12,2, 5,0 Hz, 2H), 1,91 1,61 (m, 3H), 1,53 (dq, J = 12,1, 6,3, 5,7 Hz, 4H), 1,39-1,05 (m, 10H), 0,86 (t, J = 6,8 Hz, 3H). 13C RMN (75 MHz, CDCb) 8150,40, 131,21, 129,06, 128,52, 128,08, 128,06, 126,90, 126,88, 123,28, 55,21,42,51,35,46, 33,71,33,69, 31,63, 29,32, 28,96, 28,86, 26,37, 26,35, 23,73, 23,32, 22,55.

5-(4-clorofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1H-imidazol-2-amina (8f). Obtenida del procedimiento general como un aceite de color naranja, rendimiento del 41 %. 1 H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 87,49-7,30 (m, 2H), 7,26 (d, J = 3,9 Hz, 2H), 6,73 (s, 1H), 4,19 (q, J = 6,2 Hz, 1H), 3,66 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 3,44 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 2,26-2,00 (m, 2H), 1,79 1,61 (m, 2H), 1,52 (ddd, J = 12,6, 7,9, 5,4 Hz, 4H), 1,34-1,07 (m, 12H), 0,87 (t, J = 6,8 Hz, 3H). 13C RMN (75 MHz, CDCb) 8129,46, 128,93, 127,98, 55,40, 42,80, 33,72, 31,68, 29,25, 29,02, 28,90, 26,40, 23,76, 22,60, 14,07.

5-(4-bromofenil)-N-cidopentil-1-octil-1H-imidazol-2-amina (8g). Obtenida del procedimiento general como un aceite de color naranja, rendimiento del 52 %. 1 H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 87,52 (dd, J = 8,5, 2,0 Hz, 2H), 7,20 (dd, J = 8,4, 2,0 Hz, 2H), 6,75 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,20 (q, J = 6,3 Hz, 1H), 3,67 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 3,44 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 2,27-1,98 (m, 2H), 1,94-1,62 (m, 4H), 1,53 (dq, J = 11,6, 5,7 Hz, 4H), 1,19 (s, 10H), 0,88 (t, J = 6,5 Hz, 3H). 13C RMN (75 MHz, CDCb) 8 131.79, 130,13, 129,56, 127,96, 123,82, 120.96, 55,29, 42,66, 33,81, 31,69, 29,42, 29,03, 28,92, 26,46, 23,75, 22,61, 14,08.

5-(3,4-didorofenil)-N-cidopentil-1-octil-1H-imidazol-2-amina (8h). Obtenida del procedimiento general como un aceite de color amarillo, rendimiento del 49 %. 1 H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 87,49-7,36 (m, 2H), 7,14 (dd, J = 8,3, 2,1 Hz, 1H), 6,76 (s, 1H), 4,19 (q, J = 6,3 Hz, 1H), 3,80-3,57 (m, 2H), 3,50 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 2,22-1,98 (m, 2H), 1,80-1,61 (m, 4H), 1,60-1,43 (m, 4H), 1,19 (d, J = 3,1 Hz, 10H), 0,87 (t, J = 6,8 Hz, 3H). 13C RMN (75 MHz, CDCb) 8151,06, 132,70, 131,31, 130,75, 130,58, 129,29, 126,93, 126,78, 124,82, 55,27, 42,74, 33,79, 31,68, 29,42, 29,04, 28,91, 26,43, 23,74, 22,60, 14,07.

Química: reactivos y análisis. Todos los disolventes y reactivos se adquirieron de fuentes comerciales y se usaron sin purificación previa. El análisis por TLC se realizó en placas con soporte de aluminio. Los productos se purificaron por cromatografía en columna de gel de sílice (malla de 200-300). Todos los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker Avance 300 a 300 MHz (1H) y a 75 MHz (13C). Los desplazamientos químico de 1H y13C se indican en partes por millón con respecto al tetrametilsilano usando la señal de disolvente residual como referencia interna. Las siguientes abreviaturas se usaron para designar multiplicidades de desplazamiento químico: s = singlete, d = doblete, dd = doblete de dobletes, t = triplete, dt = doblete de tripletes, q = cuarteto, p = penteto y m=multiplete. Los espectros de ¹³C RMN son el protón desacoplado. Los 2-aminoimidazoles 1-7 se sintetizaron según los procedimientos establecidos en la bibliografía [17-19][14].

Cepas y medios de crecimiento.

Se usaron en este estudio las cepas P. aeruginosa PA14 [16], Escherichia coli TG1 (16), E. coli MG1655 (17), S. entérica serovar Typhimurium ATCC14028 (18), Porphyromonas gingivalis ATCC33277 (20), Serratia liquefaciens MG44 [21], Burkholderia cepacia LMG1222T (20), C. albicans SC5314 (21), Staphylococcus aureus ATCC6538, S. aureus SH1000 [24,25] y Staphylococcus epidermidis [26]. Los cultivos nocturnos de C. albicans SC5314 se cultivaron con aireación en YPD (extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 % y dextrosa al 2 %) a 30 °C. Los cultivos nocturnos de S. Typhimurium ATCC14028, S. liquefaciens MG44, B. cepacia LMG1222T, S. aureus ATCC6538, S. aureus SH1000 y S. epidermidis se cultivaron con aireación en caldo de lisogenia (LB, por sus siglas en inglés) a 37 °C (16). Para los experimentos sobre los sustratos de titanio recubiertos, los cultivos durante la noche de S. aureus SH1000 se cultivaron en caldo de soja tríptico (TSB, por sus siglas en inglés) a 37 °C en condiciones de agitación. Los cultivos nocturnos de P. gingivis ATCC33277 se cultivaron anaeróbicamente (Anoxomat, AN20°; Mart Microbiology, Dracten, Países Bajos) en LB a 37 °C. Los cultivos nocturnos de P. aeruginosa PA14 se cultivaron con aireación en LB o en caldo de soja trípticasa (TSB) a 37 °C. Los cultivos nocturnos de E. coli MG1655 se cultivaron con aireación en TSB a 37 °C. Se preparó una solución salina tamponada con fosfato (PBS) combinando 8,8 g de litro^-1de NaCl, 1,24 litros^-1de K2HPO4 y 0,39 g de litro^-1de KH2PO4 (pH 7,4). El medio RPMI 1640 con L-glutamina y sin bicarbonato de sodio se adquirió de Sigma y se tamponó a pH 7,0 con MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico; Sigma, St. Louis, MO) (concentración final, 165 mM).

Ensayo antibiopelícula: inhibición de biopelículas bacterianas.

Se usó un ensayo de clavija estática, descrito anteriormente [7,27], para la formación de biopelículas bacterianas. El dispositivo de biopelícula Calgary consiste en una plataforma que lleva 96 clavijas de poliestireno (Nunc n.° 445497) que se ajusta como una tapa de placa de microtitulación con una clavija colgando en cada pocillo de placa de microtitulación (Nunc n.° 269789). Se prepararon diluciones dobles en serie de los compuestos (disueltos en DMSO al 100 % o etanol) en 100 μl de caldo líquido (TSB diluido 1/20) por pocillo en la placa de microtitulación por duplicado o por triplicado, con una concentración máxima de 1600 μM y una concentración mínima de 0,8 μM. Posteriormente, un cultivo durante la noche de S. Typhimurium ATCC14028, P. aeruginosa PA14, E. coli TG1, S. aureus SH1000 o S. aureus ATCC6538 8 (todo cultivado en LB) se diluyó 1:100 en TSB 1/20 (o TSB para S. aureus SH1000), mientras que los cultivos durante la noche de S. liquefaciens MG44 y B. cepacia LMG1222T se diluyeron 1:50 en TSB 1/20. Los cultivos de P. gingivis ATCC33277 se diluyeron en TSB 1/20 para tener una concentración final de 1,10⁸células/ml. A continuación, se añadieron 100 μl a cada pocillo de la placa de microtitulación, dando como resultado un volumen total de 200 μl de medio por pocillo (la concentración final de los compuestos varía de 800 μM (2 % de DMSO o etanol) a 0,4 μM (0,001 % de DMSO o etanol). En la siguiente etapa, la tapa con clavijas se colocó en la placa de microtitulación y la placa se incubó durante 24 h o 48 h a 25 °C o 37 °C sin agitación. A 37 °C, las placas se colocaron en un recipiente sellado con toallas húmedas en el fondo para evitar la evaporación del medio de crecimiento. Las biopelículas de P. gingivis ATCC33277 se cultivaron anaeróbicamente a 37 °C durante 72 h. Durante este período de incubación, se formaron biopelículas en la superficie de las clavijas. Después de la incubación, la densidad óptica a 600 nm (DO600) se midió para las células planctónicas en la placa de microtitulación usando un lector multimodo Synergy MX (Biotek, Winooski, VT). Esto proporciona una primera indicación del efecto de los compuestos sobre el crecimiento planctónico. En cuanto a la cuantificación de la formación de biopelículas, las clavijas se lavaron una vez en 200 μl de PBS. Las bacterias unidas restantes se tiñeron durante 30 min con 200 μl de violeta cristal al 0,1 % (p/v) en una solución de isopropanol/metanol/PBS (v/v 1:1:18). El exceso de tinción se enjuagó mediante la colocación de las clavijas en una placa de 96 pocillos rellena con 200 μl de agua destilada por pocillo. Después de secar al aire las clavijas (30 min), el tinte unido a la biopelícula adherente se extrajo con ácido acético glacial al 30 % (200 μl por pocillo de una placa de 96 pocillos). Las densidades ópticas a 570 nm (DO570) de cada pocillo se midió usando un lector multimodo Synergy Mx (Biotek, Winooski, VT). Los valores de BIC50 e IC50 para cada compuesto se determinaron a partir del gradiente de concentración usando un ajuste de curva no lineal (GraphPad Prism 5; Graphpad Software, Inc., La Jolla, CA). BIC50 se define como la concentración del compuesto necesaria para inhibir la formación de biopelículas en un 50 %. En el mismo ensayo se evaluó el efecto sobre el crecimiento planctónico. IC50 se define como la concentración del compuesto necesaria para inhibir el crecimiento planctónico en un 50 %. La actividad se considera específica de una biopelícula si la BIC50 es al menos dos veces menor que la IC50. Los datos representan las medias de al menos 3 repeticiones técnicas con los intervalos de confianza del 95 % correspondientes.

Ensayo anti-biopelícula: inhibición de biopelículas de C. albicans

El potencial de los compuestos para prevenir la formación de biopelículas de C. albicans SC5314 se evaluó mediante el método de cuantificación del azul de título celular (CTB) (26). Para el método CTB, un cultivo durante la noche de C. albicans SC5314 se lavó con PBS y una suspensión celular de 10⁶células/ml (DO600 = 0,1) se preparó en medio RPMI 1640 (pH 7,0). Se prepararon diluciones dobles en serie de los compuestos (disueltos en DMSO al 100 % o etanol) en 100 μl de medio RPMI1640 por pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos de poliestireno de fondo redondo (TPP; Trasadingen, Suiza) por duplicado o triplicado, con una concentración máxima de 1600 μM y una concentración mínima de 0,8 μM. Se añadieron 100 μl de la suspensión celular a cada pocilio de la placa de microtitulación, dando como resultado un volumen total de 200 μl de medio por pocillo (la concentración final de los compuestos varía de 800 μM (2 % de DMSO o etanol) a 0,4 μM (0,001 % de Dm So o etanol). Después de 16 h de incubación estática a 37 °C, se lavaron las biopelículas y se cuantificaron con CST como se describió anteriormente [26].

Ensayos de biopelículas mixtas.

Biopelículas de C. albicans/E. coli. Los cultivos nocturnos de C. albicans SC5314 (YPD) y E. coli MG1655 (TSB) se lavaron tres veces con PBS, después de lo cual se diluyeron en medio RPMI a densidades ópticas a 600 nm (DO600) de 1 y 0,01, respectivamente. Se mezclaron volúmenes iguales de estas suspensiones celulares y se añadieron 100 μl de esta suspensión celular mixta junto con el compuesto a los pocillos de una placa de microtitulación por triplicado. Se analizaron las concentraciones de 25 μM (0,0625 % de DMSO o etanol) y 100 μM (0,25 % de DMSO o etanol). Después de 24 h de incubación a 37 °C, se retiró el medio y se lavó la biopelícula con PBS. A continuación, las células se volvieron a suspender en 100 μl de PBS mediante raspado, sonicación (1 min, 45 kHz, USC300-T; VWR, Rador, PA, EE. UU.) y pipeteo enérgico hacia arriba y hacia abajo. Por último, se realizaron series de dilución y la cuantificación de las poblaciones de E. coli MG1655 y C. albicans SC5314 se realizaron usando siembra en placas selectiva en placas de TSA que contenían 25 mg/l de anfotericina B y placas de YPD que contenían 100 μg/ml de tetraciclina, respectivamente. El porcentaje de las células de C. albicans SC5314 y E. coli se determinó MG1655 con respecto al tratamiento de control con DMSO o etanol.

Biopelículas de C. albicans/S. epidermidis. Los cultivos nocturnos de C. albicans SC5314 (YPD) y S. epidermidis (TSB) se diluyeron en medio RPMI 1640 a DO(600) de 0,05 y 0,01, respectivamente. Volúmenes iguales de las suspensiones celulares de cada organismo se mezclaron antes de su uso. Se añadieron 100 μl de esta suspensión de células mixtas junto con el compuesto a los pocillos de una placa de microtitulación de fondo redondo (TPP, Trasadingen, Suiza) por triplicado. Se analizaron las concentraciones de 25 μM (0,0625 % de DMSO o etanol) y 100 μM (0,25 % de Dm SO o etanol). Después de 24 h de incubación a 37 °C, se lavaron las biopelículas con PBS y se añadió medio reciente con o sin compuestos. Después de una incubación adicional durante 48 h a 37 °C, las biopelículas se lavaron con PBS, después de lo cual las células se volvieron a suspender en 100 μl de PBS mediante raspado, sonicación (1 min, 45 kHz, USC300-T; VWR, Rador, PA, EE. UU.) y pipeteo enérgico hacia arriba y hacia abajo. Por último, las células de biopelícula se diluyeron en PBS y se sembraron en placas en placas de agar YPD que contenían 100 mg/l de ampicilina y placas de TSA que contenían 25 mg/l de anfotericina B, para determinar el número de UFC fúngicas y bacterianas después de 2 días de incubación a 37 °C, respectivamente. El porcentaje de las células de C. albicans SC5314 y S. epidermidis se determinó con respecto al tratamiento de control con DMSO o etanol.

Biopelículas de C. albicans/S. aureus. Los cultivos nocturnos de C. albicans SC5314 (YPD, 30 °C) y S. aureus SH1000 se lavaron (LB, 37 °C) con PBS, después de lo cual se diluyeron en medio RPMI para obtener suspensiones celulares de 10⁶células/ml para células fúngicas y 10⁸células/ml para bacterias. Se mezclaron volúmenes iguales de estas suspensiones celulares y se añadieron 100 μl de esta suspensión celular mixta junto con el compuesto a los pocillos de una placa de microtitulación por triplicado. Se analizaron las concentraciones de 25 μM (0,0625 % de DMSO o etanol) y 100 μM (0,25 % de DMSO o etanol). Las placas se incubaron a 37 °C durante 90 min. Después de la incubación, los pocillos se lavaron dos veces con PBS y se añadieron 200 μl del medio RPMI reciente con o sin compuestos por triplicado a los pocillos. Después de 24 h de incubación a 37 °C, se retiró el medio y se lavó la biopelícula con PBS. A continuación, las células se volvieron a suspender en 100 μl de PBS mediante raspado, sonicación (1 min, 45 kHz, USC300-T; VWR, Rador, PA, EE. UU.) y pipeteo enérgico hacia arriba y hacia abajo. Por último, se realizaron series de dilución y la cuantificación de las poblaciones de S. aureus SH1000 y C. albicans SC5314 se realizó usando siembra en placas selectiva en placas de t Sa que contenían 25 mg/l de anfotericina B y placas de YPD que contenían 100 μg/ml de tetraciclina, respectivamente. El porcentaje de las células de C. albicans SC5314 y S. aureus SH1000 se determinó con respecto al tratamiento de control con DMSO o etanol.

Biopelículas de E. coli/P. aeruginosa. Los cultivos durante la noche de E. co liTG1 y P. aeruginosa PA14 se diluyeron 1/100 en el mismo vial de TSB 1/20 para formar una suspensión de cultivo mixto. Se prepararon diluciones dobles en serie de los compuestos (disueltos en DMSO al 100 % o etanol) en 100 μl de caldo líquido (TSB diluido 1/20) por pocillo en la placa de microtitulación del dispositivo de biopelícula Calgary (Nunc n.° 269789) por duplicado o por triplicado, con una concentración máxima de 1600 μM y una concentración mínima de 0,8 μM. Se añadieron 100 μl de la suspensión de cultivo mixto a cada pocillo de la placa de microtitulación, dando como resultado un volumen total de 200 μl de medio por pocillo (la concentración final de los compuestos varía de 800 μM (2 % de DMSO o etanol) a 0,4 μM (0,001 % de DMSO o etanol). La tapa con clavijas se colocó en la placa de microtitulación, y la placa se incubó durante 72 h a 37 °C, lo que permitió la formación de biopelículas en las clavijas (Nunc n.° 269789) del dispositivo de biopelícula Calgary. Después de 72 h, la biopelícula era de color violeta cristal como se describió anteriormente [27]. Se midieron DO570 (biopelícula) y DO(600) (planctónica) y BIC50 así como IC50 se calcularon, respectivamente.

Biopelículas de S. aureus/S. epidermidis. Los cultivos durante la noche de S. aureus ATCC6538 y S. epidermidis se cultivaron en medio LB y se diluyeron 1/200 en el mismo vial de TSB para formar una suspensión de cultivo mixto. A continuación, se prepararon diluciones dobles en serie de los compuestos (disueltos en DMSO al 100 % o etanol) en 100 μl de medio TSB por pocillo en la placa de microtitulación (Nunc n.° 269789) por duplicado o por triplicado, con una concentración máxima de 1600 μM y una concentración mínima de 0,8 μM. Se añadieron 100 μl de la suspensión de cultivo mixto a cada pocillo de la placa de microtitulación, dando como resultado un volumen total de 200 μl de medio por pocilio (la concentración final de los compuestos varía de 800 μM (2 % de DMSO o etanol) a 0,4 μM (0,001 % de DMSO o etanol). A continuación, las células se incubaron durante 48 h a 37 °C, lo que permitió la formación de biopelículas en las clavijas (Nunc n.° 269789) del dispositivo de biopelícula Calgary. Después de 24 h, se añadió medio reciente con compuestos a los pocillos y después de 48 h la biopelícula era de color violeta cristal como se describió anteriormente [27]. Se midieron DO570 (biopelícula) y DO(600)(planctónica) y BIC50 así como IC50 se calcularon respectivamente.

Ensayo de viabilidad celular de mamífero. La viabilidad celular de dos tipos de células primarias humanas, a saber, osteoblastos (OB) y células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (MSC) se analizó según la norma ISO 10993-5, como se describió anteriormente [29]. Brevemente, las células se sembraron en placas de ensayo de cultivo de tejidos de 96 pocillos (TPP, Suiza) a 5 * 10³células/cm²en medio de cultivo celular DMEM Advanced suplementado con suero al 10 %, 1 x GlutaMAX, 0,05 mg/ml de gentamicina y se dejó que se unieran durante la noche. Al día siguiente, las células se expusieron a (i) medio de cultivo celular y medio con el control correspondiente (0,5 % de etanol o DMSO) (controles negativos), (ii) medio con 0,05 % de fenol (control citotóxico) y (iii) medio con compuestos (12,5 μM) y se incubaron durante 2 h, 48 h y 6 días (8 repeticiones para cada condición). En cada punto de tiempo, se determinaron directamente los números de células viables y muertas mediante tinción con azul de tripano, e indirectamente midiendo la actividad metabólica con tinción de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio).

Tinción con azul de tripano. El medio se retiró de los pocillos y se añadió 1/3 de azul de tripano en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) a las células, se incubó durante 3 min, después de lo cual, se retiró azul de tripano y se añadió medio DMEM a los pocillos. En cada uno de los cuatro pocillos, se contaron dos campos de microscopía para células viables (transparentes) y muertas (azules).

Tinción de MTT. El medio se retiró de los pocillos y se añadieron 100 μl de medio, complementado con suero al 10 % y 0,5 mg/ml de MTT a las células. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO2. Al día siguiente, se retiró el medio con MTT y se añadieron 100 μl de isopropanol ácido. A continuación, las células se centrifugaron a 2300 g y se transfirieron 50 μl del sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos. La absorbancia se midió a 570 nm y el fondo se midió a 660 nm. Se examinaron cuatro pocillos por condición.

Diferenciación osteogénica. El efecto sobre el potencial de diferenciación osteogénica se evaluó como se ha descrito anteriormente [29]. Sólo se analizaron las sustancias que permitieron la supervivencia de las células durante más de 3 semanas, que es el tiempo necesario para la diferenciación osteogénica madura. Brevemente, se cultivaron osteoblastos y células madre mesenquimales derivadas de médula ósea en un control de disolvente positivo (medio osteogénico con DMSO al 0,5 % o fondo de etanol), un control negativo (medio sin complementos osteogénicos) y muestras tratadas (medio osteogénico, DMSO al 0,5 % o fondo de etanol y 12,5 μM de compuesto de ensayo) con cuatro repeticiones por condición. Se recogieron células madre mesenquimales y cultivos celulares de osteoblastos después de 3 o 5 semanas, respectivamente, para el ensayo de calcio y ADN.

Ensayo de calcio y ADN. La deposición de calcio de los osteoblastos y las células madre mesenquimales se midió con el ensayo de Calcium CPC LiquiColor (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) como se describió anteriormente [29]. Brevemente, los cultivos celulares se extrajeron con ácido tricloroacético al 5 % (500 μl por muestra), se añadió un complejo O-cresolftaleína, y el contenido de calcio se determinó espectrofotométricamente a 550 nm. El contenido de ADN se determinó como se describió anteriormente [29]. Se usaron valores de ADN para normalizar el contenido de calcio. Se examinaron cuatro pocillos por condición, y se tomaron dos muestras de cada pocillo para cada ensayo.

Unión covalente de 2-aminoimidazoles funcionalizados en sustratos de titanio.

Para aumentar el potencial de osteointegración, se desbastaron primero discos redondos estériles de Ti (Ti comercialmente puro, grado 2; altura: 2 mm; diámetro: 5 mm) por granallado de cuentas con partículas de Ah O³de alta pureza y por grabado con una mezcla ácida, seguido de una etapa de lavado con isopropanol. La rugosidad de los discos, recibida de Biotech Dental (Salon-de-Provence, Francia), se determinó con interferometría de luz blanca (Wyko NT 3300 Optical Profiler, Veeco Instruments, Mannheim, Alemania), que dio como resultado una rugosidad superficial promedio, Sa, de 0,78 ± 0,14 μm; una altura de diez puntos, Sz, de 8,18 ± 1,56 μm y una rugosidad cuadrática media, Sq, de 0,98 ± 0,18. Estos discos de Ti lisos se funcionalizaron a continuación con un resto de ácido carboxílico mediante un tratamiento con 3-aminopropil-trietoxisilano protegido con Fmoc, seguido de desprotección con tetrahidrofurano/piperidina (90:10) (30). Posteriormente, los discos de Ti funcionalizados se colocaron en un recipiente de hidrólisis que contenía una solución de n-heptano/diisocianato de hexametileno (85:15) (1 ml/disco), se agitaron durante 3 h a temperatura ambiente y después se enjuagaron con n-heptano. A continuación, los discos se transfirieron a una solución de ácido 6-aminohexanoico, se agitaron durante 16 h y se enjuagaron con agua desmineralizada libre de pirógenos y después con acetona. A continuación, las muestras enjuagadas se secaron a temperatura ambiente durante 1 h. Para la unión covalente de LC0024 (compuesto 8 g de la Fig. 2) a los discos de Ti, se sintetizó un análogo de LC0024 que contenía una amina primaria (LC0024-NH²). (Fig. 6A, compuesto 9.7), según un método basado en el método descrito en la referencia 6 y el método descrito anteriormente para la síntesis de compuestos 8. El protocolo de síntesis detallado se proporciona a continuación y en la Figura 6A.

N1-(pirimidin-2-il)octano-1,8-diamina (9.1)

A una solución de 2-cloropirimidina (5 g, 43,7 mmol) en etanol (50 ml) se le añade octano-1,8-diamina (18,9 g, 131 mmol, 3 equiv.). La reacción se agita a 85 °C durante 16 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, el disolvente se elimina in vacuo. El crudo se recoge en acetato de etilo (40 ml) y se lava con agua (2 x 20 ml). La capa orgánica se seca sobre Na²SO⁴, se filtra y se reduce in vacuo.

El crudo se purifica por cromatografía sobre gel de sílice con DCM/MeOH/TEA (100/10/2) como eluyente. El producto se aísla como un aceite de color amarillo (4,8 g, 50 %).

1H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 88,27 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,50 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,43 (s, 2H), 3,39 (td, J = 7,2, 5,7 Hz, 2H), 2,67 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 1,68-1,50 (m, 2H), 1,54-1,22 (m, 11H). 13C RMN (75 MHz, CDCls) 8 162,42, 157,96, 110,18, 42,23, 41,43, 33,83, 29,53, 29,39, 29,31, 26,88, 26,79.

(8-(pirimidin-2-ilamino)octilo) carbamato de terc-butilo (9.2)

A una solución de W1-(pirimidin-2-il)octano-1,8-diamina (4,8 g, 21,6 mmol) en DCM (50 ml) se le añade dicarbonato de di-terc-butilo (4,7 g, 21,6 mmol). La reacción se agita durante la noche a ta. Después se eliminaron los compuestos volátiles in vacuo. El producto se aisló como un aceite de color amarillo (6,8 g, 98 %) y se usó sin purificación adicional.

1H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 88,27 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,50 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,27 (br, 1H), 4,56 (br, 1H), 3,39 (td, J = 7,1, 5,8 Hz, 2H), 3,10 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 1,60 (ddd, J = 14,3, 7,9, 6,3 Hz, 2H), 1,50-1,22 (m, 19H). 3-(4-bromofenil)-1-(8-((terc-butoxicarbonil)amino)octilo)-2-hidroxi-2,3-dihidro-1H-imidazo[1,2-a] pirimidin-4-io bromuro (9.3) A una solución de (8-(pirimidin-2-ilamino)octil)carbamato de terc-butilo (6,8 g, 21 mmol) en ACN (75 ml) se le añade 2-bromo-1-(4-bromofenil)etan-1-ona (7,62 g, 27,4 mmol). La reacción se agita durante 6 h a 85 °C. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, los compuestos volátiles se eliminaron in vacuo y el producto crudo (11,8 g, 93 %) se usa para la siguiente etapa.

1-(8-aminooctil)-5-(4-bromofenil)-1H-imidazol-2-amina (9.4)

Al 3-(4-bromofenil)-1-(8-((terc-butoxicarbonil)amino)octil)-2-hidroxi-2,3-dihidro-1H-imidazo[1,2-a]pirimidin-4-io bromuro finamente pulverizado (12 g, 19,99 mmol) en un vaso de precipitados se le añade PPA (20 g). La mezcla se calienta a 150 °C mientras se agita con una varilla de vidrio hasta que cese la evaporación del agua. La suspensión se enfrió a 60 °C y se vertió en 200 ml de agua helada. Después de enfriar a ta, se añadió cuidadosamente HClO⁴(15 %, 100 ml). La suspensión se extrajo usando acetato de etilo (5 * 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre NaSO⁴y se filtraron. Los disolventes se redujeron al vacío y el producto se aisló como un sólido de color amarillo. El intermedio crudo se usó sin purificación adicional. A una solución de intermedio crudo en ACN (30 ml) se le añade hidrazina (64 % en agua) (6,86 ml, 140 mmol). La reacción se agitó a 85 °C durante la noche. El disolvente se redujo in vacuo. La hidrazina se eliminó mediante codestilación con tolueno (3 * 20 ml) in vacuo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/NH³(7 N en MeOH) 100/12 como eluyente. El producto se obtuvo como un aceite de color naranja (3,34 g, 46 %).

¹H RMN(300 MHz, Cloroformo-d) 87,59-7,47 (m, 2H), 7,23-7,11 (m, 2H), 6,64 (s, 1H), 3,80-3,64 (m, 2H), 3,45 (s, 2H), 2,66 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,56 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,38 (q, J = 7,0, 6,6 Hz, 2H), 1,19 (q, J = 5,1, 4,3 Hz, 9H). 13C RMN (75 MHz, CDCla) 8149,29, 131,84, 129,97, 129,65, 128,23, 123,43, 121,23, 50,27, 43,12, 42,02, 33,42, 29,46, 29,14, 28,86, 26,66, 26,33.

(8-(2-amino-5-(4-bromofenil)-1H-imidazol-1-il)octil)carbamato de terc-butilo (9.5)

A una mezcla de 1-(8-aminooctil)-5-(4-bromofenil)-1H-imidazol-2-amina (2 g, 5,47 mmol) en DCM (15 ml) se le añade dicarbonato de di-terc-butilo (1,25 g, 5,75 mmol). La reacción se agita durante la noche y después se retiran los volátiles in vacuo. El producto (2,45 g, 96 %) se usa en la siguiente etapa sin purificación adicional.

1 H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 87,57-7,48 (m, 2H), 7,22-7,15 (m, 2H), 6,67 (s, 1H), 4,57 (s, 1H), 3,78-3,68 (m, 2H), 3,08 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 1,56 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,44 (s, 11H), 1,19 (t, J = 6,9 Hz, 8H). 13C RMN (75 MHz, CDCls) 8 159,63, 149,18, 131,85, 129,63, 128,31, 123,78, 121,18, 50,87, 43,14, 29,50, 28,93, 28,83, 28,44, 26,55, 26,32. (8-(5-(4-bromofenil)-2-(ciclopentilamino)-1H-imidazol-1-il)octil)carbamato de terc-butilo (9.6)

A una suspensión de (8-(2-amino-5-(4-bromofenil)-1H-imidazol-1-il)octilo)carbamato de terc-butilo (2 g, 4,3 mmol) en tolueno (25 ml) se le añade ciclopentanona (0,54 g, 6,45 mmol). La reacción se somete a reflujo durante 16 h y después de enfriar a temperatura ambiente, el disolvente se elimina in vacuo. Se añade metanol (30 ml) y se añade borohidruro sódico (0,82 g, 21,5 mmol) por partes a 0 °C. La reacción se agita durante 16 h a ta. Después se retira el MeOH in vacuo y el crudo se recoge en acetato de etilo (20 ml) y agua (20 ml). La mezcla se agita durante 15 min, se separa y la fase acuosa se extrae con acetato de etilo (2 x 20 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavan con salmuera (20 ml), se secan sobre Na²SO⁴, se filtran y se reducen in vacuo. El producto crudo se purifica mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/TEA (100/5) como eluyente. El producto (1,53 g, 67 %) se obtiene como un aceite de color amarillo.

1H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 87,55-7,46 (m, 2H), 7,24-7,12 (m, 2H), 6,73 (s, 1H), 4,49 (s, 1H), 4,24-4,15 (m, 1H), 3,71- 3,63 (m, 2H), 3,44 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 3,08 (q, J = 6,7 Hz, 2H), 2,15-2,06 (m, 2H), 1,83-1,64 (m, 6H), 1,60-1,49 (m, 5H), 1,44 (s, 9H), 1,17 (t, J = 6,8 Hz, 7H).

1-(8-aminooctil)-5-(4-bromofenil)-N-ciclopentil-1H-imidazol-2-amina (9.7)

A una solución de (8-(5-(4-bromofenil)-2-(ciclopentilamino)-1H-imidazol-1-il)octilo)carbamato de terc-butilo (1,53 g, 2,87 mmol) en DCM (20 ml) a 0 °C se le añade gota a gota TFA (5 ml). La reacción se agita durante 16 h a temperatura ambiente. Los disolventes se eliminan in vacuo y el crudo se recoge en acetato de etilo (30 ml) y se añade una solución saturada de NaHCO³hasta el pH = 8. Las fases se separan y la capa de agua se extrae con acetato de etilo (4 x 20 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavan con salmuera (20 ml), se secan sobre Na²SO⁴y se filtran y reducen in vacuo. El crudo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice con acetato de etilo/NH³(7 N en MeOH (100/15) como eluyente. El producto 3.11 (880 mg, 71 %) se obtiene como un aceite de color amarillo.

¹H RMN (300 MHz, Cloroformo-d) 87,51 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,17 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,72 (s, 1H), 3,74-3,64 (m, 2H), 3,44 (s, 3H), 2,76 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 2,15-2,02 (m, 2H), 1,80-1,58 (m, 4H), 1,58-1,38 (m, 6H), 1,34-1,04 (m, 9H). 13C RMN (101 MHz, CDCb) 8150,57, 131.84, 131,80, 129,96, 129,62, 129,59, 128,05, 123,31, 121,11, 55,39, 42,68, 41,30, 33,74, 31,41, 30,92, 29,18, 28,94, 28,88, 28,70, 26,46, 26,24, 23,73. HRMS (EI): m/z calculada para C²²H³³BrN⁴: 432,1889; encontrada: 432,1887.

Esta amina primaria (compuesto 9.7) se hizo reaccionar con el resto carboxilo en la superficie de Ti de los discos durante 16 horas de agitación a temperatura ambiente (Fig.6B). Se empleó una combinación de carbodiimida (3 equivalentes) y Oxyma (2 equivalentes en una mezcla de disolventes de diclorometano/dimetilformamida (95/5) como reactivos de acoplamiento. Una vez completada la reacción, los soportes sólidos se lavaron con una mezcla de diclorometano/dimetilformamida (50/50) (5 veces) y con diclorometano (3 veces). Finalmente, estos soportes sólidos se secaron bajo una corriente de argón.

Formación de biopelículas bacterianas en discos de titanio. El potencial de las bacterias para formar biopelículas en discos de Ti se evaluó incubando primero el control-Ti y los discos de LC0024-Ti durante la noche en suero bovino fetal (FBS, Life Technologies, Europa) a 37 °C en una caja con un tejido húmedo estéril para evitar la evaporación. Posteriormente, los discos se lavaron en PBS para eliminar el exceso de suero. A continuación, los discos se transfirieron a los pocillos de una placa de 24 pocillos con el lado rugoso hacia arriba y se colocaron tubos de silicona (9 mm de DE * 5 mm de DI * 15 mm de longitud) (VWR International) sobre los discos para excluir los laterales y el fondo. Los cultivos durante la noche de S. aureus se diluyeron en medio TSB y se añadieron 200 μl de una suspensión de 1 * 10⁴células/ml a los pocillos. Después de la incubación estática de 24 h a 37 °C en una caja con un tejido húmedo estéril, los discos se lavaron con PBS estéril y se transfirieron a tubos eppendorf de 2 ml llenos con 1 ml de PBS. Los tubos con los discos se sometieron vigorosamente a agitación vorticial durante 1 minuto, se sonicaron durante 10 min a 45.000 Hz en un sonicador de baño de agua (VWR USC 300-T) y se sometieron a agitación vorticial de nuevo durante 1 min. Las suspensiones bacterianas resultantes se diluyeron y se sembraron en placas en placas TSB. Después de 24 h de incubación a 37 °C, las UFC/ml se determinaron mediante recuento de placas.

Formación de biopelículas de S. aureus en discos recubiertos para visualización con microscopía confocal de barrido láser (CLSM, por sus siglas en inglés).

Las biopelículas de S. aureus SH1000 se cultivaron en discos de control-Ti y LC0024-Ti como se describió anteriormente, y se tiñeron para su visualización mediante el uso de la tinción de BacLight LIVE/DEAD® (Molecular Probes, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las biopelículas teñidas se analizaron usando una CLSM (Leica TCS SP5, Heidelberg, Alemania) en una configuración de microscopio invertido, con un objetivo de inmersión en agua HCX PL APO CS 63x/1.2. Durante la visualización de CLSM, se tomaron 25 imágenes digitales con un barrido X-Y de unos pocos μm por encima del plano de la superficie. El espesor de las secciones ópticas fue de 577 nm a la máxima anchura completa a media altura y la resolución de la imagen fue de 2048 * 2048 píxeles. Las tinciones LIVE (SYTO® 9) y DEAD (yoduro de propidio) se excitaron mediante un láser de argón (488 nm) y un láser HeNe (594 nm), respectivamente. Las imágenes obtenidas se analizaron en MATLAB usando una macro de software de desarrollo propio para calcular las fracciones de área de células vivas y muertas en una fina sección óptica próxima a la superficie del disco de Ti. Esta macro permite ejecutar automáticamente grandes series de imágenes restando el fondo, eliminando artefactos menores de 20 píxeles y calculando el área cubierta por objetos sobre una intensidad establecida.

Modelo de infección asociada a biopelículas de S. aureus en ratones.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la KU Leuven (número de proyecto P125/2011). El modelo se basa en el implante subcutáneo de un sustrato en el dorso de los ratones, seguido de infección con dosis microbianas precisas en el sitio del implante después de 24 h. Se usaron ratones BALB/c hembra libres de patógenos de ocho semanas de edad que pesaban 20 g. Los ratones se alojaron en jaulas ventiladas individualmente (4 ratones/jaula) y tuvieron acceso adlibitum a alimentos y agua estériles. Un día antes de la cirugía, todos los animales se inmunosuprimieron mediante la adición de dexametasona (0,4 mg/l) al agua potable. El sistema inmunitario se suprimió durante todo el experimento. El día de la cirugía, los ratones se anestesiaron por vía intraperitoneal con una mezcla de ketamina (Ketamine1000®; Pfizer, Puos, Bélgica) y medetomidina (Domitor®; Pfizer) (45 mg/kg de ketamina y 0,6 mg/kg de medetomidina). Una vez dormidos, se afeitó la parte inferior de la espalda de los animales y se desinfectó con isopropanol yodado (1 %). Antes de la incisión, la piel se anestesió localmente con gel de xilocaína (2 %, AstraZeneca, Zoetermeer, Países Bajos). A continuación, se realizó una pequeña incisión subcutánea para crear un espacio de 2 cm de longitud y 1 cm de ancho para el implante de un disco. Después de la implantación, la incisión se cerró con grapas quirúrgicas, se desinfectó y se anestesió localmente con gel de xilocaína. La reversión de la anestesia se realizó mediante inyección intraperitoneal de atipamezol (Antisedan®; Pfizer, 0,5 mg/kg para ratones). 24 h después de la implantación de los discos, los ratones se anestesiaron con una mezcla de ketamina y medetomidina como se indicó anteriormente y se les inoculó S. aureus SH1000. Para ello, se lavó un cultivo bacteriano durante la noche y se volvió a suspender en solución salina estéril (0,9 %) a una concentración de 1 * 10⁸células/ml. Se inyectaron 100 μl del inóculo bacteriano por vía subcutánea en el área alrededor del disco. La anestesia se invirtió con una inyección intraperitoneal de atipamezol como se mencionó anteriormente. Después de 4 días de formación de biopelículas, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y los discos se explantaron. La piel se desinfectó primero con clorhexidina al 0,5 % en alcohol al 70 % antes de extraer los discos de debajo del tejido subcutáneo, que se recogió en tubos de microcentrífuga. La formación de biopelículas en los discos de Ti se evaluó mediante recuentos de UFC. Para ello, las biopelículas formadas sobre los discos se lavaron dos veces con PBS, se sonicaron durante 10 min en un sonicador de baño de agua (Branson 2210) a 40.000 Hz y se sometieron a agitación vorticial durante 30 s en 1 ml de PBS. Se pesaron y homogeneizaron muestras de tejido circundante. Las suspensiones bacterianas resultantes (discos y tejido circundante) se diluyeron y se sembraron en placas por duplicado en placas de agar TSB. Las UFC se contaron después de la incubación de 24 h a 37 °C.

Ensayo de citotoxicidad para células en los discos de titanio recubiertos: ensayo de contacto directo

Las células estromales derivadas de médula ósea humana (MSC) se sembraron a una densidad celular de 5000 células/cm²en medio Eagle modificado por Dulbecco avanzado (Life Technologies, EE. UU.) complementado con FBS al 10 %, 1 x GlutaMAX y 0,05 mg/ml de gentamicina (Gibco, Carlsbad, CA). Los cultivos celulares se mantuvieron en 5 % de CO2 a 37 °C, hasta alcanzar una confluencia del 95 %. A continuación, las células se tripsinizaron (Tripsina-EDTA, Sigma Aldrich), se contaron con hemocitómetro, y se usaron para en ensayo de contacto directo. Las células de 4° pase se usaron para los experimentos.

Cada disco se colocó en un pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos (TPP, Suiza) y las MSC se sembraron en el pocillo de cultivo a una densidad celular de 5000 células/cm². Los cultivos celulares se mantuvieron en 5 % de CO2 a 37 °C durante 6 días. El área en las proximidades de los discos (donde el cultivo celular está en contacto directo con la superficie lateral de los discos) se controló para cambios en la morfología del cultivo celular y la zona de inhibición del crecimiento. Se tomaron fotografías del cultivo celular en las proximidades de los discos en el día 1, 3 y 6. En el día 6, los cultivos celulares también se tiñeron con MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) para una mejor visualización. Por ello, se añadió 10 % de MTT (Sigma Aldrich) al medio de cultivo celular y se incubó durante la noche a 37 °C. Al día siguiente se inspeccionó la viabilidad de las células (los cristales violetas determinaron las células viables) y se fotografiaron. Se usó material de referencia no citotóxico y citotóxico para el control positivo y negativo. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Ensayo de potencial de osteointegración in vitro.

Se determinó el potencial de osteointegración in vitro de los discos LC0024-Ti usando células estromales derivadas de médula ósea humanas (MSC) y células endoteliales microvasculares humanas (HMVEC). MSC y HMVEC se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco avanzado (Life Technologies, EE. UU.) complementado con 10 % de FBS, 1 x GlutaMAX y 0,05 mg/ml de gentamicina (Gibco, Carlsbad, CA) y medio 131 complementado con un complemento de crecimiento microvascular (Life Technologies, EE. UU.), respectivamente. Las MSC y el HMVEC se sembraron a densidades celulares de 5000 células/cm²y se cultivaron en 5 % de CO2 a 37 °C para un pase. Después de alcanzar una confluencia del 95 %, las células se tripsinizaron (Tripsina-EDTA, Sigma Aldrich) y se contaron con un hemocitómetro. Las células de 4° pase se usaron para los experimentos.

Los discos se colocaron en los pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos (TPP, Suiza). Posteriormente, las áreas superiores de los discos se sembraron con MSC o HMVEC a una densidad celular de 9000 células/disco: se colocaron aproximadamente 50 μl de suspensión celular en la parte superior del disco, y se distribuyeron uniformemente de modo que una gota cubriera toda la superficie del disco. A continuación, los discos se mantuvieron en la incubadora, permitiendo que las células se adhirieran. Después de 30 min, se añadió medio de cultivo adicional. Las células se cultivaron durante 5 y 12 días, y luego se fijaron con formalina durante 15 min. A continuación, se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron con faloidina (para solución madre, se disolvió 1 mg de faloidina en 10 ml de metanol; para la solución de trabajo, la solución madre se diluyó 1:20 con PBS) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min para teñir el citoesqueleto de actina. Después de la incubación, las células se lavaron nuevamente 3 veces con PBS y las muestras se incubaron con Vectashield/DAPI (Vector Laboratories, EE. UU.) para teñir los núcleos. A continuación, se tomaron imágenes de los discos de Ti lisos con un objetivo de 40x en un microscopio fluorescente (Nikon T300). Los experimentos se realizaron por triplicado.

Ejemplo 1. Actividad preventiva de 5-Ar-2Al seleccionados contra biopelículas bacterianas y fúngicas

Se seleccionaron seis 5-aril-2-aminoimidazoles (5-Ar-2AIs) (Fig. 1) con actividad previamente informada contra biopelículas de S. Typhimurium (25 °C) y P. aeruginosa (25 °C) (BIC⁵⁰< 75 μM) y se analizó su actividad antibiopelícula preventiva contra un panel amplio de patógenos bacterianos y fúngicos en una configuración de biopelícula monoespecie, mediante el uso de un ensayo basado en violeta cristal y CTB, respectivamente (Tabla 1). BIC50 se define como la concentración del compuesto necesaria para inhibir la formación de biopelículas en un 50 %. En el mismo ensayo se evaluó el efecto sobre el crecimiento planctónico. IC50 se define como la concentración del compuesto necesaria para inhibir el crecimiento planctónico en un 50 %. La actividad se considera específica de una biopelícula si la BIC50 es al menos dos veces menor que la IC50. Nuestro panel de prueba bacteriano incluyó S. liquefaciens (Y-proteobacterias Gram-negativas) capaces de colonizar una amplia variedad de superficies en agua, suelo, tractos digestivos de roedores, plantas, insectos, peces y seres humanos (infecciones nosocomiales); E. coli (^y-proteobacterias Gram-negativas), conocida por formar biopelículas, entre otras cosas, material vegetal, superficies alimentarias (contacto) y catéteres urinarios; P. gingivis (bacteroidetes Gram-negativos), un constituyente importante en las biopelículas de la placa dental implicadas en las enfermedades periodontales; S. aureus (cocos Gram-positivos), que forma biopelículas, entre otras cosas, en heridas crónicas y catéteres y B. cepacia (p-proteobacterias Gramnegativas), implicadas en infecciones por biopelículas en los pulmones de pacientes con fibrosis quística; junto a las bacterias analizadas previamente S. Typhimurium y P. aeruginosa (Y-proteobacterias Gram-negativas).

Los compuestos 1 y 2 se sustituyen en la posición N1 del resto 2-aminoimidazol (39) con un grupo alquilo de longitud intermedia (Fig. 1) [32]. Como se indica en la Tabla 1, se descubrió que el compuesto 2 era muy activo contra la formación de biopelículas de las bacterias Gram-positivas (S. Aureus ATCC6538, S. aureus SH1000 y S. epidermidis) con valores BIC50 entre 2 y 6 μM. El compuesto 1 también tuvo una actividad antibiopelícula contra estas bacterias, sin embargo, en una medida más moderada. Por otra parte, ambos compuestos mostraron una actividad antibiopelícula potente y específica contra P. gingivalis, P. aeruginosa (25 °C) y S. Typhimurium Gram-negativas, con valores BIC50 entre 2 y 50 μM. Ambos compuestos también inhibieron la formación de biopelículas de E. coli y P. aeruginosa a 37 °C (BIC50 entre 6 y 120 μM), sin embargo, de una manera no específica de biopelícula. El compuesto 2, pero no el compuesto 1, tuvo una potente actividad específica de biopelícula contra biopelículas de S. liquefaciens (BIC50 = 18,8 μM, IC50 = 38,0 μM). Por último, ambos compuestos afectaron moderadamente a la formación de biopelículas de B. cepacia, con valores BIC50 entre 145 y 400 μM. Por último, el compuesto 2 tuvo una capacidad muy fuerte para inhibir la formación de biopelículas del hongo C. albicans (BIC⁵⁰= 6,2 μM), mientras el compuesto 1 sólo fue moderadamente activo.

Los 2-aminoimidazoles 2N-sustituidos 3 a 5 (7) en general sólo mostraron una actividad moderada no específica de biopelícula contra las bacterias Gram-positivas S. aureus ATCC6538 y S. aureus SH1000 (valores BIC50 entre 12,3 y 200,3 μM) mientras que los compuestos no estaban activos contra S. epidermidis. Con respecto a las especies Gramnegativas, se observó una alta actividad contra las biopelículas de P. gingivalis, P. aeruginosa (25 °C), S. Typhimurium, y S. liquefaciens (valores BIC50 entre 1 y 15 μM), una menor actividad contra E. coli y B. cepacia (valores BIC50 entre 45 y 331 μM) y sin actividad contra P. aeruginosa a 37 °C. Sólo las actividades moderadas se midieron contra el hongo C. albicans

Por último, el conjugado 2-aminoimidazol/triazol 6 (13) mostró una actividad potente, aunque no específica de biopelícula, contra P. gingivis y S. Typhimurium (BIC50 de 18,1 y 2 μM respectivamente) y una actividad moderada específica de biopelícula contra S. aureus ATCC6538, P. aeruginosa (25 °C) y S. liquefaciens. No se observó actividad contra S. aureus SH1000, S. epidermidis, P. aeruginosa (37 °C), B. cepacia y C. albicans.

Tabla 1 Efecto de 5-Ar-2Als en un panel de biopelículas bacterianas y fúngicas de monoespecies

S.aureus ATCC6538 S.aureus SH1000 S. epidermidis P. gingivis ATCC33277 E.coli TG1

3

a BIC50: concentración del compuesto necesaria para inhibir la formación de biopelículas en un 50 %. b IC50: concentración del compuesto necesaria para inhibir el crecimiento planctónico en un 50 %. c La formación de biopelículas se estudió a 25 °C y 37 °C para simular las condiciones ambientales e in vivo, respectivamente. d~: Los valores B(IC)⁵⁰no se pudieron calcular con precisión debido a la inclinación de la curva. ♦ El efecto sobre el crecimiento planctónico se ha determinado previamente mediante el análisis de la curva de crecimiento [6,7,9]. Los compuestos que tienen una actividad específica de biopelícula (2 x BIC⁵⁰< IC50) están marcados en gris.

Ejemplo 2. Actividad preventiva de diversos 5-Ar-2AIs contra biopelículas bacterianas-fúngicas mixtas

Existen pruebas claras de que las interacciones de C. albicans con las bacterias desempeñan un papel importante en varias enfermedades humanas. Dentro de las biopelículas mixtas, las bacterias interactúan preferentemente con células hifales de C. albicans. Se proporciona una visión general de las interacciones bacterias-Candida y su efecto sobre el desarrollo fúngico en (40). Por otra parte, las interacciones bacterianas-fúngicas pueden cambiar la susceptibilidad al tratamiento antimicrobiano. Las biopelículas mixtas de células S. aureus y C. albicans, por poner un ejemplo, muestran una resistencia mejorada de S. aureus a vancomicina, un efecto que está, en parte, mediado por la matriz de C. albicans. Por lo tanto, se evalúan los compuestos de la Fig. 1 para la actividad preventiva contra un panel de biopelículas bacterianas-fúngicas mixtas, que consisten en combinaciones por pares de C. albicans y E. coli, S. epidermidis y S. aureus.

Como se indica en la Tabla 2, el 5-Ar-2AI N1-sustituido 2 parece ser el compuesto más adecuado para el tratamiento de biopelículas fúngicas-bacterianas mixtas, ya que causó una fuerte reducción de cada especie en las biopelículas mixtas analizadas a una concentración de 100 μM. La formación de biopelículas de C. albicans/S. epidermidis incluso se inhibió completamente a 25 μM.

Tabla 2 Efecto de 5-Ar-2Als en un panel de biopelículas fúngicas-bacterianas mixtas.

C.a. : Candida albicans; S.e. : Staphyococcus epidermidis; S.a. : Staphylococcus aureus. Los compuestos con < 75 % de supervivencia de UFC están marcados en gris.

El compuesto 2N-sustituido 3 tuvo una actividad moderada (inhibición incompleta) contra la combinación C. albicans/E. coli, la combinación C. albicans/S. epidermidis y contra S. aureus dentro de la combinación C. albicans/S. aureus. Por último, el compuesto 5 tuvo una fuerte actividad (inhibición completa a 100 μM) contra S. epidermidis en la biopelícula de C. albicans/S. epidermidis, pero sólo una actividad moderada contra C. albicans en la combinación C. albicans/E. coli y S. aureus en la combinación C. albicans/S. aureus.

Ejemplo 3. Actividad preventiva de diversos 5-Ar-2AIs contra biopelículas bacterianas de especies mixtas

Los informes recientes indican que las biopelículas bacterianas de especies mixtas pueden ser más resistentes a los agentes antimicrobianos que las biopelículas de una única especie (41-48). La resiliencia a nivel comunitario puede ser proporcionada, por ejemplo, por una especie resistente capaz de proteger a toda la comunidad (42). Por lo tanto, se evalúa un subconjunto de los compuestos de la Fig. 1 para la actividad preventiva contra una mezcla de las bacterias Gram-negativas E. coli y P. aeruginosa (que a menudo se coproducen en infecciones del tracto urinario) (49) y una mezcla de las bacterias Gram-positivas S. aureus y S. epidermidis, usando un ensayo basado en violeta cristal (50).

Como se indica en la Tabla 3, todos los compuestos analizados mostraron una fuerte actividad preventiva contra la mezcla de bacterias Gram-negativas y la mezcla de bacterias Gram-positivas, con valores BIC50 de entre 0,5 y 74,3 μM. Cabe destacar que la actividad de los compuestos 2N-sustituidos contra las biopelículas de especies mixtas fue mayor que la de las biopelículas monoespecies de las especies constituyentes.

Tabla 3 Efecto de 5-Ar-2Als en un panel de biopelículas mixtas de E. coli/P. aeruginosa y S. aureus/S. epidermidis.

a BIC50: concentración de inhibidor necesaria para inhibir la formación de biopelículas en un 50 %. b IC50: concentración de inhibidor necesaria para inhibir el crecimiento planctónico en un 50 %. c ~: Los valores B(IC)⁵⁰no se pudieron calcular con precisión debido a la inclinación de la curva. Los compuestos que tienen una actividad específica de biopelícula (2 x BIC⁵⁰< IC50) están marcados en gris.

Ejemplo 4. Comparación de la actividad antibiopelícula y toxicidad de diversos 5-Ar-2Is

En general, se puede concluir a partir de los resultados anteriores que el 5-Ar-2AI N1-sustituido 2 muestra el espectro de actividad más amplio, con una fuerte actividad contra la mayoría de las biopelículas bacterianas monoespecies, la biopelícula monoespecie de C. albicans, tanto la mezcla de bacterias Gram-negativas como la mezcla de bacterias Grampositivas y contra todas las biopelículas bacterianas-fúngicas mixtas. También el otro compuesto N1-sustituido 1 muestra la actividad contra la mayoría de estas biopelículas, aunque sea a dosis más altas. Desafortunadamente, como se ha informado anteriormente, el compuesto 2, y los 5-Ar-2AIs N1-sustituidos en general, muestra una fuerte toxicidad contra las líneas celulares de tumores eucariotas, células óseas y el nematodo Caenorhabditis elegans. De hecho, los 5-Ar-2AIs N1-sustituidos generalmente tiene un índice terapéutico (Tl, por sus siglas en inglés) menor que 1 con respecto a la inhibición de la biopelícula [29]. El TI se calcula como la relación de la concentración del compuesto que produce toxicidad contra las líneas celulares tumorales (IC 50) respecto a la concentración necesaria para ejercer el efecto “terapéutico” deseado sobre las biopelículas (BIC50). Cuanto mayor sea el índice terapéutico, más amplia será la ventana de seguridad del compuesto. Los 2-aminoimidazoles 2N-sustituidos 3-5, por otro lado, tiene una buena actividad contra la mayoría de las biopelículas monoespecies y de especies mixtas de Gram-negativas, pero tienen una actividad más moderada contra las biopelículas monoespecies de las Gram-positivas y C. albicans y contra sus biopelículas mixtas. Sin embargo, los 5-Ar-2Als 2N-sustituidos, generalmente tienen una toxicidad mucho menor, con un TI muy por encima de 1 [29]. El conjugado 2-aminoimidazol/triazol 6 generalmente tiene una mayor toxicidad [29] y un espectro de actividad estrecho contra biopelículas bacterianas monoespecies. A partir de este análisis queda claro que actualmente falta una clase de compuestos no tóxicos con una actividad preventiva de amplio espectro contra bacterias Gram-positivas (tanto en biopelículas monoespecies como en mixtas). Este perfil de actividad es especialmente interesante para la aplicación en recubrimientos antibiopelícula para implantes ortopédicos, dado el hecho de que los estafilococos están asociados con mayor frecuencia con las infecciones por implantes (51). Se planteó la hipótesis de que los 5-Ar-2AI sustituidos tanto en la posición N1 - como 2N- podría combinar la actividad de amplio espectro (o al menos la actividad contra Gram-positivas) de los compuestos N1-sustituidos, con la baja toxicidad de los compuestos 2N-sustituidos. Para probar esta hipótesis se sintetizó una serie de ocho 5-Ar-2AIs N1-,2N-disustituidos y se analizó su actividad frente a un amplio panel de biopelículas bacterianas y fúngicas y su toxicidad frente a células óseas.

Ejemplo 5. Actividad preventiva de nuevos compuestos contra biopelículas bacterianas y fúngicas monoespecies

La actividad preventiva de los nuevos 5-Ar-2Als N1-,2N-disustituidos se evaluó primero contra un panel de biopelículas bacterianas y fúngicas monoespecies. Curiosamente, como se indica en la Tabla 4, todos los compuestos inhibieron la formación de biopelículas de S. aureus ATCC6538 Gram-positivas (37 °C) a bajas concentraciones (BIC50 entre 1 y 41 |^j M), excepto el compuesto 8d, que tuvo una BIC50 superior de 116 j M. Por consiguiente, estos nuevos compuestos se caracterizan por una mayor actividad antibiopelícula en comparación con los 5-Ar-2Is 3 y 5 que sólo están sustituidos en la posición 2N. El crecimiento bacteriano no se vio afectado por estos compuestos para concentraciones iguales a la BIC50, salvo en el caso del compuesto 8a, lo que apunta a una actividad específica de la biopelícula.

Sin embargo, ninguno de los compuestos fue activo contra biopelículas de P. aeruginosa a 25 °C o 37 °C, mientras que el efecto sobre la formación de biopelículas de E. coli dependía fuertemente del patrón de sustitución del anillo 5-arilo. Sólo los compuestos 8a, 8b, 8e y 83f con un anillo de fenilo no sustituido o para-clorfenilo en la posición 5 del anillo de 2-aminoimidazol presentaron una actividad potente contra las células de biopelícula de E. coli a 25 °C, y sólo los compuestos 8a y 8e con un anillo de 5-fenilo no sustituido mostraron actividad a 37 °C. Las actividades a 25 °C fueron específicas de biopelícula (excepto en el caso del compuesto 8a), mientras a 37 °C también se vio afectado el crecimiento planctónico. La mayoría de los nuevos compuestos mostraron una potente actividad preventiva contra

Los nuevos compuestos tienen un perfil de actividad interesante para la aplicación en recubrimientos antibiopelícula para implantes ortopédicos. Por otra parte, los experimentos preliminares indicaron que estos compuestos conservan su actividad después de la unión covalente a una superficie, haciéndolos adecuados para su incorporación tanto en recubrimientos de antibiopelícula covalentes como en recubrimientos de liberación lenta. A la luz de la aplicación de estos compuestos como recubrimientos antiinfecciosos en implantes ortopédicos, se determinó su efecto sobre la viabilidad y el comportamiento funcional de las células óseas. De manera adicional, esto permite una fácil comparación con la toxicidad de los 5-Ar-2Als descritos anteriormente, que se ha evaluado mediante el uso de los mismos ensayos [29].

El efecto de los nuevos compuestos se analizó primero en la viabilidad (es decir, porcentaje de células viables en la muestra tratada en comparación con el número total (viables y no viable) de células en la muestra tratada) de osteoblastos (OB) y células madre mesenquimales (MSC) en función del tiempo. Para cada compuesto se usó una dosis de 12,5 j M, que está muy por encima del valor BIC50 de la mayoría de los compuestos para la inhibición de la biopelícula de S. aureus y S. aureus^/S. epidermidis^. Como se muestra en la Fig. 3A y la Fig. 3B, la viabilidad celular medida por tinción con azul de tripano sólo se redujo muy ligeramente (< 10 %) al principio del tratamiento para un número limitado de compuestos. Tras 6 días de exposición, ninguno de los compuestos alteró la viabilidad celular de los dos tipos de células, excepto el compuesto 8c, que redujo muy ligeramente la viabilidad de OB. La tinción de MTT indicó que la actividad metabólica de ambos tipos de células incluso aumentó en comparación con el control de disolvente después de 6 días de tratamiento con los compuestos 8c, 8d, 8 g y 81 h (Fig. 4), todos ellos con un sustituyente parabromofenilo o 3,4-diclorofenilo en la posición 5 del anillo de imidazol. Curiosamente, también se observó un aumento en la proliferación (Fig. 3A y Fig. 3B) después de 6 días de exposición a los compuestos 8c, 8d, 8g y 81 h (OB, Fig. 3B) y 8d (MSC, Fig. 3A). Sin embargo, la proliferación de MSC y OB se redujo ligeramente después de 6 días de tratamiento con los compuestos 8a, 8e, 8f y 8g y los compuestos 8a y 8e, respectivamente.

A continuación, se analizaron los compuestos 8b, 8c, 8d, 8g y 8h, que permitieron la supervivencia de las células MSC y OB durante más de 3 semanas, con respecto a su potencial de diferenciación osteogénica, ya que estos dos tipos celulares son responsables de la producción de nueva matriz ósea dentro del tejido óseo. La deposición de calcio se eligió como un indicador del fenotipo osteogénico, ya que es el marcador final y funcional de la diferenciación de osteoblastos. Como se muestra en la Fig. 5, ninguno de los compuestos afectó negativamente a la deposición de calcio de cualquiera de los dos tipos de células a 12,5 j M. Curiosamente, todos los compuestos excepto el compuesto 8d (p < 0,05 para las células OB del compuesto 8c; p < 0,001 para el resto de los compuestos) indujeron significativamente la deposición de calcio de ambos tipos de células. Esto indica que el recubrimiento antibiopelícula de implantes ortopédicos con estos compuestos podría incluso estimular el potencial osteointegrador.

Ejemplo 8. Actividad antibiopelícula in vitro de los discos LC0024-Ti contra S. aureus.

Los discos de titanio recubiertos con LC0024 o el compuesto 8g de la Fig. 2 mostraron una reducción de las células de biopelículas de S. aureus SH1000 presentes en la superficie de los discos. La formación de biopelículas de las células de S. aureus en los discos recubiertos fue 3 veces menor (inhibida con 67,4 %) en comparación con los discos de control (Fig. 7).

Ejemplo 9. Análisis microscópico in vitro de discos lisos de LC0024-Ti con CLSM.

Para confirmar los resultados del recuento de UFC, el crecimiento de biopelículas en discos de control-Ti y LC0024-Ti se visualizó mediante CLSM mediante el uso de tinción LIVE/dead® BacLight™, que hace que las células viables se tiñan de verde y las muertas de rojo. La formación de imágenes por CSLM mostró una reducción significativa de las células de biopelícula viables (verde) en los discos LC0024-Ti en comparación con los discos de control-Ti no tratados (Fig. 8). El análisis de imágenes adicional confirmó esta reducción ya que la fracción de área en los discos de LC0024-Ti recubiertos con S. aureus viables fue 3 veces (P < 0, 01) menor en comparación con los discos de control-Ti no tratados (31 % de células viables restantes) (Fig. 8). La Fig. 9 muestra que el espesor de la biopelícula sobre los discos recubiertos era sólo 5 jm menor que en la muestra de control.

Ejemplo 10. Efecto antibiopelícula in vivo de discos lisos de titanio recubiertos con el compuesto LC0024 (compuesto 8g de la Fig. 2).

La actividad antibiopelícula in vivo de los discos de Ti recubiertos con LC0024 se evaluó mediante el uso de un modelo adaptado de infección asociada a biomaterial, que se desarrolló originalmente para el estudio de la formación de biopelículas de S. epidermidis en sustratos de Ti y silicona (31). Para ello, los discos de control-Ti y LC0024-Ti se implantaron por vía subcutánea en la parte posterior de los ratones y 24 h después se inyectaron por vía subcutánea ~10⁸células de S. aureus junto a los implantes para permitir la formación de biopelículas in vivo ^. Después de 4 días, se explantaron los discos y se evaluó la formación de biopelículas en los discos de Ti mediante recuentos de UFC. Como se muestra en la Fig. 10, la recuperación promedio de células de S. aureus fue 24 veces más baja para los discos recubiertos con LC0024 que para los discos de control no recubiertos. Esta disminución significativa (p < 0,05) indica la eficacia de los discos lisos LC0024-Ti para aplicaciones in vivo .

Ejemplo 11. Citotoxicidad de células estromales derivadas de médula ósea humanas en discos de titanio recubiertos.

Los discos de titanio se recubrieron con el compuesto 8g (o LC0024). La Fig. 11 muestra que la morfología del cultivo celular de las células estromales derivadas de la médula ósea humanas permaneció sin cambios tras el uso de discos de titanio recubiertos. Además, no se observó ninguna zona de inhibición del crecimiento para todos los discos analizados. Según la prueba de contacto directo, todos los discos/moléculas recubiertas se consideran no citotóxicos.

Ejemplo 12. Potencial de osteointegración in vitro.

Un problema importante para la aplicación de implantes es el efecto sobre las células osteogénicas (MSC) y vasculogénicas (HMVEC). Estos tipos de células son necesarios para la integración del implante en el tejido circundante, es decir, osteointegración (32). Como se observa por la tinción con faloidina/DAPI en el día 5 (Fig. 12), los discos de control-Ti y los discos LC0024-Ti analizados se apoyan en la unión y el crecimiento de MSC y HMVEC. Por otra parte, la superficie de los discos permitió el crecimiento de ambos tipos de células también durante períodos prolongados de tiempo, es decir, 12 días. Para todos los discos analizados, se observó un aumento obvio en los números de células en el día 12 en comparación con el día 5.

En conjunto, todos los discos analizados permitieron la fijación y el crecimiento de células osteogénicas y vasculogénicas, lo que indica un buen potencial de osteointegración. Generalmente, las MSC funcionaron mejor que las HMVEC; se adhirieron a más tipos de sustrato y proliferaron más, lo que es de esperar debido a las diferencias de características entre los tipos de células.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 5-aril-2-aminoimidazoles sustituidos representados por la fórmula estructural (I),

en donde,

R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C4-12 y cicloalquilo C3-12 sustituidos o no sustituidos;

R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2-3, alquilo C4-10 y cicloalquilo C3-10 sustituidos o no sustituidos;

R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, metoxi, metilo, hidroxilo y metilsulfonilo;

y sales, hidratos, solvatos, estereoisómeros o formas polimórficas farmacéuticamente aceptables de los mismos.

2. El compuesto de 5-aril-2-aminoimidazol sustituido según la reivindicación 1 seleccionado del grupo que consiste en N-isobutil-1 -octil-5-fenil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(4-clorofenil)-N-isobutil-1 -octil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(4-bromofenil)-N-isobutil-1 -octil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(3,4-diclorofenil)-N-isobutil-1 -octil-1 H-imidazol-2-amina, N-ciclopentil-1 -octil-5-fenil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(4-clorofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(4-bromofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1H-imidazol-2-amina, y 5-(3,4-diclorofenil)-N-ciclopentil-1 -octil-1 H-imidazol-2-amina.

3. Una superficie recubierta con compuestos de 5-aril-2-aminoimidazol sustituido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

4. La superficie según la reivindicación 3, en donde dicha superficie es la superficie de un implante veterinario o médico.

5. La superficie según la reivindicación 4, en donde dicha superficie es la superficie de un implante de titanio.

6. Una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección patológica asociada con una infección microbiana o para disminuir o erradicar el crecimiento bacteriano en un animal o ser humano, en donde dicha composición comprende uno o más excipientes y una cantidad inhibidora de biopelícula microbiana de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 5-aril-2-aminoimidazoles sustituidos representados por la fórmula estructural (I),

en donde,

R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2-3, alquilo C^1ü y cicloalquilo C3-10 sustituidos o no sustituidos;

R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en halógeno, nitro, metoxi, metilo, hidroxilo y metilsulfonilo; y sus sales, hidratos, solvatos, estereoisómeros o formas polimórficas farmacéuticamente aceptables.

7. La composición para su uso según la reivindicación 6, en donde dicha composición comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en N-isobutil-1-octil-5-fenil-1H-imidazol-2-amina, 5-(4-clorofenil)-N-isobutil-1 -octil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(4-bromofenil)-N-isobutil-1-octil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(3,4-diclorofenil)-N-isobutil-1 -octil-1 H-imidazol-2-amina, N-ciclopentil-1 -octil-5-fenil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(4-clorofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(4-bromofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1 H-imidazol-2-amina, y 5-(3,4-diclorofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1 H-imidazol-2-amina.

8. La composición para su uso según la reivindicación 6 o 7, en donde la infección microbiana es una infección bacteriana Gram-positiva seleccionada del grupo que consiste en una especie neumocócica, Staphylococcus aureus resistente a meticilina, S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus, S. capitis, S. warneri, Streptococcus spp. resistente a múltiples fármacos, Enterococcus spp y, Propionibacterium acnes.

9. Un método para tratar una infección microbiana en una planta o para inhibir la formación de biopelícula microbiana en una planta, o en una superficie con la que un ser humano o un animal puede entrar en contacto, aplicando a dicha planta o superficie, un compuesto antimicrobiano según la reivindicación 1 o 2.

10. El método según la reivindicación 9, en donde la biopelícula microbiana es una biopelícula microbiana Gram-positiva.

11. El uso de una composición para desinfectar o esterilizar una superficie ex vivo para disminuir o erradicar una biopelícula o evitar el crecimiento de una biopelícula, en donde dicha composición comprende una cantidad inhibidora de biopelícula de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 5-aril-2-aminoimidazoles sustituidos representados por la fórmula estructural (I)

en donde,

R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2-3, alquilo C^10 y cicloalquilo C3-10 sustituidos o no sustituidos;

R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en halógeno, nitro, metoxi, metilo, hidroxilo y metilsulfonilo;

y sus sales, hidratos, solvatos, estereoisómeros o formas polimórficas farmacéuticamente aceptables.

El uso según la reivindicación 11, en donde la biopelícula es una biopelícula bacteriana Gram-positiva. El uso de una composición según la reivindicación 11 o 12, en donde dicha composición comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en N-isobutil-1-octil-5-fenil-1H-imidazol-2-amina, 5-(4-clorofenil)-N-isobutil-1 -octil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(4-bromofenil)-N-isobutil-1-octil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(3,4-diclorofenil)-N-isobutil-1 -octil-1 H-imidazol-2-amina, N-ciclopentil-1 -octil-5-fenil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(4-clorofenil)-N-ciclopentil-1 -octil-1 H-imidazol-2-amina, 5-(4-bromofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1 H-imidazol-2-amina, y 5-(3,4-diclorofenil)-N-ciclopentil-1-octil-1H-imidazol-2-amina.

El uso de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde dicha composición comprende uno o más excipientes.

El uso de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde dicho excipiente es un disolvente para dicho compuesto; en particular en donde dicho disolvente se selecciona del grupo que consiste en dimetilformamida, tetrahidrofurano, acetonitrilo, diclorometano, N-metilpirrolidona, acetona, cloroformo, dimetilsulfóxido y mezclas de los mismos.